RU2700410C1 - Method of immunostaining a biological material for confocal microscopy - Google Patents
Method of immunostaining a biological material for confocal microscopy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2700410C1 RU2700410C1 RU2019115276A RU2019115276A RU2700410C1 RU 2700410 C1 RU2700410 C1 RU 2700410C1 RU 2019115276 A RU2019115276 A RU 2019115276A RU 2019115276 A RU2019115276 A RU 2019115276A RU 2700410 C1 RU2700410 C1 RU 2700410C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- washing
- carried out
- buffer
- antibodies
- room temperature
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5061—Muscle cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/5375—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by changing the physical or chemical properties of the medium or immunochemicals, e.g. temperature, density, pH, partitioning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к иммуногистохимии и иммуноцитохимии.The invention relates to biology and medicine, namely to immunohistochemistry and immunocytochemistry.
Известен способ иммуноокрашивания гистологических срезов тканей взрослых млекопитающих (модельных объектов мышей и человека), а также тканей беспозвоночных животных, включающий стадии фиксации материала параформальдегидом, блокирования неспецифического связывания бычьим сывороточным альбумином и/или сывороткой, инкубации с первичными и вторичными антителами в блокирующем буфере, отмывание от антител и получение изображения с последующей 3D-реконструкцией (совмещение всех изображений) для получения объемной картины образца (Garcia-Porrero, J. A., Manaia, A., Jimeno, J., Lasky, L. L., Dieterlen-Lièvre, F., & Godin, I. E. Antigenic profiles of endothelial and hemopoietic lineages in murine intraembryonic hemogenic sites. Developmental & Comparative Immunology, 1998, 22(3), 303-319).A known method of immunostaining histological sections of adult mammalian tissues (model objects of mice and humans), as well as tissues of invertebrates, including the steps of fixing the material with paraformaldehyde, blocking non-specific binding of bovine serum albumin and / or serum, incubating with primary and secondary antibodies in blocking buffer, washing from antibodies and obtaining an image followed by 3D reconstruction (combining all images) to obtain a three-dimensional picture of the sample (Garcia-Porrer o, JA, Manaia, A., Jimeno, J., Lasky, LL, Dieterlen-Lièvre, F., & Godin, IE Antigenic profiles of endothelial and hemopoietic lineages in murine intraembryonic hemogenic sites. Developmental & Comparative Immunology, 1998, 22 (3), 303-319).
Недостатками данного способа является высокая трудозатратность, связанная с получением серийных срезов, частая потеря срезов при резке тканей и иммунохимическом окрашивании, сложность совмещения изображений, полученных со срезов, влияющих на качество финальной объемной картины.The disadvantages of this method are the high labor costs associated with obtaining serial slices, the frequent loss of slices during tissue cutting and immunochemical staining, the difficulty of combining images obtained from slices that affect the quality of the final three-dimensional picture.
Опубликован и широко используется метод иммуноокрашивания отдельных органов эмбрионов и взрослых животных антителами, включающие стадии изоляции органов или систем органов, их фиксацию, блокирования неспецифического связывания и обработку первичными и вторичными антителами отмывание от антител и получение изображения с помощью конфокальной микроскопии (Kumar, M., & Tanwar, P. Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts. JoVE, Journal of Visualized Experiments, 2017, (119), e55134.).The method of immunostaining individual organs of embryos and adult animals with antibodies has been published and is widely used, including the steps of isolating organs or organ systems, fixing them, blocking non-specific binding, and treating antibodies with primary and secondary antibodies to wash and image using confocal microscopy (Kumar, M., & Tanwar, P. Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts. JoVE, Journal of Visualized Experiments, 2017, (119), e55134.).
