RU2713138C1 - Method of producing chitosan aspartate nanoparticles - Google Patents
Method of producing chitosan aspartate nanoparticles Download PDFInfo
- Publication number
- RU2713138C1 RU2713138C1 RU2019129326A RU2019129326A RU2713138C1 RU 2713138 C1 RU2713138 C1 RU 2713138C1 RU 2019129326 A RU2019129326 A RU 2019129326A RU 2019129326 A RU2019129326 A RU 2019129326A RU 2713138 C1 RU2713138 C1 RU 2713138C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chitosan
- nanoparticles
- concentration
- solution
- acid
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области химии полимеров, нанотехнологии, фармацевтической промышленности, медицине и может быть использовано для получения полимерных наночастиц из аспарагината хитозана, перспективного для создания новых, в том числе персонализированных лекарственных форм.The invention relates to the field of polymer chemistry, nanotechnology, the pharmaceutical industry, medicine and can be used to obtain polymer nanoparticles from chitosan asparaginate, promising to create new, including personalized dosage forms.
Последнее четвертое поколение лекарственных средств на основе наночастиц - так называемых терапевтических систем - характеризуется высокой эффективностью, отсутствием побочных эффектов, пролонгированным действием, предполагает направленный транспорт лекарственного вещества и его векторное действие в зоне запланированной локализации, а также, и это самое главное, инициирование процесса саногенеза (восстановление механизмов саморегуляции) живого организма. Терапевтически активные наночастицы получают, как правило, инкапсулированием биологически активного вещества (БАВ) в липосомальную или липоплексовую оболочку, полиэлектролитные капсулы, наномицеллы амфифильных полимеров или циклодекстриновые нанополости, либо адсорбцией БАВ на поверхности наночастиц и др. В отличие от классических лекарственных форм, проникновение действующего вещества которых обеспечивается через эндотелий, проникновение наносистем происходит на уровне эндоцитоза.The last fourth generation of drugs based on nanoparticles - the so-called therapeutic systems - is characterized by high efficiency, the absence of side effects, prolonged action, involves targeted transport of the drug and its vector effect in the zone of planned localization, and also, and most importantly, the initiation of the process of sanogenesis (restoration of self-regulation mechanisms) of a living organism. Therapeutically active nanoparticles are obtained, as a rule, by encapsulating a biologically active substance (BAS) in the liposomal or lipoplex shell, polyelectrolyte capsules, amphiphilic polymer nanomicelles or cyclodextrin nanocavities, or by the adsorption of biologically active substances on the surface of nanoparticles, etc. Unlike classical dosage forms, the penetration of the active substance which is provided through the endothelium, the penetration of nanosystems occurs at the level of endocytosis.
Наибольшим потенциалом должны обладать наночастицы полностью построенные из БАВ. В качестве потенциального материала для создания таких частиц может рассматриваться аминополисахарид хитозан. Хитозан обладает антибактериальным, противовирусным и фунгицидным действием, проявляет антитоксическую, иммунотропную и противовоспалительную активности. Материалы на основе хитозана совместимы с живыми тканями, биорезорбируемы, способны стимулировать процессы ранозаживления, регенерации тканей, саногенеза.The highest potential should have nanoparticles completely constructed from biologically active substances. The aminopolysaccharide chitosan can be considered as a potential material for creating such particles. Chitosan has antibacterial, antiviral and fungicidal effects, exhibits antitoxic, immunotropic and anti-inflammatory activity. Chitosan-based materials are compatible with living tissues, bioresorbable, able to stimulate the processes of wound healing, tissue regeneration, sanogenesis.
В настоящее время для получения наночастиц хитозана используют методы сшивания полимерной эмульсии преимущественно глутаровым альдегидом, коацервации/осаждения с использованием растворов неорганических солей, распылительной сушки в присутствии сшивающих агентов или в среде сверхкритических жидкостей, ионотропного гелеобразования с применением натриевой соли триполифосфата и др. (Naskar S., Koutsu K., Sharma S. Chitosan-based nanoparticles as drug delivery systems: a review on two decades of research // Journal of Drug Targeting. 2019. Vol. 27. No 4. P 379-393).Currently, to obtain chitosan nanoparticles, methods are used for crosslinking a polymer emulsion mainly with glutaraldehyde, coacervation / precipitation using inorganic salt solutions, spray drying in the presence of crosslinking agents or in a medium of supercritical fluids, ionotropic gelation using sodium salt of tripolyphosphate, etc. (Naskar ., Koutsu K., Sharma S. Chitosan-based nanoparticles as drug delivery systems: a review on two decades of research // Journal of Drug Targeting. 2019. Vol. 27. No. 4. P 379-393).
Данные методы получения наночастиц хитозана многостадийны, сложны в аппаратурном оформлении и требуют дорогостоящего оборудования. Некоторые методы предполагают использование органических растворителей, сшивающих реагентов и поверхностно-активных веществ, большинство из которых не разрешено к применению в медико-фармацевтических приложениях и образует токсичные побочные продукты. Все это может оказывать негативное действие на биосовместимость и другие биохимические свойства готового материала, и соответственно, ограничивать его применение в медицинской практике. Кроме того, данные способы не поддаются масштабированию.These methods of producing chitosan nanoparticles are multistage, complicated in hardware design and require expensive equipment. Some methods involve the use of organic solvents, cross-linking agents and surfactants, most of which are not approved for use in medical and pharmaceutical applications and form toxic by-products. All this can have a negative effect on biocompatibility and other biochemical properties of the finished material, and, accordingly, limit its use in medical practice. In addition, these methods are not scalable.
