RU2700258C1 - Method for stimulating regeneration of muscular branches of facial nerve in experiment - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to neurosurgery, and can be used for stimulation of regeneration of muscle branches of facial nerve in experiment. That is ensured by introducing the autoplasma taken directly before the operation prepared by centrifugation at rate of 1000 rpm for 20 minutes into the guide. Central and proximal ends of the transected nerve are placed in the autoplasma. Conductor is fixed in bed of transected nerve by applying single nodular sutures on fascia of surrounding tissues.

EFFECT: method provides improved results of post-traumatic regeneration of nerve fiber and recovery of motor and sensitive function in innervated tissues by increasing the rate of directed growth of axons in the area of the intersected nerve, improvement of reparative processes, less manifestations of inflammatory phenomena, restoration of integrity and function of nerve conduction in earlier terms after trauma.

1 cl, 1 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии и предназначено для стимуляции процессов регенерации концов пересеченных периферических нервов.The invention relates to medicine, namely to neurosurgery and is intended to stimulate the regeneration of the ends of crossed peripheral nerves.

В настоящее время предложены различные способы стимуляции репарации поврежденных периферических нервов в сочетании с направленной тубуляцией их концов.Currently, various methods of stimulating the repair of damaged peripheral nerves in combination with directed tubulation of their ends have been proposed.

Среди методов направленных на катализацию регенераторных процессов при реконструкции поврежденных периферических нервов, можно выделить метод использования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани крысы в составе фибринового клея Tissucol-Kit на модели 5 мм диастаза седалищного нерва крысы (Р.Ф. Масгутов, Г.А. Масгутова, А.А. Рогожин и др. журнал "Гены и клетки" Том X №3 2015, "Стимуляция регенерации седалищного нерва крысы с использованием тубуляции в сочетании с аллотрансплантацией мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани". с. 1-5), способ стимулирования регенерации нерва (патент на изобретение №2464020 от 20.10.2012 г., авторы Ю.А. Чернышев, И.С. Рагинов, Г.А. Масгутова и др.), клеточная терапия (журнал "ActaNature" том 7 №3 2015. Е.С. Петрова "Восстановление поврежденного нерва с помощью клеточной терапии", с. 42-53), применение гидрогелевого матрикса (журнал "Клеточная трансплантология и тканевая инженерия", том II, №4, 2007 г. Г.А. Фомина, Р.Ф. Масгутов, В.Г. Штырлин и др. "Гидрогелевый матрикс на основе биосовместимых карбомеров для восполнения дефектов нервной ткани", с. 63-67), трехмерный матрикс-наполнитель кондуита (Патент на изобретение №2517117 от 27.05.2014 г. - "Способ стимулирования регенерации нерва с помощью наноструктурированного матрикса и генетических конструкций").Among the methods aimed at catalyzing regenerative processes during the reconstruction of damaged peripheral nerves, one can single out the method of using mesenchymal stem cells of rat adipose tissue as part of Tissucol-Kit fibrin glue on a model of 5 mm rat sciatic nerve diastasis (R.F. Masgutov, G.A. Masgutova , A. A. Rogozhin and other journal “Genes and Cells” Volume X No. 3 2015, “Stimulation of regeneration of rat sciatic nerve using tubulation in combination with allotransplantation of mesenchymal stromal cells from adipose tissue”, p. 1-5), method stim stimulation of nerve regeneration (patent for the invention No. 2464020 from 10.20.2012, authors Yu.A. Chernyshev, I. S. Raginov, G. A. Masgutova and others), cell therapy (journal "ActaNature" Volume 7 No. 3 2015. E.S. Petrova "Restoring a damaged nerve using cell therapy", p. 42-53), the use of a hydrogel matrix (the journal "Cell Transplantology and Tissue Engineering", Volume II, No. 4, 2007 G.A. Fomina, RF Masgutov, VG Shtyrlin, et al. "Hydrogel matrix based on biocompatible carbomers to make up for neural tissue defects", p. 63-67), a three-dimensional matrix filler of conduit (Patent for invention No. 2517117 dated 05/27/2014 - “A method of stimulating nerve regeneration using a nanostructured matrix and genetic constructs”).

