RU2720518C1 - Strain of sindbis fever virus 1383 clone 3 - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medical virology and can be used for developing diagnostic techniques and biological protection means. Disclosed is a high-yield strain of the Sindbis fever virus strain 1383 clone 3 virus registered in the State Virus Collection (number of a depositor of SVC No. 1273), recovered from the CNS (from the brain of sick birds - Somateria mollissima and then by sequential genetic cloning), characterized by complete primary structure of envelope proteins (envelop 1 - E1 and envelop 2 - E2) and nucleocapsid (core - C) of virion. Strain has high immunogenic and antigenic activity.

EFFECT: strain of the Sindbis fever virus 1383 clone 3 is a convenient biotechnological model for obtaining diagnostic and vaccine preparations, as well as a genetic vector for applied genetic engineering.

1 cl, 3 dwg, 2 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3), зарегистрированного в Государственной коллекции вирусов (ГКВ №1273), обладающего высокой репродуктивной активностью, с охарактеризованной полной первичной структурой белков оболочки (envelop 1 - E1 и envelop 2 - Е2) и нуклеокапсида (core - С) вириона. Изобретение может быть использовано для разработки методов диагностики и средств биологической защиты.The invention relates to medical virology and relates to a strain of Sindbis fever virus strain 1383 clone 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3), registered in the State virus collection (ST-Bills No. 1273), which has high reproductive activity, characterized by a complete primary structure of envelope proteins (envelop 1 - E1 and envelop 2 - E2) and nucleocapsid (core - C) of the virion. The invention can be used to develop diagnostic methods and biological protection.

Предшествующий уровень техники.The prior art.

Вирусы лихорадки Синдбис (SV) - род Alphavirus, серокомплекс вирусов западного энцефаломиелита (Western encephalomyelitis - WEE-ЗЭЛ) и лихорадки Синдбис (WEE-SV) - являются возбудителями лихорадочных заболеваний человека и теплокровных животных [1, 2, 3, 4]. Объединение вирусов Синдбис - и Западного энцефаломиелита лошадей - WEE - подобных вирусов в один серокомплекс внутри рода Alphavirus основано на антигенном сходстве белков оболочки вириона (белки Е1 и Е2) SV- и WEE, определяемом в реакциях иммунофлюоресценции - РИФ, реакции нейтрализации инфекционной активности - РН, реакции торможения гемагглютинации - РТГА [5], иммуноферментном анализе - ИФА, иммуноблоте) [1; 6].Sindbis fever viruses (SV) - the genus Alphavirus, a serocomplex of Western encephalomyelitis viruses (Western encephalomyelitis - WEE-ZEL) and Sindbis fever (WEE-SV) - are the causative agents of febrile diseases in humans and warm-blooded animals [1, 2, 3, 4]. The combination of Sindbis and Western Encephalomyelitis viruses of horses - WEE - like viruses into one serocomplex within the genus Alphavirus is based on the antigenic similarity of the virion envelope proteins (E1 and E2 proteins) SV- and WEE, as determined in immunofluorescence-RIF reactions, and the neutralization of the infection-R , hemagglutination inhibition reactions - RTGA [5], enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA, immunoblot) [1; 6].

Вирусы WEE являются особо опасными вирусами с рекомбинантной структурой генома вируса Сидбис (SV) и вируса восточного энцефаломиелита. SV относятся к группе новых и возвращающихся инфекций (2-ая группа патогенности). Вирус лихорадки Сидбис передается кровососущими членистоногими (комарами Aedes communis, Culex, Culisetta [1; 3] и может переноситься на большие расстояния во время сезонной миграции птиц [7]. Описаны случаи эпидемических вспышек лихорадки Синдбис разной интенсивности и выделение SV в северных и южных широтах Африки, в Центральной Европе, Западной Украине, Фенноскандии, Российской Федерации (северо-западные регионы РФ, Южное Поволжье, Северный Кавказ, Татария, Тюмень), Индии, Китае (КНР). SV распространены в Евразии, Африке, Юго-Восточной Азии и Океании [4]. SV были выделены в основном от комаров и на основании антигенного сходства и определения первичной структуры гена Е2 вирионов (аа-последовательностей гликопротеина Е2) распределены в пять генотипов, коррелирующих с их географическим распространением и путями миграции птиц [7]. Заболевания человека с характерными симптомами встречаются наиболее часто в странах Северной Европы [8; 9]. Эпидемии с тысячами серологически подтвержденных случаев возникают примерно через каждые 5-7 лет. В Финляндии заболевание было названо болезнь Погоста [10, 11], в Швеции - болезнь Окельбо [12], в России -Карельская лихорадка [13].WEE viruses are particularly dangerous viruses with the recombinant structure of the genome of Sidbis virus (SV) and Eastern encephalomyelitis virus. SV belong to the group of new and recurring infections (2nd group of pathogenicity). Sidbis fever virus is transmitted by blood-sucking arthropods (mosquitoes Aedes communis, Culex, Culisetta [1; 3] and can be transported over long distances during seasonal bird migration [7]. Cases of epidemic outbreaks of Sindbis fever of different intensities and the release of SV in northern and southern latitudes have been described. Africa, Central Europe, Western Ukraine, Fennoscandia, the Russian Federation (northwestern regions of the Russian Federation, the Southern Volga region, Northern Caucasus, Tatarstan, Tyumen), India, China (PRC) .VV are common in Eurasia, Africa, Southeast Asia and Oceania [4]. SV would and isolated mainly from mosquitoes and on the basis of antigenic similarity and determination of the primary structure of the E2 gene of the virions (aa sequences of the glycoprotein E2) are distributed into five genotypes that correlate with their geographical distribution and bird migration routes [7]. Human diseases with characteristic symptoms are most often in Northern Europe [8; 9]. Epidemics with thousands of serologically confirmed cases occur every 5-7 years. In Finland, the disease was called Pogost disease [10, 11], in Sweden - Okelbo disease [12], in Russia - Karelian fever [13].

Характерными симптомами заболевания человека являются лихорадка, выраженная головная боль, артралгии и миалгии. В течение первых дней болезни может появляться сыпь везикулярного или геморрагического характера, которая может сохраняться от 7 до 20 дней. У человека описаны случаи длительного сохранения хронических артралгий крупных суставов и снижения иммунитета [8, 9, 14]. Как возбудители заболеваний человека с указанными симптомами наиболее известны штаммы вируса лихорадки Синдбис, циркулирующие в северо-западных регионах России и в прилежащих европейских странах [15].The characteristic symptoms of a human disease are fever, severe headache, arthralgia and myalgia. During the first days of the disease, a rash of a vesicular or hemorrhagic nature may appear, which can last from 7 to 20 days. In humans, cases of prolonged preservation of chronic arthralgia of large joints and a decrease in immunity have been described [8, 9, 14]. As the causative agents of human diseases with these symptoms, the most known strains of the Sindbis fever virus circulating in the northwestern regions of Russia and in adjacent European countries [15].