Известен способ получения наночастиц глутамата хитозана (см. патент РФ №2562723 по кл. МПК С08В37/08, опуб. 10.09.2015). Способ предусматривает растворение порошка хитозана с молекулярной массой ММ = 3, 9 или 30 кДа в водном растворе глутаминовой кислоты концентрации 0.005-0.1375% в соотношении [хитозан] : [глутаминовая кислота] = 1 : 0.864 при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение 2 час. По первому варианту способа реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре, затем в систему вводят этанол и центрифугируют. Твердый осадок фильтруют и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С. По второму варианту способа реакционную смесь перемешивают при температуре 70°С. По окончании реакции полученный раствор вакуумируют на роторном испарителе при 70-75°С и при -0.8 - -0.9 атм, а затем при той же температуре в вакууме 0.5-1 мм рт.ст. По данным динамического светорассеяния водной дисперсии способ позволяет получить наночастицы глутамата хитозана размером от 165 до 340 нм.A known method of producing nanoparticles of chitosan glutamate (see RF patent No. 2562723, class IPC С08В37 / 08, publ. 09/10/2015). The method involves dissolving chitosan powder with a molecular weight of MM = 3, 9 or 30 kDa in an aqueous solution of glutamic acid at a concentration of 0.005-0.1375% in the ratio [chitosan]: [glutamic acid] = 1: 0.864 with stirring at a speed of 200 rpm for 2 hours According to the first variant of the method, the reaction mixture is stirred at room temperature, then ethanol is introduced into the system and centrifuged. The solid precipitate is filtered and dried in a vacuum oven at a temperature of 30 ° C. According to the second variant of the method, the reaction mixture is stirred at a temperature of 70 ° C. At the end of the reaction, the resulting solution is evacuated on a rotary evaporator at 70-75 ° C and at -0.8 - -0.9 atm, and then at the same temperature in a vacuum 0.5-1 mm Hg. According to the dynamic light scattering of an aqueous dispersion, the method allows to obtain chitosan glutamate nanoparticles ranging in size from 165 to 340 nm.
Однако, в предложенном способе получения наночастиц глутамата хитозана используются только низкомолекулярные образцы хитозана. Реализация способа требует специального дорогостоящего оборудования (термостат, вакуумный сушильный шкаф, роторный испаритель), высоких температур, низких давлений (вакуум), достаточно длительного времени проведения эксперимента. Введение этилового спирта в объем реакционной смеси может вызвать агрегацию нанодисперсий и укрупнение наночастиц. Кроме того, при высаживании частиц этиловым спиртом протекает депротонирование солевой формы хитозана, так что в способе получают частицы не глутамата хитозана, а хитозана в основной форме. Получение биологически активных наночастиц хитозана в способе не ставилось.However, in the proposed method for producing chitosan glutamate nanoparticles, only low molecular weight chitosan samples are used. The implementation of the method requires special expensive equipment (thermostat, vacuum oven, rotary evaporator), high temperatures, low pressures (vacuum), a sufficiently long experiment time. The introduction of ethyl alcohol into the volume of the reaction mixture can cause aggregation of nanodispersions and enlargement of nanoparticles. In addition, when particles are planted with ethyl alcohol, deprotonation of the salt form of chitosan proceeds, so that in the method particles of chitosan not glutamate are obtained, but chitosan in the main form. Obtaining biologically active nanoparticles of chitosan in the method was not set.
Наиболее близким к заявленному является способ получения наночастиц сукцината хитозана (см. патент РФ №2562721 по кл. МПК С08В 37/08, опуб. 10.09.2015). Способ предусматривает растворение порошка янтарной кислоты при температуре 20°С в дистиллированной воде до получения раствора концентрации 0.11-0.17 %, фильтрацию не растворившейся янтарной кислоты, введение в фильтрат предварительно очищенного низкомолекулярного хитозана с ММ = 3, 9 или 30 кДа при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение 2 часов. Затем в раствор добавляют этанол, суспензию центрифугируют, фильтруют и сушат твердый осадок в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С. По данным динамического светорассеяния способ позволяет получить наночастицы низкомолекулярного хитозана с размером от 165 до 340 нм. Closest to the claimed is a method of producing nanoparticles of chitosan succinate (see RF patent No. 2562721, class IPC C08B 37/08, publ. 09/10/2015). The method involves dissolving succinic acid powder at a temperature of 20 ° C in distilled water to obtain a solution concentration of 0.11-0.17%, filtering insoluble succinic acid, introducing into the filtrate a pre-purified low molecular weight chitosan with MM = 3, 9 or 30 kDa with stirring at a speed of 200 rpm for 2 hours. Then ethanol is added to the solution, the suspension is centrifuged, filtered and the solid precipitate is dried in a vacuum oven at a temperature of 30 ° C. According to dynamic light scattering, the method allows to obtain nanoparticles of low molecular weight chitosan with a size of from 165 to 340 nm.
