RU2702609C1 - Method for simulating tuberculosis infection in vitro - Google Patents
Method for simulating tuberculosis infection in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2702609C1 RU2702609C1 RU2018129016A RU2018129016A RU2702609C1 RU 2702609 C1 RU2702609 C1 RU 2702609C1 RU 2018129016 A RU2018129016 A RU 2018129016A RU 2018129016 A RU2018129016 A RU 2018129016A RU 2702609 C1 RU2702609 C1 RU 2702609C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- tuberculosis
- vitro
- blood
- cell
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- G—PHYSICS
- G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
- G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
- G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
- G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/32—Mycobacterium
Abstract
Description
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к способам моделирования туберкулезной инфекции in vitro, и может быть использовано при изучении молекулярных и клеточных механизмов патогенеза туберкулеза, эффективности противотуберкулезных препаратов и прочих лекарственных веществ, влияющих на взаимодействие клеток иммунной системы больного человека с микобактерией туберкулеза.The invention relates to experimental medicine, namely to methods for modeling in vitro tuberculosis infection, and can be used to study the molecular and cellular mechanisms of the pathogenesis of tuberculosis, the effectiveness of anti-TB drugs and other drugs that affect the interaction of cells of the immune system of a sick person with mycobacterium tuberculosis.
Отличительной чертой туберкулезного процесса является формирование специфических гранулем, представляющих собой хорошо организованные динамичные клеточные структуры, основным составляющим компонентом которых являются клетки иммунной системы находящиеся на разной стадии дифференцировки и в разной функциональной активности. Формирование туберкулезной гранулемы начинается сразу после инфицирования человека за счет направленной миграции к очагу макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, нейтрофилов и прочих клеток преимущественно из периферической крови. В зависимости от выраженности и направленности иммунных реакций в гранулеме, микобактерия туберкулеза может элиминироваться, приводя к полному выздоровлению, либо длительно персистировать в гранулеме (так называемая латентная туберкулезная инфекция), либо активироваться, диссеминировать и вызывать активные формы туберкулеза. (1). Микобактерии туберкулеза, находясь внутриклеточно в гранулеме также претерпевают изменения, часто переходя в дормантное состояние и приобретая антибиотикорезистентность (2). Экспериментальные модели туберкулезной инфекции, основанные на использовании экспериментальных животных, из-за значительного отличия функционирования иммунной системы, не способны полностью охватить особенности иммунопатогенеза туберкулеза у человека (3), поэтому перспективным является использование моделей туберкулезной инфекции in vitro (1; 4).A distinctive feature of the tuberculosis process is the formation of specific granulomas, which are well-organized, dynamic cellular structures, the main component of which are the cells of the immune system at different stages of differentiation and in different functional activities. The formation of tuberculous granuloma begins immediately after infection of a person due to directed migration to the focus of macrophages, T- and B-lymphocytes, neutrophils and other cells mainly from peripheral blood. Depending on the severity and direction of the immune reactions in the granuloma, mycobacterium tuberculosis can be eliminated, leading to a complete recovery, or persist for a long time in the granuloma (the so-called latent tuberculosis infection), or be activated, disseminated and cause active forms of tuberculosis. (one). Mycobacterium tuberculosis, while being intracellular in the granuloma, also undergo changes, often turning into a dormant state and acquiring antibiotic resistance (2). Experimental models of tuberculosis infection based on the use of experimental animals, due to the significant difference in the functioning of the immune system, are not able to fully capture the characteristics of the immunopathogenesis of tuberculosis in humans (3), therefore, the use of in vitro models of tuberculosis infection is promising (1; 4).
Известно несколько способов моделирования трехмерных гранулематозиых структур in vitro, используемых для изучения взаимодействий микобактерий туберкулеза и клеток макроорганизма. В способе, предложенном К.А. Birkness и соавт.(5), использовались мононуклеарные клетки периферической крови в равных соотношениях с аутологичными макрофагами, к которым добавляли микобактерий туберкулеза. Культивирование клеток проводили на пластике с низкими адгезивными свойствами. В получавшихся при этом гранулемах часть клеток все равно прилипала к дну культуральной посуды и сформированные структуры носили смешанный двух-трехмериый характер. Причем агрегаты клеток были небольшими по размеру - до 10-15 клеток, а для получения более крупных структур требовалось добавление цитокинов (IL-2, TNFα или IFNγ), что является дополнительным артифициальным фактором и искажает протекающие в физиологических условиях процессы. Обязательное использование специального культуралыюго пластика с низкими адгезивными свойствами делает этот метод довольно дорогостоящим.Several methods are known for modeling three-dimensional granulomatous in vitro structures used to study the interactions of mycobacterium tuberculosis and macroorganism cells. In the method proposed by K.A. Birkness et al. (5) used peripheral blood mononuclear cells in equal proportions with autologous macrophages, to which mycobacterium tuberculosis was added. Cell cultivation was carried out on plastic with low adhesive properties. In the granulomas resulting from this, some of the cells still adhered to the bottom of the culture dish, and the formed structures were of a mixed two-three-dimensional nature. Moreover, the cell aggregates were small in size - up to 10-15 cells, and to obtain larger structures, the addition of cytokines (IL-2, TNFα or IFNγ) was required, which is an additional artifact factor and distorts the processes occurring under physiological conditions. The obligatory use of a special culture of low plastic with low adhesive properties makes this method quite expensive.