Однако в каждой из этих методик есть и свои недостатки: негативными последствиями применения стволовых клеток являются иммунный ответ реципиента на введение чужеродных клеток, стимуляция новообразований, развитие воспалений и соединительно-тканного рубца, активация макрофагов и др. (журнал "ActaNature" том 7 №3 2015. Е.С. Петрова "Восстановление поврежденного нерва с помощью клеточной терапии", с. 42-53; М.В. Угрюмов, А.Н. Коновалов, Е.И. Гусев //Вестник РАМН. 2004. №11. с. 8-17).However, each of these methods has its drawbacks: the negative consequences of using stem cells are the recipient’s immune response to the introduction of foreign cells, stimulation of neoplasms, the development of inflammation and connective tissue scar, macrophage activation, etc. (ActaNature Journal, Volume 7, No. 3 2015. E.S. Petrova "Restoration of a damaged nerve using cell therapy", pp. 42-53; M.V. Ugryumov, A.N. Konovalov, E.I. Gusev // Vestnik RAMS. 2004. No. 11. p. 8-17).

Критика аналоговCriticism of analogues

Наряду с работами, в которых отмечено влияние клеточной терапии на реципиента, опубликованы данные о том, что эффект применения клеточной терапии незначителен или отсутствует вовсе (Shi W., YaoJ., ChenX. //Artif. CellsBlood. Substil. Immobil. Biotechnol. 2010. V. 38. №1. P.299-37). Возможно, что этот эффект проявляется непродолжительное время, как в случае использования стволовых клеток на других экспериментальных моделях, что требует дальнейшего изучения.Along with works in which the effect of cell therapy on the recipient is noted, data have been published that the effect of cell therapy is negligible or absent at all (Shi W., YaoJ., ChenX. // Artif. Cells Blood. Substil. Immobil. Biotechnol. 2010 . V. 38. No. 1. P.299-37). It is possible that this effect manifests itself for a short time, as in the case of using stem cells in other experimental models, which requires further study.

ПрототипPrototype

В качестве прототипа нами выбран способ стимуляции восстановления поврежденного нерва мезенхимальными стволовыми клетками (журнал Медицинские новости №10 2011. Д.Ю. Петрова, В.Н. Подгайский, М.К. Недзьведь и др. "Возможность восстановления поврежденных периферических нервов при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток ". с. 9-72. Техника стимуляции репарации мезенхимальными стволовыми клетками поврежденных периферических нервов состоит в следующем: В просвет анастомоза вводят суспензию мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в количестве 1х10⁶/мл. Вводимые клетки предварительно окрашивали витальным красителем РКН-26, для определения их локализации в просвете протеза после трансплантации.As a prototype, we have chosen a method of stimulating the restoration of a damaged nerve by mesenchymal stem cells (Medical News Magazine No. 10 2011. D.Yu. Petrova, V.N. Podgaysky, M.K. Nedzved and others. stem cells. "p. 9-72. The technique for stimulating the repair of damaged peripheral nerves by the mesenchymal stem cells is as follows: A suspension of mesenchymal stem cells (MSC) is introduced into the lumen of the anastomosis ve 1x10 ⁶ / ml. The input cells were pre-stained with the vital stain RKN-26, for determining their localization in the lumen of the prosthesis after the transplantation.

Техника выделения МСК из жировой ткани. Проводится промывание липоаспират стерильным раствором Хенкса с инкубацией в течении 45 мин. с 0,075%-ым раствором коллагеназы I типа ("Sigma", Германия) в PBS (фосфатный буфер). Нейтрализацию фермента проводят равным объемом среды DMEM, содержащий 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (НИИ ЭиМ, РБ). Клетки отмывают 2 раза центрифугированием, клеточный осадок ресуспендируют и в среде DMEM, содержащий 10% ЭТС, 1% антибиотика и 1% глутамина, и засевают в культуральные чашки диаметром 60 мм. Через 24 часа производят смену культуральной среды для удаления не прикрепившихся клеток. В дальнейшем смена среды производится каждые четвертые сутки. По достижении культурами 70-80% конфлюэнтности, клетки их снимают с поверхности культурного пластика с помощью трипсина/ЭДТА, затем активность трипсина ингибируют добавлением среды DMEM, содержащей 10% ЭТС и после двукратного отмывания центрифугированием клетки засевают в культурные чашки для получения первого пассажа.Technique for isolating MSCs from adipose tissue. The lipoaspirate is washed with a sterile Hanks solution with incubation for 45 minutes. with a 0.075% solution of type I collagenase (Sigma, Germany) in PBS (phosphate buffer). The neutralization of the enzyme is carried out with an equal volume of DMEM medium containing 10% fetal calf serum (ETS) (Research Institute of EiM, RB). Cells are washed 2 times by centrifugation, the cell pellet is resuspended in DMEM medium containing 10% ETS, 1% antibiotic and 1% glutamine, and seeded in culture dishes with a diameter of 60 mm. After 24 hours, the culture medium is changed to remove non-adherent cells. Subsequently, a change of medium is made every fourth day. When the cultures reach 70-80% confluency, the cells are removed from the surface of the culture plastic using trypsin / EDTA, then the trypsin activity is inhibited by the addition of DMEM medium containing 10% ETS and, after washing twice by centrifugation, the cells are seeded in culture plates to obtain the first passage.