Однако, в способе используют низкомолекулярный, предварительно очищенный образец хитозана. Получение сукцината хитозана предполагает растворение хитозана в предварительно полученном растворе янтарной кислоты. Высаживание солевой формы хитозана органическим растворителем в объеме реакционной среды трудно контролируется и может привести к агрегации и, соответственно, укрупнению наночастиц. Кроме того, введение в водную дисперсию сукцината хитозана этилового спирта должно сопровождаться депротонированием солевой формы хитозана, так что в способе получают наночастицы не сукцината хитозана, а хитозана. Получение биологически активных наночастиц хитозана в способе не ставилось.However, the method uses a low molecular weight, pre-purified sample of chitosan. Obtaining chitosan succinate involves the dissolution of chitosan in a previously prepared solution of succinic acid. The precipitation of the salt form of chitosan with an organic solvent in the volume of the reaction medium is difficult to control and can lead to aggregation and, accordingly, enlargement of nanoparticles. In addition, the introduction of ethyl alcohol in the aqueous dispersion of chitosan succinate succinate should be accompanied by deprotonation of the salt form of chitosan, so that in the method nanoparticles of chitosan rather than chitosan are obtained. Obtaining biologically active nanoparticles of chitosan in the method was not set.
Технической проблемой заявляемого изобретения является разработка способа получения биологически активных, устойчивых к агрегации наночастиц на основе аспарагината хитозана и L-аспарагиновой кислоты.The technical problem of the claimed invention is the development of a method for producing biologically active nanoparticles resistant to aggregation based on chitosan aspartate and L- aspartic acid.
Техническим результатом является получение биологически активных, кинетически стабильных наночастиц аспарагината хитозана размером 50-310 нм при упрощении способа получения и сохранении высокой биологической активности полимерной системы.The technical result is to obtain biologically active, kinetically stable nanoparticles of chitosan asparaginate with a size of 50-310 nm while simplifying the method of obtaining and maintaining high biological activity of the polymer system.
Техническая проблема достигается тем, что в способе получения производных хитозана, заключающемся в смешивании хитозана с кислотой и получении целевого продукта, согласно изобретению, используют порошок высокомолекулярного хитозана, в качестве кислоты используют порошок L-аспарагиновой кислоты, которые смешивают и диспергируют в воде для получения раствора аспарагината хитозана с концентрацией в нем хитозана (0.2-1.8)⋅10-2 М и концентрацией L-аспарагиновой кислоты (1.5-3.0)⋅10-2 М при мольном соотношении [хитозан(-NН2)] : [кислота] = 0.07-0.60, в полученный раствор аспарагината хитозана при перемешивании добавляют раствор хлорида натрия для получения водной дисперсии с концентрацией в ней хлорида натрия (2.5-10)⋅10-2 М и содержащей наночастицы аспарагината хитозана.The technical problem is achieved by the fact that in the method for producing chitosan derivatives, which consists in mixing chitosan with acid and obtaining the target product, according to the invention, high molecular weight chitosan powder is used, L- aspartic acid powder is used as acid, which is mixed and dispersed in water to obtain a solution chitosan asparaginate with a concentration of chitosan (0.2-1.8) ⋅10 -2 M in it and a concentration of L- aspartic acid (1.5-3.0) ⋅10 -2 M with a molar ratio of [chitosan (-NH 2 )]: [acid] = 0.07 -0.60, in the floor enny asparaginata chitosan solution with stirring was added a solution of sodium chloride to obtain an aqueous dispersion having a concentration therein of sodium chloride (2.5-10) ⋅10 -2 M and asparaginate nanoparticles comprising chitosan.
Для получения стабилизированных наночастиц аспарагината хитозана после добавления раствора хлорида натрия в водную дисперсию дополнительно вводят тетроглицеролат кремния до его концентрации в дисперсии (0.2-0.3)⋅10-2 М и перемешивают смесь в течение 48 часов.To obtain stabilized chitosan asparaginate nanoparticles, after adding a sodium chloride solution to the aqueous dispersion, silicon tetroglycerolate is additionally added to its concentration in the dispersion (0.2-0.3) × 10 -2 M and the mixture is stirred for 48 hours.
Использование раствора L-аспарагиновой кислоты концентрации более 3.0⋅10-2 М нецелесообразно вследствие ограниченной растворимости порошка кислоты в воде.The use of a solution of L- aspartic acid with a concentration of more than 3.0-10 -2 M is impractical due to the limited solubility of the acid powder in water.
При использовании для получения наночастиц водного раствора аспарагината хитозана с концентрацией хитозана более 1.8⋅10-2 М формируются частицы микронного размера. При использовании растворов аспарагината хитозана с С ХТЗ < 0.2⋅10-2 М и С Asp < 1.5⋅10-2 М наночастицы не формируются.When an aqueous solution of chitosan asparaginate with a chitosan concentration of more than 1.8 × 10 -2 M is used to obtain nanoparticles, micron-sized particles are formed. When using chitosan with solutions asparaginata HTZ C <0.2⋅10 -2 M and C Asp <1.5⋅10 -2 M nanoparticles are not formed.