Известен также способ (6), при котором предлагается использовать агарозный гель, которым предварительно покрывают лунки 96-луиочного культурального планшета. Суспензия моиоиуклеарных клеток в культуральной среде на основе питательной среды RPMI помещается поверх застывшего агарозного геля. Дальнейшее культивирование осуществляется при избегании малейших механических воздействий - условие, которое надо соблюдать и при смене культуральной среды, иначе гранулемы не формируются. Выполнить это условие довольно сложно, что делает метод малонадежным. Использование в качестве матрикса линейного полисахарида агарозы нежелательно, так как она взаимодействует с рецепторами на поверхности макрофагов, меняя реактивность этих гранулем-образующих клеток. Кроме того, агароза - довольно дорогой по стоимости субстрат.There is also known a method (6), in which it is proposed to use an agarose gel with which the wells of a 96-well culture plate are pre-coated. A suspension of myo-cell cells in a culture medium based on RPMI nutrient medium is placed on top of a solidified agarose gel. Further cultivation is carried out while avoiding the slightest mechanical influences - a condition that must be observed when changing the culture medium, otherwise granulomas do not form. It is rather difficult to fulfill this condition, which makes the method unreliable. The use of a linear agarose polysaccharide as a matrix is undesirable, since it interacts with receptors on the surface of macrophages, changing the reactivity of these granuloma-forming cells. In addition, agarose is a fairly expensive substrate.
Описан способ (7), в котором трехразмерные туберкулезные гранулемы in vitro получали из мононуклеаров периферической крови, используя микрошарики сефарозы, покрытые микобактериальными антигенами, либо инфицированные микобактериями. Недостатком способа является необходимость использования инородного материала и, таким образом, существенные отличия структуры гранулем от тех, которые формируются при реальном заболевании.Method (7) is described in which three-dimensional in vitro tuberculosis granulomas were obtained from peripheral blood mononuclear cells using Sepharose beads coated with mycobacterial antigens or infected with mycobacteria. The disadvantage of this method is the need to use foreign material and, therefore, significant differences in the structure of granulomas from those that are formed in a real disease.
Наиболее близким к заявленному является способ формирования гранулем в коллагеновом матриксе (8), заключающийся в выделении мононуклеарных клеток периферической крови на градиенте плотности фиколла с последующим их суспендированием в растворе, состоящем из коллагена 95%, фибронектина 4% и NaOH 1%. При этом для формирования гранулемоподобных структур к 50 мкл раствора добавляется 50000 мононуклеарных клеток, микобактерий туберкулеза добавляются к клеткам в соотношении 1:10. Формирование трехмерной структуры происходит в течение 45 минут при температуре 37°С.Closest to the claimed one is a method for forming granulomas in a collagen matrix (8), which consists in isolating peripheral blood mononuclear cells on a density gradient of ficoll, followed by their suspension in a solution consisting of 95% collagen, 4% fibronectin and 1% NaOH. At the same time, 50,000 mononuclear cells are added to 50 μl of the solution to form granuloma-like structures, and tuberculosis mycobacteria are added to the cells in a ratio of 1:10. The formation of a three-dimensional structure occurs within 45 minutes at a temperature of 37 ° C.
Указанный способ имеет несколько недостатков:The specified method has several disadvantages:
1. В качестве веществ для формирования трехмерного матрикса используются коммерческие препараты коллаген и фибронектин, которые обладают иммуногенными свойствами и могут оказывать влияние на взаимодействие мононуклеарных клеток крови.1. As substances for the formation of a three-dimensional matrix, commercial preparations of collagen and fibronectin are used, which have immunogenic properties and can affect the interaction of mononuclear blood cells.
2. Технические особенности способа не позволяют использовать объем трехмерной структуры более 50 мкл с 50000 мононуклеарных клеток, что создает неудобства для манипуляций и накопления необходимого материала для исследований.2. The technical features of the method do not allow the use of a volume of a three-dimensional structure of more than 50 μl with 50,000 mononuclear cells, which creates inconvenience for manipulation and the accumulation of the necessary material for research.
3. Авторы указывают, что при других соотношениях микобактерий и мононуклеарных клеток, кроме как 1:10, гранулемы не формируются3. The authors indicate that with other ratios of mycobacteria and mononuclear cells, except 1:10, granulomas do not form
4. Длительное время формирования матрикса приводит к тому, что большая часть клеток оседает на дно и не участвует в формировании трехмерной гранулемоподобной структуры.4. The long formation time of the matrix leads to the fact that most of the cells settle to the bottom and are not involved in the formation of a three-dimensional granuloma-like structure.
