RU2697519C1 - Peptide agent comprising a psma-binding ligand based on a urea derivative, a method for production thereof and use thereof for preparing a conjugate with a drug and diagnostic agent - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.SUBSTANCE: present invention relates to a substance of general formula(I),where n = 3-5; X, Y, Z independently represent F, Cl, Br, H; R = OH, H; R= H, Br. Invention also relates to a method of producing such a substance, to use thereof for producing a conjugate with a drug or diagnostic agent for diagnosing or treating diseases caused by cells expressing a prostatic specific membrane antigen (PSMA), as well as to the conjugate itself.EFFECT: obtaining novel means of delivering diagnostic or therapeutic agents, including PSMA-ligand with a linker, having low toxicity, high affinity and selectivity of action on cells expressing PSMA, which enables to use them for treating diseases associated with high expression PSMA, with a lower dosage with selective action on cancer cells, without affecting healthy cells.12 cl, 20 dwg, 1 tbl, 1 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области органической и медицинской химии, а также молекулярной биологии и касается нового класса соединений, которые могут быть использованы в качестве средств для доставки лекарственных или диагностических соединений (агентов) для диагностики или лечения онкологических заболеваний. В частности, диагностики или лечения заболеваний, вызванных клетками, экспрессирующими ПСМА, такими как клетки рака предстательной железы.The invention relates to the field of organic and medical chemistry, as well as molecular biology, and relates to a new class of compounds that can be used as means for the delivery of medicinal or diagnostic compounds (agents) for the diagnosis or treatment of cancer. In particular, the diagnosis or treatment of diseases caused by cells expressing PSMA, such as prostate cancer cells.

Уровень техникиState of the art

Рак простаты является наиболее распространенным злокачественным заболеванием у мужчин и занимает второе место среди причин смертности в западном мире. По состоянию на 2016 год, общее количество больных раком предстательной железы, зарегистрированных на территории России, составило более 200 тыс. человек. Прирост количества больных по отношению к 2015 году составил 8,0%. В настоящее время не существует радикального лечения нерезектабельных опухолей простаты. Концентрации лекарственных средств, которые могли бы полностью уничтожить опухоль, обычно нельзя достичь из-за ограничивающих дозу побочных действий, таких как токсичность для желудочно-кишечного тракта и костного мозга. Кроме того, у опухолей после продолжительного лечения может развиваться резистентность против противораковых средств. Из-за высокой смертности и болезненности, связанной с прогрессированием заболевания, крайне необходимо развитие новых способов и средств направленной терапии. Поэтому при разработке современных лекарственных средств нацеливание цитотоксических средств на область опухоли может рассматриваться как одна из важнейших задач.Prostate cancer is the most common malignant disease in men and is the second leading cause of death in the Western world. As of 2016, the total number of prostate cancer patients registered in Russia amounted to more than 200 thousand people. The increase in the number of patients compared to 2015 was 8.0%. There is currently no radical cure for unresectable prostate tumors. Concentrations of drugs that could completely destroy the tumor cannot usually be achieved due to dose-limiting side effects, such as toxicity to the gastrointestinal tract and bone marrow. In addition, after prolonged treatment, tumors may develop resistance against anticancer agents. Due to the high mortality and pain associated with the progression of the disease, the development of new methods and means of targeted therapy is urgently needed. Therefore, in the development of modern drugs, targeting cytotoxic drugs to the tumor area can be considered as one of the most important tasks.

Среди потенциальных маркеров, которые были идентифицированы при раке простаты, наиболее известным, является специфический для простаты мембранный антиген (ПСМА, PSMA). Этот трансмембранный гликопротеид II типа, молекулярной массой примерно 100 кДа, состоит из короткого внутриклеточного участка (аминокислоты 1-18), трансмембранного домена (аминокислоты 19-43) и протяженного внеклеточного домена (аминокислоты 44-750), который экспрессируется главным образом в нормальном эпителии простаты человека, но коррелирует с повышением в раковой простате, включая метастазирование. Поскольку PSMA экспрессируется практически всеми раками простаты и его экспрессия еще больше усиливается в низкодифференцированных, метастатических и гормононезависимых карциномах, он является весьма привлекательной целью для визуализации и терапии простаты.Among the potential markers that have been identified in prostate cancer, the best known is the prostate-specific membrane antigen (PSMA, PSMA). This type II transmembrane glycoprotein, with a molecular weight of approximately 100 kDa, consists of a short intracellular region (amino acids 1-18), a transmembrane domain (amino acids 19-43) and an extended extracellular domain (amino acids 44-750), which is expressed mainly in normal epithelium human prostate, but correlates with an increase in the prostate cancer, including metastasis. Since PSMA is expressed by almost all prostate cancers and its expression is further enhanced in low-grade, metastatic and hormone-independent carcinomas, it is a very attractive target for imaging and therapy of the prostate.

Наиболее близким к заявляемому соединению является простат-специфический антиген для эндотерапии рака предстательной железы, в одном из частных воплощений изобретения соединения характеризуются наличием в структуре мочевины на основе глутаминовой кислоты и лизина (DCL) ароматического фрагмента при ε-положении лизина и в структуре линкера, в виде дипептида из ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина, а также его бром-замещенных аналогов, с различной конфигурацией оптического центра аминокислот, который необходим для соединения с доставляемой молекулой, и хелатирующий агент для включения металла или радиометалла (международная заявка WO 2017165473). Однако, наличие в структуре мочевины на основе глутаминовой кислоты и лизина (DCL), только ароматического фрагмента при омега положении лизина не обеспечивает точное позиционирование соединения в структуре ПСМА, что в свою очередь снижает эффективность связывания препарата с мишенью и эффективность действия соединения в целом. В заявке также раскрыт способ получения соединений, заключающийся в алкилировании на первом этапе три-(трет-бутил) защищенного производного мочевины на основе глутаминовой кислоты и лизина, последующей реакцией ацилирования получившегося продукта Вос-аминопентановой кислотой. Делее проводится удаление Вос-защитной группы в присутствии трифторуксуной кислоты в дихлорметане, с последующим получением конъюгата с хелатирующей группой. Однако в синтезе данного соединения используется в качестве восстанавливающего агента, на стадии алкилирования лизина цианоборгидрид натрия, который является токсичным реагентом. Так же использование ВОС-производного аминопентановой кислоты не позволяет избирательно получить аминопроизводное с защищенными карбоксильными группами, что значительно усложняет дальнейшую модификацию молекулы.Closest to the claimed compound is a prostate-specific antigen for endotherapy of prostate cancer, in one particular embodiment of the invention, the compounds are characterized by the presence of an aromatic fragment in the urea structure based on glutamic acid and lysine (DCL) at the ε-position of the lysine and in the structure of the linker, as a dipeptide of aromatic amino acids phenylalanine and tyrosine, as well as its bromine-substituted analogues, with a different configuration of the optical center of amino acids, which is necessary for I delivered molecule and a chelating agent to include metal or radiometal (WO 2017165473 application). However, the presence in the urea structure based on glutamic acid and lysine (DCL), only an aromatic fragment at the omega position of lysine, does not provide accurate positioning of the compound in the PSMA structure, which in turn reduces the efficiency of drug binding to the target and the overall effect of the compound. The application also discloses a method for preparing compounds, which comprises, in the first step, alkylation of a tri- (tert-butyl) protected urea derivative based on glutamic acid and lysine, followed by an acylation reaction of the resulting product with Boc-aminopentanoic acid. Subsequently, the Boc-protecting group is removed in the presence of trifluoroacetic acid in dichloromethane, followed by the preparation of a conjugate with a chelating group. However, in the synthesis of this compound is used as a reducing agent, in the stage of lysine alkylation, sodium cyanoborohydride, which is a toxic reagent. Also, the use of a BOC-derivative of aminopentanoic acid does not allow selective production of an amino derivative with protected carboxyl groups, which greatly complicates the further modification of the molecule.

Таким образом, недостатком известных соединений (конъюгатов) является их низкая эффективность связывания с мишенью и, как следствие, необходимость использования доставляемых препаратов в более высоких концентрациях, что может вызывать специфическую цитотоксичность.Thus, the disadvantage of the known compounds (conjugates) is their low binding efficiency to the target and, as a consequence, the need to use the delivered drugs in higher concentrations, which can cause specific cytotoxicity.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей настоящего изобретения является разработка новых средств доставки диагностических или терапевтических средств, включающих ПСМА-лиганд с линкером, соединения, являющегося средством для доставки лекарственного или диагностического агента и способ его получения.The present invention is the development of new means of delivery of diagnostic or therapeutic agents, including the PSMA ligand with a linker, a compound that is a means for the delivery of a medicinal or diagnostic agent and a method for its preparation.

Техническим результатом заявляемой группы изобретений является высокая аффинность и селективность действия заявляемых соединений в отношении клеток, экспрессирующих ПСМА. Данные соединения позволяют расшить арсенал перспективных кандитатов для разработки лекарственных и диагностических средств для лечения заболеваний, связанных с высокой экспрессией ПСМА, с меньшей дозировкой при избирательном действии на раковые клетки, не затрагивая здоровые клетки. Новые соединения обладают низкой токсичностью, о чем свидетельствует отсутствие активности на клеточной линии здоровых клеток легочного эпителия человека. Заявляемый способ получения соединений является более экологичным и безопасным за счет применения менее токсичных реагентов. Использование для восстановительного аминирования триацетоксиборогидрида натрия вместо цианоборогидрида натрия позволяет избежать возможности отравления персонала черезвычайно токсичным и летучим циановодородом, который выделяется как побочный продукт при использовании цианоборогидрида натрия. Так же использование азидопроизводного аминопентановой кислоты вместо ВОС-производного при синтезе линкера позволяет избежать использования коррозионной и токсичной трифторуксусной кислоты. Кроме того, использование азидопроизводного аминопентановой кислоты позволяет получить ПСМА вектор с длинным гидрофобным линкером и защищенными карбоксигрупами, что в свою очередь облегчает его модификацию, увеличивает выход и снижает количество используемых в процессе растворителей вследствие значительного увеличения растворимости исходного соединения (ПСМА вектор с длинным гидрофобным линкером и защищенными карбоксигрупами).The technical result of the claimed group of inventions is the high affinity and selectivity of the claimed compounds in relation to cells expressing PSMA. These compounds allow us to expand the arsenal of promising candidates for the development of drugs and diagnostic tools for the treatment of diseases associated with high expression of PSMA, with a lower dosage with a selective effect on cancer cells without affecting healthy cells. The new compounds have low toxicity, as evidenced by the lack of activity on the cell line of healthy human pulmonary epithelial cells. The inventive method for producing compounds is more environmentally friendly and safe through the use of less toxic reagents. The use of sodium triacetoxyborohydride instead of sodium cyanoborohydride for reductive amination avoids the possibility of poisoning personnel with extremely toxic and volatile hydrogen cyanide, which is released as a by-product when using sodium cyanoborohydride. Also, the use of the azide derivative of aminopentanoic acid instead of the BOC derivative in the synthesis of the linker avoids the use of corrosive and toxic trifluoroacetic acid. In addition, the use of the azide derivative of aminopentanoic acid makes it possible to obtain a PSMA vector with a long hydrophobic linker and protected carboxy groups, which in turn facilitates its modification, increases the yield and reduces the number of solvents used in the process due to a significant increase in the solubility of the starting compound (PSMA vector with a long hydrophobic linker and protected carboxy groups).

Ключевой особенностью заявляемого соединения является наличие в структуре длинного гидрофобного линкера, а также дополнительных ароматических фрагментов, наличие которых, способствует лучшему связыванию заявляемого средства с белковой мишенью, за счет вовлечения дополнительных взаимодействий между соединением и гидрофобными карманами в структуре гидрофобного туннеля белковой мишени.A key feature of the claimed compound is the presence in the structure of a long hydrophobic linker, as well as additional aromatic fragments, the presence of which contributes to better binding of the claimed agent to the protein target, due to the involvement of additional interactions between the compound and hydrophobic pockets in the structure of the hydrophobic tunnel of the protein target.

Поставленная задача решается средством для доставки лекарственного или диагностического агента, представляющим собой ковалентно-связанные ПСМА-связывающий лиганд на основе производного мочевины структуры DCL и модифицированный гидрофобный пептидный линкер, включающий фрагменты 6-аминогексановой или 5-аминопентановой или 4-аминобутановой кислот, фрагмент фенилаланина, фрагмент тирозина или его производное, общей формулы:The problem is solved by a means for the delivery of a medicinal or diagnostic agent, which is a covalently linked PSMA binding ligand based on a DCL urea derivative and a modified hydrophobic peptide linker comprising fragments of 6-aminohexanoic or 5-aminopentanoic or 4-aminobutanoic acid, a phenylalanine fragment, a tyrosine fragment or its derivative of the general formula:

где n=3-5, где X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н; R=ОН, Н; R₁=Н, Br.where n = 3-5, where X, Y, Z independently of each other represent F, Cl, Br, H; R = OH, H; R ₁ = H, Br.

Также поставленная задача решается способом получения заявляемого средства, включающим получение тритретбутилового производного ПСМА-связывающего лиганда формулы (2):Also, the problem is solved by the method of obtaining the claimed funds, including obtaining tritrebutyl derivative of the PSMA-binding ligand of the formula (2):

с последующим алкилированием полученного тритретбутилового производного ПСМА-связывающего лиганда с получением соединения общей формулы (II):followed by alkylation of the obtained tritrebutyl derivative of the PSMA-binding ligand to obtain a compound of General formula (II):

,

,

где X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н,where X, Y, Z independently from each other represent F, Cl, Br, H,

с последующим получением соединения, содержащего алкилированное тритретбутил производное ПСМА-лиганда и фрагмент линкера, представляющего собой алкильный фрагмент, включающий 3-5 атомов углерода общей формулы (III):followed by the preparation of a compound containing an alkylated tritrebutyl derivative of a PSMA ligand and a linker fragment, which is an alkyl fragment comprising 3-5 carbon atoms of the general formula (III):

,

,

где X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н, n=3-5,where X, Y, Z independently of each other are F, Cl, Br, H, n = 3-5,

которое модифицируют янтарным ангидридом, с получением производного соединения ацилированного янтарным ангидридом, далее осуществляют получение дипептидов производных ароматических аминокислот, представляющих собой фенилаланил-фенилаланин или фенилаланил-тирозин общей формулы (IV), для связывания с модифицированным фрагментом линкера,which is modified with succinic anhydride to obtain a derivative of the compound acylated with succinic anhydride, then the dipeptides of derivatives of aromatic amino acids representing phenylalanyl-phenylalanine or phenylalanyl-tyrosine of the general formula (IV) are prepared to bind to the modified linker fragment,

,

,

где R=ОН, Н; R₁=Н, Br, затем получают тритретбутил производное радикала ПСМА-связывающего лиганда и модифицированного гидрофобного пептидного линкера, включающего фрагменты 6-аминогексановой или 5-аминопентановой или 4-аминобутановой кислот, фрагмент фенилаланина или его производное, фрагмент тирозина или его производное общей формулы (V):where R = OH, H; R ₁ = H, Br, then a tritrebutyl derivative of a PSMA-binding ligand radical and a modified hydrophobic peptide linker including 6-aminohexanoic or 5-aminopentanoic or 4-aminobutanoic acid fragments, a phenylalanine fragment or its derivative, a tyrosine fragment or its derivative of the general formula (V):

,

,

где n=3-5, X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н; R=ОН, Н; R₁=Н, Brwhere n = 3-5, X, Y, Z independently of each other represent F, Cl, Br, H; R = OH, H; R ₁ = H, Br

с последующим удалением тритретбутильных защитных групп соединения формулы (V) с получением ковалентно-связанных ПСМА-связывающего лиганда и модифицированного гидрофобного пептидного линкера общей формулы (I).followed by removal of the tritrebutyl protective groups of the compounds of formula (V) to obtain covalently linked PSMA binding ligand and a modified hydrophobic peptide linker of the general formula (I).

При этом получение алкилированного тритретбутил производного ПСМА-лиганда осуществляют путем восстановительного аминирования замещенными бензальдегидами, а получение соединения формулы (III) проводят путем ацилирования производными азида бутановой или пентановой или гексановой кислот с получением азидного производного с последующей реакцией восстановления азида до аминогруппы. Реакцию восстановления азида до аминогруппы проводят в присутствии трифенилфосфина и воды в растворе ТГФ или в растворе метанола с использованием водорода в присутствии палладия на углероде в качестве катализатора. Модификацию янтарным ангидридом фрагмента линкера, представляющего собой алкильный фрагмент, включающий 3-5 атомов углерода осуществляют реакцией ацилирования янтарным ангидридом аминогруппы в присутствии ненуклиофильных оснований, в качестве которых используют диизопропилэтиламин или триэтиламин. Получение тритретбутил производного конъюгата формулы (V) осуществляют реакцией ацилирования производным соединения (III), ацилированного янтарным ангидридом, дипептида формулы (IV), а удаление тритретбутильных защитных групп проводят в присутствии 9-11% ТФУ в течение 15-17 часов в дихлорметане.In this case, the production of the alkylated tritrebutyl derivative of the PSMA ligand is carried out by reductive amination with substituted benzaldehydes, and the preparation of the compound of formula (III) is carried out by acylation of the butane or pentanoic or hexanoic acid azide derivatives to obtain the azide derivative followed by the reduction of the azide to the amino group. The reaction of reducing azide to an amino group is carried out in the presence of triphenylphosphine and water in a THF solution or in a methanol solution using hydrogen in the presence of palladium on carbon as a catalyst. The modification with succinic anhydride of the linker fragment, which is an alkyl fragment containing 3-5 carbon atoms, is carried out by the acylation reaction with succinic anhydride of the amino group in the presence of non-nucleophilic bases, which are used as diisopropylethylamine or triethylamine. Obtaining tritrebutyl derivative of the conjugate of formula (V) is carried out by an acylation reaction with a derivative of compound (III) acylated with succinic anhydride, a dipeptide of formula (IV), and the removal of tritrebutyl protective groups is carried out in the presence of 9-11% TFA for 15-17 hours in dichloromethane.

