RU2717160C1 - Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц - Google Patents
Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц Download PDFInfo
- Publication number
- RU2717160C1 RU2717160C1 RU2019129494A RU2019129494A RU2717160C1 RU 2717160 C1 RU2717160 C1 RU 2717160C1 RU 2019129494 A RU2019129494 A RU 2019129494A RU 2019129494 A RU2019129494 A RU 2019129494A RU 2717160 C1 RU2717160 C1 RU 2717160C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- substrate
- spectrum
- sers
- protein
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000004020 conductor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 37
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 claims description 24
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 11
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 11
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 8
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 70
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 abstract 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 31
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 27
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 27
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 25
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 25
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 25
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 24
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 24
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 16
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 16
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 15
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 12
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 6
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 5
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine hydrochloride Chemical compound Cl.ON WTDHULULXKLSOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000011898 label-free detection Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 102000003989 Aurora kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000433 Aurora kinases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- WUKWITHWXAAZEY-UHFFFAOYSA-L calcium difluoride Chemical compound [F-].[F-].[Ca+2] WUKWITHWXAAZEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001634 calcium fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000004093 laser heating Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
- G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
- G01J3/28—Investigating the spectrum
- G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
- G01J3/4406—Fluorescence spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области определения биомолекул с помощью эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и может быть использовано в медицинской диагностике для определения белков-маркеров различных патологий, в том числе с использованием технологии «лаборатория на чипе». Способ определения белков включает приготовление твердофазного ГКР-субстрата, представляющего собой каплю смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца, замороженную на подложке из теплопроводного не имеющего собственного КР-спектра материала; воздействие на полученный субстрат лучом лазера при охлаждении ГКР-субстрата до температуры, обеспечивающей существование субстрата в твердом состоянии, запись ГКР-спектра и его матобработку. Технический результат состоит в повышении интенсивности и увеличении соотношения сигнал/шум получаемых спектров, в т.ч. в присутствии примесей, и в повышении стабильности получаемых результатов анализа во времени. 8 з.п. ф-лы, 7 ил.
Description
Изобретение относится к области определения биомолекул с помощью эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и может быть использовано в медицинской диагностике для определения белков-маркеров различных патологий, в том числе, с использованием технологии «лаборатория на чипе».
В настоящее время все более широкое применение находят микрофлюидные устройства, так называемые «лаборатории на чипе», позволяющие быстро и надежно обнаруживать и количественно определять в биологических жидкостях пациента (кровь, моча, слюна и др.) наличие биомаркеров, свидетельствующих о развитии тех или иных заболеваний. Эти устройства, предназначенные для экспресс-диагностики «у постели больного», должны быть компактны, мобильны, недороги, просты в изготовлении и использовании и обеспечивать получение надежных диагностических результатов.
Для идентификации биомаркеров в подобных системах в числе других применяют методы, основанные на эффекте гигантского комбинационного рассеяния, см., например, [US 7267948 В2, опубл. 11.09.2007] и др. В англоязычной литературе для его обозначения используют аббревиатуру SERS (Surface Enhanced Raman Scattering). Эффект ГКР наблюдается при регистрации комбинационного рассеяния (КР) света от молекул, адсорбированных на поверхности наноструктур некоторых металлов, в частности, серебра и золота. При облучении лазером за счет индукции локализованных поверхностных плазмонов в металлических наноструктурах достигается многократное усиление локальных электрических полей, что позволяет усилить сигнал КР. Спектроскопия с использованием эффекта ГКР обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами обнаружения и определения анализируемых веществ, в частности, большая скорость анализа, возможность регистрировать спектр ГКР заданного вещества в смеси с посторонними веществами за счет возможности выделить спектр отдельного соединения из общих спектральных данных, высокая чувствительность, сравнимая с классическими иммуноферментными методами анализа. Во всем мире наблюдается повышенный интерес к практическому применению спектроскопии ГКР для детекции и/или идентификации биомаркеров различных патологий, в том числе, биомаркеров белковой природы.
Для усиления локальных электромагнитных полей и получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния часто применяют коллоидные растворы плазмонных наночастиц, обычно серебра или золота [Lucas A. Lane, Ximei Qian, Shuming Nie, SERS Nanoparticles in Medicine: From Label-Free Detection to Spectroscopic Tagging, Chemical Reviews, 2015, 115(19), 10489-10529]. В отличие от ГКР-активных наноструктурированных поверхностей, получаемых при помощи литографических методов, наночастицы относительно дешевы, долго хранятся и не требуют сложного оборудования для получения и использования. Как правило, раствор анализируемого образца смешивают с коллоидным раствором наночастиц, после чего наночастицы должны сформировать агрегаты, имеющие частоты плазмонного резонанса, близкие к частоте лазера, используемого для получения сигнала КР. Получают спектры ГКР с высокими коэффициентами усиления сигнала, что позволяет обнаруживать наличие в растворе низких концентраций целевых белков и проводить их количественное определение по интенсивности характерных полос на получаемом спектре.
Однако, достаточное для получения надежного диагностического результата усиление сигнала полностью зависит от характера агрегации плазмонных наночастиц, приводящего к формированию «горячих точек» -участков максимального усиления локального электрического поля в результате плазмонного резонанса в отдельных участках, расположенных между агрегированными частицами. Неагрегированные наночастицы имеют пренебрежимо малую ГКР-активность, из-за чего проблема контролируемой агрегации наночастиц является одним из основных направлений исследований в области применения ГКР.