В структуру вирионов SV входят три белка: гликопротеин оболочки вириона Е1 (envelop 1), гликопротеин Е2 (envelop 2) и белок С нуклеокапсида (core - С).The structure of SV virions includes three proteins: the glycoprotein of the envelope of virion E1 (envelop 1), the glycoprotein E2 (envelop 2) and protein C of the nucleocapsid (core - C).

Альфавирусы относятся к РНК-содержащим вирусам с геномом положительной полярности и имеют липидную оболочку. Геном альфавирусов (49S РНК) представлен одноцепочечной РНК положительной полярности (геномная РНК вируса инфекционна), кодирует неструктурные (nsP) белки (nsP1 - nsP2 - nsP3 - nsP4) полимеразного комплекса и структурные (str) белки (белок нуклеокапсида С - [core] -Е3 - Е2 - 6к - E1 вириона. Str белки транслируются с 26 S - субгеномной РНК в виде полипротеина.Alphaviruses are RNA-containing viruses with a genome of positive polarity and have a lipid membrane. The genome of alphaviruses (49S RNA) is a single-stranded RNA of positive polarity (genomic RNA of the virus is infectious), encodes non-structural (nsP) proteins (nsP1 - nsP2 - nsP3 - nsP4) polymerase complex and structural (str) proteins (nucleocapsid C protein - [core] - E3 - E2 - 6k - E1 of the virion Str proteins are translated from 26 S - subgenomic RNA as a polyprotein.

Белок С обладает протеазной активностью и разрезает полипротеин в участке С -Е3 (триптофан-серин), сайты Е3 - Е2 - 6К - Е1 разрезаются клеточными протеазами. Белок Е3 не включается в структуру вириона SV. Белок нуклеокапсида ("кор"-core-белок, С-белок) выполняет разнообразные функции в процессе морфогенеза вируса: способствует депротеинизации геномной РНК, участвует в формировании вирусного рибонуклеопротеина путем связывания (1-98 N-концевых аа остатков) с дочерней геномной РНК, участвует в формировании сферического нуклеокапсида вириона, взаимодействуя с эндодоменами встроенных в клеточную стенку структурных гликопротеинов Е2 и Е1 [2].Protein C has protease activity and cuts the polyprotein in the C-E3 site (tryptophan-serine), sites E3 - E2 - 6K - E1 are cut by cellular proteases. Protein E3 is not included in the structure of the virion SV. The nucleocapsid protein (core protein, C protein) performs various functions in the process of virus morphogenesis: it promotes deproteinization of genomic RNA, participates in the formation of viral ribonucleoprotein by binding (1-98 N-terminal aa residues) to daughter genomic RNA, participates in the formation of the spherical nucleocapsid of the virion, interacting with the endodomains of the structural glycoproteins E2 and E1 embedded in the cell wall [2].

Белки Е1 и Е2 включены в липидную оболочку вириона и формируют на поверхности вириона шипы, индуцирующие в инфицированном организме образование нейтрализующих антител и анти-гемагглютинирующих антител. Обработка альфавирусов липид-экстрагирующими соединениями (нейонными детергентами, например, NP40, этиловым эфиром, хлороформом) в течение 30 мин. приводит к инактивации вирусных частиц и диссоциации вирионов. Диаметр зрелого вириона около 50-55 нм. Антитела к этим белкам или же сами белки в сыворотке иммунного (или больного) организма или в инфицированных клетках выявляются с помощью иммунологических реакций и вирусологических методов.Proteins E1 and E2 are included in the lipid membrane of the virion and form spikes on the virion surface that induce the formation of neutralizing antibodies and anti-hemagglutinating antibodies in the infected body. Treatment of alphaviruses with lipid-extracting compounds (neural detergents, for example, NP40, ethyl ether, chloroform) for 30 minutes leads to inactivation of viral particles and dissociation of virions. The diameter of the mature virion is about 50-55 nm. Antibodies to these proteins or the proteins themselves in the serum of an immune (or sick) organism or in infected cells are detected using immunological reactions and virological methods.

Особенности строения генома SV и способ формирование вирионов обеспечивают возможность использования SV и других альфавирусов в качестве генных векторов для прикладных генно-инженерных разработок [16, 17].The structural features of the SV genome and the method of forming virions provide the possibility of using SV and other alphaviruses as gene vectors for applied genetic engineering developments [16, 17].

Задача создания методов экспресс-диагностики (в особенности для дифференциации от других, близких по антигенной структуре альфавирусов или «комариных» вирусов других семейств (например, вируса Зика) остается весьма актуальной. Отсутствие коммерческих экспресс-диагностических (для SV) тест-систем сдерживает проведение плановых экологических исследований в приграничных к территории России регионах, где описано выделение вариантов SV (Швеция, Финляндия, страны Прибалтики, Западная Украина, Армения, Азербайджан и др.) и в районах с потенциальным распространением вирусных инфекций, сходных по клинической картине заболевания. Первичная структура геномов штаммов SV, выделенных в России: в Южном Поволжье, Северном Кавказе, Казани и Тюмени определена нами и размещена в Ген-банке (MG679373, MG679374, MG679375, MG679376, MG679377, MG679378, MG679380, MG679381).The task of creating rapid diagnostic methods (especially for differentiation from other alphaviruses or mosquito viruses of other families similar in antigenic structure (for example, Zika virus) remains very urgent. The lack of commercial rapid diagnostic (for SV) test systems hinders the implementation of planned environmental studies in the regions bordering the territory of Russia, where the allocation of SV options is described (Sweden, Finland, the Baltic countries, Western Ukraine, Armenia, Azerbaijan, etc.) and in areas with potential the spread of viral infections similar in the clinical picture of the disease.The primary structure of the genomes of SV strains isolated in Russia: in the South Volga, Northern Caucasus, Kazan and Tyumen, was determined by us and placed in the Gene Bank (MG679373, MG679374, MG679375, MG679376, MG679377, MG679378, MG679380, MG679381).