Главный недостаток данного аналога состоит в том, что антитела маркируют только поверхностные структуры, не проникая глубоко в ткани. Из-за этого, более глубокие тканевые слои, свыше 150 мкм, оказываются неокрашенными и не идентифицируемыми микроскопией.The main disadvantage of this analogue is that antibodies mark only surface structures without penetrating deep into the tissue. Because of this, deeper tissue layers, above 150 microns, turn out to be unpainted and not identifiable by microscopy.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ иммуноокрашивания изолированных тканей млекопитающих и их целых эмбрионов на ранних стадиях развития для конфокальной микроскопии. Способ включает подготовку материала, фиксацию в 2% параформальдегиде (ПФА) на фосфатном буфере в течение 20 мин на льду, промывку фосфатным буфером 3 раза по 10 мин на льду, дегидратацию 50% метанолом в течение 10 мин, а затем 100% метанолом 2 раза по 10 мин на льду, после чего проводят гидратацию материала, для чего материал обрабатывают последовательно 75 % метанолом, 50% метанолом и 2 раза фосфатным буфером, при этом продолжительность каждой обработки составляет 10 мин; блокируют неспецифическое связывание 0.2% обезжиренным сухим молоком с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 0.3% Triton Х-100, приготовленными на фосфатном буфере, в течение 1 часа на льду; инкубацию с первичными антителами сывороткой или БСА, приготовленными на фосфатном буфере в течение ночи в холодной комнате при перемешивании, промывку фосфатным буфером с 0,4% Triton Х-100 и 1% обезжиренным молоком, при +4°С 3 раза по часу, затем ведут инкубацию с вторичными антителами фосфатным буфером с 0,4% Triton Х-100 и 1% обезжиренным молоком при +4°С в течение ночи, промывают фосфатным буфером с 0,4% Triton Х-100 и 1% обезжиренным молоком, при +4°С 3 раза по часу, после чего проводят дегидратацию биологического объекта, инкубируя объект в смеси метанола и фосфатного буфера в соотношении 50-50%, а затем выдерживают в течение 10 мин в 100% метаноле. После дегидратации материал подвергают оптическому просветлению путем химического обесцвечивания 2-3-х кратной обработкой раствором бензилового спирта (БС) и бензилбензоата (ББ) при соотношении 1:2, с последующим замещением на свежую смесь БС:ББ. Подготовленный материал анализируют конфокальной микроскопией с использованием z-стеков и 3D реконструкции (Yokomizo, T., Yamada-Inagawa, T., Yzaguirre, A. D., Chen, M. J., Speck, N. A., & Dzierzak, E. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature protocols, 2012, 7(3), 421–431).Closest to the claimed technical solution is a method for immunostaining of isolated mammalian tissues and their entire embryos in the early stages of development for confocal microscopy. The method includes preparing the material, fixing in 2% paraformaldehyde (PFA) on phosphate buffer for 20 minutes on ice, washing with
К недостаткам данного способа следует отнести:The disadvantages of this method include:
- использование в качестве фиксатора 2% ПФА не позволяет повысить проницаемость мембран биологического образца на этапе фиксации;- the use of 2% PFA as a fixer does not allow to increase the permeability of the membranes of the biological sample at the fixation stage;
- короткие по времени этапы отмывок фосфатным буфером не обеспечивают достаточное удаление первичных и вторичных антител из тканей и увеличивают неспецифический сигнал при детекции флуорохромов;- short-time steps of washing with phosphate buffer do not provide sufficient removal of primary and secondary antibodies from tissues and increase the nonspecific signal during the detection of fluorochromes;
- низкий уровень блокирования неспецифического связывания антител, что также приводит появлению неспецифического сигнала при детекции флуорохромов, и, как следствие, может стать причиной искаженной или неточной интерпретации результатов.- a low level of blocking of non-specific binding of antibodies, which also leads to the appearance of a non-specific signal during the detection of fluorochromes, and, as a result, can cause a distorted or inaccurate interpretation of the results.
- ограниченная проницаемость антител внутрь биологических тканей, на глубину свыше 150 мкм;- limited permeability of antibodies into biological tissues, to a depth of more than 150 microns;
- короткий этап просветления биологического объекта, который не достаточен для полного химического обесцвечивания тканей и, как следствие, получение недостаточно четкого изображения при микроскопировании.- a short stage of enlightenment of a biological object, which is not sufficient for complete chemical bleaching of tissues and, as a result, obtaining insufficiently clear images during microscopy.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение качества визуализации клеток и тканей крупных биологических объектов, за счет облегчения проникновение антител в глубокие слои образца, при сохранении структуры тканей и специфики связывания, и обеспечения оптической прозрачности образца за счет его химического обесцвечивания для беспрепятственного проникновения лазерного луча в глубокие слои объекта.The task to which the invention is directed is to improve the quality of imaging of cells and tissues of large biological objects, by facilitating the penetration of antibodies into the deeper layers of the sample, while maintaining the structure of tissues and the specificity of binding, and ensuring optical transparency of the sample due to its chemical discoloration for unhindered penetration of the laser beam into the deep layers of the object.