В присутствии анализируемого вещества агрегация может быть самопроизвольной. Так, в статье [Li-Jia Xu, Cheng et. al. "Label-Free Detection of Native Proteins by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Using Iodide-Modified Nanoparticles", Analytical Chemistry, 2014, 86: 2238-2245] описано определение нативных белков с помощью ГКР, включающее самопроизвольную агрегацию серебряных наночастиц в золе в присутствии исследуемого белка, со снятием спектров непосредственно из жидкой капли. В этом случае молекула белка служит в качестве моста, связывающего отдельные плазмонные наночастицы в агрегаты, в центре которых находится белок. Такой подход позволяет получить очень интенсивные спектры, но не обеспечивает хорошую воспроизводимость - в статье указано, что для некоторых аналитов авторы дополнительно добавляют в качестве агрегирующего реагента сульфат магния. Кроме того, самопроизвольная агрегация обычно происходит в относительно чистых растворах - присутствие примесей зачастую препятствует формированию агрегатов из белковых молекул и плазмонных наночастиц. Такой способ агрегации также требует контроля рН раствора и знания изоэлектрической точки исследуемых белков, т.к. в большинстве случаев связывание белка и плазмонных наночастиц, которые обычно отрицательно заряжены, обусловлено электростатическим притяжением за счет положительного заряда белков. Соответственно, становится необходимо использовать значения рН, при которых белок имеет достаточно большой положительный заряд. Это накладывает ограничения на универсальность метода, поскольку многие белки теряют стабильность при тех значениях рН, при которых они приобретают положительный заряд.
Улучшения воспроизводимости результатов для различных типов аналитов можно добиться при помощи принудительной агрегации частиц в золе. С этой целью для получения агрегированных наноструктур в коллоидных растворах наночастиц металлов используют химические агрегирующие агенты, как правило, соли металлов, например, хлорид лития [WO 2005065541 (А2), опубл. 21.07.2005], хлорид натрия [Soumik Siddhanta, Dhanasekaran Karthigeyan, Partha P. Kundu, Tapas K. Kundu, Chandrabhas Narayana, Surface enhanced Raman spectroscopy of Aurora kinases: direct, ultrasensitive detection of autophosphorylation, RSC Advances, 2013, 3: 4221-4230], закисленный сульфат натрия [Xiao X. Han, et. al. "Label-Free Highly Sensitive Detection of Proteins in Aqueous Solutions Using Surface-Enhanced Raman Scattering, Analytical Chemistry, 2008, 81: 3329-3333]. Однако, образцы, полученные из биологического материала пациента, не являются чистыми растворами анализируемых белков и могут содержать множество примесей, способных препятствовать агрегации наночастиц даже после добавления агрегирующего реагента. Агрегирующий реагент также может вытеснять анализируемое вещество с поверхности наночастиц, тем самым препятствуя получению сигнала. Применяемый чаще всего в качестве агрегирующего реагента хлорид натрия может служить типичным примером - хлорид-ион способен вытеснять с поверхности серебра многие вещества, которые в его отсутствие могли бы дать интенсивный сигнал. Сродство аналитов к серебру варьирует, поэтому сложно подобрать агрегирующий реагент, не имеющий собственного спектра и пригодный к использованию для определения широкого круга анализируемых веществ, тем более в присутствии посторонних примесей. Другое ограничение связано с тем, что в присутствии агрегатора может наблюдаться нерегулируемый рост степени агрегации, в результате чего интенсивность сигнала ГКР начинает падать, при этом регистрирация ГКР-спектров с временами накопления больше 20-60 секунд, становится неэффективной. Это связано с тем, что упомянутые выше «горячие точки» расположены по всему объему растущего агрегата, а сигнал ГКР генерируется только «горячими точками», расположенными на его поверхности. По мере роста агрегатов отношение объема к поверхности растет, и количество анализируемого белка, попавшего в «горячие точки», находящиеся внутри агрегата и таким образом экранированные, растет, в то время как количество аналита в «горячих точках» на поверхности агрегатов падает вместе с общей поверхностью раздела фаз в коллоидной системе. В результате, существует оптимальный уровень агрегации, в котором система пребывает ограниченное время.
Достижение принудительной агрегации наночастиц металлов в коллоидных растворах возможно под действием физических методов. В статье [Jianhua Zhou et. al. "Convenient formation of nanoparticle aggregates on microfluidic chips for highly sensitive SERS detection of biomolecules" Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402: 1601-1609] для принудительной агрегации золь золотых наночастиц пропускают через микрофлюидный канал микрочипа, снабженного клапаном, пропускающим воду, но задерживающим наночастицы. Наночастицы, концентрируясь в зоне перед клапаном, агрегируются за счет концентрирования и механического столкновения под действием потока жидкости. Через эту же зону пропускают раствор с анализируемым белком, который адсорбируется на сформированные агрегаты наночастиц и генерирует сигнал ГКР. После регистрации спектра ГКР клапан открывают, и агрегаты удаляются потоком, затем процесс можно повторить. К недостаткам способа следует отнести:
- необходимость использования меньших, чем обычно, мощностей лазера с целью предотвращения формирования пузырьков газа в микрофлюидном канале;
- потеря в интенсивности сигнала, вызванная тем, что анализируемый белок подают уже после формирования агрегатов, когда общая поверхность, доступная для адсорбции уже уменьшилась;
- уязвимость к наличию примесей, конкурентно связывающихся с наночастицами.