Коммерческие диагностические тест-системы, основанные на использовании очищенных вирусных антигенов и антител к ним (методы иммуноферментного анализа - ИФА, иммунофлюоресценции - ИФ, латекс агглютинации - ЛА, иммуноблота -ИФБ), а также на выявлении генетического материала этого вируса (например, метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции - ОТ-ПЦР) не известны.Commercial diagnostic test systems based on the use of purified viral antigens and antibodies to them (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA, immunofluorescence - IF, latex agglutination - LA, immunoblot-IFB), as well as the detection of the genetic material of this virus (for example, the reverse method transcriptions - polymerase chain reaction - RT-PCR) are not known.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Технической задачей изобретения является создание штамма вируса лихорадки Синдбис, эффективно репродуцирующегося в клеточной культуре (первичной или перевиваемой), пригодного для использования в производственных целях.An object of the invention is the creation of a strain of Sindbis fever virus, which is effectively reproduced in cell culture (primary or transplantable), suitable for use in industrial purposes.

Заявленный штамм - «штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3)» был получен из клеток головного мозга больных птиц -Somateria mollissima в культуре клеток Vero-Е6 путем заражения клеток 10%-ной суспензией головного мозга и последовательного генетического клонирования вируса.The claimed strain - "Sindbis fever virus strain 1383 clone 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) strain" was obtained from brain cells of sick birds -Somateria mollissima in Vero-E6 cell culture by infection of cells with a 10% suspension of the brain and serial genetic cloning of the virus.

Полученный штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) депонирован в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ №1273) под названием «штамм SV-1383/клон 3, род Alfavirurus, семейство Togaviridae» и зарегистрирован в международном ген-банке: № MG679379, 2018 г. Представленный штамм хорошо хранится при минус 70°С.The resulting strain of Sindbis fever virus 1383 clone 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) was deposited in the State collection of viruses (STB No. 1273) under the name "strain SV-1383 / clone 3, genus Alfavirurus, family Togaviridae" and registered in the international gene bank: No. MG679379, 2018. The strain presented is well stored at minus 70 ° C.

Предлагаемый штамм содержит три структурных белка: гликопротеины Е1 и Е2 и белок С нуклеокапсида.The proposed strain contains three structural proteins: glycoproteins E1 and E2 and protein C nucleocapsid.

Технический результат: получен оригинальный штамм вируса лихорадки Синдбис, эффективно репродуцирующийся в клеточной культуре (например, в фибробластах эмбрионов кур - ФЭК или в перевиваемых линиях клеток почек зеленой мартышки VERO-E6), с высокими титрами при использовании производственных методов культивирования (роллерное или суспензионное), обладающего выраженной иммуногенной активностью и широкими антигенными связями с другими известными штаммами вируса Синдбис, с охарактеризованной первичной структурой белков вириона.EFFECT: original strain of Sindbis fever virus is obtained that reproduces efficiently in cell culture (for example, in chicken embryo fibroblasts - FEC or in transplantable green monkey kidney cell lines VERO-E6), with high titers using production cultivation methods (roller or suspension) possessing pronounced immunogenic activity and broad antigenic bonds with other known strains of the Sindbis virus, with the primary structure of the virion proteins characterized.

Полученные сведения о первичной структуре вирусных белков данного штамма (E1, Е2, С) позволяют контролировать фенотип вируса при генетическом клонировании и могут быть использованы для создания генно-инженерных препаратов. Актуальна возможность прикладного использования генетически охарактеризованного штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 в качестве генетического вектора, эффективно экспрессирующего полезные гены для адресной доставки сконструированного белка в клеточное ядро.The information obtained on the primary structure of the viral proteins of this strain (E1, E2, C) allows us to control the phenotype of the virus during genetic cloning and can be used to create genetically engineered drugs. The possibility of the applied use of the genetically characterized strain of the Sindbis 1383 clone 3 fever virus as a genetic vector that efficiently expresses useful genes for targeted delivery of the engineered protein to the cell nucleus is relevant.

Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.

На фиг. 1 приведена аминокислотная последовательность белка Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (SEQ ID NO: 1).In FIG. 1 shows the amino acid sequence of protein E1 of the Sindbis strain 1383 clone 3 fever (SEQ ID NO: 1).

На фиг. 2 приведена аминокислотная последовательность белка Е2 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (SEQ ID NO: 2), у штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 выявлена замена (глютамин Q55->K лизин) в сайте вирулентности. Данный штамм также имеет уникальную замену (apr.R114 -> S серии) в сайте проникновения вируса в клетку (на фиг. 2 замены в позициях 55 и 114 выделены курсивом и подчеркиванием).In FIG. Figure 2 shows the amino acid sequence of the E2 protein of the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain (SEQ ID NO: 2), the replacement of the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain (glutamine Q55-> K lysine) was detected in the virulence site. This strain also has a unique substitution (apr.R114 -> S series) at the site of virus penetration into the cell (in Fig. 2, substitutions at positions 55 and 114 are shown in italics and underline).

На фиг. 3 приведена аминокислотная последовательность белка С нуклеокапсида штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (SEQ ID NO: 3).In FIG. 3 shows the amino acid sequence of protein C of the nucleocapsid strain of Sindbis fever virus 1383 clone 3 (SEQ ID NO: 3).

Примеры осуществления заявленного изобретения.Examples of the implementation of the claimed invention.

Все исследования данного штамма, как и других изолятов SV, взятых для сравнения, проводились по стандартным (классическим) методикам [18].All studies of this strain, as well as other SV isolates taken for comparison, were carried out according to standard (classical) methods [18].

Пример 1. Культуральные свойства штамма вируса лихорадкиExample 1. Cultural properties of a strain of fever virus

Синдбис 1383 клон 3Sinbis 1383 clone 3

Вирус SV-1383 нами выделен из клеток головного мозга больных птенцов. Штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 отличается способностью эффективно размножаться в клеточных линиях, широко используемых в производственных целях; имеет короткий цикл репродукции, эффективно индуцирует специфические антитела, перекрестно реагирующие с другими SV из разных регионов РФ.We isolated the SV-1383 virus from the brain cells of sick chicks. The Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain is characterized by its ability to efficiently propagate in cell lines widely used for production purposes; It has a short reproduction cycle, effectively induces specific antibodies that cross-react with other SVs from different regions of the Russian Federation.

Предложенный штамм хорошо размножается в клетках зеленой мартышки -VERO-E6, фибробластах эмбриона человека - ФЭЧ, легких эмбриона человека - ЛЭЧ, клетках почек хомячка ВНК-21, клетках почек свиньи - СПЭВ при разных условиях культивирования (монослойная культура на пластиковых матрацах или в роллерных бутылях).The proposed strain multiplies well in green monkey-VERO-E6 cells, human embryo fibroblasts - PEF, human embryo lungs - LEF, VNK-21 hamster kidney cells, pig kidney cells - SPEV under different cultivation conditions (monolayer culture on plastic mattresses or roller large bottles).