Поставленная задача решается тем, что в известном методе иммуноокрашивания биологического материала для конфокальной микроскопии, включающим подготовку материала, фиксацию, удаление фиксатора, блокирование неспецифического связывания антител, инкубацию с первичными антителами в блокирующем буфере, отмывку от первичных антител, инкубацию с вторичными антителами в блокирующем буфере, отмывку от вторичных антител, дегидратацию, просветление и визуализацию объекта, согласно изобретению, в качестве блокирующего буфера используют фосфатный буфер, содержащий 0,1-1,0% неионного детергента, 20,0% диметилсульфоксида, 1,0% бычьего сывороточного альбумина, не более 10,0% овечьей сыворотки и 0.03% азида натрия, фиксацию проводят в растворе 4% параформальдегида с метанолом на фосфатном буфере в течение 5-6 часов при +4°С; удаление фиксатора ведут отмывочным буфером 3 раза по 20 мин при комнатной температуре; блокирование неспецифического связывания антител проводят в течение 12 часов блокирующим буфером при +4°С; инкубацию с первичными антителами в блокирующем буфере ведут в течение 5-7 суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании, последующую отмывку от первичных антител ведут в отмывочном буфере, 6 раз по 20 мин, при комнатной температуре; инкубацию с вторичными антителами в блокирующем буфере проводят в течение 2 суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании, отмывку от вторичных антител ведут 6 раз по 20 мин при комнатной температуре в отмывочном буфере; дегидратацию осуществляют инкубацией материала в 50% метаноле в течение 10 мин, а затем переносят в 100% метанол на 20 мин, с последующим замещением раствора на 100% свежий метанол и выдерживают не менее 20 мин при постоянном перемешивании; оптическое просветление путем химического обесцвечивания проводят инкубацией материала в смеси бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении 1:2, в течение 1 часа при комнатной температуре, с дальнейшим замещением свежим раствором бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении 1:2 и инкубируют в нем в течение ночи при постоянном перемешивании, после чего проводят визуализацию объекта.The problem is solved in that in the known method of immunostaining biological material for confocal microscopy, including preparing the material, fixing, removing the fixative, blocking non-specific binding of antibodies, incubation with primary antibodies in blocking buffer, washing from primary antibodies, incubation with secondary antibodies in blocking buffer , washing from secondary antibodies, dehydration, enlightenment and visualization of an object according to the invention, phosphorus is used as a blocking buffer buffer containing 0.1-1.0% non-ionic detergent, 20.0% dimethyl sulfoxide, 1.0% bovine serum albumin, not more than 10.0% sheep serum and 0.03% sodium azide, fixation is carried out in a solution of 4% paraformaldehyde with methanol on phosphate buffer for 5-6 hours at + 4 ° C; removal of the fixative is carried out with
Заявляемый способ позволяет, по сравнению с прототипом, значительно расширить круг исследуемых биологических материалов, в частности, он пригоден для исследования изолированных целых органов мелких лабораторных позвоночных животных, эмбрионов позвоночных животных, беспозвоночных животных целиком, но лишенных раковин или наружного скелета, размером до 6 см3.The inventive method allows, in comparison with the prototype, significantly expand the range of biological materials studied, in particular, it is suitable for the study of isolated whole organs of small laboratory vertebrates, vertebrate embryos, whole invertebrates, but devoid of shells or an external skeleton, up to 6 cm in size 3 .
Проведение фиксации в растворе 4% параформальдегида на фосфатном буфере, содержащим метанол, в течение 5-6 часов при +4°С повышает проникновение реактивов внутрь образца, обеспечивая повышение проницаемости мембран клеток с самых начальных этапов обработки, и, в конечном результате, приводит к повышению качества визуализации клеток и тканей крупных биологических объектов.Fixation in a solution of 4% paraformaldehyde in a phosphate buffer containing methanol for 5-6 hours at + 4 ° C increases the penetration of reagents into the sample, increasing the permeability of cell membranes from the very initial stages of processing, and, ultimately, leads to improving the quality of imaging of cells and tissues of large biological objects.
Целесообразно в качестве отмывочного буфера для удаления остатков фиксатора, первичных и вторичных антител использовать фосфатный буфер с добавлением неионных детергентов, сохраняющих структуру тканей в концентрациях от 0,1 до 1,0%. В качестве неионных детергентов, удовлетворяюших данному требованию, в практике известны только два детергента - Tween-20 или Triton X-100. К настоящему моменту в иммуногистохимии используются именно эти два соединения из семейства неионных (нейтральных) детергентов – Tween-20 и Triton X-100. Это связано с их низкой критической концентрацией мицеллообразования (ККМ), которые при 25°С составляют 0,06 мМ и 0,2 – 0,9 мМ, соответственно, и способностью разрушать белково-липидные, межлипидные, но не межбелковые взаимодействия, за счет чего сохраняется структура тканей и органов. Предложенный диапазон концентраций от 0,1 до 1,0% обусловлен тем, что концентрации ниже 0,1% не обеспечивает проникновение антител в глубокие слои образца более 100 мкм, а концентрации выше 1,0% могут привести к разрушению тканей.It is advisable to use phosphate buffer with the addition of nonionic detergents that preserve the structure of tissues in concentrations from 0.1 to 1.0% as a washing buffer to remove fixative residues, primary and secondary antibodies. As non-ionic detergents that satisfy this requirement, only two detergents are known in practice - Tween-20 or Triton X-100. To date, it is these two compounds from the family of nonionic (neutral) detergents — Tween-20 and Triton X-100 — that are used in immunohistochemistry. This is due to their low critical micelle concentration (CMC), which at 0 ° C is 0.06 mM and 0.2 - 0.9 mM, respectively, and their ability to destroy protein-lipid, interlipid, but not protein-protein interactions, due to which preserves the structure of tissues and organs. The proposed concentration range from 0.1 to 1.0% is due to the fact that concentrations below 0.1% do not allow the penetration of antibodies into the deeper layers of the sample more than 100 microns, and concentrations above 1.0% can lead to tissue destruction.
