RU2714325C1 - Method for predicting the risk of a skin pathology in the form of melanosis or dyschromia associated with excessive arsenic contamination in a human - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, particularly to dermatology, and aims at predicting the risk of a skin pathology in the form of melanosis or dyschromia associated with excessive arsenic contamination. Blood, urine and buccal epithelium are sampled. Arsenic content is determined in urine sample, C-peptide level in blood serum, and DNA is extracted from buccal epithelium sample. If observing simultaneous detection of presence of variant homozygous genotype of TERT (rs10054203) gene, variant homozygous or heterozygous genotypes of MMP9 Gln279Arg (rs17576) gene, variant homozygous gene genotype ZMPSTE24 (rs2076697) under condition of simultaneous presence of arsenic in urine above 300 mcg/dm³, as well as when C-peptide level in blood serum exceeds the norm range of 0.5–3.2 ng/cm³, an increased risk of a skin pathology in the form of melanosis or dyschromia associated with excessive arsenic contamination is predicted.

EFFECT: invention provides reliable assessment of arsenic effect on predisposition of human skin pathologies.

1 cl, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано для ранней диагностики и прогнозирования токсического действия мышьяка на проявление у человека кожной патологии в виде меланоза или дисхромии.The invention relates to medicine, namely to dermatology, and can be used for early diagnosis and prediction of the toxic effect of arsenic on the manifestation of a skin pathology in humans in the form of melanosis or dyschromia.

Изобретение предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия мышьяка, поступающего из окружающей среды, на здоровье человека, проживающего на территориях с повышенным содержанием этого токсиканта в питьевой воде.The invention is intended to identify the adverse effects of arsenic from the environment on the health of a person living in areas with a high content of this toxicant in drinking water.

Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ профилактики, а кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности, мышьяка, обуславливающего риск нарушения кожного покрова в виде меланоза или дисхромии.The invention can be used to make a preliminary diagnosis both in specialized clinics for examination of patients, and in conventional healthcare institutions. The results of these examinations are necessary for the development of individual prevention programs, and in addition, they can be used in the formation of sanitary and hygienic measures to prevent and eliminate the effects of harmful chemicals, in particular arsenic, which causes a risk of skin damage in the form of melanosis or dyschromia.

Меланоз - это явление, возникающее в виде пигментных пятен на теле человека. Заболевание имеет код по Международной классификации болезней 10-ой редакции (МКБ-10) - С43. Проявляется избыточным меланином в человеческом организме - веществом, защищающим тело от ультрафиолетовых лучей. Темный цветовой оттенок кожи и глаз обусловлен количеством гранул данного пигмента. Меланин выполняет защитную функцию для клеток ДНК, оберегают ее от разрушительного влияния ультрафиолета. Меланоз кожи - когда цветовые пигменты начинают вырабатываться в превышенной концентрации. Также меланоциты выделяются в таких местах организма, где в норме не содержатся - в почках, слизистых оболочках, головном мозге. В отдельных случаях болезнь принимает предраковую форму, начальную стадию онкологии. (Источник: https://onko.guru/termin/melanoz.html | Онкология от А до Я на Onko.guru).Melanosis is a phenomenon that occurs in the form of age spots on the human body. The disease has a code according to the International classification of diseases of the 10th edition (ICD-10) - C43. It is manifested by excess melanin in the human body - a substance that protects the body from ultraviolet rays. The dark color shade of the skin and eyes is due to the number of granules of this pigment. Melanin performs a protective function for DNA cells, protect it from the destructive effects of ultraviolet radiation. Skin melanosis - when color pigments begin to be produced in excess concentration. Also, melanocytes are secreted in such places of the body where they are not normally found - in the kidneys, mucous membranes, and the brain. In some cases, the disease takes on a precancerous form, the initial stage of oncology. (Source: https://onko.guru/termin/melanoz.html | Oncology from A to Z on Onko.guru).

Дисхромия кожи - это состояние, при котором видоизменяется естественный цвет кожного покрова. Заболевание имеет код по МКБ-10 L81. Явление распространенное и в большинстве случаев не выступает патологическим нарушением. Дискомфорт от дисхромии носит эстетичный и психологичный характер (источник: https://promelanin.ru/bolezni/pjatna-na-kozhe/dishromiya-kozhi.html).Skin dyschromia is a condition in which the natural color of the skin is altered. The disease has a code for ICD-10 L81. The phenomenon is common and in most cases does not appear as a pathological violation. The discomfort of dyschromia is aesthetic and psychological in nature (source: https://promelanin.ru/bolezni/pjatna-na-kozhe/dishromiya-kozhi.html).

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что повышенный уровень мышьяка в окружающей среде может явиться причиной дермопатологии.The relevance of the proposed method is determined by the fact that an increased level of arsenic in the environment can cause dermopathology.

В связи с широким использованием химических технологий в различных производственных циклах и сферах человеческой деятельности пристальное внимание ученых и медиков привлекает проблема выявления пороговых критериев, позволяющих на ранних этапах оценить, что воздействие вредного химического вещества превышает компенсаторные возможности организма и наносит вред здоровью человека. Актуальность исследования неблагоприятного воздействия мышьяка особенно обусловлена на территориях, для которых характерна эндемичность его присутствия в природных водах (природная биогеохимическая провинция с повышенным содержанием мышьяка).Due to the widespread use of chemical technologies in various production cycles and areas of human activity, the attention of scientists and physicians is attracted by the problem of identifying threshold criteria that allow us to assess at an early stage that the exposure to a harmful chemical exceeds the compensatory capabilities of the body and is harmful to human health. The relevance of the study of the adverse effects of arsenic is especially determined in territories that are characterized by endemicity of its presence in natural waters (a natural biogeochemical province with an increased content of arsenic).

Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье человека, ранней диагностики нарушений здоровья, а также для выбора эффективной профилактики, актуальным является выделение маркерных показателей конкретных заболеваний или их предвестников у человека под воздействием мышьяка, которые могут быть использованы в качестве индикаторов возможной кожной патологии и в качестве дополнительных диагностических критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.For the tasks of assessing the degree of environmental impact on human health, early diagnosis of health disorders, and also for choosing effective prevention, it is important to highlight marker indicators of specific diseases or their precursors in humans under the influence of arsenic, which can be used as indicators of possible skin pathology and as additional diagnostic criteria for the sanitary-epidemiological situation.

Из уровня техники известен ряд генетических методов прогнозирования возможности заболеваний кожи под воздействием ряда факторов, в том числе, химических.A number of genetic methods are known from the prior art for predicting the possibility of skin diseases under the influence of a number of factors, including chemical ones.

Из патента РФ №2454668 известен способ прогнозирования развития профессиональных злокачественных новообразований кожи у работников производства стекловолокна. Согласно известному способу из периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят анализ dup16bp полиморфизма 3 интрона и Arg72Pro полиморфизма 4 экзона гена ТР53. При выявлении сочетания генотипов *Arg/*Pro и *W/*dup16 прогнозируют риск развития злокачественных новообразований кожи. При обнаружении генотипов *Arg/*Arg и *W/*W прогнозируют устойчивость к формированию заболевания. Изобретение обеспечивает получение прогностических критериев развития злокачественных новообразований кожи или устойчивости к ним у работников производства стекловолокна на основе молекулярно-генетических маркеров.From the patent of the Russian Federation No. 2454668, a method is known for predicting the development of professional malignant neoplasms of the skin in glass fiber production workers. According to the known method, DNA is isolated from peripheral venous blood, dup16bp analysis of intron 3 polymorphism and Arg72Pro polymorphism 4 of exon TP53 gene is carried out. If a combination of the * Arg / * Pro and * W / * dup16 genotypes is detected, the risk of developing malignant neoplasms of the skin is predicted. When genotypes * Arg / * Arg and * W / * W are detected, resistance to disease formation is predicted. The invention provides prognostic criteria for the development of skin malignant neoplasms or resistance to them in glass fiber production workers based on molecular genetic markers.

Известен способ прогнозирования развития меланомы (злокачественная опухоль, развивающаяся из меланоцитов кожи) в европейских популяциях, заключающийся в том, что проводят анализ Arg72Pro полиморфизма гена ТР53, при выявлении носительства генотипа *Arg/*Arg прогнозируют повышенный риск развития меланомы (OR=1,28; 95% CI 1,05-1,55) [Chunying LI, Kexin chen, Zhengsheng Liu et al. Polymorphisms of TP53 Arg72Pro, but not p73 G4C14>A4TA4 and p21 Ser31Arg, contribute to risk of cutaneus melanoma. // J Invest Dermatol. - 2008. - V. 128. - N. 6. - P. 1585-1588]. Однако исследования предрасположенности к развитию эпителиальных злокачественных опухолей кожи (базальноклеточный рак, плоскоклеточная карцинома) не выявили связи ассоциации Arg72Pro полиморфизма гена ТР53 с заболеванием [Almquist LM, Kagaras MR, Welsh MM et al. The role of TP53 and MDM2 polymorphisms in TP53 mutagenesis and risk of non-melanoma skin cancer].There is a method for predicting the development of melanoma (a malignant tumor developing from skin melanocytes) in European populations, which consists in analyzing Arg72Pro polymorphism of the TP53 gene, and when carriage of the * Arg / * Arg genotype is identified, an increased risk of melanoma development is predicted (OR = 1.28 ; 95% CI 1.05-1.55) [Chunying LI, Kexin chen, Zhengsheng Liu et al. Polymorphisms of TP53 Arg72Pro, but not p73 G4C14> A4TA4 and p21 Ser31Arg, contribute to risk of cutaneus melanoma. // J Invest Dermatol. - 2008. - V. 128. - N. 6. - P. 1585-1588]. However, studies of the susceptibility to the development of epithelial malignant skin tumors (basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma) did not reveal a association of the Arg72Pro TP53 gene polymorphism with the disease [Almquist LM, Kagaras MR, Welsh MM et al. The role of TP53 and MDM2 polymorphisms in TP53 mutagenesis and risk of non-melanoma skin cancer].

