RU2719013C1 - Genetic engineering structure for stimulating post-traumatic regeneration of peripheral nerves - Google Patents
Genetic engineering structure for stimulating post-traumatic regeneration of peripheral nerves Download PDFInfo
- Publication number
- RU2719013C1 RU2719013C1 RU2019130023A RU2019130023A RU2719013C1 RU 2719013 C1 RU2719013 C1 RU 2719013C1 RU 2019130023 A RU2019130023 A RU 2019130023A RU 2019130023 A RU2019130023 A RU 2019130023A RU 2719013 C1 RU2719013 C1 RU 2719013C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasmid
- pncure
- cells
- nerve
- dna
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтики, и может быть использовано для стимуляции восстановления периферической иннервации после травматического повреждения. Изобретение представляет собой плазмидную бицистронную конструкцию, одновременно несущую по одной копии нуклеотидной последовательности, кодирующей: мозговой нейротрофический фактор (BDNF), стимулирующий рост аксонов, формирование сосудов, кровоснабжающих нерв, выживание мотонейронов, лишенных травмой иннервируемых ими мишеней; и активатор плазминогена урокиназного типа или урокиназу (uPA), как активирующий факторы роста и нейротрофины, так и самостоятельно стимулирующий необходимые для регенерации процессы - клеточную миграцию и клеточную пролиферацию. Последовательность расположения участков, кодирующих BDNF и uPA - BDNF перед uPA и разделяющая их последовательность IRES-HCV обеспечивают необходимую преимущественную экспрессию BDNF. uPA экспрессируется в количестве примерно в 10 раз меньшем, чем BDNF.The invention relates to the field of biotechnology and pharmaceuticals, and can be used to stimulate the restoration of peripheral innervation after traumatic injury. The invention is a plasmid bicistronic construct, simultaneously carrying one copy of the nucleotide sequence encoding: cerebral neurotrophic factor (BDNF), stimulating axon growth, the formation of blood vessels supplying the nerve, the survival of motor neurons lacking trauma to the targets they innervate; and an urokinase-type plasminogen activator or urokinase (uPA), both activating growth factors and neurotrophins, as well as independently stimulating the processes necessary for regeneration — cell migration and cell proliferation. The sequence of location of the sites encoding BDNF and uPA - BDNF before uPA and the IRES-HCV sequence separating them provide the necessary preferential expression of BDNF. uPA is expressed in an amount of about 10 times less than BDNF.
Изобретение может быть использовано для приготовления лекарственного средства для стимуляции восстановления иннервации после травматического повреждения периферических нервов.The invention can be used to prepare a medicinal product to stimulate the restoration of innervation after traumatic damage to the peripheral nerves.
Уровень техникиState of the art
Разработка способов и средств регенерация тканей и органов является актуальной биомедицинской задачей. Различные травмы, заболевания, хирургические вмешательства часто сопровождаются повреждением нервов. Данная проблема затрагивает миллионы людей по всему миру, в том числе трудоспособное население и не редко приводит к инвалидности когнитивного, моторного или психотического характера, что ведет к снижению качества жизни, а также вызывает социальные и экономические проблемы [Afsoun Seddighi, Amir Nikouei, Amir Saied Seddighi, Ali Reza Zali, Seyed Mahmood Tabatabaei, Ali Reza Sheykhi, Fatemeh Yourdkhani, Shoayb Naeimian. Peripheral Nerve Injury: A Review Article. International Clinical Neuroscience Journal Vol 3, No 1, p. 1-6. JTS Pettikiriarachchi, CL Parish, MS Shoichet, JS Forsythe, DR Nisbet. Biomaterials for brain tissue engineering. Australian journal of chemistry 63 (8), 1143-1154.]. По данным 2015 года повреждения периферических нервов встречаются у 13-23 пациентов из 100 000 и представляют одну из основных проблем современной травматологии и неврологии.The development of methods and means for the regeneration of tissues and organs is an urgent biomedical task. Various injuries, diseases, surgical interventions are often accompanied by nerve damage. This problem affects millions of people around the world, including the able-bodied population and often leads to disabilities of a cognitive, motor or psychotic nature, which leads to a decrease in the quality of life, and also causes social and economic problems [Afsoun Seddighi, Amir Nikouei, Amir Saied Seddighi, Ali Reza Zali, Seyed Mahmood Tabatabaei, Ali Reza Sheykhi, Fatemeh Yourdkhani, Shoayb Naeimian. Peripheral Nerve Injury: A Review Article. International Clinical Neuroscience Journal
[Karp, J., Dalton, P., & Shoichet, M. (2003). Scaffolds for Tissue Engineering. MRS Bulletin, 28(4), 301-306. doi:10.1557/mrs2003.85]. Этиология травмам периферических нервов включает в себя проникающие травмы, сдавливание, вытягивание, ишемию и менее распространенные механизмы, такие как тепловой, электрический шок, излучение, перкуссия и вибрация [Afsoun Seddighi, Amir Nikouei, Amir Saied Seddighi, Ali Reza Zali, Seyed Mahmood Tabatabaei, Ali Reza Sheykhi, Fatemeh Yourdkhani, Shoayb Naeimian. Peripheral Nerve Injury: A Review Article. International Clinical Neuroscience Journal Vol 3, No 1, p. 1-6.]. Поврежденные нервы периферической нервной системы обладают способностью к регенерации. Однако спонтанная регенерация нерва при отсутствии какого-либо медицинского вмешательства чаще всего не приводит к регенерации поврежденного или утраченного участка нерва и восстановлению иннервации травмированных тканей. Хирургическое вмешательство, при котором проводится пространственное совмещение концов разорванного/пересеченного нерва посредством сшивания его концов с (или без) использованием трансплантатов, также часто не приводит к восстановлению функций. Нейриты перестают расти, не достигая иннервируемых мишеней и в местах остановки роста формируются невриномы. Дополнительными ограничениями являются: длина необходимого трансплантата, недостаток донорского материала, возможность развития различных заболеваний, образованием невриномы, рубцевание [Karp, J., Dalton, Р., & Shoichet, М. (2003). Scaffolds for Tissue Engineering. MRS Bulletin, 28(4), 301-306. doi:10.1557/mrs2003.85]. Использование аллогенных трансплантатов, может вызывать иммунный ответ [J.M. Karp, P.D. Dalton, M.S. Shoichet, F. Cahn. Scaffolds for Tissue Engineering. MRS BULLETIN. April 2003, pp. 301-306]. Активно разрабатываются подходы стимуляции и восстановления периферической иннервации за счет обеспечения определенных органов, тканей и их отдельных зон необходимыми полипептидными продуктами (гормонами, ферментами, ростовыми факторами и т.д.), при этом наиболее перспективным подходом считается применение векторных конструкций, включающих гены, которые кодируют нужные белки, являющиеся ключевыми факторами, стимулирующими рост нервов и восстановление периферической иннервации.[Karp, J., Dalton, P., & Shoichet, M. (2003). Scaffolds for Tissue Engineering. MRS Bulletin, 28 (4), 301-306. doi: 10.1557 / mrs2003.85]. The etiology of peripheral nerve injuries includes penetrating injuries, squeezing, traction, ischemia and less common mechanisms such as heat, electric shock, radiation, percussion and vibration [Afsoun Seddighi, Amir Nikouei, Amir Saied Seddighi, Ali Reza Zali, Seyed Mahmood Tabatabei , Ali Reza Sheykhi, Fatemeh Yourdkhani, Shoayb Naeimian. Peripheral Nerve Injury: A Review Article. International Clinical Neuroscience Journal
Из уровня техники известен способ стимуляции регенеративных процессов в ишемизированных тканях, включающий введение в организм больного среды культивирования стромальных клеток из жировой ткани человека, содержащей факторы роста VEGF, HGF, ангиопоэтин и ангиогенин для эффективного стимулирования регенеративных процессов в ишемизированных тканях [RU 2497529, 10.11.2013].The prior art method for stimulating regenerative processes in ischemic tissues, including the introduction into the patient's body of a culture medium for culturing stromal cells from human adipose tissue, containing growth factors VEGF, HGF, angiopoietin and angiogenin to effectively stimulate regenerative processes in ischemic tissues [RU 2497529, 10.11. 2013].
Также из уровня техники известен способ получения зрелых человеческих нейротрофических белков семейства NGF/BDNF, которые полностью биологически активны. Кроме того, раскрыт ген, кодирующий человеческий BDNF.Also known from the prior art is a method for producing mature human neurotrophic proteins of the NGF / BDNF family, which are fully biologically active. In addition, a gene encoding human BDNF is disclosed.
Доказано, что нейротрофические факторы могут быть полезными при лечении дегенерации нервных клеток и потери дифференцированной функции, которая происходит при различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера или Паркинсона, либо после таких травматических повреждений, как инсульт или физическая травма спинного мозга [US 5235043, 10.08.1993].It has been proven that neurotrophic factors can be useful in the treatment of nerve cell degeneration and the loss of differentiated function that occurs in various neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's or Parkinson’s disease, or after traumatic injuries such as stroke or physical injury to the spinal cord [US 5235043, 10.08 .1993].
Из уровня техники известен способ стимуляции восстановления иннервации поврежденной ткани с помощью введения в область повреждения векторной конструкции, обеспечивающей высокий уровень экспрессии фактора, участвующего в процессе регенерации нерва, который заключается в том, что в поврежденную мышцу вводят терапевтически эффективное количество рекомбинантной плазмиды с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: l, которая содержит модифицированную нуклеотидную последовательность, кодирующую BDNF человека, и последовательность Козак, в качестве плазмидного вектора использован pVax1 Invitrogen [RU 2538621, 10.01.2015]. Данный способ позволяет ускорить восстановление структуры и проводимости периферических нервов после травм, путем трансфекции мышц, иннервируемых поврежденным нервом, плазмидной конструкцией, кодирующей мозговой нейротрофический фактор (BDNF). Недостатком указанного способа можно отметить то, что данная плазмида вызывает повышение локальной продукции только одного из нейротрофических факторов - BDNF. Белок с данной плазмиды считывается в виде предшественника, что необходимо для его правильного созревания. Для реализации нейротрофической активности предшественник должен подвергнуться протеолитической активации, без которой он вместо поддержки выживания нейронов стимулирует их гибель.The prior art method for stimulating the restoration of the innervation of damaged tissue by introducing into the area of damage a vector construct that provides a high level of expression of a factor involved in the process of nerve regeneration, which consists in injecting a therapeutically effective amount of a recombinant plasmid with the nucleotide sequence SEQ into the damaged muscle ID NO: l, which contains a modified nucleotide sequence encoding a human BDNF, and a Kozak sequence, in pVax1 Invitrogen was used as a plasmid vector [RU 2538621, 01/10/2015]. This method allows to accelerate the restoration of the structure and conductivity of peripheral nerves after injuries, by transfecting the muscles innervated by the damaged nerve with a plasmid construct encoding brain neurotrophic factor (BDNF). The disadvantage of this method can be noted that this plasmid causes an increase in local production of only one of the neurotrophic factors - BDNF. The protein from this plasmid is read in the form of a precursor, which is necessary for its proper maturation. To realize neurotrophic activity, the precursor must undergo proteolytic activation, without which it instead of supporting the survival of neurons stimulates their death.
Из уровня техники известен способ стимуляции восстановления иннервации поврежденной ткани у млекопитающих с помощью введения в область повреждения векторной конструкции, обеспечивающей высокий уровень экспрессии фактора, участвующего в процессе регенерации нерва, заключающийся в том, что в поврежденную мышцу вводят терапевтически эффективное количество рекомбинантной плазмиды, содержащей плазмидный вектор pVax1 со встроенным по сайтам рестрикции EcoRI и EcoRV фрагментом ДНК, кодирующим оптимизированную для экспрессии в клетках млекопитающих урокиназу, содержащий последовательность Козак, слитую с модифицированным геном урокиназы, характеризующуюся нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, рекомбинантная плазмида, предназначенная для экспрессии гена урокиназы в клетках млекопитающих, содержащая плазмидный вектор pVaxl со встроенным по сайтам рестрикции EcoRI и EcoRV фрагментом ДНК, кодирующим оптимизированную для экспрессии в клетках млекопитающих урокиназу, содержащим последовательность Козак, слитую с модифицированным геном урокиназы, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID N0:1, а также фрагмент ДНК, кодирующий оптимизированную для экспрессии в клетках млекопитающих урокиназу, содержащий последовательность Козак, слитую с модифицированным геном урокиназы, и характеризующийся нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2 [RU 2563541, 20.09.2015]. Известный способ позволяет ускорить восстановление структуры и проводимости периферических нервов после травм и ишемии путем трансфекции мышц, иннервируемых поврежденным нервом. Недостатком данного способа можно указать то, что данная плазмида кодирует только урокиназу, которая, несмотря на то что обладает способностью стимулировать процессы регенерации не обладает собственными нейротрофическими эффектами и может лишь активировать эндогенные нейротрофины, экспрессия которых при травматическом повреждении недостаточна для обеспечения эффективной реиннервации.The prior art method for stimulating the restoration of the innervation of damaged tissue in mammals by introducing into the damage region a vector construct that provides a high level of expression of a factor involved in the process of nerve regeneration, which consists in introducing a therapeutically effective amount of a recombinant plasmid containing plasmid into the damaged muscle pVax1 vector with a DNA fragment integrated at the EcoRI and EcoRV restriction sites encoding optimized for expression in mammalian cells urokinase containing the Kozak sequence fused to the modified urokinase gene, characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, a recombinant plasmid designed for expression of the urokinase gene in mammalian cells, containing the pVaxl plasmid vector with the EcoRI and EcoRV fragment inserted at the restriction sites DNA encoding an optimized urokinase expression for mammalian cells containing a Kozak sequence fused to a modified urokinase gene characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID N0: 1, as well as a DNA fragment encoding an optimized urokinase for expression in mammalian cells, containing the Kozak sequence fused to the modified urokinase gene, and characterized by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 [RU 2563541 September 20, 2015]. The known method allows to accelerate the restoration of the structure and conductivity of peripheral nerves after injuries and ischemia by transfection of the muscles innervated by the damaged nerve. The disadvantage of this method is that this plasmid encodes only urokinase, which, although it has the ability to stimulate regeneration processes, does not have its own neurotrophic effects and can only activate endogenous neurotrophins whose expression during traumatic injury is insufficient to ensure effective reinnervation.
Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения является способ стимуляции восстановления периферической иннервации ткани после травмы, заключающийся во введении терапевтически эффективного количества (1) плазмидного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую BDNF, или (2) плазмидного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую uPA дикого типа (NM 002658), или их комбинации (3), или (4) комбинации плазмидного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую BDNF с плазмидным вектором, содержащим оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую хемокин, продуцируемый стромальными клетками SDF-1 [RU 2486918, 10.07.2013]. Известный способ позволяет ускорить восстановление структуры и проводимости периферических нервов после травм за счет локального увеличения продукции нейротрофических факторов. При этом указывается, что комбинация (1:1 по весу кДНК) плазмид pVax1-BDNFopt + pVax1-uPA обеспечивает дополнительное 1,5-2-кратное (в сравнении с экспрессией только BDNF или uPA) ускорение восстановления проводимости и структуры нерва, а, следовательно, и иннервации соответствующих скелетных мышц.The closest analogue (prototype) of the present invention is a method of stimulating the restoration of peripheral tissue innervation after injury, which consists in introducing a therapeutically effective amount of (1) a plasmid vector containing a nucleotide sequence encoding a BDNF, or (2) a plasmid vector containing a nucleotide sequence encoding a human wild-type uPA (NM 002658), or combinations thereof (3), or (4) combinations of a plasmid vector containing a nucleotide sequence encoding BDNF with a plasmid vector containing an optimized nucleotide sequence encoding a chemokine produced by SDF-1 stromal cells [RU 2486918, 07/10/2013]. The known method allows to accelerate the restoration of the structure and conductivity of peripheral nerves after injuries due to a local increase in the production of neurotrophic factors. It is indicated that the combination (1: 1 by weight of cDNA) of plasmids pVax1-BDNFopt + pVax1-uPA provides an additional 1.5-2-fold (in comparison with expression of only BDNF or uPA) acceleration of restoration of nerve conduction and structure, and, consequently, the innervations of the corresponding skeletal muscles.
Однако в случае применения смеси плазмид не гарантирована их скоординированная работа. Проникновение плазмид имеющих разную массу и разную последовательность вставки в ткани происходит независимо, их активность регулируется и реализуется в разных клетках также независимо и поэтому невозможно достигнуть оптимального соотношения экспрессирующихся в тканях белков и поэтому невозможно достигнуть максимальной эффективности структуры и функциональной активности поврежденных периферических нервов.However, in the case of using a mixture of plasmids, their coordinated work is not guaranteed. The penetration of plasmids having different masses and different insertion sequences into tissues occurs independently, their activity is regulated and realized in different cells also independently, and therefore it is impossible to achieve the optimal ratio of proteins expressed in tissues, and therefore it is impossible to achieve maximum efficiency of the structure and functional activity of damaged peripheral nerves.
Таким образом, с учетом накопленных данных, существует потребность в разработке генно-инженерных конструкций нового поколения для создания эффективных генотерапевтических препаратов для стимуляции восстановления структуры и функциональной активности периферических нервов после травматических повреждений.Thus, taking into account the accumulated data, there is a need to develop a new generation of genetically engineered constructs to create effective gene therapy drugs to stimulate the restoration of the structure and functional activity of peripheral nerves after traumatic injuries.
Раскрытие изобретенияDisclosure of Invention
Техническим результатом заявляемого изобретения является скоординированная локализованная экспрессия двух белков с достижением оптимального соотношения продукции рекомбинантного human-BDNF и продукции human-uPA. BDNF экспрессируется в количестве, на порядок большем, чем uPA, при этом достигается продукция рекомбинантного human-BDNF не менее 70 нг/мл и продукция human-uPA не менее 9 нг/мл кондиционированной среды при минимально возможном увеличении размера плазмиды (не более 5.5 тыс. п.н.). Данное соотношение human-BDNF и human-uPA является более предпочтительным, чем соотношение, возникающее при трансфекции отдельными плазмидами, поскольку избыток human-uPA может привести к избыточной активации ММП и повреждению/аутолизу ткани. Оптимальное соотношение продукции human-BDNF и human-uPA обеспечивается благодаря наличию в составе генетической конструкции IRES (internal ribosome entry site) вируса гепатита С, который обеспечивает продукцию первого белка на порядок более высокую, чем второго белка. К преимуществам данной генетической конструкции, помимо наличия IRES можно отнести:The technical result of the claimed invention is the coordinated localized expression of two proteins with the achievement of the optimal ratio of the production of recombinant human-BDNF and human-uPA production. BDNF is expressed in an amount an order of magnitude greater than uPA, with the production of recombinant human-BDNF of at least 70 ng / ml and the production of human-uPA of at least 9 ng / ml of conditioned medium with the smallest possible increase in plasmid size (not more than 5.5 thousand bp). This ratio of human-BDNF and human-uPA is more preferable than the ratio arising from transfection with individual plasmids, since an excess of human-uPA can lead to excessive activation of MMP and damage / autolysis of the tissue. The optimal ratio of human-BDNF to human-uPA production is ensured by the presence of the hepatitis C virus in the IRES (internal ribosome entry site) genetic construct, which provides the production of the first protein an order of magnitude higher than the second protein. The advantages of this genetic construct, in addition to the presence of IRES, include:
1. Наличие SV40 энхансера, встроенного между промотором и энхансером цитомегаловируса. Добавление этой последовательности было призвано увеличить активный транспорт плазмиды в ядро целевой клетки, за счет распознавания SV40 энхансера множеством транскрипционных факторов.1. The presence of SV40 enhancer, inserted between the promoter and enhancer of the cytomegalovirus. The addition of this sequence was intended to increase the active transport of the plasmid into the nucleus of the target cell, due to the recognition of the SV40 enhancer by a variety of transcription factors.
2. Короткого искусственного интрона (КИИ), который призван усилить транспорт бицистронной мРНК в цитоплазму клетки. Добавление этой последовательности (~100 п.н.) в плазмиду перед старт-кодоном human-BDNF увеличило продукцию белков human-BDNF и human-uPA. Это было подтверждено экспериментально: 70 нг/мл human-BDNF в кондиционированной среде для плазмиды с КИИ и 55 нг/мл human-BDNF в кондиционированной среде для плазмиды без КИИ.2. A short artificial intron (CII), which is designed to enhance the transport of bicistronic mRNA into the cell cytoplasm. Adding this sequence (~ 100 bp) to the plasmid before the start codon of human-BDNF increased the production of human-BDNF and human-uPA proteins. This was confirmed experimentally: 70 ng / ml human-BDNF in conditioned medium for plasmid with KII and 55 ng / ml human-BDNF in conditioned medium for plasmid without KII.
3. В качестве вставки в сконструированной плазмиде pNCure были использованы природные кДНК генов мозгового нейротрофического фактора и активатора плазминогена урокиназного типа человека, полученные из культуры мезенхимных стромальных клеток подкожного жира здорового донора методом обратной транскрипции (RT-PCR).3. As an insert in the constructed plasmid pNCure, natural cDNAs of genes of the brain neurotrophic factor and plasminogen activator of human urokinase type obtained from the culture of healthy donor subcutaneous fat mesenchymal stromal cells by RT-PCR were used.
Технический результат также достигается лекарственной формой, содержащей в качестве активного компонента заявляемую генотерапевтическую конструкцию и фармацевтически приемлемые растворители для парентерального введения, стабилизаторы и консерванты.The technical result is also achieved by a dosage form containing, as an active component, the inventive gene therapy construct and pharmaceutically acceptable solvents for parenteral administration, stabilizers and preservatives.