Поставленная задача также решается применением заявляемого средства для образования конъюгата с лекарственным или диагностическим агентом. При этом лекарственные или диагностические агенты являются средствами для диагностики или лечения заболеваний, вызванных клетками, экспрессирующими ПСМА, таким как рак предстательной железы.The problem is also solved by the use of the claimed means for the formation of a conjugate with a medicinal or diagnostic agent. Moreover, drug or diagnostic agents are agents for diagnosing or treating diseases caused by cells expressing PSMA, such as prostate cancer.

Общая схема синтеза заявляемого средства для доставки лекарственного или диагностического агента представлена на фиг. 1, 2 и 3.A general synthesis scheme of the inventive drug or diagnostic agent delivery agent is shown in FIG. 1, 2 and 3.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг. 1, 2 и 3 представлена общая схема синтеза заявляемого средства. In FIG. 1, 2 and 3 presents a General scheme for the synthesis of the claimed funds.

На фиг. 4 представлены графики интенсивности флуоресцентного сигнала клеток LNCaP, 22Rv1, РС3 при воздействии конъюгатами (80) - №1, (79) - №2 и без воздействия. Данные представлены как среднее со стандартным отклонением, где

- LNCaP,

- 22Rv1,

- РС3.In FIG. Figure 4 shows graphs of the intensity of the fluorescent signal of LNCaP, 22Rv1, PC3 cells when exposed to conjugates (80) - No. 1, (79) - No. 2 and without exposure. Data are presented as mean with standard deviation, where

- LNCaP,

- 22Rv1,

- PC3.

На фиг. 5 представлено изображение клеток 22Rv1 после воздействия коньюгатом формулы (80) в течение одного часа, зеленый цвет маркирует накопление флуоресцентного сигнала FAM (GFP канал), в синий цвет окрашены ядра клеток (DAPI).In FIG. Figure 5 shows the image of 22Rv1 cells after exposure to a conjugate of formula (80) for one hour, green indicates the accumulation of the FAM fluorescence signal (GFP channel), cell nuclei (DAPI) are colored blue.

На фиг. 6 представлено изображение клеток 22Rv1 после воздействия заявляемым средством (соединение формулы (79)) в течение одного часа, зеленый цвет маркирует накопление флуоресцентного сигнала FAM (GFP канал), в синий цвет окрашены ядра клеток (DAPI).In FIG. 6 presents the image of 22Rv1 cells after exposure to the claimed agent (compound of formula (79)) for one hour, green indicates the accumulation of the fluorescent signal FAM (GFP channel), cell nuclei (DAPI) are colored blue.

На фиг. 7 представлено изображение клеток LNCaP после воздействия коньюгатом формулы (80) в течение одного часа, зеленый цвет маркирует накопление флуоресцентного сигнала FAM (GFP канал), в синий цвет окрашены ядра клеток (DAPI).In FIG. Figure 7 shows the image of LNCaP cells after exposure to a conjugate of formula (80) for one hour, green indicates the accumulation of the FAM fluorescent signal (GFP channel), cell nuclei (DAPI) are colored blue.

На фиг. 8 представлено изображение клеток LNCaP после воздействия заявляемым средством (соединение формулы (79)) в течение одного часа, зеленый цвет маркирует накопление флуоресцентного сигнала FAM (GFP канал), в синий цвет окрашены ядра клеток (DAPI).In FIG. 8 shows an image of LNCaP cells after exposure to the inventive agent (compound of formula (79)) for one hour, green indicates the accumulation of the fluorescent FAM signal (GFP channel), cell nuclei (DAPI) are colored blue.

На фиг. 9 представлено изображение клеток РС3 после воздействия коньюгатом формулы (80) в течение одного часа, зеленый цвет маркирует накопление флуоресцентного сигнала FAM (GFP канал), в синий цвет окрашены ядра клеток (DAPI).In FIG. Figure 9 shows the image of PC3 cells after exposure to the conjugate of formula (80) for one hour, green indicates the accumulation of the FAM fluorescent signal (GFP channel), cell nuclei (DAPI) are colored blue.

На фиг. 10 представлено изображение клеток РС3 после воздействия коньюгатом формулы (79) в течение одного часа, зеленый цвет маркирует накопление флуоресцентного сигнала FAM (GFP канал), в синий цвет окрашены ядра клеток (DAPI).In FIG. Figure 10 shows an image of PC3 cells after exposure to a conjugate of formula (79) for one hour, green indicates the accumulation of the FAM fluorescent signal (GFP channel), cell nuclei (DAPI) are colored blue.

На фиг. 11 представлена гистограмма экспрессии сигнала FAM клеточными популяциями в линиях 22RV1, LNCaP, РС3 при воздействии коньюгата формулы (80) - №1 и результаты эксперимента при предварительной инкубации с избытком заявляемого средства - К.In FIG. 11 shows a histogram of FAM signal expression by cell populations in lines 22RV1, LNCaP, PC3 when exposed to a conjugate of formula (80) - No. 1 and the experimental results during preliminary incubation with an excess of the claimed drug - K.

На фиг. 12 показано графическое представление процента клеток, экспрессирующих FAM флуорисцентный сигнал. К - результаты эксперимента при предварительной инкубации с избытком заявляемого средства (соединение формулы (80)) в течение 60 мин.In FIG. 12 is a graphical representation of the percentage of cells expressing a FAM fluorescent signal. K - the results of the experiment during preliminary incubation with an excess of the claimed funds (compound of formula (80)) for 60 minutes

На фиг. 13 представлена гистограмма экспрессии сигнала FAM клеточными популяциями в линиях 22RV1, LNCaP, РС3 при воздействии коньюгата формулы (79) - №2 и результаты эксперимента при предварительной инкубации с избытком заявляемого средства - К.In FIG. 13 shows a histogram of FAM signal expression by cell populations in lines 22RV1, LNCaP, PC3 when exposed to a conjugate of formula (79) - No. 2 and the experimental results during preliminary incubation with an excess of the claimed drug - K.

На фиг. 14 - графическое представление процента клеток, экспрессирующих FAM флуорисцентный сигнал. К - результаты эксперимента при предварительной инкубации с избытком заявляемого средства (соединение формулы (79)) в течение 60 мин.In FIG. 14 is a graphical representation of the percentage of cells expressing a FAM fluorescent signal. K - the results of the experiment during preliminary incubation with an excess of the claimed funds (compound of formula (79)) for 60 minutes

На фиг. 15 представлен масс-спектр соединения (82).In FIG. 15 shows the mass spectrum of compound (82).

На фиг. 16 показан ¹Н-ЯМР спектр соединения (83).In FIG. 16 shows the ¹ H-NMR spectrum of compound (83).

На фиг. 17 представлен масс-спектр соединения (83).In FIG. 17 shows the mass spectrum of compound (83).

На фиг. 18, 19 представлена схема образование коньюгата с лекарственным соединением - доцетакселем.In FIG. 18, 19 is a diagram of the formation of a conjugate with a drug compound - docetaxel.

На фиг. 20 представлена схема синтеза ПСМА-векторного фрагмента на основе дипептида L-фенилаланил-L-тирозина (L-Phe-L-Tyr (33)).In FIG. 20 shows a synthesis scheme for a PSMA vector fragment based on the L-phenylalanyl-L-tyrosine dipeptide (L-Phe-L-Tyr (33)).

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Ниже приведены определения терминов, которые используются в описании настоящего изобретения.The following are definitions of terms that are used in the description of the present invention.

«ПСМА (PSMA)» - трансмембранный гликопротеид II типа с массой - 100 кДа, состоящий из 750 аминокислот. Данный белок состоит из короткого внутриклеточного участка (1-18 аминокислоты), трансмембранного домна (19-43 аминокислоты) и большого внеклеточного домена (44-750 аминокислоты). Данный белок обладает высокой экспрессией в тканях предстательной железы, в связи с этим является перспективной мишенью для адресной доставки."PSMA (PSMA)" is a transmembrane type II glycoprotein with a mass of 100 kDa, consisting of 750 amino acids. This protein consists of a short intracellular region (1-18 amino acids), a transmembrane domain (19-43 amino acids) and a large extracellular domain (44-750 amino acids). This protein has a high expression in the tissues of the prostate gland, and therefore is a promising target for targeted delivery.

В заявляемом техническом решении под средством для доставки лекарственного или диагностического агента, представляющее собой ковалентно-связанные ПСМА-связывающий лиганд и модифицированный гидрофобный пептидный линкер, включающий фрагменты 6-аминогексановой или 5-аминопентановой или 4-аминобутановой кислот, фрагмент фенилаланина, фрагмент тирозина или его производное. Термин «конъюгат» в заявляемом техническом решении означает соединение включающее средство для доставки с лекарственным или диагностическим агентом.In the claimed technical solution under the means for delivery of a medicinal or diagnostic agent, which is a covalently linked PSMA-binding ligand and a modified hydrophobic peptide linker comprising fragments of 6-aminohexanoic or 5-aminopentanoic or 4-aminobutanoic acid, a phenylalanine fragment, a tyrosine fragment or its derivative. The term "conjugate" in the claimed technical solution means a compound comprising a means for delivery with a medicinal or diagnostic agent.

EDC*HCl - 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлоридEDC * HCl - 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

PFPOH - пентафторфенолPFPOH - Pentafluorophenol

НОВТ - гидроксибензотриазолNOVT - hydroxybenzotriazole

HBTU - 3-[Бис(диметиламино)метилиумил]-3Н-бензотриазол-1-оксид гексафторфосфатHBTU - 3- [Bis (dimethylamino) methyl methyl] -3H-benzotriazole-1-oxide hexafluorophosphate

EtOAc/MeOH - этилацетат/метанолEtOAc / MeOH - ethyl acetate / methanol

DMAP - 4-диметиламинопиридинDMAP - 4-dimethylaminopyridine

DCM - дихлорметанDCM - Dichloromethane

DIC - диизопропилкарбодиимидDIC - diisopropylcarbodiimide

DMF - ДМФАDMF - DMF

DIPEA - диизопропилэтиламинDIPEA - Diisopropylethylamine

TFA - трифторуксусная кислотаTFA - trifluoroacetic acid

ДХМ - дихлорметанDXM - Dichloromethane

PBS - натрий-фосфатный буферPBS - Sodium Phosphate Buffer

FBS - фетальная телячья сывороткаFBS - Fetal Calf Serum

PPh₃ - трифенилфосфинPPh ₃ - triphenylphosphine

РуВОР - бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфоний гексафторфосфатRuVOR - benzotriazol-1-yl-hydroxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate

THF - тетрагидрофуранTHF - tetrahydrofuran

ВОС₂О - ди-третбутил дикарбонатBOC ₂ O - di-tert-butyl dicarbonate

«IC₅₀» (ПК₅₀) - концентрация соединения, при которой наблюдается 50% ингибирование ферментативной активности"IC ₅₀ " (PK ₅₀ ) - the concentration of the compound at which 50% inhibition of enzymatic activity is observed

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, выпаривание растворителя осуществляли с использованием роторного испарителя, при пониженном давлении при температуре бани примерно 50°С; контроль за ходом реакции осуществляли при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ), и время реакции указано только для иллюстрации; структуру и чистоту всех выделенных соединений подтверждали, по меньшей мере, одним из следующих методов: ТСХ (пластины для ТСХ с предварительно нанесенным силикагелем 60 F₂₅₄ Merck), масс-спектрометрия или ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Выход продукта приведен только для иллюстрации. Колоночную флэш-хроматографию осуществляли, используя Merck силикагель 60 (230-400 меш ASTM). Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) зарегистрированы на спектрометре Bruker microTOF II. Спектры ЯМР регистрировали на приборах Bruker Avance-400 (рабочая частота 400.1 и 100.6 МГц для ¹Н и ¹³С, соответственно) и Agilent 400-MR (рабочая частота 400.0 и 100.6 МГц для ¹Н и ¹³С, соответственно), используя дейтерированный хлороформ (99,8% D) или ДМСО (99,9% D) в качестве растворителя, если не указано иное, относительно тетраметилсилана (TMS) в качестве внутреннего стандарта, миллионных долях (м.д.); обычные используемые сокращения следующие: с - синглет, д - дублет, т - триплет, кв - квартет, м - мультиплет, шир. - широкий и так далее.All reagents used are commercially available; the solvent was evaporated using a rotary evaporator under reduced pressure at a bath temperature of about 50 ° C; the progress of the reaction was monitored by thin layer chromatography (TLC), and the reaction time is indicated for illustration only; the structure and purity of all isolated compounds was confirmed by at least one of the following methods: TLC (TLC plates with 60 F ₂₅₄ Merck pre-coated silica gel), mass spectrometry, or nuclear magnetic resonance (NMR). The product yield is for illustration only. Flash column chromatography was performed using Merck silica gel 60 (230-400 mesh ASTM). High resolution mass spectra (HRMS) were recorded on a Bruker microTOF II spectrometer. NMR spectra were recorded on Bruker Avance-400 instruments (operating frequency 400.1 and 100.6 MHz for ¹ N and ¹³ C, respectively) and Agilent 400-MR (operating frequency 400.0 and 100.6 MHz for ¹ N and ¹³ C, respectively) using deuterated chloroform (99.8% D) or DMSO (99.9% D) as a solvent, unless otherwise indicated, relative to tetramethylsilane (TMS) as an internal standard, ppm (ppm); The usual abbreviations used are as follows: s - singlet, d - doublet, t - triplet, q - quartet, m - multiplet, width. - wide and so on.

В некоторых вариантах воплощения, опухолевые клетки могут экспрессировать PSMA, такие как клетки опухоли предстательной железы или метастазированные клетки опухоли предстательной железы. В других вариантах воплощения, опухоль можно лечить путем прицельного действия на прилегающие или расположенные рядом клетки, которые экспрессируют PSMA. Например, можно прицельно воздействовать на сосудистые клетки, в которых возникает ангиогенез, связанный с опухолью. По существу, все солидные опухоли экспрессируют PSMA в неоваскулатуре. Поэтому способы по настоящему изобретению можно использовать для лечения практически всех солидных опухолей, включая опухоль легкого, почечно-клеточную, глиобластому, поджелудочной железы, мочевого пузыря, саркому, меланому, молочной железы, толстой кишки, зародышевых клеток, феохромоцитому, пищевода и желудка. Также, в соответствии с настоящим изобретением можно лечить некоторые доброкачественные поражения и ткани, включая эндометрий, шванному и хронической пептической язвы пищевода (синдром Баррета).In some embodiments, the tumor cells may express PSMA, such as prostate tumor cells or metastatic prostate tumor cells. In other embodiments, the tumor can be treated by targeting adjacent or adjacent cells that express PSMA. For example, it is possible to target vascular cells in which angiogenesis associated with a tumor occurs. Essentially, all solid tumors express PSMA in neovascular. Therefore, the methods of the present invention can be used to treat almost all solid tumors, including a tumor of the lung, renal cell, glioblastoma, pancreas, bladder, sarcoma, melanoma, breast, colon, germ cells, pheochromocytoma, esophagus and stomach. Also, in accordance with the present invention, some benign lesions and tissues, including the endometrium, schwannomas and chronic peptic ulcers of the esophagus (Barrett's syndrome) can be treated.

Лекарственные средства могут вводиться перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно). Клиническая дозировка средства, содержащего соединение общей формулы (I), у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активных ингредиентов в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента.Medicines can be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically). The clinical dosage of an agent containing a compound of general formula (I) in patients can be adjusted depending on the therapeutic efficacy and bioavailability of the active ingredients in the body, their metabolic rate and excretion from the body, as well as on the patient’s age, gender and stage of illness.

Заявляемое средство для доставки формулы (I) представляет собой ковалентно связанные лиганд, обеспечивающий селективное связывание с ПСМА, и линкер.The inventive means for the delivery of formula (I) is a covalently linked ligand, providing selective binding to PSMA, and a linker.

где n=3-5, где X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н; R=Н, ОН; R₁=Н, Br.where n = 3-5, where X, Y, Z independently of each other represent F, Cl, Br, H; R = H, OH; R ₁ = H, Br.

В качестве лиганда выступает соединение, представляющее собой аналог переходного состояния субстрата (NAAG) и являющегося ПСМА-вектором на основе производного мочевины структуры DCL формулы (1), включая модификацию ε-аминогруппы лизина в лиганде ПСМА с использованием различных бензиловых производных, способствующих улучшению связывания с белковой мишенью.The ligand is a compound that is an analogue of the transition state of the substrate (NAAG) and which is a PSMA vector based on the urea derivative of the DCL structure of formula (1), including the modification of the ε-amino group of lysine in the PSMA ligand using various benzyl derivatives, which improve binding to protein target.

Линкер представляет собой модифицированный гидрофобный пептид, включающий фрагменты 6-аминогексановой или 5-аминонопентановой или 4-аминобутановой кислот, фрагмент янтарной кислоты, фрагмент аминокислоты фенилаланина, производное фенилаланина, с введенными заместителями в ароматический фрагмент, фрагмент 2-азидоэтанола.The linker is a modified hydrophobic peptide comprising fragments of 6-aminohexanoic or 5-aminonopentanoic or 4-aminobutanoic acid, a succinic acid fragment, a phenylalanine amino acid fragment, a phenylalanine derivative with substituents in the aromatic fragment, a 2-azidoethanol fragment.

Способ синтеза заявляемых соединений заключается в следующем.The method of synthesis of the claimed compounds is as follows.