Известен способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта 2282del4 гена филаггрина (см. Хантимерова Э.Ф., Нуртдинова Г.М., Карунас А.С., Гималова Г.Ф. Клинико-генетическая характеристика больных атопическим дерматитом и крапивницей с мутациями в гене филаггрина // Фундаментальные исследования. - 2014. - №10 (4). - С. 752-756). Однако данный способ имеет низкую пропускную способность, ввиду невысокой скорости проведения обследования пациентов (время анализа 1-2 дня), ввиду сложности, трудоемкости используемых лабораторных технологий, являющихся к тому же вредными для медицинского персонала, проводящего их. Это затрудняет определение наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.A known method for determining a hereditary predisposition to impaired barrier function of the skin, including venous blood sampling, isolation of genetic material, polymerase chain reaction of DNA synthesis, followed by analysis of restriction fragment length polymorphism, determination of the nucleotide sequence and based on this determination of the polymorphic variant 2282del4 of the filaggrin gene (see Khantimerova E.F., Nurtdinova G.M., Karunas A.S., Gimalova G.F. Clinical and genetic characteristics of patients with atopic dermatitis volume and urticaria with mutations in the filaggrin gene // Fundamental Research. - 2014. - No. 10 (4). - S. 752-756). However, this method has a low throughput, due to the low speed of the examination of patients (analysis time 1-2 days), due to the complexity, the complexity of the used laboratory technologies, which are also harmful to the medical staff conducting them. This makes it difficult to determine a hereditary predisposition to a violation of the barrier function of the skin, for example, during medical examinations or periodic medical examinations of a large number of people working in harmful and / or dangerous working conditions for short (short) periods of time.

В патенте РФ №2585960 описан способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи. Сущность способа состоит в том, что из венозной крови осуществляют выделение генетического материала. Проводят полимеразную цепную реакцию синтеза ДНК с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта 2282del4 филаггрина. При проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры: «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3'; «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3', размер ампликона - 205 пар оснований, а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера «FLG-2 S1» 5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-АС3'. Детекцию нуклеотидной последовательности осуществляют с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности в положении 2282 с референсными последовательностями. При выявлении на полученной пирограмме отсутствия делеции в положении 2282 гена филаггрина при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют низкую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи. При выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта ins/del в положении 2282 гена филаггрина определяют высокую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи.In the patent of the Russian Federation No. 2585960 a method for determining a hereditary predisposition to a violation of the barrier function of the skin is described. The essence of the method consists in the fact that the selection of genetic material is carried out from venous blood. A polymerase chain reaction of DNA synthesis is carried out, followed by analysis of the polymorphism of the lengths of restriction fragments, determination of the nucleotide sequence, and based on this, the determination of the polymorphic variant 2282del4 filaggrin. When carrying out the polymerase chain reaction, specific primers are used: “FLG-2 F1” 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3 '; "FLG-2 R1" 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3 ', the amplicon size is 205 base pairs, and after the polymerase chain reaction, the pyrosequencing reaction is carried out in real time using a specific primer " FLG-2 S1 "5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-AC3 '. The nucleotide sequence is detected using a chemiluminescent signal, then the obtained nucleotide sequence at position 2282 is compared with reference sequences. If there is a lack of deletion at the position 2282 of the filaggrin gene on the resulting pyrogram, when the organism is exposed to a harmful production factor of an irritating and sensitizing effect, a low hereditary predisposition to impaired skin barrier function is determined. When a heterozygous ins / del variant is detected on the resulting pyrogram at position 2282 of the filaggrin gene, a high hereditary predisposition to impaired skin barrier function is determined.

Недостатком указанного известного способа является то, что уровень барьерного функционала кожи является важным фактором, препятствующим попаданию и проникновению в организм вредных факторов, присутствующих в атмосферном воздухе или воздухе рабочей зоны, но не единственным. Если же вредный фактор присутствует в питьевой воде и его воздействие на кожу связано с процессами ферментации и метаболизма коньюгированного вредного химического фактора, такого как соединения мышьяка, оценки барьерной функции и дефекта гена филаггрина будет недостаточно, необходима оценка полиморфности генов, характеризующих обменные процессы, нарушение которых приводит к патологии кожных покровов.The disadvantage of this known method is that the level of the barrier functional of the skin is an important factor preventing the entry and penetration into the body of harmful factors present in the atmospheric air or air of the working area, but not the only one. If the harmful factor is present in drinking water and its effect on the skin is associated with the fermentation and metabolism of conjugated harmful chemical factors, such as arsenic compounds, the assessment of the barrier function and the defect of the filaggrin gene will be insufficient, an assessment of the polymorphism of genes characterizing metabolic processes, violation of which leads to pathology of the skin.

Из уровня техники известен способ прогнозирования среднетяжелого течения хронической истинной экземы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья РФ (Патент РФ №2578441). Сущность способа заключается в том, что выделяют ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизмов генов -308G/A TNFα,+250A/G Ltα,+1663A/G TNFR2 и их сочетаний. Повышенный риск развития среднетяжелого течения хронической истинной экземы прогнозируют при наличии аллеля +250G Ltα или сочетании аллеля+250G Ltα с аллелем +1663G TNFR2, или сочетании аллеля -308A TNFα с аллелем +1663G TNFR2, или сочетании аллеля -308G TNFα с аллелем+250G Ltα. Прогнозируют пониженный риск развития среднетяжелого течения ХИЭ при сочетании аллеля -308G TNFα с генотипом +250АА Ltα. Однако, известный способ оценивает только генетический риск развития хронической истинной экземы, поскольку исследуются гены рецепторной системы фактора некроза опухоли, отражающие события апоптоза, а генетические особенности формирования и проявлений дисхромии и меланоза, характеризующих арсеникоз, сценарий которого предполагает участие генов ферментов детоксикации и внутриклеточных белковых субстанций, данным известным способом не отражены.The prior art method for predicting the moderate course of chronic true eczema in individuals of Russian nationality, natives of the Central Black Earth Region of the Russian Federation (RF Patent No. 2578441). The essence of the method lies in the fact that DNA is isolated from peripheral venous blood, polymorphisms of the -308G / A TNFα, + 250A / G Ltα, + 1663A / G TNFR2 genes and their combinations are analyzed. An increased risk of developing a moderate course of chronic true eczema is predicted in the presence of the + 250G Ltα allele or the combination of the + 250G Ltα allele with the + 1663G TNFR2 allele, or the combination of the -308A TNFα allele with the + 1663G TNFR2 allele, or the combination of the -308G TNFα allele with the + 250 allele . A reduced risk of developing a moderate course of CIE is predicted with the combination of the -308G TNFα allele with the + 250AA Ltα genotype. However, the known method only assesses the genetic risk of developing chronic true eczema, since the genes of the receptor system of the tumor necrosis factor are studied, which reflect the events of apoptosis, and the genetic features of the formation and manifestations of dyschromia and melanosis characterizing arsenicosis, the scenario of which involves the participation of genes of detoxification enzymes and intracellular protein substances , in a known manner are not reflected.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы определения прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии в условиях избыточной контаминации мышьяком, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.Moreover, from the prior art, no known methods for determining the prediction of the risk of skin pathology in the form of melanosis or dyschromia under conditions of excessive arsenic contamination were identified, therefore, it is not possible to choose the closest analogue to the claimed object.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности оценки влияния мышьяка на предрасположенность проявлений кожной патологии у человека в виде меланоза или дисхромии на основе выявления молекулярно-генетических маркеров, с обеспечением возможности в последующем судить о развитии таких состояний уже на ранних стадиях их формирования.The technical result achieved by the present invention is to provide a reliable assessment of the effect of arsenic on the predisposition of manifestations of human skin pathology in the form of melanosis or dyschromia based on the identification of molecular genetic markers, with the possibility of subsequently judging the development of such conditions already in the early stages of their formation .