Также технический результат достигается способом стимуляции локальной экспрессии мозгового нейротрофического фактора и активатора плазминогена урокиназного типа в периневральных тканях в области травмы, включающий введение лекарственной формы, содержащей генотерапевтическую конструкцию, в терапевтически-эффективном количестве. При этом введение лекарственной формы осуществляют путем единомоментной (разовой) многоточечной периневральной внутримышечной инъекции в области травмы нерва, повторяемой от 3 до 5 раз с периодичностью 1 раз в 2-4 недели до достижения терапевтического эффекта.The technical result is also achieved by the method of stimulating local expression of the cerebral neurotrophic factor and the urokinase type plasminogen activator in the perineural tissues in the area of the injury, comprising administering a dosage form containing the gene therapy construct in a therapeutically effective amount. In this case, the administration of the dosage form is carried out by a single (single) multipoint perineural intramuscular injection in the area of a nerve injury, repeated from 3 to 5 times with a frequency of 1 time in 2-4 weeks until the therapeutic effect is achieved.
Технический результат также достигается применением заявляемой генотерапевтической конструкции в качестве генотерапевтического средства для лечения травм периферических нервов.The technical result is also achieved by using the inventive gene therapy design as a gene therapy agent for treating peripheral nerve injuries.
При этом кДНК hBDNF встроена в модифицированную, оптимизированную плазмиду сконструированную на основе pVax1 сразу после промотора CMV и консенсусной последовательности Козак (GCCACC) с использованием сайтов рестрикции NheI и HindIII. кДНК huPA (клонированная с использованием сайтов рестрикции Асс651 и EagI) отделена от hBDNF с помощью IRES HCV [Lukavsky PJ. Structure and function of HCV IRES domains. Virus Res. 2009; 139(2): 166-71], собранного из синтетических олигонуклеотидов (амплифицированных с помощью ПЦР и клонированных с использованием сайтов рестрикции HindIII и Acc65I). Каждая кДНК несет свои собственные стартовый и стоп-кодоны.At the same time, hBDNF cDNA was inserted into a modified, optimized plasmid constructed on the basis of pVax1 immediately after the CMV promoter and Kozak consensus sequence (GCCACC) using the NheI and HindIII restriction sites. huPA cDNA (cloned using Ass651 and EagI restriction sites) was separated from hBDNF using IRES HCV [Lukavsky PJ. Structure and function of HCV IRES domains. Virus Res. 2009; 139 (2): 166-71] assembled from synthetic oligonucleotides (amplified by PCR and cloned using HindIII and Acc65I restriction sites). Each cDNA carries its own start and stop codons.
Основные элементы конструкции:The main structural elements:
Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coli:Regulatory elements of expression and translation of the construct in E. coli bacteria:
В использованный вектор сконструированный на основе pVaxl были внесены следующие изменения:The following changes were made to the pVaxl-based vector used:
- исходно присутствующий в векторе pVax1 ген устойчивости к канамицину заменен на гомологичный,- the kanamycin resistance gene originally present in the pVax1 vector is replaced by a homologous gene,
- в промоторную область вектора pVax1 добавлена ранее отсутствовавшая там последовательность энхансера SV40, призванная улучшить транспорт плазмиды в ядро,- in the promoter region of the vector pVax1 added previously missing there sequence of the SV40 enhancer, designed to improve plasmid transport to the nucleus,
перед вставкой, кодирующей терапевтические белки, был добавлен искусственный интрон (который способствовал увеличению продукции целевых белков более, чем на 30%).an artificial intron (which contributed to an increase in the production of target proteins by more than 30%) was added before the insert encoding therapeutic proteins.
- между целевыми вставками был помещен сайт внутренней посадки рибосомы вируса гепатита С (IREShcv), который обеспечивает эффективное считывание обоих лекарственных белков с преобладанием экспрессии первого белка по сравнению со вторым примерно на порядок. Возможно использование функционально аналогичных последовательностей IRES (вирусных, прокариотических и эукариотических сайтов внутренней посадки рибосомы)- between the target inserts was placed the site of the internal landing of the ribosome of the hepatitis C virus (IREShcv), which provides an efficient reading of both drug proteins with a predominance of expression of the first protein compared to the second by about an order of magnitude. It is possible to use functionally similar IRES sequences (viral, prokaryotic and eukaryotic sites of the internal landing of the ribosome)
Комбинацию использованных в генетической конструкции энхансера SV40, с коротким искусственным интроном и КИИ, и с сайтом внутренней посадки рибосомы вируса гепатита С (IREShcv) можно рассматривать как неотъемлемые характеристические свойства созданной плазмиды.The combination of the SV40 enhancer used in the genetic design, with a short artificial intron and CII, and with the hepatitis C virus ribosome internal landing site (IREShcv) can be considered as integral characteristic properties of the created plasmid.
Для реализации данного изобретения потенциально могут быть использованы любые терапевтические вектора и др. плазмиды, отвечающие следующим требованиям: небольшой размер, наличие последовательности, обеспечивающей селекцию, высокая копийность на этапе наработки, пригодность для экспрессии белков в эукариотических клеточных системах.For the implementation of this invention, any therapeutic vectors and other plasmids can potentially be used that meet the following requirements: small size, the presence of a sequence that allows selection, high copy number at the time of production, and suitability for the expression of proteins in eukaryotic cell systems.
Любой из функциональных элементов может быть заменен на существующий (из других генетических конструкций) или заново синтезированный.Any of the functional elements can be replaced by an existing one (from other genetic constructs) or newly synthesized.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Изобретение поясняется следующими чертежами.The invention is illustrated by the following drawings.
На фиг. 1 показано содержание hBDNF и huPA в кондиционированной среде после трансфекции HEK293 вариантами плазмиды pNCure.In FIG. 1 shows the content of hBDNF and huPA in a conditioned medium after transfection with HEK293 variants of the plasmid pNCure.
На фиг. 2 представлен обобщенный механизм действия плазмиды pNCure.In FIG. 2 presents a generalized mechanism of action of the plasmid pNCure.
На фиг. 3 представлена структура плазмидной ДНК pNCure, кодирующей пробелки мозгового нейротрофического фактора человека (human-proBDNF) и активатора плазминогена урокиназного типа человека (human-uPA).In FIG. Figure 3 shows the structure of pNCure plasmid DNA encoding human brain neurotrophic factor (human-proBDNF) and human urokinase type plasminogen activator (human-uPA) plasmogen DNA.
На фиг. 4 представлено обоснование преимущества многоточечного режима введения лекарственного средства. Введение в несколько точек обеспечивает более высокий уровень экспрессии трансгенов по сравнению с введением препарата в одну точку (окрашивание b-галактозидазой - верхние панели и левая нижняя панель, 100х, n=3; иммуноферментный анализ экспрессии трансгенов - нижняя средняя и правая панели).In FIG. 4 presents the rationale for the benefits of a multi-point regimen of drug administration. The introduction at several points provides a higher level of transgene expression compared to the administration of the drug at one point (staining with b-galactosidase - upper panels and lower left panel, 100x, n = 3; enzyme immunoassay for transgene expression - lower middle and right panels).
На фиг. 5 показано стимулирующее влияние BDNF и uPA на дифференцировку клеток Neuro2a в нейральном направлении, выражающееся в изменениях морфологии клеток. pVax - среда культивирования НЕК293 клеток, трансфицированных контрольной плазмидой; pNCure - среда культивирования НЕК293 клеток, трансфицированных плазмидой, содержащей BDNF и uPA; 1% ФБС - среда культивирования клеток, содержащая 1% ФБС, положительный контроль; 10% ФБС - среда культивирования клеток, содержащая 10% ФБС, отрицательный контроль.In FIG. Figure 5 shows the stimulating effect of BDNF and uPA on the differentiation of Neuro2a cells in the neural direction, expressed in changes in cell morphology. pVax — medium for culturing HEK293 cells transfected with a control plasmid; pNCure - HEK293 culture medium transfected with a plasmid containing BDNF and uPA; 1% PBS - cell culture medium containing 1% PBS, positive control; 10% FBS - cell culture medium containing 10% FBS, negative control.
На фиг. 6 представлены результаты статистического анализа влияния продуцируемых клетками НЕК293, трансфицированных плазмидой pNCure нейротрофических факторов (BDNF и uPA) на число клеток, формирующих нейриты на in vitro модели нейральной дифференцировки клеток Neuro2a. pVax - среда культивирования НЕК293 клеток, трансфицированных контрольной плазмидой; pNCure -среда культивирования НЕК293 клеток, трансфицированных плазмидой, содержащей BDNF и uPA; 1% ФБС - среда культивирования клеток, содержащая 1% ФБС, положительный контроль; 10% ФБС - среда культивирования клеток, содержащая 10% ФБС, отрицательный контроль. Статистический обсчет нейритов в одиннадцати случайно выбранных полях зрения трех лунок. Представлены результаты 4-х независимых экспериментов, * и **р<0,05 по сравнению с группой pVax, N=11.In FIG. Figure 6 presents the results of a statistical analysis of the effect produced by HEK293 cells transfected with plasmid pNCure neurotrophic factors (BDNF and uPA) on the number of cells forming neurites in an in vitro model of neural differentiation of Neuro2a cells. pVax — medium for culturing HEK293 cells transfected with a control plasmid; pNCure medium for culturing HEK293 cells transfected with a plasmid containing BDNF and uPA; 1% PBS - cell culture medium containing 1% PBS, positive control; 10% FBS - cell culture medium containing 10% FBS, negative control. Statistical calculation of neurites in eleven randomly selected fields of view of three holes. The results of 4 independent experiments are presented, * and ** p <0.05 compared with the pVax group, N = 11.
На фиг. 7 представлены результаты анализа влияния продуцируемых клетками НЕК293, трансфицированных плазмидой pNCure нейротрофических факторов (BDNF и uPA) на формирование нейритов на модели эксплантов спинальных ганглиев мыши в Матригеле, сделанные на 4-е сутки. pVax - среда культивирования HEK293 клеток, трансфицированных контрольной плазмидой. Стрелками обозначены мигрирующие клетки (панель pVax); или отрастающие аксоны (на панели pNCure). На нижней панели представлены увеличенные области, демонстрирующие мигрирующие клетки (панель pVax) и регенерирующие аксоны (панель pNCure).In FIG. Figure 7 presents the results of the analysis of the effect of HEK293 cells transfected with plasmid pNCure of neurotrophic factors (BDNF and uPA) on the formation of neurites in the mouse spinal ganglia explant model in Matrigel made on the 4th day. pVax is a culture medium for HEK293 cells transfected with a control plasmid. Arrows indicate migrating cells (pVax panel); or growing axons (in the pNCure panel). The lower panel shows enlarged areas showing migrating cells (pVax panel) and regenerating axons (pNCure panel).
На фиг. 8 показано влияние продуцируемых клетками НЕК293, трансфицированных плазмидой pNCure нейротрофических факторов (BDNF и uPA), на миграцию клеток из эксплантов спинальных ганглиев мыши в Матригель. Ядра клеток окрашены DAPI. Белой прерывистой линией обозначена граница экспланта; стрелками указан путь миграции клеток из эксплантов в Матригель. На верхней панели результаты использования кондиционированной среды клеток НЕК293, трансфецированных контрольной плазмидой pVax. На нижней панели результаты использования кондиционированной среды клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой pNCure, продуцирующей нейротрофические факторы (BDNF и uPA).In FIG. Figure 8 shows the effect of NEK293 cells transfected with plasmid pNCure of neurotrophic factors (BDNF and uPA) produced on cell migration from mouse spinal ganglia explants to Matrigel. Cell nuclei stained with DAPI. A white dashed line indicates the border of the explant; arrows indicate the path of cell migration from explants to Matrigel. The upper panel shows the results of using the conditioned medium of HEK293 cells transfected with the control plasmid pVax. The bottom panel shows the results of using the conditioned medium of HEK293 cells transfected with the pNCure plasmid producing neurotrophic factors (BDNF and uPA).
На фиг. 9 показано влияние генетической конструкции pNCure в дозах 60 мкг (pNCure_1) и 120 мкг (pNCure_2) мкг на восстановление функции поврежденного общего малоберцового нерва. Амплитуда суммарного потенциала действия нерва отражает число активных нейритов в нерве. Электрофизиологическое исследование амплитуды СПДН на 24 сутки эксперимента. Значения представлены в виде медианы и процентилей 25% и 75% (* - п>5; р<0.05 по сравнению с группой "-К").In FIG. Figure 9 shows the effect of the pNCure genetic construct at doses of 60 μg (pNCure_1) and 120 μg (pNCure_2) μg on the restoration of the function of the damaged common fibular nerve. The amplitude of the total potential action of the nerve reflects the number of active neurites in the nerve. Electrophysiological study of the amplitude of SPDN on the 24th day of the experiment. Values are presented as medians and percentiles 25% and 75% (* - n> 5; p <0.05 compared with the “-K” group).
На фиг. 10 показано влияние генетической конструкции pNCure в дозах 60 мкг (pNCure_1) и 120 мкг (pNCure_2) мкг на восстановление функции поврежденного общего малоберцового нерва. Латентный период СПДН обратно пропорционален скорости проведения импульса по нерву. Электрофизиологическое исследование латентного периода СПДН через 24 суток после начала эксперимента. Значения представлены в виде медианы и процентилей 25% и 75% (n>5).In FIG. Figure 10 shows the effect of the pNCure genetic construct at doses of 60 μg (pNCure_1) and 120 μg (pNCure_2) μg on the restoration of function of the damaged common fibular nerve. The latent period of LDS is inversely proportional to the speed of the impulse along the nerve. Electrophysiological study of the latent period of SPDN 24 days after the start of the experiment. Values are presented as medians and percentiles 25% and 75% (n> 5).
На фиг. 11 представлены данные подтверждающие достоверное увеличение количества аксонов на 24-е сутки от начала эксперимента при введении генетической конструкции pNCure. На верхних панелях показаны поперечные срезы нерва с окрашенными нейритами. Данные представлены виде медианы и процентилей 25% и 75%. Пунктиром отмечено соответствующее значение для интактного нерва (n>5, p<0.05 по сравнению с группой "-К").In FIG. 11 presents data confirming a significant increase in the number of axons on the 24th day from the start of the experiment with the introduction of the pNCure genetic construct. The upper panels show transverse sections of a nerve with stained neurites. Data are presented as medians and percentiles 25% and 75%. The dashed line marks the corresponding value for the intact nerve (n> 5, p <0.05 compared with the “-K" group).
На фиг. 12 представлены результаты, подтверждающие локальный характер экспрессии лекарственного белка в ткани экспериментального животного. Иммуноферментный анализ образцов тканей мыши, подвергшейся инъекции генетической конструкции, на содержание рекомбинантного мозгового нейротрофического фактора человека.In FIG. 12 presents the results confirming the local nature of the expression of the drug protein in the tissue of the experimental animal. Enzyme-linked immunosorbent assay of mouse tissue samples subjected to injection of a genetic construct for the content of recombinant human brain neurotrophic factor.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С.All reagents used are commercially available, all procedures, unless otherwise specified, were carried out at room temperature or ambient temperature, that is, in the range from 18 to 25 ° C.
Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний. Например, могут изменяться стратегия сборки генетической конструкции (используемые праймеры, сайты клонирования и т.д.). Методы наращивания, выделения и очистки плазмид, способ трансфекции, методы оценки концентраций АФР и др.Below is a more detailed description of the claimed invention. The present invention may be subjected to various changes and modifications understood by one skilled in the art upon reading this description. Such changes do not limit the scope of claims. For example, the assembly strategy of the genetic construct (primers used, cloning sites, etc.) may change. Methods of building, isolation and purification of plasmids, transfection method, methods for assessing the concentration of AFR, etc.
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксическому материалу, который не взаимодействует с действием активного компонента фармацевтической композиции. "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к биосовместимому раствору, который в достаточной степени имеет такие характеристики, как стерильность, p[Eta], изотоничность, стабильность и подобные, и может включать любые растворители, разбавители, включая стерильный физиологический раствор, раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций, содержащий лактат раствор Рингера для инъекций и другие водные буферные растворы, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и подобные. Фармацевтически приемлемый носитель также может содержать стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты или другие добавки, которые хорошо известны специалистам в данной области, или другой наполнитель, известный из уровня техники.The term "pharmaceutically acceptable" refers to a non-toxic material that does not interact with the action of the active component of the pharmaceutical composition. “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to a biocompatible solution that sufficiently has characteristics such as sterility, p [Eta], isotonicity, stability and the like, and may include any solvents, diluents, including sterile saline, sodium chloride solution for injection , Ringer's solution for injection, dextrose solution for injection, dextrose and sodium chloride solution for injection, lactate-containing Ringer's solution for injection and other aqueous buffer solutions, dispersion media , Coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents and the like. A pharmaceutically acceptable carrier may also contain stabilizers, preservatives, antioxidants or other additives that are well known to those skilled in the art, or another excipient known in the art.
Действующей основой препарата является плазмидная ДНК pNCure (фиг. 3), кодирующая одновременно два лекарственных белка: пробелок мозговой нейротрофический фактор человека (human-proBDNF) и активатор плазминогена урокиназного типа человека (human-uPA).The active drug base is pNCure plasmid DNA (Fig. 3), which encodes two drug proteins simultaneously: a human brain neurotrophic factor (human-proBDNF) protein and human urokinase type plasminogen activator (human-uPA).
В качестве основы для конструирования плазмидного вектора был выбран одобренный для клинического использования вектор pVax1, соответствующий требованиям Food and Drug Administration (FDA, 1996), изначально предназначенный для иммунизации животных с помощью ДНК, кодирующих белки-мишени, минуя стадии экспрессии белка в клетках продуцентах и их очистки.The pVax1 vector approved for clinical use, which meets the requirements of the Food and Drug Administration (FDA, 1996), was originally designed to immunize animals with DNA encoding target proteins, bypassing the stages of protein expression in producer cells and was selected as the basis for constructing the plasmid vector. their cleaning.
Для улучшения эффективности, уменьшения размера и повышения безопасности исходный pVax1 был значительно модифицирован:To improve efficiency, reduce size and increase security, the original pVax1 has been significantly modified:
- был заменен ген устойчивости к канамицину,- the kanamycin resistance gene was replaced,
- в промоторную область добавлена последовательность энхансера SV40, призванная улучшить транспорт плазмиды в ядро,- an SV40 enhancer sequence was added to the promoter region, designed to improve plasmid transport to the nucleus,
- перед вставкой, кодирующей терапевтические белки, был добавлен искусственный интрон (который способствовал увеличению продукции целевых белков более, чем на 30%).- an artificial intron (which contributed to an increase in the production of target proteins by more than 30%) was added before the insert encoding therapeutic proteins.
- между целевыми вставками был помещен сайт внутренней посадки рибосомы вируса гепатита С (IRESHCV), который обеспечивает эффективное считывание обоих лекарственных белков с преобладанием экспрессии первого белка (human-proBDNF) по сравнению со вторым (human-uPA) не менее, чем в 10 раз.- a hepatitis C virus ribosome internal landing site (IRES HCV ) was placed between the target inserts, which ensures efficient reading of both drug proteins with a predominance of expression of the first protein (human-proBDNF) compared to the second (human-uPA) of not less than 10 time.
В качестве вставки были использованы природные кДНК генов мозгового нейротрофического фактора и активатора плазминогена урокиназного типа человека, полученные из культуры мезенхимных стромальных клеток подкожного жира здорового донора методом обратной транскрипции (RT-PCR).As an insert, natural cDNAs of genes of the brain neurotrophic factor and plasminogen activator of human urokinase type were used, obtained from a culture of healthy donor subcutaneous fat mesenchymal stromal cells by reverse transcription (RT-PCR).
Обобщенный механизм действия pNCure представлен на фиг. 2 и описан подробнее ниже.The generalized mechanism of action of pNCure is shown in FIG. 2 and is described in more detail below.
Мозговой нейротрофический фактор секретируется клетками в виде пробелка и активируется во внеклеточной среде. В зрелой форме через связывание с рецептором trkB он обеспечивает выживание и регенерацию, а также стимулирует рост аксонов различных типов нейронов. Однако, в виде пробелка он обладает большим сродством к альтернативному рецептору р75 на поверхности нейронов и Шванновских клеток, который запускает апоптоз. Одной из основных эндопротеаз, осуществляющих внеклеточную активацию BDNF, является эндопротеаза плазмин, которая в свою очередь нуждается в активации активатором плазминогена урокиназного типа (или урокиназой).Brain neurotrophic factor is secreted by cells in the form of a gap and is activated in the extracellular environment. In mature form, through binding to the trkB receptor, it ensures survival and regeneration, and also stimulates the growth of axons of various types of neurons. However, in the form of a white space, it has a great affinity for the alternative p75 receptor on the surface of neurons and Schwann cells, which triggers apoptosis. One of the main endoproteases carrying out extracellular activation of BDNF is plasmin endoprotease, which in turn needs to be activated by an urokinase-type plasminogen activator (or urokinase).
Кроме того, большинство нейротрофинов и факторов роста, так же как и мозговой нейротрофический фактор синтезируются в виде пробелков и для обеспечения их активности нуждаются в протеолитической активации. Локально синтезируемый после введения препарата активатор плазминогена, кроме активации синтезируемого после введения препарата мозгового нейротрофического фактора, активирует эндогенные нейротрофические факторы и факторы роста, также способствуя процессу регенерации.In addition, most neurotrophins and growth factors, as well as brain neurotrophic factor, are synthesized in the form of gaps and require proteolytic activation to ensure their activity. The plasminogen activator locally synthesized after drug administration, in addition to activating the brain neurotrophic factor synthesized after drug administration, activates endogenous neurotrophic factors and growth factors, also contributing to the regeneration process.
Это важно в связи с тем, что ранее многократно показано нарушение процесса активации факторов роста в очагах ишемии, формирующихся при травматическом повреждении тканей.This is important due to the fact that previously a violation of the process of activation of growth factors in foci of ischemia that is formed during traumatic tissue damage has been repeatedly shown.
Помимо активации BDNF, других нейротрофинов и факторов роста плазмин и урокиназный активатор плазминогена способствуют разрушению фибрина (интраневральные кровоизлияния с последующим образованием фибринового тромба неизбежно сопровождают травматические повреждения нервных стволов), который обладает нейротоксическим действием и является ингибитором роста аксонов, а также активируют резидентные (эндогенные) факторы роста.In addition to the activation of BDNF, other neurotrophins and growth factors, plasmin and the urokinase plasminogen activator contribute to the destruction of fibrin (intraneural hemorrhage followed by the formation of a fibrin thrombus inevitably accompanies traumatic damage to nerve trunks), which has a neurotoxic effect and is an inhibitor of axon growth and also activates resident (endogenous) growth factors.