Предлагаемый способ моделирования туберкулезной инфекции in vitro путем получения гранулемоподобных структур из мононуклеарных клеток венозной крови в присутствии микобактерий туберкулеза, культивируемых в трехмерном матриксе, отличающийся тем, что мононуклеарные клетки крови ресуспендируют в аутоплазме крови с добавлением в полученную взвесь микобактерий туберкулеза в соотношении возбудитель: клетка от 3:1 до 1:50, с последующим добавлением 10% CaCl2 из расчета 150 мкл на 1 мл клеточной суспензии, что позволяет более полно отобразить особенности иммунопагенеза туберкулезной инфекции у человека за счет использования аутологичных тканей, расширить возможности использования этой модели в эксперименте, за счет использования более широкого спектра соотношений микобактерия/клетка и привлечения других, участвующих в граунклемогенезе типов клеток, а также отказаться от использования дорогостоящих коммерческих реактивов и специфической аппаратуры. Кроме того, активация факторов свертывания крови наступает сразу после добавления CaCl2, плазматической сгусток формируется через 10-15 минут, при этом клетки не успевают осесть на дно культурального планшета и оказываются в фибриновой сети, которая, тем не менее, не мешает их направленной миграции. Использование в качестве матрикса аутологичной плазмы исключает артифициальные воздействия, связанные с использованием гетерологичных материалов. При использовании указанного способа, мы наблюдали формирование гранулем при добавлении микобактерий туберкулеза в соотношении к мононуклеарных клеткам от 3:1 до 1:50, что позволяет существенно расширить решаемые экспериментальные задачи. Еще одним преимуществом заявляемого способа является возможность его осуществления без применения дорогостоящих реактивов, что позволяет широко использовать его в практике научных исследований иммунопатологических механизмов гранулемогенеза при развитии туберкулезного процесса, изучении иммунологических механизмов, регулирующих процессы образования и эволюции гранулем при инфекционных гранулематозных воспалительных процессах, при поиске, разработке и изучении новых противотуберкулезных препаратов.The proposed method for modeling in vitro tuberculosis infection by obtaining granuloma-like structures from mononuclear cells of venous blood in the presence of tuberculosis mycobacteria cultured in a three-dimensional matrix, characterized in that the mononuclear blood cells are resuspended in the blood autoplasma with the addition of tuberculosis mycobacteria in the suspension in the ratio of the pathogen: cell 3: 1 to 1:50, followed by addition of 10% CaCl 2 from a rate of 150 l per 1 ml of cell suspension that allows more complete display especially immunopagenesis of tuberculosis infection in humans through the use of autologous tissues, expand the possibilities of using this model in the experiment, by using a wider range of mycobacteria / cell ratios and attract other cell types involved in granulomatogenesis, and also refuse to use expensive commercial reagents and specific equipment. In addition, the activation of blood coagulation factors occurs immediately after the addition of CaCl 2 , a plasma clot forms in 10-15 minutes, while the cells do not have time to settle to the bottom of the culture plate and end up in a fibrin network, which, however, does not interfere with their directed migration . The use of autologous plasma as a matrix excludes artifacts associated with the use of heterologous materials. When using this method, we observed the formation of granulomas with the addition of mycobacterium tuberculosis in the ratio of mononuclear cells from 3: 1 to 1:50, which allows us to significantly expand the experimental problems to be solved. Another advantage of the proposed method is the possibility of its implementation without the use of expensive reagents, which allows it to be widely used in the practice of scientific research of immunopathological mechanisms of granulomatogenesis in the development of the tuberculosis process, the study of immunological mechanisms that regulate the formation and evolution of granulomas in infectious granulomatous inflammatory processes, when searching, the development and study of new anti-TB drugs.