В работе [Barbara Fazio et. al. "SERS detection of Biomolecules at Physiological pH via aggregation of Gold Nanorods mediated by Optical Forces and Plasmonic Heating", Scientific Reports 2016, 6, doi:10.1038/srep26952] описан способ ГКР анализа биомолекул, в котором агрегацию плазмонных наночастиц индуцируют при помощи оптических сил и плазмонного нагрева, т.е. наночастицы вынужденно двигаются под давлением света и концентрируются около поверхности ячейки, оставаясь в луче лазера из-за взаимодействия индуцированного в частице дипольного момента и электрического поля лазера. Смесь раствора анализируемого образца и золя наночастиц помещают под лазер, в результате чего происходит самопроизвольная сборка агрегатов, включающих наночастицы и молекулы анализируемого вещества. Недостатком способа является необходимость использования наночастиц определенной формы (авторы используют золотые наностержни), т.к. форма наночастиц влияет на характеристики движения под действием света. Как и в большинстве других способов, в данном случае также существует непредсказуемость и невоспроизводимость результатов при исследовании растворов, содержащих разнообразные примеси, например, биологических жидкостей и их экстрактов. Также, поскольку агрегаты формируются в течение длительного времени (до 30 минут), возможна денатурация белковых молекул из-за длительного нагрева лазером.
Общей чертой всех упомянутых аналогов является то, что формирование агрегатов наночастиц с белковыми молекулами происходит в жидкой фазе. В качестве прототипа настоящего изобретения взят способ определения белка с помощью ГКР, основанный на использовании твердофазного ГКР-субстрата, содержащего агрегаты наночастиц серебра с белком [Sercan Keskina, Mustafa Culha, "Label-free detection of proteins from dried-suspended droplets using surface enhanced Raman scattering", International Journal of Nanomedicine, 2015, 10: 537-547]. Для получения твердого ГКР-субстрата навеску белка (лизоцим, цитохром С, миоглобин, BSA и др.) растворяют в воде и добавляют золь серебряных наночастиц, приготовленный по общепринятой методике [Ratyakshi, R.P. Chaunan, Colloidal Synthesis of Silver Nano Particles, Asian Journal of Chemistry, 2009, 21(10): 113-116] путем восстановления нитрата серебра цитратом натрия при кипячении. В одном из вариантов способа каплю смеси помещают на нижнюю сторону горизонтально расположенной подложки из фторида кальция, после чего высушивают при комнатной температуре. После высушивания подложку переворачивают и проводят измерение сигналов ГКР с поверхности высушенной капли с использованием конфокального микроскопа на спектрометре с длиной волны лазера 785 нм. В процессе высушивания наночастицы формируют агрегаты постоянного размера, что позволяет получать сигналы ГКР, не деградирующие со временем. При этом агрегаты включают в себя белок независимо от заряда белковой молекулы, что позволяет использовать отрицательно заряженные наночастицы для определения отрицательно заряженных белков. К недостаткам способа следует отнести:
- относительно низкий уровень сигнала, поскольку сигнал снимается с плоской поверхности, которая содержит меньше «горячих точек», чем аналогичный объем жидкости,
- невозможность использования больших мощностей лазера, что вызвано неэффективным отводом тепла от точки фокусировки лазера - высушенный золь не является сплошной металлической пленкой и обладает ограниченной теплопроводностью, а плазменный резонанс приводит к усиленному поглощению энергии лазера и нагреву агрегатов.
- ненадежность результатов в присутствии примесей. В процессе высушивания увеличение концентрации примесей может индуцировать неконтролируемую агрегацию наночастиц и нарушить равномерное распределение наночастиц и анализируемых белков в высушенной капле.
- сложность подготовки ГКР-субстрата, связанная с необходимостью использования специальных материалов подложки и обеспечения гладкости и чистоты поверхности.
Техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в совершенствовании ГКР-способа анализа белков с использованием твердофазного ГКР-субстрата. Настоящее изобретение обеспечивает повышение интенсивности и увеличение соотношения сигнал/шум получаемых спектров в отсутствие агрегирующих реагентов, в том числе, в присутствии примесей, а также позволяет повысить стабильность и воспроизводимость получаемых результатов анализа во времени.
Техническая проблема решена заявляемым способом определения белков с использованием гигантского комбинационного рассеяния, включающим приготовление твердофазного ГКР-субстрата, содержащего смесь плазмонных наночастиц с содержащим белок анализируемым образцом, воздействие на полученный субстрат лучом лазера, запись ГКР-спектра и его математическую обработку, отличающимся тем, что в качестве твердофазного ГКР-субстрата используют криозоль, представляющий собой каплю смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца, при этом капля смеси заморожена на подложке из теплопроводного, не имеющего собственного спектра комбинационного рассеяния, преимущественно, отражающего свет материала, а воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера при охлаждении ГКР-субстрата до температуры, обеспечивающей существование субстрата в твердом состоянии в процессе анализа.