Изобретение поясняется иллюстрациями, где:The invention is illustrated by illustrations, where:
- на фиг. 1 представлены кривые объемного распределения наночастиц аспарагината хитозана, полученных методом коацервации без (а) и в присутствии стабилизатора (б);- in FIG. Figure 1 shows the volumetric distribution curves of chitosan asparaginate nanoparticles obtained by coacervation without (a) and in the presence of a stabilizer (b);
- на фиг. 2 приведен пример сформированного монослоя фибробластов через 48 час культивирования в питательной среде DMEM с 10% FBS с добавкой водной дисперсии наночастиц аспарагината хитозана. - in FIG. Figure 2 shows an example of a formed fibroblast monolayer after 48 hours of cultivation in DMEM culture medium with 10% FBS with the addition of an aqueous dispersion of chitosan asparaginate nanoparticles.
В основе способа получения наночастиц лежит внутримолекулярная сшивка макромолекул полимера низкомолекулярной солью (принцип коацервации) с сохранением солевой формы аспарагината хитозана (водные дисперсии наночастиц). The method of producing nanoparticles is based on intramolecular crosslinking of polymer macromolecules with a low molecular weight salt (coacervation principle) while maintaining the salt form of chitosan asparaginate (aqueous dispersions of nanoparticles).
Таким образом, наночастицы представляют собой водную дисперсию наночастиц аспарагината хитозана. Thus, the nanoparticles are an aqueous dispersion of nanoparticles of chitosan asparaginate.
Для получения кинетически стабильных наночастиц аспарагината хитозана способ предусматривает получение наночастиц типа «ядро-оболочка» посредством формирования на поверхности наночастиц аспарагината хитозана пленочной оболочки из неорганической сетки ≡Si-О-Si≡ связей путем добавления в систему водно-глицеринового раствора тетроглицеролата кремния. To obtain kinetically stable chitosan asparaginate nanoparticles, the method involves the production of core-shell nanoparticles by forming a film shell on the surface of chitosan asparaginate nanoparticles from an inorganic ≡Si-O-Si≡ bond by adding silicon tetroglycerolate to the system of an aqueous glycerol solution.
Используют хитозан со степенью дезацетилирования ≥ 75-80 мольн. % и ММ 200 кДа.Use chitosan with a degree of deacetylation ≥ 75-80 mol. % and MM 200 kDa.
L-аспарагиновая кислота (Asp) - двухосновная, биполярная алифатическая аминокислота, одна из 20 протеиногенных аминокислот организма, выполняет роль нейромедиатора в центральной нервной системе. Данная кислота и ее соли широко используются как компоненты лекарственных средств. L- aspartic acid (Asp) is a dibasic, bipolar aliphatic amino acid, one of the body's 20 proteinogenic amino acids, and acts as a neurotransmitter in the central nervous system. This acid and its salts are widely used as components of drugs.
Хлорид натрия (NaCl) - натриевая соль соляной кислоты. Является сильным электролитом, при растворении в воде полностью диссоциирует на ионы Na+ и Cl-. Хлорид натрия (ФС.2.2.0014.15) обладает гидратирующим, дезинтоксикационным действием, нормализует кислотно-щелочной баланс в живом организме, поддерживает соответствующее осмотическое давление плазмы крови и внеклеточной жидкости. В медицинской практике чаще всего используется 0.9% раствор хлорида натрия, который изотоничен плазме крови и гипертонические растворы (3-10%) для внутривенного введения. При наружной аппликации они проявляют противомикробную активность.Sodium chloride (NaCl) - sodium salt of hydrochloric acid. It is a strong electrolyte; when dissolved in water, it completely dissociates into Na + and Cl - ions. Sodium chloride (FS.2.2.0014.15) has a hydrating, detoxifying effect, normalizes the acid-base balance in a living organism, and maintains the corresponding osmotic pressure of blood plasma and extracellular fluid. In medical practice, the most commonly used is a 0.9% solution of sodium chloride, which is isotonic with blood plasma and hypertonic solutions (3-10%) for intravenous administration. With external application, they exhibit antimicrobial activity.
Тетроглицеролат кремния (Si(OGly)4) - биологически активное вещество, проявляет транскутанную и антибактериальную активности. В водной среде гидролизуется с протеканием золь-гель реакции и формированием полисилоксановой пространственной сетки ≡Si-О-Si≡ связей, центрами нуклеации которых выступают свободные гидроксигруппы. Золь-гель гидрогели на основе тетроглицеролата кремния обладают ранозаживляющей, транскутанной активностью и рекомендованы для практического использования в качестве самостоятельных лекарственных средств или основ фармацевтических композиций.Silicon tetroglycerolate (Si (OGly) 4 ) is a biologically active substance that exhibits transcutaneous and antibacterial activity. It is hydrolyzed in an aqueous medium with a sol-gel reaction and the formation of a polysiloxane spatial network of “Si-O-Si” bonds, the nucleation centers of which are free hydroxy groups. Sol-gel hydrogels based on silicon tetroglycerolate have wound healing, transcutaneous activity and are recommended for practical use as independent drugs or as the basis for pharmaceutical compositions.
Глицерин (Gly(ОН)3) в составе водно-глицериновой среды является растворителем для тетроглицеролата кремния и пластификатором для хитозана. Разрешен к применению в медицине (ФС.2.2.0006.15).Glycerin (Gly (OH) 3 ) in the composition of the water-glycerol medium is a solvent for silicon tetroglycerolate and a plasticizer for chitosan. Approved for use in medicine (FS.2.2.0006.15).
Размер наночастиц аспарагината хитозана в водной дисперсии измеряют на анализаторе частиц Litesizer™500 методом динамического светорассеивания с использованием одноразовых пoлистиpoльных кювет.The size of chitosan asparaginate nanoparticles in an aqueous dispersion is measured on a Litesizer ™ 500 particle analyzer using dynamic light scattering using disposable polystyrene cuvettes.