Помимо этого, урокиназный активатор плазминогена регулирует направление роста нервных волокон через связывание с рецептором uPAR на поверхности конуса роста нервных клеток. Однако для запуска необходимых протеолитических каскадов и реализации навигационной функции количество урокиназного активатора плазминогена не должна быть слишком высоким, так как его излишняя активность может быть причиной нежелательных явлений, например, излишний протеолиз матриксных белков.In addition, the urokinase plasminogen activator regulates the direction of nerve fiber growth through binding to the uPAR receptor on the surface of the nerve growth cone. However, the amount of urokinase plasminogen activator should not be too high to start the necessary proteolytic cascades and realize the navigation function, since its excessive activity can cause undesirable effects, for example, excessive proteolysis of matrix proteins.
Использованный дизайн плазмидного вектора, с одной стороны, позволил вместить в плазмиду кДНК двух факторов роста при минимально возможном увеличении размера плазмиды, а с другой позволил обеспечить близкое к оптимальному соотношение продуцируемых белков, т.е. высокую продукцию рекомбинантного human-BDNF и умеренную продукцию human-uPA, различающуюся в среднем на порядок.The used design of the plasmid vector, on the one hand, made it possible to accommodate two growth factors in the cDNA with the smallest possible increase in the size of the plasmid, and on the other hand, it ensured a close to optimal ratio of the produced proteins, i.e. high production of recombinant human-BDNF and moderate production of human-uPA, which differs on average by an order of magnitude.
Бицистронная генетическая конструкция была собрана следующим образом: кДНК hBDNF была встроена в модифицированный вектор pVax1 сразу после промотора CMV и консенсусной последовательности Козака (GCCACC) с использованием сайтов рестрикции NheI и HindIII [Kozak М, 1984, "Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo". Nature. 308 (5956): 241-246. doi:10.1038/308241a0]. кДНК huPA (клонированная с использованием сайтов рестрикции Асс651 и EagI) была отделена от hBDNF с помощью IRES HCV [Lukavsky PJ. Structure and function of HCV IRES domains. Virus Res. 2009; 139(2): 166-71], собранного из синтетических олигонуклеотидов (амплифицированных с помощью ПЦР и клонированных с использованием сайтов рестрикции HindIII и Асс651). Согласно исследованию R. Jubin [Jubin R, Vantuno NE, Kieft JS, et al. Hepatitis С virus internal ribosome entry site (IRES) stem loop Hid contains a phylogenetically conserved GGG triplet essential for translation and IRES folding. J Virol. 2000; 74(22): 10430-7] IRES HCV обеспечивает продукцию второго белка (huPA) в 10 раз меньше в молярном отношении, чем первого (hBDNF). Каждая кДНК несет свои собственные стартовый и стоп-кодоны (старт-кодон huPA является встроенным в IRES HCV). Для повышения продуктивности плазмиды были сконструированы несколько вариантов плазмиды: с синтетическим интроном и последовательностью WPRE (фиг. 1). Синтетический интрон с последовательностью SEQ ID NO: 1 был сконструирован de novo, собран из синтетических олигонуклеотидов и введен между промотором CMV и консенсусной последовательностью Kozak (сайт рестрикции NheI) (жирным шрифтом выделены ключевые последовательности интрона). Было проведено исследование каждого варианта плазмиды с прямой и обратной ориентацией интрона (f/r-Intr) с оценкой влияния ориентации интрона (прямая или обратная) на продукцию белка. Последовательность WPRE была клонирована из pAAV-EFla-tdTomato-WPRE-pGHpA (Botond Roska, Addgene плазмида # 67527) [Wertz A, Trenholm S, Yonehara K, Hillier D, Raics Z, Leinweber M, Szalay G, Ghanem A, Keller G, Rozsa B, Conzelmann KK, Roska B. Science. 2015 Jul 3; 349(6243):70-4. doi: 10.1126/science.aab1687] и введена в варианты плазмидного вектора, содержащего f/r-Intr между стоп-кодоном huPA и сигналом полиаденилирования бычьего гормона роста (сайт рестрикции XbaI).The bicistronic genetic construct was assembled as follows: hBDNF cDNA was inserted into the modified pVax1 vector immediately after the CMV promoter and Kozak consensus sequence (GCCACC) using the NheI and HindIII restriction sites [Kozak M, 1984, "Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. " Nature. 308 (5956): 241-246. doi: 10.1038 / 308241a0]. huPA cDNA (cloned using the Ass651 and EagI restriction sites) was separated from hBDNF using IRES HCV [Lukavsky PJ. Structure and function of HCV IRES domains. Virus Res. 2009; 139 (2): 166-71] assembled from synthetic oligonucleotides (amplified by PCR and cloned using the HindIII and Ass651 restriction sites). According to a study by R. Jubin [Jubin R, Vantuno NE, Kieft JS, et al. Hepatitis C virus internal ribosome entry site (IRES) stem loop Hid contains a phylogenetically conserved GGG triplet essential for translation and IRES folding. J Virol. 2000; 74 (22): 10430-7] IRES HCV provides the production of the second protein (huPA) 10 times less in molar ratio than the first (hBDNF). Each cDNA carries its own start and stop codons (the huPA start codon is built into IRES HCV). To increase plasmid productivity, several plasmid variants were constructed: with a synthetic intron and a WPRE sequence (Fig. 1). A synthetic intron with the sequence SEQ ID NO: 1 was constructed de novo, assembled from synthetic oligonucleotides and inserted between the CMV promoter and the Kozak consensus sequence (NheI restriction site) (key intron sequences are shown in bold). A study was made of each plasmid variant with direct and reverse intron orientation (f / r-Intr) with an assessment of the influence of intron orientation (direct or reverse) on protein production. The WPRE sequence was cloned from pAAV-EFla-tdTomato-WPRE-pGHpA (Botond Roska, Addgene plasmid # 67527) [Wertz A, Trenholm S, Yonehara K, Hillier D, Raics Z, Leinweber M, Szalay G, Ghanem A, Keller G , Rozsa B, Conzelmann KK, Roska B. Science. 2015
Анализ кондиционированной среды HEK293, трансфицированных вариантами бицистронного вектора, на содержание hBDNF и huPA и анализ эффективности трансфекции показали, что оптимальным соотношением продуктивности и размера обладает вариант вектора с прямой ориентацией синтетического интрона и без WPRE. Полученная плазмида pVaxlm-f-Intr-hBDNF-IRES-huPA была названа «плазмидой для лечения нервов» (для краткости pNCure).Analysis of HEK293 conditioned medium transfected with bicistronic vector variants for the content of hBDNF and huPA and analysis of transfection efficiency showed that the variant of the vector with direct orientation of the synthetic intron and without WPRE has the optimal ratio of productivity and size. The resulting plasmid pVaxlm-f-Intr-hBDNF-IRES-huPA was called the "plasmid for the treatment of nerves" (for brevity pNCure).
После травмы нерва у человека экспрессия нейротрофинов и мозгового нейротрофического фактора, в частности, повышается примерно на 1 месяц, а экспрессия урокиназы повышается примерно на 1 неделю, чего, с учетом низкой скорости роста нейритов у человека, обычно недостаточно для полноценной реиннервации, в особенности, при высокоуровневой травме нервного ствола.After a nerve injury in humans, the expression of neurotrophins and brain neurotrophic factor, in particular, increases by about 1 month, and the expression of urokinase increases by about 1 week, which, given the low growth rate of neurites in humans, is usually not enough for complete reinnervation, in particular, with high-level nerve trunk injury.
pNCure относится к фармакологической группе биологических препаратов для генной терапии, стимуляторов восстановления иннервации после травм периферического нерва. Последовательность pNCure (pVax2-fIntron-hBDNF-IRESHCV-huPA) SEQ ID NO: 2 с обозначением функциональных фрагментов: 
Способ стимуляции локальной экспрессии мозгового нейротрофического фактора и активатора плазминогена урокиназного типа в тканях животных моделей за счет введения генотерапевтической конструкции.A method of stimulating local expression of a cerebral neurotrophic factor and plasminogen activator of the urokinase type in the tissues of animal models by introducing a gene therapy construct.
Внутримышечное введение pNCure в область травмы периферического нерва, вызывает длительную локальную продукцию мозгового нейротрофического фактора и активатора плазминогена урокиназного типа и, тем самым, стимулирует выживание нейронов, утративших связи с мишенями, восстановление проведения нервного импульса по сохранившимся нейритам, восстановление иннервации тканей за счет стимуляции роста нейритов, активацию нейротрофинов и факторов роста, необходимых для обеспечения всех компонентов механизмов регенерации, важных для восстановления иннервации.Intramuscular injection of pNCure into the area of the peripheral nerve injury causes long-term local production of the cerebral neurotrophic factor and urokinase-type plasminogen activator and, thereby, stimulates the survival of neurons that have lost contact with the targets, the restoration of nerve impulse conduction from preserved neurites, and restoration of tissue innervation due to growth stimulation neurites, activation of neurotrophins and growth factors necessary to ensure all components of the regeneration mechanisms important for restoration phenomena of innervation.
Для эффективного запуска и поддержания процессов регенерации необходимо обеспечить продукцию трансгенов длительное время и на достаточном уровне, что требует адекватной доставки генетической конструкции в клетки-продуценты (мышечные волокна). Однократное введение плазмиды в мышечную ткань обеспечивает экспрессию трансгенов в течении не более чем одного месяца. Оптимальным способом доставки генетической конструкции является многократное внутримышечное введение плазмиды. Причем разовая доза лекарственного препарата должна вводиться малыми объемами в несколько точек мышцы в периневральной области. Это нужно с одной стороны для того чтобы увеличить число мышечных волокон, которые будут локально производить лекарственные белки, и для того чтобы уменьшить потери лекарственного средства за счет минимизации возможности обратного вытекания раствора при введении большого объема.To effectively start and maintain the regeneration processes, it is necessary to ensure the production of transgenes for a long time and at a sufficient level, which requires adequate delivery of the genetic construct to producer cells (muscle fibers). A single introduction of the plasmid into muscle tissue ensures the expression of transgenes for no more than one month. The optimal method for delivering the genetic construct is multiple intramuscular administration of the plasmid. Moreover, a single dose of the drug should be administered in small volumes at several points in the muscle in the perineural region. This is necessary on the one hand in order to increase the number of muscle fibers that will locally produce medicinal proteins, and in order to reduce drug losses by minimizing the possibility of backflow of the solution with the introduction of a large volume.
Для стимуляции восстановления нерва переднюю большеберцовую мышцу (иннервируется поврежденным нервом) обкалывали раствором плазмиды pNCure (60 мкл, 1 мкг/мкл) - 6 инъекций в разные точки мышцы.To stimulate nerve recovery, the anterior tibial muscle (innervated by a damaged nerve) was punctured with pNCure plasmid solution (60 μl, 1 μg / μl) - 6 injections at different points in the muscle.
Сравнение эффективности введения дозы лекарственного средства в несколько точек и в одну точку мышцы проводили с помощью гистологического окрашивания криосрезов мышцы после введения маркерной плазмиды, кодирующей бета-галактозидазу и с помощью иммуноферментного анализом среды культивирования мышечных эксплантов на hBDNF и huPA (Фиг. 4).The effectiveness of administering the dose of the drug at several points and at one point in the muscle was compared using histological staining of muscle cryosections after administration of a marker plasmid encoding beta-galactosidase and using an enzyme-linked immunosorbent assay for culturing muscle explants on hBDNF and huPA (Fig. 4).
Применение заявляемой генотерапевтической конструкции в качестве генотерапевтического средства для лечения травм периферических нервов.The use of the inventive gene therapy construct as a gene therapy for treating peripheral nerve injuries.
Примеры специфической фармакологической активности pNCure in vitro. В качестве тест-системы использовали линейные клетки НЕК293 и Neuro2a.Examples of specific pharmacological activity of pNCure in vitro. The linear cells HEK293 and Neuro2a were used as a test system.
1. Содержание урокиназы (uPA) и BDNF в кондиционной среде культивирования клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой pNCure и контрольной плазмидой pVax1. The content of urokinase (uPA) and BDNF in a conditioned medium for culturing HEK293 cells transfected with pNCure plasmid and pVax control plasmid
Клетки НЕК293 представляют собой линию эмбрионального почечного эпителия человека (АТСС® CRL-1573™), которые легко трансфицируются (эффективность трансфекции до 95%), выдерживают большое количество пассажей, и поэтому являются общепринятым объектом для оценки эффективности экспрессии трансгенов после трансфекции исследуемыми плазмидами.HEK293 cells are a line of human embryonic renal epithelium (ATCC® CRL-1573 ™), which are easily transfected (transfection efficiency up to 95%), can withstand a large number of passages, and therefore are a common object for evaluating the efficiency of transgene expression after transfection with the studied plasmids.
Клетки линии НЕК293 культивировали в стандартных асептических условиях СО2 инкубатора с использованием среды DMEM (Gibco или HyClone), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (Gibco или HyClone) и 1% антибиотика-антимикотика (Gibco или HyClone). Пассирование клеток осуществляли раствором трипсина/ЭДТА.HEK293 cells were cultured under standard aseptic conditions in a CO 2 incubator using DMEM medium (Gibco or HyClone) containing 10% fetal bovine serum (PBS) (Gibco or HyClone) and 1% antibiotic-antimycotic (Gibco or HyClone). Cells were passaged with trypsin / EDTA solution.
Для оценки функциональной активности нейротрофных факторов BDNF и uPA использовали кондиционированную среду культивирования, полученную от НЕК293 (АТСС® CRL-1573™), трансфицированных плазмидой pNCure. Для трансфекции клетки высевали в ч. Петри из расчета 104 клеток/см2 и культивировали в СО2 инкубаторе при +37°С, используя укомплектованную среду роста. Для проведения трансфекции использовали клетки HEK293, достигшие плотности 70% монослоя. Перед трансфекцией клеткам меняли укомплектованную среду роста на DMEM, не содержащий сыворотку и антибиотик. Плазмиду pNCure и контрольную pVax в количестве 5 мкг смешивали с 250 мкл бессывороточной среды Opti-MEM (GIBCO). Через 5 мин в каждый раствор добавляли по 40 мкл реагента Lipofectamine2000™ (Invirogen), разведенного предварительно также в 250 мкл среды Opti-MEM. Полученную смесь плазмид и трансфекционного реагента инкубировали 30 мин при комнатной температуре, далее растворы добавляли в среду культивирования клеток HEK293 и инкубировали 6 часов. Через 6 ч. клеткам меняли среду на укомплектованную среду роста DMEM.To assess the functional activity of the neurotrophic factors BDNF and uPA, we used conditioned culture medium obtained from HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™) transfected with pNCure plasmid. For transfection, cells were seeded in Petri h at the rate of 10 4 cells / cm 2 and cultured in a CO 2 incubator at + 37 ° C using a complete growth medium. For transfection, HEK293 cells were used, which reached a density of 70% of the monolayer. Before transfection, the complete growth medium was changed to cells with serum and antibiotic-free DMEM. Plasmid pNCure and control pVax in an amount of 5 μg were mixed with 250 μl of Opti-MEM serum-free medium (GIBCO). After 5 min, 40 μl of Lipofectamine2000 ™ reagent (Invirogen), previously diluted in 250 μl of Opti-MEM medium, was added to each solution. The resulting mixture of plasmids and transfection reagent was incubated for 30 min at room temperature, then the solutions were added to the HEK293 cell culture medium and incubated for 6 hours. After 6 hours, the cells were exchanged with the complete DMEM growth medium.
Для увеличения концентрации факторов BDNF и uPA в кондиционированной среде роста НЕК после трансфекции их pNCure клеточную массу наращивали до количества 5×107, собирали среду и концентрировали с помощью мембранной фильтрации в условиях центрифугирования. Диаметр пор фильтров должен быль таким, чтобы в конечном растворе содержались белки, молекулярная масса которых больше 20 кДа. Те же манипуляции осуществляли с контрольной средой. Для этого через 72 ч среды культивирования собирали, центрифугировали при 1000 g 10 мин для очищения среды от клеток и полученный супернатант переносили в чистые пробирки. Далее образцы концентрировали в 1000 раз с использованием фильтров (Centrycon YM-10, Millipore), задерживающих белки с молекулярной массой более 20 кДа.To increase the concentration of BDNF and uPA factors in the conditioned HEK growth medium after transfection, their pNCure cell mass was increased to 5 × 10 7 , the medium was collected and concentrated using membrane filtration under centrifugation conditions. The pore diameter of the filters should be such that the final solution contains proteins whose molecular weight is more than 20 kDa. The same manipulations were carried out with the control medium. For this, after 72 h, the culture media were collected, centrifuged at 1000 g for 10 min to clear the cells from the medium, and the obtained supernatant was transferred to clean tubes. Next, the samples were concentrated 1000 times using filters (Centrycon YM-10, Millipore), trapping proteins with a molecular weight of more than 20 kDa.
Далее методом ИФА определяли концентрацию BDNF и uPA с использованием коммерческих наборов: для BDNF человека использовали коммерческий набор Human Free BDNF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems); для uPA человека использовали Human uPA ELISA Kit (Abeam). Процедуру осуществляли в строгом соответствии с протоколом изготовителя. Используя стандартные образцы BDNF и uPA, готовили калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы пробы №1 содержали 500 пг/мл BDNF и uPA, каждая последующая содержала BDNF и uPA в 2 раза меньше. Пробы №0 содержали только контрольный раствор Sample Diluent. Собранные образцы кондиционированной среды в количестве 800 мкл, а также стандартные образцы BDNF и uPA наносили в лунки 96-ти луночных планшет в трех повторах и инкубировали на шейкере в течение 12 ч. при +4°С. Далее планшеты промывали раствором Wash Buffer и в каждую лунку добавляли по 100 мкл биотинилированных моноклональных антител против BDNF и uPA человека. Через 3 ч инкубации планшеты отмывали и в лунки вносили по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 ч планшеты промывали и вносили в лунки по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл буфера Stop Buffer, и оценивали интенсивность реакции на спектрофотометре Zenith 3200 Anthos при длине волны 450 нм.Next, the concentrations of BDNF and uPA were determined by ELISA using commercial kits: for human BDNF, the commercial Human Free BDNF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) was used; Human uPA ELISA Kit (Abeam) was used for human uPA. The procedure was carried out in strict accordance with the manufacturer's protocol. Using standard samples of BDNF and uPA, calibration samples of known concentration were prepared so that samples No. 1 contained 500 pg / ml BDNF and uPA, each subsequent one contained BDNF and
Данные, полученные в результате измерения концентрации BDNF и uPA методом ИФА в кондиционированных средах клеток НЕК 293 после трансфекции pNCure или контрольной плазмидой pVax, представлены в Таблицах 1 и 2.The data obtained by measuring the concentration of BDNF and uPA by ELISA in conditioned media of HEK 293 cells after transfection with pNCure or control plasmid pVax are presented in Tables 1 and 2.
н/о - не обнаруженоn / a - not found
н/о - не обнаруженоn / a - not found
Суммированные данные по определению концентраций BDNF и uPA в кондиционированной среде клеток НЕК293, трансфицированных pNCure или контрольной плазмидой pVax, приведены в Таблице 3.The summarized data on the determination of the concentrations of BDNF and uPA in the conditioned medium of HEK293 cells transfected with pNCure or the control plasmid pVax are shown in Table 3.
Коммерческие наборы Human Free BDNF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) и Human uPA ELISA Kit (Abeam) для измерения концентрации BDNF и uPA в среде культивирования определяют пороговую концентрацию BDNF от 62,5 пг/мл и uPA от 62,5 пг/мл. В результате наших измерений было обнаружено, что экспрессия белков в контрольной кондиционированной среде ниже порогового уровня определения.The commercial Human Free BDNF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) and Human uPA ELISA Kit (Abeam) for measuring the concentration of BDNF and uPA in the culture medium determine the threshold concentration of BDNF from 62.5 pg / ml and uPA from 62.5 pg / ml. As a result of our measurements, it was found that the expression of proteins in the control conditioned medium is below the threshold level of determination.
Таким образом, при трансфекции клеток НЕК293 контрольной плазмидой pVax содержание BDNF и uPA в кондиционированной среде не обнаруживается. При трансфекции клеток НК293 pNCure происходит длительное и многократное увеличение экспрессии нейротрофных факторов BDNF и uPA в концентрациях, достаточных для проведения углубленного изучения биологической активности in vitro. Для проведения дальнейших экспериментов использовали контрольный образец кондиционированной среды и образец кондиционированной среды, содержащий нейротрофные факторы.Thus, upon transfection of HEK293 cells with the control plasmid pVax, the content of BDNF and uPA in the conditioned medium was not detected. Transfection of NK293 pNCure cells leads to a prolonged and multiple increase in the expression of neurotrophic factors BDNF and uPA at concentrations sufficient to conduct an in-depth study of biological activity in vitro. For further experiments, a control sample of conditioned medium and a sample of conditioned medium containing neurotrophic factors were used.
Таким образом, кондиционированная среда клеток НЕК293, трансфицированных pNCure содержит факторы BDNF и uPA в концентрациях, достаточных для оценки их биологической активности in vitro.Thus, the conditioned medium of HEK293 cells transfected with pNCure contains factors BDNF and uPA at concentrations sufficient to evaluate their biological activity in vitro.
2. Влияние кондиционной среды культивирования клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой pNCure и контрольной плазмидой pVax, на скорость роста нейритов нейробластомы мыши Neuro2a (модель нейрогенеза)2. The effect of the conditioned medium for the cultivation of HEK293 cells transfected with pNCure plasmid and control plasmid pVax on the growth rate of neuroblastoma mouse neuroblastoma Neuro2a (model of neurogenesis)
Линия Neuro2a (АТСС® CCL-131™) представляет собой линию клеток нейробластомы мыши, выдерживает большое количество пассажей, и способна дифференцироваться в нейральном направлении при снижении содержания сыворотки в среде культивирования до 1%. Данная линия также является хорошо описанной и воспроизводимой моделью для оценки влияния тестируемых веществ на скорость роста нейритов (модель нейритогенеза in vitro).The Neuro2a line (ATCC® CCL-131 ™) is a mouse neuroblastoma cell line, can withstand a large number of passages, and is able to differentiate in the neural direction while reducing the serum content in the culture medium to 1%. This line is also a well-described and reproducible model for assessing the effect of test substances on the growth rate of neurites (in vitro model of neuritogenesis).