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии у человека, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком, характеризующийся тем, что производят отбор проб крови и мочи, определяют в пробе мочи содержание мышьяка, а в сыворотке крови - уровень С-пептида, также у указанного человека отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена теломеразы TERT, гена матриксной металлопротеиназы ММР9 Gln279Arg и гена цинкметаллопептидазы ZMPSTE24, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TERT (rs 10054203), гена ММР9 Gln279Arg (rs17576) и гена ZMPSTE24 (rs2076697), устанавливая при этом для каждого из указанных генов одно из следующих его состояний: нормальное гомозиготное СС, вариантное гомозиготное GG для гена TERT (rs 10054203); гетерозиготное AG, нормальное гомозиготное АА, вариантное гомозиготное GG для гена ММР9 Gln279Arg (rs17576); нормальное гомозиготное ТТ, вариантное гомозиготное СС для гена ZMPSTE24 (rs2076697), и при одновременном обнаружении следующих диагностических критериев: наличие вариантного гомозиготного генотипа гена TERT (rs 10054203), вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена ММР9 Gln279Arg (rs17576), вариантного гомозиготного генотипа гена ZMPSTE24 (rs2076697), при условии одновременного наличия мышьяка в моче выше 300 мкг/дм³, а также при превышении уровня С-пептида в сыворотке крови выше диапазона нормы 0,5-3,2 нг/см³, прогнозируют повышенный риск возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком.The specified technical result is achieved by the proposed method for predicting the risk of skin pathology in the form of melanosis or dyschromia in humans associated with excessive arsenic contamination, characterized in that blood and urine samples are taken, the content of arsenic is determined in the urine sample, and the level C in blood serum -peptide, a sample of buccal epithelium is also taken from the indicated person, deoxyribonucleic acid (DNA) is extracted from the indicated sample, then on a detecting amplification In a real-time polymerase chain reaction, the gene is genotyped for the polymorphism of the TERT telomerase gene, the MMP9 matrix metalloproteinase gene Gln279Arg and the zinc metallopeptidase gene ZMPSTE24, using a DNA fragment as a primer by examining the TERT gene genotypes (rs 10054203g9) and gene M27 r75 g27 of r27 gene ZMPSTE24 (rs2076697), while establishing for each of these genes one of the following conditions: normal homozygous SS, variant homozygous GG for the TERT gene (rs 10054203); heterozygous AG, normal homozygous AA, variant homozygous GG for the MMP9 gene Gln279Arg (rs17576); normal homozygous TT, variant homozygous SS for the ZMPSTE24 gene (rs2076697), and with the simultaneous detection of the following diagnostic criteria: the presence of the variant homozygous genotype of the TERT gene (rs 10054203), the variant homozygous or heterozygous genotype of the MMP9GsGnS7 gene, gnS7, gnS75, gnS75, gs27 (rs2076697), with the simultaneous presence of arsenic in urine above 300 μg / dm ³ , and also when the level of C-peptide in the blood serum is above the normal range of 0.5-3.2 ng / cm ³ , an increased risk of pathology in the form of melanosis or dyschromia associated with excessive arsenic contamination.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.The technical result is achieved due to the following.

Роль мышьяка в организме проявляется во влиянии на нарушение тканевого дыхания и снижение энергетических ресурсов клетки в результате метаболического разобщения окислительного фосфорилирования.The role of arsenic in the body is manifested in the effect on impaired tissue respiration and a decrease in cell energy resources as a result of metabolic dissociation of oxidative phosphorylation.

Основные расстройства, вызываемые мышьяком:The main disorders caused by arsenic:

- общий ацидоз, развивающийся вследствие угнетения окислительных процессов и накопления в тканях молочной, пировиноградной кислоты и других кислых продуктов обмена.- General acidosis, which develops as a result of inhibition of oxidative processes and the accumulation in the tissues of lactic, pyruvic acid and other acidic metabolic products.

- нарушение гемодинамики из-за паралича капилляров, увеличения порозности стенок кровеносных сосудов, расстройства сердечной деятельности, местного токсического действия на выделительные органы, что приводит к значительному обезвоживанию организма, потере солей.- violation of hemodynamics due to paralysis of capillaries, increased porosity of the walls of blood vessels, cardiac disorders, local toxic effects on excretory organs, which leads to significant dehydration of the body, loss of salts.

- гемолиз и анемия, усиливающее гипоксию тканей, обусловленную не только расстройством реакций окислительного фосфорилирования, но и нарушением транспорта кислорода вследствие включения мышьяка в молекулу Hb.- hemolysis and anemia, enhancing tissue hypoxia, caused not only by a disorder of oxidative phosphorylation reactions, but also by a violation of oxygen transport due to the inclusion of arsenic in the Hb molecule.

- дегенеративное и некротическое поражение тканей в местах их контакта с мышьяком.- degenerative and necrotic tissue damage in places of their contact with arsenic.

- эмбриотоксические, гонадотоксический и тератогенный эффекты.- embryotoxic, gonadotoxic and teratogenic effects.

Последствия попадания избытка мышьяка зависят от физиологического состояния организма, путей поступления вещества, возраста человека, наличия сопутствующих заболеваний и от ряда других факторов. Чаще наблюдается хроническая интоксикация, связанная с употреблением воды с повышенной концентрацией мышьяка. Также встречаются случаи ингаляционного отравления при длительном производственном или бытовом контакте с мышьяксодержащими инсектицидами и пестицидами, керамикой, древесиной и стеклом. Хроническая интоксикация приводит к периферической невропатии (боль, слабость, парестезии), характерным изменениям пигментации кожи, гиперкератозу, линиям Ми, ломкости ногтей, алопеции и нарушению перистальтики кишечника. Кроме того, она ассоциирована со злокачественными новообразованиями печени, легких, кожи и почек. Референтные значения мышьяка в моче: 0-300 мкг/дм³.The consequences of getting an excess of arsenic depend on the physiological state of the body, the routes of intake of the substance, the age of the person, the presence of concomitant diseases, and a number of other factors. More often chronic intoxication is associated with the use of water with an increased concentration of arsenic. There are also cases of inhalation poisoning during prolonged industrial or household contact with arsenic-containing insecticides and pesticides, ceramics, wood and glass. Chronic intoxication leads to peripheral neuropathy (pain, weakness, paresthesia), characteristic changes in skin pigmentation, hyperkeratosis, Mie lines, brittle nails, alopecia and impaired intestinal motility. In addition, it is associated with malignant neoplasms of the liver, lungs, skin and kidneys. Reference values of arsenic in urine: 0-300 mcg / dm ³ .

В качестве диагностического критерия прогнозирования риска формирования нарушений кожного покрова в виде меланоза и дисхронии у человека в условиях избыточной контаминации мышьяком рекомендуется использовать измененный генотип гена теломеразы TERT, гена матриксной металлопротеиназы ММР9 Gln279Arg и гена цинкметаллопептидазы ZMPSTE24, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TERT (rs10054203), гена ММР9 Gln279Arg (rs17576) и гена ZMPSTE24 (rs2076697).As a diagnostic criterion for predicting the risk of skin disorders in the form of melanosis and dyschrony in humans under conditions of excessive arsenic contamination, it is recommended to use the altered genotype of the TERT telomerase gene, the MMP9 matrix metalloproteinase gene Gln279Arg and the ZMPSTE24 zinc metallopeptidase gene, using the gene for DNA primer analysis TERT (rs10054203), MMP9 gene Gln279Arg (rs17576) and ZMPSTE24 gene (rs2076697).

Ген теломеразы TERT отвечает за кодировку белка, регулирующего стабильность хромосом. Теломераза - фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК. Теломеры содержат уплотненную ДНК и стабилизируют хромосомы. При каждом делении клетки теломерные участки укорачиваются. TERT- это обратная транскриптаза, то есть фермент, создающий одноцепочечную ДНК на основе шаблонной одноцепочечной РНК. Теломеры обеспечивают защиту главного фрагмента ДНК от поражения при репликации. Когда они заканчиваются, клетки не способны делиться. Однако некоторые из них не сталкиваются с подобными проблемами. Это обусловлено наличием в их составе другого фермента - теломеразы. Он все время удлиняет теломеры. Такие особенности характерны для раковых и стволовых клеток. Теломеры находятся на 4 окончаниях хромосом и напоминают кончики шнурков. Эти элементы предотвращают склеивание хромосомных концов друг с другом. Также они помогают избежать слипания с остальными хромосомами. При нарушении этого процесса клетки погибают или трансформируются в опухоли. По мере деления клеток окончания теломеразы укорачиваются. Как следствие, клетки прекращают процесс деления. Эти изменения являются генетическими и эпигенетическими. Это значит, что они зависят от наследственной предрасположенности и воздействия внешних факторов.The tert telomerase gene is responsible for encoding a protein that regulates chromosome stability. Telomerase is an enzyme that adds special repetitive DNA sequences. Telomeres contain compacted DNA and stabilize chromosomes. At each cell division, telomeric regions are shortened. TERT is reverse transcriptase, that is, an enzyme that creates single-stranded DNA based on template single-stranded RNA. Telomeres protect the main DNA fragment from damage during replication. When they end, the cells are not able to divide. However, some of them do not face similar problems. This is due to the presence in their composition of another enzyme - telomerase. He lengthens telomeres all the time. Such features are characteristic of cancer and stem cells. Telomeres are located at the 4 ends of the chromosomes and resemble the ends of laces. These elements prevent gluing of the chromosome ends to each other. They also help to avoid adhesion to other chromosomes. If this process is disturbed, the cells die or transform into tumors. As the cells divide, telomerase ends are shortened. As a result, cells stop the process of division. These changes are genetic and epigenetic. This means that they depend on a hereditary predisposition and exposure to external factors.