В качестве исходных реагентов для получения наночастиц используют хитозан со степенью дезацетилирования ≥ 75-80 мольн. % и ММ = 200 кДа, L-аспарагиновую кислоту, хлорид натрия, раствор тетроглицеролата кремния в глицерине, бидистиллированную воду, дегазированную от СО2 и О2 кипячением при 100°С в течение 1 час.Chitosan with a degree of deacetylation of ≥ 75-80 mol is used as initial reagents for producing nanoparticles. % and MM = 200 kDa, L- aspartic acid, sodium chloride, a solution of silicon tetroglycerolate in glycerol, bidistilled water, degassed from CO 2 and O 2 by boiling at 100 ° C for 1 hour.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Готовят водный раствор хитозана и L-аспарагиновой кислоты из расчета в нем концентрации хитозана С ХТЗ = (0.2-1.8)⋅10-2 М и концентрации L-аспарагиновой кислоты С Asp = (1.5-3.0)⋅10-2 М при соблюдении мольного соотношения [хитозан(-NН2)] : [кислота] = 0.07-0.60. Процесс растворения компонентов проводят по стандартной методике при комнатной температуре. Для этого навески порошка хитозана и порошка L-аспарагиновой кислоты помещают в колбу заданного объема, добавляют расчетное количество бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения компонентов (формирования аспарагината хитозана) не более 2 часов и фильтруют через фильтр Millipore с диаметром пор ≤ 0.45 мкм. Хранят при +4°С не более двух суток.An aqueous solution of chitosan and L -asparaginovoy acid based chitosan concentration therein HTZ C = (0.2-1.8) ⋅10 -2 M and the concentration C L -asparaginovoy acid Asp = (1.5-3.0) ⋅10 -2 M molar subject the ratio of [chitosan (-NH 2 )]: [acid] = 0.07-0.60. The process of dissolving the components is carried out according to standard methods at room temperature. For this, weighed portions of chitosan powder and L- aspartic acid powder are placed in a flask of a given volume, the calculated amount of bidistilled water is added, the components are completely dissolved (chitosan asparaginate formation) for no more than 2 hours and filtered through a Millipore filter with a pore diameter ≤ 0.45 μm. Store at + 4 ° C for no more than two days.
Для приготовления раствора хлорида натрия концентрации С NaCl = 0.2 М навеску NaCl массой 1.17 г помещают в колбу объемом 100 мл и доводят бидистиллированной водой до метки. To prepare the sodium chloride solution of concentration C = NaCl 0.2 M NaCl weighed weighing 1.17 g is placed in a flask of 100 ml volume and adjusted to the mark with twice distilled water.
Тетроглицеролат кремния используют в виде вводно-глицеринового раствора при мольном соотношении [Si(OGly)4] : [Gly(ОН)3]=1:3-1:6.Silicon tetroglycerolate is used in the form of a glycerol-introduction solution at a molar ratio of [Si (OGly) 4 ]: [Gly (OH) 3 ] = 1: 3-1: 6.
Для получения наночастиц аспарагината хитозана используют метод коацервации. Для этого в полученный раствор аспарагината хитозана при перемешивании добавляют раствор хлорида натрия до С NaCl в полученном растворе (2.5-10)⋅10-2 М. При использовании раствора с С NaCl < 2.5⋅10-2 М образуется незначительное количество сшивок, а при концентрации С NaCl > 10⋅10-2 М формируются микрочастицы. To obtain chitosan asparaginate nanoparticles, the coacervation method is used. To do this, a solution of sodium chloride to C NaCl in the resulting solution (2.5-10) ⋅10 -2 M is added to the obtained solution of chitosan asparaginate with a solution of (2.5-10) ⋅10 -2 M. When using a solution with C NaCl <2.5⋅10-2 -2 M, a small amount of crosslinking is formed, With NaCl concentrations> 10⋅10 -2 M, microparticles are formed.
Для получения стабилизированных (кинетически стабильных) наночастиц аспарагината хитозана в раствор аспарагината хитозана с добавкой раствора хлорида натрия вводят раствор тетроглицеролата кремния в глицерине до концентрации в полученном растворе С Si(OGly)4 = (0.2-0.3)⋅10-2 М. Систему диспергируют на магнитной мешалке с частотой оборотов 500 об/мин в течение 48 час. Введение Si(OGly)4 позволяет получить стабильные наночастицы типа «ядро-оболочка». Частицы агрегативно устойчивы более одного года.For stabilized (kinetically stable) chitosan nanoparticles asparaginata asparaginata chitosan solution with addition of sodium chloride solution is administered tetroglitserolata silicon solution in glycerol to a concentration in the resulting solution with Si (OGly) 4 = (0.2-0.3) ⋅10 -2 M. dispersed system on a magnetic stirrer with a speed of 500 rpm for 48 hours. The introduction of Si (OGly) 4 allows one to obtain stable core-shell nanoparticles. Particles are aggregatively stable for more than one year.