Сначала получают тритретбутиловое производное ПСМА-связывающего лиганда формулы (2):First get tritetbutyl derivative of the PSMA-binding ligand of the formula (2):

Соединение формулы (2) может быть получено известным из уровня техники способом (Ryan P. Murelli, Andrew X. Zhang, Julien Michel, William L. Jorgensen, David A. Spiege. Chemical Control Over Immune Recognition: A Class of Antibody-Recruiting Molecules (ARMs) that Target Prostate Cancer. J. AM. CHEM. SOC. 2009, 131, 17090-17092). Затем полученное тритретбутиловое производное ПСМА-связывающего лиганда алкилируют с получением соединения формулы (II). Реакцию алкилирования проводят путем восстановительного аминирования замещенными бензальдегидами (Jan Tykvart,

Schimer, Jitka

, Petr Pachl, Lenka

, Pavel Majer, Jan Konvalinka, Pavel

. Rational design of urea-based glutamate carboxypeptidase II (GCPII) inhibitors as versatile tools for specific drug targeting and delivery. Bioorg Med Chem. 2014, 22(15):4099-108.)The compound of formula (2) can be obtained by a method known in the art (Ryan P. Murelli, Andrew X. Zhang, Julien Michel, William L. Jorgensen, David A. Spiege. Chemical Control Over Immune Recognition: A Class of Antibody-Recruiting Molecules (ARMs) that Target Prostate Cancer. J. AM. CHEM. SOC. 2009, 131, 17090-17092). Then, the resulting tritrebutyl derivative of the PSMA binding ligand is alkylated to give a compound of formula (II). The alkylation reaction is carried out by reductive amination with substituted benzaldehydes (Jan Tykvart,

Schimer, Jitka

, Petr Pachl, Lenka

, Pavel Majer, Jan Konvalinka, Pavel

. Rational design of urea-based glutamate carboxypeptidase II (GCPII) inhibitors as versatile tools for specific drug targeting and delivery. Bioorg Med Chem. 2014, 22 (15): 4099-108.)

где X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н.where X, Y, Z independently of each other represent F, Cl, Br, N.

Получение соединения формулы (III) проводят путем ацилирования производными азидо- бутановой или пентановой или гексановой кислот с получением азидного производного алкилированного производного ПСМА-лиганда (IV) с последующей реакцией восстановления азида до аминогруппы, при этом реакцию восстановления азида до аминогруппы проводят в присутствии трифенилфосфина и воды в растворе ТГФ или в растворе метанола с использованием водорода в присутствии палладия на углероде в качестве катализатора.The preparation of a compound of formula (III) is carried out by acylation with derivatives of azidobutanoic or pentanoic or hexanoic acids to obtain an azide derivative of an alkylated derivative of a PSMA ligand (IV) followed by a reduction reaction of azide to an amino group, wherein the reduction of azide to an amino group is carried out in the presence of triphenylphosphine and water in a THF solution or in a methanol solution using hydrogen in the presence of palladium on carbon as a catalyst.

Реакцию ацилирования проводят в среде полярного апротонного растворителя растворяют исходный амин (II), азидо-кислоту и ненуклеофильное основание, взятые из расчета, что на 1 мольный эквивалент амина берут по меньшей мере 1 мольный эквивалент азидокислоты и основания, а также не менее 100 мольных эквивалента полярного апротонного растворителя, к полученной смеси при перемешивании добавляют по меньшей мере 1 мольный эквивалент РуВОР, полученную смесь перемешивают при комнатной температуре до исчезновения исходного амина (II). Далее из полученную реакционной смеси удаляется растворитель при пониженном давлении, и целевой полупродукт выделяется с помощью колоночной хроматографии (Puriflach SILICA-HP 120G, 50 мкм, градиент от 100% петролейного эфира до 100% EtOAc в течение 30 мин, скорость потока = 50 мл/мин). Верхняя граница используемых реагентов не ограничивается, т.к. избыток какого-либо реагента не уменьшает выходов реакций, однако при большом избытке может понадобиться дополнительная очистка продуктов реакций.The acylation reaction is carried out in a polar aprotic solvent, the starting amine (II), azido acid and non-nucleophilic base are dissolved, taking into account that at least 1 molar equivalent of azido acid and base, as well as at least 100 molar equivalents, are taken for 1 molar equivalent of amine polar aprotic solvent, at least 1 molar equivalent of RuBOP is added to the resulting mixture with stirring, the resulting mixture is stirred at room temperature until the starting amine (II) disappears. Then, the solvent was removed from the resulting reaction mixture under reduced pressure, and the target intermediate was isolated by column chromatography (Puriflach SILICA-HP 120G, 50 μm, gradient from 100% petroleum ether to 100% EtOAc for 30 min, flow rate = 50 ml / min). The upper limit of the reagents used is not limited, because an excess of any reagent does not reduce the yields of the reactions; however, with a large excess, additional purification of the reaction products may be necessary.

Далее реакцию восстановления азидо-группы до амино-группы в среде ТГФ/вода с содержанием воды по меньшей мере 10 об. %, в которой растворяют полученное азидо-производное и трифенилфосфин, взятые из расчета, что на 1 мольный эквивалент азидопроизводного берут по меньшей мере 1,5 мольных эквивалента трифенилфосфина, а также не менее 50 мольных эквивалентов смеси растворителей (ТГФ/вода) из расчета на воду. Реакционную смесь нагревали при температуре не менее 45°С до исчезновения исходного азидо-производного. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (триэтиламин: хлористый метилен: метанол; от 1%:98%:1% до 1%:89%:10%).Next, the reaction of reduction of the azido group to the amino group in a THF / water medium with a water content of at least 10 vol. %, in which the obtained azido derivative and triphenylphosphine are dissolved, taken from the calculation that at least 1.5 molar equivalents of triphenylphosphine and at least 50 molar equivalents of the solvent mixture (THF / water) are calculated per 1 molar equivalent of the azide derivative based on water. The reaction mixture was heated at a temperature of at least 45 ° C until the initial azido derivative disappeared. The solvent was removed under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (triethylamine: methylene chloride: methanol; from 1%: 98%: 1% to 1%: 89%: 10%).

Предпочтительно в качестве азидо-кислот использовать азидо-бутановую или пентановую или гексановую кислоты.As azido acids, it is preferable to use azido-butanoic or pentanoic or hexanoic acids.

Предпочтительно в качестве полярного апротонного растворителя использовать ДМФА или ДМСО.It is preferable to use DMF or DMSO as the polar aprotic solvent.

Предпочтительно в качестве ненуклеофильного основания использовать диизопропилэтиламин или триэтиламин.It is preferable to use diisopropylethylamine or triethylamine as a non-nucleophilic base.

,

,

где X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н, n=3-5.where X, Y, Z independently of each other are F, Cl, Br, H, n = 3-5.

Модификация янтарным ангидридом фрагмента линкера, представляющего собой алкильный фрагмент, включающий 3-5 атомов углерода с получением производного соединения (III), ацилированного янтарным ангидридом. При этом модификацию янтарным ангидридом фрагмента линкера, представляющего собой алкильный фрагмент, включающий 3-5 атомов углерода осуществляют реакцией ацилирования янтарным ангидридом аминогруппы в присутствии ненуклиофильных оснований. В качестве ненуклеофильных оснований используют диизопропилэтиламин или триэтиламин.Modification by succinic anhydride of the linker fragment, which is an alkyl fragment comprising 3-5 carbon atoms to obtain a derivative of compound (III) acylated with succinic anhydride. Moreover, the modification with succinic anhydride of the linker fragment, which is an alkyl fragment comprising 3-5 carbon atoms, is carried out by the acylation reaction with succinic anhydride of the amino group in the presence of non-nucleophilic bases. As non-nucleophilic bases, diisopropylethylamine or triethylamine is used.

Реакцию ацилирования янтарным ангидридом проводят в среде неполярного апротонного растворителя путем растворения исходного амина (III), янтарного ангидрида и ненуклеофильного основания, взятых из расчета, что на 1 мольный эквивалент амина берут по меньшей мере 1 мольный эквивалент янтарного ангидрида и ненуклефильного основания, а также не менее 100 мольных эквивалента неполярного апротонного растворителя, полученную смесь перемешивают при комнатной температуре до исчезновения исходного амина (III).Acylation with succinic anhydride is carried out in a non-polar aprotic solvent by dissolving the starting amine (III), succinic anhydride and non-nucleophilic base, based on the assumption that at least 1 molar equivalent of succinic anhydride and non-nucleophilic base are taken per 1 molar equivalent of amine less than 100 molar equivalents of a non-polar aprotic solvent, the resulting mixture was stirred at room temperature until the starting amine (III) disappeared.

Предпочтительно в качестве неполярного апротонного растворителя использовать дихлорметан или хлороформ.It is preferable to use dichloromethane or chloroform as a non-polar aprotic solvent.

Предпочтительно в качестве ненуклеофильного основания использовать диизопропилэтиламин или триэтиламин.It is preferable to use diisopropylethylamine or triethylamine as a non-nucleophilic base.

Получение дипептидов производных ароматических аминокислот, представляющих собой фенилаланил-фенилаланин или фенилаланил-тирозин, для связывания с модифицированным фрагментом линкера соединения формулы (V).Obtaining dipeptides of derivatives of aromatic amino acids, which are phenylalanil-phenylalanine or phenylalanil-tyrosine, for binding to a modified linker fragment of a compound of formula (V).

Синтез дипептидов проиллюстрирован на схемах (а) и (б), где синтез ПСМА-векторного фрагмента на основе дипептида L-Phe-L-Phe - схема (a), a D-Phe-D-Phe - схема (б).The synthesis of dipeptides is illustrated in schemes (a) and (b), where the synthesis of a PSMA vector fragment based on the L-Phe-L-Phe dipeptide is (a), and D-Phe-D-Phe is scheme (b).

К дипептиду L-Phe-L-Phe в смеси воды с диоксаном, не менее 25 об. % воды в смеси, в присутствии основания в количестве не менее 3-х мольных эквивалентов, добавляли не менее 1 эквивалента ВОС-ангидрида при температуре не выше 5°С. Реакционную смесь оставляют перемешиваться не менее 6 часов при комнатной температуре. Полученную смесь промывали водным раствором соляной кислоты с концентрацией не менее 1 моль/л до не более 4 моль/л, полученный раствор экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу осушивали над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении. Полученный продукт представляет собой белые кристаллы.To the dipeptide L-Phe-L-Phe in a mixture of water with dioxane, not less than 25 vol. % water in the mixture, in the presence of a base in an amount of at least 3 molar equivalents, was added at least 1 equivalent of BOC anhydride at a temperature not exceeding 5 ° C. The reaction mixture was allowed to stir for at least 6 hours at room temperature. The resulting mixture was washed with an aqueous solution of hydrochloric acid with a concentration of at least 1 mol / L to not more than 4 mol / L, the resulting solution was extracted with ethyl acetate. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated under reduced pressure. The resulting product is white crystals.

Предпочтительно в качестве основания использовать гидрокарбонат натрия, карбонат натрия, гидроксид натрия или гидроксид калия.Preferably, sodium bicarbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide or potassium hydroxide are used as the base.

Для получения соединения (26), проводили реакцию BOCPhePhe с 3-аминопропилазидом (не менее 1 мольн. экв.) в присутствии не менее 1 эквивалента HBTU, HOBt и DIPEA. После протекания реакции целевой продукт выделяли методом колоночной хроматографии.To obtain compound (26), BOCPhePhe was reacted with 3-aminopropylazide (at least 1 mol. Equiv.) In the presence of at least 1 equivalent of HBTU, HOBt and DIPEA. After the reaction, the target product was isolated by column chromatography.

Реакцию удаления трет-бутильной защитной группы соединения (26) проводили с помощью раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане, с содержанием кислоты не менее 8 об. %. Реакционную смесь перемешивали, контроль протекания реакции проводили методом ТСХ до исчезновения пятна исходного вещества Rf~0.3. По окончании реакции растворитель удаляли при пониженном давлении и далее полученный продукт промывали диэтиловым эфиром.The removal of the tert-butyl protective group of compound (26) was carried out using a solution of trifluoroacetic acid in dichloromethane, with an acid content of at least 8 vol. % The reaction mixture was stirred, the reaction progress was monitored by TLC until the stain of the starting material disappeared Rf ~ 0.3. At the end of the reaction, the solvent was removed under reduced pressure, and then the resulting product was washed with diethyl ether.

Синтез дипептида D-Phe-D-Phe осуществлялся аналогично производному с L-Phe-L-Phe.The synthesis of the D-Phe-D-Phe dipeptide was carried out similarly to the derivative with L-Phe-L-Phe.

Синтез ПСМА-векторного фрагмента на основе дипептида L-фенилаланил-L-тирозина (L-Phe-L-Tyr (33)) осуществлялся по схеме (с) (Фиг. 20). К суспензии L-фенилаланина в смеси растворителей диоксан - вода с содержанием воды не менее 40 об. %, при температуре не более 5°С добавляли основание в количестве не менее одного мольного эквивалента и ди-трет-бутил дикарбонат ВОС₂О в количестве не менее одного мольного эквивалента. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение не менее 4 суток. Реакционную смесь концентрировали в вакууме роторного испарителя до удаления органического растворителя. Затем в водный остаток добавляли раствор соляной кислоты с концентрацией не менее 1 моль/л, до рН не более 4 и экстрагировали этилацетатом. Объединенную органическую фазу промывали насыщенным раствором NaHCO₃ и NaCl, сушили Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Затем повторно переупаривали с дихлорметаном. Продукт реакции получали в виде бесцветного аморфного вещества.The synthesis of the PSMA vector fragment based on the L-phenylalanyl-L-tyrosine dipeptide (L-Phe-L-Tyr (33)) was carried out according to scheme (c) (Fig. 20). To a suspension of L-phenylalanine in a solvent mixture of dioxane - water with a water content of at least 40 vol. %, at a temperature of not more than 5 ° C, a base was added in an amount of at least one molar equivalent and BOC ₂ O di-tert-butyl dicarbonate in an amount of at least one molar equivalent. The resulting mixture was stirred at room temperature for at least 4 days. The reaction mixture was concentrated in vacuo on a rotary evaporator to remove the organic solvent. Then, a solution of hydrochloric acid with a concentration of at least 1 mol / L was added to the aqueous residue, to a pH of not more than 4, and extracted with ethyl acetate. The combined organic phase was washed with saturated NaHCO ₃ and NaCl, dried with Na ₂ SO ₄ and concentrated in vacuo. Then re-evaporated with dichloromethane. The reaction product was obtained as a colorless amorphous substance.

Предпочтительно в качестве основания использовать гидрокарбонат натрия, карбонат натрия, гидроксид натрия или гидроксид калия.Preferably, sodium bicarbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide or potassium hydroxide are used as the base.

К раствору соединения (31) в дихлорметане добавляли EDC*HCl (не менее 1 экв.), PFPOH (не менее 1 экв.) и перемешивали в течение не менее 12 часов при комнатной температуре. Дальнейшую очистку проводили с помощью колоночной хроматографии на колонке с силикагелем (элюент - дихлорметан). Продукт реакции (желтое маслянистое вещество), растворяли в смеси ТГФ - вода (не менее 30 об. % воды) и добавляли при перемешивании L-тирозин (не менее 1 экв.). К полученному раствору прикапывали раствор ненуклеофильного основания (не менее 1 экв.) и перемешивали в течение не менее 12 часов при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную смесь концентрировали в вакууме роторного испарителя до полного удаления органического растворителя. Остаток в колбе подкисляли раствором HCl с концентрацией не менее 1 моль/л до рН не менее 4 и экстрагировали этилацетатом. Объединенную органическую фазу промывали насыщенным раствором NaHCO₃ и NaCl, сушили Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Полученный бесцветный аморфный остаток растворяли в минимальном количестве дихлорметана и прикапывали при перемешивании гексан, до прекращения выпадения осадка. Выпавший осадок отфильтровывали и ресуспендировали в гексане в УЗИ-бане, затем заново отфильтровывали.To a solution of compound (31) in dichloromethane was added EDC * HCl (at least 1 equiv.), PFPOH (at least 1 equiv.) And stirred for at least 12 hours at room temperature. Further purification was carried out using column chromatography on a column of silica gel (eluent was dichloromethane). The reaction product (yellow oily substance) was dissolved in a THF-water mixture (at least 30 vol.% Water) and L-tyrosine (at least 1 equiv.) Was added with stirring. A solution of a non-nucleophilic base (not less than 1 equiv.) Was added dropwise to the resulting solution and stirred for at least 12 hours at room temperature. At the end of the reaction, the reaction mixture was concentrated in a vacuum of a rotary evaporator until the organic solvent was completely removed. The residue in the flask was acidified with a solution of HCl with a concentration of at least 1 mol / L to a pH of at least 4 and was extracted with ethyl acetate. The combined organic phase was washed with saturated NaHCO ₃ and NaCl, dried with Na ₂ SO ₄ and concentrated in vacuo. The resulting colorless amorphous residue was dissolved in a minimum amount of dichloromethane and hexane was added dropwise with stirring until the precipitation ceased. The precipitate was filtered off and resuspended in hexane in an ultrasound bath, then filtered again.

Предпочтительно в качестве ненуклеофильного основания использовать диизопропилэтиламин или триэтиламинIt is preferable to use diisopropylethylamine or triethylamine as a non-nucleophilic base.

На третьем этапе повторно осуществляли процесс активации карбоксильной группы соединения (32) с последующим взаимодействием с азидопропиламином (не менее 1 экв) в течение не менее 24 часов при комнатной температуре в дихлорметане. По окончании сырую реакционную массу хроматографировали на колонке с силикагелем, в результате получали промежуточный дипептидный амид, который вовлекался в реакцию удаления трет-бутоксикарбонильной защиты действием 10 об.% раствора трифторуксусной кислоты в безводном дихлорметане.At the third stage, the activation of the carboxyl group of compound (32) was repeated, followed by interaction with azidopropylamine (at least 1 equiv) for at least 24 hours at room temperature in dichloromethane. At the end, the crude reaction mass was chromatographed on a silica gel column, and an intermediate dipeptide amide was obtained, which was involved in the removal of tert-butoxycarbonyl protection by the action of a 10 vol% solution of trifluoroacetic acid in anhydrous dichloromethane.