Для сравнения проведены исследования с другими штаммами SV, выделенными в разных регионах мира:For comparison, studies were conducted with other strains of SV isolated in different regions of the world:

EgAR-339 выделен в Египте от комаров Culex univittatus;EgAR-339 isolated in Egypt from mosquitoes Culex univittatus;

Ф-720 выделен в Армении от комаров Aedes sp.;F-720 isolated in Armenia from mosquitoes Aedes sp .;

штамм Pogosta (Финляндия) выделен от человека;Pogosta strain (Finland) isolated from humans;

штамм Ставрополь выделен от комаров Aedes sp.;Stavropol strain isolated from mosquitoes Aedes sp .;

штамм Астрахань выделен от комаров Aedes sp.Astrakhan strain isolated from mosquitoes Aedes sp.

Инфекционный титр вируса определяют путем титрования в монослойной 2-х суточной культуре клеток VERO-E6 в пластиковых микропланшетах по развитию цитопатического эффекта (ЦПЭ, единиц ЦПЭ/мл) или при титровании в пластиковых флаконах - подсчетом бляшек под агаровым покрытием (число бляшек БОЕ\мл). Через 16-24 ч. после заражения инфекционный титр штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) достигает максимальных значений:Virus infectious titer is determined by titration in a monolayer 2-day culture of VERO-E6 cells in plastic microplates to develop a cytopathic effect (CPE, CPE / ml units) or by titration in plastic bottles by counting plaques under agar coating (number of plaques PFU / ml ) 16-24 hours after infection, the infectious titer of the Sindbis fever virus strain 1383 clone 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) reaches its maximum values:

8-9×10⁸ - 1-5×10⁹ БОЕ/мл, данные по другим вирусам представлены в таблице (Таблица 1). Продукция инфекционного вируса на 1 клетку может превышать 1000 ед. БОЕ (бляшкообразующих единиц). Роллерное выращивание вируса позволяет получить наибольшее (по массе) количество вируса.8-9 × 10 ⁸ - 1-5 × 10 ⁹ PFU / ml, data for other viruses are presented in the table (Table 1). The production of an infectious virus per 1 cell can exceed 1000 units. PFU (plaque forming units). Roller virus growing allows you to get the largest (by weight) amount of the virus.

Одновременно с инфекционной активностью в культуральной жидкости накапливаются вирусные гемагглютинины (ГА) до титров 1:128-1:256, которые определяют в реакции агглютинации (РГА) с эритроцитами гуся [18]. Реакция происходит в зоне рН 5,6-6.2 с оптимумом рН 5,8-6,0. Соотношение БОЕ/ГАЕ (гемагглютинирующие единицы) равное 10⁶-10⁷ свидетельствует о высоком содержании зрелых вирионов и может использоваться как простой ориентировочный показатель на стадиях концентрации и очистки вируса.Along with infectious activity, viral hemagglutinins (GA) accumulate in the culture fluid to titers of 1: 128-1: 256, which are determined in the agglutination reaction (RGA) with goose erythrocytes [18]. The reaction occurs in the pH zone of 5.6-6.2 with an optimum pH of 5.8-6.0. The ratio of PFU / GAE (hemagglutinating units) equal to 10 ⁶ -10 ⁷ indicates a high content of mature virions and can be used as a simple indicative indicator at the stages of concentration and purification of the virus.

* EgAR-339 выделен в Египте от комаров Culex univittatus* EgAR-339 isolated in Egypt from mosquitoes Culex univittatus

** Ф-720 выделен в Армении от комаров Aedes sp.** F-720 isolated in Armenia from mosquitoes Aedes sp.

*** штамм Pogosta (Финляндия) выделен от человека*** Pogosta strain (Finland) isolated from humans

+ штамм Ставрополь выделен от комаров Aedes sp.+ Stavropol strain isolated from mosquitoes Aedes sp.

++ штамм Астрахань выделен от комаров Aedes sp.++ strain Astrakhan isolated from mosquitoes Aedes sp.

Вирус можно сконцентрировать методами дифференциального центрифугирования и очистить в градиенте плотности сахарозы: (до концентрации и очистки 10⁸-10⁹ БОЕ/мл, после очистки 10¹¹-10¹² БОЕ/мл). В отличие от других штаммов SV, штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 эффективно размножается в первичных и перевиваемых клеточных линиях, используемых для производственных целей.The virus can be concentrated by differential centrifugation methods and purified in a sucrose density gradient: (before concentration and purification 10 ⁸ -10 ⁹ PFU / ml, after purification 10 ¹¹ -10 ¹² PFU / ml). Unlike other SV strains, the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain efficiently propagates in primary and transplantable cell lines used for production purposes.

В этом исследовании отмечено, что продукция штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 в клеточной культуре Vero Е6 по сравнению с данными об отечественных и зарубежных изолятах вирусов Синдбис выше на 2-4 порядка, что подчеркивает его высокую продуктивность. Подобная закономерность прослеживается и при заражении других клеточных линий (ФЭЧ, ЛЭЧ, ВНК-21, СПЭВ) при сходных условиях культивирования как в монослойной культуре, так и на пластиковых матрацах или в роллерных бутылях.In this study, the production of the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain in Vero E6 cell culture was 2-4 orders of magnitude higher than the data on domestic and foreign Sindbis virus isolates, which emphasizes its high productivity. A similar pattern can be observed during the infection of other cell lines (PEC, LEC, VNK-21, SPEV) under similar cultivation conditions both in a monolayer culture and on plastic mattresses or in roller bottles.

Пример 2. Антигенные свойства штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3.Example 2. Antigenic properties of the strain of fever virus Sindbis 1383 clone 3.

Структурные белки вириона штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 можно выявить методами РИФ или ИФА в зараженных SV клеточных культурах (использовались классические методики, так как коммерческие тест-системы отсутствуют). Использование специфических антител в реакции непрямой РИФ позволяет выявить белки Е1 и Е2 в виде свечения в цитоплазме зараженных клеток. Белок С через 1-4 ч. после заражения штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 определяется специфическим антителами сначала в цитоплазме, а затем транспортируется в ядро клетки.The structural proteins of the virion of the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain can be detected by RIF or ELISA in SV-infected cell cultures (classical methods were used as there are no commercial test systems). The use of specific antibodies in the indirect RIF reaction allows the detection of E1 and E2 proteins in the form of a glow in the cytoplasm of infected cells. Protein C, 1-4 hours after infection of the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain, is determined by specific antibodies, first in the cytoplasm, and then transported to the cell nucleus.