Способ осуществляется следующим образом: проводится забор периферической крови в стерильную одноразовую пробирку с хелатором двухвалентных катионов (ЭДТА или цитрат натрия). Выделение мононуклеарных клеток крови проводится центрифугированием на градиенте плотности, например, с использованием фиколла с плотностью 1,077 г/см3. После центрифугирования плазма крови собирается в отдельную пробирку и стерилизуется фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Полученные мононуклеарные клетки дважды отмываются от фиколла в культуральной среде или солевом буферном растворе, не содержащем кальция и магния. Далее мононуклеарные клетки ресуспендируются в аутоплазме в соотношении 1 млн клеток на 1 мл плазмы. К суспензии клеток добавляются микобактерий туберкулеза в соотношении микобактерия/клетка от 3:1 до 1:50 в зависимости от задач эксперимента. Суспензия мононуклеарных клеток и микобактерий туберкулеза в аутоплазме перемещается в лунки 96-луночного планшета в объеме 150 мкл. Активация образования плазматического сгустка, содержащего клетки и микобактерий, осуществляется добавлением 10% CaCl2 в количестве 150 мкл на 1 мл суспензии. Затем планшет инкубируется в течение 30 минут при 37°С, 5% CO2 и 96% влажности, и далее в лунки добавляется культуральная среда типа IMDM или RPMI-1640 в количестве 100 мкл. Смена среды выполняется через 24 часа и затем каждые 3-4 суток. При этом более 95% клеток сохраняют свою жизнеспособность на сроках 7 и 10 дней. Через 24 часа можно наблюдать формирование трехмерных структур, состоящих из мононуклеарных клеток периферической крови (моноциты и лимфоциты) размерами от 10 до 200 клеток - процесс, в основе которого лежит хемотаксис лимфоцитов к фагоцитировавшим микобактерий туберкулеза моноцитам. При наблюдении в более поздние сроки, клеточные структуры увеличиваются в размерах за счет привлечения новых клеток, моноциты подвергаются дифференцировке в макрофаги и, в дальнейшем, в эпителиоидные клетки – процесс, во многом напоминающий таковой при развитии туберкулезной инфекции у человека. При окраске с нитросиним тетразолием видно, что моноциты-макрофаги, расположенные в толще гранулемы, активируются с образованием активных форм кислорода, сами гранулемы состоят из моноцитов, макрофагов и лимфоцитов без примеси нейтрофилов и эритроцитов. Трехмерные гранулемоподобные структуры формируются также при добавлении к суспензии мононуклеарных клеток крови клеток иного гистогенетического происхождения (мезенхимальные стромальные клетки), лекарственных препаратов (рифамипицин), а также при использовании мононулеарных клеток лабораторного животного (спленоциты мыши).The method is as follows: the peripheral blood is collected in a sterile disposable tube with a chelator of divalent cations (EDTA or sodium citrate). Isolation of mononuclear blood cells is carried out by centrifugation on a density gradient, for example, using ficoll with a density of 1.077 g / cm 3 . After centrifugation, the blood plasma is collected in a separate tube and sterilized by filtration through a filter with a pore diameter of 0.22 μm. The obtained mononuclear cells are washed twice from ficoll in a culture medium or saline buffer solution that does not contain calcium and magnesium. Next, mononuclear cells are resuspended in autoplasma in the ratio of 1 million cells per 1 ml of plasma. Mycobacterium tuberculosis is added to the cell suspension in a ratio of mycobacteria / cell from 3: 1 to 1:50 depending on the objectives of the experiment. A suspension of mononuclear cells and mycobacterium tuberculosis in the autoplasma is transferred to the wells of a 96-well plate in a volume of 150 μl. The activation of the formation of a plasma clot containing cells and mycobacteria is carried out by adding 10% CaCl 2 in an amount of 150 μl per 1 ml of suspension. The plate is then incubated for 30 minutes at 37 ° C, 5% CO 2 and 96% humidity, and then culture medium such as IMDM or RPMI-1640 in the amount of 100 μl is added to the wells. The change of medium is carried out after 24 hours and then every 3-4 days. Moreover, more than 95% of the cells retain their viability for periods of 7 and 10 days. After 24 hours, one can observe the formation of three-dimensional structures consisting of peripheral blood mononuclear cells (monocytes and lymphocytes) ranging in size from 10 to 200 cells - a process based on chemotaxis of lymphocytes to monocytes phagocytosed with Mycobacterium tuberculosis. When observed at a later date, the cell structures increase in size due to the attraction of new cells, monocytes undergo differentiation into macrophages and, subsequently, into epithelioid cells - a process that is largely reminiscent of that during the development of tuberculosis infection in humans. When stained with nitro-blue tetrazolium, it can be seen that macrophage monocytes located in the granuloma layer are activated with the formation of reactive oxygen species, granulomas themselves are composed of monocytes, macrophages and lymphocytes without the admixture of neutrophils and red blood cells. Three-dimensional granuloma-like structures are also formed when cells of a different histogenetic origin (mesenchymal stromal cells), drugs (rifamipicin) are added to the suspension of mononuclear blood cells, as well as when mononuclear cells of a laboratory animal (mouse splenocytes) are used.
Пример 1. Вакуумную пробирку BD Vacutainer® СРТ™ для выделения моноцитов и лимфоцитов, содержащую цитрат натрия и разделительную систему гель/Ficoll™, заполняют кровью из локтевой вены человека, аккуратно тщательно перемешивают, центрифугируют при 1500 g 20 мин, затем плазму, находящуюся над поверхностью полученного мононуклеарного клеточного слоя отбирают пипеткой, переносят в отдельную пробирку и стерилизуют фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, мононуклеары переносят в другую пробирку и отмывают от фиколла и плазмы, для чего добавляют 10 мл раствора Хэнкса без ионов кальция и магния, центрифугируют 10 мин при 1500 g и супернатант осторожно декантируют; последнюю процедуру повторяют еще гранулемы, состоящие из 10-20 клеток в количестве 10-30 гранулем на лунку, причем в составе гранулем обнаруживаются CFSE-меченые клетки.Example 1. The BD Vacutainer® CPT ™ vacuum tube for isolating monocytes and lymphocytes containing sodium citrate and the gel / Ficoll ™ separation system is filled with blood from the human ulnar vein, carefully mixed, centrifuged at 1500 g for 20 minutes, then the plasma above the surface of the obtained mononuclear cell layer is pipetted, transferred to a separate tube and sterilized by filtration through a filter with a pore diameter of 0.22 μm, the mononuclear cells are transferred to another tube and washed from ficoll and plasma, for which purpose 10 ml of Hanks solution without calcium and magnesium ions, centrifuged 10 min at 1500 g and the supernatant carefully decanted off; the last procedure is repeated by granulomas, consisting of 10-20 cells in the amount of 10-30 granulomas per well, and CFSE-labeled cells are found in the granulomas.