Добавление TFA производили при охлаждении на водяной бане со льдом при температуре не более 10°С с последующим постепенным нагревом реакционной смеси до комнатной температуры. Снятие защиты при комнатной температуре проводили не менее 3 часов.The addition of TFA was carried out by cooling in an ice water bath at a temperature of not more than 10 ° C, followed by gradual heating of the reaction mixture to room temperature. Deprotection at room temperature was performed for at least 3 hours.

Таким образом, в результате последовательности реакций по схеме превращения был осуществлен синтез линкера (33), который использован в последующем для получения высокоспецифичных ПСМА-векторов. Разработанные методы синтеза отличаются экологичностью, хорошими выходами целевых продуктов, высокой селективностью процессов и не требуют применения специальной аппаратуры или дорогостоящих реагентов.Thus, as a result of the reaction sequence according to the transformation scheme, the linker was synthesized (33), which was subsequently used to obtain highly specific PSMA vectors. The developed synthesis methods differ in environmental friendliness, good yields of target products, high selectivity of the processes, and do not require the use of special equipment or expensive reagents.

Синтез D-Phe-D-Tyr и D-Phe-D-Tyr(Br) проводился аналогично.The synthesis of D-Phe-D-Tyr and D-Phe-D-Tyr (Br) was carried out similarly.

где R=Н, ОН; R₁=H, Br.where R = H, OH; R ₁ = H, Br.

Получение тритретбутил производного соединения радикала ПСМА-связывающего лиганда и модифицированного гидрофобного пептидного линкера, включающего фрагменты 6-аминогексановой или 5-аминопентановой или 4-аминобутановой кислот, фрагмент фенилаланина или его производное, фрагмент тирозина или его производное общей формулы (VI), проводили/осуществляли реакцией образования амидной связи продукта ацилирования янтарным ангидридом и дипептидом формулы (V).The preparation of tritrebutyl derivative of a PSMA binding ligand radical compound and a modified hydrophobic peptide linker comprising 6-aminohexanoic or 5-aminopentanoic or 4-aminobutanoic acid fragments, a phenylalanine fragment or its derivative, a tyrosine fragment or its derivative of the general formula (VI) was carried out / carried out the reaction of formation of an amide bond of the acylation product of succinic anhydride and a dipeptide of the formula (V).

К раствору продукта ацилирования янтарным ангидридом в ДМФА добавляли не менее 1 эквивалента дипептида, НОВТ, HBTU и ненуклеофильного основания. Смесь перемешивали не менее 24 ч. Далее удаляли растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии. Элюента-EtOAc/МеОН=5:1.To a solution of the acylation product of succinic anhydride in DMF was added at least 1 equivalent of dipeptide, HOBT, HBTU and non-nucleophilic base. The mixture was stirred for at least 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated using column chromatography. Eluent EtOAc / MeOH = 5: 1.

Предпочтительно в качестве ненуклеофильного основания использовали диизопропилэтиламин или триэтиламинPreferably, diisopropylethylamine or triethylamine is used as the non-nucleophilic base.

,

,

где X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н, ОН, n=3-5, R=H, ОН; R₁=Н, Br.where X, Y, Z independently of each other are F, Cl, Br, H, OH, n = 3-5, R = H, OH; R ₁ = H, Br.

Получение соединения радикала ПСМА-связывающего лиганда и модифицированного гидрофобного пептидного линкера, общей формулы (I) осуществляли путем удаления тритретбутильных защитных групп соединения формулы (VI). Удаление тритретбутильных защитных групп проводили в присутствии 9-11 об. % ТФУ в течение 15-17 часов в дихлорметане.The preparation of a PSMA-binding ligand radical compound and a modified hydrophobic peptide linker of the general formula (I) was carried out by removing the tritretbutyl protective groups of the compound of the formula (VI). Removal of tritrebutyl protective groups was carried out in the presence of 9-11 vol. % TFA for 15-17 hours in dichloromethane.

Применение соединения общей формулы (I) заключается в получении конъюгата с лекарственным или диагностическим агентом. При этом для получения конечных конъюгатов (с лекарственным или диагностическим препаратом) проводится реакция азид-алкинового циклоприсоединения, между заявляемым соединением (средство доставки, ПСМА-лиганд с ликером), содержащим в своем составе азидо-группу, и доставляемой молекулой (лекарственным или диагностическим средством) (Kolb, Н.С, Finn, М.G. and Sharpless, К.В. (2001), Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angewandte Chemie International Edition, 40: 2004-2021.; Hartmuth С Kolb, K. Barry Sharpless, The growing impact of click chemistry on drug discovery, In Drug Discovery Today, Volume 8, Issue 24, 2003, Pages 1128-1137, ISSN 1359-6446,). В случае отсутствия у доставляемой молекулы фрагмента терминальной тройной связи в структуре, она должна быть модифицирована химически таким образом, чтобы полученное производное содержало терминальную тройную связь. Специалисту в данной области техники известно, каким образом возможно осуществление такой модификации.The use of a compound of general formula (I) is to provide a conjugate with a drug or diagnostic agent. In this case, to obtain the final conjugates (with a drug or diagnostic drug), an azide-alkine cycloaddition reaction is carried out between the claimed compound (delivery vehicle, PSMA ligand with liquor) containing an azido group, and the delivered molecule (drug or diagnostic tool) ) (Kolb, N.C., Finn, M.G. and Sharpless, C.V. (2001), Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angewandte Chemie International Edition, 40: 2004-2021; Hartmuth With Kolb, K. Barry Sharpless, The growing impact of click chemistry on drug discovery, In Drug Discovery Today, Volume 8, Issue 24, 2003, Pages 1128-1137, ISSN 1359-6446,). If the delivered molecule does not have a terminal triple bond fragment in the structure, it must be chemically modified so that the resulting derivative contains a terminal triple bond. One skilled in the art knows how such a modification is possible.

Конъюгат может быть представлен общей структурной формулойThe conjugate may be represented by the general structural formula

,

,

где n=3-5;where n = 3-5;

X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н;X, Y, Z independently of each other are F, Cl, Br, H;

R=ОН, Н;R = OH, H;

R₁=Н, Br;R ₁ = H, Br;

R₂ = лекарственный или диагностический агент.R ₂ = drug or diagnostic agent.

В заявляемом техническом решении раскрыты соединения (средства доставки), способные связываться с ПСМА, нацеливаться на ПСМА для доставки средств диагностики, визуализации и терапевтических (лекарственных средств). Также раскрыты соединения и способы их получения, а также применение соединений для диагностики, визуализации и лечения заболеваний, вызванных патогенными популяциями клеток, которые экспрессируют или сверхэкспрессируют ПСМА. Как показали проведенные эксперименты, заявляемые средства доставки проявляют высокую аффинность в отношении ПСМА, образованные комплексы заявляемого средства доставки с терапевтическим агентом являются эффективными в лечении заболеваний, вызванных патогенными клетками, которые экспрессируют ПСМА, такими как клетки рака предстательной железы.The claimed technical solution discloses compounds (delivery vehicles) capable of binding to PSMA, targeting PSMA to deliver diagnostic, visualization and therapeutic agents (drugs). Compounds and methods for their preparation are also disclosed, as well as the use of compounds for the diagnosis, visualization and treatment of diseases caused by pathogenic populations of cells that express or overexpress PSMA. As experiments have shown, the inventive delivery vehicles exhibit high affinity for PSMA, the complexes of the inventive delivery agent with a therapeutic agent formed are effective in the treatment of diseases caused by pathogenic cells that express PSMA, such as prostate cancer cells.

В качестве лекарственного (терапевтического) средства (агента) могут быть использованы любые молекулы, способные модулировать или модифицировать клеточную функцию. В качестве лекарственных средств могут быть использованы пептиды, олигопептиды, ретроинвертированные олигопептиды, белки, аналоги белка, апопротеины, гликопротеины, ферменты, коферменты, ингибиторы ферментов, аминокислоты и их производные, рецепторы и другие мембранные белки, антигены и антитела против них; гаптены и антитела против них; гормоны, липиды, фосфолипиды, липосомы; токсины; антибиотики; бета-блокаторы; противораковые средства, в том числе химиотерапевтические средства; простагландины и аналоги простогландинов; противовоспалительные вещества; иммуносупрессоры, иммуностимуляторы; минеральные и питательные добавки.As a drug (therapeutic) agent (agent), any molecule capable of modulating or modifying cellular function can be used. As medicines, peptides, oligopeptides, retro-inverted oligopeptides, proteins, protein analogues, apoproteins, glycoproteins, enzymes, coenzymes, enzyme inhibitors, amino acids and their derivatives, receptors and other membrane proteins, antigens and antibodies against them can be used; haptens and antibodies against them; hormones, lipids, phospholipids, liposomes; toxins; antibiotics beta blockers; anticancer drugs, including chemotherapeutic agents; prostaglandins and prostaglandin analogues; anti-inflammatory substances; immunosuppressants, immunostimulants; mineral and nutritional supplements.

В качестве лекарственных (химиотерапевтических) средств используют соединения, которые являются цитотоксическими, усиливают проницаемость опухоли, ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, стимулируют апоптоз, снижают противоапоптическую активность в целевых клетках, применяются для лечения заболеваний, вызванных инфекционными агентами, усиливают эндогенный иммунный ответ, направленный на патогенные клетки, или применимы для лечения болезненного состояния, вызванного патогенными клетками. Такие химиотерапевтические средства могут функционировать при помощи любого из большого разнообразия механизмов действия. Например, цитотоксические соединения могут нарушать любой из целого ряда клеточных механизмов, которые важны для выживания клетки и/или клеточной пролиферации и/или вызывают клеточную смерть или апоптоз. Химиотерапевтические средства включают, но не ограничивают, следующие соединения: адренокортикоиды, кортикостероиды, алкилирующие средства, антиадрогены, антиэстрогены, андрогены, акламицин и производные акламицина, эстрогены, антиметаболиты, такие как цитозинарабинозид, аналоги пурина, аналоги пиримидина, метотрексат, бисульфан, карбоплатина, хлорамбуцил, цисплатин и др. соединения платины, тамоксифен, таксол, паклитаксел, производные паклитаксела, циклофосфамид, дауномицин, ризоксин, растительные алкалоиды, преднизолон, гидроксимочевина, тенипозид, митомицины, дискодермолиды, ингибиторы микротрубочек, эпотилоны, тубулизины, циклопропилбенз [е] индол он, втор-циклопропилбенз [е] индол он, О-Ас-втор-циклопропилбенз[е]индолон, блеомицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, виндезин, винорелбин и их аналоги и производные), азотистые иприты, нитрозомочевины, колхицин и его производные, тритилцистеин, галикондрин В, доластатины, аманитины, камптотецин и его производные, гелданамицин и его производные, эстрамустин, нокодазол, МАР4, колцемид, противовоспалительные средства, ингибиторы пептидной и петидомиметической передачи сигнала, рапамицин, эверолимус, сиролимус, криптофицин, бортезомиб, тиобортезомиб, тубулизин, аминоптерин, доцетаксел, доксорубицин, даунорубицин, верукарин, дидемнин В, гелданомицин, пурваланол А, испинезид, будесонид, дазатиниб, эпотилон, майтанзины, ингибиторы тирозинкиназы, амфотерицинВ, ацикловир, трифлуридин, ганцинкловир, зидовудин, рибавирин и т.п.Compounds that are cytotoxic, increase the permeability of the tumor, inhibit the proliferation of tumor cells, stimulate apoptosis, reduce anti-apoptotic activity in target cells, are used to treat diseases caused by infectious agents, and enhance the endogenous immune response directed to pathogenic cells, or are useful for treating a disease state caused by pathogenic cells. Such chemotherapeutic agents may function using any of a wide variety of mechanisms of action. For example, cytotoxic compounds can disrupt any of a number of cellular mechanisms that are important for cell survival and / or cell proliferation and / or cause cell death or apoptosis. Chemotherapeutic agents include, but are not limited to, the following compounds: adrenocorticoids, corticosteroids, alkylating agents, antiadrogens, antiestrogens, androgens, aclamycin and derivatives of aclamycin, estrogens, antimetabolites such as cytosine arabinoside, purine analogs, pyrimidine analogs, bisulfanocarbamate, methotrexate , cisplatin and other platinum compounds, tamoxifen, taxol, paclitaxel, paclitaxel derivatives, cyclophosphamide, daunomycin, rhizoxin, plant alkaloids, prednisolone, hydroxymech Evina, teniposide, mitomycin, discodermolides, microtubule inhibitors, epothilones, tubulisins, cyclopropylbenz [e] indolone, sec-cyclopropylbenz [e] indolone, O-Ac-sec-secoplopropylbenz [e] indolone, bleomycin, vinca alkaloids (vinca vinblastine, vindesine, vinorelbine and their analogs and derivatives), nitrogen mustards, nitrosoureas, colchicine and its derivatives, tritylcysteine, halicondrin B, dolastatins, amanitines, camptothecin and its derivatives, geldanamycin and its derivatives, estramazoltidine, anti-colostolmodine, N, colostamoltocid, wed peptidic and petidomimetic signaling inhibitors, rapamycin, everolimus, sirolimus, cryptophycin, bortezomib, thiobortezomib, tubulizin, aminopterin, docetaxel, doxorubicin, daunorubicin, verucarin, eidanizinodinzinodinzinodinzinodinzinodinzinodinzinodinzinodinzinodinozindenazinodinzinodinzinodinzinodinzinodinzinodinzinodinzinodinozindenazinodinozindinzinodinzinodinzinodinzinodinozindenazinodinozindinazinodinozindinazinodinozindinazinodinozindinazinodinozindinazinidinozindinazinidinazindenazinodinozindesinidinazindinazinidinazindenazin tyrosine kinase inhibitors, amphotericin B, acyclovir, trifluridine, gantsinclovir, zidovudine, ribavirin and the like.

В качестве средств визуализации могут быть использованы без ограничения, флуоресцентные средства, такие как Oregon Green (например, Oregon Green 488, Oregon Green 514 и т.п.), AlexaFluor (например, AlexaFluor 488, AlexaFluor 647 и т.п.), флуоресцеин и родственные аналоги, флуоресцентные средства BODIPY (например, BODIPY F1, BODIPY 505 и т.п.), родаминовые флуоресцентные средства (тетраметилродамин и т.п.), флуоресцентные средства DyLight (например, DyLight 680, DyLight 800 и т.п.); циановые красители (например Heptamethine IR-780, Heptamethine IR-808, IRDye® 800CW, DY-675, DY-676, DY-677, DY-678, Cy5, Cy7 и т.п.). Следует принимать во внимание, что конъюгаты терапевтических или диагностических средств с заявляемыми соединениями (средствами доставки) можно применять отдельно или в комбинации с другими соединениями, подходящими для диагностики, визуализации и/или лечения заболеваний, вызванных клетками, экспрессирующими ПСМА, а также в комбинации с другими соединениями, которые вводят для лечения других симптомов заболевания, например, паллиативные средства, действие которых сфокусировано на облегчении симптомов заболевания и/или побочных эффектов терапевтического режима, но не является лечебным. Например, паллиативное лечение включает болеутоляющие средства, средства против тошноты и средства против рвоты.As imaging agents, fluorescents such as Oregon Green (e.g., Oregon Green 488, Oregon Green 514, etc.), AlexaFluor (e.g. AlexaFluor 488, AlexaFluor 647, etc.) can be used, fluorescein and related analogues, BODIPY fluorescent agents (e.g., BODIPY F1, BODIPY 505, etc.), rhodamine fluorescent agents (tetramethylrodamine, etc.), DyLight fluorescent agents (e.g. DyLight 680, DyLight 800, etc. .); cyan dyes (e.g. Heptamethine IR-780, Heptamethine IR-808, IRDye® 800CW, DY-675, DY-676, DY-677, DY-678, Cy5, Cy7, etc.). It should be borne in mind that conjugates of therapeutic or diagnostic agents with the claimed compounds (delivery vehicles) can be used alone or in combination with other compounds suitable for the diagnosis, visualization and / or treatment of diseases caused by cells expressing PSMA, as well as in combination with other compounds that are administered to treat other symptoms of the disease, for example, palliative agents, the action of which is focused on alleviating the symptoms of the disease and / or side effects Comrade therapeutic regimen, but it is not curative. For example, palliative care includes painkillers, anti-nausea drugs and anti-vomiting agents.

Ниже представлено более детальное описание заявляемого способа, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.Below is a more detailed description of the proposed method, which does not limit the scope of claims of the claimed invention, but demonstrates the possibility of carrying out the invention with the achievement of the claimed technical result.