Перечисленные ниже графические материалы поясняют сущность изобретения. На всех фигурах по оси ординат указана интенсивность ГКР-спектра в CCDcts (CCD counts - количество условных цифровых единиц, накопленных ПЗС матрицей).
Фиг. 1. ГКР-спектр миоглобина в присутствии мочевины, полученный заявляемым способом. Образец для анализа - криозоль, полученный замораживанием в течение 20 мин. при температуре - 8°С смеси (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором миоглобина, содержащего примесь мочевины. Концентрация компонентов в криозоле - наночастицы - 5×1010 ч./мл, миоглобин - 50 нг/мл, мочевина - 0,5 мМ. Условия анализа: спектрометр BWTek i-Raman 532 nm, длина волны лазера 532 нм, мощность 7,5 мВт, время накопления 100 сек. Образец криозоля во время анализа охлаждают сухим льдом.
Фиг. 2. ГКР-спектр той же смеси в жидком виде без замораживания. Условия анализа: спектрометр BWTek i-Raman 532 nm, длина волны лазера 532 нм, мощность 7,5 мВт, время накопления 100 сек.
Фиг. 3 Сопоставление ГКР-спектров, представленных на Фиг. 1 и 2, приведенных в одном масштабе. А - ГКР-спектр криозоля, Б - ГКР-спектр жидкого золя.
Фиг. 4. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина, полученных в соответствии с заявляемым способом, в зависимости от времени приготовления криозоля. Концентрация компонентов в криозоле: наночастицы - 5×1010 ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл. А - ГКР-спектры, измеренные через 1, 5, 10, 15 и 20 мин после приготовления криозоля, Б -зависимость интенсивности пика 1002 см-1 от времени хранения криозоля. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.
Фиг. 5. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина, в жидком золе, полученных в разное время после приготовления. Концентрация компонентов в анализируемой смеси: наночастицы - 5×1010 ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, NaCl - 40 мМ. А - ГКР-спектры, измеренные через 1, 5, 10, 15 и 20 мин после приготовления раствора, Б - зависимость интенсивности пика 1002 см-1 от времени хранения образца. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.
Фиг. 6. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина без и в присутствии примеси сахарозы. Образец для анализа - жидкий золь, полученный смешением (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором гемоглобина. В смесь добавляют NaCl и перемешивают. Концентрация компонентов в анализируемой смеси - наночастицы - 5×1010 ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, NaCl - 40 мМ. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек. А - ГКР-спектр гемоглобина без примеси сахарозы, Б - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в концентрации 10 мкг/мл.
Фиг. 7. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина в присутствии примеси сахарозы, полученных из криозоля и из раствора. А - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в криозоле, полученном замораживанием смеси (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором гемоглобина, содержащего примесь сахарозы, в течение 60 мин при температуре -3°С. Концентрация компонентов в криозоле - наночастицы -5×1010 ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, сахароза - 10 мкг/мл. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек., охлаждение криозоля сухим льдом. Б - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в жидком золе. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.
Сущность физических процессов, предположительно, происходящих при формировании криозоля плазмонных наночастиц, описана ниже. При комнатной температуре в жидком водном золе в отсутствии агрегирующих реагентов плазмонные наночастицы (например, серебра или золота) находятся в состоянии свободной подвижности; по мере роста кристаллов льда плазмонные наночастицы концентрируются между кристаллами и агрегируют, формируя в местах столкновения фронтов кристаллизации воды трехмерные структуры, повторяющие контуры кристаллов льда. Особенностью заявляемого способа является одновременное концентрирование молекул определяемых белков в зоне формирования агрегатов в пространстве между растущими кристаллами льда.
Механизмы агрегации частиц в разбавленных коллоидных растворах недостаточно изучены, однако, на основании имеющихся данных можно предполагать, как формируется криозоль при замораживании раствора. Известно, что при замораживании водных растворов формирование льда начинается в отдельных центрах кристаллизации с постепенным ростом кристаллов, которые прекращают расти после столкновения разных фронтов кристаллизации. Растворимость веществ в формируемом кристалле, как правило, ниже, чем в жидкой фазе, поэтому по мере замерзания в растворе растет концентрация веществ, которые были исключены из объема жидкости, потраченного на образование кристаллов. Между растущим льдом и жидкой водой существует равновесное соотношение концентрации растворенного вещества, из-за чего по мере кристаллизации концентрация растворенных веществ в жидкой фазе линейно растет, при условии ограниченного объема. Однако, это справедливо только при условии, что растворенное вещество успевает распределиться по всему объему за счет диффузии. При быстром росте кристалла диффузионные процессы начинают отставать от притока нового вещества в жидкую фазу, растворенное вещество не успевает диффундировать от фронта кристаллизации, а перед растущим кристаллом формируется зона повышенного содержания растворенных веществ. Чем быстрее растет кристалл льда и чем меньше растворимость вещества в твердой фазе, тем более резкий получается градиент концентрации. Максимальная концентрация должна наблюдаться на границе двух отдельных кристаллов льда.