Удаление фиксатора 3-кратной отмывкой по 20 мин. отмывочным буфером на основе фосфатного буфера с добавлением 0,1-1,0% неионного детергента при комнатной температуре обеспечивает более эффективное удаление фиксатора из глубоких слоев тканей и органов. Отмывка образца после фиксации очень важный этап, от которого зависит визуальная выраженность структур со специфическим окрашиванием. Плохо отмытый от фиксатора образец дает сильное фоновое свечение при микроскопировании, в результате чего, визуализация интересующих структур, становится более затруднительной, т.е. получаемое изображение нечеткое. Использование предложенного состава и режима отмывки материала на момент визуализации объекта в микроскопе, минимизирует фоновое свечение, и повышает качество визуализации интересующих структур.Removing the latch with 3x washing for 20 minutes. washing buffer based on phosphate buffer with the addition of 0.1-1.0% nonionic detergent at room temperature provides a more effective removal of the fixative from the deep layers of tissues and organs. Washing the sample after fixation is a very important stage, on which the visual expression of structures with specific staining depends. A sample poorly washed from the fixative gives a strong background glow during microscopy, as a result of which visualization of structures of interest becomes more difficult, i.e. the resulting image is not clear. Using the proposed composition and the regime of washing the material at the time of visualization of the object in a microscope minimizes the background glow and improves the quality of visualization of structures of interest.
Для достижения заявленного технического результата в качестве блокирующего буфера в заявленном способе предлагается использовать фосфатный буфер, содержащий 0,1-1,0% неионного детергента, 20,0% диметилсульфоксида, 1,0% бычьего сывороточного альбумина, не более 10,0% овечьей сыворотки и 0.03% азида натрия. Одновременное использование сочетанного действия двух блокирующих агентов: 1% бычьего сывороточного альбумина и не более чем 10% овечьей сыворотки, а также увеличение времени экспозиции (до 12 ч) при +4°С, способствует более полному «забиванию» мест неспецифического связывания, предотвращая их связывание с первичными и вторичными антителами, и, как следствие, получению более четких изображений, специфического окрашивания. Проникновение блокаторов в глубокие слои образца достигается не только присутствием неионного детергента (0,1-1,0%), но и добавлением в состав блокирующего буфера 20% ДМСО – пенетрирующего агента, способствующего переносу блокирующих веществ на глубину более 150 мкм. Предложенный состав блокирующего буфера при рекомендованных условиях экспозиции позволяет исключить неспецифическое окрашивание по всей глубине образца и в дальнейшем маркировать только структуры, представляющие научный интерес, и получать четкое изображение искомых структур.To achieve the claimed technical result, it is proposed to use a phosphate buffer containing 0.1-1.0% non-ionic detergent, 20.0% dimethyl sulfoxide, 1.0% bovine serum albumin, not more than 10.0% sheep as a blocking buffer in the claimed method serum and 0.03% sodium azide. The simultaneous use of the combined action of two blocking agents: 1% bovine serum albumin and not more than 10% sheep serum, as well as an increase in exposure time (up to 12 hours) at + 4 ° C, contributes to a more complete "clogging" of non-specific binding sites, preventing them binding to primary and secondary antibodies, and, as a result, obtaining clearer images, specific staining. The penetration of blockers into the deeper layers of the sample is achieved not only by the presence of a nonionic detergent (0.1-1.0%), but also by adding 20% DMSO, a penetrating agent, to the blocking buffer, which promotes the transfer of blocking substances to a depth of more than 150 microns. The proposed composition of the blocking buffer under the recommended exposure conditions makes it possible to exclude nonspecific staining throughout the entire depth of the sample and subsequently mark only structures of scientific interest and obtain a clear image of the desired structures.