Пример 4. Все процедуры идентичны таковым в Примере 1, но при смене культуральной среды в лунках планшета с гранулемами добавляли антибактериальный препарат рифампицин. После окончания культивирования через 10 при конфокальной микроскопии фиксированного плазматического сгустка наблюдали уменьшение количества микобактерий в гранулемах как вне-, так и внутриклеточно. Уменьшение микобактериальной нагрузки подтвердилось последующими микробиологическими методами при посеве гомогенизированного плазматического сгустка на твердые питательные среды. Аналогично, при смене культуральной среды использовали не рифампицин, а иммуномодулирующий препарат полудан, добавление которого приводило к увеличению клеточности трехмерных гранулемоподобных структур, уменьшению микобактериальной нагрузки.Example 4. All procedures are identical to those in Example 1, but when changing the culture medium in the wells of a tablet with granulomas, the antibacterial drug rifampicin was added. After cultivation, after 10, confocal microscopy of a fixed plasma clot showed a decrease in the number of mycobacteria in granulomas, both extra- and intracellularly. The decrease in mycobacterial load was confirmed by subsequent microbiological methods when plating a homogenized plasma clot on solid nutrient media. Similarly, when changing the culture medium, it was not rifampicin that was used, but an immunomodulatory drug, half-dan, the addition of which led to an increase in the cellularity of three-dimensional granuloma-like structures, and a decrease in mycobacterial load.
Способ опробован в экспериментальной лаборатории ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» Минзрава России. Общий объем экспериментальной работы представлен в таблице:The method was tested in the experimental laboratory of the FSBI "Novosibirsk Research Institute of Tuberculosis" of the Ministry of Health of Russia. The total amount of experimental work is presented in the table:
раз. Далее подсчитывают число выделенных клеток, ресуспендируют их в плазме в соотношении 1 млн клеток на 1 мл плазмы, к суспензии мононуклеарных клеток добавляют микобактерий туберкулеза в различных пропорциях микобактерия/клетка - от 3:1 до 1:50, перемешивают и переносят в лунки 96-луночного планшета в объеме по 150 мкл. Затем в лунки раскапывают по 15 мкл 10% раствора кальция хлорида, планшет помещают в СО2-инкубатор при 37°С, 5% CO2 и 96% влажности, и через 30 минут инкубации в лунки добавляют культуральную питательную среду RPMI-1640 в количестве 100 мкл. Через 24 часа в составе сгустка наблюдаются гранулематозные очаги размером 10-200 клеток в количестве от 10 до 30 гранулем на лунку.time. Next, the number of selected cells is counted, they are resuspended in plasma in the ratio of 1 million cells per 1 ml of plasma, mycobacterium tuberculosis in various proportions of mycobacteria / cell is added to the suspension of mononuclear cells from 3: 1 to 1:50, mixed and transferred to wells 96- well plate in a volume of 150 μl. Then, 15 μl of a 10% solution of calcium chloride are instilled into the wells, the plate is placed in a CO 2 incubator at 37 ° C, 5% CO 2 and 96% humidity, and after 30 minutes of incubation, RPMI-1640 culture medium is added to the wells in an amount 100 μl After 24 hours, granulomatous lesions with a size of 10-200 cells in an amount of 10 to 30 granulomas per well are observed in the clot.
Пример 2. Все процедуры идентичны таковым в Примере 1, за исключением того, что суспензию клеток в концентрации 1 млн на 1 мл получают не из мононуклеарных клеток крови человека, а из спленоцитов лабораторной мыши и используют аутоплазму кроми. В данном примере, предназначенном для демонстрации возможности формирования гранулем не из мононуклеаров крови, а из сложной смеси мононуклеаров и других клеток лабораторных животных, взвесь спленоцитов получали стандартным методом из селезенки мыши, а кровь - из ретроорбитального синуса. После 24-часовой инкубации в сгустках наблюдали сформированные гранулемы, состоящие из 5-15 клеток в количестве 15-30 гранулем на лунку.Example 2. All procedures are identical to those in Example 1, except that a suspension of cells at a concentration of 1 million per 1 ml is obtained not from human blood mononuclear cells, but from laboratory mouse splenocytes and autoplasma is used. In this example, designed to demonstrate the possibility of granulomas forming not from blood mononuclear cells, but from a complex mixture of mononuclear cells and other laboratory animal cells, a splenocyte suspension was obtained by the standard method from the mouse spleen, and blood from the retroorbital sinus. After a 24-hour incubation, formed granulomas were observed in clots, consisting of 5-15 cells in an amount of 15-30 granulomas per well.