Агрегация наночастиц происходит в результате похожего процесса концентрирования коллоидных частиц, вызванного их термодинамическим отталкиванием от растущего кристалла льда. Приток воды к поверхности кристалла и структурирование приповерхностных слоев молекул делает энергетически невыгодным нахождение частицы около интерфейса кристаллизации. Энергия взаимодействия воды с наночастицей служит энергетическим барьером для формирования льда и приводит к сверхохлаждению пограничного слоя воды, что замедляет рост кристалла и способствует вытеснению коллоидных частиц в жидкую фазу. Природа явления отличается от концентрирования растворенных веществ, но результат такой же. При этом, из-за малой скорости диффузии в коллоидных растворах даже перед медленно растущим кристаллом формируется слой с повышенной концентрацией наночастиц [Anthony М. Anderson, М. Grae Worster, «Freezing colloidal suspensions: periodic ice lenses and compaction)), Journal of Fluid Mechanics, 2014, 758: 786-808]. По мере преодоления электростатического отталкивания, сближенные наночастицы формируют перманентные агрегаты за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.
Таким образом, в криозоле формируются зоны повышенной концентрации наночастиц и белков, особенно в местах столкновения двух растущих кристаллов льда. Формирующиеся агрегаты захватывают из раствора белковые молекулы, часть которых сорбируется в так называемых «горячих точках» (представляют собой зоны максимального усиления электромагнитного поля за счет эффекта ГКР), расположенных в основном между соседними частицами в агрегатах. Процесс сорбции белка в агрегатах имеет равновесный характер и зависит от концентрации белка в растворе, поэтому концентрирование белка вместе с наночастицами вносит вклад в усиление сигнала ГКР. При этом, как показывают экспериментальные данные и в соответствии с теоретическими представлениями, присутствие примесей в образце меньше влияет на агрегацию наночастиц при формировании криозоля, чем при агрегации в растворе.
По сравнению с прототипом, использование криозоля позволяет получить преимущество в интенсивности ГКР-спектров также за счет того, что рассеяние света происходит в объеме образца, а не на плоской поверхности. При этом большее количество «горячих точек», имеющихся в объеме, вносит вклад в интенсивность сигнала. Как показывают эксперименты, оптимальная интенсивность сигнала достигается при высоте столба замороженной жидкости около 1 мм.
Возможность использования эффекта совместной агрегации плазмонных наночастиц с молекулами белка при замораживании разбавленных коллоидных растворов для получения ГКР-субстратов, позволяющих регистрировать спектры аналитов непосредственно из замерзшей капли, обнаружена нами впервые и не является очевидной, поскольку процессы агрегирования, происходящие в концентрированных и разбавленных коллоидных системах, не идентичны и не до конца изучены.
В качестве плазмонных наночастиц могут быть использованы любые частицы, для которых агрегация способствует усилению эффекта ГКР, в частности, наночастицы серебра, или наночастицы золота, или гибридные наночастицы («core-shell» и др.), размером в диапазоне от 10 до 100 нм, обеспечивающем получение спектров с максимальной интенсивностью. Для получения криозолей могут быть использованы плазмонные наночастицы, полученные любым известным способом, например, путем восстановления нитрата серебра гидроксиламин-гидрохлоридом в щелочных условиях [Nicolae Leopold, Bernhard Lendl, "A New Method for Fast Preparation of Highly Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) Active Silver Colloids at Room Temperature by Reduction of Silver Nitrate with Hydroxylamine Hydrochloride", Journal of Physical Chemistry B, 2003, 107(24): 5723-5727] или восстановлением нитрата серебра цитратом натрия при кипячении [Ratyakshi, R.P. Chaunan, "Colloidal Synthesis of Silver Nano Particles", Asian Journal of Chemistry, 2009, 21(10): 113-116]. Содержание наночастиц в золе, используемом для получения криосубстрата, может варьировать в пределах от 1010 до 1013 ч./мл в зависимости от характеристик используемых наночастиц.
Анализируемый раствор белка и золь наночастиц смешивают в соотношении, близком к 1:1, обеспечивающим, как определено экспериментально, максимально равномерное смешение компонентов и эффективную сорбцию белка на поверхности наночастиц. Смесь перемешивают, затем замораживают, предпочтительно в темноте, при температуре, обеспечивающей формирование в условиях эксперимента агрегатов наночастиц такого размера, который соответствует максимальной интенсивности ГКР-спектров. На практике для большинства белков для получения криозоля используют температуру в диапазоне от минус 1°С до минус 10°С. Для получения криозоля аликвоту смеси помещают на светоотражающую поверхность теплопроводного материала, не имеющего собственного выраженного КР-спектра. На практике удобно использовать подложку из алюминия. Полученный твердый субстрат можно использовать сразу, или хранить в закрытом контейнере в течение нескольких недель при температуре минус 20°С или ниже.
Для измерения ГКР-спектра образец криозоля, охлаждаемый сухим льдом или другим хладагентом, помещают под объектив микроскопа спектрометра, предпочтительно изолированного от внешних источников света. Охлаждение позволяет использовать максимально возможную мощность лазера без риска расплавить криозоль, а также проводить настройку параметров измерения или повторные накопления сигнала без временных ограничений. Для получения ГКР-спектров может быть использовано лазерное излучение с любой подходящей длиной волны, что определяется свойствами анализируемого образца и имеющимися техническими возможностями. Сначала снимают спектр фона при выключенном лазере, затем включают лазер и регистрируют ГКР-спектр. Время накопления сигнала и мощность лазерного излучения подбирают экспериментально с учетом требуемой интенсивности спектра. Полученный спектр подвергают математической обработке с использованием программного обеспечения, позволяющего анализировать спектральные данные.