Для изучения биологического влияния продуцируемых плазмидой нейротрофных факторов BDNF и uPA, была проведена оценка их способности стимулировать дифференцировку клеток нейробластомы Neuro2a в нейральном направлении. При дифференцировке в нейрональном направлении клетки формируют отростки - нейриты. Для оценки влияния на нейральную дифференцировку Neuro2a клетки культивировали примерно до 40% монослоя в полной среде роста, содержащей DMEM, 10% раствор ФБС, 1% раствор антибиотика-антимикотика, и 1% раствор незаменимых аминокислот (NEAA, Non Essential Amino Acids, Invitogen). В день эксперимента клеткам меняли среду культивирования на кондиционированную среду клеток НЕК293, трансфицированных pNCure или контрольной плазмидой pVax. Среду разводили таким образом, что конечная концентрация BDNF составила 100 нг/мл. Контрольную среду разводили в той же пропорции. В качестве отрицательного контроля клеткам меняли среду на полную среду роста клеток, содержащую 10% раствор ФБС; в качестве положительного контроля для дифференцировки использовали среду роста с 1% пониженным содержанием ФБС. После этого клетки инкубировали 72 ч. Далее были проанализированы отростки, формирующиеся от тел клеток Neuro2a. Визуализацию осуществляли с использованием светового микроскопа, оборудованного CDD камерой. Подсчет числа отростков (зон ветвления) осуществляли с использованием программы ClickCounter2.To study the biological effect of plasmid-produced neurotrophic factors BDNF and uPA, their ability to stimulate the differentiation of Neuro2a neuroblastoma cells in the neural direction was evaluated. With differentiation in the neuronal direction, cells form processes - neurites. To assess the effect on Neuro2a neural differentiation, cells were cultured up to about 40% monolayer in complete growth medium containing DMEM, 10% PBS, 1% solution of antibiotic-antimycotics, and 1% solution of essential amino acids (NEAA, Non Essential Amino Acids, Invitogen) . On the day of the experiment, the culture medium was changed to the conditioned medium of HEK293 cells transfected with pNCure or the control plasmid pVax. The medium was diluted so that the final concentration of BDNF was 100 ng / ml. The control medium was diluted in the same proportion. As a negative control, the cells were changed to full cell growth medium containing 10% PBS; as a positive control for differentiation, we used a growth medium with a 1% reduced content of PBS. After this, the cells were incubated for 72 hours. Next, the processes formed from the bodies of Neuro2a cells were analyzed. Visualization was carried out using a light microscope equipped with a CDD camera. The number of shoots (branching zones) was calculated using the ClickCounter2 program.
Было обнаружено, что через 72 ч в группе pNCure происходит значительное усиление формирования отростков, чего не наблюдается в группе отрицательного контроля (10% ФБС), где визуализируются лишь единичные клетки, имеющие отростки. На фиг. 5 показаны клетки, приобретающие морфологию нейронов (группы pNCure, 1% ФБС и группа pVax). Примечательно, что в группе pVax также наблюдается незначительное стимулирующее влияние на формирование нейритов по сравнению с отрицательным контролем 10% ФБС. Это может объяснять тем, что кондиционированная среда клеток НЕК, хоть и не содержит в высоких концентрациях исследуемые факторы BDNF и uPA, тем не менее, содержит другие факторы, которые также способны стимулировать нейрогенез. Тем не менее, при сравнении результатов, полученных в группах pNCure и pVax, было подтверждено статистически значимое влияние продуктов экспрессии pNCure (BDNF и uPA) на формирование нейритов. На фиг. 6 представлены результаты статистической обработки, подтверждающие стимулирующий эффект, оказываемый факторами продуцируемыми при трансфекции плазмидой pNCure, на клетки Neuro2a к дифференцировке в нейральном направлении.It was found that after 72 hours a significant increase in the formation of processes occurs in the pNCure group, which is not observed in the negative control group (10% FBS), where only single cells with processes are visualized. In FIG. 5 shows cells acquiring neuronal morphology (pNCure groups, 1% PBS and pVax group). It is noteworthy that in the pVax group there is also a slight stimulating effect on the formation of neurites in comparison with the negative control of 10% PBS. This can be explained by the fact that the conditioned environment of HEK cells, although it does not contain the studied factors BDNF and uPA in high concentrations, nevertheless, contains other factors that can also stimulate neurogenesis. Nevertheless, when comparing the results obtained in the pNCure and pVax groups, a statistically significant effect of pNCure expression products (BDNF and uPA) on the formation of neurites was confirmed. In FIG. Figure 6 presents the results of statistical processing confirming the stimulating effect exerted by factors produced upon transfection with the pNCure plasmid on Neuro2a cells to differentiate in the neural direction.
Таким образом, показано, что трансфекция клеток НЕК293 плазмидой pNCure, содержащей кДНК BDNF человека и uPA человека вызывает значительное увеличение содержания этих факторов в среде культивирования по сравнению с контролем pVax. Этот эффект длительный, что свидетельствует о том, что введение трансгена в клетки обеспечивает стабильную его экспрессию на протяжении 72 ч. в культуре клеток. Кроме того, нейротрофные факторы BDNF и uPA, продуцируемые клетками, вызывают дифференцировку клеток Neuro2a в нейральном направлении, о чем свидетельствует увеличение формирование отростков (нейритов) от тел клеток.Thus, it was shown that transfection of HEK293 cells with pNCure plasmid containing human BDNF cDNA and human uPA causes a significant increase in the content of these factors in the culture medium compared to the pVax control. This effect is long-lasting, which indicates that the introduction of the transgene into cells ensures its stable expression for 72 hours in cell culture. In addition, the neurotrophic factors BDNF and uPA produced by cells cause Neuro2a cells to differentiate in the neural direction, as evidenced by an increase in the formation of processes (neurites) from cell bodies.
3. Рост аксонов и миграция нейральных клеток из эксплантов в Матригель. содержащий среду культивирования клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой pNCure и контрольной плазмидой pVax на трехмерной эксплантной модели спинального ганглия мыши в Матригеле3. Axon growth and migration of neural cells from explants to Matrigel. containing medium for culturing HEK293 cells transfected with pNCure plasmid and pVax control plasmid in a three-dimensional explant model of mouse spinal ganglion in Matrigel
Для выделения ганглиев использовали постнатальных мышей линии C57BL в возрасте 3 дней. Культивировали спинальные ганглии ex vivo в геле (Матригеле). Метод позволяет изучать процессы, происходящие в тканевом экспланте спинального ганглия в трехмерном пространстве. В Матригель вводили кондиционированную среду культивирования клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой pNCure (или контрольной плазмидой pVax), анализировали их влияние на экспланты в динамике в течение 7 д от момента помещения эксплантов в Матригель. На каждый эксплант наносили 60 мкл Матригеля, в который предварительно добавляли кондиционированную среду клеток НЕК293, трансфицированных pNCure (концентрация по BDNF составляла 100 нг/мл) или контрольной плазмидой (разведенной в одинаковой пропорции с опытной средой). Планшет помещали на 10 мин. в СО2 инкубатор (+37°С) для полимеризации Матригеля. Далее в лунки вносили по 400 мкл теплой среды RPMI1640, в которую также добавляли кондиционированную среду клеток НЕК293, трансфицированных препаратом pNCure (концентрация по BDNF 100 нг/мл) или контрольной плазмидой и помещали планшет в инкубатор. Визуализацию эксплантов осуществляли на 4 сутки при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М (Zeiss).To isolate the ganglia, 3-day old postnatal C57BL mice were used. Cultured spinal ganglia ex vivo in a gel (Matrigel). The method allows to study the processes occurring in the tissue explant of the spinal ganglion in three-dimensional space. The conditioned culture medium of HEK293 cells transfected with the pNCure plasmid (or the control plasmid pVax) was introduced into Matrigel, and their effect on the explants in dynamics was analyzed within 7 days from the moment the explants were placed in Matrigel. 60 μl of Matrigel was applied to each explant, to which the conditioned medium of HEK293 cells transfected with pNCure (BDNF concentration was 100 ng / ml) or a control plasmid (diluted in the same proportion with the experimental medium) was preliminarily added. The tablet was placed for 10 minutes. in a CO 2 incubator (+ 37 ° C) for the polymerization of Matrigel. Next, 400 μl of warm RPMI1640 medium was added to the wells, to which the conditioned medium of HEK293 cells transfected with pNCure (BDNF concentration of 100 ng / ml) or a control plasmid was also added and the plate was placed in an incubator. The explants were visualized on
На фиг. 7 показаны микрофотографии трехмерных эксплантов СГ, сделанные на 4-е сутки культивирования эксплантов в Матригеле. Наличие нейротрофных факторов: BDNF и uPA (белковые продукты pNCure) стимулирует рост нейритов из эксплантов СГ в Матригель (стрелки на вкладке pNCure) по сравнению с контрольным образцом (pVax). При этом в контроле, как и в опыте, происходит миграция нейральных клеток из СГ в Матригель (стрелки на вкладке pVax), однако роста нейритов практически не наблюдается. Дополнительно на нижней панели фигуры приведены увеличенные области, в которых показаны мигрирующие клетки в контрольной группе pVax и растущие нейриты в опытной группе pNCure. Исходя из этих данных видно, что присутствие нейротрофных факторов BDNF и uPA обладает мощным стимулом для регенерации поврежденных путем денервации аксонов спинальных ганглиев.In FIG. 7 shows microphotographs of three-dimensional explants of SG made on the 4th day of explant cultivation in Matrigel. The presence of neurotrophic factors: BDNF and uPA (pNCure protein products) stimulates the growth of neurites from SG explants to Matrigel (arrows on the pNCure tab) compared to the control sample (pVax). Moreover, in the control, as in the experiment, the migration of neural cells from SG to Matrigel takes place (arrows on the pVax tab), but neurite growth is practically not observed. Additionally, the lower panel of the figure shows enlarged areas in which migrating cells in the pVax control group and growing neurites in the pNCure experimental group are shown. Based on these data, it is seen that the presence of neurotrophic factors BDNF and uPA has a powerful stimulus for the regeneration of spinal ganglia damaged by axonal denervation.
Визуализацию ядер нейральных клеток, мигрировавших из эксплантов СГ в Матригель оценивать с использованием конфокальной микроскопии (микроскоп Leica TCS SP5; программное обеспечение LAS AF). Флуоресцентный краситель DAPI визуализировали с помощью лазера длиной волны 405 нм. Изображения со всех лунок получали при одинаковых настройках микроскопа.Visualization of the nuclei of neural cells migrating from SG explants to Matrigel was assessed using confocal microscopy (Leica TCS SP5 microscope; LAS AF software). DAPI fluorescent dye was visualized using a 405 nm laser. Images from all wells were obtained with the same microscope settings.
При анализе изображений оказалось, что присутствие в Матригеле нейротрофных факторов BDNF и uPA, содержащихся в кондиционированной среде клеток, трансфицированных pNCure, стимулирует как скорость миграции нейральных клеток (стрелки на Фиг. 8), так и их число (синяя флуоресценция) по сравнению с контролем. Обнаруженная разница между группой pNCure и контроль pVax была очевидна при визуальном анализе.When analyzing the images, it turned out that the presence of neurotrophic factors BDNF and uPA in Matrigel contained in the conditioned medium of cells transfected with pNCure stimulates both the rate of migration of neural cells (arrows in Fig. 8) and their number (blue fluorescence) compared to the control . The observed difference between the pNCure group and the pVax control was apparent by visual analysis.
Таким образом, при изучении биологической активности препарата in vitro было обнаружено, что трансфекция клеток НЕК293 плазмидой pNCure, содержащей кДНК BDNF человека и uPA человека вызывает значительное увеличение содержания этих факторов в среде культивирования. Этот эффект является длительным и наблюдается на протяжении как минимум 72 ч. Нейротрофные факторы BDNF и uPA усиливают дифференцировку клеток Neuro2a в нейральном направлении, усиливая формирование отростков (нейритов) от тел клеток. Более того, присутствие нейротрофных факторов BDNF и uPA обладает мощным стимулом для регенерации нейритов и миграции клеток спинального ганглия на трехмерной эксплантной модели СГ мыши в Матригеле.Thus, when studying the biological activity of the drug in vitro, it was found that transfection of HEK293 cells with pNCure plasmid containing human BDNF cDNA and human uPA causes a significant increase in the content of these factors in the culture medium. This effect is long lasting and is observed for at least 72 hours. Neurotrophic factors BDNF and uPA enhance the differentiation of Neuro2a cells in the neural direction, enhancing the formation of processes (neurites) from cell bodies. Moreover, the presence of neurotrophic factors BDNF and uPA has a powerful incentive for neurite regeneration and spinal ganglion cell migration in a three-dimensional explanted model of mouse SG in Matrigel.
4. Восстановление проводимости поврежденного нерва при действии плазмиды pNCure4. The restoration of the conductivity of the damaged nerve under the action of the plasmid pNCure
Восстановление проводимости нерва оценивали с помощью регистрации вызванных потенциалов действия, регистрируемых с поверхностной ветви общего малоберцового нерва. Мышей на 24-е сутки после повреждения нерва и введения лекарственного препарата эксперимента подвергали эвтаназии. Стимуляцию нерва проводили в электрофизиологической камере с раствором Лайли на 7-8 мм проксимальнее места повреждения с использованием пары серебряных электродов. Параметры стимуляции: частота импульса 1 Гц, продолжительность импульса 0.05 мс и супрамаксимальная амплитуда 10 В. Промежуток времени от забоя животного до момента регистрации вызванных потенциалов действия составлял около 35-45 минут для каждого животного. Суммарные потенциалы действия нерва (СПДН) регистрировали 3 раза для каждого нерва с использованием монополярного аспирирующего электрода, который располагался на 10 мм дистальнее места повреждения. Регистрирующий электрод был связан через усилитель сигнала и аналого-цифровой преобразователь (Е14-140 L-card) с компьютером. Регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью программы PowerGraph Professional 3.3. Регистрируемый СПДН характеризуется двумя параметрами - латентным периодом и амплитудой. Латентный период - время от момента стимуляции нерва до момента регистрации вызванного потенциала действия характеризует скорость проведения возбуждения по нерву, причем его величина обратно пропорциональна скорости проведения возбуждения по нерву. Таким образом, увеличение латентного периода после повреждения свидетельствует о снижении скорости проведения вызванных потенциалов по поврежденному нерву. Поскольку скорость проведения вызванных потенциалов действия по нерву определяется качеством миелиновой оболочки нервных волокон, то укорочение латентного периода свидетельствует о лучшем ее восстановлении.The restoration of nerve conduction was evaluated by recording evoked action potentials recorded from the surface branch of the common peroneal nerve. Mice on the 24th day after nerve damage and administration of the experiment drug were euthanized. Nerve stimulation was performed in an electrophysiological chamber with Laili's solution 7-8 mm proximal to the site of injury using a pair of silver electrodes. Stimulation parameters: a pulse frequency of 1 Hz, a pulse duration of 0.05 ms and a supramaximal amplitude of 10 V. The time interval from slaughtering the animal to the moment of recording evoked action potentials was about 35-45 minutes for each animal. Total nerve action potentials (SPND) were recorded 3 times for each nerve using a monopolar aspiration electrode, which was located 10 mm distal to the site of injury. The recording electrode was connected through a signal amplifier and an analog-to-digital converter (E14-140 L-card) with a computer. Data recording and analysis was performed using PowerGraph Professional 3.3. Registered SPDN is characterized by two parameters - latent period and amplitude. The latent period - the time from the moment of nerve stimulation to the moment of registration of the evoked action potential characterizes the speed of the excitation along the nerve, and its value is inversely proportional to the speed of the excitation along the nerve. Thus, an increase in the latent period after injury indicates a decrease in the speed of the evoked potentials along the damaged nerve. Since the speed of conducting evoked potentials of action on the nerve is determined by the quality of the myelin sheath of nerve fibers, the shortening of the latent period indicates its best recovery.
Амплитуда характеризует количество нервных волокон, участвующих в проведении возбуждения (Fugleholm К, 2000; Vleggeert-Lankamp CLAM, 2007). Чем меньше амплитуда СПДН, тем меньшее количество активных нервных волокон содержит поврежденный нерв.The amplitude characterizes the number of nerve fibers involved in the excitation (Fugleholm K, 2000; Vleggeert-Lankamp CLAM, 2007). The smaller the amplitude of LPS, the less active nerve fibers contain a damaged nerve.
Повреждение общего малоберцового нерва методом раздавливания вызывало нарушение функции нерва, о чем свидетельствовало уменьшение амплитуды и увеличение латентного периода СПДН. Результаты демонстрируют, что на 24 сутки после начала эксперимента при измерении СПДН с поверхностной ветви общего малоберцового нерва с помощью электрофизиологической методики у животных, которым делали инъекцию pNCure в дозе 60 мкг (1 мг/мл), амплитуда СПДН была достоверно выше по сравнению с животными, которым инъецировали контрольный вектор pVax. Так, амплитуда СПДН поверхностной ветви общего малоберцового нерва у мышей, получивших 60 мкг pNCure, на 24 день проведения эксперимента была в 1.7 раза больше, чем амплитуда СПДН у мышей из группы "-К": 0.475 (0.338; 0.612) и 0.285 (0.245; 0.353) мВ (n=10; р<0.001), соответственно. Сравнимый рост амплитуды СПДН наблюдали и в группе положительного контроля (+К) - 0.457 (0.329; 0.573) мВ (n=10; p<0.05). В группе экспериментальных животных, которым делали инъекции 120 мкг pNCure ("pNCure_2"), на 24 день проведения эксперимента амплитуда СПДН была в 2.2 раза больше, чем амплитуда СПДН у мышей из группы "-К" и составила 0.627 (0.506; 0.832) мВ (n=5; p<0.001). Хотя достоверно показатели амплитуды СПДН между группами "pNCure_1" и "pNCure_2" не отличались (р=0.174), видно, что инъекция 120 мкг плазмиды pNCure способствует лучшему восстановлению проводимости нервных волокон, чем инъекция 60 мкг pNCure (фиг. 9).Damage to the common peroneal nerve by crushing caused a violation of the nerve function, as evidenced by a decrease in amplitude and an increase in the latent period of LDS. The results demonstrate that, on the 24th day after the start of the experiment, when measuring LPS from the superficial branch of the common peroneal nerve using an electrophysiological technique in animals that were injected with pNCure at a dose of 60 μg (1 mg / ml), the amplitude of LPS was significantly higher compared to animals with which the pVax control vector was injected. Thus, the amplitude of LDS in the surface branch of the common peroneal nerve in mice that received 60 μg of pNCure was 1.7 times greater on day 24 of the experiment than the amplitude of LDS in mice from the K group: 0.475 (0.338; 0.612) and 0.285 (0.245 ; 0.353) mV (n = 10; p <0.001), respectively. A comparable increase in the SPDN amplitude was also observed in the positive control group (+ K) - 0.457 (0.329; 0.573) mV (n = 10; p <0.05). In the group of experimental animals that were injected with 120 μg pNCure ("pNCure_2"), on day 24 of the experiment, the LDS amplitude was 2.2 times greater than the LDS amplitude in mice from the -K group and amounted to 0.627 (0.506; 0.832) mV (n = 5; p <0.001). Although the SPDN amplitude amplitude values between the "pNCure_1" and "pNCure_2" groups did not differ significantly (p = 0.174), it is seen that injection of 120 μg of pNCure plasmid promotes better restoration of nerve fiber conductivity than injection of 60 μg pNCure (Fig. 9).
Латентный период СПДН поврежденного нерва мышей, которых подвергали лечению pNCure, как в дозе 60 мкг, так и в дозе 120 мкг, на 24 день проведения эксперимента достоверно не отличался от аналогичного показателя групп контроля (фиг. 10). Так в группе "pNCure_1" латентный период составил 0.715 (0.622; 0.893) мс, а в группе "pNCure_2" - 0.507 (0.45; 0.887) мс. В группах контроля латентный период составил 0.861 (0.68; 0.983) мс в группе "-К" и 0.771 (0.7; 0.94) мс в группе "+К". Хотя статистически достоверной разницы по величине латентного периода СПДН между группами обнаружено не было, наблюдается тенденция к уменьшению латентного периода СПДН (увеличению скорости проведения СПДН) после введения pNCure, причем наблюдается дозовая зависимость. Поскольку данная постановка эксперимента предполагала многократные инъекции плазмидного препарата (по причине ориентации исследования на последующее применение препарата у человека) и не могла продолжаться менее 24 сут, то отсутствие статистически достоверной разницы в величине латентного периода между экспериментальными и контрольными группами, вероятно, связано, как с относительно щадящим методом повреждения нерва, так и с более высоким эндогенным регенераторным потенциалом мышей. Благодаря этому существующая в начальные моменты разница в продолжительности латентного периода СПДН между экспериментальными и контрольными группами на 24 сут уменьшается.The latent period of LDS of the damaged nerve of mice treated with pNCure, both at a dose of 60 μg and a dose of 120 μg, on day 24 of the experiment did not significantly differ from that of the control groups (Fig. 10). So, in the pNCure_1 group, the latent period was 0.715 (0.622; 0.893) ms, and in the pNCure_2 group it was 0.507 (0.45; 0.887) ms. In the control groups, the latent period was 0.861 (0.68; 0.983) ms in the “-K” group and 0.771 (0.7; 0.94) ms in the “+ K” group. Although there was no statistically significant difference in the latency period of the LDS between the groups, there is a tendency to a decrease in the latent period of LDS (increase in the rate of LDS) after pNCure administration, and a dose dependence is observed. Since this experimental design assumed multiple injections of the plasmid preparation (due to the orientation of the study on the subsequent use of the drug in humans) and could not continue for less than 24 days, the absence of a statistically significant difference in the latent period between the experimental and control groups was probably due to a relatively gentle method of nerve damage, and with a higher endogenous regenerative potential of mice. Due to this, the difference in the duration of the latent period of LDS between the experimental and control groups existing at the initial moments decreases by 24 days.
Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что нервы животных, которым делали инъекцию плазмиды pNCure в дозе 60 и 120 мкг, содержат большее количество функциональных нервных волокон, чем у животных из группы контроля (показатель амплитуда СПДН), причем более выраженный эффект наблюдается при инъекции двукратной дозы - 120 мкг.The data obtained suggest that the nerves of animals injected with pNCure plasmids at a dose of 60 and 120 μg contain a greater number of functional nerve fibers than in animals from the control group (the magnitude of the SPDN amplitude), with a more pronounced effect when injected twice doses - 120 mcg.
5. Оценка восстановления структуры нерва при действии плазмиды pNCure Оценку влияния генотерапевтического лекарственного средства на восстановление структуры поврежденного нерва осуществляли с помощью иммунофлуоресцентного анализа срезов поврежденных нервов. Для этого нервы после измерения проводимости на 24-й день эксперимента фиксировали 4% раствором формальдегида в фосфатном буфере в течение 3 часов. Фиксированные препараты отмывали от формалина в фосфатно-солевом буфере в течение 3 часов и замораживали с помощью погружения в жидкий азот в среде для замораживания Tissue-Tek (Sakura Finetek). Из участка нерва, расположенного на 3 мм дистальнее места повреждения, готовили поперечные срезы толщиной 6 мкм. Полученные срезы отмывали в фосфатно-солевом буфере (рН 7.0) 3 раза по 5 минут. Первичные и вторичные антитела разводили в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,1% Triton X-100 и 5% нормальной козьей сыворотки. На срезы наносили разведенные в 80 раз первичные кроличьи антитела к белку цитоскелета аксонов NF200 (Abeam, ab8135). Часть срезов окрашивают кроличьими неспецифическими IgG в качестве отрицательного контроля (Thermo scientific, #NC-100-P0). Срезы с нанесенными на них первичными антителами инкубировали при 4°С в течение ночи. Затем срезы отмывали в фосфатно-солевом буфере (рН 7.0) 3 раза по 5 минут и наносили на них вторичные антитела: козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с Alexa 488 (Invitrogen). Срезы инкубировали в темноте во влажной камере в течение 1 часа. Затем срезы отмывали в фосфатно-солевом буфере (рН 7.0) 3 раза по 5 минут и наносили на них 300 мМ раствор 4-,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Invitrogen) в фосфатно-солевом буфере. Срезы инкубировали в течение 2-х минут, а затем снова отмывали в фосфатно-солевом буфере (рН 7.0) 3 раза по 5 минут. Со срезов удаляли избыточную жидкость и заключали в нефлюоресцирующую среду.5. Evaluation of the restoration of the nerve structure under the action of the plasmid pNCure. Evaluation of the effect of the gene therapy drug on the restoration of the structure of the damaged nerve was carried out using immunofluorescence analysis of sections of damaged nerves. For this, the nerves after measuring the conductivity on the 24th day of the experiment were fixed with a 4% solution of formaldehyde in phosphate buffer for 3 hours. The fixed preparations were washed from formalin in phosphate-buffered saline for 3 hours and frozen by immersion in liquid nitrogen in a Tissue-Tek freezing medium (Sakura Finetek). From a nerve site located 3 mm distal to the site of injury, transverse sections were prepared with a thickness of 6 μm. The obtained sections were washed in phosphate-buffered saline (pH 7.0) 3 times for 5 minutes. Primary and secondary antibodies were diluted in phosphate buffered saline containing 0.1% Triton X-100 and 5% normal goat serum. 80-fold diluted primary rabbit antibodies to axon cytoskeleton protein NF200 (Abeam, ab8135) were applied to the sections. Some sections were stained with rabbit non-specific IgG as a negative control (Thermo scientific, # NC-100-P0). Sections coated with primary antibodies were incubated at 4 ° C. overnight. Then the sections were washed in phosphate-buffered saline (pH 7.0) 3 times for 5 minutes and secondary antibodies were applied to them: goat antibodies against rabbit immunoglobulins conjugated to Alexa 488 (Invitrogen). Sections were incubated in the dark in a humid chamber for 1 hour. Then the sections were washed in phosphate-buffered saline (pH 7.0) 3 times for 5 minutes and applied to them with a 300 mM solution of 4-, 6-diamidino-2-phenylindole (Invitrogen) in phosphate-buffered saline. Sections were incubated for 2 minutes, and then washed again in phosphate-buffered saline (pH 7.0) 3 times for 5 minutes. Excess fluid was removed from the sections and enclosed in a non-fluorescent medium.
Съемку полученных срезов проводили с помощью микроскопа Leica DM6000, оборудованного CCD DFC490 камерой (Leica Microsystems). Возбуждение красителя Alexa 488 проводят при длине волны 488 нм, а регистрацию вызванного возбуждения - при максимуме длин волн 546 нм. Количество окрашенных аксонов на полученных снимках оценивают при помощи программы Metamorph 7.1.The obtained sections were shot using a Leica DM6000 microscope equipped with a CCD DFC490 camera (Leica Microsystems). The excitation of Alexa 488 dye is carried out at a wavelength of 488 nm, and the registration of the induced excitation is carried out at a maximum wavelength of 546 nm. The number of stained axons in the obtained images is estimated using the Metamorph 7.1 program.
При анализе окрашенных криосрезов поврежденных нервов к маркеру зрелых аксонов NF200 оказалось, что через 24 суток после начала эксперимента у животных, которым вводили плазмиду pNCure в дозе 60 мкг, количество и размер структур, положительно окрашенных на аксоны, было больше по сравнению с животными, которым вводили контрольный вектор pVax. В нервах, полученных от животных из группы "pNCure_1" наблюдали в 2.1 раза больше аксонов по сравнению с нервами животных из группы контроля: 573 (489; 619) и 276 (234; 311) (n>5, p<0.05), соответственно (фиг. 11). В нервах, полученных от мышей из групп "pNCure_2" и "+К", количество нервных волокон на срез составило 554 (518; 633) и 461 (407; 545), что составляет статистически достоверную разницу с аналогичным показателем мышей из группы "-К", но достоверно не отличается от группы "pNCure_1".When analyzing stained cryosections of damaged nerves to the marker of mature axons NF200, it turned out that 24 days after the start of the experiment in animals that were injected with the plasmid pNCure at a dose of 60 μg, the number and size of structures positively stained for axons was larger compared to animals that the control vector pVax was introduced. 2.1 times more axons were observed in the nerves obtained from animals from the pNCure_1 group compared to the nerves of animals from the control group: 573 (489; 619) and 276 (234; 311) (n> 5, p <0.05), respectively (Fig. 11). In the nerves obtained from mice from the groups "pNCure_2" and "+ K", the number of nerve fibers per section was 554 (518; 633) and 461 (407; 545), which is a statistically significant difference with the same indicator for mice from the group - K ", but not significantly different from the group" pNCure_1 ".
Полученные данные свидетельствуют о более эффективном восстановлении структуры нерва (числа нейритов) в поврежденных нервах у животных, которым вводили генетическую конструкцию pNCure.The data obtained indicate a more effective restoration of the nerve structure (the number of neurites) in damaged nerves in animals that were injected with the pNCure genetic construct.
Таким образом, при изучении биологической активности препарата in vivo, установлено, что плазмида pNCure достоверно стимулирует восстановление структуры нерва. Помимо восстановления структуры поврежденного нерва плазмида pNCure стимулирует восстановление его функции, характеризующееся увеличением числа нервных волокон, проводящих потенциалы действия (увеличение амплитуды вызванных потенциалов действия по сравнению с контролем).Thus, when studying the biological activity of the drug in vivo, it was found that the plasmid pNCure significantly stimulates the restoration of the nerve structure. In addition to restoring the structure of the damaged nerve, the pNCure plasmid stimulates the restoration of its function, characterized by an increase in the number of nerve fibers conducting action potentials (an increase in the amplitude of evoked action potentials compared to the control).
Исследуемый препарат показал себя практически нетоксичным и может быть использован для терапии повреждений нервной ткани у человека. За минимальную терапевтически эффективную дозу рекомендуется принимать дозу, эквивалентную исследуемой дозе препарата 20 мкг/кг для животных моделей. При пересчете дозы на человека использовано соотношение масс животного и человека с использованием коэффициента безопасности, рекомендованного различными руководствами (Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, Москва, 2012. - 944 с.). Таким образом, начальная доза для человека составляет 2 мкг/кг веса (140 мкл на пациента весом 70 кг). Учитывая небольшой объем, в котором возможно периневральное многоточечное введение препарата, максимальный объем введения принят равным 2 мл (2 мг) (данный объем распределен на многоточечное введение - обкалывание зоны повреждения). В любом случае введение препарата в соответствии с настоящим изобретением определяет лечащий врач на основании специфических параметров пациента, таких как возраст, масса тела, пол, степень повреждения нервной ткани и т.п.The studied drug proved to be practically non-toxic and can be used to treat damage to the nervous tissue in humans. For the minimum therapeutically effective dose, it is recommended to take a dose equivalent to the studied dose of the
Примеры, демонстрирующие безопасность.Security examples.
Исследование диссеминации плазмиды pNCure в органы и ткани мыши после многократного внутримышечного введения.The study of dissemination of the plasmid pNCure in organs and tissues of the mouse after repeated intramuscular injection.
Для изучения способности исследуемой плазмиды pNCure диссеминировать из места введения (передняя большеберцовая мышца) в органы и ткани использовали самцов мышей линии С57/В16 в возрасте 10-12 недель и массой 23-27 г. Все манипуляции с животными выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными этическим комитетом при ФФМ МГУ. На протяжении всего эксперимента мыши находились на стандартном режиме в виварии и получали стандартный гранулированный корм (ООО «Аллер Петфуд», Россия) ad libitum при свободном доступе к воде. С 1-го по 7-ой день мышей выдерживали при описанных выше стандартных условиях без осуществления манипуляций. На 8-ой день эксперимента мышам делали инъекцию генетической конструкции pNCure с целью исследования ее диссеминации из места введения. Для этого каждую из мышей анестезировали инъекцией 400 мкл 2.5% раствора 2,2,2-трибромэтанола («Sigma»), фиксировали ее на операционном столике животом вверх. Голень левой задней конечности очищали от шерсти и дезинфицировали 70% спиртом. Инъекцию генетической конструкции pNCure осуществляли инсулиновым шприцем (BD) с толщиной иглы 29G путем обкалывания передней большеберцовой мышцы (6 инъекций, суммарный объем - 60 мкл). Обкалывание осуществляли чрескожно от нижней трети голени вдоль оси мышцы к верхней трети голени. Каждый раз иглу вводили срезом вверх, а по ходу продвижения иглы понемногу вводили раствор генетической конструкции. После введения раствора плазмиды шприц с иглой каждый раз очень быстро извлекали. Мышь отвязывали от столика, присваивали ей номер экспериментальной группы и помещали в клетку.To study the ability of the studied plasmid pNCure to disseminate from the injection site (anterior tibial muscle) into organs and tissues, we used male C57 / B16 mice aged 10-12 weeks and weighing 23-27 g. All manipulations with animals were performed in accordance with the "Rules for works using experimental animals ”, approved by the ethics committee at the FFM MSU. Throughout the experiment, the mice were in standard mode in the vivarium and received standard granular food (LLC Aller Petfood, Russia) ad libitum with free access to water. From the 1st to the 7th day, the mice were kept under the standard conditions described above without manipulation. On the 8th day of the experiment, the mice were injected with the pNCure genetic construct in order to study its dissemination from the injection site. For this, each of the mice was anesthetized by injection of 400 μl of a 2.5% solution of 2,2,2-tribromoethanol (Sigma), fixed on the operating table with its stomach up. The shin of the left hind limb was cleaned of wool and disinfected with 70% alcohol. The pNCure genetic construct was injected with an insulin syringe (BD) with a needle thickness of 29G by chipping the anterior tibial muscle (6 injections,
В исследовании было 2 группы экспериментальных животных.The study had 2 groups of experimental animals.
В первой группе ("pNCure_1") мышам делали внутримышечную инъекцию плазмиды pNCure в концентрации 1 мг/мл.In the first group ("pNCure_1"), the mice were injected intramuscularly with plasmid pNCure at a concentration of 1 mg / ml.
Во второй группе ("pNCure_2") мышам делали внутримышечную инъекцию плазмиды pNCure, в концентрации 2 мг/мл.In the second group ("pNCure_2"), the mice were injected intramuscularly with the plasmid pNCure, at a concentration of 2 mg / ml.
Мышам обоих групп ("pNCure_1" и "pNCure_2") за период проведения всего исследования делали по 4 инъекции: на 8-й, 11-й, 15-й, 19-й дни эксперимента. Всего в эксперименте использовали 26 мышей: по 12 мышей в каждой группе "pNCure_1" и "pNCure_2". Еще двум мышам не делали инъекций генетических конструкций и использовали их в качестве доноров органов и тканей для приготовления контрольных и калибровочных образцов.Mice of both groups ("pNCure_1" and "pNCure_2") were given 4 injections during the entire study period: on the 8th, 11th, 15th, 19th days of the experiment. A total of 26 mice were used in the experiment: 12 mice in each group pNCure_1 and pNCure_2. Two more mice were not injected with genetic constructs and used them as organ and tissue donors for the preparation of control and calibration samples.
Через 1, 2 и 4 недели после окончания курса внутримышечных инъекций pNCure, т.е. на 26-й, 33-й и 40-й день эксперимента из каждой группы забивали по 4 мыши методом цервикальной дислокации. У них забирали образцы крови (300-400 мкл), а также легких, печени, почек, селезенки, сердца, головного мозга, мышечной ткани из места введения и из контралатеральной конечности.1, 2, and 4 weeks after completion of the intramuscular injection of pNCure, i.e. on the 26th, 33rd and 40th day of the experiment, 4 mice were scored from each group by cervical dislocation. Blood samples (300-400 μl), as well as lungs, liver, kidneys, spleen, heart, brain, muscle tissue from the injection site and from the contralateral limb were taken from them.
Образцы органов размером приблизительно 2×2×3 мм (масса около 20-30 мг) взвешивали и помещали в полипропиленовые криопробирки, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С до момента проведения исследования.Organ samples of approximately 2 × 2 × 3 mm (weight about 20-30 mg) were weighed and placed in polypropylene cryovials, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until the time of the study.
Образцам крови давали свернуться (30 минут при комнатной температуре) и позволяли сыворотке крови отделиться от тромба (18 часов при +4°С). Затем пробирки со свернувшейся кровью центрифугировали при 10000g в течение 15 минут, отделившуюся сыворотку крови переносили в криопробирки, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С до момента анализа.Blood samples were allowed to clot (30 minutes at room temperature) and allowed the serum to separate from the thrombus (18 hours at + 4 ° C). Then, coagulated blood tubes were centrifuged at 10000 g for 15 minutes, the separated blood serum was transferred to cryovials, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until analysis.
По завершении эксперимента полученные в разные временные точки эксперимента образцы органов и тканей лизировали при 56°С в течение 18-24 часов (до полного растворения) в 200 мкл раствора, содержащего 50 мМ Tris (рН 8.0), 100 мМ ЭДТА, 0.5% SDS и 0.7 мг протеиназы К на 1 мл раствора. Полученные лизаты разводили деионизованной водой в 10 раз и использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени. Лизаты органов и тканей, содержащих ДНК, до момента исследования хранили при -20°С. Из образцов сыворотки крови ДНК выделяли фенол-хлороформным методом с последующим переосаждением изопропанолом и восстановлением деионизованной водой до исходного объема сыворотки крови.At the end of the experiment, organ and tissue samples obtained at different time points of the experiment were lysed at 56 ° C for 18-24 hours (until completely dissolved) in 200 μl of a solution containing 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM EDTA, 0.5% SDS and 0.7 mg of proteinase K per 1 ml of solution. The resulting lysates were diluted 10 times with deionized water and used as a matrix for real-time PCR. Lysates of organs and tissues containing DNA were stored at -20 ° C until the study. DNA was isolated from serum samples using the phenol-chloroform method, followed by reprecipitation with isopropanol and reduction with deionized water to the original volume of blood serum.
Оценку диссеминации плазмидной ДНК из места введения в органы и ткани оценивали методом ПЦР в реальном времени. Для этого использовали пары праймеров, приведенные в таблице 4.Assessment of the dissemination of plasmid DNA from the site of introduction into organs and tissues was evaluated by real-time PCR. To do this, used a pair of primers shown in table 4.
Амплификацию контрольных и экспериментальных образцов производили в термоциклере iCycler с системой детекции iQ5 (Bio-Rad) при помощи набора для ПЦР в реальном времени qPCRmix-HS SYBR (#PK147L) согласно прописи реакционной смеси и программе амплификации рекомендуемой производителем. Количество раствора вносимой ДНК составило 1 мкл на 25 мкл тотального объема реакционной смеси. Отжиг праймеров на матрицу осуществляли при 57.5°С, а элонгацию осуществляли при 72°С в течение 20 секунд. Регистрацию флуоресцентного сигнала (SYBR) в канале FAM и анализ полученных результатов осуществляли при помощи программы CFX Manager Software (Bio-Rad). В качестве анализируемого параметра использовали параметр ΔCt, обратно пропорциональный количеству исходной ДНК в реакционной смеси и характеризующий цикл, когда уровень сигнала превысил значение фона. Параллельно с обнаружением плазмидной ДНК в органах и тканях мыши определяли количество геномной ДНК (ген мышечного актина альфа-1 - Acta1). Данный тест использовали в качестве внутреннего контроля для сравнения качества выделения ДНК из образцов и органов мыши от образца к образцу и контроля на деградацию ДНК. Нормирование определенной в образце плазмидной ДНК осуществляли на массу лизированного образца органа или ткани.The amplification of the control and experimental samples was performed in the iCycler thermal cycler with the iQ5 detection system (Bio-Rad) using the qPCRmix-HS SYBR real-time PCR kit (# PK147L) according to the reaction formula and the manufacturer's recommended amplification program. The amount of the introduced DNA solution was 1 μl per 25 μl of the total volume of the reaction mixture. Primers on the template were annealed at 57.5 ° С, and elongation was carried out at 72 ° С for 20 seconds. Registration of the fluorescent signal (SYBR) in the FAM channel and analysis of the results were carried out using the CFX Manager Software (Bio-Rad). The parameter ΔCt, inversely proportional to the amount of the initial DNA in the reaction mixture and characterizing the cycle when the signal level exceeded the background value, was used as the analyzed parameter. In parallel with the detection of plasmid DNA in the organs and tissues of the mouse, the amount of genomic DNA (muscle actin alpha-1 gene - Acta1) was determined. This test was used as an internal control to compare the quality of DNA extraction from samples and mouse organs from sample to sample and control for DNA degradation. The plasmid DNA defined in the sample was normalized to the mass of the lysed sample of an organ or tissue.
Методика анализа содержания плазмидной и геномной ДНК в образцах сыворотки крови, образцов органов и тканей была валидирована. Для валидации использовались растворы плазмиды pNCure на деионизованной воде концентрацией 0.5 нг/мкл, 5 пг/мкл, 50 фг/мкл, 0.5 фг/мкл, а также растворы плазмиды pNCure на экстракте сыворотки крови и лизатах образцов органов и тканей с концентрацией pNCure 0.5 нг/мкл, 5 пг/мкл, 50 фг/мкл, 0.5 фг/мкл. Калибровочные образцы подвергали анализу на содержание плазмидной ДНК методом ПЦР в реальном времени с использованием праймеров pNCure-f и pNCure-r (в 3 независимых повторах). Полученные данные использовали для построения калибровочных графиков, выведения уравнений с целью последующего вычисления концентрации плазмиды pNCure в образцах сыворотки крови, образцах органов и тканей. Для получения калибровочных графиков использовали логарифмическую интерполяцию 
Выполненная валидация подтвердила, что плазмидная ДНК одинаково хорошо и воспроизводимо определяется во всех типах матриц: от деионизованной воды до экстрактов сыворотки крови, образцов органов и тканей. Поскольку как таковой экстракции ДНК из образцов органов и тканей (за исключением сыворотки крови) не проводилось (лишь лизис и разбавление в 10 раз), то и эффективность экстракции плазмидной ДНК из образцов органов и тканей не оценивали. В эксперименте также анализу подвергали образцы, содержащие плазмидную ДНК в количестве 5 аг на ПЦР-реакцию. Однако полученные для них параметры ΔCt оказались ниже предела чувствительности метода.The validation performed confirmed that plasmid DNA is equally well and reproducibly determined in all types of matrices: from deionized water to extracts of blood serum, samples of organs and tissues. Since, as such, DNA extraction from samples of organs and tissues (with the exception of blood serum) was not carried out (only lysis and
Определение количества плазмидной ДНК в образцах органов и тканей С использованием калибровочных кривых плазмидной ДНК в образцах крови, а также лизатах органов и тканей были получены уравнения, позволяющие определять количество плазмидной ДНК в экспериментальных образцах органов и тканей. Общий вид полученного уравнения:Determination of the amount of plasmid DNA in samples of organs and tissues Using calibration curves of plasmid DNA in blood samples, as well as lysates of organs and tissues, equations were obtained that allow determining the amount of plasmid DNA in experimental samples of organs and tissues. General view of the resulting equation:
Р - искомое количество плазмидной ДНК в экспериментальном образце,P is the desired amount of plasmid DNA in the experimental sample,
ΔCt - значение порогового цикла для соответствующего образцаΔCt - threshold cycle value for the corresponding sample
А и k - коэффициенты из уравнения
Определение пределов чувствительности (LOD) и количественного определения (LOQ) ПЦР-метода детекции плазмидной ДНКDetermination of the limits of sensitivity (LOD) and quantification (LOQ) of the PCR method for detecting plasmid DNA
Для определения пределов чувствительности (Limit of Detection) и пределов количественного определения (LOQ) плазмидной ДНК в образцах органов и тканей, а также в сыворотке крови использовали данные измерений, полученные в ходе валидации методики при анализе «холостых» проб лизатов и экстрактов, не содержащих плазмидную ДНК. LOD оценивается как количество плазмидной ДНК в реакционной смеси, соответствующее утроенному среднему значению ΔCt (из 3), полученному при анализе «холостых» проб лизатов или экстрактов, a LOQ - количество плазмидной ДНК, соответствующее десяти средним значениям ΔCt, полученных при анализе «холостых» проб [3]. Формулы для вычисления LOD и LOQ приведены ниже:To determine the limits of sensitivity (Limit of Detection) and the limits of quantitative determination (LOQ) of plasmid DNA in samples of organs and tissues, as well as in blood serum, we used the measurement data obtained during validation of the method for the analysis of “blank” samples of lysates and extracts that do not contain plasmid DNA. LOD is estimated as the amount of plasmid DNA in the reaction mixture corresponding to a triple average ΔCt value (out of 3) obtained by analysis of “blank” samples of lysates or extracts, and LOQ is the amount of plasmid DNA corresponding to ten average ΔCt values obtained by analysis of “blank” samples [3]. The formulas for calculating LOD and LOQ are given below:
LOD - предел обнаружения,LOD - detection limit,
LOQ - предел измерения,LOQ - measurement limit,
Р - искомое количество плазмидной ДНК в экспериментальном образце,P is the desired amount of plasmid DNA in the experimental sample,
ΔCt - значение порогового цикла для соответствующего образцаΔCt - threshold cycle value for the corresponding sample
А и k - коэффициенты из уравнения 
Результаты определения пределов чувствительности (LOD) и количественного определения (LOQ) ПЦР-метода детекции плазмидной ДНК приведены в таблице 6.The results of determining the limits of sensitivity (LOD) and quantitative determination (LOQ) of the PCR method for detecting plasmid DNA are shown in table 6.