Пример 1. Готовят водный раствор аспарагината хитозана из расчета концентрация хитозана 0.9⋅10-2 М и концентрация L-аспарагиновой кислоты 3.0⋅10-2 М. Для этого навески хитозана и аспарагиновой кислоты помещают в колбу заданного объема, добавляют расчетное количество бидистиллированной воды, перемешивают в течение 2-х час. Полученный раствор аспарагината хитозана фильтруют через фильтр Millipore с диаметром пор ≤ 0.45 мкм. В систему вводят раствор хлорида натрия до концентрации 2.5⋅10-2 М и перемешивают. Example 1. An aqueous solution of chitosan asparaginate is prepared based on the concentration of chitosan 0.9⋅10 -2 M and the concentration of L- aspartic acid 3.0 кислоты10 -2 M. For this, weighed portions of chitosan and aspartic acid are placed in a flask of a given volume, the calculated amount of bidistilled water is added, stirred for 2 hours. The resulting solution of chitosan asparaginate is filtered through a Millipore filter with a pore diameter of ≤ 0.45 μm. A solution of sodium chloride is introduced into the system to a concentration of 2.5 × 10 −2 M and mixed.
По данным динамического светорассеяния размер частиц аспарагината хитозана в водной дисперсии составляет 300-310 нм.According to dynamic light scattering, the particle size of chitosan asparaginate in the aqueous dispersion is 300-310 nm.
Пример 2. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 1. Отличие состоит в том, что концентрация хитозана в растворе составляет С ХТЗ = 0.5⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 200-220 нм. Example 2 All steps of the preparation of nanoparticles of chitosan asparaginata similar to Example 1. The difference is that the concentration of chitosan in the solution is HTZ C = 0.5⋅10 -2 M. particle size allocated 200-220 nm.
Пример 3. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 1. Отличие в том, что концентрация хлорида натрия в растворе составляет С NaCl = 5⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 200-220 нм. Example 3. All stages of obtaining chitosan asparaginate nanoparticles are similar to Example 1. The difference is that the concentration of sodium chloride in the solution is C NaCl = 5⋅10 -2 M. The size of the selected particles is 200-220 nm.
Пример 4. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 2. Отличие в том, что С NaCl = 5⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 180-190 нм. Example 4. All stages of obtaining nanoparticles of chitosan asparaginate are similar to example 2. The difference is that With NaCl = 5⋅10 -2 M. The size of the selected particles is 180-190 nm.
Пример 5. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 3. Отличие в том, что С NaCl = 10⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 190-200 нм. Example 5. All stages of obtaining chitosan asparaginate nanoparticles are similar to example 3. The difference is that With NaCl = 10⋅10 -2 M. The size of the selected particles is 190-200 nm.
Пример 6. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 4. Отличие в том, что С NaCl = 10⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 70-80 нм. Пример объемного распределения наночастиц аспарагината хитозана, полученных методом коацервации, приведен на фиг. 1 а. Example 6. All stages of obtaining nanoparticles of chitosan asparaginate are similar to example 4. The difference is that With NaCl = 10⋅10 -2 M. The size of the selected particles is 70-80 nm. An example of the volume distribution of chitosan asparaginate nanoparticles obtained by coacervation is shown in FIG. 1 a.
Пример 7. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 5. Отличие в том, что концентрация L-аспарагиновой кислоты в растворе составляет С Asp = 1.5⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 90-100 нм. Example 7. All the steps for producing chitosan asparaginate nanoparticles are similar to Example 5. The difference is that the concentration of L- aspartic acid in the solution is C Asp = 1.5 × 10 -2 M. The size of the isolated particles is 90-100 nm.
Пример 8. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 6. Отличие в том, что С ХТЗ = 1.8⋅10-2 М, в полученную систему дополнительно вводят раствор тетроглицеролата кремния в глицерине до концентрации С Si(OGly)4 = 0.3⋅10-2 М и перемешивают в течение 48 час на магнитной мешалке. Example 8. All the steps for producing chitosan asparaginate nanoparticles are similar to Example 6. The difference is that With ChTZ = 1.8⋅10 -2 M, a solution of silicon tetroglycerolate in glycerol is additionally introduced into the resulting system to a concentration of С Si (OGly) 4 = 0.3⋅10 -2 M and stirred for 48 hours on a magnetic stirrer.
По данным динамического светорассеяния размер частиц аспарагината хитозана в водной дисперсии составляет 290-300 нм.According to dynamic light scattering, the particle size of chitosan asparaginate in the aqueous dispersion is 290-300 nm.
Пример 9. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 8. Отличие в том, что С ХТЗ = 0.9⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 80-90 нм. Example 9. All steps of the preparation of nanoparticles of chitosan asparaginata same as example 8. The difference is that C = 0.9⋅10 -2 HTZ M. particle size allocated 80-90 nm.
Пример 10. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 9. Отличие в том, что С ХТЗ = 0.2⋅10-2 М, С Si(OGly)4 = 0.2⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 50-60 нм. EXAMPLE 10 All the steps of obtaining chitosan nanoparticles asparaginata same as example 9. The difference is that C HTZ = 0.2⋅10 -2 M, C, Si (OGly) 4 = 0.2⋅10 -2 M. particle size allocated 50-60 nm.