Ниже приведены примеры, демонстрирующие возможность осуществления предлагаемого способа с получением заявленного технического результата.
Пример 1. Получение спектра миоглобина в присутствии примеси мочевины.
Известно, что присутствие примеси мочевины затрудняет агрегацию наночастиц, уменьшая ГКР-активность золя.
Раствор миоглобина в воде 100 нг/мл, содержащий 1 мМ мочевины, смешивают в объемном соотношении 1:1 с золем серебряных наночастиц (гидродинамический диаметр 42 нм), содержащем 1011 ч./мл. Конечная концентрация белка в смеси составляет 50 нг/мл, наночастиц - 5×1010 ч./мл, мочевины - 0,5 мМ. Для получения криозоля каплю полученной смеси (-20 мкл) помещают в пластиковое кольцо толщиной 1 мм и диаметром 5 мм, размещенное на алюминиевой пластине, после чего образец помещают в морозильную камеру с температурой -8°С на 20 мин. Пластину с криозолем в пластиковом контейнере с сухим льдом помещают под объектив микроскопа спектрометра BWTek i-Raman 532, с длиной волны лазера 532 нм. Устанавливают время накопления 100 сек с 5 повторами для усреднения, снимают фоновый спектр, предварительно экранировав микроскоп от внешних источников света. Затем на мощности лазера 20% (7,5 мВт) накапливают ГКР-спектр с тем же временем накопления. Вычитание фонового спектра в процессе обработки полученных спектров с помощью специального программного обеспечения происходит автоматически. Полученный спектр показан на фиг. 1. Как видно из рисунка, на ГКР-спектре криозоля присутствуют характерные полосы высокой интенсивности, соответствующие миоглобину и мочевине.
На такой же алюминиевой пластине снимают ГКР-спектр жидкого золя, имеющего тот же состав, что и состав криозоля: 20 мкл смеси помещают в пластиковое кольцо, лежащее на подложке из алюминия, и помещают образец под микроскоп спектрометра. Накопление сигнала и получение спектра осуществляют аналогично тому, как описано выше для криозоля. Полученный спектр, показанный на фиг. 2, не содержит выраженных сигналов миоглобина, присутствуют только пики мочевины и слабо выраженные сигналы, которые сложно опознать в связи с их низкой интенсивностью. Также обращает на себя внимание неблагоприятное соотношение сигнал/шум на спектре, полученном с использованием жидкого субстрата.
При сопоставлении спектров криозоля и жидкого образца, представленных на одном рисунке в одинаковом масштабе, как показано на Фиг. 3, наглядно видно, что спектр ГКР криозоля, содержащего миоглобин в присутствии мочевины, в десятки раз превосходит по интенсивности ГКР-спектр жидкого золя аналогичного состава (ср. интенсивность пика мочевины при 1002 см-1). Значительно более высокое соотношение интенсивности сигнал/шум на спектре, полученном для криозоля, обеспечивает более высокую чувствительность определения белка по сравнению с жидким субстратом.
Как отмечено выше, в спектре жидкого золя, содержащего миоглобин и примесь мочевины, отсутствуют характерные ГКР-сигналы миоглобина. Показательно, что в отсутствие мочевины удается получить спектр миоглобина в растворе, хотя и существенно менее интенсивный, чем с использованием криозоля. Мочевина способствует исчезновению ГКР-спектра белка, предположительно, из-за нарушения самопроизвольной агрегации наночастиц серебра.
Таким образом, использование заявляемого способа позволяет не только увеличить интенсивность спектра белка по сравнению с использованием жидкого субстрата, но и получать ГКР-спектр белка высокой интенсивности при наличии примесей, присутствие которых в образце делает получение спектра белка из раствора невозможным. Использование криозоля также позволяет повысить чувствительность способа за счет возрастания соотношения сигнал/шум.
Пример 2. Получение спектра гемоглобина в присутствии сахарозы.
Для приготовления криозоля использованы водные растворы гемоглобина (2000 нг/мл), не содержащие примесей и содержащие примесь сахарозы (10 мкг/мл) сахарозы, которая негативно влияет на агрегацию наночастиц, уменьшая ГКР-активность золя. Исследуемый раствор смешивают с золем серебряных наночастиц (гидродинамический диаметр 42 нм, концентрация 1011 ч./мл) в объемном соотношении 1:1. Конечная концентрация белка в смеси составляет 1000 нг/мл, наночастиц -5×1010 ч./мл, сахарозы, если она присутствует - 10 мкг/мл. Для приготовления образца 5 мкл смеси помещают в алюминиевую лунку высотой 1 мм и диаметром 2 мм. Алюминиевую лунку помещают на 1 час в термоконтейнер, наполненный колотым льдом из замороженного 20% водного раствора глицерина, с температурой около -4°С. Затем образец, помещенный в пластиковый контейнер с сухим льдом, переносят под объектив микроскопа спектрометра BWTek innoRam 785, с длиной волны лазера 785 нм. Устанавливают время накопления 5 сек с 5 повторами для усреднения, снимают фоновый спектр, предварительно экранировав микроскоп от внешних источников света. Затем включают лазер на мощности 20% (42 мВт) и накапливают ГКР-спектр с тем же временем накопления. Вычитание фонового спектра происходит автоматически.