Многочисленные научные исследования помогли установить, что у некоторых людей процесс укорачивания теломеров является слишком быстрым. Это становится причиной возникновения серьезных патологий и преждевременного старения. Таким образом, поддерживается концепция возможного вовлечения прогрессирующего укорочения теломер в патогенез возрастных нарушений в человеческом организме. В этом смысле важен тот факт, что ослабление теломеразной активности или усиление изнашивания теломер наблюдается у человека при различных синдромах, связанных с преждевременным старением, таких как врожденный дискератоз, синдром Вернера или телеангиэктатическая атаксия.Numerous scientific studies have helped to establish that in some people the process of shortening telomeres is too fast. This causes serious pathologies and premature aging. Thus, the concept of the possible involvement of progressive telomere shortening in the pathogenesis of age-related disorders in the human body is supported. In this sense, it is important that a decrease in telomerase activity or increased wear of telomeres is observed in humans with various syndromes associated with premature aging, such as congenital dyskeratosis, Werner syndrome, or telangiectatic ataxia.

Теломеры с белками образуют защитную структуру шелтерин (телосома), не позволяющую клетке распознать концы линейной ДНК в качестве двунитевых разрывов, что предотвращает их репарацию. Повышение активности теломеразы наблюдается примерно при 90% злокачественных опухолей человека различного происхождения и могут быть следствием молекулярно-генетических нарушений, заключающихся в мутациях в кодирующем участке гена теломеразы, что является редким событием, а чаще - в мутациях промотора обратной транскриптазы теломеразы (TERT - от англ. «Telomerase Reverse Transcriptase»). Мутации промотора TERT обнаружены в злокачественных опухолях различного гистогенеза (глиобластомы, меланома кожи, рак мочевого пузыря и др.), включая эндокринные органы (щитовидная и околощитовидные железы, надпочечники).Telomeres with proteins form the protective structure of shelterin (telosome), which does not allow the cell to recognize the ends of linear DNA as double-stranded breaks, which prevents their repair. An increase in telomerase activity is observed in approximately 90% of human cancers of various origins and may be due to molecular genetic disorders consisting in mutations in the coding region of the telomerase gene, which is a rare event, and more often, in mutations in the telomerase reverse transcriptase promoter (TERT - from English . "Telomerase Reverse Transcriptase"). Mutations of the TERT promoter were found in malignant tumors of various histogenesis (glioblastomas, skin melanoma, bladder cancer, etc.), including endocrine organs (thyroid and parathyroid glands, adrenal glands).

ММР-9 является ферментом семейства цинк-металлопротеиназ, реализующим ремоделирование межклеточной среды фибробластами кожи. Протеазы семейства ММР участвуют в разрушении межклеточного матрикса в физиологических условиях (эмбриональное развитие, размножение, ангиогенез, развитие костной ткани, миграция клеток) и при патологии (артрит, внутримозговые кровотечения, метастазирование опухолей). Большинство ММР секретируется в виде неактивных пропротеинов, которые активируются внеклеточными протеиназами [Vandooren J., Van den Steen P.E., Opdenakker G. Biochemistry and molecular biology of gelatinase В or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade // Crit Rev Biochem Mol Biol. - 2013. - V. 48. - N 3. - P. 222-272]. Индуцируемый ультрафиолетом синтез MMP-9 способствует разрушению фибриллярного коллагена типа I и III в дерме. Коэкспрессия ММР-2, 3, 9 приводит к деградации неколлагеновых компонентов дермы, в том числе гликопротеинов и протеогликанов базальной мембраны. При старении клеток кожи уровень тканевых ингибиторов ММР снижается, что способствует активации ремоделирования межклеточного матрикса [Wong V.W., Garg R.K., Sorkin М. et al. Loss of keratinocyte focal adhesion kinase stimulates dermal proteolysis through upregulation of MMP9 in wound healing // Ann Surg. - 2014. - Vol. 260. - N 6. - P. 1138-1146; Xue S.N., Lei J, Lin D.Z. et al. Changes in biological behaviors of 58 rat dermal fibroblasts induced by high expression of MMP9 // World J Emerg Med. - 2014. - V. 5. - N 2. - P. 139-143].MMP-9 is an enzyme of the zinc metalloproteinase family that implements remodeling of the intercellular medium with skin fibroblasts. Proteases of the MMP family are involved in the destruction of the intercellular matrix under physiological conditions (embryonic development, reproduction, angiogenesis, bone tissue development, cell migration) and pathology (arthritis, intracerebral hemorrhage, tumor metastasis). Most MMPs are secreted as inactive proproteins that are activated by extracellular proteinases [Vandooren J., Van den Steen PE, Opdenakker G. Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade // Crit Rev Biochem Mol Biol. - 2013. - V. 48. - N 3. - P. 222-272]. The ultraviolet-induced synthesis of MMP-9 contributes to the destruction of fibrillar collagen type I and III in the dermis. Coexpression of MMP-2, 3, 9 leads to the degradation of non-collagen components of the dermis, including glycoproteins and proteoglycans of the basement membrane. With aging skin cells, the level of tissue MMP inhibitors decreases, which contributes to the activation of remodeling of the extracellular matrix [Wong V.W., Garg R.K., Sorkin M. et al. Loss of keratinocyte focal adhesion kinase stimulates dermal proteolysis through upregulation of MMP9 in wound healing // Ann Surg. - 2014 .-- Vol. 260. - N 6. - P. 1138-1146; Xue S.N., Lei J, Lin D.Z. et al. Changes in biological behaviors of 58 rat dermal fibroblasts induced by high expression of MMP9 // World J Emerg Med. - 2014. - V. 5. - N 2. - P. 139-143].

Ген ZMPSTE24 - цинкметаллопроиназа STE24, которая перерабатывает ламин А. Дефект этого гена вызывает синдром выраженного преждевременного старения. Ламин А/С - белки человека, принадлежащие к семейству ламинов и кодируемые геном LMNA на первой хромосоме. Ламины (у позвоночных имеются три формы: А, В, С) сплетаются под мембраной клеточного ядра в слой, называемый ядерной ламиной. Мутации и вариации гена LMNA ассоциированы с мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса, семейной частичной липодистрофией, конечностно-поясной мышечной дистрофией, дилатационной кардиомиопатией, болезнью Шарко-Мари-Тута и синдромом прогерии Хатчинсона-Гилфорда. Синдром прогерии, исключительно редкое расстройство, вызывается синтезом ламина А неправильной формы, называемой прогерином. Генерация нормальной формы ламина А. Неспособность сгенерировать зрелый белок нормальной формы (справа) приводит к образованию патологического ламина под названием «прогерин». В свою очередь, прогерин нарушает функционирование клеточного ядра, приводя к изменениям кожи и ускоренному старению. Металлопротеиназы (а именно ZMPSTE24) в виде карбоксипептидаз участвуют в биосинтезе нейроэндокринных белков, таких как инсулин.The ZMPSTE24 gene is STE24 zincmetalloproinase, which processes lamin A. A defect in this gene causes severe premature aging syndrome. Lamin A / C - human proteins belonging to the lamin family and encoded by the LMNA gene on the first chromosome. Lamines (in vertebrates there are three forms: A, B, C) are woven under the membrane of the cell nucleus into a layer called a nuclear lamin. Mutations and variations of the LMNA gene are associated with Emery-Dreyfus muscular dystrophy, familial partial lipodystrophy, limb-waist muscular dystrophy, dilated cardiomyopathy, Charcot-Marie-Tooth disease and Hutchinson-Guildford progeria syndrome. Progeria Syndrome, an extremely rare disorder, is caused by the synthesis of lamin A, an irregular shape called progerin. Generation of the normal form of lamin A. Inability to generate a mature protein of normal form (right) leads to the formation of a pathological lamin called progerin. In turn, progerin disrupts the functioning of the cell nucleus, leading to skin changes and accelerated aging. Metalloproteinases (namely ZMPSTE24) in the form of carboxypeptidases are involved in the biosynthesis of neuroendocrine proteins, such as insulin.

С-пептид (от англ. connecting peptide, «соединяющий» пептид) - пептид, образующийся при расщеплении проинсулина пептидазами (ZMPSTE24).C-peptide (from the English. Connecting peptide, "connecting" peptide) - a peptide formed during the cleavage of proinsulin peptidases (ZMPSTE24).