Пример 11. Все этапы получения наночастиц аспарагината хитозана аналогичны примеру 10. Отличие в том, что С ХТЗ = 0.9⋅10-2 М, С Asp = 1.5⋅10-2 М. Размер выделенных частиц 60-70 нм. Пример объемного распределения наночастиц аспарагината хитозана, полученных методом коацервации в присутствии стабилизатора приведен на фиг. 1 б. EXAMPLE 11 All the steps of obtaining chitosan nanoparticles asparaginata analogous to Example 10. The difference is that C HTZ = 0.9⋅10 -2 M, C, Asp = 1.5⋅10 -2 M. particle size allocated 60-70 nm. An example of the volume distribution of chitosan asparaginate nanoparticles obtained by coacervation in the presence of a stabilizer is shown in FIG. 1 b
Данные примеров 1-11 представлены в таблице.The data of examples 1-11 are presented in the table.
Таким образом, показана возможность получения кинетически стабильных наночастиц аспарагината хитозана размером 50-310 нм сравнительно простым способом с использованием принципов коацервации и золь-гель стабилизации. Thus, the possibility of obtaining kinetically stable nanoparticles of chitosan asparaginate with a size of 50-310 nm in a relatively simple way using the principles of coacervation and sol-gel stabilization has been shown.
Способ получения наночастиц аспарагината хитозана экономически выгодно масштабируется.The method of producing nanoparticles of chitosan asparaginate scales economically.
Пример 12. Оценка цитотоксичности и биосовместимости наночастиц аспарагината хитозана. Используют дисперсию наночастиц аспарагината хитозана, полученную по примерам 2, 6, 10. Оценку цитотоксичности и биосовместимости проводят с использованием культуры человеческих дермальных фибробластов, полученных из биоптатов кожи здоровых взрослых доноров после косметической операции. Example 12. Assessment of cytotoxicity and biocompatibility of nanoparticles of chitosan asparaginate . A dispersion of chitosan asparaginate nanoparticles obtained according to Examples 2, 6, 10 is used. Cytotoxicity and biocompatibility are evaluated using a culture of human dermal fibroblasts obtained from skin biopsy samples from healthy adult donors after cosmetic surgery.
В стерильные чашки Петри вносят ростовую среду DMEM (Sigma), дополненную 10% FBS (Hyclone) и 1% антибиотиков (Sigma), водную дисперсию наночастиц аспарагината хитозана в объемном соотношении [водная дисперсия наночастиц] : [ростовая среда] = 1 : 1, а затем суспензию человеческих дермальных фибробластов из расчета 200 тыс. кл./мл и культивируют 72 час в условиях насыщающей влажности в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С. Оценивают время формирования зрелого монослоя клеток, которое сравнивают с временем формирования монослоя культуры клеток, выросшей в такой же питательной среде в отсутствии водной дисперсии наночастиц аспарагината хитозана, и относительный индекс пролиферации - отношение количества клеток, выросших в тестовой среде по сравнению с контролем.In sterile Petri dishes, DMEM growth medium (Sigma) is added, supplemented with 10% FBS (Hyclone) and 1% antibiotics (Sigma), an aqueous dispersion of chitosan asparaginate nanoparticles in a volume ratio [aqueous dispersion of nanoparticles]: [growth medium] = 1: 1, and then a suspension of human dermal fibroblasts at the rate of 200 thousand cells / ml and cultured for 72 hours under conditions of saturation humidity in an incubator with 5% CO 2 at 37 ° C. Estimate the time of formation of a mature monolayer of cells, which is compared with the time of formation of a monolayer of cell culture grown in the same nutrient medium in the absence of an aqueous dispersion of chitosan asparaginate nanoparticles, and the relative proliferation index is the ratio of the number of cells grown in the test medium compared to the control.
Тестирование показало, что время формирования зрелого монослоя человеческих дермальных фибробластов в присутствии наночастиц аспарагината хитозана составляет менее 48 час, а в контроле - более 60 час. Относительный индекс пролиферации клеток фибробластов через 48 час культивирования в присутствии наночастиц аспарагината хитозана равен 2.7, в контроле - 1.0. Пример сформированного монослоя фибробластов через 48 час культивирования в условиях насыщающей влажности в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в питательной среде DMEM с 10% FBS с добавкой водной дисперсии наночастиц аспарагината хитозана приведен на фиг. 2.Testing showed that the formation time of a mature monolayer of human dermal fibroblasts in the presence of chitosan asparaginate nanoparticles is less than 48 hours, and in the control, more than 60 hours. The relative fibroblast cell proliferation index after 48 hours of cultivation in the presence of chitosan asparaginate nanoparticles is 2.7, and in the control, 1.0. An example of a formed monolayer of fibroblasts after 48 hours of cultivation under conditions of saturation humidity in a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C in DMEM culture medium with 10% FBS with the addition of an aqueous dispersion of chitosan asparaginate nanoparticles is shown in FIG. 2.
Полученные результаты показывают, что наночастицы аспарагината хитозана не цитотоксичны и биосовместимы, поскольку не угнетают рост клеточной культуры человеческих дермальных фибробластов. Кроме того, присутствие в ростовой среде наночастиц аспарагината хитозана значительно ускоряет рост клеточной популяции фибробластов.The results show that chitosan asparaginate nanoparticles are not cytotoxic and biocompatible, since they do not inhibit the growth of cell culture of human dermal fibroblasts. In addition, the presence of chitosan asparaginate nanoparticles in the growth medium significantly accelerates the growth of the fibroblast cell population.