Пример 1.Example 1

(9S,13S)-три-трет-бутил 3,11-диоксо-1-фенил-2-окса-4,10,12-триазапентадекан-9,13,15-трикарбоксилат (1)(9S, 13S) -tri-tert-butyl 3,11-dioxo-1-phenyl-2-oxa-4,10,12-triazapentadecane-9,13,15-tricarboxylate (1)

Гидрохлорид ди-трет-бутилового эфира L-глутаминовой кислоты (1.0 г, 3.38 ммоль) и триэтиламин (1,54, 11.09 ммоль) растворили в CH₂Cl₂ (30 мл), полученный раствор охладили до -78°С. К полученному раствору добавили по каплям раствор трифосгена (341 мг, 1.15 ммоль) в 10 мл CH₂Cl₂. После добавления раствора трифосгена температура реакции довели до комнатной температуры, после этого раствор перемешивали в течение 30 мин. Далее в реакционную смесь внесли раствор H-Lyc(Z)-Ot-Bu (757 мг, 2.03 ммоль) и триэтиламин (283 мкл, 2.03 ммоль) в 50 мл дихлорметана. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. После этого реакционную смесь разбавили 50 мл CH₂Cl₂, и промыли водой (2×100 мл). Объединенные органические фракции высушили над сульфатом натрия. Растворитель удалили при пониженном давлении. Дальнейшую очистку полученной фракции проводили методом колоночной хроматографии (1.5:1 гексан: этилацетат). Таким образом, соединение (1) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 1 г (79%).L-glutamic acid di-tert-butyl ester hydrochloride (1.0 g, 3.38 mmol) and triethylamine (1.54, 11.09 mmol) were dissolved in CH ₂ Cl ₂ (30 ml), the resulting solution was cooled to -78 ° C. To the resulting solution, a solution of triphosgene (341 mg, 1.15 mmol) in 10 ml of CH ₂ Cl _{2 was} added dropwise. After adding a solution of triphosgene, the reaction temperature was brought to room temperature, after which the solution was stirred for 30 minutes. Next, a solution of H-Lyc (Z) -Ot-Bu (757 mg, 2.03 mmol) and triethylamine (283 μl, 2.03 mmol) in 50 ml of dichloromethane were added to the reaction mixture. The resulting reaction mixture was stirred for 16 hours at room temperature. After this, the reaction mixture was diluted with 50 ml of CH ₂ Cl ₂ , and washed with water (2 × 100 ml). The combined organic fractions were dried over sodium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure. Further purification of the obtained fraction was carried out by column chromatography (1.5: 1 hexane: ethyl acetate). Thus, the compound (1) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 1 g (79%).

2-[3-(5-амино-1-трет-бутоксикарбонилфенил)уреидо]глутаминовой кислоты ди-трет-бутиловый эфир (2)2- [3- (5-amino-1-tert-butoxycarbonylphenyl) ureido] glutamic acid di-tert-butyl ether (2)

К раствору соединения (1) (1.0 г., 1.61 ммоль) в метаноле (30 мл) было добавлено 100 мг 10% Pd/C. Реакция проводилась в атмосфере водорода (р=1 атм.). Контроль окончания реакции проводился с помощью тонкослойной хроматографии. По окончании реакции полученная реакционная смесь была отфильтрована через диатомитовый порошок Celite. Растворитель был удален при пониженном давлении. Таким образом, соединение (2) было выделено в виде постепенно кристаллизующейся желтой маслянистой жидкости, выход составил 0.762 г (97%).To a solution of compound (1) (1.0 g, 1.61 mmol) in methanol (30 ml) was added 100 mg of 10% Pd / C. The reaction was carried out in a hydrogen atmosphere (p = 1 atm.). Control of the end of the reaction was carried out using thin layer chromatography. At the end of the reaction, the resulting reaction mixture was filtered through Celite diatomaceous powder. The solvent was removed under reduced pressure. Thus, compound (2) was isolated as a gradually crystallizing yellow oily liquid; the yield was 0.762 g (97%).

Ди-трет-бутил-2-(3-(1-(трет-бутокси)-6-((бензил)амино)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентандиоат (3)Di-tert-butyl-2- (3- (1- (tert-butoxy) -6 - ((benzyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (3)

В 15 мл CH₂Cl₂ растворили соединение (2) 400 мг, 0.820 ммоль и бензальдегид 87 мг; 0.820 ммоль. Реакционную смесь перемешивали в течении 3 часов и добавили триацетоксиборгидрида натрия 261 мг; 1.231 ммоль. Сухой остаток отфильтровали в дихлорметане через вату. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку с помощью метода колоночной хроматографии (система метанол-дихлорметан, градиент 1:30-1:15). В результате получили 379 мг целевого продукта (3), выход 80%.In 15 ml of CH ₂ Cl ₂ , compound (2) 400 mg, 0.820 mmol and benzaldehyde 87 mg were dissolved; 0.820 mmol. The reaction was stirred for 3 hours and 261 mg sodium triacetoxyborohydride was added; 1.231 mmol. The dry residue was filtered in dichloromethane through cotton. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification using column chromatography (methanol-dichloromethane system, gradient 1: 30-1: 15). The result was 379 mg of the target product (3), yield 80%.

Ди-трет-бутил-2-(3-(1-(трет-бутокси)-6-((4-хлоробензил)амино)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентандиоат (4)Di-tert-butyl-2- (3- (1- (tert-butoxy) -6 - ((4-chlorobenzyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (4)

В 5 мл дихлорметана растворили 0,480 г (0,000984 моль, 1 экв) амина (2) и 0,138 г (0,000984 моль, 1 экв) n-хлорбензальдегида. Полученный раствор перемешивали ночь при комнатной температуре, после чего добавили 0,313 г (0,00148 моль, 1,5 экв) триацетоксиборогидрида натрия. Полученный раствор перемешивали в течение 24 ч, после чего растворитель удалили под вакуумом. Сухой остаток ресуспендировали в дихлорметане, осадок отфильтровали через вату, в результате чего получили прозрачный раствор. Растворитель удалили под вакуумом, после чего маслянистый остаток подвергли очистке с помощью метода колоночной хроматографии (система метанол-дихлорметан, градиент 1:30-1:15, нанесение вещества в виде раствора в системе 1:30, 20 г силикагеля).0.480 g (0.000984 mol, 1 equiv) of amine (2) and 0.138 g (0.000984 mol, 1 equiv) of n-chlorobenzaldehyde were dissolved in 5 ml of dichloromethane. The resulting solution was stirred overnight at room temperature, after which 0.313 g (0.00148 mol, 1.5 equiv) of sodium triacetoxyborohydride was added. The resulting solution was stirred for 24 hours, after which the solvent was removed in vacuo. The dry residue was resuspended in dichloromethane, the precipitate was filtered through cotton wool, resulting in a clear solution. The solvent was removed in vacuo, after which the oily residue was purified by column chromatography (methanol-dichloromethane system, gradient 1: 30-1: 15, applying the substance as a solution in the system 1:30, 20 g of silica gel).

Таким образом, соединение (4) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 0,41 г (68%).Thus, the compound (4) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 0.41 g (68%).

Ди-трет-бутил-2-(3-(1-(трет-бутокси)-6-((4-бромобензил)амино)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентандиоат (5)Di-tert-butyl-2- (3- (1- (tert-butoxy) -6 - ((4-bromobenzyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (5)

В 5 мл дихлорметана растворили 0,378 г (0,000775 моль, 1 экв) амина (2) и 0,143 г (0,000775 моль, 1 экв) n-бромбензальдегида. Полученный раствор перемешивали ночь при комнатной температуре, после чего было добавили 0,246 г (0,00116 моль, 1,5 экв) триацетоксиборогидрида натрия. Полученный раствор перемешивали в течение 24 ч, после чего растворитель удалили под вакуумом. Сухой остаток ресуспендировали в дихлорметане, осадок отфильтровали через вату, в результате чего получили прозрачный раствор. Растворитель удалили под вакуумом, после чего маслянистый остаток подвергли очистке с помощью метода колоночной хроматографии (система метанол-дихлорметан, градиент 1:30-1:15, нанесение вещества в виде раствора в системе 1:30, 20 г силикагеля).0.378 g (0.000775 mol, 1 equiv) of amine (2) and 0.143 g (0.000775 mol, 1 equiv) of n-bromobenzaldehyde were dissolved in 5 ml of dichloromethane. The resulting solution was stirred overnight at room temperature, after which 0.246 g (0.00116 mol, 1.5 equiv) of sodium triacetoxyborohydride was added. The resulting solution was stirred for 24 hours, after which the solvent was removed in vacuo. The dry residue was resuspended in dichloromethane, the precipitate was filtered through cotton wool, resulting in a clear solution. The solvent was removed in vacuo, after which the oily residue was purified by column chromatography (methanol-dichloromethane system, gradient 1: 30-1: 15, applying the substance as a solution in the system 1:30, 20 g of silica gel).

Таким образом, соединение (5) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 0,313 г (68%).Thus, the compound (5) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 0.313 g (68%).

Ди-трет-бутил-2-(3-(1-(трет-бутокси)-6-((4-гидроксибензил)амино)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентандиоат (6)Di-tert-butyl-2- (3- (1- (tert-butoxy) -6 - ((4-hydroxybenzyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (6)

Соединение (2) (443 мг, 0.909 ммоль) растворили в 7 мл CH₂Cl₂, колбу продули аргоном. Затем добавили эквимолярное количество n-гидроксибензальдегида (111 мг, 0.909 ммоль), перемешивали в течение 2 часов в атмосфере аргона при комнатной температуре. После добавили 1.5 эквивалента триацетоксиборогидрида натрия (288 мг, 1.364 ммоль). Колбу снова продули аргоном и оставили перемешиваться на 20 ч. За ходом реакции следили с помощью тонкослойной хроматографии. По окончании синтеза избыток растворителя упарили, получившуюся смесь разделили с помощью колоночной хроматографии. Выход соединения (6) составил 74% (400 мг, 0.596 ммоль)Compound (2) (443 mg, 0.909 mmol) was dissolved in 7 ml of CH ₂ Cl ₂ , the flask was purged with argon. Then, an equimolar amount of n-hydroxybenzaldehyde (111 mg, 0.909 mmol) was added, and stirred for 2 hours under argon at room temperature. Then 1.5 equivalents of sodium triacetoxyborohydride (288 mg, 1.364 mmol) was added. The flask was purged again with argon and allowed to stir for 20 hours. The progress of the reaction was monitored by thin layer chromatography. At the end of the synthesis, the excess solvent was evaporated, and the resulting mixture was separated by column chromatography. The yield of compound (6) was 74% (400 mg, 0.596 mmol)

Ди-трет-бутил 2-(3-(1-(трет-бутокси)-6-((3-хлорбензил)амино)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (7)Di-tert-butyl 2- (3- (1- (tert-butoxy) -6 - ((3-chlorobenzyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (7)

К раствору соединения (2) (400 мг, 0,820 ммоль) в DCM, добавили 3-хлорбензальдегид (115 мг, 0,820 ммоль), полученный раствор перемешивали в течение 3 часов в атмосфере аргона. Далее в реакционную смесь добавили 261 мг (1,230 ммоль) триацетоксиборгидрида, реакцию проводили в течение 16 часов. Полученную реакционную смесь упарили при пониженном давлении, образовавшийся осадок отфильтровали, полученный фильтрат упарили при пониженном давлении. Дальнейшую очистку проводили с помощью колоночной хроматографии с элюентом DCM/MeOH (100/0 до 0/100 в течение 30 минут). Таким образом, соединение (7) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 389 мг (77%).To a solution of compound (2) (400 mg, 0.820 mmol) in DCM, 3-chlorobenzaldehyde (115 mg, 0.820 mmol) was added, the resulting solution was stirred for 3 hours under argon atmosphere. Next, 261 mg (1.230 mmol) of triacetoxyborohydride was added to the reaction mixture, the reaction was carried out for 16 hours. The resulting reaction mixture was evaporated under reduced pressure, the precipitate formed was filtered off, and the resulting filtrate was evaporated under reduced pressure. Further purification was performed using column chromatography with DCM / MeOH eluent (100/0 to 0/100 for 30 minutes). Thus, compound (7) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 389 mg (77%).

Ди-трет-бутил 2-(3-(1-(трет-бутокси)-6-((4-хлор-2-фторбензил)амино)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (8)Di-tert-butyl 2- (3- (1- (tert-butoxy) -6 - ((4-chloro-2-fluorobenzyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (8)

К раствору соединения (2) (400 мг, 0,820 ммоль) в DCM, добавили 2-фтор-4-хлорбензальдегид (130 мг, 0,820 ммоль), полученный раствор перемешивали в течение 3 часов в атмосфере аргона. Далее в реакционную смесь добавили 261 мг (1,230 ммоль) триацетоксиборгидрида, реакцию проводили в течение 16 часов. Полученную реакционную смесь упарили при пониженном давлении, образовавшийся осадок отфильтровали, полученный фильтрат упарили при пониженном давлении. Дальнейшую очистку проводили с помощью колоночной хроматографии с элюентом DCM/MeOH (100/0 до 0/100 в течение 30 минут). В результате был выделено 453 мг (0,719 ммоль) целевого продукта, выход 88% Таким образом, соединение (8) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 453 мг (88%).To a solution of compound (2) (400 mg, 0.820 mmol) in DCM, 2-fluoro-4-chlorobenzaldehyde (130 mg, 0.820 mmol) was added, the resulting solution was stirred for 3 hours under argon atmosphere. Next, 261 mg (1.230 mmol) of triacetoxyborohydride was added to the reaction mixture, the reaction was carried out for 16 hours. The resulting reaction mixture was evaporated under reduced pressure, the precipitate formed was filtered off, and the resulting filtrate was evaporated under reduced pressure. Further purification was performed using column chromatography with DCM / MeOH eluent (100/0 to 0/100 for 30 minutes). As a result, 453 mg (0.719 mmol) of the target product was isolated, 88% yield. Thus, compound (8) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 453 mg (88%).

Ди-трет-бутил 2-(3-(1-(трет-бутокси)-6-((4-хлор-3-фторбензил)амино)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (9)Di-tert-butyl 2- (3- (1- (tert-butoxy) -6 - ((4-chloro-3-fluorobenzyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (9)

К раствору соединения (2) (400 мг, 0,820 ммоль) в DCM, добавили 3-фтор-4-хлорбензальдегид (130 мг, 0,820 ммоль), полученный раствор перемешивали в течение 3 часов в атмосфере аргона. Далее в реакционную смесь добавили 261 мг (1,230 ммоль) триацетоксиборгидрида, реакцию проводили в течение 16 часов. Полученную реакционную смесь упарили при пониженном давлении, образовавшийся осадок отфильтровали, полученный фильтрат упарили при пониженном давлении. Дальнейшую очистку проводили с помощью колоночной хроматографии с элюентом DCM/MeOH (100/0 до 0/100 в течение 30 минут).To a solution of compound (2) (400 mg, 0.820 mmol) in DCM, 3-fluoro-4-chlorobenzaldehyde (130 mg, 0.820 mmol) was added, the resulting solution was stirred for 3 hours under argon atmosphere. Next, 261 mg (1.230 mmol) of triacetoxyborohydride was added to the reaction mixture, the reaction was carried out for 16 hours. The resulting reaction mixture was evaporated under reduced pressure, the precipitate formed was filtered off, and the resulting filtrate was evaporated under reduced pressure. Further purification was performed using column chromatography with DCM / MeOH eluent (100/0 to 0/100 for 30 minutes).

Таким образом, соединение (9) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 467 мг (90%).Thus, compound (9) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 467 mg (90%).

(14S,18S)-три-трет-бутил-9-бензил-3,8,16-триоксо-1-фенил-2-окса-4,9,15,17-тетраазаикосан-14,18,10-трикарбоксилат (10)(14S, 18S) -tri-tert-butyl-9-benzyl-3,8,16-trioxo-1-phenyl-2-oxa-4,9,15,17-tetraazaicosan-14,18,10-tricarboxylate ( ten)

Соединение (3) 366 мг; 0.567 ммоль растворили в 10 мл DMF. При перемешивании добавили DIPEA 307 мкл; 1.792 ммоль, затем 4-(((бензаокси)карбонил)амино)бутановую кислоту. После полного растворения кислоты систему продули аргоном. Добавили РуВОР 463 мг; 0.894 и оставили при перемешивании на сутки. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (этилацетат : гексан; градиент от 5% до 100% этилацетата). Масса полученного вещества (10) 120 мг; выход 25%.Compound (3) 366 mg; 0.567 mmol was dissolved in 10 ml of DMF. With stirring, DIPEA 307 μl was added; 1.792 mmol, then 4 - (((benzaoxy) carbonyl) amino) butanoic acid. After complete dissolution of the acid, the system was purged with argon. Added RuBOR 463 mg; 0.894 and left with stirring for a day. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (ethyl acetate: hexane; gradient from 5% to 100% ethyl acetate). The mass of the obtained substance (10) 120 mg; yield 25%.

(S)-ди-трет-бутил-2-(3-((S)-6-(6-азидо-N-бензилгесанамдо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогесан-2-ил)уреидо)пентадионат (11)(S) -di-tert-butyl-2- (3 - ((S) -6- (6-azido-N-benzylgesanamdo) -1- (tert-butoxy) -1-oxogesan-2-yl) ureido) pentadionate (11)

Соединение (3) (379 мг; 0.656 ммоль) растворили в 10 мл DMF и прилили DIPEA 337 мкл; 1.961 ммоль. К полученной смеси добавили 6-азидгексановую кислоту 184 мг; 1.172 ммоль. Систему продули аргоном и добавили РуВОР 512 мг; 0.984 ммоль. Оставили перемешиваться на сутки. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (этилацетат : гексан; градиент от 5% до 100% этилацетата). В результате выделили 120 мг целевого продукта (11), выход 25%.Compound (3) (379 mg; 0.656 mmol) was dissolved in 10 ml of DMF and DIPEA 337 μl was added; 1.961 mmol. To the resulting mixture was added 6-azidhexanoic acid 184 mg; 1.172 mmol. The system was purged with argon and RuBOP 512 mg was added; 0.984 mmol. Left to mix for a day. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (ethyl acetate: hexane; gradient from 5% to 100% ethyl acetate). As a result, 120 mg of the expected product (11) was isolated, 25% yield.