В качестве критерия возникновения нарушений кожных покровов (меланоз, дисхромия) в условиях избыточной контаминации мышьяком рекомендуется использовать:As a criterion for the occurrence of skin disorders (melanosis, dyschromia) in conditions of excessive arsenic contamination, it is recommended to use:

- измененный генотип (вариантный гомозиготный) гена теломеразы TERT (rs10054203) C309G, отвечающего за сохранение и регенерацию теломеров, которые обеспечивают защиту главного фрагмента ДНК от поражения при репликации и зависят от активности теломеразы, а в случае мутации создаются условия для ослабления теломеразной активности или усиления изнашивания теломер, что наблюдается у человека при различных синдромах, связанных с преждевременным старением, таких как врожденный дискератоз;- a modified genotype (variant homozygous) of the tERT telomerase gene (rs10054203) C309G, which is responsible for the conservation and regeneration of telomeres, which protect the main DNA fragment from damage during replication and depend on telomerase activity, and in the case of a mutation, conditions are created for weakening telomerase activity or amplification telomere wear, which is observed in humans with various syndromes associated with premature aging, such as congenital dyskeratosis;

- измененный генотип (вариантный гомозиготный) гена цинкметаллопептидазы ZMPSTE24 (rs2076697) Т/С, отвечающего за биосинтез нейроэндокринных белков, таких как инсулин и С-пептид, а также способствует образованию вазопрессорного соединения ангиотензина II вызывающего сужение сосудов периферических артерий и повышающего артериального давления, а дефект гена вызывает синдром выраженного преждевременного старения, предполагается связь гена с развитием синдрома гиперкератоза;- the altered genotype (variant homozygous) of the zincmetallopeptidase gene ZMPSTE24 (rs2076697) T / C, which is responsible for the biosynthesis of neuroendocrine proteins, such as insulin and C-peptide, and also promotes the formation of a vasopressor compound angiotensin II causing vasoconstriction of peripheral arteries, and increases peripheral arterial blood vessels, and a gene defect causes a pronounced premature aging syndrome; it is suggested that the gene is associated with the development of hyperkeratosis syndrome;

- измененный генотип (гетерозиготный или вариантный гомозиготный) гена матриксной металлопротеиназы ММР9 (rs17576) Gln279Arg, A/G, отвечающего за формировании и поддержании внеклеточного матрикса - тканевых структур, служащих каркасом, на котором развиваются клетки, полиморфизм ММР9 - риск дефекта синтеза коллагена, риск получения более рыхлого коллагена, снижение количества и качества коллагеновых волокон способствует уменьшению толщины дермального слоя, появлению морщин, складок, птоза тканей.- altered genotype (heterozygous or variant homozygous) of the matrix metalloproteinase gene MMP9 (rs17576) Gln279Arg, A / G, responsible for the formation and maintenance of the extracellular matrix - tissue structures that serve as the framework on which the cells develop, collagen polymorphism MMP9 - risk of defect synthesis obtaining more loose collagen, reducing the quantity and quality of collagen fibers helps to reduce the thickness of the dermal layer, the appearance of wrinkles, wrinkles, tissue ptosis.

Совокупные проявления полиморфизма данных генов, отвечающих за ключевые ферментные реакции обмена веществ, способствуют формированию нарушений скорости метаболизма, снижению апоптоза и феномену кожных нарушений, как составляющего процесса ускоренного старения.The combined manifestations of the polymorphism of these genes, which are responsible for key enzymatic metabolic reactions, contribute to the formation of metabolic rate disturbances, a decrease in apoptosis and the phenomenon of skin disorders, as a component of accelerated aging.

Также показателем, характеризующим сам феномен нарушения ферментативноопосредованных реакций обмена, является С-пептид, образующийся при расщеплении проинсулина пептидазами, возрастные повышения уровня которого сопровождают течение сахарного диабета 2-го типа и кожных нарушений.Also, an indicator characterizing the very phenomenon of impaired enzyme-mediated metabolic reactions is the C-peptide, which is formed during the cleavage of proinsulin by peptidases, age-related increases in the level of which accompany the course of type 2 diabetes mellitus and skin disorders.

Модулирующие указанные процессы ионы мышьяка (мышьяком производится замена цинка в молекуле металлопептидаз) в данном изобретении будут характеризовать 2 критерия: содержание мышьяка в моче и ответ на его контаминацию - уровень содержания IgG к мышьяку. Подтверждающим фактором нарушения ферментоопосредованного метаболизма и формирования кожных нарушений (меланоз, дисхромия) будет служить нарастание уровня С-пептида и специфического ответа на мышьяк по критерию содержания IgG к мышьяку. Реализующим или запускающим процесс нарушения фосфорного обмена служит экспозиция мышьяка, превышающая верхний предел референтной концентрации в моче (референтный диапазон мышьяка в моче 0,0-300,0 мкг/дм³).The arsenic ions modulating these processes (arsenic replaces the zinc in the metal peptidase molecule) in this invention will be characterized by 2 criteria: the content of arsenic in the urine and the response to its contamination is the level of IgG content to arsenic. A confirming factor in the violation of enzyme-mediated metabolism and the formation of skin disorders (melanosis, dyschromia) will be an increase in the level of C-peptide and a specific response to arsenic according to the criterion of the content of IgG to arsenic. Realizing or starting the process of phosphorus metabolism disturbance is the exposure of arsenic in excess of the upper limit of the reference concentration in the urine (the reference range of arsenic in urine is 0.0-300.0 μg / dm ³ ).

Таким образом, для установления ранних проявлений и формирования специфического нарушения кожных покровов в виде меланоза, дисхромии, ассоциированных с содержанием мышьяка в моче, рекомендуется использование методического подхода, основанного на определении генотипов кандидатных генов и в случае вариантной гомозиготы GG участка гена TERT rs10054203; гетерозиготы AG или вариантной гомозиготы GG участка гена ММР9 rs 17576 Gln279Arg, и вариантной гомозиготы СС участка гена ZMPSTE24 rs2076697, отклонении от физиологической нормы содержания IgG специфического к мышьяку в виде его гиперпродукции, избыточном содержании мышьяка в моче выше 300 мкг/дм³ (т.е. выше верхней границы референтной концентрации) прогнозируют риск формирования кожных нарушений, выражающихся дисхромией, меланозом, ассоциированных с контаминацией мышьяком.Thus, to establish early manifestations and the formation of a specific violation of the skin in the form of melanosis, dyschromia associated with the content of arsenic in the urine, it is recommended to use a methodological approach based on determining the genotypes of candidate genes and in the case of variant GG homozygosity of the TERT rs10054203 gene region; heterozygotes AG or variant homozygosity GG of the MMP9 rs 17576 Gln279Arg gene region, and variant homozygosity of the CC region of the ZMPSTE24 rs2076697 gene, deviation from the physiological norm of arsenic-specific IgG in the form of its hyperproduction, excess arsenic content in the urine above 300 μg / dm ³ ( E. Above the upper limit of the reference concentration), the risk of the formation of skin disorders expressed by dyschromia, melanosis associated with arsenic contamination is predicted.

Это доказывается повышением экспрессии С-пептида, т.к. С-пептид является показателем, повышение уровня которого сопровождаются кожными нарушениями. Уровень С-пептида отражает функциональное состояние металлопептидаз (цинкметаллопептидазы ZMPSTE24, матриксной металлопротеиназы ММР-9), при дефекте которых возникают нарушения, характеризующиеся истончением дермального и гипертрофией рогового слоев кожи.This is proved by increased expression of the C-peptide, because C-peptide is an indicator, an increase in the level of which is accompanied by skin disorders. The level of the C-peptide reflects the functional state of metallopeptidases (zinc metallopeptidases ZMPSTE24, matrix metalloproteinases MMP-9), in the event of a defect of which there are disorders characterized by thinning of the dermal layer and hypertrophy of the corneous layers of the skin.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб крови и мочи, а также стандартных методик изучения генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.Thanks to the use of blood and urine samples as the test material, as well as standard methods for studying genetic parameters, the simplicity, reliability and accessibility of studies, as well as obtaining the results of the necessary information content, are ensured.

Установление содержания химического контаминанта - мышьяка, именно в моче обусловлено тем, что моча является средой, имеющей реферируемые (фоновые) уровни в отношении техногенных химических веществ, а также стандартной средой используемой для протоколов интоксикаций, вызванных металлами.The determination of the content of a chemical contaminant - arsenic in the urine is due to the fact that urine is a medium with referenced (background) levels in relation to technogenic chemicals, as well as a standard medium used for protocols of intoxication caused by metals.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма указанных генов TERT; ММР9 и ZMPSTE24.Thanks to the use of buccal epithelium as a test material (a sample of biological material from the mucous membrane of the cheek), the simplicity and reliability of studies are ensured, as well as the necessary information content in terms of the isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) from the indicated sample and through polymerase chain reaction (PCR) polymorphism genotyping said TERT genes; MMP9 and ZMPSTE24.