Антисыворотка к цельному или разрушенному штамму вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 нейтрализует инфекционную активность в организме и/или «in vitro». Заболевание лихорадкой Синдбис или иммунизация лабораторных животных (мышей и кроликов) препаратами очищенного вируса или разрушенного вируса приводит к развитию специфического иммунного ответа, эффективность которого определяется уровнем нарастания специфических антител в организме при изучении в реакции нейтрализации, при этом в основном участвуют антитела к белку Е2. Все работы выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ №755 от 12.08.1977 г.). В исследовании использованы 4 группы мышей линии Balb/c (самки), 6-7 недель (массой 18-20 гр.) по 5 особей в каждой, а также в некоторых опытах использованы кролики. Антисыворотка к цельному или разрушенному вирусу, главным образом к белку Е1, вызывает торможение реакции агглютинации эритроцитов (гуся или человека с 1-ой группой крови), в зоне рН 6,7-7,2. Для сравнения в исследовании использовали штамм Ф-720, который выделен на Северном Кавказе, штамм SV - EgAR-339, который выделен в северных районах Египта, а также штамм WEE 163-А вирус западного энцефаломиелита, аттенуированный штамм, прототипный вариант которого выделен в западных регионах США и является природным рекомбинантом между SV и восточным энцефаломиелитом лошадей [19].The Sindbis 1383 clone 3 antiserum to the whole or destroyed strain of the fever virus neutralizes the infectious activity in the body and / or in vitro. Sindbis fever or immunization of laboratory animals (mice and rabbits) with preparations of a purified virus or a destroyed virus leads to the development of a specific immune response, the effectiveness of which is determined by the level of increase of specific antibodies in the body when studied in the neutralization reaction, mainly antibodies to E2 protein are involved. All work was carried out in accordance with the "Rules for the use of experimental animals" (order of the Ministry of Health No. 755 of 08/12/1977). The study used 4 groups of Balb / c mice (females), 6-7 weeks (weighing 18-20 g.), 5 animals each, and rabbits were also used in some experiments. The antiserum to the whole or destroyed virus, mainly to the E1 protein, inhibits the agglutination of erythrocytes (goose or person with the 1st blood group), in the pH range of 6.7-7.2. For comparison, the study used strain F-720, which was isolated in the North Caucasus, strain SV - EgAR-339, which was isolated in the northern regions of Egypt, as well as strain WEE 163-A, virus of Western encephalomyelitis, an attenuated strain, a prototype of which was isolated in Western regions of the USA and is a natural recombinant between SV and eastern horse encephalomyelitis [19].

Приведенные в Таблице 2 данные показывают высокую нейтрализующую активность гипериммунных антител к гомологичному штамму вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 и одновременно положительные перекрестные реакции с изолятами SV из разных географических регионов. Это свойство обеспечивает возможность использования антител к штамму вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 для выявления иммунохимическими методами генетических вариантов SV из разных географических регионов. Моноклональные антитела также позволяют дифференцировать вирусы Синдбис в серологических реакциях [5, 19]. Одновременно, такие антитела реагируют в реакции нейтрализации с вирусом западного энцефаломиелита (WEE 163-А).The data in Table 2 show a high neutralizing activity of hyperimmune antibodies to the homologous strain of Sindbis 1383 clone 3 fever virus and at the same time positive cross-reactions with SV isolates from different geographical regions. This property makes it possible to use antibodies to the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain to identify genetic variants of SV from different geographical regions by immunochemical methods. Monoclonal antibodies also make it possible to differentiate Sindbis viruses in serological reactions [5, 19]. At the same time, such antibodies react in a neutralization reaction with Western encephalomyelitis virus (WEE 163-A).

Предлагаемый штамм содержит три структурных белка: гликопротеины Е1 и Е2 и белок С нуклеокапсида, аминокислотная последовательность которых определяли на основании первичной структуры вирусного генома путем секвенирования.The proposed strain contains three structural proteins: glycoproteins E1 and E2 and protein C of the nucleocapsid, the amino acid sequence of which was determined based on the primary structure of the viral genome by sequencing.

Пример 3. Анализ аминокислотной последовательности белка гликопротеина оболочки вириона Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3.Example 3. The amino acid sequence analysis of the protein of the glycoprotein membrane of the virion E1 strain of Sindbis fever virus 1383 clone 3.

Штамм зарегистрирован в ген-банке (№ MG 679379) и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, обозначенную как envelop 1 (белок Е1), представленную на фиг. 1.The strain is registered in the gene bank (No. MG 679379) and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, designated as envelop 1 (protein E1), shown in FIG. 1.

Белок Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 имеет аминокислотную (аа) последовательность, сходную с белками Е1 «северных» изолятов SV, выделенных в Фенноскандии (ВКЛ, Окельбо, Погоста и др.), (96,1-98,9%) независимо от источника выделения, биологического вида хозяина (комар, птица, человек) и времени выделения вируса, что свидетельствует о сформировавшемся очаге лихорадки Синдбис в Северо-Европейской части Европы. Дивергенция (%) аа-последовательности белка Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 с белком Е1 изолятов SV из Южного Поволжья, Северного Кавказа, Юго-восточной Азии наиболее высока (в зоне 18,2-24,3%).Protein E1 of the Sindbis fever virus strain 1383 clone 3 has an amino acid (aa) sequence similar to E1 proteins of the “northern” SV isolates isolated in Fennoscandia (ON, Okelbo, Pogosta et al.), (96.1-98.9%) regardless of the source of isolation, the biological species of the host (mosquito, bird, human) and the time of virus isolation, which indicates the formed focus of Sindbis fever in the North European part of Europe. Divergence (%) of the aa sequence of the E1 protein of the Sindbis virus strain 1383 clone 3 with protein E1 of SV isolates from the South Volga region, the North Caucasus, and Southeast Asia is highest (in the zone of 18.2-24.3%).

Пример 4. Анализ аминокислотной последовательности белка Е2 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3Example 4. The amino acid sequence analysis of the protein E2 strain of fever virus Sindbis 1383 clone 3

Штамм зарегистрирован в ген-банке (№ MG 679379) и имеет следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, обозначенную как envelop 2 (белок Е2), представленную на фиг. 2.The strain is registered in the gene bank (No. MG 679379) and has the following amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, designated as envelop 2 (protein E2), shown in FIG. 2.

Белок Е2 оболочки вириона штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 выполняет важные функции в морфогенезе и проявлении биологических свойств вириона: как и у других изолятов SV.Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain E2 envelope protein performs important functions in the morphogenesis and manifestation of the biological properties of the virion: as in other SV isolates.

Штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 содержит частично перекрывающиеся участки проникновения вируса в клетку (область ~55 - 110аа), сайты связывания с клеткой (нейтрализуемые эпитопы, область ~ 62 - 209 аа), сайт вирулентности вируса (область ~3 - 170 аа), трансмембранный домен (~350 - 394 аа), С-концевой-эндогенный домен связывания с нуклеокапсидом (~395 - 423аа). Замены в этих участках могут приводить к изменению фенотипических свойств вириона: влиять на эффективность связывания вируса с клеткой (адсорбция), скорость проникновения вируса в клетку, компактность вириона при формировании зрелой частицы.The Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain contains partially overlapping sections of the virus penetration into the cell (region ~ 55 - 110aa), cell binding sites (neutralizable epitopes, region ~ 62 - 209 aa), the virus virulence site (region ~ 3 - 170 aa) , transmembrane domain (~ 350 - 394 aa), C-terminal-endogenous nucleocapsid binding domain (~ 395 - 423aa). Substitutions in these areas can lead to a change in the phenotypic properties of the virion: affect the efficiency of binding of the virus to the cell (adsorption), the rate of penetration of the virus into the cell, and the compactness of the virion during the formation of a mature particle.

Белок Е2 оболочки вириона штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 наиболее сходен с «северными» вариантами SV. Для вирусов ВКЛ, Окельбо, Погоста различия в пределах 3,2% с представленным штаммом, что также указывает на сформировавшийся очаг лихорадки Синдбис в Северо-Западном регионе Европы. В отличие от других «северных» изолятов SV у штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 выявлена замена (глютамин Q55->K лизин) в сайте вирулентности. Данный штамм также имеет уникальную замену (арг. R114 -> S серии) в сайте проникновения вируса в клетку (замены в позициях 55 и 114 выделены на фиг. 2 курсивом и подчеркиванием). Указанные аа-замены можно использовать на этапах культивирования как маркерные.Protein E2 of the coat of the virion of the Sindbis fever virus strain 1383 clone 3 is most similar to the "northern" variants of SV. For viruses ON, Okelbo, Pogosta, the differences are within 3.2% of the presented strain, which also indicates the formed focus of Sindbis fever in the Northwest region of Europe. Unlike other “northern” SV isolates, the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain revealed a replacement (glutamine Q55-> K lysine) at the virulence site. This strain also has a unique substitution (arg. R114 -> S series) at the site of virus penetration into the cell (substitutions at positions 55 and 114 are highlighted in italics and underline in Fig. 2). The indicated aa substitutions can be used at the culture stages as marker ones.

Пример 5. Анализ аминокислотной последовательности белка нуклеокапсида (Core - С) штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3.Example 5. The amino acid sequence analysis of the protein nucleocapsid (Core - C) strain of the Sindbis fever virus 1383 clone 3.

Штамм зарегистрирован в ген-банке (№ MG 679379) и имеет следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, обозначенную как Core-C (белок С) нуклеокапсида, представленную на фиг. 3.The strain is registered in the gene bank (No. MG 679379) and has the following amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, designated as the Core-C (protein C) nucleocapsid shown in FIG. 3.

В N-концевой 1\2части белка С содержится мотив транслокации (nuclear location signal - NLS) этого белка в клеточное ядро (выделен курсивом (фиг. 3)). Это свойство можно рассматривать как перспективный элемент для разработки генно-инженерных конструкций и адресного транспорта полезных белков в клеточное ядро.In the N-terminal 1 \ 2 part of protein C contains the translocation motif (nuclear location signal - NLS) of this protein to the cell nucleus (highlighted in italics (Fig. 3)). This property can be considered as a promising element for the development of genetic engineering constructs and targeted transport of useful proteins into the cell nucleus.

Т.о., выявленная первичная структура белков вириона штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Е2, Е1 и С) имеет высокое сходство с другими изолятами вируса Синдбис (SV), выделенными от человека, птиц и комаров в разных регионах мира и России. Белок Е1 штамма SV 1383 clone 3 обладает высоким сходством с аналогичными белками «северных» изолятов SV Окельбо, Погоста, карельской лихорадки (процент гомологии 96,1-98,9%), независимо от биологического источника и времени выделения вируса (комар, птица, человек). В то же время дивергенция (%) аа-последовательности белка Е1 штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 с белком Е1 изолятов SV из Южного Поволжья, Северного Кавказа, Юго-восточной Азии наиболее высока (в зоне 18,2-24,3%).Thus, the revealed primary structure of the proteins of the virion of the Sindbis virus strain 1383 clone 3 (E2, E1 and C) is highly similar to other Sindbis virus isolates (SV) isolated from humans, birds and mosquitoes in different regions of the world and Russia. Protein E1 of strain SV 1383 clone 3 is highly similar to similar proteins of the “northern” isolates of SV Okelbo, Pogost, Karelian fever (percent homology 96.1-98.9%), regardless of the biological source and time of virus isolation (mosquito, bird, person). At the same time, the divergence (%) of the aa sequence of the E1 protein of the Sindbis virus strain 1383 clone 3 with the E1 protein of the SV isolates from the South Volga region, the North Caucasus, and Southeast Asia is highest (in the zone of 18.2-24.3%) .

Промышленная применимостьIndustrial applicability

Полученный штамм может быть использован для разработки средств диагностики и методов биологической защиты (вакцины и противовирусные препараты), включая испытания «in vitro» новых лекарственных препаратов против других, более патогенных для человека альфавирусов, чем SV, например, вирусов венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ-VEE), восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ-ЕЕЕ) и западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ-WEE). А также для дифференцирования с другими видами альфавирусов, вызывающих заболевания со сходными клиническими проявлениями (например, вирус лихорадки Чикунгунья, вирус лихорадки Росс Ривер и др.).The resulting strain can be used to develop diagnostic tools and biological protection methods (vaccines and antiviral drugs), including in vitro tests of new drugs against other alphaviruses that are more pathogenic for humans than SV, for example, Venezuelan encephalomyelitis viruses of horses (VEL- VEE), Eastern Horse Encephalomyelitis (VESEL-EEE) and Western Horse Encephalomyelitis (ZEL-WEE). And also for differentiation with other types of alphaviruses that cause diseases with similar clinical manifestations (for example, Chikungunya fever virus, Ross River fever virus, etc.).