Ди-трет-бутил-2-(3-(6-(11-азидо-N-(4-хлорбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентандиоат (12)Di-tert-butyl-2- (3- (6- (11-azido-N- (4-chlorobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (12 )

В 5 мл диметилформамида растворили 0,129 г (0,000211 моль, 1 экв.) соединения (4) и 0,066 г (0,000422 моль, 2 экв.) 6-азидогексановой кислоты. Добавили 0,197 г (0,000422 моль, 2 экв.) PyBrOP. Реакционную смесь охлаждали в ледяной бане в течение 5 минут, после чего добавили 220 мкл (0,00127 моль, 6 экв.) диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при охлаждении в течение 1 минуты, после чего в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель удалили под вакуумом, полученный маслянистый остаток подвергли очистке с помощью метода колоночной хроматографии (система этилацетат-петролейный эфир, градиент 1:3 - 1:1, сухое нанесение на 1 г силикагеля, 12 г силикагеля в колонке).0.129 g (0.000211 mol, 1 equiv.) Of compound (4) and 0.066 g (0.000422 mol, 2 equiv.) Of 6-azidohexanoic acid were dissolved in 5 ml of dimethylformamide. 0.197 g (0.000422 mol, 2 equiv.) Of PyBrOP was added. The reaction mixture was cooled in an ice bath for 5 minutes, after which 220 μl (0.00127 mol, 6 equiv.) Of diisopropylethylamine was added. The reaction mixture was stirred while cooling for 1 minute, and then overnight at room temperature. The solvent was removed in vacuo, the resulting oily residue was purified by column chromatography (ethyl acetate-petroleum ether system, gradient 1: 3 - 1: 1, dry coating on 1 g of silica gel, 12 g of silica gel in a column).

Таким образом, соединение (12) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 0,082 г (52%)Thus, compound (12) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 0.082 g (52%)

Ди-трет-бутил-2-(3-(6-(11-азидо-N-(4-бромбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентандиоат (13)Di-tert-butyl-2- (3- (6- (11-azido-N- (4-bromobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (13 )

В 5 мл диметилформамида растворили 0,185 г (0,000282 моль, 1 экв.) соединения (5) и 0,133 г (0,000846 моль, 3 экв.) 6-азидогексановой кислоты. Добавили 0,394 г (0,000846 моль, 3 экв.) PyBrOP. Реакционную смесь охлаждали в ледяной бане в течение 5 минут, после чего добавили 442 мкл (0,00254 моль, 9 экв.) диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при охлаждении в течение 1 минуты, после чего в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель удалили под вакуумом, полученный маслянистый остаток подвергли очистке с помощью метода колоночной хроматографии (система этилацетат-петролейный эфир, градиент 1:3 - 1:1, сухое нанесение на 1 г силикагеля, 12 г силикагеля в колонке).0.185 g (0.000282 mol, 1 equiv.) Of compound (5) and 0.133 g (0.000846 mol, 3 equiv.) Of 6-azidohexanoic acid were dissolved in 5 ml of dimethylformamide. 0.394 g (0.000846 mol, 3 equiv.) Of PyBrOP was added. The reaction mixture was cooled in an ice bath for 5 minutes, after which 442 μl (0.00254 mol, 9 equiv.) Of diisopropylethylamine was added. The reaction mixture was stirred while cooling for 1 minute, and then overnight at room temperature. The solvent was removed in vacuo, the resulting oily residue was purified by column chromatography (ethyl acetate-petroleum ether system, gradient 1: 3 - 1: 1, dry coating on 1 g of silica gel, 12 g of silica gel in a column).

Таким образом, соединение (13) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 0,124 г (55%).Thus, compound (13) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 0.124 g (55%).

Ди-трет-бутил 2-(3-(6-(6-азидо-N-(4-гидроксибензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (14)Di-tert-butyl 2- (3- (6- (6-azido-N- (4-hydroxybenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (14)

В колбу на 100 мл внесли соединение (6) (354 мг, 0.596 ммоль), добавили 3 эквивалента 6-азидогексановой кислоты (289 мг, 1.839 ммоль), растворенного в 1 мл DMF, затем внесли 9 эквивалентов DIPEA (784.4 мг, 935 мл, 5.368 ммоль) и 20 мл DMF. Реакционную смесь продули аргоном, после добавили 2 эквивалента РуВОР (624 мг, 1.199 ммоль) и оставили перемешивать в атмосфере аргона в течение 20 ч при комнатной температуре. По окончании реакции избыток растворителя упарили, вещество выделили с помощью колоночной хроматографии. Выход целевого продукта (14) составил 43% (190 мг, 0.259 ммоль).Compound (6) (354 mg, 0.596 mmol) was added to a 100 ml flask, 3 equivalents of 6-azidohexanoic acid (289 mg, 1.839 mmol) dissolved in 1 ml of DMF were added, then 9 equivalents of DIPEA (784.4 mg, 935 ml) were added , 5.368 mmol) and 20 ml of DMF. The reaction mixture was purged with argon, after which 2 equivalents of RuBOP (624 mg, 1.199 mmol) were added and the mixture was allowed to stir under argon for 20 h at room temperature. At the end of the reaction, the excess solvent was evaporated, the substance was isolated by column chromatography. The yield of the target product (14) was 43% (190 mg, 0.259 mmol).

Ди-трет-бутил 2-(3-(6-(6-азидо-N-(3-хлорбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (15)Di-tert-butyl 2- (3- (6- (6-azido-N- (3-chlorobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (15)

К смеси 6-азидогексановой кислоты (200 мг, 1.27 ммоль) и соединения (7) (389 мг, 0.635 ммоль) в 10 мл DMF добавили РуВОР (496 мг, 0.952 ммоль) и 332 мкл (1.905 ммоль) DIPEA. Полученный раствор перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь упарили при пониженном давлении. Дальнейшую очистку проводили методом колоночной хроматографии (EtOAc/гексан: 1/2). Таким образом, соединение (15) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 337 г (71%).To a mixture of 6-azidohexanoic acid (200 mg, 1.27 mmol) and compound (7) (389 mg, 0.635 mmol) in 10 ml of DMF was added RuBOP (496 mg, 0.952 mmol) and 332 μl (1.905 mmol) of DIPEA. The resulting solution was stirred for 16 hours. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure. Further purification was performed by column chromatography (EtOAc / Hexane: 1/2). Thus, compound (15) was isolated as a colorless oily substance; the yield was 337 g (71%).

Ди-трет-бутил 2-(3-(6-(6-азидо-N-(4-хлор-2-фтор-бензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (16)Di-tert-butyl 2- (3- (6- (6-azido-N- (4-chloro-2-fluoro-benzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (16)

К смеси 6-азидогексановой кислоты (226 мг, 1.438 ммоль) и соединения (8) (453 мг, 0.719 ммоль) в 10 мл DMF добавили РуВОР (561 мг, 1.078 ммоль) и 376 мкл (2.157 ммоль) DIPEA. Полученный раствор перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь упарили при пониженном давлении. Дальнейшую очистку проводили методом колоночной хроматографии (EtOAc/hexane: 1/2). В результате было выделено 300 мг (0,390 ммоль) целевого продукта, выход составил 54%. Таким образом, соединение (16) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 300 мг (54%).To a mixture of 6-azidohexanoic acid (226 mg, 1.438 mmol) and compound (8) (453 mg, 0.719 mmol) in 10 ml of DMF, RuBOP (561 mg, 1.078 mmol) and 376 μl (2.157 mmol) of DIPEA were added. The resulting solution was stirred for 16 hours. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure. Further purification was performed by column chromatography (EtOAc / hexane: 1/2). As a result, 300 mg (0.390 mmol) of the target product were isolated; the yield was 54%. Thus, compound (16) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 300 mg (54%).

Ди-трет-бутил 2-(3-(6-(6-азидо-N-(4-хлор-3-фторбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан)-2-ил)уреидо)пентанедиоат (17)Di-tert-butyl 2- (3- (6- (6-azido-N- (4-chloro-3-fluorobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexane) -2-yl) ureido ) pentanedioate (17)

К смеси 6-азидогексановой кислоты (233 мг, 1.482 ммоль) и соединения (9) (467 мг, 0.741 ммоль) в 10 мл DMF добавили РуВОР (578 мг, 1.111 ммоль) и 387 мкл (2.223 ммоль) DIPEA. Полученный раствор перемешивали в течение 16 часов. Реакционную смесь упарили при пониженном давлении. Дальнейшую очистку проводили методом колоночной хроматографии (EtOAc/гексан: 1/2). В результате было выделено 330 мг (0,429 ммоль) целевого продукта, выход составил 58%.To a mixture of 6-azidohexanoic acid (233 mg, 1.482 mmol) and compound (9) (467 mg, 0.741 mmol) in 10 ml of DMF, RuBOP (578 mg, 1.111 mmol) and 387 μl (2.223 mmol) of DIPEA were added. The resulting solution was stirred for 16 hours. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure. Further purification was performed by column chromatography (EtOAc / Hexane: 1/2). As a result, 330 mg (0.429 mmol) of the target product were isolated; the yield was 58%.

Таким образом, соединение (17) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 330 мг (58%).Thus, compound (17) was isolated as a colorless oily substance; the yield was 330 mg (58%).

(S)-ди-трет-бутил-2-(3-((S)-6-(4-амино-N-бензилбутанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогесан-2-ил)уреидо)пентадионат (18)(S) -di-tert-butyl-2- (3 - ((S) -6- (4-amino-N-benzylbutanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxogesan-2-yl) ureido) pentadionate (18)

Соединение (10) 120 мг; 0.148 ммоль растворили в 15 мл метанола. После этого добавили 12 мг Pd/C и продули систему водородом. Оставили перемешиваться на сутки. Полученную смесь профильтровали на сорбенте Kiselgur. Растворитель упарили при пониженном давлении. Масса полученного соединения (18) 68 мг, выход 70%.Compound (10) 120 mg; 0.148 mmol was dissolved in 15 ml of methanol. After that, 12 mg of Pd / C was added and the system was purged with hydrogen. Left to mix for a day. The resulting mixture was filtered on a Kiselgur sorbent. The solvent was evaporated under reduced pressure. The mass of the obtained compound (18) 68 mg, yield 70%.

(S)-ди-трет-бутил 2-(3-((S)-6-(6-амино-N-бензилгексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (19)(S) -di-tert-butyl 2- (3 - ((S) -6- (6-amino-N-benzylhexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (nineteen)

К раствору 161 мг (0,187 ммоль) соединения (11) в 10 мл метанола добавили 21 мг 10% Pd/C в 400 мкл воды. Реакция проводилась в атмосфере водорода (р=1 атм). Контроль окончания реакции проводился с помощью тонкослойной хроматографии. Далее полученная реакционная смесь была отфильтрована через диатомитовый порошок Kiselgur. Растворитель был удален при пониженном давлении. В результате было выделено 96 мг целевого соединения (19), выход 71%.To a solution of 161 mg (0.187 mmol) of compound (11) in 10 ml of methanol was added 21 mg of 10% Pd / C in 400 μl of water. The reaction was carried out in a hydrogen atmosphere (p = 1 atm). Control of the end of the reaction was carried out using thin layer chromatography. The resulting reaction mixture was then filtered through Kiselgur diatomaceous powder. The solvent was removed under reduced pressure. As a result, 96 mg of the target compound (19) was isolated, 71% yield.

(S)-Ди-трет-бутил 2-(3-((S)-6-(6-амино-N-(4-хлорбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (20)(S) -di-tert-butyl 2- (3 - ((S) -6- (6-amino-N- (4-chlorobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexane-2- sludge) ureido) pentanedioate (20)

К раствору 135 мг (0,180 ммоль) соединения (12) в 11 мл смеси ТГФ/вода (10/1) было добавлено 95 мг (0,360 ммоль) Ph₃P, полученную смесь перемешивали 6 часов при температуре 50°С. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и выделяли продукт с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, система: 1% раствор TEA в DCM:MeOH, 8% МеОН в течение 10 минут, далее от 8% до 100% МеОН за 1 минуту, промывка МеОН в течение 4 минут). В результате было выделено 45 мг целевого продукта (20), выход 35%.To a solution of 135 mg (0.180 mmol) of compound (12) in 11 ml of a THF / water mixture (10/1) was added 95 mg (0.360 mmol) of Ph ₃ P, the resulting mixture was stirred for 6 hours at a temperature of 50 ° C. Then the solvent was removed under reduced pressure and the product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, system: 1% TEA in DCM: MeOH, 8% MeOH for 10 minutes, then from 8% to 100% MeOH in 1 minute, washing with MeOH for 4 minutes). As a result, 45 mg of the expected product was isolated (20), yield 35%.

(S)-Ди-трет-бутокси 2-(3-((S)-6-(6-амино-N-(4-бромбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (21)(S) -di-tert-butoxy 2- (3 - ((S) -6- (6-amino-N- (4-bromobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexane-2- sludge) ureido) pentanedioate (21)

К раствору 128 мг (0,167 ммоль) соединения (13) в 11 мл смеси ТГФ/вода (10/1) было добавлено 88 мг (0,333 ммоль) Ph₃P, полученную смесь перемешивали 6 часов при температуре 50°С. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и выделяли продукт с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, система: 1% раствор TEA в DCM:MeOH, 8% МеОН в течение 10 минут, далее от 8% до 100% МеОН за 1 минуту, промывка МеОН в течение 4 минут). В результате было выделено 55 мг целевого продукта (21), выход 43%.To a solution of 128 mg (0.167 mmol) of compound (13) in 11 ml of a THF / water mixture (10/1), 88 mg (0.333 mmol) of Ph ₃ P was added, the resulting mixture was stirred for 6 hours at a temperature of 50 ° C. Then the solvent was removed under reduced pressure and the product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, system: 1% TEA in DCM: MeOH, 8% MeOH for 10 minutes, then from 8% to 100% MeOH in 1 minute, washing with MeOH for 4 minutes). As a result, 55 mg of the target product was isolated (21), yield 43%.

(S)-ди-трет-бутил 2-(3-((S)-6-(6-амино-N-(3-хлорбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентадиоат (22)(S) -di-tert-butyl 2- (3 - ((S) -6- (6-amino-N- (3-chlorobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1-oxohexane-2- sludge) ureido) pentadioate (22)

К раствору 159 мг исходного азида (15) в 5 мл THF было добавлено 0.5 мл Н₂О и 111 мг PPh₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 60°С, контроль окончания реакции проводили с помощью ТСХ. После окончания реакции реакционную смесь упарили, и очищали с помощью флеш-хроматографии в системе DCM/MeOH/Et₃N (95/4/1). В результате чего было выделено 120 мг целевого продукта (22), выход 78%.To a solution of 159 mg of starting azide (15) in 5 ml of THF was added 0.5 ml of H ₂ O and 111 mg of PPh ₃ . The reaction mixture was stirred for 2 hours at 60 ° C; the end of the reaction was monitored by TLC. After completion of the reaction, the reaction mixture was evaporated and purified by flash chromatography in DCM / MeOH / Et ₃ N (95/4/1). As a result, 120 mg of the target product was isolated (22), yield 78%.

(S)-ди-трет-бутил 2-(3-((S)-6-(6-амино-N-(4-хлор-2-фторбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентадиоат (23)(S) -di-tert-butyl 2- (3 - ((S) -6- (6-amino-N- (4-chloro-2-fluorobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1- oxohexan-2-yl) ureido) pentadioate (23)

К раствору 139 мг исходного азида (16) в 5 мл THF было добавлено 0.5 мл Н₂О и 95 мг PPh₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 60°С, контроль окончания реакции проводили с помощью ТСХ. После окончания реакции реакционную смесь упарили, и очищали с помощью флеш-хроматографии в системе DCM/MeOH/Et₃N (95/4/1). В результате чего было выделено 120 мг целевого продукта (23), выход 78%.To a solution of 139 mg of starting azide (16) in 5 ml of THF was added 0.5 ml of H ₂ O and 95 mg of PPh ₃ . The reaction mixture was stirred for 2 hours at 60 ° C; the end of the reaction was monitored by TLC. After completion of the reaction, the reaction mixture was evaporated and purified by flash chromatography in DCM / MeOH / Et ₃ N (95/4/1). As a result, 120 mg of the target product was isolated (23), yield 78%.

(S)-Ди-трет-бутил 2-(3-((S)-6-(6-амино-N-(4-хлор-3-фторбензил)гексанамидо)-1-(трет-бутокси)-1-оксогексан-2-ил)уреидо)пентанедиоат (24)(S) -di-tert-butyl 2- (3 - ((S) -6- (6-amino-N- (4-chloro-3-fluorobenzyl) hexanamido) -1- (tert-butoxy) -1- oxohexan-2-yl) ureido) pentanedioate (24)

К раствору 227 мг (0,306 ммоль) соединения (17) в 11 мл смеси ТГФ/вода (10/1) было добавлено 161 мг (0,611 ммоль) Ph₃P, полученную смесь перемешивали 6 часов при температуре 50°С. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и выделяли продукт с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, система: 1% раствор TEA в DCM:MeOH, 8% МеОН в течение 10 минут, далее от 8% до 100% МеОН за 1 минуту, промывка МеОН в течение 4 минут). В результате было выделено 138 мг целевого продукта (24), выход 61%.To a solution of 227 mg (0.306 mmol) of compound (17) in 11 ml of a THF / water mixture (10/1) was added 161 mg (0.611 mmol) of Ph ₃ P, the resulting mixture was stirred for 6 hours at a temperature of 50 ° C. Then the solvent was removed under reduced pressure and the product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, system: 1% TEA in DCM: MeOH, 8% MeOH for 10 minutes, then from 8% to 100% MeOH in 1 minute, washing with MeOH for 4 minutes). As a result, 138 mg of the expected product was isolated (24), yield 61%.