Благодаря тому, что в заявляемом способе в качестве диагностических критериев предлагается использовать одновременно именно полиморфизм гена TERT (rs10054203); ММР9 (rs17576) Gln279Arg и ZMPSTE24 (rs2076697), обеспечивается точность диагностики. Поэтому по данным показателям можно судить о генетически детерминированном характере нарушений кожных покровов в виде меланоза и дисхронии, и разрабатывать в последующем индивидуальные программы лечения.Due to the fact that in the claimed method, it is proposed to use precisely the TERT gene polymorphism (rs10054203) at the same time as diagnostic criteria; MMP9 (rs17576) Gln279Arg and ZMPSTE24 (rs2076697), diagnostic accuracy is ensured. Therefore, according to these indicators, one can judge the genetically determined nature of skin disorders in the form of melanosis and dyschrony, and subsequently develop individual treatment programs.

Причем из уровня техники неизвестны методы выявления предрасположенности к риску нарушения пигментации кожи в условиях избыточной контаминации мышьяком с использованием одновременно именно полиморфизмов этих генов.Moreover, from the prior art, methods are not known for identifying a predisposition to a risk of skin pigmentation disorders under conditions of excessive arsenic contamination using both polymorphisms of these genes at the same time.

Уровень IgG к мышьяку характеризует сам феномен специфической сенсибилизации.The level of IgG to arsenic characterizes the very phenomenon of specific sensitization.

Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфными вариантами указанных генов, ассоциированных с генетическим дефектом, и врожденной чувствительностью к внешним факторам (например, мышьяк), одновременно с количеством химического токсиканта - мышьяк в моче, и превышением уровня IgG к мышьяку по сравнению с физиологической нормой, будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния мышьяка на потенциальное развитие кожной патологии у человека.It is thanks to the expansion of information indicators associated with the polymorphic variants of these genes associated with a genetic defect and innate sensitivity to external factors (for example, arsenic), simultaneously with the amount of a chemical toxicant - arsenic in the urine, and an excess of the level of IgG to arsenic compared with physiological norm, the accuracy of evaluating the modifying effect of arsenic on the potential development of skin pathology in humans will be ensured.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.Based on the foregoing, we can conclude that the technical result is achieved due to the totality of operations of the proposed method, their sequence and modes of its implementation.

Предлагаемый способ реализуется следующим образомThe proposed method is implemented as follows

1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием природной биогеохимической провинции, характеризующей повышенным содержанием мышьяка в природных водах. Исследования были проведены на территории одного из промышленных регионов Российской Федерации, характеризующейся наличием в питьевой воде повышенных концентраций мышьяка (более 1 ПДК)1. Choose the territory of environmental risk, characterized by the presence of a natural biogeochemical province, characterized by an increased content of arsenic in natural waters. Studies were conducted on the territory of one of the industrial regions of the Russian Federation, characterized by the presence in the drinking water of increased concentrations of arsenic (more than 1 MAC)

2. На указанной территории проводят отбор группы пациентов одной этнической популяции. Затем проводят отбор пробы мочи у обследуемых пациентов для определения содержания мышьяка. Содержание мышьяка в моче определяют по Методике «Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой», изложенной в МУК 4.1.1483-03, с использованием масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500сх с октопольной реакционной ячейкой (USA). Устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе мочи над его референтным уровнем (в примере конкретного осуществления на территории максимальным референтным значением по мышьяку был показатель равный 300,0 мкг/дм³).2. In the indicated territory, a group of patients of one ethnic population is selected. Then urine samples are taken from the examined patients to determine the arsenic content. The content of arsenic in urine is determined according to the Method “Control Methods. Chemical factors. Determination of the content of chemical elements in diagnosed biosubstrates, preparations and biologically active additives by the method of mass spectrometry with inductively coupled argon plasma ”, described in MUK 4.1.1483-03, using a mass spectrometer with inductively coupled plasma Agilent 7500xx with an octopole reaction cell (USA ) It is established whether there is an excess of the concentration of this contaminant in the urine sample over its reference level (in the example of a specific implementation in the territory, the maximum reference value for arsenic was 300.0 μg / dm ³ ).

3. Затем определяют в пробе крови содержание IgG к мышьяку по методике: Зайцева Н.В., Беляев Е.Н., Долгих О.В. Способы диагностики сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям / Методические рекомендации.- М., 2002. - С. 29. А также определяют в пробе крови содержание С-пептида по методике иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора DRG C-Peptide ELISA (EIA-1293).3. Then determine the content of IgG in arsenic in the blood sample according to the method: Zaitseva N.V., Belyaev E.N., Dolgikh O.V. Methods for the diagnosis of sensitization to low molecular weight chemical compounds / Methodological recommendations. - M., 2002. - P. 29. And also determine the content of C-peptide in a blood sample by enzyme-linked immunosorbent assay using a commercial DRG C-Peptide ELISA kit (EIA-1293) .

4. Также у указанного пациента отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.4. Also, a sample of buccal epithelium (in the form of a smear from the mucous membrane of the cheek) is taken from the indicated patient. After taking the material, the tampon (the working part of the probe with a cotton swab) is placed in a sterile Eppendorf tube with 500 μl of transport medium (sterile 0.9% NaCl solution). The tube with the solution and the working part of the probe is closed.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.Next, DNA is extracted from the sample. For this, samples in an amount of 100 μl are lysed with 300 μl of a lysing solution, which is a 0.5% solution of sarcosyl and proteinase K (20 mg / ml) in acetate buffer (pH 7.5). Then, a sorbent (kaolin) is added and the washing samples are washed with phosphate-buffered saline (pH 7.2) from proteins and a mixture of isopropyl alcohol: acetone from lipids. Nucleic acids remain on the sorbent. The DNA adsorbed on the sorbent is then extracted from the sample with TE buffer, which is a mixture of 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA (pH 8.0). The extract is centrifuged. After centrifugation of the tube, the supernatant contains purified DNA.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК генов TERT (rs10054203); ММР9 (rs17576) Gln279Arg и ZMPSTE24 (rs2076697).The resulting material is ready for the production of polymerase chain reaction (PCR). PCR is carried out on a detecting amplifier with hybridization-fluorescence detection in real time using ready-made sets of primers and probes manufactured by Syntol CJSC, Russia, in which TERT DNA sections were used as primers (rs10054203); MMP9 (rs17576) Gln279Arg and ZMPSTE24 (rs2076697).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного пациента готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов TERT (rs10054203); ММР9 (rs17576) Gln279Arg, и ZMPSTE24 (rs2076697) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма указанных генов ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПНР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.An amplification reaction is carried out, this is achieved by the fact that in order to study the allelic state of each gene in an individual patient, their reaction mixture is prepared. 0.1 μl of the prepared primer mixture (the term used in genetics for labeled final nucleotides that limit (cut off) the amplified gene nucleotide chain) and probes for selected TERT genes (rs10054203) is added to each tube; MMP9 (rs17576) Gln279Arg, and ZMPSTE24 (rs2076697) (reagent kits were used to determine the polymorphism of these genes by Synthol CJSC, Russia). The remaining components necessary for the implementation of the NDP are added to each tube: nucleotides (deoxynucleoside triphosphates: 10 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP), buffers (100 mM Tris-HCl buffer, 500 mM KCl, 40 mM MgCl ₂ ) and Tag F- polymerase. Make a sample in an amount of 10 μl. Thus, the total volume of the reaction mixture is 25 μl. Each tube is tightly closed by a stopper and installed in the amplifier.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.During PCR, amplification and detection are performed on a Bio-Rad detection amplifier CFX96.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).A universal amplification program selected by the reagent manufacturer is used. It includes several stages: Stage 1 - activation of TaqF polymerase (“hot start” mode) lasts 15 minutes at 95 ° C; Stage 2 - installation cycles of amplification without measuring fluorescence (5 cycles); Stage 3 - amplification duty cycles with fluorescence measurement (40 cycles).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).Each amplification cycle includes DNA denaturation (5 s at 95 ° C), primer annealing (20 s at 60 ° C) and the DNA polymerization reaction itself (15 s at 72 ° C).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.The fluorescence signal arising from the accumulation of amplification products of DNA regions is recorded in the “real time” mode after the annealing of the primers for the selected genes via the VIC channel to detect one of the allelic variants of the genes, and by the FAM channel for an alternative.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.The results are interpreted based on the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at a predetermined level, which corresponds to the presence (or absence) of the threshold cycle value (N) in the corresponding column in the result table displayed in the software for the CFX96 amplifier.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена в исследуемом участке ДНК (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние гена.The ratio of the threshold cycles obtained through two detection channels determines the state of the gene in the studied DNA region (allelic discrimination method). There were two possible variants of the gene state: homozygous - in the case when one of the values of the threshold cycle is not determined (below the threshold line) and heterozygous - in the case when two values of the threshold cycles were obtained and parabolic fluorescence curves were obtained from these channels. Depending on the accumulation of which amplification product occurs in the reaction, a heterozygous or normal homozygous or variant homozygous state of the gene is established.