В такой же алюминиевой лунке снимают ГКР-спектр жидкого золя: помещают 5 мкл смеси в лунку, в качестве агрегирующего реагента добавляют NaCl в конечной концентрации 40 мМ, перемешивают и помещают образец под микроскоп спектрометра. Накопление сигнала осуществляют аналогично тому, как для замороженных образцов.
Изменение интенсивности спектра во времени отличается для измерений и использованием криозоля и с использованием жидкого золя. Как видно на фиг. 4, спектр чистого раствора гемоглобина, полученный с использованием криозоля, не убывает в интенсивности в течение, как минимум, 25 минут после замораживания, форма спектра также не меняется. На фиг. 5 представлены спектры такого же раствора белка, полученные с использованием жидкого золя. В этом случае, график на фиг. 5Б демонстрирует падение интенсивности ГКР-сигнала со временем. При сравнении спектров в криозоле и в жидком субстрате в начальный момент времени можно также отметить, что с использованием криозоля интенсивность спектра как минимум в 2,5 раза выше.
На Фиг. 6 сопоставлены ГКР-спектры чистого гемоглобина и в присутствии примеси сахарозы, полученные с использованием жидкого золя. Спектр на фиг. 6А получен для раствора гемоглобина без примеси сахарозы, спектр фиг. 6Б - с примесью сахарозы. Видно, что спектр гемоглобина с примесью сахарозы имеет существенно более низкую интенсивность, а также в нем отсутствуют некоторые, характерные для гемоглобина, пики. Очевидно, что присутствие сахарозы в жидком золе значительно затрудняет получение ГКР-спектров белка.
ГКР-спектр, полученный с использованием криозоля, при добавлении того же количества сахарозы оказывается только в два раза менее интенсивным по сравнению с криозолем без сахарозы, при этом полностью сохраняется форма спектра, что видно при сравнении спектра А на фиг. 7 со спектрами на Фиг. 4. Влияние сахарозы на интенсивность и, особенно, на форму спектра белка в криозоле значительно менее выражено, чем в жидком золе. При сравнении на фиг. 7 ГКР-спектров одной и той же смеси гемоглобина с сахарозой, полученных с использованием криозоля и жидкого субстрата (А и Б соответственно), видно, что усиление в криозоле, как минимум, в пять раз выше, чем в жидком золе, если сравнивать по пику на 1002 см-1, а пик 1046 см-1, вообще не определяется на ГКР-спектре, полученном с использованием жидкого субстрата.
Полученные результаты показывают, что использование криозоля для получения ГКР-спектра гемоглобина демонстрирует ряд преимуществ по сравнению с использованием жидкого золя: получение стабильного во времени ГКР-спектра, по сравнению с затухающим сигналом в жидком золе; повышение интенсивности ГКР-спектра и соотношения сигнал/шум; менее выраженное влияние примеси сахарозы на интенсивность ГКР-спектра; отсутствие влияния примеси сахарозы на форму ГКР-спектра; возможность получения полноценного ГКР-спектра белка в присутствии примеси сахарозы, по сравнению со спектром в жидком золе, в котором исчезла часть пиков, характерных для гемоглобина.
Таким образом, заявляемый способ характеризуется следующими преимуществами относительно известных аналогов и прототипа:
- отсутствие необходимости использовать агрегирующий реагент для получения интенсивных ГКР-спектров;
- способ позволяет определять белковые аналиты даже в присутствии веществ, обычно препятствующих агрегации, таких, как мочевина, сахароза и др., что позволяет использовать его для анализа белкового состава образцов, полученных из биологических жидкостей, и содержащих примеси, в присутствии которых невозможно индуцировать агрегацию наночастиц классическими методами;
- способ позволяет получить стабильные агрегаты плазмонных наночастиц, сохраняющие высокую ГКР-активность во времени, что позволяет получать спектры ГКР с большими временами накопления и значительно повышает чувствительность метода, а также позволяет сохранять образцы для проведения повторных измерений;
- способ характеризуется высокой чувствительностью благодаря увеличению интенсивности и соотношения сигнал/шум получаемых ГКР-спектров.