(S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-фенилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота (25)(S) -2 - ((S) -2 - ((tert-butoxycarbonyl) amino) -3-phenylpropanamido) -3-phenylpropanoic acid (25)

К раствору 1 г 3.2 ммоль дипептида L-Phe-L-Phe в 120 мл смеси диоксан/вода (3/1) было добавлено 958 мг 4.4 ммоль ВОС₂О и 920 мг 10.8 NaHCO₃, полученную смесь перемешивали в течение 6 часов. Далее реакционную смесь упаривали и растворяли в 50 мл EtOAc и промывали раствором 0.1М HCl (рН=1). Полученную органическую фракцию сушили над Na₂SO₄ и упаривали при пониженном давлении. В результате чего было выделено 958 мг целевого продукта, выход 72%.To a solution of 1 g 3.2 mmol of L-Phe-L-Phe dipeptide in 120 ml of dioxane / water (3/1) was added 958 mg of 4.4 mmol of BOC ₂ O and 920 mg of 10.8 NaHCO ₃ , the resulting mixture was stirred for 6 hours. Next, the reaction mixture was evaporated and dissolved in 50 ml EtOAc and washed with a solution of 0.1 M HCl (pH = 1). The resulting organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated under reduced pressure. As a result, 958 mg of the expected product was isolated, yield 72%.

Трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-азидопропил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)карбамат (26)Tert-butyl - ((S) -1 - (((S) -1 - ((3-azidopropyl) amino) -1-oxo-3-phenylpropan-2-yl) amino) -1-oxo-3-phenylpropane -2-yl) carbamate (26)

Соединение (25) растворили в 40 мл DMF. Добавили НОВТ, HBTU. К полученной смеси прилили DIPEA. Оставили перемешивать в течении 16 часов, после чего упарили растворитель при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (этилацетат: гексан; градиент от 5% до 100% этилацетата) В результате выделили 890 мг целевого продукта (26), выход 53%.Compound (25) was dissolved in 40 ml of DMF. Added NOVT, HBTU. DIPEA was added to the resulting mixture. It was left to mix for 16 hours, after which the solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (ethyl acetate: hexane; gradient from 5% to 100% ethyl acetate). As a result, 890 mg of the expected product (26) was isolated, yield 53%.

(S)-2-амино-N-((S)-1-((3-азидопропил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)-3-фенилпропанамид (27)(S) -2-amino-N - ((S) -1 - ((3-azidopropyl) amino) -1-oxo-3-phenylpropan-2-yl) -3-phenylpropanamide (27)

256 мг соединения (26) были растворены в 2700 мкл DCM после чего к реакционной смеси было добавлено 300 мкл TFA. Реакционную смесь перемешивали 2 часа, контроль протекания реакции проводили методом ТСХ. После окончания реакционную смесь промыли диэтиловым эфиром. Полученную маслянистую фракцию растворили в DCM и промыли раствором NaHCO₃. Органическую фракцию сушили над Na₂SO₄. В результате чего выделено ~180 мг целевого продукта (27), выход 88%.256 mg of compound (26) were dissolved in 2700 μl of DCM, after which 300 μl of TFA was added to the reaction mixture. The reaction mixture was stirred for 2 hours, the control of the reaction was carried out by TLC. After completion, the reaction mixture was washed with diethyl ether. The resulting oily fraction was dissolved in DCM and washed with a NaHCO ₃ solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ . As a result, ~ 180 mg of the target product was isolated (27), yield 88%.

(R)-2-((R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-фенилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота (28)(R) -2 - ((R) -2 - ((tert-butoxycarbonyl) amino) -3-phenylpropanamido) -3-phenylpropanoic acid (28)

500 мг дипептида D-Phe-D-Phe (1,6 ммоль) растворили в 40 мл смеси диоксан/вода (3/1). К раствору прибавили 479,1 мг ВОС₂О (2,2 ммоль) и 460,1 мг NaHCO₃ (5,5 ммоль). Данную смесь перемешивали в течении 6 часов, после чего удалили растворитель при пониженном давлении, растворили в 50 мл этилацетата и промывали 0,1 М раствором HCl (рН=1). Органическую фракцию сушили над Na₂SO₄, после чего удалили растворитель при пониженном давлении. Масса продукта 28 - 638 мг. Выход - 97%.500 mg of the D-Phe-D-Phe dipeptide (1.6 mmol) was dissolved in 40 ml of dioxane / water (3/1). 479.1 mg of BOC ₂ O (2.2 mmol) and 460.1 mg of NaHCO ₃ (5.5 mmol) were added to the solution. This mixture was stirred for 6 hours, after which the solvent was removed under reduced pressure, dissolved in 50 ml of ethyl acetate and washed with 0.1 M HCl solution (pH = 1). The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ , after which the solvent was removed under reduced pressure. The mass of the product is 28 - 638 mg. The yield is 97%.

Трет-бутил ((R)-1-(((R)-1-((3-азидопропил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)карбамат (29)Tert-butyl ((R) -1 - (((R) -1 - ((3-azidopropyl) amino) -1-oxo-3-phenylpropan-2-yl) amino) -1-oxo-3-phenylpropane 2-yl) carbamate (29)

588 мг соединения (28) (1,425 ммоль) растворили в примерно 20 мл ДМФА. К раствору прибавили 649 мг HBTU (1,711 ммоль) и 192 мг НОВТ (1,421 ммоль). К смеси прилили 372 мкл DIPEA (2,136 ммоль). Затем в реакционную смесь ввели 596 мг NH₂-(СН₂)₃-N₃ (5,96 ммоль). Реакционная смесь перемешивалась в течении 16 часов, после чего удалили растворитель при пониженном давлении. Очистка вещества производилась с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 15μ 25g F0025, система этилацетат/петролейный эфир, этилацетат от 5% до 40 в течение 6 минут, от 40% до 60 в течении 15 минут, от 60% до 100% в течении 6 минут, 100% в течении 3 минут). Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Конечная масса полученного продукта (29) - 406 мг. Выход - 58%.588 mg of compound (28) (1.425 mmol) was dissolved in approximately 20 ml of DMF. 649 mg of HBTU (1.711 mmol) and 192 mg of HOBT (1.421 mmol) were added to the solution. 372 μl DIPEA (2.136 mmol) was added to the mixture. Then, 596 mg of NH ₂ - (CH ₂ ) ₃ -N ₃ (5.96 mmol) was introduced into the reaction mixture. The reaction mixture was stirred for 16 hours, after which the solvent was removed under reduced pressure. The substance was purified using the column chromatography method (Puriflash 15μ 25g F0025, ethyl acetate / petroleum ether system, ethyl acetate from 5% to 40 for 6 minutes, from 40% to 60 for 15 minutes, from 60% to 100% for 6 minutes, 100% for 3 minutes). Next, the solvent was removed under reduced pressure. The final mass of the obtained product (29) is 406 mg. The yield is 58%.

(R)-2-амино-N-((R)-1-((3-азидопропил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)-3-фенилпроанамид (30)(R) -2-amino-N - ((R) -1 - ((3-azidopropyl) amino) -1-oxo-3-phenylpropan-2-yl) -3-phenylproanamide (30)

406 мг соединения (29) (0,822 ммоль) растворили в 6585 мкл ДХМ. К раствору прибавили 980 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали в течении 3 часов. После этого удалили растворитель при пониженном давлении. Затем растворили полученное вещество в ДХМ, добавили насыщенный раствор NaHCO₃ в воде, перемешивали в течении 10 минут, экстрагировали и оставили органическую фазу сушиться над Na₂SO₄ на ночь. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Масса продукта (30) - 274 мг. Выход - 85%.406 mg of compound (29) (0.822 mmol) was dissolved in 6585 μl of DCM. 980 μl trifluoroacetic acid was added to the solution. The mixture was stirred for 3 hours. After that, the solvent was removed under reduced pressure. Then, the obtained substance was dissolved in DCM, a saturated solution of NaHCO ₃ in water was added, stirred for 10 minutes, extracted and the organic phase was left to dry over Na ₂ SO ₄ overnight. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The mass of the product (30) is 274 mg. The yield is 85%.

(S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-фенилпропановая кислота (31)(S) -2 - ((tert-butoxycarbonyl) amino) -3-phenylpropanoic acid (31)

К суспензии аминокислоты L-фенилаланина (1.32 г, 8 ммоль) в 50 мл смеси растворителей ТГФ - вода (3:2) при 0°С добавили NaOH (0.32 г, 8 ммоль, 1 экв.) и ди-трет-бутил дикарбонат ВОС₂О (1.74 г, 8 ммоль, 1 экв.). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 суток. Реакционную смесь сконцентрировали в вакууме роторного испарителя до удаления органического растворителя. Затем в водный остаток добавляли 1М раствором соляной кислоты до рН=6 и экстрагировали этилацетатом (3*50 мл). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным раствором NaHCO₃ и NaCl, сушили Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Затем повторно переупаривали с дихлорметаном. Продукт реакции получали в виде бесцветного аморфного вещества (31) с выходом 90% (1.91 г, 7.2 ммоль).To a suspension of the amino acid L-phenylalanine (1.32 g, 8 mmol) in 50 ml of a mixture of THF-water solvents (3: 2) at 0 ° C was added NaOH (0.32 g, 8 mmol, 1 equiv.) And di-tert-butyl dicarbonate BOC ₂ O (1.74 g, 8 mmol, 1 equiv.). The resulting mixture was stirred at room temperature for 4 days. The reaction mixture was concentrated in vacuo on a rotary evaporator until the organic solvent was removed. Then, 1 M hydrochloric acid was added to the aqueous residue to pH = 6 and extracted with ethyl acetate (3 * 50 ml). The combined organic phase was washed with saturated NaHCO ₃ and NaCl, dried with Na ₂ SO ₄ and concentrated in vacuo. Then re-evaporated with dichloromethane. The reaction product was obtained as a colorless amorphous substance (31) with a yield of 90% (1.91 g, 7.2 mmol).

(S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-фенилпропанамидо)-3-(4-гидроксифенил)пропановая кислота (32)(S) -2 - ((S) -2 - ((tert-butoxycarbonyl) amino) -3-phenylpropanamido) -3- (4-hydroxyphenyl) propanoic acid (32)

К раствору соединения (31) (1.91 г, 7.2 ммоль) в 50 мл дихлорметана добавили EDC*HCl (1.65 г, 8.6 ммоль, 1.2 экв.), PFPOH (1.31 г, 7.12 ммоль, 1 экв.) и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. Затем в реакционную смесь добавляли силикагель (10 г) и полученную суспензию хроматографировали на колонке с силикагелем (элюент - дихлорметан). Продукт реакции (желтое маслянистое вещество) растворяли в 60 мл смеси ТГФ - вода (2:1) и добавляли при перемешивании L-тирозин (1.45 г, 8 ммоль, 1 экв.). К полученному раствору прикапывали DIPEA (1.4 мл, 8 ммоль, 1 экв.) и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную смесь концентрировали в вакууме роторного испарителя до полного удаления органического растворителя. Остаток в колбе подкисляли 1М раствором HCl до рН=2 и экстрагировали этилацетатом (3*50 мл). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным раствором NaHCO₃ и NaCl, сушили Na₂SO₄ и концентрировали в вакууме. Полученный бесцветный аморфный остаток растворяли в минимальном количестве дихлорметана и прикапывали при перемешивании 100 мл гексана. Выпавший осадок отфильтровали и ресуспендировали в 50 мл гексана в УЗИ-бане, затем заново отфильтровали. Получили продукт реакции в виде белого твердого вещества (32) с выходом 52% (1.78 г, 4.16 ммоль).To a solution of compound (31) (1.91 g, 7.2 mmol) in 50 ml of dichloromethane was added EDC * HCl (1.65 g, 8.6 mmol, 1.2 equiv.), PFPOH (1.31 g, 7.12 mmol, 1 equiv.) And stirred for 12 hours at room temperature. Then, silica gel (10 g) was added to the reaction mixture, and the resulting suspension was chromatographed on a silica gel column (eluent was dichloromethane). The reaction product (yellow oily substance) was dissolved in 60 ml of a THF-water mixture (2: 1) and L-tyrosine (1.45 g, 8 mmol, 1 equiv.) Was added with stirring. DIPEA (1.4 ml, 8 mmol, 1 equiv.) Was added dropwise to the resulting solution, and stirred for 12 hours at room temperature. At the end of the reaction, the reaction mixture was concentrated in a vacuum of a rotary evaporator until the organic solvent was completely removed. The residue in the flask was acidified with 1M HCl to pH = 2 and extracted with ethyl acetate (3 * 50 ml). The combined organic phase was washed with saturated NaHCO ₃ and NaCl, dried with Na ₂ SO ₄ and concentrated in vacuo. The resulting colorless amorphous residue was dissolved in a minimal amount of dichloromethane and 100 ml of hexane was added dropwise with stirring. The precipitate was filtered off and resuspended in 50 ml of hexane in an ultrasound bath, then filtered again. The reaction product was obtained as a white solid (32) with a yield of 52% (1.78 g, 4.16 mmol).

(S)-1-(((S)-1-((3-азидопропил)амино)-3-(4-гидроксифенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-аммоний трифторацетат (33)(S) -1 - (((S) -1 - ((3-azidopropyl) amino) -3- (4-hydroxyphenyl) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxo-3-phenylpropane- 2-ammonium trifluoroacetate (33)

К раствору соединения (32) (1.78 г, 4.16 ммоль) в 50 мл дихлорметана добавили EDC*HCl (0.95 г, 5 ммоль, 1.2 экв.), PFPOH (0.76 г, 4.16 ммоль, 1 экв.) и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. Затем в реакционную смесь добавляли силикагель (10 г) и полученную суспензию хроматографировали на колонке с силикагелем (элюент - дихлорметан/этилацетат 40:1). Продукт реакции (желтое маслянистое вещество) растворяли в 60 мл ТГФ и добавляли при перемешивании азидопропиламин (0.42 г, 4 16 ммоль, 1 экв.). К полученному раствору прикапывали DIPEA (0.72 мл, 4.16 ммоль, 1 экв.) и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную смесь концентрировали в вакууме роторного испарителя и хроматографировали остаток на колонке с силикагелем (элюент - дихлорметан/метанол 40:1). Полученный продукт растворяли в 20 мл безводного дихлорметана и охлаждали на бане со льдом до 0°С. Далее при перемешивании прикапывали 2 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре в течение 3-4 часов до полного исчезновения исходного вещества (ТСХ-контроль). По окончании реакции упаривали смесь в вакууме роторного растворителя, переупаривали остаток дважды с дихлорметаном и вакуумировали до полного удаления органического растворителя. Получили продукт реакции в виде желтого аморфного вещества (33) с выходом 57% (1.24 г, 2.37 ммоль).To a solution of compound (32) (1.78 g, 4.16 mmol) in 50 ml of dichloromethane was added EDC * HCl (0.95 g, 5 mmol, 1.2 equiv.), PFPOH (0.76 g, 4.16 mmol, 1 equiv.) And stirred for 12 hours at room temperature. Then, silica gel (10 g) was added to the reaction mixture, and the resulting suspension was chromatographed on a silica gel column (eluent dichloromethane / ethyl acetate 40: 1). The reaction product (yellow oily substance) was dissolved in 60 ml of THF and azidopropylamine (0.42 g, 4–16 mmol, 1 eq.) Was added with stirring. DIPEA (0.72 ml, 4.16 mmol, 1 equiv.) Was added dropwise to the resulting solution and stirred for 12 hours at room temperature. At the end of the reaction, the reaction mixture was concentrated in a vacuum of a rotary evaporator and the residue was chromatographed on a silica gel column (eluent dichloromethane / methanol 40: 1). The resulting product was dissolved in 20 ml of anhydrous dichloromethane and cooled in an ice bath to 0 ° C. Then, with stirring, 2 ml of trifluoroacetic acid was added dropwise and the reaction solution was stirred at room temperature for 3-4 hours until the starting material completely disappeared (TLC control). At the end of the reaction, the mixture was evaporated in a vacuum of a rotary solvent, the residue was re-evaporated twice with dichloromethane and evacuated until the organic solvent was completely removed. The reaction product was obtained as a yellow amorphous substance (33) with a yield of 57% (1.24 g, 2.37 mmol).

(R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-фенилпропановая кислота (34)(R) -2 - ((tert-butoxycarbonyl) amino) -3-phenylpropanoic acid (34)

К суспензии аминокислоты D-фенилаланина (4 г, 24 ммоль) в 30 мл смеси растворителей диоксан - вода (1:2) при 0°С добавили NaHCO₃ (1.8 г, 30 ммоль, 1.2 экв.) и ди-трет-бутил дикарбонат ВОС₂О (5.18 г, 45 ммоль, 1 экв.). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Реакционную смесь сконцентрировали в вакууме роторного испарителя до удаления органического растворителя. Затем в водный остаток добавляли 1М раствором соляной кислоты до рН=6 и экстрагировали этилацетатом (3*30 мл). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным раствором NaHCO₃ и NaCl, сушили Na₂RO₄ и концентрировали в вакууме. Затем повторно переупаривали с дихлорметаном. Продукт реакции получали в виде желтого масла вещества (34) с выходом 97% (6.25 г, 23 ммоль).To a suspension of the amino acid D-phenylalanine (4 g, 24 mmol) in 30 ml of a solvent mixture of dioxane - water (1: 2) at 0 ° C was added NaHCO ₃ (1.8 g, 30 mmol, 1.2 equiv.) And di-tert-butyl BOC ₂ O dicarbonate (5.18 g, 45 mmol, 1 equiv.). The resulting mixture was stirred at room temperature for 2 days. The reaction mixture was concentrated in vacuo on a rotary evaporator until the organic solvent was removed. Then, 1 M hydrochloric acid was added to the aqueous residue to pH = 6 and extracted with ethyl acetate (3 * 30 ml). The combined organic phase was washed with saturated NaHCO ₃ and NaCl, dried with Na ₂ RO ₄ and concentrated in vacuo. Then re-evaporated with dichloromethane. The reaction product was obtained as a yellow oil of substance (34) in 97% yield (6.25 g, 23 mmol).