Длительное инкубирование образца с антителами, разведенными в блокирующем буфере, содержащим детергент и ДМСО, способствует переносу антител в глубокие (более 150 мкм) слои образца. Увеличение времени экспозиции до 5-7 суток для первичных и до 2 суток для вторичных антител, при комнатной температуре при постоянном перемешивании, обеспечивает более надежное проникновение антител вглубь образца толщиной до 1 см. Предложенные условия инкубации дают возможность маркировать структуры, локализованные внутри изолированных тканей и органов мелких лабораторных животных, эмбрионов позвоночных животных, беспозвоночных животных целиком, но лишенных раковины или наружного скелета, значительно превышающие предел 150 мкм, не прибегая при этом к получению срезов.Prolonged incubation of the sample with antibodies diluted in blocking buffer containing detergent and DMSO promotes the transfer of antibodies into the deep (more than 150 microns) layers of the sample. Increasing the exposure time to 5-7 days for primary and up to 2 days for secondary antibodies, at room temperature with constant stirring, provides more reliable penetration of antibodies into the sample up to 1 cm thick. The proposed incubation conditions make it possible to label structures localized inside isolated tissues and organs of small laboratory animals, embryos of vertebrates, whole invertebrates, but devoid of shell or external skeleton, significantly exceeding the limit of 150 microns, not egaya thus to obtain slices.
Увеличение времени экспозиции биологического материала в смеси бензилового спирта и бензилбензоата (1:1) (на ночь), при проведении процедуры просветления способствует полному химическому обесцвечиванию образцов, после которого лазерный луч конфокального микроскопа проходит сквозь объект толщиной до 1 см. Благодаря этому, возможна детекция флуорохромов и получение изображения искомых структур, минуя трудоемкий процесс резки, обработки срезов, получения изображений с каждого из них и 3D реконструкции изображения.Increasing the exposure time of biological material in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate (1: 1) (at night), during the bleaching procedure, contributes to complete chemical discoloration of the samples, after which the laser beam of the confocal microscope passes through an object up to 1 cm thick. Due to this, detection is possible fluorochromes and obtaining the image of the desired structure, bypassing the laborious process of cutting, processing slices, obtaining images from each of them and 3D reconstruction of the image.
Визуализацию объекта ведут с помощью конфокальной микроскопии в комбинации режимов Z–stack и TILE-scan.Object visualization is carried out using confocal microscopy in a combination of Z – stack and TILE-scan modes.
Получение изображений с конфокального микроскопа посредством сочетания режимов Z–stack (z-стек) и TILE-scan (мозаичное сканирование) позволяет не только изучать структуры находящиеся в поле зрения ограниченном окуляром, но также смещать предметный столик с образцом. Это значительно расширяет обозреваемую площадь объекта, и, как следствие, позволяет делать 3D реконструкции больших участков.Obtaining images from a confocal microscope by combining the Z – stack (z-stack) and TILE-scan (mosaic scanning) modes allows not only to study the structures that are in the field of view limited by the eyepiece, but also to shift the object table with the sample. This greatly expands the observed area of the object, and, as a result, allows you to make 3D reconstruction of large sections.
Заявляемый способ иллюстрируется следующими фигурами:The inventive method is illustrated by the following figures:
Фиг. 1. Этапы подготовки и визуализированная нервная система эмбриона мыши Mus musculus (12 суток после оплодотворения), где - (А) эмбрион до оптического просветления, (Б) эмбрионы после оптического просветления в смеси бензилового спирта и бензилбензоата, (В) детектированная нейрональными антителами Tuj1, эмбриональная нервная система, (Г) большое увеличение тройничного (звездочка), слухового (стрелка) и языкоглоточного (наконечник) ганглиев в головной части эмбриона, (Д) большое увеличение туловищной части эмбриона, демонстрирующее спинной мозг (стрелка), сердце (звездочка), кишечник (наконечник) и пр. Примерная глубина залегания структур: тройничный ганглий 0,5 и 1,5 мм (т.к. они на иллюстрации парные), слуховой на 1,0 мм глубины, языкоглоточный – 1,5 мм, спинной мозг 0,1-1,9 мм, сердце 1,0 мм, кишечник – 1,2 мм.FIG. 1. Preparation stages and visualized nervous system of the Mus musculus mouse embryo (12 days after fertilization), where - (A) the embryo before optical enlightenment, (B) the embryos after optical enlightenment in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate, (C) detected by Tuj1 neuronal antibodies , the embryonic nervous system, (D) a large increase in the trigeminal (asterisk), auditory (arrow) and glossopharyngeal (tip) ganglia in the head of the embryo, (D) a large increase in the trunk of the embryo, showing the spinal cord (arrow) ), heart (asterisk), intestines (tip), etc. Approximate depth of structures: trigeminal ganglion 0.5 and 1.5 mm (as they are paired in the illustration), auditory 1.0 mm depth, glossopharyngeal - 1.5 mm, spinal cord 0.1-1.9 mm, heart 1.0 mm, intestines - 1.2 mm.
Фиг. 2. Детекция нейронального тубулина (Tuj1) в сердце взрослой мыши Mus musculus. Максимальная проекция поверхностных (стрелки) и глубинных (звездочка) нейрональных структур. Глубина залегания обозначенных звездочкой структур более 600 мкм.FIG. 2. Detection of neuronal tubulin (Tuj1) in the heart of an adult Mus musculus mouse. The maximum projection of surface (arrows) and deep (asterisk) neuronal structures. The depth of the structures marked with an asterisk is more than 600 microns.