Результаты исследования диссеминации плазмиды pNCure в органы и ткани мышей из области введения приведены в таблицах.The results of the study of dissemination of the plasmid pNCure in the organs and tissues of mice from the injection area are shown in tables.
Расчет количества плазмидной ДНК, попавшей в состав реакционной ПЦР-смеси, осуществляли при помощи приведенной выше формулы 
Расчет количества плазмидной ДНК в исходных образцах сыворотки крови, а также образцах органов и тканей осуществляли путем нормирования данных на массу образца с учетом всех примененных разбавлений. Полученные данные приведены в Таблице 9.The calculation of the amount of plasmid DNA in the initial samples of blood serum, as well as samples of organs and tissues was carried out by normalizing the data on the mass of the sample, taking into account all applied dilutions. The data obtained are shown in Table 9.
Полученные данные демонстрируют, что в абсолютном большинстве образцов плазмидная ДНК отсутствует или находится ниже предела чувствительности метода обнаружения. В некоторых образцах обнаруживаются следовые количества выбранной специфической последовательности плазмидной ДНК.The data obtained demonstrate that in the vast majority of samples, plasmid DNA is absent or is below the detection limit of the detection method. In some samples, traces of the selected specific plasmid DNA sequence are detected.
Для проверки экспрессии данной генетической конструкции вне сайта введения был проведен иммуноферментный анализ на мозговой нейротрофический фактор человека в гомогенатах образцов органов и тканей (Human Free BDNF Immunoassay, R&D, #DBD00). Результаты исследования приведены на фиг. 12. Видно, что достоверного повышения уровня экспрессии белков, кодируемых данной плазмидой, в органах и тканях животных (за исключением мышцы, куда делали инъекцию) не наблюдается.An enzyme-linked immunosorbent assay for human brain neurotrophic factor in homogenates of organ and tissue samples (Human Free BDNF Immunoassay, R&D, # DBD00) was performed to test the expression of this genetic construct outside the injection site. The results of the study are shown in FIG. 12. It is seen that there is no significant increase in the expression level of proteins encoded by this plasmid in the organs and tissues of animals (with the exception of the muscle where the injection was made).
На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы о том, что диссеминация плазмиды pNCure после ее многократного внутримышечного введения из места введения в органы и ткани мыши не значительна. Увеличение количества вводимой плазмиды pNCure в 2 раза в целом отражается на большем количестве плазмиды в месте инъекции, однако, согласно полученным данным, не способствует усилению ее диссеминации из места введения. С течением времени количество плазмиды pNCure в органах и тканях животного прогрессивно убывает, хотя следы выбранной специфической последовательности плазмидной ДНК можно обнаружить в незначительных количествах в органах и тканях части животных через 4 недели после последней инъекции. При этом максимально-детектируемые количества выбранной специфической последовательности плазмидной ДНК составляют не более 0.2% от стандартной введенной дозы (60 мкг) и не сопровождаются эктопической экспрессией трансгена. По-видимому, обнаруживаемые фрагменты плазмидной ДНК не являются функционально-активными.Based on the results obtained, the following conclusions can be drawn that dissemination of the plasmid pNCure after its multiple intramuscular administration from the place of introduction into the organs and tissues of the mouse is not significant. A 2-fold increase in the amount of pNCure plasmid introduced is generally reflected in a larger number of plasmids at the injection site, however, according to the data obtained, it does not enhance its dissemination from the injection site. Over time, the amount of pNCure plasmid in the organs and tissues of the animal progressively decreases, although traces of the selected specific plasmid DNA sequence can be found in small amounts in the organs and tissues of some
ГенотоксичностьGenotoxicity
Исследование выполнено на половозрелых самцах мышей Fi (СВАхС57В1/6), массой 20-22 г., в возрасте 8-9 недель, полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая». Условия содержания животных соответствовали стандартам, указанным в: Guide for the care and use of laboratory animals/ National Academy press; Washington, D.C., 2011; Приказе Минздрава России от 01.04.2016 №199н "Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики"; СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. До начала эксперимента мыши содержались в лаборатории в течение не менее 5 дней. Во время этого периода осуществлялся ежедневный осмотр внешнего состояния животных. Мыши с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями от нормы исключались из эксперимента.The study was performed on sexually mature male Fi mice (CBAxC57B1 / 6), weighing 20-22 g., At the age of 8-9 weeks, obtained from the Stolbovaya laboratory animal nursery. The conditions of the animals were in accordance with the standards specified in: Guide for the care and use of laboratory animals / National Academy press; Washington, D.C., 2011; Order of the Ministry of Health of Russia dated April 01, 2016 No. 199n "On approval of the Rules of Good Laboratory Practice"; SP 2.2.1.3218-14 “Sanitary and epidemiological requirements for the design, equipment and maintenance of experimental biological clinics (vivariums)” dated August 29, 2014. Before the start of the experiment, the mice were kept in the laboratory for at least 5 days. During this period, a daily examination of the external condition of the animals was carried out. Mice with abnormalities detected during the examination were excluded from the experiment.
Оценку ДНК-повреждающей активности препарата проводили методом ДНК-комет в щелочной версии. Препарат из расчета 20 и 200 мг/кг вводили животным в бедренную мышцу, однократно, на сроки 3 и 24 часа. В качестве отрицательного контроля использовали животных, которым внутримышечно вводили физиологический раствор в эквивалентных количествах. В качестве положительного контроля использовали животных, которым вводили внутрибрюшинно метилметансульфонат в дозе 40 мг/кг на срок 3 часа. Умерщвление животных осуществляли смещением шейных позвонков. Выделяли бедренную мышцу, в которую проводили инъекцию препарата, обе бедренные кости, печень и головной мозг. Эпифизы бедренных костей срезали и вымывали клетки костного мозга 2 мл предварительно охлажденного до 4°С фосфатно-солевого буфера (ФСБ), содержащего 20 mM EDTA-Na2 и 10% ДМСО (рН 7.5). Печень и головной мозг измельчали в стеклянной пробирке в 2 мл того же буфера и раздавливали стеклянной палочкой. Бедренную мышцу гомогенизировали в 2 мл ФСБ с использованием гомогенизатора IKA Т25 при 8000 об/мин в течение 15 секунд. Пробирки с измельченными тканями выдерживали 5 мин при комнатной температуре для осаждения крупных фрагментов. Полученные суспензии клеток в объеме 60 мкл вносили в пробирки, содержащие 240 мкл 1% раствора легкоплавкой агарозы в буфере ФСБ, подогретого до 36°С (микротермостат «Термит», Россия) и ресуспендировали. Затем 60 мкл раствора агарозы с клетками наносили на предварительно покрытые 1% универсальной агарозой предметные стекла, покрывали покровным стеклом и помещали на лед. Далее все операции проводили в затемненном помещении при желтом свете. После затвердевания агарозы (около 5-10 минут) покровные стекла осторожно удаляли, микропрепараты помещали в стеклянную кювету (тип Шиффендекер), заливали предварительно охлажденным до 4°С лизирующим буфером (10 mM Tris-HCl [рН 10], 2.5М NaCl, 100 mM EDTA-Na2, 1% Triton Х-100, 10% ДМСО) и инкубировали не менее 1 часа. После окончания лизиса микропрепараты переносили в охлажденный до 4°С буфер для электрофореза - 300 mM NaOH, 1 mM EDTA-Na2 [рН>13]. Инкубировали в течение 20 мин для реализации щелочно-лабильных сайтов и щелочной денатурации ДНК. После микропрепараты переносили в камеру для электрофореза (SubCell GT, "Bio-Rad"), заполненную свежим охлажденным буфером и проводили электрофорез в течение 20 минут при напряженности поля 1 V/cm и силе тока ~300 mA. По окончанию электрофореза микропрепараты переносили в стеклянную кювету, отмывали в течение 10 мин в фосфатно-солевом буфере и фиксировали в 70% растворе этилового спирта в течение 15 минут. После фиксации микропрепараты высушивали и хранили до анализа при комнатной температуре.Assessment of DNA-damaging activity of the drug was carried out by the method of DNA-comets in the alkaline version. The drug at the rate of 20 and 200 mg / kg was administered to the animals in the femoral muscle, once, for a period of 3 and 24 hours. As a negative control, animals were used which were injected intramuscularly with physiological saline in equivalent amounts. As a positive control, we used animals that were injected intraperitoneally with methyl methanesulfonate at a dose of 40 mg / kg for a period of 3 hours. Killing animals was carried out by displacement of the cervical vertebrae. The femoral muscle was injected into which the drug was injected, both thigh bones, liver and brain. Epiphyses of the femur were cut off and washed out of bone marrow cells with 2 ml of phosphate-buffered saline (FSB) pre-cooled to 4 ° С containing 20 mM EDTA-Na 2 and 10% DMSO (pH 7.5). The liver and brain were ground in a glass tube in 2 ml of the same buffer and crushed with a glass rod. The femoral muscle was homogenized in 2 ml of FSB using an IKA T25 homogenizer at 8000 rpm for 15 seconds. Tubes with crushed tissues were kept for 5 min at room temperature to precipitate large fragments. The resulting cell suspensions in a volume of 60 μl were introduced into tubes containing 240 μl of a 1% solution of low-melting agarose in FSB buffer heated to 36 ° C (Termit microthermostat, Russia) and resuspended. Then, 60 μl of a solution of agarose with cells was applied onto slides precoated with 1% universal agarose, covered with a coverslip and placed on ice. Further, all operations were carried out in a darkened room with yellow light. After hardening of the agarose (about 5-10 minutes), the coverslips were carefully removed, the micropreparations were placed in a glass cuvette (Schiffendecker type), poured with lysis buffer pre-cooled to 4 ° C (10 mM Tris-HCl [pH 10], 2.5 M NaCl, 100 mM EDTA-Na 2 , 1% Triton X-100, 10% DMSO) and incubated for at least 1 hour. After lysis was complete, the micropreparations were transferred to an electrophoresis buffer cooled to 4 ° С — 300 mM NaOH, 1 mM EDTA-Na 2 [pH> 13]. Incubated for 20 min to realize alkaline labile sites and alkaline DNA denaturation. After the micropreparations were transferred to an electrophoresis chamber (SubCell GT, Bio-Rad) filled with fresh chilled buffer, electrophoresis was performed for 20 minutes at a field strength of 1 V / cm and current strength of ~ 300 mA. At the end of electrophoresis, the micropreparations were transferred to a glass cuvette, washed for 10 minutes in phosphate-buffered saline, and fixed in 70% ethyl alcohol solution for 15 minutes. After fixation, the micropreparations were dried and stored until analysis at room temperature.
Непосредственно перед микроскопированием препараты окрашивали флуоресцирующим красителем SYBR Green I (1:10000 в ТЕ-буфере [рН 8.5] с 50% глицерином,) в течение 30 мин в темноте. Анализ проводили на эпифлуоресцентном микроскопе Микмед-2 12Т («Ломо», Россия), совмещенном с цифровой камерой высокого разрешения (VEC-335, «ЭВС», Россия), при увеличении х200. Полученные с микропрепаратов изображения ДНК-комет анализировали с использованием программного обеспечения CASP 1.2.2. В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте). С каждого микропрепарата снимали и анализировали не менее 100 ДНК-комет.Immediately prior to microscopy, the preparations were stained with SYBR Green I fluorescent dye (1: 10000 in TE buffer [pH 8.5] with 50% glycerol,) for 30 min in the dark. The analysis was carried out on an Mikmed-2 12T epifluorescence microscope (Lomo, Russia) combined with a high-resolution digital camera (VEC-335, EVS, Russia), at a magnification of x200. Micropreparation images of DNA comets were analyzed using CASP 1.2.2 software. The percentage of DNA in the tail of DNA comets (% of DNA in the tail) was used as an indicator of DNA damage. At least 100 DNA comets were removed and analyzed from each micropreparation.
Перед статистической обработкой выборки каждой экспериментальной группы проверялись на нормальность и гомогенность дисперсий показателей с использованием критерия Шапиро-Уилка и критерия Барлетта, соответственно. При соответствии указанным условиям проводили статистическую оценку с использованием непараметрического критерия Даннета. Если распределение отличалось от нормального, и/или выявлялись отличия в дисперсиях, в соответствии с рекомендуемыми подходами к статистической обработке данных метода ДНК-комет проводили логарифмическое преобразование исходных показателей с последующим анализом с использованием непараметрического критерия Даннета.Before statistical processing, the samples of each experimental group were checked for normality and homogeneity of variances of indicators using the Shapiro-Wilk test and the Barlett test, respectively. When these conditions were met, a statistical evaluation was carried out using the non-parametric Dunnet test. If the distribution was different from normal, and / or differences in variances were detected, in accordance with the recommended approaches to the statistical processing of data from the DNA-comet method, a logarithmic transformation of the initial indicators was carried out with subsequent analysis using the non-parametric Dunnet test.
Поврежденность ДНК, оцениваемая по показателю %ДНК в хвосте, в органах/тканях животных негативного контроля находилась в пределах исторических контролей лаборатории. У животных группы позитивного контроля введение метилметансульфоната в дозе 40 мг/кг привело к статистически значимому увеличению ДНК-повреждений в исследованных органах/тканях животных.DNA damage, as measured by the% DNA in the tail, in the organs / tissues of animals of the negative control was within the historical laboratory controls. In animals of the positive control group, administration of methyl methanesulfonate at a dose of 40 mg / kg led to a statistically significant increase in DNA damage in the studied organs / tissues of animals.
В клетках костного мозга животных группы негативного контроля уровень ДНК-повреждений зарегистрирован на уровне 3.7±1.6% ДНК в хвосте. У животных, обработанных препаратом в дозах 20 и 200 мг/кг, данный показатель составил 3.4±0.9% и 3.2±0.9% ДНК в хвосте, соответственно. Сопоставление полученных данных с показателем соответствующего негативного контроля не выявило статистически значимых отличий.In the bone marrow cells of animals of the negative control group, the level of DNA damage was recorded at the level of 3.7 ± 1.6% of DNA in the tail. In animals treated with the drug at doses of 20 and 200 mg / kg, this indicator was 3.4 ± 0.9% and 3.2 ± 0.9% of DNA in the tail, respectively. Comparison of the obtained data with the indicator of the corresponding negative control did not reveal statistically significant differences.
Влияние препарата pNCure на уровень ДНК-повреждений в органах и тканях мышей в условиях 3-часовой экспозицииEffect of pNCure on the level of DNA damage in organs and tissues of mice under conditions of 3-hour exposure
В клетках печени животных, обработанных растворителем, уровень ДНК-повреждений зарегистрирован на уровне 3.5±0.3% ДНК в хвосте. Не выявлено значимых отличий по сравнению с контролем при введении животным препарата в дозах 20 и 200 мг/кг: 3.2±0.7 и 3.0±0.5% ДНК в хвосте, соответственно.In solvent-treated animal liver cells, the level of DNA damage was recorded at 3.5 ± 0.3% of DNA in the tail. There were no significant differences compared with the control when the animals were administered the drug at doses of 20 and 200 mg / kg: 3.2 ± 0.7 and 3.0 ± 0.5% of DNA in the tail, respectively.
Уровень ДНК-повреждений в клетках головного мозга контрольных животных зарегистрирован на уровне 1.9±0.6% ДНК в хвосте. После введения препарата в дозах 20 и 200 мг/кг показатель составил, соответственно, 1.8±0.2 и 1.8±0.5 %ДНК в хвосте, что статистически значимо не отличалось от показателя соответствующего негативного контроля.The level of DNA damage in the brain cells of control animals was recorded at 1.9 ± 0.6% of DNA in the tail. After administration of the drug at doses of 20 and 200 mg / kg, the indicator was 1.8 ± 0.2 and 1.8 ± 0.5% of DNA in the tail, respectively, which did not statistically significantly differ from the corresponding negative control.
В клетках мышечной ткани животных группы негативного контроля уровень ДНК-повреждений зарегистрирован на уровне 5.4±0.9% ДНК в хвосте. У животных, обработанных препаратом в дозах 20 и 200 мг/кг, данный показатель составил 5.8±0.8 и 5.3±0.7% ДНК в хвосте. Сопоставление полученных данных с показателем соответствующего негативного контроля не выявило статистически значимых отличий.In the muscle tissue cells of animals of the negative control group, the level of DNA damage was recorded at the level of 5.4 ± 0.9% of DNA in the tail. In animals treated with the drug at doses of 20 and 200 mg / kg, this indicator was 5.8 ± 0.8 and 5.3 ± 0.7% of DNA in the tail. Comparison of the obtained data with the indicator of the corresponding negative control did not reveal statistically significant differences.
Влияние препарата pNCure на уровень ДНК-повреждений в органах и тканях мышей в условиях 24-часовой экспозицииThe effect of pNCure on the level of DNA damage in the organs and tissues of mice under 24-hour exposure
В клетках костного мозга животных, обработанных растворителем, уровень ДНК-повреждений зарегистрирован на уровне 2.4±1.0% ДНК в хвосте. После введения препарата в дозах 20 и 200 мг/кг данный показатель оказался сходным: соответственно, 2.4±0.8 и 2.4±0.5% ДНК в хвосте.In solvent-treated animals' bone marrow cells, the level of DNA damage was recorded at 2.4 ± 1.0% of DNA in the tail. After administration of the drug in doses of 20 and 200 mg / kg, this indicator turned out to be similar: 2.4 ± 0.8 and 2.4 ± 0.5% of DNA in the tail, respectively.
Аналогично, в клетках печени не выявлено значимых отличий по сравнению с контролем при введении препарата в дозах 20 и 200 мг/кг: 2.0±0.3 и 1.9±0.5% ДНК в хвосте против 2.3±0.3% для негативного контроля.Similarly, in the liver cells there were no significant differences compared with the control when the drug was administered in doses of 20 and 200 mg / kg: 2.0 ± 0.3 and 1.9 ± 0.5% of DNA in the tail against 2.3 ± 0.3% for the negative control.
Уровень ДНК-повреждений в клетках головного мозга животных негативного контроля зарегистрирован на уровне 1.1±0.3% ДНК в хвосте. После введения препарата в дозах 20 и 200 мг/кг показатель составил, соответственно, 1.2±0.3 и 1.3±0.7% ДНК в хвосте, что статистически значимо не отличалось от показателя соответствующего негативного контроля.The level of DNA damage in the brain cells of animals of negative control was recorded at the level of 1.1 ± 0.3% of DNA in the tail. After administration of the drug at doses of 20 and 200 mg / kg, the indicator was 1.2 ± 0.3 and 1.3 ± 0.7% of DNA in the tail, respectively, which did not statistically significantly differ from the corresponding negative control.
В клетках мышечной ткани мышей группы негативного контроля уровень ДНК-повреждений зарегистрирован на уровне 5.3±1.5% ДНК в хвосте. У животных, обработанных препаратом в дозах 20 и 200 мг/кг, данный показатель составил 4.9±1.0 и 5.5±0.9% ДНК в хвосте, соответственно. Попарное сопоставление полученных данных с показателями соответствующего негативного контроля не выявило статистически значимых отличий.In the cells of muscle tissue of mice of the negative control group, the level of DNA damage was recorded at the level of 5.3 ± 1.5% of DNA in the tail. In animals treated with the drug in doses of 20 and 200 mg / kg, this indicator was 4.9 ± 1.0 and 5.5 ± 0.9% of DNA in the tail, respectively. A pairwise comparison of the obtained data with indicators of the corresponding negative control did not reveal statistically significant differences.
Таким образом, установлено, что препарат pNCure при внутримышечном введении мышам в дозах 20 и 200 мг/кг в условиях 3-й 24-часовой экспозиции не индуцирует ДНК-повреждений в клетках костного мозга, печени, головного мозга и мышечной ткани.Thus, it was found that pNCure, when administered intramuscularly to mice at doses of 20 and 200 mg / kg under conditions of the 3rd 24-hour exposure, does not induce DNA damage in the cells of bone marrow, liver, brain and muscle tissue.
Результаты проведенных экспериментов позволяют сделать следующие выводы: Препарат pNCure при однократном внутримышечном введении в дозах 20 и 200 мг/кг на срок 3 часа не индуцирует повреждения ДНК в клетках костного мозга, печени, головного мозга и мышечной ткани мышей. Препарат pNCure при однократном внутримышечном введении в дозах 20 и 200 мг/кг на срок 24 часа не индуцирует повреждения ДНК в клетках костного мозга, печени, головного мозга и мышечной ткани мышей.The results of the experiments allow us to draw the following conclusions: pNCure with a single intramuscular injection at doses of 20 and 200 mg / kg for a period of 3 hours does not induce DNA damage in the cells of the bone marrow, liver, brain and muscle tissue of mice. The pNCure preparation with a single intramuscular injection in doses of 20 and 200 mg / kg for a period of 24 hours does not induce DNA damage in the cells of the bone marrow, liver, brain and muscle tissue of mice.