Claims (9)
1. Способ определения белков с использованием гигантского комбинационного рассеяния (далее - ГКР), включающий приготовление твердофазного ГКР-субстрата, содержащего смесь плазмонных наночастиц с содержащим белок анализируемым образцом, воздействие на полученный субстрат лучом лазера, запись ГКР-спектра и его математическую обработку, отличающийся тем, что в качестве твердофазного ГКР-субстрата используют криозоль, представляющий собой каплю смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца, при этом капля смеси заморожена на подложке из теплопроводного не имеющего собственного спектра комбинационного рассеяния материала, а воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера при охлаждении ГКР-субстрата до температуры, обеспечивающей существование субстрата в твердом состоянии.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве плазмонных наночастиц используют наночастицы серебра, или наночастицы золота, или гибридные наночастицы.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что содержание плазмонных наночастиц в золе составляет 1010-1013 ч./мл.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для замораживания смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца используют подложку из светоотражающего материала.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для замораживания смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца используют подложку из алюминия.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что замораживание смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца осуществляют при температуре минус 4°С.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что замораживание смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца осуществляют при температуре минус 8°С.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера с длиной волны 785 нм.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера с длиной волны 532 нм.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129494A RU2717160C1 (ru) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129494A RU2717160C1 (ru) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2717160C1 true RU2717160C1 (ru) | 2020-03-18 |
Family
ID=69898389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019129494A RU2717160C1 (ru) | 2019-09-19 | 2019-09-19 | Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2717160C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438215A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-05-06 | 山东中医药大学 | 一种基于dna超支化自组装检测肺癌标志物的sers探针和试剂盒 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030059820A1 (en) * | 1997-11-26 | 2003-03-27 | Tuan Vo-Dinh | SERS diagnostic platforms, methods and systems microarrays, biosensors and biochips |
| WO2005065541A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-21 | Intel Corporation | Methods for using raman spectroscopy to obtain a protein profile of a biological sample |
| RU2643697C1 (ru) * | 2017-05-11 | 2018-02-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физического материаловедения Сибирского отделения Российской академии наук | Способ получения композитных наноструктур: диоксид кремния - серебро |
| CN110068565A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-07-30 | 长江师范学院 | Sers传感芯片的应用及其检测方法和制备方法 |
-
2019
- 2019-09-19 RU RU2019129494A patent/RU2717160C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030059820A1 (en) * | 1997-11-26 | 2003-03-27 | Tuan Vo-Dinh | SERS diagnostic platforms, methods and systems microarrays, biosensors and biochips |
| WO2005065541A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-21 | Intel Corporation | Methods for using raman spectroscopy to obtain a protein profile of a biological sample |
| RU2643697C1 (ru) * | 2017-05-11 | 2018-02-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физического материаловедения Сибирского отделения Российской академии наук | Способ получения композитных наноструктур: диоксид кремния - серебро |
| CN110068565A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-07-30 | 长江师范学院 | Sers传感芯片的应用及其检测方法和制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| S. Keskin, M. Culha "Label-free detection of proteins from dried-suspended droplets using surface enhanced Raman scattering", International Journal of Nanomedicine, Analyst, 2012, N137, 2651-2657. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114438215A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-05-06 | 山东中医药大学 | 一种基于dna超支化自组装检测肺癌标志物的sers探针和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rawat et al. | Visual detection of arginine, histidine and lysine using quercetin-functionalized gold nanoparticles | |
| Csáki et al. | Localized surface plasmon resonance based biosensing | |
| Yang et al. | A dynamic surface enhanced Raman spectroscopy method for ultra-sensitive detection: from the wet state to the dry state | |
| Hamon et al. | Colloidal design of plasmonic sensors based on surface enhanced Raman scattering | |
| US9658163B2 (en) | Assaying substrate with surface-enhanced raman scattering activity | |
| Stokes et al. | Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy as a sensitive and selective technique for the detection of folic acid in water and human serum | |
| Rao et al. | Colorimetric and fluorometric detection of protamine by using a dual-mode probe consisting of carbon quantum dots and gold nanoparticles | |
| Lin et al. | Uniform gold spherical particles for single-particle surface-enhanced Raman spectroscopy | |
| JP6196159B2 (ja) | 金属錯体量子結晶及びそれを用いる生化学物質の表面増強ラマン散乱（ｓｅｒｓ）分析法 | |
| JP2010203973A (ja) | 表面増強ラマン散乱の測定方法 | |
| RU2717160C1 (ru) | Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц | |
| Palanisamy et al. | Fast, sensitive and selective colorimetric gold bioassay for dopamine detection | |
| Nair et al. | Au nano-urchins enabled localized surface plasmon resonance sensing of beta amyloid fibrillation | |
| Unser et al. | Direct glucose sensing in the physiological range through plasmonic nanoparticle formation | |
| Liao et al. | Au–Ag–Au double shell nanoparticles-based localized surface plasmon resonance and surface-enhanced Raman scattering biosensor for sensitive detection of 2-mercapto-1-methylimidazole | |
| Al-Sammarraie et al. | Silver nanoparticles-based substrate for blood serum analysis under 785 nm laser excitation | |
| Zhu et al. | Au nanocone array with 3D hotspots for biomarker chips | |
| Wang et al. | Research progress of SERS on uranyl ions and uranyl compounds: a review | |
| Yuan et al. | Machine learning-driven multi-level composite SERS platform for trace detection of chlorogenic acid as pharmacodynamic substance in honeysuckle | |
| Nejdl et al. | Rapid preparation of self-assembled CdTe quantum dots used for sensing of DNA in urine | |
| Saini et al. | Axonic Au tips induced enhancement in Raman spectra and biomolecular sensing | |
| Zhang et al. | Research on the Raman properties of NiFe/cicada wing composite SERS platform modified by silver nanoparticles | |
| Geng et al. | Rapid and sensitive detection of amphetamine by SERS-based competitive immunoassay coupled with magnetic separation | |
| Liu et al. | Label-free and sensitive detection of microalgae protein using GNRs-based resonance light scattering system | |
| Fu et al. | Highly sensitive and naked eye dual-readout method for L-cysteine detection based on the NSET of fluorophore functionalized gold nanoparticles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |