RU2703949C1 - Variable domains of a light and heavy chain of a human cathegerin-17 mouse monoclonal antibody, an antigen-binding fragment (fab) against human cadherin-17, containing said domains - Google Patents

Variable domains of a light and heavy chain of a human cathegerin-17 mouse monoclonal antibody, an antigen-binding fragment (fab) against human cadherin-17, containing said domains Download PDF

Info

Publication number
RU2703949C1
RU2703949C1 RU2018116026A RU2018116026A RU2703949C1 RU 2703949 C1 RU2703949 C1 RU 2703949C1 RU 2018116026 A RU2018116026 A RU 2018116026A RU 2018116026 A RU2018116026 A RU 2018116026A RU 2703949 C1 RU2703949 C1 RU 2703949C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cadherin
human
antibodies
antibody
fab
Prior art date
Application number
RU2018116026A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Ольга Николаевна Солопова
Максим Николаевич Боков
Николай Евгеньевич Варламов
Любовь Петровна Позднякова
Петр Георгиевич Свешников
Ольга Борисовна Шемчукова
Сергей Сергеевич Зацепин
Елена Витальевна Клячко
Тимур Анверович Ягудин
Original Assignee
Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО ВНЦМДЛ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО ВНЦМДЛ) filed Critical Открытое акционерное общество "Всероссийский научный Центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО ВНЦМДЛ)
Priority to RU2018116026A priority Critical patent/RU2703949C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2703949C1 publication Critical patent/RU2703949C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

FIELD: immunology.
SUBSTANCE: present invention relates to immunology. Disclosed is an antibody which selectively binds to human cadherin-17, its antigen-binding fragment (Fab) and variable domains of said antibody.
EFFECT: present invention widens the range of means of detecting cadherin-17.
3 cl, 8 dwg, 5 tbl, 4 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к антителам, в частности к вариабельным доменам легкой и тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела, связывающегося с кадгерином-17 человека, и антигенсвязывающему фрагменту (Fab) против кадгерина-17 человека, содержащему указанные домены.The present invention relates to antibodies, in particular to the variable domains of the light and heavy chains of a murine monoclonal antibody binding to human cadherin-17, and an antigen binding fragment (Fab) against human cadherin-17 containing these domains.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Рак желудка (РЖ) находится на втором месте по смертности от онкологических заболеваний и на 4-ом месте по распространенности среди злокачественных опухолей (Tan I.B. и др. Intrinsic subtypes of gastric cancer, based on gene expression pattern, predict survival and respond differently to chemotherapy. Gastroenterology, 2011, 141: 476-485; Kamangar F. и др. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol, 2006, 24: 2137-2150). Медиана продолжительности жизни пациентов с РЖ составляет 7-10 месяцев. 5-летняя выживаемость пациентов с РЖ составляет приблизительно 20%, при правильно подобранном лечении может увеличиваться до 40%. (Tan I.B. и др. Intrinsic subtypes of gastric cancer, based on gene expression pattern, predict survival and respond differently to chemotherapy. Gastroenterology, 2011, 141: 476-485; Hartgrink H.H. Improving outcome for scirrhous gastric cancer. Gastric Cancer, 2009, 12: 3-5). В настоящее время для лечения РЖ наиболее широко распространена терапия препаратами на основе неспецифических цитостатиков. В случае аденокарциномы с увеличенной экспрессией HER2-neu применение Herceptin в комбинации с химиотерапией повышает медиану выживаемости до 13,8 месяцев (Bang Y.J. и др. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet, 2010, 376: 687-697). Учитывая высокую смертность от РЖ и отсутствие чувствительных и специфических маркеров для ранней диагностики РЖ, поиск соответствующих мишеней и терапевтических средств против этих мишеней остается крайне актуальным во всем мире.Gastric cancer (RG) is second in cancer mortality and fourth in prevalence among malignant tumors (Tan IB et al. Intrinsic subtypes of gastric cancer, based on gene expression pattern, predict survival and respond differently to chemotherapy Gastroenterology, 2011, 141: 476-485; Kamangar F. et al. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol, 2006, 24: 2137-2150). The median life expectancy of patients with cancer is 7–10 months. The 5-year survival rate for patients with pancreatic cancer is approximately 20%, with the right treatment, it can increase up to 40%. (Tan IB et al. Intrinsic subtypes of gastric cancer, based on gene expression pattern, predict survival and respond differently to chemotherapy. Gastroenterology, 2011, 141: 476-485; Hartgrink HH Improving outcome for scirrhous gastric cancer. Gastric Cancer, 2009, 12: 3-5). Currently, for the treatment of pancreatic cancer, drug therapy based on non-specific cytostatics is the most common. In the case of adenocarcinoma with increased HER2-neu expression, the use of Herceptin in combination with chemotherapy increases the median survival to 13.8 months (Bang YJ et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet, 2010, 376: 687-697). Given the high mortality from cancer and the lack of sensitive and specific markers for early diagnosis of cancer, the search for appropriate targets and therapeutic agents against these targets remains extremely relevant worldwide.

Кадгерин-17 (CDH17) является одним из членов надсемейства семидоменных кадгеринов, он присутствует на клетках печени и желудочно-кишечного тракта в эмбриогенезе, поэтому второе его название - печеночно-кишечный кадгерин (liver-intestinal cadherin или LI cadherin). CDH17 экспрессируется на клетках гепатоцеллюлярной карциномы (Liu L.X. и др. Targeting cadherin-17 inactivates Wnt signaling and inhibits tumor growth in liver carcinoma. Hepatology, 2009, 50: 1453-1463; Wong B.W. и др. Identification of liver-intestine cadherin in hepatocellular carcinoma - a potential disease marker. Biochem Biophys Res Commun., 2003, 311: 618-624), рака желудка (Grotzinger C. и др. LI-cadherin: a marker of gastric metaplasia and neoplasia. Gut, 2001, 49: 73-81), рака протоков поджелудочной железы (Takamura M. и др., Expression of liver-intestine cadherin and its possible interaction with galectin-3 in ductal adenocarcinoma of the pancreas. Cancer Sci., 2003, 94: 425-430) и колоректального рака (Hinoi T. и др. CDX2 regulates liver intestine-cadherin expression in normal and malignant colon epithelium and intestinal metaplasia. Gastroenterology, 2002, 123: 1565-1577; Park J.H. и др. Comparison of cadherin-17 expression between primary colorectal adenocarcinomas and their corresponding metastases: the possibility of a diagnostic marker for detecting the primary site of metastatic tumour. Histopathology, 2011, 58: 315-318; Bartolomé R.A. и др. Cadherin-17 interacts with α2β1 integrin to regulate cell proliferation and adhesion in colorectal cancer cells causing liver metastasis. Oncogene, 2014, 33(13): 1658-69). CDH17 отсутствует на нормальных клетках тканей желудка, тогда как более 75% опухолевых клеток при РЖ экспрессируют CDH17 (Dong W.G. и др. LI-cadherin is inversely correlated with galectin-3 expression in gastric cancer. Dig Dis Sci, 2008, 53: 1811-1817). Высокий уровень экспрессии CDH17 ассоциируется с прогрессирующим РЖ и с неблагоприятным прогнозом (Ito R. и др. Clinicopathological significant and prognostic influence of cadherin-17 expression in gastric cancer. Virchows Arch, 2005, 447: 717-722), а также с метастазированием в лимфоузлах (Ko S. и др. Overexpression of LI-cadherin in gastric cancer is associated with lymph node metastasis. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 319: 562-568). Нокаутирование гена CDH17 при помощи лентивирусной микро-РНК ингибирует пролиферацию, адгезию, рост опухоли и метастазирование клеток линии BGC823 РЖ человека в экспериментах in vitro и in vivo (Liu Q.S. и др. Lentiviral-mediated miRNA against liver-intestine cadherin suppresses tumor growth and invasiveness of human gastric cancer. Cancer Sci, 2010, 101: 1807-1812; Zhang J. и др. Blockade of proliferation and migration of gastric cancer via targeting CDH17 with an artificial microRNA. Med Oncol, 2011, 28: 494-501; Xu Y. и др. Knockdown of liver-intestine cadherin decreases BGC823 cell invasiveness and metastasis in vivo. World J Gastroenterol, 2012, 18: 3129-3137). Таким образом, CDH17 является онкогеном и онкомаркером для диагностики РЖ (Su M.C. и др. Cadherin-17 is a useful diagnostic marker for adenocarcinomas of the digestive system. Mod Pathol, 2008, 21: 1379-1386). Было установлено, что в клетках гепатоцеллюлярной карциномы действие CDH17 опосредуется через сигнальный путь Wnt (Liu L.X. и др. Targeting cadherin-17 inactivates Wnt signaling and inhibits tumor growth in liver carcinoma. Hepatology, 2009, 50: 1453-1463). В случае с РЖ было показано, для CDH17-индуцированного онкогенеза и метастазирования происходит активация NFkB сигнального пути (Wang и др. Cadherin-17 induces tumorigenesis and lymphatic metastasis in gastric cancer through activation of NFκB signaling pathway. Cancer Biol Ther, 2013, 14: 262-270). При раке прямой кишки CDH17 активирует сигнальный путь с альфа2-бэта1 интегрином, что приводит к активации Ras и адгезивных киназ, что в свою очередь ведет к повышению адгезии и пролиферации опухолевых клеток (Bartolomé R.A. и др. Cadherin-17 interacts with α2β1 integrin to regulate cell proliferation and adhesion in colorectal cancer cells causing liver metastasis. Oncogene, 2014, 33(13): 1658-69). Что является основным сигнальным путем для CDH17 при раке желудка, остается до конца невыясненным. В работе Lin со авторами (Lin Z. И др. Targeting cadherin-17 inactivates Ras/Raf/MEK/ERK signaling and inhibits cell proliferation in gastric cancer. PLoS One. 2014, 9(1):e85296) была показана реализация пути integrin-Ras/Raf/MEK/ERK для клеток РЖ, в этой же работе авторы установили, что при подавлении CDH17 наступает явное ингибирование пролиферации, миграции, адгезии опухолевых клеток, угнетается формирование колоний клеток, индуцируется апоптоз.Cadherin-17 (CDH17) is one of the members of the superfamily of the seven-domain cadherins, it is present on the cells of the liver and the gastrointestinal tract in embryogenesis, therefore its second name is the liver-intestinal cadherin (LI cadherin). CDH17 is expressed on hepatocellular carcinoma cells (Liu LX et al. Targeting cadherin-17 inactivates Wnt signaling and inhibits tumor growth in liver carcinoma. Hepatology, 2009, 50: 1453-1463; Wong BW et al. Identification of liver-intestine cadherin in hepatocellular carcinoma - a potential disease marker. Biochem Biophys Res Commun., 2003, 311: 618-624), gastric cancer (Grotzinger C. et al. LI-cadherin: a marker of gastric metaplasia and neoplasia. Gut, 2001, 49: 73 -81), pancreatic duct cancer (Takamura M. et al., Expression of liver-intestine cadherin and its possible interaction with galectin-3 in ductal adenocarcinoma of the pancreas. Cancer Sci., 2003, 94: 425-430) and colorectal cancer (Hinoi T. et al. CDX2 regulates liver intestine-cadherin expression in normal and malignant colon epithelium and intestinal metaplasia. Gastroenterolog y, 2002, 123: 1565-1577; Park J.H. et al. Comparison of cadherin-17 expression between primary colorectal adenocarcinomas and their corresponding metastases: the possibility of a diagnostic marker for detecting the primary site of metastatic tumor. Histopathology, 2011, 58: 315-318; Bartolomé R.A. et al. Cadherin-17 interacts with α2β1 integrin to regulate cell proliferation and adhesion in colorectal cancer cells causing liver metastasis. Oncogene, 2014, 33 (13): 1658-69). CDH17 is absent on normal gastric tissue cells, while more than 75% of tumor cells in cancer express CDH17 (Dong WG et al. LI-cadherin is inversely correlated with galectin-3 expression in gastric cancer. Dig Dis Sci, 2008, 53: 1811- 1817). A high level of expression of CDH17 is associated with progressive cancer and with an unfavorable prognosis (Ito R. et al. Clinicopathological significant and prognostic influence of cadherin-17 expression in gastric cancer. Virchows Arch, 2005, 447: 717-722), as well as metastasis in lymph nodes (Ko S. et al. Overexpression of LI-cadherin in gastric cancer is associated with lymph node metastasis. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 319: 562-568). Knocking out the CDH17 gene with lentiviral micro-RNA inhibits proliferation, adhesion, tumor growth and metastasis of human BGC823 cells in human in vitro and in vivo experiments (Liu QS et al. Lentiviral-mediated miRNA against liver-intestine cadherin suppresses tumor growth and invasiveness of human gastric cancer. Cancer Sci, 2010, 101: 1807-1812; Zhang J. et al. Blockade of proliferation and migration of gastric cancer via targeting CDH17 with an artificial microRNA. Med Oncol, 2011, 28: 494-501; Xu Y. et al. Knockdown of liver-intestine cadherin decreases BGC823 cell invasiveness and metastasis in vivo. World J Gastroenterol, 2012, 18: 3129-3137). Thus, CDH17 is an oncogen and tumor marker for diagnosing pancreatic cancer (Su M.C. et al. Cadherin-17 is a useful diagnostic marker for adenocarcinomas of the digestive system. Mod Pathol, 2008, 21: 1379-1386). It was found that in hepatocellular carcinoma cells the effect of CDH17 is mediated via the Wnt signaling pathway (Liu L.X. et al. Targeting cadherin-17 inactivates Wnt signaling and inhibits tumor growth in liver carcinoma. Hepatology, 2009, 50: 1453-1463). In the case of cancer, it has been shown that for CDH17-induced oncogenesis and metastasis, the NFkB signaling pathway is activated (Wang et al. Cadherin-17 induces tumorigenesis and lymphatic metastasis in gastric cancer through activation of the NFκB signaling pathway. Cancer Biol Ther, 2013, 14: 262-270). In colorectal cancer, CDH17 activates the signaling pathway with alpha2-beta1 integrin, which leads to the activation of Ras and adhesive kinases, which in turn leads to increased adhesion and proliferation of tumor cells (Bartolomé RA et al. Cadherin-17 interacts with α2β1 integrin to regulate cell proliferation and adhesion in colorectal cancer cells causing liver metastasis. Oncogene, 2014, 33 (13): 1658-69). What is the main signaling pathway for CDH17 in gastric cancer remains unclear. Lin et al. (Lin Z. et al. Targeting cadherin-17 inactivates Ras / Raf / MEK / ERK signaling and inhibits cell proliferation in gastric cancer. PLoS One. 2014, 9 (1): e85296) showed the implementation of the integrin pathway -Ras / Raf / MEK / ERK for RG cells, in the same work, the authors found that when CDH17 is suppressed, there is a clear inhibition of proliferation, migration, and adhesion of tumor cells, the formation of cell colonies is inhibited, and apoptosis is induced.

В настоящее время известны антитела против кадгерина-17 человека, описанные в публикациях заявок РСТ WO 2010123874 A1 и WO 2012/054084 А3 компании Oxford Biotherapeutics Ltd. (GB), а также в патентной заявке Японии JP 2017024991 A (заявитель - Университет Токио, (JP)) и в публикации заявки РСТ WO 2017120557 А1 (заявитель - компания Arbele Limited (CN)).Antibodies against human cadherin-17 are currently known, as described in PCT application publications WO 2010123874 A1 and WO 2012/054084 A3 of Oxford Biotherapeutics Ltd. (GB), as well as in Japanese Patent Application JP 2017024991 A (Applicant is University of Tokyo, (JP)) and in the publication of PCT Application WO 2017120557 A1 (Applicant is Arbele Limited (CN)).

Однако существует насущная необходимость в получении новых антител против кадгерина-17 человека с улучшенными характеристиками.However, there is an urgent need for new antibodies against human cadherin-17 with improved characteristics.

Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Несмотря на то, что несколько вариантов антител против кадгерина-17 (CDH17) человека известны из предшествующего уровня техники, существует насущная необходимость в получении новых антител против кадгерина-17 человека с целью расширения арсенала таких антител и получения антител с улучшенными характеристиками.Despite the fact that several variants of antibodies against human cadherin-17 (CDH17) are known from the prior art, there is an urgent need for new antibodies against human cadherin-17 in order to expand the arsenal of such antibodies and obtain antibodies with improved characteristics.

Целью настоящего изобретения является получение мышиных антител, связывающихся с кадгерином-17 человека, определение последовательностей вариабельных доменов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей указанных антител и получение антигенсвязывающих фрагментов (Fab) мышиного антитела, связывающихся с кадгерином-17 человека.The aim of the present invention is to obtain murine antibodies that bind to human cadherin-17, the definition of sequences of the variable domains of the heavy (VH) and light (VL) chains of these antibodies and to obtain antigen-binding fragments (Fab) of a mouse antibody that binds to human cadherin-17.

Указанная цель была достигнута путем выделения двух мышиных антител 1Е6 и 2G6 против слитых белков, содержащих фрагменты кадгерина-17 человека (24-132аа и 581-678аа) с тиоредоксином и обладающих способностью к связыванию кадгерина-17 человека, и определения последовательности их вариабельных участков.This goal was achieved by isolating two murine antibodies 1E6 and 2G6 against fusion proteins containing human cadherin-17 fragments (24-132aa and 581-678aa) with human thioredoxin and capable of binding human cadherin-17, and determining the sequence of their variable regions.

Настоящее изобретение представляет собой вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела 1Е6, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.The present invention is a variable region of the heavy chain (VH) of antibody 1E6 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

Также настоящее изобретение представляет собой вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела 2G6, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4The present invention also provides a variable region of the heavy chain (VH) of a 2G6 antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4

Также настоящее изобретение представляет собой антигенсвязывающий фрагмент (Fab), содержащий указанные вариабельные участки антитела 1Е6 или указанные вариабельные участки антитела 2G6.Also, the present invention is an antigen binding fragment (Fab) comprising said variable regions of antibody 1E6 or said variable regions of antibody 2G6.

Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings

На Фиг. 1 показан дот-блот анализ шести антител 1E6, 2A11, 2B2, 2B4, 2B6, 2G6 с использованием слитых белков CDH17(581-678aa)-Trx и CDH17(24-132aa)-Trx при различных концентрациях белков.In FIG. Figure 1 shows a dot blot analysis of six 1E6, 2A11, 2B2, 2B4, 2B6, 2G6 antibodies using CDH17 (581-678aa) -Trx and CDH17 (24-132aa) -Trx fusion proteins at different protein concentrations.

На Фиг. 2 показан дот-блот анализ шести антител 1E6, 2A11, 2B2, 2B4, 2B6, 2G6 с использованием слитых белков CDH17(581-678aa)-Trx и CDH17(24-132aa)-Trx, а также слитого белка ММР14 с тиоредоксином, использованного в качестве отрицательного контроля.In FIG. Figure 2 shows a dot blot analysis of six antibodies 1E6, 2A11, 2B2, 2B4, 2B6, 2G6 using the fusion proteins CDH17 (581-678aa) -Trx and CDH17 (24-132aa) -Trx, as well as the fusion protein MMP14 with thioredoxin used as a negative control.

На Фиг. 3 показаны результаты Вестерн-блот анализа содержания CDH17 в тотальных белковых экстрактах опухолевых и нормальных тканей толстой кишки (дорожки 1 и 2, соответственно, 20 мкг тотального белка на дорожку). Слева - окраска антителом 2G6, справа - антителом 1Е6. Слева указаны молекулярные массы белков стандарта (кДа).In FIG. Figure 3 shows the results of a Western blot analysis of the content of CDH17 in total protein extracts of tumor and normal colon tissue (lanes 1 and 2, respectively, 20 μg of total protein per lane). Left - staining with 2G6 antibody, right - antibody 1E6. The molecular weights of standard proteins (kDa) are indicated on the left.

На Фиг. 4 показаны результаты иммунофлуоресцентного анализа для антитела 1Е6. Сверху - изображение клеток в световом поле, снизу - изображение тех же клеток с использованием флуоресцентного фильтраIn FIG. 4 shows the results of an immunofluorescence assay for antibody 1E6. Above is an image of cells in a light field, below is an image of the same cells using a fluorescent filter.

На Фиг. 5 показаны результаты иммунофлуоресценного анализа для антитела 1Е6. Сверху - изображение клеток в световом поле, снизу - изображение тех же клеток с использованием флуоресцентного фильтраIn FIG. 5 shows the results of an immunofluorescence assay for antibody 1E6. Above is an image of cells in a light field, below is an image of the same cells using a fluorescent filter.

На Фиг. 6 показаны результаты иммунофлуоресценного анализа для антитела ПолиАТ. Сверху - изображение клеток в световом поле, снизу - изображение тех же клеток с использованием флуоресцентного фильтраIn FIG. 6 shows the results of an immunofluorescence assay for a PolyAT antibody. Above is an image of cells in a light field, below is an image of the same cells using a fluorescent filter.

На Фиг. 7 показаны результаты иммунофлуоресценного анализа для антитела ПолиАТ. Сверху - изображение клеток в световом поле, снизу - изображение тех же клеток с использованием флуоресцентного фильтраIn FIG. 7 shows the results of an immunofluorescence assay for a PolyAT antibody. Above is an image of cells in a light field, below is an image of the same cells using a fluorescent filter.

На Фиг. 8 показаны результаты определения константы диссоциации (Kd) для антител 1Е6 и 2G6.In FIG. Figure 8 shows the results of determining the dissociation constant (Kd) for antibodies 1E6 and 2G6.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь также содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий фрагмент (Fab). Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя, а CDRs образуют петли, связывающие конструкцию из бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в непосредственной близости друг от друга благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat и др., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987) в сочетании с рентгеноструктурной кристаллографией, как описано в публикации WO 91/09967.Antibodies usually consist of two heavy chains linked together by disulfide bonds, and light chains associated with the N-terminus of each of the heavy chains. Each heavy chain contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain at the other end. Each light chain also contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain. The variable domains of each pair of light and heavy chains form an antigen-binding fragment (Fab). The variable domains of the light and heavy chains have a similar overall structure, and each domain includes a framework of four regions, the sequences of which are relatively conservative, linked through three regions that complementarity determining (complementarity determining regions, CDRs). Four frame sections form a beta-fold type conformation, and CDRs form loops connecting the beta-fold structure. Plots CDRs are located in close proximity to each other due to the frame sections and contribute to the formation of antigennegative plot. Plots of CDRs and frame regions of antibodies can be determined by reference to the Kabat numbering system (Kabat numbering system, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987) in combination with x-ray crystallography, as described in publication WO 91/09967.

Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler и др. Nature, 1975, 256:495-497), получившую название гибридόмной технологии. Суть метода сводится к получению культуры «бессмертных» гибридов (гибридόм) путем слияния плазматической клетки (В-лимфоцита, продуцирующего антитела) и опухолевой клетки (миеломы или плазмацитомы). Полученная гибридόма способна продуцировать моноклональные антитела (как В-клетка) и при этом бесконечно делится (как опухолевая клетка), что позволяет достаточно долгое время секретировать in vitro или in vivo антитело, специфическое для целевого антигена.To obtain antibodies that can bind to any specific antigen, they usually use the methodology of Kohler and Milstein (Kohler et al. Nature, 1975, 256: 495-497), called hybrid technology. The essence of the method is to obtain a culture of “immortal” hybrids (hybrid) by fusion of a plasma cell (B-lymphocyte producing antibodies) and a tumor cell (myeloma or plasmacytoma). The resulting hybrid is capable of producing monoclonal antibodies (like a B cell) and at the same time it divides endlessly (like a tumor cell), which allows secreting an antibody specific for the target antigen in vitro or in vivo for a rather long time.

Слияние клеток происходит под действием полиэтиленгликоля, изолецитина или вируса Сендай. На следующем этапе необходимо отобрать неслившиеся с лимфоцитами миеломные клетки (неслившиеся лимфоциты убирать не нужно: через недолгое время они погибнут сами). В процессе такой селекции гибридόмные клетки высаживают на среды, содержащие вещества, блокирующие синтез нуклеотидов миеломными клетками. Для этого выведены специальные мутантные миеломные клеточные линии, дефектные по некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов.Cell fusion occurs under the influence of polyethylene glycol, isolecithin or Sendai virus. At the next stage, it is necessary to select myeloma cells that are not fused with lymphocytes (you do not need to remove fused lymphocytes: after a short time they will die themselves). In the process of such selection, hybrid cells are planted on media containing substances that block the synthesis of nucleotides by myeloma cells. For this, special mutant myeloma cell lines were discovered that are defective in some enzymes involved in the synthesis of nucleotides.

Отбор гибридόм, секретирующих нужные антитела, проводится путем проверки среды, в которой росли клетки, на предмет наличия в ней антител нужной специфичности.The selection of hybridomas secreting the desired antibodies is carried out by checking the environment in which the cells grew, for the presence of antibodies of the desired specificity in it.

Таким образом отбирают клетки, секретирующие антитела стабильно и в достаточном количестве. Большой объем антител нарабатывают или in vitro, или путем введения гибридом в перитонеальную полость мышей для получения асцита (Свешников, П.Г. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию. П.Г. Свешников, В.В. Малайцев, И.М. Богданова, О.Н. Солопова, изд. МГУ, М., 2006).In this way, cells secreting antibodies are stably and in sufficient quantity selected. A large volume of antibodies is produced either in vitro or by introducing hybridomas into the peritoneal cavity of mice to obtain ascites (Sveshnikov, P.G. Introduction to molecular immunology and hybridoma technology. P.G. Sveshnikov, V.V. Malaytsev, I.M. Bogdanova, O.N. Solopova, ed. Of Moscow State University, M., 2006).

Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекций животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например, использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, модифицирование антигена такими способами как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, гемоцианин улитки, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри, например, Harlow и др. Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988.The preparation of material used as an antigen for injection of animals includes methods well known in the art, for example, the use of a full-sized protein, the use of a peptide selected from immunogenic regions of the protein, modification of the antigen by methods such as, for example, binding to dinitrophenol, binding with arsanilic acid, antigen denaturation, antigen binding to a carrier protein, such as, for example, snail hemocyanin, with peptides containing receptor binding sites -cells class II, with the beads, as well as any other methods known in the art. See, for example, Harlow et al. Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988.

В частности, антителами, обладающими способностью к связыванию с кадгерином-17 человека, являются антитела, содержащие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи согласно настоящему изобретению. Указанные вариабельные домены тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, а вариабельные домены легкой цепи антитела (VL) содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, необходимые для функционирования указанного антитела. Изолированный антигенсвязывающий фрагмент (Fab) согласно настоящему изобретению, селективно связывающийся с кадгерином-17 человека, включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1 и вариабельный домен легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2; или вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 4In particular, antibodies having the ability to bind to human cadherin-17 are antibodies containing the variable domains of the heavy and light chains according to the present invention. Said monoclonal antibody heavy chain variable domains contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and antibody light chain variable domains (VL) contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 necessary for functioning the specified antibodies. The isolated antigen binding fragment (Fab) of the present invention selectively binding to human cadherin-17 includes a heavy chain variable domain (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable domain (VL) with the amino acid sequence of SEQ ID NO : 2; or the variable domain of the heavy chain (VH) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the variable domain of the light chain (VL) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4

В настоящем изобретении фраза “антитело или Fab, обладающие способностью к связыванию с кадгерином-17 человека” означает молекулу, которая связывается с кадгерином-17 человека, образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса с использованием описанных здесь методов. Термин “селективно связывается с кадгерином-17 человека” означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с кадгерином-17 человека в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к кадгерину-17 человека, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антитело или Fab, которые предпочтительно связываются с кадгерином-17 человека, являются антитело или Fab, которые связываются с кадгерином-17 человека, но не связываются в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Такое существенное связывание предполагает, например, связывание антитела или Fab, связывающихся с кадгерином-17 человека, с молекулой, не являющейся кадгерином-17 человека, с аффиностью или силой недостаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с кадгерином-17 человека, определить уровень кадгерина-17 человека в образце. Примерами таких молекул и компонентов, которые могут присутствовать в образце, являются, но не ограничиваются ими, белки, не являющиеся кадгерином-17 человека, липиды и углеводы.In the present invention, the phrase “antibody or Fab having the ability to bind to human cadherin-17” means a molecule that binds to human cadherin-17, forms a stable complex. A stable complex is a complex in which binding between partners occurs for a period of time sufficient to detect the specified complex using the methods described here. The term “selectively binds to human cadherin-17” means the ability of the molecule to bind preferably to human cadherin-17, as opposed to binding to proteins unrelated to human cadherin-17, or to binding to non-protein components present in the sample. An antibody or Fab that preferably binds to human cadherin-17 is an antibody or Fab that binds to human cadherin-17 but does not substantially bind to other molecules or components that may be present in the sample. Such substantial binding involves, for example, binding of an antibody or Fab binding to human cadherin-17 to a non-human cadherin-17 molecule with an affinity or strength insufficient to interfere with the ability of an antibody to bind to human cadherin-17 to determine human cadherin-17 level in the sample. Examples of such molecules and components that may be present in a sample include, but are not limited to, non-human cadherin-17 proteins, lipids, and carbohydrates.

Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом ELISA и равновесным диализом. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).The ability of an antibody or Fab to bind to an antigen can be determined by a person skilled in the art using methods including, but not limited to, ELISA and equilibrium dialysis. Methods for determining affinity and binding strength are well known to those skilled in the art, described in detail by Janeway et al. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).

Fab, пригодный для осуществления настоящего изобретения, - это Fab, обладающий способностью к связыванию с кадгерином-17 человека, когда концентрация кадгерина-17 человека составляет от около 10 нг/мл и до около 10 пг/мл. В частности, пригодные в рамках настоящего изобретения Fab связывают кадгерин-17 человека, когда концентрация кадгерина-17 человека составляет 10 нг/мл, около 1 нг/лм или менее, предпочтительно 100 пг/мл. Такие антитела и Fab описаны в сопутствующих Примерах.A Fab suitable for carrying out the present invention is a Fab having the ability to bind to human cadherin-17, when the concentration of human cadherin-17 is from about 10 ng / ml to about 10 pg / ml. In particular, Fabs useful in the framework of the present invention bind human cadherin-17 when the concentration of human cadherin-17 is 10 ng / ml, about 1 ng / lm or less, preferably 100 pg / ml. Such antibodies and Fab are described in the accompanying Examples.

Fab моноклональных мышиных антител в соответствии с настоящим изобретением, которые селективно связываются с кадгерином-17 человека, также могут быть получены с использованием подходящей гибридόмы. Гибридόмы могут быть выращены в питательной среде, и накопленные антитела могут быть выделены. Здесь и далее термин "выращиваемые клетки" относится к гибридόмам или другим линиям клеток, которые производят антитела. Способы получения и проверки таких выращиваемых клеток описаны Harlow и др. (см. выше). Методы получения антигенного материала для инъекций в животное включают в себя методы, известные из уровня техники, например, использование полноразмерного белка, пептидов, выбранных из иммуногенного участка этого белка, модифицирование антигена такими способами как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, гемоцианин улитки, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).Fab monoclonal murine antibodies in accordance with the present invention, which selectively bind to human cadherin-17, can also be obtained using a suitable hybrid. Hybrids can be grown in culture medium and accumulated antibodies can be isolated. Hereinafter, the term "grown cells" refers to hybridomas or other cell lines that produce antibodies. Methods for the preparation and verification of such cultured cells are described by Harlow et al. (See above). Methods for producing antigenic material for injection into an animal include methods known in the art, for example, the use of a full-sized protein, peptides selected from the immunogenic region of the protein, modifying the antigen by methods such as, for example, binding to dinitrophenol, binding to arsanilic acid, denaturation of antigen, binding of antigen to a carrier protein, such as, for example, snail hemocyanin, with peptides containing binding sites for class II T-cell receptors, beads, as well as e by any other methods known in the art. See Harlow et al. (See above).

Fab, связывающиеся с кадгерином-17 человека, согласно настоящему изобретению, могут включать в себя многофункциональные молекулы, например, бифункциональные молекулы, содержащие, по крайней мере, одну функциональную часть, которая специфически связывается с кадгерином-17 человека. Такие многофункциональные молекулы могут включать в себя, например, химерные молекулы, включающие в себя молекулу, которая связывается с кадгерином-17 человека, и вторую часть, которая дает возможность данной химерной молекуле связываться с субстратом или позволяет детектировать ее способом, при котором связывание с кадгерином-17 человека не ухудшаются. Примерами таких вторых частей являются, но не ограничиваются ими, фрагменты молекулы иммуноглобулина, флуоресцентный белок или фермент. Также Fab, связывающиеся с кадгерином-17 человека, согласно настоящему изобретению, могут быть модифицированы полиэтиленгликолем, т.е. пегилированы.Fabs that bind to human cadherin-17, according to the present invention, may include multifunctional molecules, for example, bifunctional molecules containing at least one functional part, which specifically binds to human cadherin-17. Such multifunctional molecules may include, for example, chimeric molecules, including a molecule that binds to human cadherin-17, and a second part that allows the chimeric molecule to bind to the substrate or allows it to be detected in a manner in which binding to cadherin -17 people do not worsen. Examples of such second parts are, but are not limited to, fragments of an immunoglobulin molecule, a fluorescent protein, or an enzyme. Also, Fabs binding to human cadherin-17 according to the present invention can be modified with polyethylene glycol, i.e. pegylated.

Термин "взаимодействие", использованный здесь, означает введение, добавление образца, предположительно содержащего кадгерин-17 человека, к Fab, связывающему кадгерин-17 человека, например, путем объединения или смешения образца с Fab. В случае, если кадгерин-17 человека присутствует в образце, образуется комплекс Fab с кадгерином-17 человека; образование такого комплекса означает способность Fab селективно связываться с кадгерином-17 человека с образованием стабильного комплекса, который может быть детектирован. Детектирование может быть качественным, количественным или полуколичественным. Связывание кадгерина-17 человека из образца с Fab происходит в условиях, подходящих для формирования комплекса. Такие условия (например, подходящие концентрации, буферы, температура, время реакции), а также методы оптимизации таких условий хорошо известны специалисту в данной области техники. Связывание может быть обнаружено и измерено с использованием множества методов, являющихся стандартными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные методы иммунохимии (например, ELISA), иммунопреципитации, методы иммуноблотинга и другие методы иммунохимии, описанные, например, Sambrook J. и др. (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) и Harlow и др. (см. выше). Эти ссылки также описывают примеры условий, в которых образуется комплекс.The term “interaction”, as used herein, means introducing, adding a sample, presumably containing human cadherin-17, to a Fab binding human cadherin-17, for example, by combining or mixing the sample with Fab. If human cadherin-17 is present in the sample, a Fab complex with human cadherin-17 is formed; the formation of such a complex means the ability of Fab to selectively bind to human cadherin-17 to form a stable complex that can be detected. Detection can be qualitative, quantitative or semi-quantitative. The binding of human cadherin-17 from the sample to the Fab occurs under conditions suitable for complex formation. Such conditions (e.g., suitable concentrations, buffers, temperature, reaction time), as well as methods for optimizing such conditions, are well known to those skilled in the art. Binding can be detected and measured using a variety of methods that are standard in the art, including, but not limited to, enzymatic immunochemistry methods (e.g., ELISA), immunoprecipitation, immunoblot methods and other immunochemistry methods described, for example, Sambrook J. et al. (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and Harlow et al. (see above). These links also describe examples of conditions in which the complex is formed.

Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров, и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например в Sambrook, J. и др. (см. выше).Methods for obtaining plasmid DNA, DNA cleavage and ligation, transformation, selection of oligonucleotides as primers, and similar methods can be standard methods well known to those skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J. et al. (See above).

Последующие примеры приведены для целей разъяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The following examples are provided for purposes of explanation and do not in any way limit the scope of the present invention.

Пример 1. Получение мышиных антител против кадгерина-17 человека.Example 1. Obtaining murine antibodies against human cadherin-17.

Для получения антител мышей линии BALB/c (самки массой 16-18 г.) иммунизировали дважды с интервалом в 2 недели в подушечки задних лап раствором иммуногена в полном (для первой иммунизации) или неполном (для второй иммунизации) адъюванте Фрейнда. В качестве иммуногена использовали рекомбинантные слитые белки фрагментов кадгерина 17 человека (24-132 аа и 581-678 аа) с тиоредоксином (Trx). Во всех случаях на одну иммунизацию брали 25 мкг белка, белок вводили в виде эмульсии, полученной из раствора белка в фосфатно-солевом буфере и равного объема полного (1-я иммунизация) или неполного (2-я иммунизация) адъюванта Фрейнда.To obtain antibodies, BALB / c mice (females weighing 16-18 g.) Were immunized twice with an interval of 2 weeks in the pads of the hind legs with an immunogen solution in complete (for the first immunization) or incomplete (for the second immunization) Freund's adjuvant. As an immunogen, recombinant fusion proteins of human cadherin fragments 17 (24-132 aa and 581-678 aa) with thioredoxin (Trx) were used. In all cases, 25 μg of protein was taken per immunization, the protein was injected in the form of an emulsion obtained from a solution of protein in phosphate-buffered saline and an equal volume of the complete (1st immunization) or incomplete (2nd immunization) Freund adjuvant.

Тестирование сывороток и культуральных супернатантов проводили при помощи непрямого иммуноферментного анализа (Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G., Immunochemistry. 1971, 8(9): P.871-4). Для этого рекомбинантные белки CDH17 (Sinobiological, Кат. №11360-H08H-100 Human Cadherin-17 / LI-cadherin / CDH17 Protein (His Tag)) сорбировали в течение ночи при 4°С на полистирольные планшеты из раствора в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 1 мкг/мл и затем вносили сыворотки в серийных разведениях или культуральные супернатанты на 1 ч при 37°С. Связавшиеся с иммобилизованным антигеном МкАт выявляли с помощью козьих антител против IgG (H + L) мыши, конъюгированных с пероксидазой при помощи периодатного метода (Peroxidase and fluorescein isothiocyanate as antibody markers. A quantitative comparison of two peroxidase conjugates prepared with glutaraldehyde or periodate and a fluorescein conjugate. Broorsma DM, Steefkerk JG, Kors N. J Histochem Cytochem. 1976 Sep; 24(9):1017-25. нужна ссылка на источник), в течение 1 ч при 37°С. В качестве субстрата использовали раствор тетраметилбензидина (ТМВ) с перекисью водорода. Оптическую плотность регистрировали при 450 нм. Результаты анализа приведены в Таблице 1.Testing of sera and culture supernatants was performed using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G., Immunochemistry. 1971, 8 (9): P.871-4). For this, recombinant CDH17 proteins (Sinobiological, Cat. No. 11360-H08H-100 Human Cadherin-17 / LI-cadherin / CDH17 Protein (His Tag)) were sorbed overnight at 4 ° C on polystyrene plates from solution in phosphate-buffered saline with a concentration of 1 μg / ml and then serum was added in serial dilutions or culture supernatants for 1 h at 37 ° C. Associated with the immobilized antigen MkAt were detected using goat antibodies against mouse IgG (H + L) conjugated to peroxidase using the periodic method (Peroxidase and fluorescein isothiocyanate as antibody markers. A quantitative comparison of two peroxidase conjugates prepared with glutaraldehyce or period conjugate. Broorsma DM, Steefkerk JG, Kors N. J Histochem Cytochem. 1976 Sep; 24 (9): 1017-25. link to the source is needed), for 1 h at 37 ° С. A solution of tetramethylbenzidine (TMB) with hydrogen peroxide was used as a substrate. The optical density was recorded at 450 nm. The results of the analysis are shown in Table 1.

На 4-й день после второй иммунизации лимфоциты из подколенных узлов гибридизовали с миеломными клетками Sp 2/0-Agl4 по стандартной методике с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 (Monoclonal Antibody Production. National Research Council (US) Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies. Washington (DC): National Academies Press (US); 1999.). Гибридомы отбирали на селективной среде HAT, тестировали в непрямом ИФА и дважды клонировали методом предельных разведений.On the 4th day after the second immunization, the lymphocytes from the popliteal nodes hybridized with Sp 2/0-Agl4 myeloma cells according to the standard method using polyethylene glycol with a molecular weight of 4000 (Monoclonal Antibody Production. National Research Council (US) Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Washington (DC): National Academies Press (US); 1999.). Hybridomas were selected on HAT selective medium, tested in indirect ELISA and cloned twice by limiting dilution method.

Антитела нарабатывали в асцитных жидкостях мышей, для этого мышам, предварительно праймированных пристаном, вводили внутрибрюшинно по 106 клеток каждого клона. Очистку антител из асцитных жидкостей проводили аффинной хроматографией на колонке с белок-G сефарозой по стандартной методике (Jungbauer, A. и др. Comparison of protein A, protein G and copolymerized hydroxyapatite for the purification of human monoclonal antibodies, J. Chromatogr. 1989, 476: 257-268). Чистоту выделенных антител контролировали при помощи SDS-ПААГ электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS и DTT в ступенчатой буферной системе Лэмлли, используя Mini PROTEAN 3 Electrophoresis System BIO-RAD, Catalog N 165-3301 (Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227: 680-685). Чистота всех полученных антител составила не менее 95%.Antibodies were generated in ascites liquids of mice; for this, 10 6 cells of each clone were intraperitoneally injected into mice previously primed with a pier. Antibodies from ascites liquids were purified by protein-G sepharose column affinity chromatography according to the standard procedure (Jungbauer, A. et al. Comparison of protein A, protein G and copolymerized hydroxyapatite for the purification of human monoclonal antibodies, J. Chromatogr. 1989, 476: 257-268). The purity of the isolated antibodies was monitored by SDS-PAGE electrophoresis in 12% polyacrylamide gel in the presence of SDS and DTT in the Lamley step buffer system using the Mini PROTEAN 3 Electrophoresis System BIO-RAD, Catalog N 165-3301 (Laemmli, UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227: 680-685). The purity of all obtained antibodies was at least 95%.

Всего было получено 6 клонов на новые рекомбинантные слитые белки кадгерин-тиоредоксин: один клон на слитой белок кадгерин-17 человека (24-132 аа) - тиоредоксин (клон 1E6) и пять клонов на слитой белок кадгерин-17 человека (581-678 аа) - тиоредоксин (клоны 2A11, 2B2, 2B4, 2B6, 2G6).A total of 6 clones were obtained for new recombinant cadherin-thioredoxin fusion proteins: one clone for human cadherin-17 fusion protein (24-132 aa) - thioredoxin (clone 1E6) and five clones for human cadherin-17 fusion protein (581-678 aa ) - thioredoxin (clones 2A11, 2B2, 2B4, 2B6, 2G6).

Пример 2. Характеристика полученных мышиных моноклональных антител против кадгерина-17.Example 2. Characterization of the obtained murine monoclonal antibodies against cadherin-17.

Иммуноферментный анализ.Linked immunosorbent assay.

Антитела из указанных 6-ти клонов тестировали в иммуноферментном анализе с фрагментами CDH17 24-132aa и CDH17 581-678аа как описано выше в Примере 1. Результаты анализа приведены в Таблицах 2А и 2Б. На основании результатов анализа были выбраны два наиболее эффективно связывающихся антитела: 1E6 и 2G6.Antibodies from these 6 clones were tested in an enzyme-linked immunosorbent assay with fragments CDH17 24-132aa and CDH17 581-678aa as described above in Example 1. The results of the analysis are shown in Tables 2A and 2B. Based on the results of the analysis, two most efficiently binding antibodies were selected: 1E6 and 2G6.

Два указанных антитела также тестировали в иммуноферментном анализе с внеклеточным доменом кадгерина-17, коммерческого препарата (Sinobiological, Кат. №:11360-H08H-100 Human Cadherin-17 / LI-cadherin / CDH17 Protein (His Tag). Кадгерин-17 сорбировали в концентрации 0,8 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали ПолиАТ-коммерческую поликлональную иммунную сыворотку кролика против кадгерина 17 (Sigma, Кат. № HPA026556). Результаты анализа приведены в Таблице 3.The two antibodies were also tested in an enzyme-linked immunosorbent assay with the extracellular domain of cadherin-17, a commercial preparation (Sinobiological, Cat. No: 11360-H08H-100 Human Cadherin-17 / LI-cadherin / CDH17 Protein (His Tag). Cadherin-17 was sorbed in concentration of 0.8 μg / ml as a positive control used PolyAT-commercial polyclonal immune serum of the rabbit against cadherin 17 (Sigma, Cat. No. HPA026556). The results of the analysis are shown in Table 3.

Дот-блот анализ.Dot blot analysis.

Анализ проводили с использованием слитых белков CDH17(581-678aa)-Trx и CDH17(24-132aa)-Trx. Слитые белки наносили на нитроцеллюлозную мембрану в количестве 1 нг, 100 пг, 10 пг или 1 пг на пятно. Результаты анализа показаны на Фиг. 1.The analysis was performed using CDH17 (581-678aa) -Trx and CDH17 (24-132aa) -Trx fusion proteins. Fusion proteins were applied to the nitrocellulose membrane in an amount of 1 ng, 100 pg, 10 pg or 1 pg per spot. The analysis results are shown in FIG. one.

Результаты анализа с использованием слитых белков CDH17(581-678aa)-Trx и CDH17(24-132aa)-Trx, а также слитого белка ММР14 с тиоредоксином, использованного в качестве отрицательного контроля, показаны на Фиг. 2. Белки наносили на мембрану в количестве 10 нг на пятно.The results of the analysis using the fusion proteins CDH17 (581-678aa) -Trx and CDH17 (24-132aa) -Trx, as well as the fusion protein MMP14 with thioredoxin, used as a negative control, are shown in FIG. 2. Proteins were applied to the membrane in an amount of 10 ng per spot.

Вестерн блот.Western blot.

Вестерн блот проводили по стандартной методике (Towbin H. и др. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76(9): 4350-4354) с использованием тотальных белковых экстрактов опухолевых и нормальных тканей толстой кишки (дорожки 1 и 2, соответственно; 20 мкг тотального белка на дорожку). Результаты анализа показаны на Фиг. 3.Western blot was performed according to the standard method (Towbin H. et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA, 1979.76 (9): 4350-4354) using total protein extracts of tumor and normal colon tissue (lanes 1 and 2, respectively; 20 μg of total protein per lane). The analysis results are shown in FIG. 3.

Иммунофлуоресцентный анализ.Immunofluorescence analysis.

Для постановки анализа готовили стекла с прикрепленными клетками. Для этого клетки снимали с поверхности культурального флакона раствором ФСБ-ЭТ, подсчитывали в камере Горяева, центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 минут, ресуспендировали в полной ростовой среде и затем переносили в культуральные чашки Петри. На дно чашек Петри клали покровные стекла размером 18мм×18мм.Glasses with attached cells were prepared for analysis. For this, the cells were removed from the surface of the culture vial with an FSB-ET solution, counted in a Goryaev chamber, centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes, resuspended in complete growth medium, and then transferred to Petri culture dishes. At the bottom of the Petri dishes, glass coverslips measuring 18 mm × 18 mm were placed.

Сливали среду с чашек Петри со стеклами, стекла доставали, промывали ФСБ, затем клали в чашки Петри, выстланные парафильмом.The medium was poured from Petri dishes with glasses, the glasses were removed, washed with FSB, then placed in Petri dishes lined with parafilm.

Наслаивали на стекла ФСБ с добавлением 4% параформальдегида, инкубировали 15 минут для фиксации клеток.Layered on glass FSB with the addition of 4% paraformaldehyde, incubated for 15 minutes to fix the cells.

Стекла промывали холодным ФСБ 3 раза по 5 минут на шейкере.The glasses were washed with cold FSB 3 times for 5 minutes on a shaker.

Клетки пермеабилизовали инкубацией в ФСБ с добавлением 0,1% Triton X-100 в течение 10 минут.Cells were permeabilized by incubation in PBS supplemented with 0.1% Triton X-100 for 10 minutes.

Промывали холодным ФСБ 3 раза по 5 минут на шейкере.Washed with cold FSB 3 times for 5 minutes on a shaker.

Остатки альдегидных групп убирали 0,5M NH4Cl инкубацией в течение 5 минут. Промывали холодным ФСБ 3 раза по 5 минут на шейкере.Residues of the aldehyde groups were removed with 0.5M NH4Cl by incubation for 5 minutes. Washed with cold FSB 3 times for 5 minutes on a shaker.

Тщательно удаляли со стекол весь ФСБ, затем накапали на каждое стекло по 3-4 капли усилителя сигнала (Signal Enchancer (Image-iT® FX Signal Enhancer, ThermoFisher Scientific)), инкубировали в течение 30 минут.All FSB was carefully removed from the glasses, then 3-4 drops of a signal amplifier (Signal Enchancer (Image-iT® FX Signal Enhancer, ThermoFisher Scientific)) were dripped onto each glass, incubated for 30 minutes.

Промывали холодным ФСБ 3 раза по 5 минут на шейкере.Washed with cold FSB 3 times for 5 minutes on a shaker.

Стекла инкубировали в блокирующем буфере (ФСБ с добавлением 10% нормальной сыворотки козы, 1% бычьего альбумина и 0,1% Triton X-100) в течение 1 часа.Glasses were incubated in blocking buffer (PBS supplemented with 10% normal goat serum, 1% bovine albumin and 0.1% Triton X-100) for 1 hour.

Затем стекла инкубировали в течение 3-4 часов с первичными антителами 1E6, 2G6, 2A11, 2B2 и ПолиАТ (Sigma, Кат. № HPA026556), разведенными в блокирующем буфере до концентрации 10 мкг/мл.Then the glasses were incubated for 3-4 hours with primary antibodies 1E6, 2G6, 2A11, 2B2 and PolyAT (Sigma, Cat. No. HPA026556), diluted in blocking buffer to a concentration of 10 μg / ml.

Промывали холодным ФСБ 3 раза по 10 минут на шейкере.Washed with cold FSB 3 times for 10 minutes on a shaker.

Инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем в ФСБ с 1% бычьим альбумином в течение 1 часа. Для стекол с ПолиАТ использовали конъюгат анти-кроличий IgG с Alexa Fluor 555, для стекол с мышиными антителами использовали конъюгат анти-мышиный IgG с Alexa Fluor 488.Оба конъюгата брали в разведении 1:800-1:1000.Incubated with secondary antibodies conjugated to a fluorescent dye in PBS with 1% bovine albumin for 1 hour. For glasses with PolyAT, an anti-rabbit IgG conjugate with Alexa Fluor 555 was used; for glasses with mouse antibodies, an anti-mouse IgG conjugate with Alexa Fluor 488 was used. Both conjugates were taken at a dilution of 1: 800-1: 1000.

Промывали холодным ФСБ 3 раза по 5 минут на шейкере.Washed with cold FSB 3 times for 5 minutes on a shaker.

Чистые предметные стекла протирали, подписывали, наносили по капле буфера для заключения (Глицерин - 1М Tris pH 9 в объемном соотношении 1:9).Clean slides were wiped, signed, applied dropwise to the buffer for conclusion (Glycerin - 1M Tris pH 9 in a volume ratio of 1: 9).

Со стекол с клетками удаляли ФСБ, стороны стекол без клеток и ребра протирали фильтровальной бумагой для полного удаления жидкости. Затем стекла с клетками клали на предметные стекла клетками вниз. Излишки буфера для заключения убирали фильтровальной бумагой.FSB was removed from the glasses with cells, the sides of the glasses without cells and the ribs were wiped with filter paper to completely remove the liquid. Then the glasses with the cells were placed on the slides with the cells down. Excess buffer for conclusion was removed with filter paper.

Флуоресцентный сигнал фиксировали при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M c цифровой камерой (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия).The fluorescent signal was recorded using an Axiovert 200M inverted fluorescence microscope with a digital camera (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany).

Результаты для антитела 1Е6 представлены на Фиг. 4 и 5. Результаты для антитела ПолиАТ представлены на Фиг. 6 и 7. Результаты для антител 2G6, 2B2 и 2A11 не приведены, поскольку сигнала флуоресценции для этих антител не наблюдали.The results for antibody 1E6 are shown in FIG. 4 and 5. The results for the PolyAT antibody are shown in FIG. 6 and 7. The results for antibodies 2G6, 2B2, and 2A11 are not shown, since no fluorescence signal was observed for these antibodies.

Определение Kd.Definition of Kd.

Константу диссоциации (Kd) определяли по методике, описанной в работах Friguet B. и др., Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antiojdy Complex by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Journal of Immunological Methods, 1985, 77: 305-319; Klotz I.M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Archives of biochemistry, 1946, 9: 109-117. Результаты показаны на Фиг. 8.The dissociation constant (Kd) was determined according to the method described by Friguet B. et al., Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antiojdy Complex by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Journal of Immunological Methods, 1985, 77: 305- 319; Klotz I.M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Archives of biochemistry, 1946, 9: 109-117. The results are shown in FIG. 8.

Значение Кd антитела 1Е6 составило 4,5±0,02×10-9, значение Кd антитела 2G6 составило 3,5±0,02×10-9.The Kd value of antibody 1E6 was 4.5 ± 0.02 × 10 -9 , the Kd value of antibody 2G6 was 3.5 ± 0.02 × 10 -9 .

Пример 3. Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты мышиных моноклональных антител против кадгерина-17, используя мРНК из подходящих линий клеток в качестве матриц.Example 3. Cloning of genes encoding Fab fragments of mouse monoclonal antibodies against cadherin-17, using mRNA from suitable cell lines as matrices.

Тотальную РНК выделяли из 1×107 клеток подходящих гибридόм, содержащих антитела согласно настоящему изобретению против кадгерина-17. Клетки (107 клеток) два раза промывали однократным буфером PBS. В пробирку со 100 мкл клеток добавляли 400 мкл раствора GTB (4 M гуанидинтиоцинат, 30 мМ цитрат натрия, 1% N-лаурилсаркозил натрия, 120 мМ β-меркаптоэтанол). Клетки суспендировали пипетированием в течение 2-3 минут и помещали на лед. Затем добавляли 50 мкл 3M ацетата натрия (pH 5,2) и 500 мкл фенола, насыщенного водой, и полученную суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex. Затем добавляли 100 мкл смеси хлороформ - изоамиловый спирт, и суспензию тщательно перемешивали на мешалке Vortex в течение 1 мин с перерывами в 1 минуту. Суспензию откручивали в течение 10 мин и супернатант переносили в новую пробирку. Процедуру повторяли. Добавляли равный объем изопропанола (500 мкл) и хранили при -20°С. Образец откручивали в течение 10 минут, осадок промывали этанолом (70%) и растворяли в воде (50 мкл). Получали в целом 30 мкг РНК (0,60 мкг/мкл), которые использовали для дальнейшего синтеза кДНК.Total RNA was isolated from 1 × 10 7 cells of suitable hybridomas containing antibodies of the present invention against cadherin-17. Cells (10 7 cells) were washed twice with a single PBS buffer. 400 μl of a GTB solution (4 M guanidine thiocinate, 30 mM sodium citrate, 1% N-laurylsarcosyl sodium, 120 mM β-mercaptoethanol) was added to a test tube with 100 μl of cells. Cells were suspended by pipetting for 2-3 minutes and placed on ice. Then, 50 μl of 3M sodium acetate (pH 5.2) and 500 μl of phenol saturated with water were added, and the resulting suspension was thoroughly mixed on a Vortex mixer. Then, 100 μl of a mixture of chloroform - isoamyl alcohol was added, and the suspension was thoroughly mixed on a Vortex mixer for 1 min with 1 minute interruptions. The suspension was unscrewed for 10 minutes and the supernatant was transferred to a new tube. The procedure was repeated. An equal volume of isopropanol (500 μl) was added and stored at -20 ° C. The sample was untwisted for 10 minutes, the precipitate was washed with ethanol (70%) and dissolved in water (50 μl). A total of 30 μg RNA (0.60 μg / μl) was obtained, which was used for further cDNA synthesis.

кДНК синтезировали с использованием набора RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) в соответствии с “протоколом синтеза кДНК, подходящего для ПЦР”, рекомендованного производителем.cDNA was synthesized using the RevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) kit according to the “cDNA synthesis protocol suitable for PCR” recommended by the manufacturer.

Дизайн праймеров для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепь.Design primers for cloning a gene encoding a heavy chain.

Для того, чтобы идентифицировать пару праймеров, пригодных для клонирования гена, кодирующего тяжелую цепь, проводили ПЦР для клонирования с использованием ДНК полимеразы Tag (реакционная смесь содержала 10X буфер для ДНК полимеразы Tag (67 мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25°C), 166 мМ (NH4)2SO4, 100 мМ 2-меркаптоэтанола) + 20 мМ MgCl2, 1,25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), ДНК полимераза Taq (2,5 U), кДНК 1 мл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Тотальную кДНК использовали в качестве матрицы. Программа ПЦР была следующей: 95°C в течение 3 минут; 35 циклов 94°C в течение 1 минуты, 45°C в течение 1 минуты и 72°C в течение 1 минуты; в конце 72°C в течение 10 минут.In order to identify a pair of primers suitable for cloning a gene encoding a heavy chain, PCR was performed for cloning using Tag DNA polymerase (the reaction mixture contained 10X Tag DNA polymerase buffer (67 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 166 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 mM 2-mercaptoethanol) + 20 mM MgCl 2 , 1.25 mM dNTP, 5'-end primer (25 pmol), 3'-end primer (25 pmol) , Taq DNA polymerase (2.5 U), cDNA 1 ml, bidistilled water up to 50 μl). Total cDNA was used as template. The PCR program was as follows: 95 ° C for 3 minutes; 35 cycles of 94 ° C for 1 minute, 45 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute; at the end of 72 ° C for 10 minutes.

5'-Концевой праймер соответствовал набору из 16 дегенеративных праймеров А3-А11, В6-В12 (SEQ ID NO: 5-20, соответственно), узнающих 95% последовательностей сигнальных пептидов в генах, кодирующих тяжелую цепь, выложенных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, T., Perry, H. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH).The 5'-terminal primer corresponded to a set of 16 degenerative primers A3-A11, B6-B12 (SEQ ID NO: 5-20, respectively) recognizing 95% of the sequences of signal peptides in the heavy chain encoding genes laid out in the Kabat database (Kabat , E., Wu, T., Perry, H. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH).

В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР использовали:As the 3'-terminal primer in PCR used:

- праймер A12, комплементарный аминокислотам 141-147 CH1 домена IgG, с введенным сайтом SalI (SEQ ID NO: 21),primer A12, complementary to amino acids 141-147 of the CH1 IgG domain, with the SalI site introduced (SEQ ID NO: 21),

- праймер A26, комплементарный 3'-концу гена, кодирующего CH1 домен антитела подкласса IgG1, с введенным сайтом XhoI (SEQ ID NO: 22).primer A26, complementary to the 3'-end of the gene encoding the CH1 domain of an antibody of the IgG1 subclass, with the XhoI site introduced (SEQ ID NO: 22).

Агарозный электрофорез продуктов ПЦР показал, что существуют пары праймеров, приводящие к образованию ПЦР фрагментов ожидаемого размера (Таблица 4).Agarose electrophoresis of PCR products showed that there are pairs of primers leading to the formation of PCR fragments of the expected size (Table 4).

Размеры полученных ПЦР фрагментов хорошо согласуются с ожидаемыми последовательностями кДНК генов тяжелой цепи IgG Mus musculus, представленной в Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.The sizes of the obtained PCR fragments are in good agreement with the expected cDNA sequences of Mus musculus IgG heavy chain genes presented in Gene-Bank and IMGT-GENE-DB.

Дизайн праймеров для клонирования гена, кодирующего легкую цепь.Design primers for cloning a gene encoding a light chain.

Ранее было показано, что изучаемое антитело содержит легкую цепь типа каппа. На основании этих данных в качестве 5'-концевого праймера использовали набор из 23 дегенеративных праймеров А15-А23, В1-В5, С1-С10 (SEQ ID NO: 23-46, соответственно). Этот набор узнает 95% последовательностей, соответствующих сигнальным пептидам в генах, кодирующих каппа цепь, опубликованных в базе данных Кабат (Kabat, E., Wu, T., Perry, H. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH).It was previously shown that the antibody under study contains a kappa-type light chain. Based on these data, a set of 23 degenerative primers A15-A23, B1-B5, C1-C10 (SEQ ID NO: 23-46, respectively) was used as the 5'-terminal primer. This kit recognizes 95% of the sequences corresponding to signal peptides in the kappa chain encoding genes published in the Kabat database (Kabat, E., Wu, T., Perry, H. 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th edn. US Departament of Health and Human Services, Public Health Service, NIH).

В качестве 3'-концевого праймера в ПЦР, соответствовавшего 3`-концу легкой цепи фрагмента Fab (каппа-тип), с введенным на 5'-конец сайтом XhoI, использовали праймер L-m-r (SEQ ID NO: 47).A primer L-m-r (SEQ ID NO: 47) was used as the 3'-end primer in PCR corresponding to the 3`-end of the light chain of the Fab fragment (kappa type) with the XhoI site inserted at the 5'-end.

Агарозный электрофорез продуктов ПЦР показал, что существуют пары праймеров, приводящие к образованию ПЦР фрагментов ожидаемого размера (Таблица 5).Agarose electrophoresis of PCR products showed that there are pairs of primers leading to the formation of PCR fragments of the expected size (Table 5).

Размеры полученных ПЦР фрагментов хорошо согласуются с ожидаемыми последовательностями кДНК генов легкой цепи IgG Mus musculus, представленной в Gene-Bank и IMGT-GENE-DB.The sizes of the obtained PCR fragments are in good agreement with the expected cDNA sequences of Mus musculus IgG light chain genes presented in Gene-Bank and IMGT-GENE-DB.

Клонирование генов, кодирующих Fab фрагменты антител против кадгерина-17Cloning of genes encoding Fab fragments of antibodies against cadherin-17

Pfu ДНК полимеразу (Fermentas) использовали для клонирования генов, кодирующих цепи антитела. Условия ПЦР оптимизировали подбором температуры отжига и концентрации Mg2+ (реакционная смесь содержала 10X буфер для Pfu ДНК полимеразы (200 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C), 100 мМ (NH4)2SO4, 100 мМ KCl, 1% Тритон X-100, 1 мг/мл БСА) + 20мМ MgCl2, 1.25 мМ dNTP, 5'-концевой праймер (25 пмоль), 3'-концевой праймер (25 пмоль), Pfu ДНК полимераза (1.25 U), кДНК 1 мкл, бидистиллированная вода до 50 мкл). Программа для ПЦР была следующая: 95°C в течение 3 минут; 35 циклов 94°C в течение 1 минуты, 45°C в течение 1 минуты и 72°C в течение 2 минут; в конце 72°C в течение 10 минут.Pfu DNA polymerase (Fermentas) was used to clone genes encoding antibody chains. The PCR conditions were optimized by selecting the annealing temperature and Mg 2+ concentration (the reaction mixture contained 10X Pfu DNA polymerase buffer (200 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 100 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 mM KCl, 1% Triton X-100, 1 mg / ml BSA) + 20 mM MgCl 2 , 1.25 mM dNTP, 5'-terminal primer (25 pmol), 3'-terminal primer (25 pmol), Pfu DNA polymerase (1.25 U), cDNA 1 μl, bidistilled water up to 50 μl). The program for PCR was as follows: 95 ° C for 3 minutes; 35 cycles of 94 ° C for 1 minute, 45 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes; at the end of 72 ° C for 10 minutes.

Пример 4. Секвенирование фрагментов генов, кодирующих вариабельные части Fab-фрагмента мышиного моноклонального антитела против кадгерина-17.Example 4. Sequencing of fragments of genes encoding the variable parts of the Fab fragment of the mouse monoclonal antibody against cadherin-17.

ПЦР-фрагменты, содержащие гены цепей Fab-фрагмента антител против кадгерина-17, элюировали из агарозного геля и секвенировали с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems. В качестве праймеров для определения последовательностей фрагментов генов использовали праймеры, с помощью которых клонировали гены антител против кадгерина-17.PCR fragments containing the chain genes of the anti-cadherin-17 antibody Fab fragment were eluted from the agarose gel and sequenced using the ABI PRISM® BigDye ™ Terminator v reagent kit. 3.1 followed by analysis of the reaction products on an ABI PRISM 3730 Applied Biosystems automated DNA sequencer. As primers for determining sequences of gene fragments, primers were used to clone anti-cadherin-17 antibody genes.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела 1E6 против кадгерина-17 человека приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.The amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of the mouse antibody 1E6 against human cadherin-17 is shown in the sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела 1E6 против кадгерина-17 человека приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.The amino acid sequence of the variable domain of the light chain of the mouse antibody 1E6 against human cadherin-17 is shown in the sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела 2G6 против кадгерина-17 человека приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 3.The amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of a murine 2G6 antibody against human cadherin-17 is shown in the sequence Listing under the number SEQ ID NO: 3.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела 2G6 против кадгерина-17 человека приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 4.The amino acid sequence of the variable domain of the light chain of mouse 2G6 anti-human cadherin-17 antibodies is shown in the sequence Listing under the number SEQ ID NO: 4.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные в настоящем описании документы являются частью настоящей заявки, целиком включенные в настоящее описание посредством ссылки.Although the present invention has been described in detail with reference to preferred embodiments thereof, it will be apparent to one skilled in the art that various substitutions can be made and equivalents applied that are not outside the scope of the present invention. All documents cited in the present description of the documents are part of the present application, which is fully incorporated into the present description by reference.

Таблица 1. Результаты ИФА. Тестирование сывороток. Сыворотки 1 и 2 титровали от разведения 1/500 с шагом 2. Сыворотка 1 - от иммунизации слитым белком CDH (24-132аа) - Trx, Сыворотка 2 - от иммунизации слитым белком CDH (581-678аа) - Trx.Table 1. The results of ELISA. Testing sera. Serum 1 and 2 were titrated from a 1/500 dilution in steps of 2. Serum 1 - from immunization with the CDH fusion protein (24-132aa) - Trx, Serum 2 - from immunization with the CDH fusion protein (581-678aa) - Trx.

Оптическая плотность, 450 нмOptical density, 450 nm СывороткаSerum 1one 22 1 / one / 500500 2,5342,534 2,4892,489 10001000 2,1472,147 2,2912,291 20002000 1,8541,854 2,1952,195 40004000 1,4481,448 2,0262,026 80008000 1,0761,076 1,7971,797 1600016000 0,7340.734 1,4081,408 3200032000 0,4730.473 1,0441,044 00 0,1970.197 0,2310.231

Таблица 2. Результаты ИФА. Тестирование антител.Table 2. The results of ELISA. Antibody Testing

А. Сорбирован фрагмент CDH17 24-132aa.A. Sorbed fragment CDH17 24-132aa.

МоАт, нг/млMoAt, ng / ml 2A112A11 2B22B2 2B42B4 2B62B6 2G62g6 1E61E6 10001000 0,1940.194 0,1290.129 0,1290.129 0,130.13 0,0980,098 3,0783,078 300300 0,1220.122 0,0810,081 0,1740.174 0,0850,085 0,0830,083 2,8462,846 100one hundred 0,1080.108 0,0710,071 0,0680,068 0,0630,063 0,0670,067 2,8642,864 30thirty 0,1060.106 0,0760,076 0,070,07 0,0660,066 0,0650,065 2,7642,764 1010 0,0930,093 0,0680,068 0,0720,072 0,0670,067 0,070,07 2,4282,428 33 0,0940,094 0,0730,073 0,0690,069 0,0670,067 0,1190.119 1,6611,661 1one 0,0990,099 0,0740,074 0,0690,069 0,0690,069 0,0720,072 0,8690.869 00 0,10.1 0,0950,095 0,0950,095 0,0950,095 0,0940,094 0,0930,093

Б. Сорбирован фрагмент CDH17 581-678ааB. Sorbed fragment CDH17 581-678aa

МоАт, нг/млMoAt, ng / ml 2A112A11 2B22B2 2B42B4 2B62B6 2G62g6 1E61E6 10001000 2,7662,766 2,5512,551 0,8170.817 0,6810.681 2,4282,428 0,2130.213 300300 2,5942,594 2,652.65 0,4150.415 0,5850.585 2,5832,583 0,1390.139 100one hundred 2,0472,047 2,2172,217 0,2070,207 0,4710.471 2,6172,617 0,0990,099 30thirty 1,3151,315 1,5081,508 0,1430.143 0,3580,358 2,2022,202 0,1020.102 1010 0,620.62 0,830.83 0,0830,083 0,2920.292 1,3251,325 0,0950,095 33 0,3050,305 0,4110.411 0,0710,071 0,1880.188 0,7440.744 0,0880,088 1one 0,1570.157 0,2130.213 0,0770,077 0,1480.148 0,3790.379 0,0960,096 00 0,0930,093 0,0980,098 0,0930,093 0,0920,092 0,0980,098 0,1120,112

Таблица 3. Результаты ИФА. Тестирование антител 2G6 и 1E6 с использованием коммерческого препарата кадгерина 17 (Sinobiological, Кат. №11360-H08H-100 Human Cadherin-17 / LI-cadherin / CDH17 Protein (His Tag). Кадгерин-17 сорбировали в концентрации 0,8 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали коммерческую поликлональную иммунную сыворотку кролика против кадгерина-17 (Sigma, Кат. № HPA026556)Table 3. The results of ELISA. Testing of 2G6 and 1E6 Antibodies Using Commercial Cadherin 17 (Sinobiological, Cat. No. 11360-H08H-100 Human Cadherin-17 / LI-cadherin / CDH17 Protein (His Tag). Cadherin-17 was sorbed at a concentration of 0.8 μg / ml Commercial rabbit polyclonal immune serum against cadherin-17 was used as a positive control (Sigma, Cat. No. HPA026556)

Сорбция CDH-17, 0,8 мкг/млSorption of CDH-17, 0.8 μg / ml Концентрация, нг/млConcentration, ng / ml поли Атpoly at МоАт 2G6Moat 2G6 МоАт 1E6Moat 1E6 10001000 2,4522,452 2,5332,533 2,7122,712 300300 2,2752,275 2,652.65 2,7352,735 100one hundred 2,0452,045 2,6562,656 2,7622,762 30thirty 1,7011,701 2,1752,175 2,4672,467 1010 1,1771,177 1,2641,264 1,8261,826 33 0,5920.592 0,5940.594 0,9240.924 1one 0,2650.265 0,250.25 0,3480.348 00 0,0480,048 0,0580.058 0,0630,063

Таблица 4. Электрофорез ПЦР фрагментов генов тяжелой цепи антител в агарозном геле.Table 4. Electrophoresis of PCR fragments of antibody heavy chain genes in an agarose gel.

ГибридомаHybridoma ТипType of Прямой праймерDirect primer Обратный праймерReverse primer ПЦР фрагмент, поPCR fragment, by CDH1 E6CDH1 E6 IgG2aIgG2a A7 (SEQ ID NO: 9)A7 (SEQ ID NO: 9) A12 (SEQ ID NO: 21)A12 (SEQ ID NO: 21) ≈450≈450 CDH2 G6CDH2 G6 IgG1IgG1 A5 (SEQ ID NO: 7)A5 (SEQ ID NO: 7) A26 (SEQ ID NO: 22)A26 (SEQ ID NO: 22) ≈700≈700

Таблица 5. Электрофорез ПЦР фрагментов генов легкой цепи антител в агарозном геле.Table 5. Electrophoresis of PCR fragments of the genes of the light chain antibodies in an agarose gel.

ГибридомаHybridoma ТипType of Прямой праймерDirect primer Обратный праймерReverse primer ПЦР фрагмент, поPCR fragment, by CDH1 E6CDH1 E6 каппаkappa A19 (SEQ ID NO: 27)A19 (SEQ ID NO: 27) L-m-r (SEQ ID NO: 47)L-m-r (SEQ ID NO: 47) ≈700≈700 CDH2 G6CDH2 G6 каппаkappa A20 (SEQ ID NO: 28)A20 (SEQ ID NO: 28) L-m-r (SEQ ID NO: 47)L-m-r (SEQ ID NO: 47) ≈700≈700

Claims (3)

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (Fab), селективно связывающееся(-ийся) с кадгерином-17 человека, которое(-ый) включает в себя вариабельный домен тяжёлой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен лёгкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 4.1. An antibody or antigen binding fragment (Fab) thereof that selectively binds to human cadherin-17, which comprises a heavy chain variable domain (VH) with an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light variable domain chain (VL) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 2. Вариабельный домен тяжёлой цепи (VH) мышиного антитела против кадгерина-17 человека по п. 1, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3.2. The variable domain of the heavy chain (VH) of a mouse antibody against human cadherin-17 according to claim 1, containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. 3. Вариабельный домен лёгкой цепи (VL) мышиного антитела против кадгерина-17 человека по п. 1, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4.3. The variable domain of the light chain (VL) of a mouse anti-human cadherin-17 antibody according to claim 1, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
RU2018116026A 2018-04-27 2018-04-27 Variable domains of a light and heavy chain of a human cathegerin-17 mouse monoclonal antibody, an antigen-binding fragment (fab) against human cadherin-17, containing said domains RU2703949C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018116026A RU2703949C1 (en) 2018-04-27 2018-04-27 Variable domains of a light and heavy chain of a human cathegerin-17 mouse monoclonal antibody, an antigen-binding fragment (fab) against human cadherin-17, containing said domains

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018116026A RU2703949C1 (en) 2018-04-27 2018-04-27 Variable domains of a light and heavy chain of a human cathegerin-17 mouse monoclonal antibody, an antigen-binding fragment (fab) against human cadherin-17, containing said domains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2703949C1 true RU2703949C1 (en) 2019-10-22

Family

ID=68318256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018116026A RU2703949C1 (en) 2018-04-27 2018-04-27 Variable domains of a light and heavy chain of a human cathegerin-17 mouse monoclonal antibody, an antigen-binding fragment (fab) against human cadherin-17, containing said domains

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2703949C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113999308A (en) * 2021-12-30 2022-02-01 深圳市人民医院 Nano antibody targeting cadherin 17 and application thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100092978A1 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 The University Of Hong Kong Cadherin-17 as diagnostic marker and therapeutic target for liver cancer
EA201300470A1 (en) * 2010-10-20 2014-05-30 Оксфорд Байотерепьютикс Лтд. ANTIBODIES
WO2016169581A1 (en) * 2015-04-20 2016-10-27 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Agents binding specifically to human cadherin-17, human cadherin-5, human cadherin-6 and human cadherin-20 rgd motif

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100092978A1 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 The University Of Hong Kong Cadherin-17 as diagnostic marker and therapeutic target for liver cancer
EA201300470A1 (en) * 2010-10-20 2014-05-30 Оксфорд Байотерепьютикс Лтд. ANTIBODIES
WO2016169581A1 (en) * 2015-04-20 2016-10-27 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Agents binding specifically to human cadherin-17, human cadherin-5, human cadherin-6 and human cadherin-20 rgd motif

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU, LING XIAO, et al. "Targeting cadherin‐17 inactivates Wnt signaling and inhibits tumor growth in liver carcinoma." Hepatology, 2009, 50(5): 1453-1463. *
WANG, YONGGANG, et al. "Anti-cadherin-17 antibody modulates beta-catenin signaling and tumorigenicity of hepatocellular carcinoma." PloSone, 2013, 8(9): e72386. *
WANG, YONGGANG, et al. "Anti-cadherin-17 antibody modulates beta-catenin signaling and tumorigenicity of hepatocellular carcinoma." PloSone, 2013, 8(9): e72386. LIU, LING XIAO, et al. "Targeting cadherin‐17 inactivates Wnt signaling and inhibits tumor growth in liver carcinoma." Hepatology, 2009, 50(5): 1453-1463. ПАЛЬЦЕВА Е.М. и др. "Влияние предоперационной лекарственной терапии на экспрессию молекул адгезии в метастазах колоректального рака в печени." Архив патологии, 2015, 3: 10-16. *
ПАЛЬЦЕВА Е.М. и др. "Влияние предоперационной лекарственной терапии на экспрессию молекул адгезии в метастазах колоректального рака в печени." Архив патологии, 2015, 3: 10-16. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113999308A (en) * 2021-12-30 2022-02-01 深圳市人民医院 Nano antibody targeting cadherin 17 and application thereof
CN113999308B (en) * 2021-12-30 2022-03-11 深圳市人民医院 Nano antibody targeting cadherin 17 and application thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2758533T3 (en) Diagnostic use of antibodies against ROR1 protein
JP5941615B2 (en) Method for immunological measurement of human CXCL1 protein
AU2008246368A1 (en) Antibodies binding to an intracellular PRL-1 or PRL-3 polypeptide
CN108473552B (en) Antigenic composition for detecting specific autoantibody of exosome protein EIF3A and method for diagnosing liver cancer using same
JP2016500659A (en) Anti-uroplakin II antibody system and method
EP1544293A1 (en) Antibody against enzyme specifically cleaving von villebrand factor and assay system using the same
RU2703949C1 (en) Variable domains of a light and heavy chain of a human cathegerin-17 mouse monoclonal antibody, an antigen-binding fragment (fab) against human cadherin-17, containing said domains
KR102429562B1 (en) Biomarker for diagnosing hepatocellular carcinoma, Cereblon and novel monoclonal antibody specific to the same
KR101439856B1 (en) A marker comprising anti-ATIC autoantibodies and a composition comprising antigen thereof for diagnosing liver cancer
WO2012147918A1 (en) Monoclonal antibody for human telomerase reverse transcriptase
KR20100034720A (en) Pauf-specific human monoclonal antibody, pharmaceutical composition for treating cancer comprising the same and method for detecting cancer using the same
JP4651495B2 (en) Monoclonal antibody specifically reacting with ISG15 protein, hybridoma producing the same, and method for detecting cancer and virus infection
JP5857334B2 (en) Antibody for detecting epithelial ovarian cancer marker and method for determining epithelial ovarian cancer
KR102614063B1 (en) Novel antibodies specifically binding to Extradomain-B Fibronectin
JPWO2006004207A1 (en) Anti-Synoviolin antibody
WO2014047973A1 (en) Monoclonal antibodies specifically recognizing b-raf mutant proteins and preparation method and use thereof
TW201125580A (en) Anti- α -enolase I antibodies for diagnosis and treatment of α -enolase I-associated diseases
RU2499000C1 (en) VARIABLE DOMAINS OF LIGHT AND HEAVY CHAIN OF MURINE MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST TUMOUR NECROSIS FACTOR ALPHA (TNF-α) OF HUMAN BEING (VERSIONS); ANTIGEN-BINDING FRAGMENT (Fab) AGAINST TNF-α OF HUMAN BEING, WHICH CONTAINS ABOVE SAID DOMAINS (VERSIONS)
WO2006091326A1 (en) Anti-prl-3 antibodies and methods of use thereof
JP5492366B2 (en) Carbohydrate-deficient transferrin (CDT) specific antibodies, their production and use
KR102645065B1 (en) Anti-bromodomain-containing protein 2-specific autoantibody cancer biomarker, antigen composition for detection thereof, and liver cancer diagnosis method using the same
CN112724253B (en) Antibody of anti-human vault protein and application thereof
CN113214393B (en) IL-6 antibody or antigen-binding fragment thereof and detection kit comprising same
WO2012077643A1 (en) IMMUNOLOGICAL cofilin-1 PROTEIN MEASUREMENT METHOD
KR20230146591A (en) Novel anti-PAD4 antibody