Полученные результаты позволяют заключить, что препарат pNCure в диапазоне исследованных дозировок не проявляет эффектов, свидетельствующих о его генотоксической активности.The results obtained allow us to conclude that the pNCure preparation in the range of studied dosages does not show effects indicating its genotoxic activity.
Исследование субхронической токсичности плазмидной ДНК pNCurePNCure Plasmid DNA Plasma Toxicity Assay
С целью исследования возможных нежелательных явлений при многократном введении исследуемого препарата выполнены токсикологические исследования, направленные на выявление возможного повреждающего действия лекарственного средства при его длительном введении, на выявление наиболее чувствительных органов и систем организма.In order to study the possible adverse effects with repeated administration of the studied drug, toxicological studies have been carried out aimed at identifying the possible damaging effect of the drug during its long-term administration, at identifying the most sensitive organs and systems of the body.
В ходе исследования учету подлежали случаи гибели животных, оценивалась неврологическая симптоматика, регистрировался вес животных, учитывалось потребление животными пищи и воды, макроскопическая и гистологическая картина состояния внутренних органов (у каждого погибшего или эвтаназированного животного), клинический анализ крови при помощи автоматического анализатора клеток крови, биохимический анализ сыворотки крови при помощи автоматического анализатора, ЭКГ во втором стандартном отведении, поведение животных в тесте «Открытое поле. Исследования выполнялись в соответствии с требованиями нормативного документа «Правила лабораторной практики».In the course of the study, cases of animal death were subject to registration, neurological symptoms were assessed, animal weight was recorded, animals consumed food and water, a macroscopic and histological picture of the state of internal organs (for each dead or euthanized animal), a clinical blood test using an automatic blood cell analyzer, biochemical analysis of blood serum using an automatic analyzer, ECG in the second standard lead, the behavior of animals in the test "Open field. The studies were carried out in accordance with the requirements of the normative document “Laboratory Practice Rules”.
Для проведения исследования хронической токсичности использовали крыс линии Wistar обоего пола массой 180-200 г и кроликов породы «Шиншилла» обоего пола массой 2,2-2,5 кг (на момент поступления в виварий). Использованные виды лабораторных животных являются стандартными тест-системами в опытах для изучения хронического токсического действия фармакологических веществ. Крысы были получены из питомника лабораторных животных «Пущино», кролики - из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово». Состояние здоровья животных при поступлении подтверждено ветеринарными сертификатами.To conduct a study of chronic toxicity, Wistar rats of both sexes weighing 180-200 g and rabbits of the Chinchilla breed of both sexes weighing 2.2-2.5 kg were used (at the time of admission to the vivarium). Used laboratory animal species are standard test systems in experiments for studying the chronic toxic effects of pharmacological substances. Rats were obtained from the Pushchino laboratory animal nursery, and rabbits from the Federal State Unitary Enterprise Rappolovo Laboratory Animal Nursery. The health status of animals upon admission is confirmed by veterinary certificates.
До начала исследования животные содержались 14 д в стандартных условиях под наблюдением без проведения исследовательских манипуляций.Before the start of the study, the animals were kept for 14 days under standard conditions under observation without conducting research manipulations.
При изучении хронического токсического действия ФС использован внутримышечный путь введения, запланированный для клинического применения. Курс введения препарата в эксперименте составил 30 сут. Выбор доз и шага доз осуществляли с учетом результатов исследования острой токсичности ФС (в выбранных дозах падеж животных отсутствовал, признаки токсического действия ФС обнаружены не были). В качестве минимальной дозы была выбрана терапевтическая доза, которая, при пересчете предполагаемой терапевтической дозы для человека (1,4 мг на 70 кг массы тела или 20 мкг/кг), составила для крыс - 0,118 мг/кг, для кроликов - 0,064 мг/кг. В качестве максимальной дозы была выбрана доза 2 мг/кг (доза, использованная в исследовании острого токсического действия фармацевтической субстанции, в сто раз превышающая предполагаемую терапевтическую дозу для человека) для обоих видов животных. Введение промежуточной дозы при отсутствии признаков острого токсического действия фармацевтической субстанции показалось нецелесообразным. Таким образом: Дозы для в/м введения крысам: 0 мг/кг, 0,118 мг/кг, 2 мг/кг.Дозы для в/м введения кроликам: 0 мг/кг, 0,064 мг/кг, 2 мг/кг.In the study of the chronic toxic effect of FS, an intramuscular route of administration, planned for clinical use, was used. The course of drug administration in the experiment was 30 days. The choice of doses and dose steps was carried out taking into account the results of a study of acute FS toxicity (there was no case of animals in the selected doses, signs of the toxic effect of PS were not detected). The therapeutic dose was chosen as the minimum dose, which, when recalculating the estimated therapeutic dose for humans (1.4 mg per 70 kg of body weight or 20 μg / kg), was 0.118 mg / kg for rats and 0.064 mg / for rabbits kg As the maximum dose, a dose of 2 mg / kg was chosen (the dose used in the study of the acute toxic effect of a pharmaceutical substance, one hundred times higher than the expected therapeutic dose for humans) for both species of animals. The introduction of an intermediate dose in the absence of signs of acute toxic effects of a pharmaceutical substance seemed inappropriate. Thus: Doses for i / m administration to rats: 0 mg / kg, 0.118 mg / kg, 2 mg / kg. Doses for i / m administration to rats: 0 mg / kg, 0.064 mg / kg, 2 mg / kg.
Животные были случайным образом распределены по группам: 1 группа (контрольная) - 20 крыс обоего пола, внутримышечно ежедневно в течение 30 дней вводили физиологический раствор; 2 группа (опытная) - 20 крыс обоего пола, внутримышечно ежедневно в течение 30 дней вводили ФС в дозе 0,118 мг/кг; 3 группа (опытная) - 20 крыс обоего пола, внутримышечно ежедневно в течение 30 дней вводили ФС в дозе 2 мг/кг; 4 группа (опытная) - 12 кроликов обоего пола, внутримышечно ежедневно в течение 30 д вводили физиологический раствор; 5 группа (контрольная) - 12 кроликов обоего пола, внутримышечно ежедневно в течение 30 дней вводили ФС в дозе 0,064 мг/кг; 6 группа (опытная) - 12 кроликов обоего пола, внутримышечно ежедневно в течение 30 дней вводили ФС в дозе 2 мг/кг. Общее количество экспериментальных крыс -60 голов (30 самок и 30 самцов), кроликов - 36 голов (18 самок и 18 самцов).Animals were randomly divided into groups: group 1 (control) - 20 rats of both sexes, saline was injected intramuscularly daily for 30 days; Group 2 (experimental) - 20 rats of both sexes; FS was administered intramuscularly daily for 30 days at a dose of 0.118 mg / kg; Group 3 (experimental) - 20 rats of both sexes; FS was administered intramuscularly daily for 30 days at a dose of 2 mg / kg; Group 4 (experimental) - 12 rabbits of both sexes, injected with saline daily intramuscularly for 30 d; Group 5 (control) - 12 rabbits of both sexes, FS was administered intramuscularly daily for 30 days at a dose of 0.064 mg / kg; Group 6 (experimental) - 12 rabbits of both sexes; FS was administered intramuscularly daily for 30 days at a dose of 2 mg / kg. The total number of experimental rats is 60 animals (30 females and 30 males), rabbits - 36 animals (18 females and 18 males).
С первого по 30 день эксперимента животным вводили физиологический раствор или ФС в дозах в соответствии с номером группы. На 30 день эксперимента эвтаназировали для последующей диагностической аутопсии и забора органов на гистологический анализ половину животных в каждой группе (5 самцов и 5 самок в каждой группе для крыс, 3 самца и 3 самки в каждой группе для кроликов). Вторая половина животных оставлена для наблюдения обратимости действия ФС. Последующие наблюдения длились 30 сут (с 31 до 60 сут эксперимента), затем животных эвтаназировали аналогичным образом. Таким образом, общая продолжительность введения ФС составит 30 дней, общая продолжительность наблюдений за животными - 60 дней.From the first to the 30th day of the experiment, the animals were injected with saline or FS in doses in accordance with the group number. On
В результате проведенных исследований определена зависимость проявлений токсического эффекта ФС на фиксируемые в вышеописанных тестах физиологические параметры от величины примененной дозы препарата при хроническом введении и обратимость токсических изменений органов и тканей.As a result of the studies, the dependence of the manifestations of the toxic effect of FS on the physiological parameters recorded in the tests described above on the magnitude of the applied dose of the drug during chronic administration and the reversibility of toxic changes in organs and tissues were determined.
Результаты и обсуждение результатов исследованияResults and discussion of research results
Гибель животных. Внутримышечное тридцатикратное ежедневное введение ФС в рассмотренных дозах не привело к гибели ни одного животного в ходе всего времени эксперимента и в течение периода последующего наблюдения в 30 дней.The death of animals. Thirty times daily intramuscular administration of PS in the considered doses did not lead to the death of any animal during the entire experiment and during the follow-up period of 30 days.
Осмотр с элементами неврологического тестирования. Параметры общего состояния животных в течение срока наблюдения (осмотры проводили на 1, 8, 15, 22, 29, 38, 45, 52, 59 дни исследования) соответствовали норме и оставались стабильными. Животные проявляли нормальную активность в клетке, отсутствовал тремор, внешний вид животных (состояние шерсти, кожи, доступных для наблюдения слизистых оболочек) соответствовал таковому у крыс и кроликов, проживающих в удовлетворительных для них условиях. Параметры индивидуального эмоционального статуса (реакция на перемещение в новую обстановку, прикосновение, вокализации при осмотре) соответствовали характерному для популяции распределению, признаки эмоциональной напряженности в клетке (барберинг) отсутствовали. На все стимулы простых рефлексов (вздрагивание, переворачивание, роговичный, ушной) животные реагировали нормально, что позволяет охарактеризовать отсутствие токсического действия ФС при тридцатикратном ежедневном применении на глубинные механизмы нервной деятельности.Inspection with elements of neurological testing. The parameters of the general condition of the animals during the observation period (examinations were carried out on
Макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов. На 30 и 60 сутки эксперимента проводили диагностическую аутопсию животных. Нижеприведенное описание в полной мере относится к каждому животному, независимо от группы.Macroscopic and histological examination of internal organs. On the 30th and 60th day of the experiment, a diagnostic autopsy of the animals was performed. The following description fully applies to each animal, regardless of group.
При наружном осмотре выделений из естественных отверстий не обнаружено. Шерсть блестящая, опрятного вида, очагов облысения нет, у некоторых кроликов - признаки линьки. Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Половые органы самцов развиты правильно, без крипторхизма. Деформации или отека конечностей нет.During the external examination of secretions from natural openings was not found. The coat is shiny, neat, there are no foci of baldness, some rabbits show signs of molting. Teeth saved. Visible mucous membranes are pale in color, shiny. The mammary glands of females without seals to the touch, there were no discharge from the nipples. The genitals of males are developed correctly, without cryptorchidism. There is no deformation or swelling of the limbs.
Грудная и брюшная полости выпота не содержали. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей не нарушено. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшина тонкие, блестящие, гладкие.The chest and abdominal cavities did not contain effusion. The position of the internal organs of the chest and abdominal cavities is not violated. Parietal and visceral pleura and peritoneum are thin, shiny, smooth.
Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы овальной формы, бледно-желтого или розоватого цвета, с гладкой поверхностью, тонкой капсулой, не спаяны между собой и подлежащими тканями. Поверхность разреза однородной окраски.The submandibular lymph nodes and salivary glands are oval, pale yellow or pinkish in color, with a smooth surface, a thin capsule, not fused together and to the underlying tissues. The cut surface is uniform in color.
Тимус треугольной формы, беловатого цвета, умеренно плотной консистенции, обычных размеров.The thymus is triangular in shape, whitish in color, moderately dense, of normal size.
Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен. Листки перикарда тонкие, прозрачные, гладкие. Величина и форма сердца без изменений. Мышца сердца на разрезе однородной коричневатой окраски, умеренно плотная.Intima of the aorta is smooth, shiny, whitish. The diameter of the aorta is not changed. The leaves of the pericardium are thin, transparent, smooth. The size and shape of the heart are unchanged. The muscle of the heart in the context of a uniform brownish color, moderately dense.
Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно-розовой окраски.The lumen of the trachea and large bronchi is not changed, the mucous membrane is shiny, smooth, pale in color. Light airy, without seals to the touch, pale pink color.
Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка безжелезистой части желудка складчатая, розоватая, блестящая, без изъязвлений. Слизистая тела желудка складчатая, розоватая, блестящая, без изъязвлений. Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая, заполнена химусом. Слизистая оболочка толстой кишки сероватого цвета, блестящая, гладкая, заполнена каловыми массами нормальной консистенции.The mucous membrane of the esophagus is shiny, smooth, pale in color. The stomach is of normal size and shape, filled with food contents. The mucous membrane of the ironless part of the stomach is folded, pinkish, shiny, without ulceration. The mucous membrane of the stomach is folded, pinkish, shiny, without ulceration. The mucous membrane of the small intestine is pale pink, shiny, smooth, filled with chyme. The mucous membrane of the colon is grayish, shiny, smooth, filled with feces of normal consistency.
Форма и величина печени без изменений. Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно плотная. У кроликов - желчный пузырь нормальный, без признаков патологических изменений.The shape and size of the liver are unchanged. The surface of the liver is smooth, uniform dark red color, the capsule is thin, transparent. The sectional liver tissue is full-blooded, moderately dense. In rabbits, the gall bladder is normal, with no signs of pathological changes.
Поджелудочная железа кружевной формы, бледно-розового цвета, дольчатая, умеренно плотной консистенции.The pancreas is lace-shaped, pale pink, lobed, moderately dense consistency.
Селезенка обычной формы, светло-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно-красном фоне селезенки видны мелкие сероватого цвета фолликулы.The spleen is of normal shape, light cherry in color, moderately dense consistency. The surface of the organ is smooth, the capsule is thin. On a section on a dark red background of the spleen, small grayish-colored follicles are visible.
Величина и форма почек без изменений. Поверхность почек коричневатого цвета, гладкая, капсула тонкая, прозрачная, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество.The size and shape of the kidneys unchanged. The surface of the kidneys is brownish, smooth, the capsule is thin, transparent, easily removable. On the section of the organ, the cortical and medulla are clearly distinguishable.
Надпочечники округлой формы, бледно-коричневого цвета, с гладкой поверхностью, умеренно плотные. На разрезе четко выделяется темно окрашенное мозговое вещество.The adrenal glands are round in shape, pale brown in color, with a smooth surface, moderately dense. A dark-colored medulla is clearly visible in the section.
Мочевой пузырь опорожнен или заполнен прозрачной мочой. Слизистая оболочка пузыря гладкая, блестящая, бледной окраски.The bladder is empty or filled with clear urine. The mucous membrane of the bladder is smooth, shiny, pale in color.
Тело матки самок обычной плотности, величины и формы. Рога матки тонкие, слизистая - блестящая, бледная. Яичники темно-красного цвета, с неровной поверхностью, умеренно плотные.The body of the uterus of females of normal density, size and shape. The uterine horns are thin, the mucous membrane is shiny, pale. The ovaries are dark red in color, with an uneven surface, moderately dense.
Семенники самцов беловатого цвета, обычных размеров и плотности.Seed plants of males of whitish color, usual sizes and density.
Оболочки головного мозга тонкие, прозрачные. Вещество мозга обычной плотности, поверхность мозга гладкая. На фронтальных разрезах мозга отчетливо видны серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет.The membranes of the brain are thin, transparent. The substance of the brain is of normal density, the surface of the brain is smooth. On the frontal sections of the brain, gray and white matter is clearly visible. The ventricles of the brain are of normal size, there is no expansion.
Раздражения кожи, отеков или инфильтратов в месте внутрибрюшинного введения не отмечалось.Irritation of the skin, edema or infiltrates at the site of intraperitoneal administration was not observed.
Нижеприведенное описание гистологических препаратов изученных органов в полной мере относится к каждому животному, независимо от группы.The following description of the histological preparations of the studied organs fully applies to each animal, regardless of group.
Клетки эндотелия внутренней оболочки аорты с четкими ядрами. Деструкций эластических волокон средней оболочки нет. Поперечная исчерченность миофибрилл отчетливая, ядра кардиомиоцитов содержат достаточное количество хроматина, ядерная оболочка тонкая. Очагов нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Кардиофиброза нет.Endothelial cells of the inner lining of the aorta with clear nuclei. There are no destruction of the elastic fibers of the middle shell. The cross striation of myofibrils is distinct, the nuclei of cardiomyocytes contain a sufficient amount of chromatin, the nuclear membrane is thin. There are no foci of tinctorial cytoplasm properties. Cardiofibrosis is not.
Эпителий гортани, трахеи, крупных бронхов не изменен, ядра четкие. Альвеолы всех долей легких содержат воздух. Ядра альвеолярного эпителия четкие, цитоплазма оксифильная. Эпителий внутрилегочных бронхов без изменений. Острые воспалительные изменения легочной ткани отсутствовали.The epithelium of the larynx, trachea, large bronchi is not changed, the nuclei are clear. Alveoli of all lobes of the lungs contain air. The nuclei of the alveolar epithelium are clear, the cytoplasm is oxyphilic. Epithelium of intrapulmonary bronchi unchanged. Acute inflammatory changes in the lung tissue were absent.
Трабекулярное строение печени на срезах - без видимых изменений. Границы гепатоцитов отчетливые, цитоплазма зернистая, слабо оксифильная. Синусоиды печени полнокровные.The trabecular structure of the liver on the slices is without visible changes. The boundaries of hepatocytes are distinct, the cytoplasm is granular, slightly oxyphilic. Sinusoids of the liver are full-blooded.
Капилляры клубочков и интерстициальной ткани почек полнокровные, цитоплазма эпителия проксимальных канальцев почек оксифильная, клеточные границы различимы, ядра нефроэпителия светлые, четкие.The capillaries of the glomeruli and interstitial tissue of the kidneys are full-blooded, the cytoplasm of the epithelium of the proximal tubule of the kidneys is oxyphilic, the cell boundaries are distinguishable, the nuclei of the nephroepithelium are bright, clear.
Сосуды коры и мозгового вещества надпочечников полнокровные. Все зоны коры надпочечников отчетливо выражены. Цитоплазма клеток пучковой зоны вакуолизирована. Клетки мозгового вещества крупные, овальной формы, объединенные в гроздья и тяжи.The vessels of the cortex and medulla of the adrenal gland are full-blooded. All zones of the adrenal cortex are distinct. The cytoplasm of the beam zone cells is vacuolated. The cells of the medulla are large, oval in shape, combined into clusters and cords.
Лимфатические узлы состояли из коркового и мозгового вещества. В корковом веществе видны фолликулы, состоящие из лимфоидных элементов. Лимфоциты имели четкие ядра, тонкую мембрану и достаточное количество хроматина. Наряду с лимфоидными элементами в узлах присутствовали плазматические клетки, ретикулярные клетки и макрофаги.Lymph nodes consisted of cortical and medulla. Follicles consisting of lymphoid elements are visible in the cortical substance. Lymphocytes had clear nuclei, a thin membrane, and a sufficient amount of chromatin. Along with lymphoid elements in the nodes were plasma cells, reticular cells and macrophages.
Атрофии или деструкции фолликулов не наблюдалось.No atrophy or destruction of follicles was observed.
Слизистая оболочка безжелезистой части желудка - без видимых изменений. Покровный эпителий слизистой тела желудка - без дефектов эпителиальной выстилки. Главные и обкладочные клетки желез тела желудка не изменены. Дефектов многослойного плоского неороговевающего эпителия слизистой пищевода нет.The mucous membrane of the ironless part of the stomach is without visible changes. The integumentary epithelium of the gastric mucosa is free from defects in the epithelial lining. The main and lining cells of the glands of the body of the stomach are not changed. There are no defects in the stratified squamous non-keratinizing epithelium of the esophagus mucosa.
Дольчатое строение поджелудочной железы сохранено. Сосуды стромы поджелудочной железы умеренно полнокровные.The lobular structure of the pancreas is preserved. Pancreatic stroma vessels are moderately full-blooded.
Фолликулы щитовидной железы заполнены небольшим количеством оксифильного, слабовакуолизированного коллоида. Эпителий фолликул обычной высоты, ядра четкие. Сосуды стромы умеренно полнокровные.Thyroid follicles are filled with a small amount of oxyphilic, weakly vacuolated colloid. The follicle epithelium is of normal height, the nuclei are clear. The stroma vessels are moderately full-blooded.
Тимус сохранил выраженное дольчатое строение. Корковое вещество долек заполнено лимфоцитами/тимоцитами. Мозговое вещество тимуса содержало меньшее количество лимфоцитов, а также светлые эпителиальные клетки, местами образующие концентрические фигуры и тельца Гассаля. Строма тимуса умеренно полнокровная.The thymus retained a pronounced lobed structure. The cortical substance of the lobules is filled with lymphocytes / thymocytes. The brain substance of the thymus contained fewer lymphocytes, as well as light epithelial cells, sometimes forming concentric figures and Gassal's bodies. Thymus stroma is moderately full-blooded.
В корковом веществе яичников самок видны фолликулы разной величины и степени созревания. Фолликулярный эпителий не изменен, ядра светлые, четкие, мозговое вещество яичников полнокровное. Клетки семенных канальцев яичек самцов находились на разных стадиях сперматогенеза. Эпителий семенных канальцев и интерстициальные клетки не изменены. Ядра четкие.Follicles of different size and degree of maturation are visible in the cortical substance of the ovaries of females. The follicular epithelium is not changed, the nuclei are bright, clear, the medulla is ovarian. Cells of the seminiferous tubules of the testicles of males were at different stages of spermatogenesis. The epithelium of the seminiferous tubules and interstitial cells are not changed. The cores are crisp.
Таким образом, по результатам макроскопического и гистологического исследования тридцатикратное ежедневное внутримышечное введение ФС в указанных дозах крысам и кроликам обоего пола не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов.Thus, according to the results of macroscopic and histological studies, thirty times daily intramuscular administration of PS in the indicated doses to rats and rabbits of both sexes is not accompanied by the development of dystrophic, destructive, focal sclerotic changes in parenchymal cells and stroma of internal organs.
Взвешивание внутренних органов животных при проведении диагностической аутопсии на 30 и 60 сутки исследования не показало статистически значимых различий как между кроликами в исследованных группах, так и между кроликами после курса введения исследуемого препарата и после периода наблюдения, последовавшего за курсом введения препарата. Аналогичным образом, не обнаружено статистически значимых различий по указанным показателям для самцов и самок крыс.Weighing of the internal organs of animals during diagnostic autopsy on the 30th and 60th day of the study did not show statistically significant differences both between rabbits in the studied groups and between rabbits after the course of administration of the study drug and after the observation period following the course of administration of the drug. Similarly, there were no statistically significant differences in the indicated indicators for male and female rats.
Клинический анализ крови. Кровь для проведения клинического анализа крови забирали у животных на 30 и 60 сутки эксперимента.Clinical blood test. Blood for clinical blood analysis was taken from animals on
Результаты анализа у кроликов показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы, например, гематокрит (норма от 35% до 48%) у кроликов на 30 день в контрольной группе составляет 39,51% при стандартном отклонении 3,03, в группе 0,064 - 39,5% при стандартном отклонении 3,15, в группе 2 - 38,73% при стандартном отклонении 3,12; гематокрит на 60 день у групп в том же порядке составляет: 43,42±3,04%, 42,95±3,24%, 42,12±4,13%. Т.е. статистически значимые различия отсутствуют и между пробами разных групп и между пробами, взятыми на 30 и 60 сутки исследования (Таблица 2.16).The results of the analysis in rabbits showed no deviations of the indicators from the physiological norm, for example, hematocrit (norm from 35% to 48%) in rabbits for 30 days in the control group was 39.51% with a standard deviation of 3.03, in the group 0.064 - 39, 5% with a standard deviation of 3.15, in group 2 - 38.73% with a standard deviation of 3.12; the hematocrit on
Результаты анализа у самцов крыс показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Гемоглобин (норма от 12 до 18 г/дл) у самцов крыс на 30 день в контрольной группе составляет 14,19 г/дл при стандартном отклонении 0,41, в группе 0,118 - 14,46 г/дл при стандартном отклонении 0,35, в группе 2 - 14,9 г/дл при стандартном отклонении 0,16; гемоглобин на 60 день у групп в том же порядке составляет: 14,82±0,29 г/дл, 14,21±0,3 г/дл, 14,4±0,24 г/дл. То есть, статистически значимые различия отсутствуют и между пробами разных групп и между пробами, взятыми на 30 и 60 сутки исследования.Analysis results in male rats showed no deviations of indicators from the physiological norm. Hemoglobin (norm from 12 to 18 g / dl) in male rats on
Результаты анализа у самок крыс показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Содержание эритроцитов (норма от 7,2 до 9,6*1012/л) у самок крыс на 30 день в контрольной группе составляет 8,11*1012/л при стандартном отклонении 0,2, в группе 0,118-8,13*1012/л при стандартном отклонении 0,13, в группе 2-8,11*1012/л при стандартном отклонении 0,19; содержание эритроцитов на 60 день у групп в том же порядке составляет: 7,95±0,18*1012/л, 8,08±0,15*1012/л, 7,92±0,18*1012/л. То есть, статистически значимые различия отсутствуют, и между пробами разных групп и между пробами, взятыми на 30 и 60 сутки исследования.Analysis results in female rats showed no deviations of indicators from the physiological norm. The erythrocyte content (norm from 7.2 to 9.6 * 10 12 / L) in female rats on
Таким образом, при выбранном режиме введения исследуемого препарата по показателям клинического анализа крови не наблюдалось различий между контрольными и опытными животными на 30 и 60 дни исследования.Thus, with the chosen regimen of administration of the studied drug according to the indicators of the clinical blood test, there were no differences between the control and experimental animals on
Биохимическое исследование сыворотки крови. Кровь для проведения биохимического анализа плазмы забирали у животных на 30 и 60 сутки эксперимента.Biochemical study of blood serum. Blood for biochemical plasma analysis was taken from animals on
Результаты анализа у кроликов показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Уровень мочевины (норма от 14 до 40 мг/дл) у кроликов на 30 день в контрольной группе составляет 25,9 мг/дл при стандартном отклонении 10,78, в группе 0,064-27,7 мг/дл при стандартном отклонении 5,86, в группе 2-30,85 мг/дл при стандартном отклонении 6,42; уровень мочевины на 60 день у групп в том же порядке составляет: 19,38±7,25 мг/дл, 24,92±8,2, 29,3±8,23 мг/дл. То есть, статистически значимые различия отсутствуют и между пробами разных групп и между пробами, взятыми на 30 и 60 сутки исследования (Таблица 2.18).The results of the analysis in rabbits showed the absence of deviations of indicators from the physiological norm. The level of urea (norm from 14 to 40 mg / dl) in rabbits on
Результаты анализа у самцов крыс показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Уровень общего белка (норма от 62 до 72 г/дл) у самцов крыс на 30 день в контрольной группе составляет 66,35 г/дл при стандартном отклонении 3,08, в группе 0,118-63,45 г/дл при стандартном отклонении 3,8, в группе 2-63,25 г/дл при стандартном отклонении 3,0; уровень общего белка на 60 день у групп в том же порядке составляет: 63,4±3,81 г/дл, 65,0±5,6 г/дл, 65,2±3,76 г/дл. То есть, статистически значимые различия отсутствуют и между пробами разных групп и между пробами, взятыми на 30 и 60 сутки исследования.Analysis results in male rats showed no deviations of indicators from the physiological norm. The level of total protein (norm from 62 to 72 g / dl) in male rats on
Результаты анализа у самок крыс показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Активность лактатдегидрогеназы (норма от 200 до 500 МЕ/л) у самок крыс на 30 день в контрольной группе составляет 336,7 МЕ/л при стандартном отклонении 31,61, в группе 0,118-346,32 МЕ/л при стандартном отклонении 13,61, в группе 2-301,92 МЕ/л при стандартном отклонении 28,59; активность лактатдегидрогеназы на 60 день у групп в том же порядке составляет: 310,8±29,06 МЕ/л, 303,03±24,46 МЕ/л, 315,24±36,39 МЕ/л. То есть, статистически значимые различия отсутствуют и между пробами разных групп и между пробами, взятыми на 30 и 60 сутки исследования.Analysis results in female rats showed no deviations of indicators from the physiological norm. The activity of lactate dehydrogenase (norm from 200 to 500 IU / l) in female rats on
Таким образом, при выбранном режиме введения исследуемого препарата по показателям клинического анализа крови не наблюдалось различий между контрольными и опытными животными на 30 и 60 дни исследования.Thus, with the chosen regimen of administration of the studied drug according to the indicators of the clinical blood test, there were no differences between the control and experimental animals on
ЭКГ во втором стандартном отведении. Электрокардиограмму у животных регистрировали на 29 и 59 сутки эксперимента.ECG in the second standard lead. The electrocardiogram in animals was recorded on the 29th and 59th day of the experiment.
Результаты ЭКГ у кроликов показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Частота сердечных сокращений (норма от 190 до 354 уд/мин) у кроликов на 29 день в контрольной группе составляет 291 уд/мин при стандартном отклонении 2,88, в группе 0,064-287 уд/мин при стандартном отклонении 8,68, в группе 2-276,5 уд/мин при стандартном отклонении 21,4; частота сердечных сокращений на 59 день у групп в том же порядке составляет: 277±13,19 уд/мин, 267,5±15,33 уд/мин, 271,5±14,58 уд/мин. То есть, статистически значимые различия отсутствуют и между параметрами разных групп и между параметрами тестирования на 29 и 59 сутки исследования.ECG results in rabbits showed no deviations of indicators from the physiological norm. The heart rate (normal from 190 to 354 beats / min) in rabbits on day 29 in the control group is 291 beats / min with a standard deviation of 2.88, in the group 0.064-287 beats / min with a standard deviation of 8.68, in the group 2-276.5 beats / min with a standard deviation of 21.4; the heart rate on day 59 in groups in the same order is: 277 ± 13.19 beats / min, 267.5 ± 15.33 beats / min, 271.5 ± 14.58 beats / min. That is, there are no statistically significant differences between the parameters of different groups and between the test parameters on days 29 and 59 of the study.
Результаты ЭКГ у самцов крыс показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Интервал QT у самцов крыс на 29 день в контрольной группе составляет 160,6 мс при стандартном отклонении 12,34, в группе 0,118-160,4 мс при стандартном отклонении 14,54, в группе 2-153,8 мс при стандартном отклонении 11,82. Итервал QT на 59 день у групп в том же порядке составляет: 155,4±10,14 мс, 155,0±17,03 мс, 159,6±14,57 мс. То есть, статистически значимые различия отсутствуют и между параметрами разных групп, и между параметрами тестирования на 29 и 59 сутки исследования.ECG results in male rats showed no deviation from the physiological norm. The QT interval in male rats on day 29 in the control group is 160.6 ms with a standard deviation of 12.34, in the group 0.118-160.4 ms with a standard deviation of 14.54, in the group of 2-153.8 ms with a standard deviation of 11 , 82. The QT interval on day 59 for groups in the same order is: 155.4 ± 10.14 ms, 155.0 ± 17.03 ms, 159.6 ± 14.57 ms. That is, there are no statistically significant differences between the parameters of different groups and between the test parameters on days 29 and 59 of the study.
Результаты ЭКГ у самок крыс показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Величина зубца R (норма от 0,07 до 0,25 мВ) у самок крыс на 29 день в контрольной группе составляет 0,16 мВ при стандартном отклонении 0,01, в группе 0,118-0,16 мВ при стандартном отклонении 0,02, в группе 2-0,15 мВ при стандартном отклонении 0,01. Величина зубца R на 59 день у групп в том же порядке составляет: 0,15±0,01 мВ, 0,16±0,01 мВ, 0,16±0,02 мВ. То есть, статистически значимые различия отсутствуют и между параметрами разных групп, и между параметрами тестирования на 29 и 59 сутки исследования.ECG results in female rats showed no deviation from the physiological norm. The value of the R wave (norm from 0.07 to 0.25 mV) in female rats on day 29 in the control group is 0.16 mV with a standard deviation of 0.01, in the group 0.118-0.16 mV with a standard deviation of 0.02 , in the group 2-0.15 mV with a standard deviation of 0.01. The value of the R wave on day 59 in groups in the same order is: 0.15 ± 0.01 mV, 0.16 ± 0.01 mV, 0.16 ± 0.02 mV. That is, there are no statistically significant differences between the parameters of different groups and between the test parameters on days 29 and 59 of the study.
Таким образом, при выбранном режиме введения исследуемого препарата по показателям электрокардиограммы не наблюдалось различий между контрольными и опытными животными на 29 и 59 дни исследования.Thus, with the chosen mode of administration of the studied drug according to the electrocardiogram indices, there were no differences between the control and experimental animals on the 29th and 59th days of the study.
Исследование поведения в тесте «Открытое поле». На 29 и 59 сутки эксперимента исследовали поведение крыс в тесте «Открытое поле» по основным показателям, отражающим локомоторную активность (пройденный путь, время в движении), ориентировочно-исследовательское поведение (количество обследованных норок, количество стоек, количество выходов в центр арены) и тревожность (время груминга, количество дефекаций, время, проведенное в центре арены, латентный период выхода в центр арены).The study of behavior in the test "Open Field". On the 29th and 59th day of the experiment, we studied the behavior of rats in the Open Field test by the main indicators reflecting locomotor activity (distance traveled, time in motion), tentative research behavior (number of minks examined, number of racks, number of exits to the center of the arena) and anxiety (grooming time, number of bowel movements, time spent in the center of the arena, latent period of exit to the center of the arena).
Результаты анализа параметров теста у самцов крыс показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Количество стоек у самцов крыс на 29 день в контрольной группе составляет 9,4 шт при стандартном отклонении 5,55, в группе 0,118-10,6 шт при стандартном отклонении 4,28, в группе 2 - 7,6 шт при стандартном отклонении 2,97; количество стоек на 59 день у групп в том же порядке составляет: 10,8±3,56 шт, 8,2±4,6 шт, 8,0±5,15 шт. То есть, статистически значимые различия отсутствуют и между параметрами разных групп и между параметрами тестирования на 29 и 59 сутки исследования (Таблица 2.24).The results of the analysis of test parameters in male rats showed the absence of deviations of indicators from the physiological norm. The number of racks in male rats on day 29 in the control group is 9.4 pcs with a standard deviation of 5.55, in the group 0.118-10.6 pcs with a standard deviation of 4.28, in group 2 - 7.6 pcs with a standard deviation of 2 97; the number of racks on day 59 for groups in the same order is: 10.8 ± 3.56 pcs, 8.2 ± 4.6 pcs, 8.0 ± 5.15 pcs. That is, there are no statistically significant differences between the parameters of different groups and between the test parameters on days 29 and 59 of the study (Table 2.24).
Результаты анализа параметров теста у самок крыс показали отсутствие отклонений показателей от физиологической нормы. Латентный период выхода в центр у самок крыс на 29 день в контрольной группе составляет 85,43 с при стандартном отклонении 41,02, в группе 0,118-87,12 с при стандартном отклонении 36,89, в группе 2-63,4 с при стандартном отклонении 44,74; латентный период выхода в центр на 59 день у групп в том же порядке составляет: 77,72±39,71 с, 75,2±37,14 с, 58,48±38,76 с. Т.е. статистически значимые различия отсутствуют и между параметрами разных групп и между параметрами тестирования на 29 и 59 сутки исследования.The results of the analysis of test parameters in female rats showed the absence of deviations of indicators from the physiological norm. The latent period of exit to the center in female rats on day 29 in the control group is 85.43 s with a standard deviation of 41.02, in the group 0.118-87.12 s with a standard deviation of 36.89, in the group of 2-63.4 s at standard deviation 44.74; The latent period of going to the center on day 59 for groups in the same order is: 77.72 ± 39.71 s, 75.2 ± 37.14 s, 58.48 ± 38.76 s. Those. There are no statistically significant differences between the parameters of different groups and between the test parameters on days 29 and 59 of the study.
Таким образом, при выбранном режиме введения исследуемого препарата по показателям локомоторной активности, ориентировочно-исследовательского поведения и тревожности (психо-эмоционального статуса) в тесте «Открытое поле» не наблюдалось различий между контрольными и опытными животными на 29 и 59 дни исследования.Thus, with the chosen regimen of administration of the study drug in terms of locomotor activity, orientational research behavior and anxiety (psycho-emotional status) in the Open Field test, there were no differences between control and experimental animals on days 29 and 59 of the study.
Общие выводы из полученных результатов.General conclusions from the results.
В целом, применение исследуемой ФС в дозах 0,064 для кроликов, 0,118 для крыс и 2 мг/кг для обоих видов животных в течение 30 дней при внутримышечном пути введения не влияло на внешний вид, общее состояние и поведение животных обоего пола, не оказывало негативного влияния на параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывало патоморфологических изменений исследованных органов и основных систем органов, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в условиях проведенного исследования. Препарат не оказывал токсического действия при ежедневном тридцатикратном введении экспериментальным животным. Таким образом, оказалось невозможным продемонстрировать обратимость токсического действия исследованной ФС: в период наблюдения, как и в период введения препарата, исследованные параметры во всех группах находились в пределах физиологической нормы. Последнее, в свою очередь, может свидетельствовать об отсутствии отставленных токсических эффектов в указанный период наблюдения.In general, the use of the studied FS in doses of 0.064 for rabbits, 0.118 for rats and 2 mg / kg for both species of animals for 30 days with an intramuscular route of administration did not affect the appearance, general condition and behavior of animals of either sex, and did not adversely affect on blood parameters and basic physiological functions of the body, did not cause pathomorphological changes in the studied organs and the main organ systems, which indicates good tolerance and harmlessness of the drug in the conditions of the study. The drug did not have a toxic effect when administered thirty times daily to experimental animals. Thus, it turned out to be impossible to demonstrate the reversibility of the toxic effect of the investigated FS: during the observation period, as well as during the administration of the drug, the studied parameters in all groups were within the physiological norm. The latter, in turn, may indicate the absence of delayed toxic effects during the indicated observation period.
Проведенные исследования показывают отсутствие токсического эффекта ФС в терапевтической дозе (пересчитанной для использованных видов животных) и стократной терапевтической дозе (для человека) и свидетельствуют об отсутствии противопоказаний по показателям хронической токсичности для клинических испытаний фармакологической субстанции лекарственного средства на основе генно-инженерной конструкции, содержащей последовательности кДНК мозгового нейротрофического фактора и активатора плазминогена урокиназного типа, для лечения травм периферических нервов pNCure. Применение заявляемой генотерапевтической конструкции обеспечивает увеличение скорости восстановления параметров проведения нервного импульса через поврежденный участок нерва, восстановления функциональной активности мышц, иннервируемых поврежденным нервом и прорастания нейритов через поврежденный участок нерва. Применение лекарственного средства, включающего заявляемую генотерапевтическую конструкцию, позволит сократить сроки лечения травм периферических нервов и снизить инвалидизации при травмах периферических нервов.Studies have shown that there is no toxic effect of FS in the therapeutic dose (recalculated for the used animal species) and the hundred-fold therapeutic dose (for humans) and indicate the absence of contraindications in terms of chronic toxicity for clinical trials of the pharmacological substance of a drug based on a genetic engineering construct containing the sequence urokinase-type cerebral neurotrophic factor and plasminogen activator cDNA for the treatment of tr im pNCure peripheral nerves. The use of the claimed gene therapy design provides an increase in the rate of restoration of the parameters of the nerve impulse through the damaged section of the nerve, restoration of the functional activity of the muscles innervated by the damaged nerve and the germination of neurites through the damaged section of the nerve. The use of a medicinal product, including the claimed gene therapy design, will reduce the time for treating peripheral nerve injuries and reduce disability in cases of peripheral nerve injuries.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019130023A RU2719013C1 (en) | 2019-09-25 | 2019-09-25 | Genetic engineering structure for stimulating post-traumatic regeneration of peripheral nerves |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019130023A RU2719013C1 (en) | 2019-09-25 | 2019-09-25 | Genetic engineering structure for stimulating post-traumatic regeneration of peripheral nerves |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2719013C1 true RU2719013C1 (en) | 2020-04-16 |
Family
ID=70277688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019130023A RU2719013C1 (en) | 2019-09-25 | 2019-09-25 | Genetic engineering structure for stimulating post-traumatic regeneration of peripheral nerves |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2719013C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2486918C1 (en) * | 2011-10-25 | 2013-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for stimulating recovered peripheral tissue innervation |
| WO2017072498A1 (en) * | 2015-10-26 | 2017-05-04 | Quethera Limited | Genetic construct |
-
2019
- 2019-09-25 RU RU2019130023A patent/RU2719013C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2486918C1 (en) * | 2011-10-25 | 2013-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method for stimulating recovered peripheral tissue innervation |
| WO2017072498A1 (en) * | 2015-10-26 | 2017-05-04 | Quethera Limited | Genetic construct |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KARAGYAUR M. et al. Non-viral transfer of BDNF and uPA stimulates peripheral nerve regeneration. Biomed Pharmacother. 2015 Aug; 74: 63-70. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019210647B2 (en) | Peptide for inducing regeneration of tissue and use thereof | |
| Liu et al. | Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients | |
| CN102711777B (en) | Tissue-regeneration promoter using recruitment of bone marrow mesenchymal stem cells and/or pluripotent stem cells in blood | |
| US20060247195A1 (en) | Method of altering cell properties by administering rna | |
| Ke et al. | Netrin-1 overexpression in bone marrow mesenchymal stem cells promotes functional recovery in a rat model of peripheral nerve injury | |
| Tracy et al. | Intravitreal implantation of TPP1-transduced stem cells delays retinal degeneration in canine CLN2 neuronal ceroid lipofuscinosis | |
| Jian et al. | Rat BMSCs initiate retinal endogenous repair through NGF/TrkA signaling | |
| Chen et al. | Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation | |
| Zhai et al. | Combined transplantation of olfactory ensheathing cells with rat neural stem cells enhanced the therapeutic effect in the retina of RCS rats | |
| CN113433324B (en) | Application of Nck1 protein as marker in diagnosis of spinal cord injury | |
| CN111450119A (en) | Perinatal tissue-derived extracellular matrix hydrogel preparation for promoting organ injury repair | |
| RU2719013C1 (en) | Genetic engineering structure for stimulating post-traumatic regeneration of peripheral nerves | |
| Zhang et al. | E-cadherin-transfected neural stem cells transplantation for spinal cord injury in rats | |
| Hu et al. | The impact of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on neovascularisation in rats with brain injury | |
| WO2012087180A1 (en) | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorders of an ischaemic or haemorrhagic nature | |
| WO2022014681A1 (en) | Pluripotent stem cells effective for treatment of motor neuron disease (mnd) | |
| CN111484977A (en) | Method for reprogramming to generate functional noradrenergic neuron | |
| US20220339246A1 (en) | Compositions including molecules of modified mrna and methods of using the same | |
| Trofimova | Molecular Mechanisms of Retina Pathology and Ways of Its Correction | |
| US20210085713A1 (en) | Compositions and methods for treating stroke | |
| Thomasen et al. | SorCS2 binds progranulin to regulate motor neuron development | |
| US20220378841A1 (en) | Modified cells and related methods | |
| CN109718375B (en) | Application of Numb or its up-regulator in preparing medicine for treating hepatic fibrosis and cirrhosis or promoting regeneration of liver parenchymal cells | |
| RU2321631C2 (en) | Non-infectious for human adenovirus as vector for substitution genetic therapy of angiogenesis disorder providing effective synthesis of human angiogenin in mammalian transfected cells, method for angiogenesis induction, method for treatment of ischemic disease, composition for induction of angiogenesis and treatment of ischemic disease | |
| CN116789843A (en) | Wnt recombinant protein and application thereof |