Недостатками прототипа являются: 1) сложная, длительная и дорогостоящая технология приготовления мезенхимальных стволовых клеток (МСК). 2) введение эмбриональных закладок или стволовых клеток в поврежденные нервные стволы нередко приводит к опухолевым перерождениям трансплантируемых в нерв стволовых клеток. 3) в технике приготовления используют 10% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), что может вызвать иммунный ответ у реципиента.The disadvantages of the prototype are: 1) a complex, lengthy and expensive technology for the preparation of mesenchymal stem cells (MSCs). 2) the introduction of embryonic bookmarks or stem cells into damaged nerve trunks often leads to tumor degeneration of stem cells transplanted into the nerve. 3) in the preparation technique, 10% fetal calf serum (ETS) is used, which can cause an immune response in the recipient.

Целью изобретения является улучшения результатов посттравматической регенерации периферического нерва в виде более полного восстановления двигательной и чувствительной функции в иннервируемых тканях, преодоление протяженных разрывов нерва, сокращения сроков пребывания больных в стационаре и повышения качества жизни больных данного контингента.The aim of the invention is to improve the results of post-traumatic regeneration of the peripheral nerve in the form of a more complete restoration of motor and sensory function in innervated tissues, overcoming extended nerve ruptures, reducing the length of hospital stay of patients and improving the quality of life of patients of this contingent.

Сущность изобретения.SUMMARY OF THE INVENTION

Сущность предлагаемого способа иллюстрирована на фиг. 1, где фиг. поз. 1 - проводник, фиг. 1 поз. 2 - аутоплазма, фиг. 1 поз. 3 - центральный конец пересеченного нерва, фиг. 1 поз. 4 - проксимальный конец пересеченного нерва.The essence of the proposed method is illustrated in FIG. 1, where FIG. pos. 1 - conductor, FIG. 1 item 2 - autoplasma, FIG. 1 item 3 - the central end of the crossed nerve, FIG. 1 item 4 - proximal end of the crossed nerve.

Под общей и местной анестезией в зоне расположения скуловой и щечной ветвей лицевого нерва экспериментального животного проводится разрез длиной 1,5-2 см. После послойного рассечения тканей и обнажения искомых ветвей, проводится выделение их из окружающих тканей в зоне от околоушной слюнной железы до угла рта. Путем иссечения участка длиной 13 мм создается модель дефекта, которая исключает возможность использования прямой нейрорафии. Проводник (фиг. 1 поз. 1) наполняют аутоплазмой (фиг. 1 поз. 2). В проводник помещают центральный конец пересеченного нерва (фиг. 1 поз. 3), и проксимальный конец пересеченного нерва (фиг. 1 поз. 4).Under general and local anesthesia in the area of the zygomatic and buccal branches of the facial nerve of the experimental animal, an incision is made 1.5-2 cm long. After layer-by-layer dissection of the tissues and exposure of the desired branches, they are extracted from the surrounding tissues in the area from the parotid salivary gland to the corner of the mouth . By excising a 13 mm-long section, a defect model is created that excludes the possibility of using direct neurography. The conductor (Fig. 1 pos. 1) is filled with autoplasma (Fig. 1 pos. 2). In the conductor placed the Central end of the crossed nerve (Fig. 1, pos. 3), and the proximal end of the crossed nerve (Fig. 1, pos. 4).

Аутоплазму получают из крови животного, взятой непосредственно перед операцией, путем центрифугирования (со скоростью 1000 об/мин в течение 20 мин.). Аутоплазму вводят шприцом в просвет проводника, который затем помещают в ложе иссеченного нерва и фиксируют узловыми швами к окружающим фасциям. Рана послойно ушивается.Autoplasma is obtained from the blood of an animal taken immediately before surgery by centrifugation (at a speed of 1000 rpm for 20 minutes). The autoplasma is injected with a syringe into the lumen of the conductor, which is then placed in the bed of the excised nerve and fixed with interrupted sutures to the surrounding fascia. The wound is sutured in layers.