Фиг. 3. Детекция нейронального тубулина (Tuj1) в легких и трахее взрослой мыши Mus musculus. Глубина залегания структур 1 мм.FIG. 3. Detection of neuronal tubulin (Tuj1) in the lungs and trachea of an adult Mus musculus mouse. The depth of the structures is 1 mm.
Фиг. 4. Этапы подготовки и визуализированные FMRF-амид-ергические элементы нервной системы тихоокеанской устрицы Crassostrea gigas, где - (А) устрица с одной удаленной створкой, (Б) мягкое тело устрицы извлеченное из раковины до процесса оптического просветления, (В) после оптического просветления в смеси БС:ББ, (Г) фрагмент нервной системы (участок отмечен рамкой на фиг. В), детектированный с помощью антител против FMRF-амида, (Д) большое увеличение паллиальных нервов (стрелки), иннервирующих мантию, (Е) большое увеличение ветви (стрелка) висцерального ганглия (наконечник), иннервирующей аддуктор (звездочка). Глубина залегания висцерального ганглия 5 мм.FIG. 4. Preparation stages and visualized FMRF amide-ergic elements of the nervous system of the Pacific oyster Crassostrea gigas, where - (A) the oyster with one leaf removed, (B) the soft body of the oyster removed from the shell before the process of optical enlightenment, (C) after optical enlightenment in a mixture of BS: BB, (D) a fragment of the nervous system (the area marked with a frame in Fig. B) detected with antibodies against FMRF amide, (D) a large increase in pallic nerves (arrows) innervating the mantle, (E) a large increase branches (arrow) of the visceral ganglion ( akonechnik), innervating the adductor (asterisk). The depth of the visceral ganglion is 5 mm.
Фиг. 5. Визуализация серотонинергических элементов нервной системы немертины Quasitetrastemma timpsoni, где - (А) общий вид головного конца червя. (Б) Большое увеличение мозга (ганглия) (стрелки). Глубина залегания структуры 500 мкм.FIG. 5. Visualization of serotonergic elements of the nervous system of the nemerthine Quasitetrastemma timpsoni, where - (A) general view of the head end of the worm. (B) A large increase in the brain (ganglion) (arrows). The depth of the structure is 500 μm.
Табл. Характеристика образцов и описание особенностей пробоподготовки материала (см. в графической части).Tab. Characterization of samples and a description of the features of sample preparation of the material (see the graphic part).
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Пример 1. В качестве объекта выбраны эмбрионы мыши Mus musculus, на сроке 12 суток после оплодотворения.Example 1. As an object, mouse embryos of Mus musculus were selected for a period of 12 days after fertilization.
Подготовка материала. Размер извлеченных эмбрионов составляет примерно 0.5×0.5×0.25 см (длина × ширина × толщина, соответственно), объемом 0.06 см3. Эмбрионы фиксируют в 4,0% ПФА стабилизированным метанолом, 5 часов при +4°С. Далее материал отмывают от фиксатора в отмывочном буфере, содержащем 0,1М ФБ с 0.1% Triton X-100 (Sigma), 3 раза по 20 минут при комнатной температуре при перемешивании. Блокирование проводят инкубацией в блокирующем буфере, содержащем 0.1% Triton X-100, 20% ДМСО, 1,0% БСА, 5% овечью сыворотку, 0,03% азида натрия в 0,1М фосфатном буфере, в течении 12 часов при температуре +4°С. После этого эмбрионы инкубируют в первичных мышиных моноклональных антителах против нейронального тубулина Tuj1 (Promega) с разведением в блокирующем буфере 1:500, в течение 5 суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После инкубации материал промывают отмывочным буфером 6 раз по 20 минут при постоянном перемешивании. Затем инкубируют во вторичных антителах против мыши, меченных флуорохромом Alexa 488 (Molecular Probes), разведенных блокирующим буфером в соотношении 1:1000, в течение 2 суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании. По окончании инкубации эмбрионы отмывают от вторичных антител отмывочным буфером 6 раз по 20 минут при постоянном перемешивании. Далее, для процесса дегидратации материал помещают в 50% метанол на 10 мин, а затем в 100% метанол на 20 мин. После этого, 100% метанол замещают его свежей порцией вторично и выдерживают еще 20 мин. После дегидратации материал подвергают оптическому просветлению путем химического обесцвечивания в смеси бензилового спирта (БС) и бензил бензоата (ББ). Для этого замещают 100% метанол на смесь БС:ББ в соотношении 1:2 в течение 1 часа, после чего замещают свежей порцией БС:ББ в том же соотношении для инкубации на ночь. Инкубацию проводят при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Визуальные отличия в степени прозрачности эмбрионов продемонстрированы на Фиг. 1, где – (А) эмбрионы до процесса просветления, а (Б) – после ночной инкубации в смеси БС:ББ. Для изучения эмбрионов в