RU2711613C1 - Novel n-sulphanilamide derivative of pyrimidin-4(1h)-one, having cerebroprotective activity for treating chronic traumatic encephalopathy - Google Patents

Abstract

FIELD: pharmaceutics.SUBSTANCE: invention refers to a compound of formula (I)EFFECT: invention can be used to develop medicinal agents of cerebroprotective action for treating chronic traumatic encephalopathy.1 cl, 2 dwg, 2 tbl, 2 ex

Description

Предшествующий уровень техникиState of the art

Хроническая травматическая энцефалопатия (ХТЭ) представляет собой хроническое нейродегенеративное заболевание, триггером которого являются повторяющиеся эпизоды легкой и средне-тяжелой черепно-мозговой травмы. [McKee AC, Cairns NJ, Dickson DW, Folkerth RD, Keene CD, Litvan I, Perl DP, Stein TD, Vonsattel JP, Stewart W, Tripodis Y, Crary JF, Bieniek KF, Dams-O'Connor K, Alvarez VE, Gordon WA, group TC. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 2016; 131:75-86.]. Ведущим симптомом ХТЭ является прогрессирующий когнитивный дефицит, который связан с усилением нейрональной гибели в следствие накопления в клетках головного мозга β-амилоида и фосфорилированного tau- белка. [Chauhan NB. Chronic neurodegenerative consequences of traumatic brain injury. Restor Neurol Neurosci. 2014; 32:337-365.]. В виду того, что основным патофизиологическим механизмом, опосредующим клинические проявления ХТЭ является увеличение степени деградации нейронов для лечения данного заболевания, как правило, применяются средства, обладающие церебропротекторным действием, использование которых направлено на ограничение вторичных механизмов повреждения клеток мозга после травмы. [Somayaji MR, Przekwas AJ, Gupta RK. Combination Therapy for Multi-Target Manipulation of Secondary Brain Injury Mechanisms. Curr Neuropharmacol. 2018; 16(4):484-504. doi:10.2174/1570159X15666170828165711]. На сегодняшний день церебропротекторы представлены препаратами метаболического действия (кортексин, холина альфосцерат, цитиколин), антиоксидантами (ресвератрол, Egb671), ГАМК-ергическими средствами (гопантеновая кислота). [Евтушенко И.С. Ноотропы и нейропротекторы в современной клинической нейрофармакологии // Международный неврологический журнал. - 2013. - №.3 (57).] Однако применение существующих церебропротекторных препаратов зачастую не оказывает должного эффекта у пациентов с ХТЭ. [Tharmaratnam Т, Iskandar MA, Tabobondung ТС, Tobbia I, Gopee-Ramanan P, Tabobondung ТА. Chronic Traumatic Encephalopathy in Professional American Football Players: Where Are We Now?. Front Neurol. 2018; 9:445. Published 2018 Jun 19. doi:10.3389/fheur.2018.00445]Chronic traumatic encephalopathy (CTE) is a chronic neurodegenerative disease that is triggered by recurring episodes of mild to moderate traumatic brain injury. [McKee AC, Cairns NJ, Dickson DW, Folkerth RD, Keene CD, Litvan I, Perl DP, Stein TD, Vonsattel JP, Stewart W, Tripodis Y, Crary JF, Bieniek KF, Dams-O'Connor K, Alvarez VE, Gordon WA, group TC. The first NINDS / NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 2016; 131: 75-86.]. The leading symptom of CTE is progressive cognitive deficiency, which is associated with increased neuronal death due to the accumulation of β-amyloid and phosphorylated tau protein in brain cells. [Chauhan NB. Chronic neurodegenerative consequences of traumatic brain injury. Restor Neurol Neurosci. 2014; 32: 337-365.]. In view of the fact that the main pathophysiological mechanism mediating the clinical manifestations of CTE is an increase in the degree of degradation of neurons for the treatment of this disease, as a rule, agents with cerebroprotective action are used, the use of which is aimed at limiting the secondary mechanisms of damage to brain cells after injury. [Somayaji MR, Przekwas AJ, Gupta RK. Combination Therapy for Multi-Target Manipulation of Secondary Brain Injury Mechanisms. Curr Neuropharmacol. 2018; 16 (4): 484-504. doi: 10.2174 / 1570159X15666170828165711]. To date, cerebroprotectors are represented by metabolic drugs (cortexin, choline alfoscerate, citicoline), antioxidants (resveratrol, Egb671), GABAergic agents (hopantenic acid). [Evtushenko I.S. Nootropics and neuroprotectors in modern clinical neuropharmacology // International Neurological Journal. - 2013. - No. 3 (57).] However, the use of existing cerebroprotective drugs often does not have the desired effect in patients with CTE. [Tharmaratnam T, Iskandar MA, Tabobondung TC, Tobbia I, Gopee-Ramanan P, Tabobondung TA. Chronic Traumatic Encephalopathy in Professional American Football Players: Where Are We Now ?. Front Neurol. 2018; 9: 445. Published 2018 Jun 19. doi: 10.3389 / fheur.2018.00445]

Вследствие этого актуальной задачей является поиск новых соединений, обладающих выраженным церебропротекторным действием в условиях хронической травматической энцефалопатии.As a result of this, the urgent task is to search for new compounds with a pronounced cerebroprotective effect in conditions of chronic traumatic encephalopathy.

Целью изобретения является поиск нового производного пиримидин-4(1Н)-она, обладающего более выраженной церебропротекторной активностью и низкой токсичностью по сравнению с известными препаратами, синтез которого экономически выгоден и технологически несложен.The aim of the invention is the search for a new derivative of pyrimidine-4 (1H) -one, which has a more pronounced cerebroprotective activity and low toxicity compared to known drugs, the synthesis of which is economically viable and technologically simple.

Среди структурных аналогов разрабатываемого объекта, обнаружено немало соединений, обладающих психотропной [Воронков А.В., Шабанова Н.Б., Поздняков Д.И., Луговой И.С., Кодониди И.П. Влияние новых производных пиримидин-4(1н)-она на психоэмоциональный дисбаланс и некоторые нарушения энергетического обмена у крыс на фоне ишемии головного мозга Современные проблемы науки и образования. 2017. №5. С. 13.], гипотензивной [А.с. 1822149 СССР МКИ А61К 31/505. Опубл. 12.10.92 г. - 8 с.] и антиоксидантной [Е.В. Петрова, Э.Т. Оганесян, И.П. Кодониди Сравнительная антиоксидантная и антигипоксическая активность нового производного 1,4-дигидро-4-оксопиримидина -соединения PDMpT HCl и мексидола Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013. - №6. - С. 38-40.] активностью.Among the structural analogues of the object under development, many compounds have been discovered that are psychotropic [Voronkov A.V., Shabanova NB, Pozdnyakov D.I., Lugovoi I.S., Kodonidi I.P. The effect of new derivatives of pyrimidin-4 (1n) -one on psychoemotional imbalance and some disturbances in energy metabolism in rats against the background of cerebral ischemia Modern problems of science and education. 2017. No5. S. 13.], antihypertensive [A.S. 1822149 USSR MKI A61K 31/505. Publ. 10/12/92 - 8 pp.] And antioxidant [E.V. Petrova, E.T. Oganesyan, I.P. Codonidi Comparative antioxidant and antihypoxic activity of a new derivative of 1,4-dihydro-4-oxopyrimidine compound PDMpT HCl and Mexidol Experimental and clinical pharmacology. - 2013. - No. 6. - S. 38-40.] Activity.

В.качестве ближайших аналогов по действию, обладающие выраженной церебропротекторной активностью и низкой токсичностью, могут быть указаны N-арилзамещенные [Тюренков И.Н., Петрова Е.В., Кодониди И.П., Оганесян Э.Т., Жогло Е.Н. Церебропротективное действие N-арилзамещенных производных 1,4-дигидропиримидина и их влияние на мозговое кровообращение. Вестник Волгоградского гос. мед. университета / - Волгоград; 2011. - Вып. 4(40). - С. 22-25.], а также N-пептидные производные пиримидин-4(1Н)-она [И.С. Луговой¹, И.П. Кодониди¹, А.В. Воронков¹, Н.Б. Шабанова¹, М.И. Кодониди Целенаправленный синтез n-пептидных производных пиримидин-4(1н)-она, обладающих церебропротекторными свойствами Журнал научных статей Здоровье и образование в XXI веке. 2017. Т. 19. №8. С. 195-199.], [Воронков А.В., Шабанова Н.Б., Кодониди И.П., Луговой И.С. Церебропротекторная активность новых производных пиримидин-4(1Н)-она PIR-9 и PIR-10 при необратимой окклюзии общих сонных артерий Фармация и фармакология. - 2018. Т 6 №2, - С. 168 - 181.].V. as the closest analogues in action, with pronounced cerebroprotective activity and low toxicity, N-aryl substituted [Tyurenkov I.N., Petrova E.V., Kodonidi I.P., Oganesyan E.T., Zhoglo E. N. Cerebroprotective effect of N-aryl substituted derivatives of 1,4-dihydropyrimidine and their effect on cerebral circulation. Bulletin of the Volgograd state. honey. University / - Volgograd; 2011. - Vol. 4 (40). - S. 22-25.], As well as N-peptide derivatives of pyrimidin-4 (1H) -one [I.S. Lugovoi ¹ , I.P. Codonidi ¹ , A.V. Voronkov ¹ , N.B. Shabanova ¹ , M.I. Codonidi Purposeful synthesis of n-peptide derivatives of pyrimidin-4 (1n) -one with cerebroprotective properties. Journal of scientific articles Health and Education in the 21st Century. 2017. V. 19. No. 8. S. 195-199.], [Voronkov A.V., Shabanova NB, Kodonidi I.P., Lugovoi I.S. Cerebroprotective activity of new pyrimidin-4 (1H) -one derivatives PIR-9 and PIR-10 with irreversible occlusion of the common carotid arteries. Pharmacy and pharmacology. - 2018. Т 6 No. 2, - P. 168 - 181.].

Способ получения 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамида (I) основан на взаимодействии N-ацетил-3-оксо-2-фенилпентанамида с 4-аминобензолсульфонамидом в среде ледяной уксусной кислоты при добавлении каталитических количеств диметилформамида.The method for producing 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] benzosulfamide (I) is based on the interaction of N-acetyl-3-oxo-2-phenylpentanamide with 4-aminobenzenesulfonamide in glacial acetic acid with the addition of catalytic amounts of dimethylformamide.

Пример синтеза 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамида (I).An example of the synthesis of 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] -benzenesulfamide (I).

Смесь 2,33 г (0,01 моль) N-ацетил-3-оксо-2-фенилпентанамида и 1,72 г (0,01 моль) 4-аминобензолсульфонамида растворяют при нагревании в 7 мл ледяной уксусной кислоте, далее прибавляют 0,5 мл диметилформамида и кипятят 2 часа. После охлаждения реакционной среды до комнатной температуры продукт выделяют диэтиловым эфиром. Осадок фильтруют и высушивают на воздухе. Полученный сырец 2,51 г очищают перекристаллизацией из этанола. Выход 68%. Вещество представляет собой белый мелкокристаллический порошок без запаха. Растворим в диметилсульфоксиде, малорастворим в этиловом спирте, нерастворим в диэтиловом эфире и воде. Т. пл: 294-296°С (из этанола). ИК-спектр (вазелиновое масло): 3341, 3180, 1631, 1624, 1587, 1324, 1162 см^-1. УФ-спектр λ_max: 204 и 256 нм. R_f(этанол)=0,74.A mixture of 2.33 g (0.01 mol) of N-acetyl-3-oxo-2-phenylpentanamide and 1.72 g (0.01 mol) of 4-aminobenzenesulfonamide is dissolved by heating in 7 ml of glacial acetic acid, then 0, 5 ml of dimethylformamide and boil for 2 hours. After the reaction medium was cooled to room temperature, the product was isolated with diethyl ether. The precipitate is filtered and dried in air. The resulting crude 2.51 g was purified by recrystallization from ethanol. Yield 68%. The substance is an odorless white crystalline powder. Soluble in dimethyl sulfoxide, sparingly soluble in ethyl alcohol, insoluble in diethyl ether and water. Mp: 294-296 ° C (from ethanol). IR (vaseline oil): 3341, 3180, 1631, 1624, 1587, 1324, 1162 cm ^-1 . UV spectrum λ _max : 204 and 256 nm. R _f (ethanol) = 0.74.

Молекулярная масса: 369,45 г/моль. Брутто формула: C₁₉H₁₉N₃O₃S.Molecular mass: 369.45 g / mol. Gross formula: C ₁₉ H ₁₉ N ₃ O ₃ S.

Элементный состав:Elemental composition:

Найдено, %: С 61,79; Н 5,16; О 12,96; S 8,67.Found,%: C 61.79; H 5.16; O 12.96; S 8.67.

Вычислено, %: С 61,77; Н 5,18; О 12,99; S 8,68.Calculated,%: C 61.77; H 5.18; About 12.99; S 8.68.

Спектр ¹Н ЯМР (300 Мгц), δ, м.д. в DMSO-d₆: 0,62-0,67 (т, 3Н, СН3); 1,01-1,06 (к. 2Н, СН2); 1,97-2,01 (т, 3Н, СН3); 7,20-7,22 (д, 2Н ArH); 7,33-7,41 (м. 3Н, ArH); 7,59 (с, 2Н, NH2); 7,83-7,89 (т, 2Н, ArH); 8,01-8,03 (д, 2Н, ArH). ¹ H NMR spectrum (300 MHz), δ, ppm in DMSO-d ₆ : 0.62-0.67 (t, 3H, CH3); 1.01-1.06 (q, 2H, CH2); 1.97-2.01 (t, 3H, CH3); 7.20-7.22 (d, 2H ArH); 7.33-7.41 (m, 3H, ArH); 7.59 (s, 2H, NH2); 7.83-7.89 (t, 2H, ArH); 8.01-8.03 (d, 2H, ArH).

Оценка фармакологической эффективности и безопасности применения 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамида.Assessment of the pharmacological efficacy and safety of the use of 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] benzylsulfamide.

Пример. 1Example. 1

Оценку «острой токсичности» 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамида производили на 70 мышах-самцах линии Balb/c. Разрабатываемое соединение вводили per os дробно с 2-х часовым временным интервалом, учитывая величину максимально допустимого объема перорального введения для данного вида животных в следующем интервале доз: 250 мг/кг; 500 мг/кг; 1000 мг/кг; 1500 мг/кг; 2000 мг/кг и 2500 мг/кг. Группа контроля (n=10) получала дистиллированную воду в эквиобъемном количестве. В ходе постановки эксперимента дальнейшего увеличения дозы избегали в виду возможной «перегрузки» животных вводимым объемом жидкости. Наблюдение за животными осуществляли на протяжении 14-дней, при этом в первые сутки мониторинг производился непрерывно. Регистрировали гибель животных, на основании чего рассчитывали показатель LD₅₀ методом Финни. [Finney, D.J. Probit Analysis: A Statistical Treatment of the Sigmoid Response Curve. Cambridge University Press, London and New York, 1947.]The acute toxicity of 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] benzylsulfamide was evaluated in 70 Balb / c male mice. The developed compound was administered per os fractionally with a 2-hour time interval, taking into account the maximum permissible amount of oral administration for a given animal species in the following dose range: 250 mg / kg; 500 mg / kg; 1000 mg / kg; 1,500 mg / kg; 2000 mg / kg and 2500 mg / kg. The control group (n = 10) received distilled water in an equal volume. During the experiment, a further increase in dose was avoided in view of the possible "overload" of animals with an injected volume of liquid. Animals were monitored for 14 days, while monitoring was carried out continuously on the first day. The death of animals was recorded, on the basis of which the LD ₅₀ value was calculated by the Finney method. [Finney, DJ Probit Analysis: A Statistical Treatment of the Sigmoid Response Curve. Cambridge University Press, London and New York, 1947.]

Данные, полученные при изучении «острой токсичности» 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамида представлены в таблице 1. При проведении данного блока экспериментальной работы установлено, что при пероральном введении 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамида в дозе 2500 мг/кг погибло одно животное (4-й день исследования). Введение разрабатываемого объекта в других вариантах дозирования гибели животных не вызвало. При этом у выживших мышей на всем временном интервале наблюдения изменений в поведенческой активности, сенсорном восприятии, состоянии кожного покрова и слизистых оболочек, а также частоте актов дефекации и мочеиспускания по отношению к контрольной группе животных не установлено. Значение LD₅₀ для соединения 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамид составило 6440,84±647,27 мг/кг, что позволяет отнести данный объект к 5 классу токсичности по СГС-классификации (Нью-Йорк и Женева, 2011).The data obtained in the study of "acute toxicity" of 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] benzylsulfamide are presented in table 1. When conducting this block of experimental work it was found that the oral administration of 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] benzylsulfamide at a dose of 2500 mg / kg killed one animal (day 4 research). The introduction of the developed object in other dosage options for the death of animals did not cause. Moreover, in surviving mice, during the entire time interval for observation of changes in behavioral activity, sensory perception, the condition of the skin and mucous membranes, as well as the frequency of acts of defecation and urination with respect to the control group of animals, it was not established. The LD ₅₀ value for the compound 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] -benzenesulfamide was 6440.84 ± 647.27 mg / kg, which allows this object is classified as toxicity class 5 according to the GHS classification (New York and Geneva, 2011).

Пример. 2Example. 2

Влияние 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамида (DMH) на сохранение памятного следа и изменение концентрации специфических маркеров нейрональной деструкции у животных изучали на экспериментальной модели ХТЭ. На данном этапе работы в качестве биологической модели использовали 40 крыс-самцов линии Wistar массой 240-260 грамм. ХТЭ моделировали методом свободного падения груза массой 150 г с высоты 50 см. на теменную область черепной коробки крыс. Травму наносили однократно в день на протяжении 7-ми дней. [Turner RC, Lucke-Wold BP, Logsdon AF, et al. Modeling Chronic Traumatic Encephalopathy: The Way Forward for Future Discovery. Front Neurol. 2015; 6:223.] Перед началом эксперимента животных подвергали тренировочным тестам по стандартным протоколам оценки памятного следа - «условный рефлекс пассивного избегания» и «тест экстраполяционного избавления» до выработки устойчивых поведенческих стереотипов. [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - с. 20-23]. При проведении данного исследования было сформировано 4 экспериментальные группы животных, сопоставимых по поведенческой активности в тестах «условный рефлекс пассивного избегания» и «тест экстраполяционного избавления»: группа крыс положительного контроля (ПК, n=10); группа животных негативного контроля (НК, n=10, не получавшая фармакологическую поддержку), группа крыс, которым вводили разрабатываемый объект и препарат сравнения (n=10 каждая экспериментальная группа). Изучаемое соединение вводили один раз в сутки интрагастрально в дозе 100 мг/кг (доза соответствующая таковой у референтного препарата) через 30 мин после нанесения травмы. Препарат сравнения (холина альфосцерат «Церепро» Верофарм, 100 мг/кг) вводили по аналогичной схеме. [Сысоев Ю.И., Оковитый С.В., Узуегбунам Б. Влияние нового производного диэтиламиноэтанола на выраженность неврологического дефицита у крыс после черепно-мозговой травмы // Биомедицина, 2018; 2: 95-105]. На 8-й день исследования во всех экспериментальных группах животных повторно воспроизводили тесты «условный рефлекс пассивного избегания» и «экстраполяционного избавления». При этом согласно протоколу испытания в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» определяемым параметром служило латентное время захода в темный отсек установки. В тесте «экстраполяционного избавления» оценивали изменение следующих показателей: латентное время выполнения задачи («подныривание») и количество неудачных попыток избегания («прыжков»). [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - с. 20-23]. После оценки изменения памятного следа у крыс производили забор венозной крови и далее животных декапитировали под хлоралгидратной анестезией (350 мг/кг, интраперитонеально) извлекали головной мозг, который гомогенизировали в механическом гомогенизаторе Поттера в 0,01 ммоль/л PBS с рН 7,2 (соотношение 1:7). Полученный гомогенат центрифугировали в режиме 5 мин. 10000g и супернатант мозговой ткани удаляли для проведения ИФА-исследования. Венозную кровь центрифугировали в режиме 15 мин 1000g с получением сыворотки, которую использовали в качестве биоматериала для ИФА-исследования. Методом ИФА в сыворотке крови определяли концентрацию белка S100β, глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и нейрон-специфичной енолазы (NSE) - соединений-биомаркеров повреждения головного мозга. В супернатанте мозговой ткани оценивали изменение концентрации β-амилоида, как специфичного маркера развития ХТЭ. [Wang KK, Yang Z, Zhu Т, et al. An update on diagnostic and prognostic biomarkers for traumatic brain injury. Expert Rev Mol Diagn. 2018; 18(2): 165-180. doi:10.1080/14737159.2018.1428089]. В работе применялись стандартные наборы реактивов для ИФА производства компании Cloud clone (США). Пробоподготовка биоматериала и ход анализа соответствовал инструкции, прилагаемой к каждому набору.The effect of 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] -benzenesulfamide (DMH) on the preservation of the memory trace and the change in the concentration of specific markers of neuronal destruction in animals was studied experimentally CHE models. At this stage of the work, 40 male Wistar rats weighing 240-260 grams were used as a biological model. CTE was simulated by the method of free fall of a cargo weighing 150 g from a height of 50 cm onto the parietal region of the cranium of rats. The injury was applied once a day for 7 days. [Turner RC, Lucke-Wold BP, Logsdon AF, et al. Modeling Chronic Traumatic Encephalopathy: The Way Forward for Future Discovery. Front Neurol. 2015; 6: 223.] Before the start of the experiment, the animals were subjected to training tests according to standard protocols for assessing the commemorative footprint - the “conditioned reflex of passive avoidance” and the “extrapolation disposal test” before developing stable behavioral stereotypes. [Guidelines for preclinical studies of drugs. Part One / Ed. A.N. Mironova. - M.: Grif and K, 2012 .-- p. 20-23]. During this study, 4 experimental groups of animals were formed that were comparable in behavioral activity in the tests “conditioned reflex of passive avoidance” and “extrapolation rid test”: a group of rats of positive control (PC, n = 10); a group of animals of negative control (NK, n = 10, which did not receive pharmacological support), a group of rats that were injected with the developed object and the comparison drug (n = 10 each experimental group). The studied compound was administered intragastrically once a day at a dose of 100 mg / kg (the dose corresponding to that of the reference drug) 30 minutes after the injury. The comparison drug (choline alfoscerate "Cerepro" Veropharm, 100 mg / kg) was administered according to a similar scheme. [Sysoev Yu.I., Okovity S.V., Uzuegbunam B. The influence of a new derivative of diethylaminoethanol on the severity of neurological deficiency in rats after traumatic brain injury // Biomedicine, 2018; 2: 95-105]. On the 8th day of the study, the tests “conditioned reflex of passive avoidance” and “extrapolation disposal” were repeated in all experimental groups of animals. Moreover, according to the test protocol in the test “conditioned reflex of passive avoidance”, the latent time of entry into the dark compartment of the installation served as the determined parameter. In the test of “extrapolation deliverance”, the change in the following indicators was evaluated: latent time of the task (“diving”) and the number of unsuccessful attempts to avoid (“jumping”). [Guidelines for preclinical studies of drugs. Part One / Ed. A.N. Mironova. - M.: Grif and K, 2012 .-- p. 20-23]. After evaluating the change in the memory footprint in rats, venous blood was collected and then the animals were decapitated under chloral hydrate anesthesia (350 mg / kg, intraperitoneally), the brain was removed, which was homogenized in a Potter mechanical homogenizer in 0.01 mmol / L PBS with pH 7.2 ( ratio 1: 7). The resulting homogenate was centrifuged in a mode of 5 min. 10000g and supernatant of brain tissue were removed for ELISA. Venous blood was centrifuged at 15 min 1000g to obtain serum, which was used as biomaterial for ELISA studies. Using the ELISA method, the concentrations of S100β protein, glial fibrillar acid protein (GFAP) and neuron-specific enolase (NSE), the brain damage biomarker compounds, were determined. In the supernatant of the brain tissue, the change in the concentration of β-amyloid was evaluated as a specific marker of the development of CTE. [Wang KK, Yang Z, Zhu T, et al. An update on diagnostic and prognostic biomarkers for traumatic brain injury. Expert Rev Mol Diagn. 2018; 18 (2): 165-180. doi: 10.1080 / 14737159.2018.1428089]. In our work, we used standard reagent kits for ELISA produced by Cloud clone (USA). Sample preparation of the biomaterial and the course of analysis corresponded to the instructions attached to each set.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением программного комплекса STATISTICA 6.0. Данные выражали в вид M±SEM. Сравнение средних осуществляли методом ANOVA с пост-тестом Ньюмена-Кейсла. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.Statistical processing of the results was carried out using the STATISTICA 6.0 software package. Data were expressed as M ± SEM. Comparison of the averages was carried out by the ANOVA method with the Newman-Keysl post-test. Differences were considered statistically significant at p <0.05.

В ходе исследования установлено, что у крыс в условиях экспериментальной ХТЭ наблюдается ухудшение памятного следа, что подтверждалось данными, полученными в тестах «условный рефлекс пассивного избегания» и «экстраполяционное избавление». Так у крыс НК группы в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» в сравнении с ПК группой животных наблюдалось снижение латентного времени захода в темный отсек установки (рис. 1) в 10,8 раза (р<0,05), в тоже время в тесте «экстраполяционное избавление» (рис. 2) у крыс, лишенных фармакологической поддержки, по отношению к ПК группе животных отмечено повышение времени выполнения задачи («подныривание») в 4,2 раза (р<0,05) и числа неудачных попыток избегания в 2,28 раза (р<0,05). Также у НК группы крыс концентрация белка S100β, GFAP, NSE и β-амилоида увеличилась в сравнении с ПК группой животных в 29 раз (р<0,05); 8 раз (р<0,05); 19 раз (р<0,05) и 25,3 раза (р<0,05) соответственно (табл. 2).In the course of the study, it was found that in rats under the conditions of experimental CTE, a memory impairment is observed, which was confirmed by the data obtained in the tests “conditioned reflex of passive avoidance” and “extrapolation disposal”. So, in rats of the NK group, in the test “conditioned reflex of passive avoidance” in comparison with the PC group of animals, a decrease in the latent time of entry into the dark compartment of the apparatus (Fig. 1) was 10.8 times (p <0.05), at the same time in the test “extrapolation disposal” (Fig. 2) in rats lacking pharmacological support, an increase in the time required to complete the task (“diving”) by 4.2 times (p <0.05) and the number of unsuccessful attempts to avoid 2.28 times (p <0.05). Also, in the NK group of rats, the concentration of S100β, GFAP, NSE, and β-amyloid protein increased by 29 times compared with the PK group of animals (p <0.05); 8 times (p <0.05); 19 times (p <0.05) and 25.3 times (p <0.05), respectively (Table 2).

На фоне введения животным холина альфосцерата по сравнению с НК группой крыс наблюдалось увеличение латентного времени захода в темный отсек в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» (рис. 1) в 2,8 раза (р<0,05). Также применение холина альфосцерата способствовало сокращению времени принятия решения животными (время, необходимое для «подныривания») в тесте «экстраполяционное избавление» в 2,13 (р<0,05), но при этом значимого влияния на изменение числа неудачных попыток «избегания» не оказало (рис. 2). Кроме того, введение холина альфосцерата крысам с экспериментальной ХТЭ способствовало снижению относительно НК группы животных содержания протеина S100β - в 2,53 раза (р<0,05), GFAP - 2,3 раза (р<0,05), NSE - 2,5 раза (р<0,05) и β-амилоида - 3,23 раза (р<0,05) (табл. 2).Compared with the NK group of rats, administration of choline alfoscerate compared to the NK group of rats showed an increase in latent time of entry into the dark compartment in the test “conditioned reflex of passive avoidance” (Fig. 1) by 2.8 times (p <0.05). Also, the use of choline alfoscerate contributed to a reduction in decision-making time by animals (the time required for “diving”) in the “extrapolation rid” test to 2.13 (p <0.05), but at the same time a significant effect on the change in the number of unsuccessful attempts to “avoid” did not (Fig. 2). In addition, the introduction of choline alfoscerate to rats with experimental CTE contributed to a decrease in the protein content of S100β relative to the NK group of animals by 2.53 times (p <0.05), GFAP - 2.3 times (p <0.05), NSE - 2 , 5 times (p <0.05) and β-amyloid - 3.23 times (p <0.05) (Table 2).

Применение разрабатываемого соединения DMH в условиях экспериментальной ХТЭ способствовало восстановлению памятного следа у крыс, что выражалось в увеличении латентного времени захода в затемненный отсек установки в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» (рис. 1) по отношению к НК группе животных в 10,4 раза (р<0,05), а также уменьшении времени «избегания» в тесте «экстраполяционное избавление» (рис. 2) в 2,04 раза (р<0,05). При этом время выполнения задачи (заход в темный отсек) в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» у крыс, получавших соединение DMH, было в 3,69 раза (р<0,05) выше аналогичного показателя животных, которым вводили холина альфосцерат. Также на фоне введение крысам соединения DMH относительно животных, лишенных фармакологической поддержки, отмечено снижение концентрации S100β, GFAP, NSE и β-амилоида в 2,99 раза (р<0,05); 3,4 раза (р<0,05); 3,5 раза (р<0,05); и 4,2 раза (р<0,05) соответственно. Необходимо отметить, что у крыс, получавших соединение DMH, содержание белка S100β было на 18,3% (р<0,05) меньше аналогичного показателя группы животных, которым вводили холина альфосцерат. Кроме того, концентрация GFAP, NSE и β-амилоида была на 44,8% (р<0,05); 38,5% (р<0,05) и 30,5% (р<0,05) соответственно меньше у крыс, получавших разрабатываемое соединение DMH в сравнении с животными, которым в качестве фармакологической поддержки вводили холина альфосцерат (табл. 2).The use of the DMH compound under development under conditions of experimental CTE contributed to the restoration of the memorial trail in rats, which was expressed in an increase in the latent time of entry into the darkened compartment of the setup in the test “conditioned reflex of passive avoidance” (Fig. 1) in relation to the NK group of animals by 10.4 times (p <0.05), as well as reducing the time of “avoidance” in the test “extrapolation disposal” (Fig. 2) by 2.04 times (p <0.05). At the same time, the task execution time (entry into the dark compartment) in the test “conditioned reflex of passive avoidance” in rats treated with DMH was 3.69 times (p <0.05) higher than that of animals injected with choline alfoscerate. Also, against the background of the administration of DMH compounds to rats relative to animals lacking pharmacological support, a decrease in the concentration of S100β, GFAP, NSE and β-amyloid was noted 2.99 times (p <0.05); 3.4 times (p <0.05); 3.5 times (p <0.05); and 4.2 times (p <0.05), respectively. It should be noted that in rats treated with DMH compound, the content of S100β protein was 18.3% (p <0.05) less than the same indicator in the group of animals that were injected with choline alfoscerate. In addition, the concentration of GFAP, NSE, and β-amyloid was 44.8% (p <0.05); 38.5% (p <0.05) and 30.5% (p <0.05), respectively, are less in rats treated with the DMH compound in comparison with animals that were administered choline alfoscerate as pharmacological support (Table 2) .

Таким образом применение 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамида в условиях экспериментальной ХТЭ способствует сохранению памятного следа у крыс, а также препятствует деструкции мозговой ткани, превосходя при этом действие референтного препарата - холина альфосцерата в эквивалентной дозе.Thus, the use of 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] -benzenesulfamide under the conditions of experimental CTE contributes to the preservation of a memorable trace in rats and also prevents the destruction of brain tissue while exceeding the effect of the reference drug - choline alfoscerate in an equivalent dose.

Claims (2)

Соединение 4-[2-метил-6-этил-4-оксо-5-фенил-пиримидин-1(Н)-ил]-бензсульфамид, общей формулы I, обладающее церебропротекторной активностью в условиях хронической травматической энцефалопатииThe compound 4- [2-methyl-6-ethyl-4-oxo-5-phenyl-pyrimidin-1 (H) -yl] -benzenesulfamide, General formula I, having cerebroprotective activity in conditions of chronic traumatic encephalopathy

Images