Как показали сравнительные исследования, аутоплазма в проводнике оказывает стимуляцию регенераторных процессов, что проявляется в ускорении роста аксонов центрального конца нерва и составляет 1,5 мм в сутки, в то время как в пустом проводнике 1 мм в сутки.As comparative studies have shown, autoplasma in the conductor stimulates regenerative processes, which manifests itself in accelerating the growth of axons of the central end of the nerve and is 1.5 mm per day, while in an empty conductor 1 mm per day.

Пример №1Example No. 1

Белая беспородистая крыса массой 200 гр. Под ингаляционным эфирным наркозом, создавалась модель повреждения двух мышечных ветвей лицевого нерва (скуловой и щечной) путем иссечения их участка лезвием протяженностью 13 мм.White thoroughbred rat weighing 200 gr. Under inhaled ether anesthesia, a model of damage to two muscle branches of the facial nerve (zygomatic and buccal) was created by excising their area with a 13 mm long blade.

В предварительно подготовленный проводник, с помощью инсулинового шприца, вводился наполнитель (аутоплазма), который затем устанавливался в адекватную позицию в ложе иссеченного участка нерва, после чего в него вводились поврежденные концы ветвей лицевого нерва. Фиксация проводника проводилась путем наложения одиночных узловых швов на фасции окружающих тканей. Рана послойно ушивалась.A filler (autoplasm) was introduced into a previously prepared conductor using an insulin syringe, which was then installed in an adequate position in the bed of the excised nerve site, after which damaged ends of the branches of the facial nerve were introduced. The conductor was fixed by applying single nodal sutures to the fascia of the surrounding tissues. The wound was sutured in layers.

Результаты: После вскрытия трубчатого проводника в содержащейся в нем аутоплазме находились проросшие через нее волокна, длина которых на 6-е сутки составляла 7 мм, что составило 1,5 мм в сутки.Results: After opening the tubular conductor, the autoplasma contained in it contained fibers sprouted through it, the length of which on the 6th day was 7 mm, which was 1.5 mm per day.

Пример: №2Example: No. 2

Белая беспородистая крыса массой 220 гр. Модель дефекта мышечных ветвей (скуловой и щечной) лицевого нерва длинной 13 мм, создавалась по аналогичной этапности.White thoroughbred rat weighing 220 gr. A model of a defect in the muscle branches (zygomatic and buccal) of the facial nerve, 13 mm long, was created according to similar stages.

В проводник вводилась аутоплазма, после чего проводник устанавливался в ложе дефекта нерва и в него вводились поврежденные концы нерва. Фиксация проводилась одиночными узловыми швами, накладываемыми на окружающие ткани. Рана послойно ушиваласьAutoplasma was introduced into the conductor, after which the conductor was installed in the bed of the nerve defect and the damaged ends of the nerve were introduced into it. Fixation was carried out by single interrupted sutures superimposed on the surrounding tissue. The wound was sutured in layers

Результаты: После вскрытия трубчатого проводника в содержащейся в нем аутоплазме находились проросшие через нее волокна, длина которых на 8-е сутки составляла 10 мм, что составило 1,5 мм в сутки.Results: After opening the tubular conductor, the autoplasma contained in it contained fibers sprouted through it, the length of which on the 8th day was 10 mm, which was 1.5 mm per day.

Признаки изобретения отличительные от прототипа:The features of the invention distinctive from the prototype:

1. В предлагаемом способе для стимуляции посттравматической регенерации используется аутоплазма крови.1. In the proposed method for the stimulation of post-traumatic regeneration uses autoplasm of the blood.

В прототипе с этой целью применяется суспензия с мезенхимальными стволовыми клетками.In the prototype, a suspension with mesenchymal stem cells is used for this purpose.

2. по предлагаемому способу для приготовления аутоплазмы используют кровь, взятую непосредственно перед операцией. Добавление консервантов не требуется.2. according to the proposed method for the preparation of autoplasma using blood taken immediately before surgery. Addition of preservatives is not required.

3. скорость регенерации нервов в просвете проводника в аутоплазме составляет 1,5 мм, что составляет 1,5 мм в сутки, в то время как в проводнике без аутоплазмы рост составляет 1 мм в сутки.3. The rate of nerve regeneration in the lumen of the conductor in the autoplasma is 1.5 mm, which is 1.5 mm per day, while in the conductor without autoplasma the growth is 1 mm per day.

Технический эффект от применения предлагаемого способаThe technical effect of the application of the proposed method

Использование предлагаемого способа стимуляции регенерации нерва при тубулизации по сравнению с существующими способами имеет следующие преимущества: усиление скорости направленного роста аксонов в зоне пересеченного нерва, что подтверждает анализ гистопрепаратов с более выраженными процессами регенерации в результате усиления ангиогенеза с образованием продольно ориентированных пучков нежных коллагеновых волокон и пучков леммоцитов. Помимо восстановления целостности и проводимости нервов в более ранние сроки после травмы, репаративные процессы протекают лучше, воспалительные изменения менее выражены, что ведет к улучшению регенерации нервного волокна.Using the proposed method for stimulating nerve regeneration during tubulation compared with existing methods has the following advantages: increased directed growth of axons in the crossed nerve zone, which confirms the analysis of histopathological preparations with more pronounced regeneration processes as a result of increased angiogenesis with the formation of longitudinally oriented bundles of tender collagen fibers and bundles lemmocytes. In addition to restoring the integrity and conduction of nerves at an earlier time after an injury, reparative processes proceed better, inflammatory changes are less pronounced, which leads to an improvement in the regeneration of nerve fiber.

Скорость регенерации нервов в просвете проводника в аутоплазме составляет 1,5 мм в сутки.The rate of nerve regeneration in the lumen of the conductor in the autoplasma is 1.5 mm per day.

Экономическая эффективность и технологическая доступность методики получения и применения аутоплазмы, непосредственно перед или во время операции. Минимален риск иммунных реакций организма на введение стимулятора.Economic efficiency and technological accessibility of the technique for obtaining and using autoplasma, immediately before or during surgery. The risk of immune reactions of the body to the introduction of a stimulant is minimal.

Положительным эффектом предлагаемого способа является усиление регенераторных процессов направленного роста аксонов, особенно при наличии протяженных дефектов между концами поврежденного периферического нерва.A positive effect of the proposed method is to enhance the regenerative processes of directed axon growth, especially in the presence of extended defects between the ends of the damaged peripheral nerve.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что заявляемый способ позволяет эффективно стимулировать регенерацию миелиновых волокон, улучшая восстановление функции проводимости нерва при его разрывах, за счет использования адекватного биосовместимого наполнителя внутри проводника в зоне потенциального пространства регенерации нерва.Thus, the obtained results indicate that the inventive method can effectively stimulate the regeneration of myelin fibers, improving the restoration of the function of nerve conduction during ruptures due to the use of an adequate biocompatible filler inside the conductor in the area of the potential nerve regeneration space.

Актуальность предлагаемой методики связана с важностью вопроса ранней посттравматической реконструкции поврежденного периферического нерва с последующим полноценным восстановлением функции иннервируемых им тканей.The relevance of the proposed method is associated with the importance of the issue of early post-traumatic reconstruction of a damaged peripheral nerve with subsequent full restoration of the function of the tissues innervated by it.

Информация принятая во вниманиеInformation taken into account

Способ стимуляции восстановления поврежденного нерва мезенхимальными стволовыми клетками (журнал Медицинские новости №10 2011. Д.Ю. Петрова, В.Н. Подгайский, М.К. Недзьведь и др. "Возможность восстановления поврежденных периферических нервов при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток". с. 9-72).A method of stimulating the restoration of a damaged nerve by mesenchymal stem cells (Medical News Magazine No. 10 2011. D.Yu. Petrova, VN Podgaysky, MK Nedzved and others. "The possibility of repairing damaged peripheral nerves during transplantation of mesenchymal stem cells." . 9-72).

Claims (1)

Способ стимуляции регенерации мышечных ветвей лицевого нерва в эксперименте, отличающийся тем, что в проводник вводят аутоплазму, взятую непосредственно перед операцией, путем центрифугирования со скоростью 1000 об/мин в течение 20 мин, затем в аутоплазму помещают центральный и проксимальный концы пересеченного нерва, проводник фиксируют в ложе пересеченного нерва путем наложения одиночных узловых швов на фасции окружающих тканей.A method of stimulating the regeneration of muscle branches of the facial nerve in an experiment, characterized in that autoplasma taken immediately before the operation is introduced into the conductor by centrifugation at a speed of 1000 rpm for 20 minutes, then the central and proximal ends of the crossed nerve are placed in the autoplasma, the conductor is fixed in the bed of the crossed nerve by applying single nodal sutures to the fascia of the surrounding tissues.

Images