ТаблицаTable
Характеристика исходной системы и размер наночастиц аспарагината хитозанаCharacterization of the initial system and size of chitosan asparaginate nanoparticles
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129326A RU2713138C1 (en) | 2019-09-18 | 2019-09-18 | Method of producing chitosan aspartate nanoparticles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129326A RU2713138C1 (en) | 2019-09-18 | 2019-09-18 | Method of producing chitosan aspartate nanoparticles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2713138C1 true RU2713138C1 (en) | 2020-02-03 |
Family
ID=69625460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019129326A RU2713138C1 (en) | 2019-09-18 | 2019-09-18 | Method of producing chitosan aspartate nanoparticles |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2713138C1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101036785A (en) * | 2007-04-29 | 2007-09-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | Chitosan nanoparticles oral preparations of hepatitis vaccine |
| US7740883B2 (en) * | 2004-03-28 | 2010-06-22 | University Of Debrecen | Nanoparticles from chitosan |
| JP2012191932A (en) * | 2011-03-03 | 2012-10-11 | Asahi Kasei Corp | Method for producing 11-sugar sialyloligosaccharide-asparagine |
| RU2554804C1 (en) * | 2014-05-27 | 2015-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук (ИМЕТ РАН) | Method for preparing calcium phosphate composite |
| RU2562723C2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing chitosan glutamate nanoparticles |
| RU2562721C2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing chitosan succinate nanoparticles |
-
2019
- 2019-09-18 RU RU2019129326A patent/RU2713138C1/en active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7740883B2 (en) * | 2004-03-28 | 2010-06-22 | University Of Debrecen | Nanoparticles from chitosan |
| CN101036785A (en) * | 2007-04-29 | 2007-09-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | Chitosan nanoparticles oral preparations of hepatitis vaccine |
| JP2012191932A (en) * | 2011-03-03 | 2012-10-11 | Asahi Kasei Corp | Method for producing 11-sugar sialyloligosaccharide-asparagine |
| RU2562723C2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing chitosan glutamate nanoparticles |
| RU2562721C2 (en) * | 2013-10-09 | 2015-09-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМХИМ" (ООО "ФАРМХИМ") | Method of producing chitosan succinate nanoparticles |
| RU2554804C1 (en) * | 2014-05-27 | 2015-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук (ИМЕТ РАН) | Method for preparing calcium phosphate composite |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nazir et al. | Nanocomposite hydrogels for melanoma skin cancer care and treatment: In-vitro drug delivery, drug release kinetics and anti-cancer activities | |
| TWI306869B (en) | Amphiphilic block copolymers and nano particles comprising the same | |
| US20190008775A1 (en) | Method for Preparing Modified Sodium Alginate Embolization Microsphere | |
| CN107778497B (en) | Composite covalent hydrogel capable of releasing according to needs as well as preparation method and application thereof | |
| Nardecchia et al. | In situ precipitation of amorphous calcium phosphate and ciprofloxacin crystals during the formation of chitosan hydrogels and its application for drug delivery purposes | |
| JPWO2015099083A1 (en) | Water dispersion that solidifies serum and blood | |
| Choi et al. | Alginate-chitosan hydrogel patch with beta-glucan nanoemulsion for antibacterial applications | |
| JP2019501261A (en) | Biodegradable amphiphilic polymers, polymer vesicles produced thereby, and use in the manufacture of lung cancer targeted therapeutics | |
| Dubashynskaya et al. | Hyaluronan-colistin conjugates: Synthesis, characterization, and prospects for medical applications | |
| TW202015801A (en) | Injectable self-assembling microbead-gel, use thereof, and method for preparing injectable self-assembling microbead-gel | |
| Zhang et al. | Encapsulation of astragaloside with matrix metalloproteinase-2-responsive hyaluronic acid end-conjugated polyamidoamine dendrimers improves wound healing in diabetes | |
| Cui et al. | A chitosan-based self-healing hydrogel for accelerating infected wound healing | |
| CN113633785B (en) | Preparation method and application of intelligent responsive shell-core polyelectrolyte nanogel | |
| RU2713138C1 (en) | Method of producing chitosan aspartate nanoparticles | |
| Han et al. | Synthesis and evaluation of hydroxycamptothecin-encapsulated chitosan nanospheres for the treatment of liver cancer | |
| RU2727360C1 (en) | Method of producing chitosan nanoparticles | |
| CN114748637B (en) | Phenylboronic acid modified nanocrystalline drug stabilization system and preparation method and application thereof | |
| CN103990134A (en) | Nano vesicle capable of co-transporting drugs and genes, manufacturing method and applications thereof | |
| US11471534B2 (en) | Chitosan-pluronic complex and nano-carrier comprising same | |
| CN103524639A (en) | Synthesis method and application of chitosan oligosaccharide/indometacin graft | |
| CN106279678B (en) | A kind of preparation for the reduction-sensitive nano-micelle that can covalently carry medicine | |
| CN114159393B (en) | Tetrandrine-loaded hybrid nanoparticles, tetrandrine-loaded soluble microneedle drug delivery system and preparation method thereof | |
| Lei et al. | Gelatinase-responsive biodegradable targeted microneedle patch for abscess wound treatment of S. aureus infection | |
| CN113995714A (en) | Cisplatin-crosslinked protein hydrogel and preparation method thereof | |
| Bao et al. | Artemisinin-loaded silk fibroin/gelatin composite hydrogel for wound healing and tumor therapy |