5. И при выполнении следующих условий: наличие вариантной гомозиготы участка гена TERT (rs 10054203); гетерозиготы или вариантной гомозиготы участка гена ММР9 (rs17576) Gln279Arg и вариантной гомозиготы участка гена ZMPSTE24 (rs 2076697), отклонении от физиологической нормы (0,5-3,2 нг/см³) уровня С-пептида в сыворотке крови, избыточном содержании мышьяка в моче выше 300 мкг/дм³, прогнозируют риск формирования кожных нарушений, выражающихся дисхромией, меланозом, ассоциированных с контаминацией мышьяком.5. And if the following conditions are met: the presence of a variant homozygous portion of the TERT gene (rs 10054203); heterozygotes or variant homozygotes of the MMP9 gene region (rs17576) Gln279Arg and variant homozygotes of the ZMPSTE24 gene region (rs 2076697), deviation from the physiological norm (0.5-3.2 ng / cm ³ ) of the serum C-peptide level, excess arsenic content in urine above 300 μg / dm ³ , the risk of the formation of skin disorders expressed as dyschromia, melanosis associated with arsenic contamination is predicted.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено обследование населения при различных условиях по содержанию мышьяка в бисредах (моча).When conducting tests to implement the proposed method, a population survey was carried out under various conditions for the content of arsenic in bisreds (urine).

Были сформированы две группы: группа наблюдения, взрослые с избыточным содержанием мышьяка в моче более 300 мкг/дм³, и группа сравнения, с содержанием мышьяка в моче менее 300 мкг/дм³. В группу наблюдения вошли 35 взрослых (средний возраст 38,2±0,6 года; 52% женщин и 48% мужчин). В группу сравнения вошел 30 человек (средний возраст 40,4±0,3 года; 58% женщин и 42% мужчин). Группы исследования были сопоставимы по возрасту, полу, этническому составу, сопутствующей патологии, социально-экономическому уровню, качеству и составу питания.Two groups were formed: the observation group, adults with an excess of arsenic in the urine of more than 300 mcg / dm ³ , and a comparison group with arsenic content in the urine of less than 300 mcg / dm ³ . The observation group included 35 adults (average age 38.2 ± 0.6 years; 52% of women and 48% of men). The comparison group included 30 people (average age 40.4 ± 0.3 years; 58% of women and 42% of men). The study groups were comparable by age, gender, ethnic composition, concomitant pathology, socio-economic level, quality and composition of nutrition.

На территории проживания группы наблюдения отмечено превышение содержания мышьяка в воде более 2,0 ПДК.On the territory of the observation group, the excess of arsenic in water was more than 2.0 MPC.

У всех обследуемых взрослых была взята проба мочи и проба венозной крови, исследование которых проводилось по вышеуказанной схеме. Также была взята проба буккального эпителия для установления по реакции ПЦР полиморфизма исследуемых генов.A urine sample and a venous blood sample were taken from all examined adults, the study of which was carried out according to the above scheme. A sample of buccal epithelium was also taken to establish the polymorphism of the studied genes by the PCR reaction.

Для доказательства достоверности заявляемых критериев диагностики предрасположенности к дисхромии, меланозу, ассоциированных с контаминацией мышьяком, было установлено в пробе сыворотки крови содержание С-пептида и IgG к мышьяку. Эти показатели являются подтверждающим фактором избыточной нагрузки (контаминации) мышьяком с одной стороны и нарушением экспрессии металлопептидаз (ММР-9 и ZMPSTE24), с другой - мутации одноименных генов формируют нарушения, которые приводят к патологии кожных покровов.To prove the reliability of the claimed criteria for the diagnosis of predisposition to dyschromia, melanosis associated with arsenic contamination, the content of C-peptide and arsenic IgG in the blood serum was established. These indicators are a confirming factor of excessive load (contamination) with arsenic on the one hand and impaired expression of metallopeptidases (MMP-9 and ZMPSTE24), on the other hand, mutations of the same genes form disorders that lead to skin pathology.

Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблице 1.The data obtained as a result of research are shown in table 1.

Результаты приведены в таблице 1 в виде пяти блоков, в каждом из которых показано различное сочетание полиморфизмов указанных генов, содержание мышьяка в моче, уровень IgG в сыворотке крови к мышьяку и содержание С-пептида в крови.The results are shown in table 1 in the form of five blocks, each of which shows a different combination of polymorphisms of these genes, the content of arsenic in urine, the level of serum IgG to arsenic and the content of C-peptide in the blood.

Данные, приведенные в указанной таблице 1, показывают, что при одновременном сочетании вариантного гомозиготного состояния генотипа аллеля гена TERT (rs10054203); вариантного гомозиготного или гетерозиготного состояния генотипа аллеля гена ММР9 (rs17576) Gln279Arg и вариантного гомозиготного состояния генотипа аллеля гена ZMPSTE24 (rs2076697), концентрации «виновного» фактора (мышьяка) в моче выше верхней границы референтной концентрации (0,0-300,0 мкг/дм³), т.е. более величины 300 мкг/дм³, и превышении выше физиологической нормы уровня IgG к мышьяку (пациенты 1-3), наблюдается повышение по сравнению с физиологической нормой содержания С-пептида. А это значит, что при этом фиксируется реализация мышьяком негативной генетической программы металлопептидазами у человека, выражающейся в риске формирования кожной патологии через проявление меланоза и дисхромии.The data shown in Table 1 show that, with the simultaneous combination of a variant homozygous state of the TERT gene allele genotype (rs10054203); variant homozygous or heterozygous state of the MMP9 gene allele genotype (rs17576) Gln279Arg and variant homozygous state of the ZMPSTE24 gene allele genotype (rs2076697), the concentration of the “guilty” factor (arsenic) in urine above the upper limit of the reference concentration (0.0-300 μg) dm ³ ), i.e. more than 300 μg / dm ³ , and exceeding the physiological norm of the level of IgG to arsenic (patients 1-3), there is an increase compared with the physiological norm of the content of C-peptide. And this means that at the same time, the implementation of arsenic of a negative genetic program of metal peptidases in humans, which is expressed in the risk of the formation of skin pathology through the manifestation of melanosis and dyschromia, is recorded.

Тогда как при допустимом (на уровне ниже верхней границы референтной концентрации) содержании мышьяка в моче, даже в условиях наследования гетерозиготного или вариантного генотипа указанных генов (пациенты 4-6), уровень IgG и содержание С-пептида находятся в пределах физиологической нормы.Whereas when the content of arsenic in the urine is acceptable (at a level below the upper limit of the reference concentration), even under conditions of inheritance of the heterozygous or variant genotype of these genes (patients 4-6), the level of IgG and the content of C-peptide are within the physiological norm.

В случае превышения содержания мышьяка в моче даже более чем 2 раза по сравнению с верхней границей референтного уровня, но при отсутствии полиморфных изменений указанных генов (пациенты 7-8), уровень IgG и содержание С-пептида находятся в пределах физиологической нормы.If the arsenic content in the urine is even more than 2 times higher than the upper limit of the reference level, but in the absence of polymorphic changes in these genes (patients 7-8), the level of IgG and the content of C-peptide are within the physiological norm.

У пациентов с нормальными гомозиготными генотипами гена TERT rs10054203; ММР9 rs17576 Gln279Arg и ZMPSTE24 rs2076697 и уровнем As в моче ниже 300,0 мкг/дм³, содержание С-пептида находятся в пределах физиологической нормы (пациенты 9-10).In patients with normal homozygous genotypes of the TERT rs10054203 gene; MMP9 rs17576 Gln279Arg and ZMPSTE24 rs2076697 and As levels in urine below 300.0 μg / dm ³ , the content of C-peptide is within the physiological norm (patients 9-10).

У пациентов 11-13, которые характеризуются превышением содержания мышьяка в моче более 300 мкг/дм³, превышением по сравнению с нормой уровня IgG к мышьяку, но при этом имеют наследование гетерозиготного генотипа только одного из указанных генов, а не одновременно всех вместе, вывод о предрасположенности к кожной патологии не диагностирован, при этом содержание С-пептида находится в пределах нормы, что указывает на отсутствие необходимых генетических условий (предрасположенности) для реализации имеющегося воздействия в виде дерматологического нарушения.In patients 11–13, which are characterized by an excess of arsenic content in the urine of more than 300 μg / dm ³ , an excess of the level of IgG to arsenic compared to the norm, but at the same time they have the inheritance of the heterozygous genotype of only one of the indicated genes, and not simultaneously all, the conclusion a predisposition to skin pathology is not diagnosed, while the content of the C-peptide is within normal limits, which indicates the absence of the necessary genetic conditions (predisposition) for the implementation of the existing effect in the form of dermatological th violation.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности из группы с повышенным содержанием мышьяка в моче и с содержанием мышьяка в моче в пределах референтной концентрации.To illustrate the implementation of the proposed method, two examples are given for specific patients of the same age and ethnicity from the group with a high content of arsenic in the urine and with the content of arsenic in the urine within the reference concentration.