микроскопе, подготовленный материал помещают в чашки Петри со стеклянным дном (MackTek) и добавляют БС-ББ раствора столько, чтобы материал был покрыт им. Далее, используя инвертированный конфокальный микроскоп в режимах сканирования Z-stack и TILE-scan, сканируют весь эмбрион в разрешении, необходимом для детектирования нервных отростков. Файлы сохраняют и просматривают в 3D, используя программы ImageJ или IMARIS. Результаты сканирования эмбриона, иллюстрирующие наличие нейронального тубулина, представлены на Фиг. 1 (В, Г, Д).Material preparation. The size of the extracted embryos is approximately 0.5 × 0.5 × 0.25 cm (length × width × thickness, respectively), with a volume of 0.06 cm 3 . Embryos are fixed in 4.0% PFA with stabilized methanol, 5 hours at + 4 ° C. Next, the material is washed from the fixative in washing buffer containing 0.1 M PBS with 0.1% Triton X-100 (Sigma), 3 times for 20 minutes at room temperature with stirring. Blocking is carried out by incubation in a blocking buffer containing 0.1% Triton X-100, 20% DMSO, 1.0% BSA, 5% sheep serum, 0.03% sodium azide in 0.1 M phosphate buffer, for 12 hours at + 4 ° C. After that, the embryos are incubated in primary mouse monoclonal antibodies against neuronal tubulin Tuj1 (Promega) with a dilution in blocking buffer of 1: 500, for 5 days at room temperature with constant stirring. After incubation, the material is washed with
Примеры 2-5 процедурно выполняют аналогично примеру 1, только берут различные биологические объекты и используют конкретные режимные параметры.Examples 2-5 are procedurally performed analogously to example 1, they only take various biological objects and use specific operating parameters.
Данные по режимным параметрам и результаты для наглядности представлены в таблице.Data on operational parameters and results are presented in the table for clarity.
Как следует из приведенных примеров и фигур заявляемый метод позволяет без труда визуализировать тканевые структуры, залегающие на глубине более 150 мкм, в отдельных органах и эмбрионах мелких позвоночных животных (мыши, крысы, амфибии, рептилии, рыбы), и в целых (нефрагментированных) беспозвоночных животных (немертины, моллюски) с параметрами глубины до 1 см и объемом до 6 см3, что ранее сделано не было.As follows from the above examples and figures, the claimed method allows you to easily visualize tissue structures occurring at a depth of more than 150 microns in individual organs and embryos of small vertebrates (mice, rats, amphibians, reptiles, fish), and in whole (unfragmented) invertebrates animals (nemerthins, mollusks) with depth parameters of up to 1 cm and a volume of up to 6 cm 3 , which was not previously done.
В качестве биологического материала могут быть использованы и другие таксономические группы животных. Данный факт следует отнести к преимуществам предложенного метода, позволяющего адаптировать его для разных биологических объектов.Other biological taxonomic groups of animals can be used as biological material. This fact should be attributed to the advantages of the proposed method, which allows it to be adapted for different biological objects.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019115276A RU2700410C1 (en) | 2019-05-20 | 2019-05-20 | Method of immunostaining a biological material for confocal microscopy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019115276A RU2700410C1 (en) | 2019-05-20 | 2019-05-20 | Method of immunostaining a biological material for confocal microscopy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2700410C1 true RU2700410C1 (en) | 2019-09-17 |
Family
ID=67989862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019115276A RU2700410C1 (en) | 2019-05-20 | 2019-05-20 | Method of immunostaining a biological material for confocal microscopy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2700410C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2633058C2 (en) * | 2010-08-05 | 2017-10-11 | Мерк Шарп Энд Домэ Корп. | Inactivated vaccines against varicella-zoster virus, methods for their production and application |
| RU2667644C2 (en) * | 2013-04-22 | 2018-09-21 | Тотиги Инститьют Оф Клиникал Патолоджи | Antitumour agent |
| WO2017133746A9 (en) * | 2016-02-05 | 2018-11-15 | Dana Genetic A/S | Method for diagnosing and treating cancer using antibodies that bind to c1 inactivator, c reactive protein and/or complement component c4 |
-
2019
- 2019-05-20 RU RU2019115276A patent/RU2700410C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2633058C2 (en) * | 2010-08-05 | 2017-10-11 | Мерк Шарп Энд Домэ Корп. | Inactivated vaccines against varicella-zoster virus, methods for their production and application |