Пример 3. Получают суспензию мононуклеаров в аутоплазме точно так же, как в Примере 1, но затем к суспензии мононуклеарных клеток добавляют клетки иного гистогенеза. В данном примере, предназначенном для демонстрации возможности изменения клеточной композиции гранулем, готовили суспензию, состоящую из 750 тыс.мононуклеаров крови и 250 тыс мезенхимальных стромальных клеток человека костно-мозгового происхождения, предварительно меченых флуоресцентным красителем CFSE. В результате через 24 часа инкубации в сгустке выявляются.Example 3. A suspension of mononuclear cells in the autoplasma is obtained in the same manner as in Example 1, but then cells of a different histogenesis are added to the suspension of mononuclear cells. In this example, designed to demonstrate the possibility of changing the cell composition of granulomas, a suspension was prepared consisting of 750 thousand blood mononuclear cells and 250 thousand human mesenchymal stromal cells of bone marrow origin, previously labeled with CFSE fluorescent dye. As a result, after 24 hours, incubations in the clot are detected.
При использовании указанного метода трехмерные гранулемоподобные структуры получали при спектре соотношений микобактерия/клетка от 3:1 до 1:50. Аналогичный результат получали при использовании спленоцитов лабораторной мыши. При добавлении к суспензии мононуклеарных клеток крови мехенхимальных клеток костномогового происхождения отмечали включение последних в состав гранулем с изменением клеточного состава гранулем и количества в них микобактерий. В серии экспериментов с добавлением антибактериального препарата отмечали изменение клеточности гранулем и микобактериальной нагрузки.Using this method, three-dimensional granuloma-like structures were obtained with a spectrum of mycobacteria / cell ratios from 3: 1 to 1:50. A similar result was obtained using laboratory mouse splenocytes. When mononuclear blood cells were added to the suspension of bone marrow-derived mechanochemical cells, the inclusion of the latter into the granulomas was noted with a change in the granulomas' cell composition and the number of mycobacteria in them. In a series of experiments with the addition of an antibacterial drug, a change in the granuloma cellularity and mycobacterial load were noted.
Таким образом, указанный метод позволяет стабильно получать трехмерные туберкулезные гранулемы in vitro без использования гетерологичных коммерческих препаратов, что позволяет исключить атрифициальные воздействия на тонкие механизмы взаимодействия клеток иммунной системы in vitro. Технологические особенности формирования трехмерного матрикса из аутоплазмы позволяют формировать плазматический сгусток объемом до 200 мкл, что в совокупности с более широким спектром соотношений клетка/микобактерия позволяет расширять спектр решаемых экспериментальных задач, в частности добавлять к клеточной суспензии клетки иного генеза, изучать эффективность и механизмы действия антибактериальных и иммуномодулирующих препаратов. Сокращение времени формирования трехмерного матрикса с 40 до 10-15 минут приводит к тому, что большая часть клеток остается в суспензии и сформированные гранулемы носят характер истинных трехмерных структур. Отказ от дорогостоящих коммерческих реактивов также позволяет широко использовать его в практике научных исследований иммунопатологических механизмов гранулемогенеза при развитии туберкулезного процесса, изучении иммунологических механизмов, регулирующих процессы образования и эволюции гранулем при инфекционных гранулематозных воспалительных процессах, при поиске, разработке и изучении новых противотуберкулезных препаратов.Thus, this method allows stably obtaining three-dimensional tuberculosis granulomas in vitro without the use of heterologous commercial preparations, which eliminates the atrophy effects on the subtle mechanisms of interaction of cells of the immune system in vitro. The technological features of the formation of a three-dimensional matrix from autoplasma make it possible to form a plasma clot with a volume of up to 200 μl, which, combined with a wider range of cell / mycobacteria ratios, allows expanding the range of experimental problems to be solved, in particular, adding cells of a different genesis to the cell suspension, studying the effectiveness and mechanisms of the action of antibacterial and immunomodulatory drugs. Reducing the time of formation of a three-dimensional matrix from 40 to 10-15 minutes leads to the fact that most of the cells remain in suspension and the formed granulomas are in the nature of true three-dimensional structures. The rejection of expensive commercial reagents also makes it possible to widely use it in the practice of scientific research of the immunopathological mechanisms of granulogenesis during the development of the tuberculosis process, the study of immunological mechanisms that regulate the formation and evolution of granulomas in infectious granulomatous inflammatory processes, and the search, development and study of new anti-TB drugs.