Полученный штамм вируса лихорадки Синдбис (вирус Синдбис 1383-клон 3 -Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) обладает рядом вирусологических свойств, позволяющих рассматривать его как удобную биотехнологическую модель для получения диагностических и вакцинных препаратов:The obtained strain of Sindbis fever virus (Sindbis virus 1383-clone 3 -Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) has a number of virological properties that make it possible to consider it as a convenient biotechnological model for obtaining diagnostic and vaccine preparations:

- штамм имеет короткий цикл репродукции в клетках (1,5-2 суток) и обладает высокой репродуктивной активностью, что обеспечивает возможность получения большого количества вируса, быстрое и продуктивное накопление штамма вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 в клеточных культурах обеспечивает возможность меньших затрат на этапах разработок,- the strain has a short cycle of reproduction in cells (1.5-2 days) and has a high reproductive activity, which provides the possibility of obtaining a large amount of virus, fast and productive accumulation of the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain in cell cultures provides the possibility of lower costs at the stages development

- штамм вызывает цитопатический эффект (ЦПЭ) в культуре клеток, что позволяет быстро определять оптимальное время накопления вируса,- the strain causes a cytopathic effect (CPE) in the cell culture, which allows you to quickly determine the optimal time of accumulation of the virus,

- инфекционная активность вируса легко определяется простыми методами биологического титрования: по наступлению ЦПЭ в клетках на микропланшетах или путем титрования в монослойной клеточной культуре по бляшкам (БОЕ\мл) под агаровым покрытием,- the infectious activity of the virus is easily determined by simple methods of biological titration: by the onset of CPE in cells on microplates or by titration in a monolayer cell culture by plaques (PFU / ml) under agar coating,

- специфические антитела к этому штамму вируса реагируют в высоких титрах с другими известными штаммами SV, циркулирующими в разных регионах России и в сопредельных странах. Штамм хорошо хранится при минус 70°С.- specific antibodies to this strain of the virus react in high titers with other known strains of SV circulating in different regions of Russia and in neighboring countries. The strain is well stored at minus 70 ° C.

- генетическую «чистоту» штамма можно легко поддерживать путем культивирования штамма в чувствительной клеточной культуре,- the genetic "purity" of the strain can be easily maintained by culturing the strain in a sensitive cell culture,

- препаративные количества вируса можно получить в монослойной или суспензионной клеточной культуре,- preparative amounts of the virus can be obtained in a monolayer or suspension cell culture,

- штамм может быть использован для получения корпускулярной и/или субъединичной вакцины,- the strain can be used to obtain a corpuscular and / or subunit vaccine,

- штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3, как представитель рода альфавирусов, менее патогенен для человека, чем особо опасные альфавирусы восточного, западного и венесуэльского энцефаломиелитов, его более удобно использовать для испытания противовирусных препаратов «in vitro» (в культуре ткани) и «in vivo» (на лабораторных животных) вместо других видов высоко патогенных альфавирусов.- Sindbis fever virus strain 1383 clone 3, as a representative of the genus alphaviruses, is less pathogenic for humans than the especially dangerous alphaviruses of eastern, western and Venezuelan encephalomyelitis, it is more convenient to use it for testing antiviral drugs “in vitro” (in tissue culture) and “in vivo ”(in laboratory animals) instead of other highly pathogenic alpha viruses.

- штамм может быть использован в качестве эффективного генетического вектора.- the strain can be used as an effective genetic vector.

В отличие от других штаммов SV, штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 эффективно размножается в первичных и перевиваемых клеточных линиях, используемых для производственных целей (что позволяет быстро получать большие количества вируса), и обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью.Unlike other SV strains, the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain multiplies efficiently in primary and transplantable cell lines used for production purposes (which makes it possible to quickly obtain large quantities of the virus) and has high immunogenic and antigenic activity.

Полученные сведения о первичной структуре белков вириона SV (С, Е2, Е1) штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 позволяют контролировать фенотип вируса на генетическом уровне (для контроля генетической стабильности вируса при культивировании).The information obtained on the primary structure of the proteins of the virion SV (C, E2, E1) strain of the Sindbis 1383 clone 3 fever virus allows controlling the phenotype of the virus at the genetic level (to control the genetic stability of the virus during cultivation).

Поскольку штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 может быть использован и как генетический вектор для получения новых вариантов в лабораторных условиях (для получения вариантов с новыми свойствами, в том числе более патогенных), сохраняются актуальность создания методов диагностики, необходимость разработки профилактических препаратов и целесообразность текущего мониторинга в приграничных районах РФ. Штамм может быть использован для испытания противовирусных препаратов «in vitro» (в культуре тканей) и «in vivo» (на лабораторных животных).Since the Sindbis 1383 clone 3 fever virus strain can also be used as a genetic vector for obtaining new variants in the laboratory (for obtaining variants with new properties, including more pathogenic ones), the relevance of creating diagnostic methods, the need to develop prophylactic drugs, and the appropriateness of the current monitoring in the border areas of the Russian Federation. The strain can be used to test antiviral drugs "in vitro" (in tissue culture) and "in vivo" (in laboratory animals).

ЛитератураLiterature

1. Львов Д.К. и Урываев Л.В. (2008) «Тогавирусы (Togaviridae)» стр. 217-224 в кн: Медицинская вирусология, 2008, Москва, МИА1. Lvov D.K. and Uryvaev L.V. (2008) “Togaviridae”, pp. 217-224 in the book: Medical Virology, 2008, Moscow, MIA

2. Strauss J.Н a. E.G. Strauss, (1994) The alphaviruses: gene expression, replication and evolution. Microbiol. Rev. 58, 491-5622. Strauss J. H a. E.G. Strauss, (1994) The alphaviruses: gene expression, replication and evolution. Microbiol. Rev. 58, 491-562

3. Griffin D. "Alphaviruses" (2008), in: Fields Virology, 6th ed., editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley pp. 376-4133. Griffin D. "Alphaviruses" (2008), in: Fields Virology, 6th ed., Editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley pp. 376-413

4. Hubalek Z. (2008) Mosquito-borne viruses in Europe. Parasitol. Res. 103 (suppl. 1) 529-5434. Hubalek Z. (2008) Mosquito-borne viruses in Europe. Parasitol. Res. 103 (suppl. 1) 529-543

5. Парасюк H.A., Ионова K.C., Михеева Т.Г., Урываев Л.В.,... (1990) Моноклональные антитела, дифференцирующие вирусы Карельской лихорадки и Синдбис в серологических реакциях. Сб. «Экология вирусов и диагностика арбовирусных инфекций» Москва, 1989, стр. 74-78.5. Parasyuk H.A., Ionova K.C., Mikheeva T.G., Uryvaev L.V., ... (1990) Monoclonal antibodies differentiating Karelian fever and Sindbis viruses in serological reactions. Sat "Ecology of viruses and the diagnosis of arbovirus infections" Moscow, 1989, pp. 74-78.