| RU2667644C2 (en) * | 2013-04-22 | 2018-09-21 | Тотиги Инститьют Оф Клиникал Патолоджи | Antitumour agent |
| WO2017133746A9 (en) * | 2016-02-05 | 2018-11-15 | Dana Genetic A/S | Method for diagnosing and treating cancer using antibodies that bind to c1 inactivator, c reactive protein and/or complement component c4 |
| RU2018131560A (en) * | 2016-02-05 | 2020-03-04 | Дана Дженетик А/С | METHODS FOR DIAGNOSTIC AND TREATMENT OF A MALIGNANT TUMOR USING ANTIBODIES WHICH ARE CONNECTED WITH A C1 INACTIVATOR, A C-REACTIVE PROTEIN AND / OR A COMPONENT OF A COMPLEMENT C4 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| & RU 2018131560. * |
| Garcia-Porrero, J. A. et al., Antigenic profiles of endothelial and hemopoietic lineages in murine intraembryonic hemogenic sites. Developmental & Comparative Immunology, 1998, 22(3), 303-319. * |
| Garcia-Porrero, J. A. et al., Antigenic profiles of endothelial and hemopoietic lineages in murine intraembryonic hemogenic sites. Developmental & Comparative Immunology, 1998, 22(3), 303-319. Kumar, M. et al., Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts. JQVE, Journal of Visualized Experiments, 2017, (119), страницы 1-6. Yokomizo, T. et al., Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols, 2012, 7(3), 421-431. * |
| Kumar, M. et al., Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts. JQVE, Journal of Visualized Experiments, 2017, (119), страницы 1-6. * |
| Yokomizo, T. et al., Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols, 2012, 7(3), 421-431. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6274443B2 (en) | Clarified biological specimen preparation kit and transparent biological specimen preparation method | |
| CN108061677A (en) | For the fining agent and its purposes of biomaterial | |
| Gómez-Gaviro et al. | Optimized CUBIC protocol for 3D imaging of chicken embryos at single-cell resolution | |
| Smolla et al. | Clearing pigmented insect cuticle to investigate small insects' organs in situ using confocal laser-scanning microscopy (CLSM) | |
| Stower et al. | Bi‐modal strategy of gastrulation in reptiles | |
| Cowdry | THE DEVELOPMENT OF THE CYTOPLASMIC CON-STITUENTS OF THE NERVE CELLS OF THE CHICK I. MITOCHONDRIA AND NEUROFIBRILS | |
| RU2700410C1 (en) | Method of immunostaining a biological material for confocal microscopy | |
| US11391653B2 (en) | Composition for immunostaining cleared large tissues and method for immunostaining cleared large biological tissues | |
| Zhang et al. | The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level: Labeling by antibody staining, RNAi loss-of-function analysis and imaging | |
| Setton et al. | Embryogenesis in a Colorado population of Aphonopelma hentzi (Girard, 1852)(Araneae: Mygalomorphae: Theraphosidae): establishing a promising system for the study of mygalomorph development | |
| JP2018044800A (en) | Transparentizing method of biological sample | |
| Sato et al. | Fertilization, syngamy, and early embryonic development in the cricket Gryllus bimaculatus (De Geer) | |
| KR102477568B1 (en) | A method of pretreatment of transparency of a biological samples with a size of 1 mm or less and a method of transparency of the biological samples comprising the same | |
| Narasimha et al. | Confocal Microscopy of Drosophilia Embryos | |
| Perea-Atienza et al. | Immunostaining and in situ hybridization of the developing Acoel nervous system | |
| Dobell | Researches on the intestinal protozoa of monkeys and man: XI. The cytology and life-history of Endolimax nana | |
| Burbach et al. | FMRF Gene Expression in the Nervous System of the Squid Doryteuthis Pealei* Hatchling | |
| Larkin et al. | Three-dimensional analysis of laser scanning confocal microscope sections reveals an array of microtubules in the cleavage furrow of sea urchin eggs | |
| KR102347035B1 (en) | Biological tissue clearing kit comprising electrolyzed water, method of biological tissue clearing and immunostaining for 3-dimensional imaging using thereof | |
| De Niz et al. | 3D imaging of undissected optically cleared Anopheles stephensi mosquitoes infected with Plasmodium parasites | |
| Abidalla et al. | Novel staining procedures for whole mount preparations of greater wax moth (Galleria mellonella) embryos: toluidine blue-rhodamine B, plus calcofluor white | |
| WO2024071029A1 (en) | Method for producing transparentized biological specimen | |
| Nishida et al. | Germline development during embryogenesis of the larvacean, Oikopleura dioica | |
| De Swaef et al. | Ultrastructural morphology of the envelope of Dover sole Solea solea eggs from fertilization until hatching with emphasis on sample preparation | |
| Feiguin et al. | 16 Methods in Drosophila Cell Cycle Biology |