Пример 1. Пациент, 38 лет, русский, дисхромия, меланоз. Установлен уровень мышьяка в моче более чем в 5 раз выше референтного уровня - 1542 мкг/дм³. Установлено наличие гетерозиготного генотипа гена ММР9 (rs17576) Gln279Arg - AG, вариантного гомозиготного генотипа гена TERT (rs10054203) - GG и вариантного гомозиготного генотипа гена ZMPSTE24 (rs2076697) - СС. Значение содержания IgG к мышьяку: 0,201 у.е., т.е. в 2,0 раза выше верхней границы нормы. Содержание С-пептида в крови - маркера нарушений работы металлопептидаз, 6,5 нг/см³, т.е. выше диапазона нормы (0,5-3,2 нг/см³). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к мышьяку и избыток продукции С-пептида на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2 раза содержания мышьяка в моче, а также наличие полиморфизма вышеуказанных генов, кодирующих ферменты, ответственные за изнашивание теломер, что наблюдается у человека при различных синдромах, связанных с преждевременным старением, таких как врожденный дискератоз; биосинтез нейроэндокринных белков, таких как С-пептид, что вызывает эффект выраженного преждевременного старения с развитием синдрома гиперкератоза; формирование и поддержание внеклеточного матрикса - тканевых структур, служащих каркасом, на котором развиваются клетки, дефект синтеза которых ведет к снижению количества и качества коллагеновых волокон и уменьшению толщины дермального слоя, что в совокупности создает условия, способствующие формированию патологии кожной ткани в виде меланоза и дисхромии, инициированной действием мышьяка.Example 1. Patient, 38 years old, Russian, dyschromia, melanosis. The level of arsenic in urine was established more than 5 times higher than the reference level - 1542 μg / dm ³ . The presence of the heterozygous genotype of the MMP9 gene (rs17576) Gln279Arg - AG, the variant homozygous genotype of the TERT gene (rs10054203) - GG, and the variant homozygous genotype of the ZMPSTE24 gene (rs2076697) - CC. The value of the content of IgG to arsenic: 0,201 cu, i.e. 2.0 times higher than the upper limit of normal. The content of C-peptide in the blood is a marker of disorders in the functioning of metallopeptidases, 6.5 ng / cm ³ , i.e. above the normal range (0.5-3.2 ng / cm ³ ). Thus, high values of the level of IgG to arsenic and an excess of C-peptide production were established against the background of an increase in urine content of more than 2 times with respect to the reference level, as well as the presence of polymorphism of the above genes encoding the enzymes responsible for telomere wear, what is observed in humans with various syndromes associated with premature aging, such as congenital dyskeratosis; biosynthesis of neuroendocrine proteins, such as C-peptide, which causes the effect of pronounced premature aging with the development of hyperkeratosis syndrome; the formation and maintenance of the extracellular matrix - tissue structures that serve as the framework on which cells develop, the synthesis defect of which leads to a decrease in the quantity and quality of collagen fibers and a decrease in the thickness of the dermal layer, which together creates conditions conducive to the formation of skin tissue pathology in the form of melanosis and dyschromia initiated by arsenic.

Это говорит о том, что, согласно предлагаемому способу, у данного пациента состояние от воздействия мышьяка оценивается, как формирование проявлений кожной патологии (дисхромия, меланоз), имеющей генетическую предрасположенность, реализующуюся в условиях избыточной контаминации мышьяком.This suggests that, according to the proposed method, in this patient the condition from exposure to arsenic is assessed as the formation of manifestations of skin pathology (dyschromia, melanosis), which has a genetic predisposition that is realized under conditions of excessive arsenic contamination.

Пример 2. Пациент, 37 лет, русский, патологии кожных покровов не выявлено. Определяется уровень мышьяка в моче более, чем в 2 раза выше референтного уровня - 500 мкг/дм³. Отсутствуют полиморфные (вариантные) генотипы гена ММР9 (rs17576) - АА, гена TERT (rs10054203 - СС и гена ZMPSTE24 (rs2076697) - ТТ. Значение содержания IgG к алюминию: 0,066 у.е. - в диапазоне нормы. Содержание С-пептида в крови - маркера нарушений работы металлопептидаз, 2,9 нг/см³, т.е. в диапазоне нормы (0,5-3,2 нг/см³). Таким образом, отсутствие полиморфизма вышеуказанных генов на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2 раза, содержания мышьяка в моче, не приводит к развитию негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgG к мышьяку и С-пептида, то есть в отсутствии негативной генетической программы превышение референтной концентрации мышьяка в моче не формирует развитие кожной патологии, и не приводит к развитию меланоза и дисхромии у данного пациента.Example 2. The patient, 37 years old, Russian, pathology of the skin was not detected. The level of arsenic in the urine is determined more than 2 times higher than the reference level - 500 μg / dm ³ . There are no polymorphic (variant) genotypes of the MMP9 gene (rs17576) - AA, the TERT gene (rs10054203 - CC, and the ZMPSTE24 gene (rs2076697) - TT. The IgG content for aluminum: 0.066 cu - in the normal range. C-peptide content in blood - a marker of disruption of metallopeptidases, 2.9 ng / cm ³ , i.e. in the normal range (0.5-3.2 ng / cm ³ ) .Thus, the absence of polymorphism of the above genes against a background of increased relative to the reference the level of more than 2 times the content of arsenic in the urine does not lead to the development of negative effects in the form of a deviation from the normal level of IgG to arsenic and C-peptides and that is, in the absence of negative genetic program exceeded the reference concentration of arsenic in the urine does not form the development of the skin disease, and does not lead to the development of melanosis and dyschromia in a given patient.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев обеспечивается его назначение.Thus, the above data show that when implementing the proposed method using the proposed criteria, its purpose is ensured.

Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить предвестники кожных патологий, ассоциированные с влиянием мышьяка, по заявляемым генетическим критериям, содержанию мышьяка в моче и по уровню IgG к мышьяку, и начать заблаговременно профилактические мероприятия.The inventive method allows with sufficient reliability to establish the precursors of skin pathologies associated with the influence of arsenic, according to the claimed genetic criteria, the content of arsenic in urine and the level of IgG to arsenic, and to start preventive measures in advance.

Claims (1)

Способ прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии у человека, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком, характеризующийся тем, что производят отбор проб крови и мочи, определяют в пробе мочи содержание мышьяка, а в сыворотке крови - уровень С-пептида, также у указанного человека отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена теломеразы TERT, гена матриксной металлопротеиназы ММР9 Gln279Arg и гена цинкметаллопептидазы ZMPSTE24, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TERT (rs10054203), гена ММР9 Gln279Arg (rs17576) и гена ZMPSTE24 (rs2076697), устанавливая при этом для каждого из указанных генов одно из следующих его состояний: нормальное гомозиготное СС, вариантное гомозиготное GG для гена TERT (rs10054203); гетерозиготное AG, нормальное гомозиготное АА, вариантное гомозиготное GG для гена ММР9 Gln279Arg (rs17576); нормальное гомозиготное ТТ, вариантное гомозиготное СС для гена ZMPSTE24 (rs2076697), и при одновременном обнаружении следующих диагностических критериев: наличие вариантного гомозиготного генотипа гена TERT (rs10054203), вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена ММР9 Gln279Arg (rs17576), вариантного гомозиготного генотипа гена ZMPSTE24 (rs2076697), при условии одновременного наличия мышьяка в моче выше 300 мкг/дм³, а также при превышении уровня С-пептида в сыворотке крови выше диапазона нормы 0,5-3,2 нг/см³, прогнозируют повышенный риск возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком.A method for predicting the risk of skin pathology in the form of melanosis or dyschromia in humans associated with excessive arsenic contamination, characterized in that blood and urine samples are taken, the content of arsenic is determined in a urine sample, and the level of C-peptide in blood serum is also determined of said person, a sample of buccal epithelium is taken, deoxyribonucleic acid (DNA) is extracted from said sample, then on a detecting amplifier using a polymerase chain reaction in the mode At present, genotyping of the polymorphism of the TERT telomerase gene, the matrix metalloproteinase MMP9 gene Gln279Arg, and the zinc metallopeptidase gene ZMPSTE24 gene is carried out using a DNA fragment as a primer by studying the TERT gene genotypes (rs10054203), the MMP9 gene Gln279Ar97 rs rp (rs10054207) and for each of these genes, one of its following conditions: normal homozygous SS, variant homozygous GG for the TERT gene (rs10054203); heterozygous AG, normal homozygous AA, variant homozygous GG for the MMP9 gene Gln279Arg (rs17576); normal homozygous TT, variant homozygous SS for the ZMPSTE24 gene (rs2076697), and with the simultaneous detection of the following diagnostic criteria: the presence of the variant homozygous genotype of the TERT gene (rs10054203), the variant homozygous or heterozygous genotype of the MMP9GsGnS7 gene, gnS9, gnS75, gn75 rs2076697), provided the simultaneous presence of arsenic in the urine greater than 300 mg / dm ^3, and also in excess of the level of C-peptide in serum above the normal range 0,5-3,2 ng / cm ^3, predict increased risk to pathology as melanosis dyschromia or associated with excess arsenic contamination.