Список литературыBibliography
1. S. Bhavanam, G.R. Rayat, M. Keelan, D. Kunimoto, S.J. Drews. Understanding the pathophysiology of the human ТВ lung granuloma using in vitro granuloma models // Future Microbiol. (2016) 11(8), 1073-10891. S. Bhavanam, G.R. Rayat, M. Keelan, D. Kunimoto, S.J. Drews. Understanding the pathophysiology of the human TV lung granuloma using in vitro granuloma models // Future Microbiol. (2016) 11 (8), 1073-1089
2. V. Peddireddy, S. N. Doddam, N. Ahmed. Mycobacterial Dormancy Systems and Host Responses in Tuberculosis // Front Immunol. (2017) 8: 842. V. Peddireddy, S. N. Doddam, N. Ahmed. Mycobacterial Dormancy Systems and Host Responses in Tuberculosis // Front Immunol. (2017) 8: 84
3. I. Kramnik, G. Beamer. Mouse models of human ТВ pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies // Semin Immunopathol. 2016 Mar;38(2):221-37.3. I. Kramnik, G. Beamer. Mouse models of human TV pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies // Semin Immunopathol. 2016 Mar; 38 (2): 221-37.
4. D. Evangelopoulos, J. Diniz da Fonseca, S. Waddell Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them // International Journal of Infectious Diseases 32 (2015) 76-80.4. D. Evangelopoulos, J. Diniz da Fonseca, S. Waddell Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them // International Journal of Infectious Diseases 32 (2015) 76-80.
5. K.A. Birkness, J. Guarner, S.B. Sable, R.A. Tripp, K.L. Kellar, J. Bartlett, F.D. Quinn. An in vitro model of the leukocyte interactions associated with granuloma formation in Mycobacterium tuberculosis infection // Immunology and Cell Biology (2007) 85, 160-1685. K.A. Birkness, J. Guarner, S.B. Sable, R.A. Tripp, K.L. Kellar, J. Bartlett, F.D. Quinn. An in vitro model of the leukocyte interactions associated with granuloma formation in Mycobacterium tuberculosis infection // Immunology and Cell Biology (2007) 85, 160-168
6. U. Seitzera J. Gerdesb, Generation and Characterization of Multicellular Heterospheroids Formed by Human Peripheral Blood Mononuclear Cells // Cells Tissues Organs 2003; 174:110-1166. U. Seitzera J. Gerdesb, Generation and Characterization of Multicellular Heterospheroids Formed by Human Peripheral Blood Mononuclear Cells // Cells Tissues Organs 2003; 174: 110-116
7. Puissegur M.P., Botanch C, Duteyrat J.L., Delsol G., Caratero C, and Altare F. (2004). An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell.Microbiol. 6, 423-433.7. Puissegur M.P., Botanch C, Duteyrat J.L., Delsol G., Caratero C, and Altare F. (2004). An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell. Microbiol. 6, 423-433.
8. N. Kapoor, S. Pawar, T.D. Sirakova, C. Deb, W.L. Warren, P.E. Kolattukudy. Human Granuloma In Vitro Model, for ТВ Dormancy and Resuscitation // Plos one (2013) 8(1) e53657.8. N. Kapoor, S. Pawar, T.D. Sirakova, C. Deb, W.L. Warren, P.E. Kolattukudy. Human Granuloma In Vitro Model, for TV Dormancy and Resuscitation // Plos one (2013) 8 (1) e53657.
Claims (2)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018129016A RU2702609C1 (en) | 2018-08-06 | 2018-08-06 | Method for simulating tuberculosis infection in vitro |
| EA201900160A EA201900160A1 (en) | 2018-08-06 | 2019-04-12 | METHOD FOR MODELING TUBERCULOSIS INFECTION IN VITRO |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018129016A RU2702609C1 (en) | 2018-08-06 | 2018-08-06 | Method for simulating tuberculosis infection in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2702609C1 true RU2702609C1 (en) | 2019-10-08 |
Family
ID=68171142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018129016A RU2702609C1 (en) | 2018-08-06 | 2018-08-06 | Method for simulating tuberculosis infection in vitro |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA201900160A1 (en) |
| RU (1) | RU2702609C1 (en) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002054073A2 (en) * | 2001-01-08 | 2002-07-11 | The Governement Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Latent human tuberculosis model, diagnostic antigens, and methods of use |
| CA2572383A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Institut Pasteur De Lille | Detection of tuberculosis and infection by mycobacterium tuberculosis using hbha |
| EA009817B1 (en) * | 2004-06-07 | 2008-04-28 | Лысуха, Николай Николаевич | Method for detecting tuberculosis infection |
| RU2447419C2 (en) * | 2010-07-15 | 2012-04-10 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения РАМН (НЦКЭМ СО РАМН) | METHOD FOR in vitro RECOVERY OF EXPERIMENTAL TUBERCULOUS GRANULOMA IN CULTURES |
| RU2491551C1 (en) * | 2011-12-26 | 2013-08-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России) | Method for species identification of tuberculosis mycobacteria in individuals infected with tuberculosis mycobacteria |
| US8551499B2 (en) * | 2007-04-30 | 2013-10-08 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | In vitro model of latent mycobacterial infection |
| RU2652882C1 (en) * | 2017-02-17 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины" (ФИЦ ФТМ) | Method for determining the ability of mycobacteria of tuberculosis to growth in alveolar macrophages of patients after the course of antituberculosis therapy |
| WO2018076404A1 (en) * | 2016-10-24 | 2018-05-03 | 广州迪澳医疗科技有限公司 | Method for in vitro detection of active tuberculosis |
| EP3407071A1 (en) * | 2016-01-20 | 2018-11-28 | Xiamen University | Method and kit for diagnosis of active tuberculosis |
-
2018
- 2018-08-06 RU RU2018129016A patent/RU2702609C1/en active
-
2019
- 2019-04-12 EA EA201900160A patent/EA201900160A1/en unknown
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002054073A2 (en) * | 2001-01-08 | 2002-07-11 | The Governement Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Latent human tuberculosis model, diagnostic antigens, and methods of use |
| EA009817B1 (en) * | 2004-06-07 | 2008-04-28 | Лысуха, Николай Николаевич | Method for detecting tuberculosis infection |
| CA2572383A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Institut Pasteur De Lille | Detection of tuberculosis and infection by mycobacterium tuberculosis using hbha |
| US8551499B2 (en) * | 2007-04-30 | 2013-10-08 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | In vitro model of latent mycobacterial infection |
| RU2447419C2 (en) * | 2010-07-15 | 2012-04-10 | Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения РАМН (НЦКЭМ СО РАМН) | METHOD FOR in vitro RECOVERY OF EXPERIMENTAL TUBERCULOUS GRANULOMA IN CULTURES |
| RU2491551C1 (en) * | 2011-12-26 | 2013-08-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России) | Method for species identification of tuberculosis mycobacteria in individuals infected with tuberculosis mycobacteria |
| EP3407071A1 (en) * | 2016-01-20 | 2018-11-28 | Xiamen University | Method and kit for diagnosis of active tuberculosis |
| WO2018076404A1 (en) * | 2016-10-24 | 2018-05-03 | 广州迪澳医疗科技有限公司 | Method for in vitro detection of active tuberculosis |
| RU2652882C1 (en) * | 2017-02-17 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины" (ФИЦ ФТМ) | Method for determining the ability of mycobacteria of tuberculosis to growth in alveolar macrophages of patients after the course of antituberculosis therapy |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201900160A1 (en) | 2020-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2018133598A1 (en) | Method for in vitro expansion of cd8+t cells and cell subsets thereof | |
| CN103756963A (en) | Method used for in vitro proliferation of NK cells | |
| CN108588022B (en) | Method for enriching human CD4+ and CD8+ TCM cells through in vitro culture | |
| CN108893443A (en) | A kind of Efficient amplification method of cytokine induction umbilical cord blood natural killer | |
| US11944672B2 (en) | Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying Treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 | |
| JP5763894B2 (en) | Cell separation method | |
| CN113699106A (en) | Separation and amplification method of killer cells induced by cytokines | |
| CN105821483A (en) | Construction method of human stem memory T cell bank | |
| CN111040995A (en) | Method for amplifying tumor killer T cells in tumor infiltrating lymphocytes | |
| Balboa et al. | Monocyte-derived dendritic cells early exposed to Mycobacterium tuberculosis induce an enhanced T helper 17 response and transfer mycobacterial antigens | |
| RU2391401C2 (en) | METHOD OF OBTAINING POPULATION OF HUMAN CD4+CD25+Foxp3+ T-LYMPHOCYTES ex vivo, DISEASE TREATMENT METHOD | |
| TWI784426B (en) | Method for natural killer cell expansion | |
| RU2702609C1 (en) | Method for simulating tuberculosis infection in vitro | |
| Kalinski et al. | Generation of stable Th1/CTL-, Th2-, and Th17-inducing human dendritic cells | |
| CN108486055B (en) | Culture medium and application thereof in central memory type T lymphocyte culture | |
| BR112015014270B1 (en) | monocyte co-differentiation from allogeneic donors | |
| CN106222139B (en) | A method of High Fragmentation activity til cell is largely prepared using concretionary pernicious Pleural effusions | |
| EA041262B1 (en) | METHOD FOR SIMULATION OF TUBERCULOSIS INFECTION IN VITRO | |
| US10301590B2 (en) | Methods, compositions, and systems for activation and expansion of cells | |
| CN111849897A (en) | In vitro activation method for cell factor induced killer cells | |
| CN110305841B (en) | Immune cell capable of eliminating in-vivo recessive infection and preparation method and application thereof | |
| TWI669400B (en) | A serum-free cell culture medium for in-vitro expansion of nature killer cells and nature killer t cells | |
| RU2437933C1 (en) | METHOD OF HUMAN REGULATORY CD4+CD25+FOXP3+T-CELL ENRICHMENT ex vivo | |
| Moore | Investigation of regulatory B-cell responses during Mycobacterium tuberculosis exposure | |
| Crespo et al. | Purification of Primary Decidual Natural Killer Cells for Functional Analysis |