6. R.J. Kuhn (2008) "Togaviridae", chapter 22, pp. 629-686 Fields Virology, 6th ed., editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley6. R.J. Kuhn (2008) "Togaviridae", chapter 22, pp. 629-686 Fields Virology, 6th ed., Editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley

7. Lundstrom J.O. a. Pfeffer M. (2010). Philogeographic of Sindbid virus and evolutionary history of Sindbis virus. Vector borne Zoonotic Dis. 10, 889-9077. Lundstrom J.O. a. Pfeffer M. (2010). Philogeographic of Sindbid virus and evolutionary history of Sindbis virus. Vector borne Zoonotic Dis. 10, 889-907

8. Kurkela S., Manni Т., Myllenen et al., (2005). Clinical and laboratory manifestation of Sindbis virus infection: prospective study, Finland 2002-2005. J. Infection Dis. 191, 1820-1829,8. Kurkela S., Manni T., Myllenen et al., (2005). Clinical and laboratory manifestation of Sindbis virus infection: prospective study, Finland 2002-2005. J. Infection Dis. 191, 1820-1829,

9. Turunen M., Kuusisto P., Uggeldahl P.E., ToivanenA. (1998) Pogosta disease: clinical observations during an outbreak in the province of North Karelia, Finland. Br. J. Rheumatol., 37, 1177-11809. Turunen M., Kuusisto P., Uggeldahl P. E., Toivanen A. (1998) Pogosta disease: clinical observations during an outbreak in the province of North Karelia, Finland. Br. J. Rheumatol., 37, 1177-1180

10. Kurkela S. et al. (2004) Causative agent of Pogosta disease isolated from blood and skin lesions. Emerg. Infect. Dis. 10, 889-89410. Kurkela S. et al. (2004) Causative agent of Pogosta disease isolated from blood and skin lesions. Emerg. Infect. Dis. 10, 889-894

11. Sane J., Kurkela S., Putkin N., et. al. (2012 Complete coding sequence and molecular epidemiological analysis of Sindbis virus isolates from mosquitoes and humans. J. of General Virology (2012), v. 93, pp. 1984-199011. Sane J., Kurkela S., Putkin N., et. al. (2012 Complete coding sequence and molecular epidemiological analysis of Sindbis virus isolates from mosquitoes and humans. J. of General Virology (2012), v. 93, pp. 1984-1990

12. Skogh M. a. Espmark A. (1982) Ockelbo disease: epidemic arthritis-exantema syndrome in Sweden caused by Sindbis-virus like agent. Lancet 319, 795-77112. Skogh M. a. Espmark A. (1982) Ockelbo disease: epidemic arthritis-exantema syndrome in Sweden caused by Sindbis-virus like agent. Lancet 319, 795-771

13. Львов Д.К., Скворцова T.M., Громашевский В.Л. и др. (1985) Выделение вируса, вызвавшего Карельскую лихорадку, от комаров Aedes sp. Вопросы вирусологии, том 30, стр. 311-31313. Lvov D.K., Skvortsova T.M., Gromashevsky V.L. et al. (1985) Isolation of the virus that caused Karelian fever from mosquitoes Aedes sp. Questions of Virology, Volume 30, pp. 311-313

14. B.S. Graham, J.E. Crowe, J.E. Ledgerwood (2008) Immunization Against Viral Diseases, in: Fields Virology, 6th ed., editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley pp. 376-41314. B.S. Graham, J.E. Crowe, J.E. Ledgerwood (2008) Immunization Against Viral Diseases, in: Fields Virology, 6th ed., Editors- in-chief D.M. Knipe a. P.M. Howley pp. 376-413

15. Kurkela S., Ratti O., Huhtamo E. et al.,(2008) Sindbis virus infection in resident birds, migratory birds, and humans, Finland. Emerg. Infect. Dis. 40, 167-173.15. Kurkela S., Ratti O., Huhtamo E. et al., (2008) Sindbis virus infection in resident birds, migratory birds, and humans, Finland. Emerg. Infect. Dis. 40, 167-173.

16. Frolov I., Hoffman T.A., Pragai A.W. et al. (1996). Alphavirus-based expression vectors: strategies a. applications. Pros. Natl. Acad. Sci. 1996, 93 (21), 11371-1137716. Frolov I., Hoffman T.A., Pragai A.W. et al. (1996). Alphavirus-based expression vectors: strategies a. applications. Pros. Natl. Acad. Sci. 1996, 93 (21), 11371-11377

17. Nenasheva V.V., Kovaleva G.V., Uryvaev L.V., et al., (2015). Enhanced expression of trim 14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunology research, 2015, vol. 62(3), pp. 255-26217. Nenasheva V.V., Kovaleva G.V., Uryvaev L.V., et al., (2015). Enhanced expression of trim 14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunology research, 2015, vol. 62 (3), pp. 255-262

18. Шубладзе A.K. и Гайдамович С.Я., 1958, Практическая вирусология, М. Медицина18. Shubladze A.K. and Gaidamovich S.Ya., 1958, Practical Virology, M. Medicine

19. Патент РФ на изобретение №2242512 «Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей (western encephalomyelitis virus-WEE 163-А) ГКВ №964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов». Заявка №2003116404. Приоритет изобретения 04 июня 2003 г. Урываев Л.В. и др.19. RF patent for the invention No. 2242512 "The strain of the virus of Western encephalomyelitis in horses (western encephalomyelitis virus-WEE 163-A) bills No. 964 for the preparation of diagnostic and prophylactic drugs." Application No. 2003116404. Priority of the invention June 4, 2003 Uryvaev L.V. and etc.

Claims (1)

Штамм вируса лихорадки Синдбис 1383 клон 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России №1273 для разработки средств диагностики и методов биологической защиты, содержащий белок гликопротеина вириона Е1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, белок гликопротеина Е2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 с заменой (глютамин Q55->K лизин) в сайте вирулентности и заменой (арг.R114 ->S серии) в сайте проникновения вируса в клетку, белок С нуклеокапсида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. The strain of the Sindbis fever virus 1383 clone 3 (Sindbis fever virus strain 1383 clone 3) of the State virus collection of the Institute of Virology. DI. Ivanovo Federal State Budgetary Institution Scientific Center N.F. Gamalei »of the Ministry of Health of Russia No. 1273 for the development of diagnostic tools and biological protection methods, containing the E1 virion glycoprotein protein with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, E2 glycoprotein protein with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with replacement (glutamine Q55-> K lysine) at the site of virulence and substitution (arg.R114 -> S series) at the site of penetration of the virus into the cell, protein C of the nucleocapsid with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

Images