(R)-2-((R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-фенилпропанамидо)-3-(4-гидроксифенил)пропановая кислота (35)(R) -2 - ((R) -2 - ((tert-butoxycarbonyl) amino) -3-phenylpropanamido) -3- (4-hydroxyphenyl) propanoic acid (35)

К раствору соединения (34) (6.25 г, 23 ммоль) в 120 мл дихлорметана добавили EDC*HCl (5.28 г, 27 ммоль, 1.2 экв.), PFPOH (4.2 г, 23 ммоль, 1 экв.) и перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем в реакционную смесь добавляли силикагель (50 г) и полученную суспензию хроматографировали на колонке с силикагелем (элюент - дихлорметан). Продукт реакции (желтое маслянистое вещество) растворяли в 110 мл смеси ТГФ - вода (8:3) и добавляли при перемешивании D-тирозин (8 г, 46 ммоль, 2 экв.). К полученному раствору прикапывали DIPEA (8 мл, 46 ммоль, 2 экв.) и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную смесь концентрировали в вакууме до полного удаления органического растворителя. Остаток в колбе подкисляли 1М раствором HCl до рН=3 и экстрагировали этилацетатом (3*80 мл). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным раствором NaHCO₃ и NaCl, сушили Na₂RO₄ и концентрировали в вакууме. Полученный бесцветный аморфный остаток растворяли в минимальном количестве дихлорметана и прикапывали при перемешивании 100 мл гексана. Выпавший осадок отфильтровали и ресуспендировали в 50 мл диэтилового эфира в УЗИ-бане, затем заново отфильтровали. Получили продукт реакции в виде белого твердого вещества (35) с выходом 84% (8.25 г, 19 ммоль).To a solution of compound (34) (6.25 g, 23 mmol) in 120 ml of dichloromethane was added EDC * HCl (5.28 g, 27 mmol, 1.2 equiv.), PFPOH (4.2 g, 23 mmol, 1 equiv.) And stirred for 2 hours at room temperature. Then, silica gel (50 g) was added to the reaction mixture, and the resulting suspension was chromatographed on a silica gel column (eluent was dichloromethane). The reaction product (yellow oily substance) was dissolved in 110 ml of a THF-water mixture (8: 3) and D-tyrosine (8 g, 46 mmol, 2 eq.) Was added with stirring. DIPEA (8 ml, 46 mmol, 2 equiv.) Was added dropwise to the resulting solution and stirred for 12 hours at room temperature. At the end of the reaction, the reaction mixture was concentrated in vacuo until the organic solvent was completely removed. The residue in the flask was acidified with 1M HCl to pH = 3 and extracted with ethyl acetate (3 * 80 ml). The combined organic phase was washed with saturated NaHCO ₃ and NaCl, dried with Na ₂ RO ₄ and concentrated in vacuo. The resulting colorless amorphous residue was dissolved in a minimal amount of dichloromethane and 100 ml of hexane was added dropwise with stirring. The precipitate formed was filtered off and resuspended in 50 ml of diethyl ether in an ultrasound bath, then filtered again. The reaction product was obtained as a white solid (35) with a yield of 84% (8.25 g, 19 mmol).

(R)-1-(((R)-1-((3-азидопропил)амино)-3-(4-гидроксифенил)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-аммоний трифторацетат (36)(R) -1 - (((R) -1 - ((3-azidopropyl) amino) -3- (4-hydroxyphenyl) -1-oxopropan-2-yl) amino) -1-oxo-3-phenylpropane- 2-ammonium trifluoroacetate (36)

К раствору соединения (35) (8.25 г, 19 ммоль) в 90 мл дихлорметана добавили EDC*HCl (4.4 г, 23 ммоль, 1.2 экв.), PFPOH (3.5 г, 19 ммоль, 1 экв.) и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. Затем в реакционную смесь добавляли силикагель (40 г) и полученную суспензию хроматографировали на колонке с силикагелем (элюент - дихлорметан/этилацетат 40:1). Продукт реакции (желтое маслянистое вещество) растворяли в 90 мл ТГФ и добавляли при перемешивании азидопропиламин (1.6 г, 19 ммоль, 1 экв.). К полученному раствору прикапывали DIPEA (4 мл, 23 ммоль, 1 экв.) и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную смесь концентрировали в вакууме роторного испарителя и хроматографировали остаток на колонке с силикагелем (элюент - дихлорметан/метанол 40:1). Полученный продукт растворяли в 60 мл безводного дихлорметана и охлаждали на бане со льдом до 0°С. Далее при перемешивании прикапывали 4 мл трифторуксусной кислоты и перемешивали реакционный раствор при комнатной температуре в течение 3-4 часов до полного исчезновения исходного вещества (ТСХ-контроль). По окончании реакции упаривали смесь в вакууме роторного растворителя, переупаривали остаток дважды с дихлорметаном и вакуумировали до полного удаления органического растворителя. Полученное масло ресуспендировали в 50 мл диэтилового эфира в УЗИ-бане, затем отфильтровали. Получили продукт реакции в виде белого порошка вещества (36) с выходом 40% (4 г, 7.6 ммоль).To a solution of compound (35) (8.25 g, 19 mmol) in 90 ml of dichloromethane was added EDC * HCl (4.4 g, 23 mmol, 1.2 equiv.), PFPOH (3.5 g, 19 mmol, 1 equiv.) And stirred for 12 hours at room temperature. Then, silica gel (40 g) was added to the reaction mixture, and the resulting suspension was chromatographed on a silica gel column (eluent dichloromethane / ethyl acetate 40: 1). The reaction product (yellow oily substance) was dissolved in 90 ml of THF and azidopropylamine (1.6 g, 19 mmol, 1 eq.) Was added with stirring. DIPEA (4 ml, 23 mmol, 1 equiv.) Was added dropwise to the resulting solution, and stirred for 12 hours at room temperature. At the end of the reaction, the reaction mixture was concentrated in a vacuum of a rotary evaporator and the residue was chromatographed on a silica gel column (eluent dichloromethane / methanol 40: 1). The resulting product was dissolved in 60 ml of anhydrous dichloromethane and cooled in an ice bath to 0 ° C. Then, 4 ml of trifluoroacetic acid were added dropwise with stirring, and the reaction solution was stirred at room temperature for 3-4 hours until the starting material completely disappeared (TLC control). At the end of the reaction, the mixture was evaporated in a vacuum of a rotary solvent, the residue was re-evaporated twice with dichloromethane and evacuated until the organic solvent was completely removed. The resulting oil was resuspended in 50 ml of diethyl ether in an ultrasound bath, then filtered. The reaction product was obtained in the form of a white powder of substance (36) with a yield of 40% (4 g, 7.6 mmol).

(3S,7S,23S,26S)-три-трет-бутил 31-азидо-12,23,26-трибензил-5,13,18,21,24,27-гексаоксо-4,6,12,17,22,25,28-гептаазагентриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (37)(3S, 7S, 23S, 26S) -tri-tert-butyl 31-azido-12,23,26-tribenzyl-5,13,18,21,24,27-hexaoxo-4,6,12,17,22 , 25,28-heptaazagentriacontane-1,3,7-tricarboxylate (37)

К раствору 60 мг (0,092 ммоль) соединения (18) в 10 мл ДХМ добавили 10 мг (0,096 ммоль) янтарного ангидрида и 23 мкл (0,135) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и упарили. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 51 мг (0,160 ммоль соединения (27), 13 мг (0,096 ммоль) HOBt, 55 мг (0,144 ммоль) HBTU, 19 мкл (0,110 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат

этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - EtOAc/МеОН=5:1. В результате было выделено 51 мг (0,045 ммоль) целевого продукта (37), выход 49%.10 mg (0.096 mmol) of succinic anhydride and 23 μl (0.135) of DIPEA were added to a solution of 60 mg (0.092 mmol) of compound (18) in 10 ml of DCM. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 51 mg (0.160 mmol of compound (27), 13 mg (0.096 mmol) of HOBt, 55 mg (0.144 mmol) of HBTU, 19 μl (0.110 mmol) of DIPEA were added, and the mixture was stirred for 24 hours. solvent under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate system

ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1. As a result, 51 mg (0.045 mmol) of the expected product (37) were isolated, 49% yield.

(3S,7S)-три-трет-бутил 33-азидо-12,25,28-трибензил-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (38)(3S, 7S) -tri-tert-butyl 33-azido-12,25,28-tribenzyl-5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30 -heptaazatriacontane-1,3,7-tricarboxylate (38)

К раствору 88 мг (0,127 ммоль) соединения (19) в 10 мл ДХМ добавили 14 мг (0,134 ммоль) янтарного ангидрида и 34 мкл (0,191) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и упарили. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 51 мг (0,160 ммоль) вещества (27), 21 мг (0,152 ммоль) HOBt, 58 мг (0,152 ммоль) HBTU, 26 мкл (0,152 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат

этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - EtOAc/MeOH=5:1. В результате было выделено 44 мг (0,038 ммоль) целевого продукта (38), выход 30%.To a solution of 88 mg (0.127 mmol) of compound (19) in 10 ml of DCM was added 14 mg (0.134 mmol) of succinic anhydride and 34 μl (0.191) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 51 mg (0.160 mmol) of substance (27), 21 mg (0.152 mmol) of HOBt, 58 mg (0.152 mmol) of HBTU, 26 μl (0.152 mmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate system

ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1. As a result, 44 mg (0.038 mmol) of the expected product (38) were isolated, yield 30%.

(3S,7S,25S,28S)-три-трет-бутил 33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-бромбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (39)(3S, 7S, 25S, 28S) -tri-tert-butyl 33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-bromobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6 , 12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (39)

К раствору 50 мг (0,065 ммоль) соединения (21) в 10 мл ДХМ добавили 7 мг (0,068 ммоль) янтарного ангидрида и 23 мкл (0,130 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и упарили. Сухой остаток растворили в 10 ДМФА и добавили 25 мг (0,049 ммоль) вещества (27), 8 мг (0,060 ммоль) HOBt, 23 мг (0,060 ммоль) HBTU, 20 мкл (0,116 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат

этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - EtOAc/MeOH=5:1. В результате было выделено 35 мг (0,028 ммоль) целевого продукта (39), выход 43%.To a solution of 50 mg (0.065 mmol) of compound (21) in 10 ml of DCM was added 7 mg (0.068 mmol) of succinic anhydride and 23 μl (0.130 mmol) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated. The dry residue was dissolved in 10 DMF and 25 mg (0.049 mmol) of substance (27), 8 mg (0.060 mmol) of HOBt, 23 mg (0.060 mmol) of HBTU, 20 μl (0.116 mmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate system

ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1. As a result, 35 mg (0.028 mmol) of the expected product (39) were isolated, yield 43%.

(3S,7S,25R,28R)-три-трет-бутил-33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-бромбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикоарбоксилат (40)(3S, 7S, 25R, 28R) -tri-tert-butyl-33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-bromobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4, 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (40)

124 мг соединения (21), 0.161 ммоль растворили в 10 мл DCM и систему продули аргоном. Добавили янтарный ангидрид 17 мг, 0,169 ммоль, после этого DIPEA 41 мкл 0.241 ммоль. Оставили при перемешивании на сутки. После добавили 1 мл метанола и оставили при перемешивании на 1,5 часа. Полученную реакционную смесь упарили. Сухой остаток растворили растворили в 2 мл DCM, добавили DIPEA 26 мкл 0.156 ммоль. Систему продули аргоном. Добавили НОВТ 17 мг, 0.117 ммоль, HBTU 44 мг, 0.117 ммоль и оставили перемешиваться на 30 минут. Далее добавили растворенное в 500 мкл DCM вещество (30) 60 мг, 0.077 ммоль. Реакционную смесь оставили перемешиваться на ночь. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат

этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100%) метанола в течение 5 минут). В результате выделили 60 мг целевого продукта (40), выход 31%.124 mg of compound (21), 0.161 mmol were dissolved in 10 ml of DCM and the system was purged with argon. Succinic anhydride was added 17 mg, 0.169 mmol, after which DIPEA 41 μl 0.241 mmol. Left with stirring for a day. After that, 1 ml of methanol was added and left under stirring for 1.5 hours. The resulting reaction mixture was evaporated. The dry residue was dissolved, dissolved in 2 ml of DCM, DIPEA 26 μl 0.156 mmol was added. The system was purged with argon. Added HOBT 17 mg, 0.117 mmol, HBTU 44 mg, 0.117 mmol and left to mix for 30 minutes. Then, the substance (30) 60 mg dissolved in 500 μl of DCM was added, 0.077 mmol. The reaction mixture was allowed to stir overnight. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate system

ethyl acetate / methanol, from 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, from 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100%) methanol for 5 minutes). As a result, 60 mg of the expected product (40) was isolated, yield 31%.

(3S,7S,25R,28R)-три-трет-бутил-33-азидо-25-бензил-12-(-4-бромбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (41)(3S, 7S, 25R, 28R) -tri-tert-butyl-33-azido-25-benzyl-12 - (- 4-bromobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26 , 29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (41)

К раствору 69 мг (88,97 мкмоль) вещества (21) в 10 мл ДХМ добавили 9 мг (93,42 мкмоль) янтарного ангидрида и 23 мкл (133,45 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 3 мл метанола и перемешивали 90 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 31 мкл (177,9 мкмоль) DIPEA, 20 мг (133,4 мкмоль) HOBt, 51 мг (133,4 мкмоль) HBTU, после систему продули аргоном и оставили перемешиваться 60 минут, далее добавили 70 мг (133,4 мкмоль) вещества (36). Смесь перемешивалась 24 ч в инертной атмосфере. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат

этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюент для ТСХ - EtOAc/MeOH=5:1.To a solution of 69 mg (88.97 μmol) of substance (21) in 10 ml of DCM, 9 mg (93.42 μmol) of succinic anhydride and 23 μl (133.45 μmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for a day. Then 3 ml of methanol was added and stirred for 90 minutes. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 31 μl (177.9 μmol) of DIPEA, 20 mg (133.4 μmol) of HOBt, 51 mg (133.4 μmol) of HBTU were added, after the system was purged with argon and allowed to mix for 60 minutes, then 70 mg (133.4 μmol) of substance (36) was added. The mixture was stirred for 24 hours in an inert atmosphere. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate system

ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1.

Таким образом, соединение (41) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 100 мг (89%).Thus, compound (41) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 100 mg (89%).

(3S,7S,25R,28R)-три-трет-бутил-33-азидо-25-бензил-28-(-3-бром-4-гидроксибензил)-12-(4-бромбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (42)(3S, 7S, 25R, 28R) -tri-tert-butyl-33-azido-25-benzyl-28 - (- 3-bromo-4-hydroxybenzyl) -12- (4-bromobenzyl) -5,13,20 , 23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (42)

К раствору 41 мг (вещества (21) в 10 мл ДХМ добавили 6 мг (55,78 мкмоль) янтарного ангидрида и 14 мкл (79,68 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивалась сутки. Далее добавили 3 мл метанола и оставили перемешиваться 90 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 18 мкл (106,25 мкмоль) DIPEA, 12 мг (79,68 мкмоль) HOBt, 30 мг (79,68 мкмоль) HBTU, после систему продули аргоном и оставили перемешиваться 60 минут, далее добавили 48 мг (79,68 мкмоль) (R)-2-амино-N-((R)-1-((3-аазидопропил)амино)-3-(3-бром-4-гидроксифенил)-1-оксопропан-2-ил)-3-фенилпропанамида. Смесь перемешивалась 24 ч в инертной атмосфере. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат

этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюент для ТСХ - EtOAc/МеОН=5:1.To a solution of 41 mg (substances (21) in 10 ml of DCM, 6 mg (55.78 μmol) of succinic anhydride and 14 μl (79.68 μmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for a day. Then 3 ml of methanol was added and left to mix for 90 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure.The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 18 μl (106.25 μmol) of DIPEA, 12 mg (79.68 μmol) of HOBt, 30 mg (79.68 μmol) of HBTU were added, after the system was purged with argon and left to mix for 60 minutes, then 48 mg (79.68 μmol) of (R) -2-amino-N - ((R) -1 - ((3-aazidopropyl) amino) -3- (3-bromo-4) was added -hydroxyphenyl) -1-oxopropan-2-yl) -3-phenylpropane . Ida mixture was stirred for 24 hours under an inert atmosphere Then the solvent was removed under reduced pressure The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent:.. The system of petroleum ether / ethyl acetate

ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1.

Таким образом, соединение (42) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 53 мг (74%).Thus, compound (42) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 53 mg (74%).

(3S,7S,25S,28S)-три-трет-бутил-33-азидо-25-бензил-12-(4-бромбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикоарбоксилат (43)(3S, 7S, 25S, 28S) -tri-tert-butyl-33-azido-25-benzyl-12- (4-bromobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26, 29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (43)

Вещество (21) 124 мг, 0.161 ммоль растворили в 10 мл DCM и систему продули аргоном. Добавили янтарный ангидрид 17 мг, 0,169 ммоль, после этого DIPEA 41 мкл 0.241 ммоль. Оставили при перемешивании на сутки. После добавили 1 мл метанола и оставили при перемешивании на 1,5 часа. Полученную реакционную смесь упарили. Сухой остаток растворили в 2 мл DCM, добавили DIPEA 34 мкл 0.199 ммоль. Систему продули аргоном. Добавили НОВТ 23 мг; 0.148 ммоль, HBTU 56 мг; 0.148 ммоль и оставили перемешиваться на 30 минут. Далее добавили растворенное в 1 мл DMF вещество (33) 60 мг, 0.199 ммоль. Реакционную смесь оставили перемешиваться на ночь. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (этилацетат/гексан от 5% до 100% этилацетата; метанол : этилацетат; от 0% до 100%). В результате выделили 98 мг целевого продукта (43), выход 39%.Substance (21) 124 mg, 0.161 mmol was dissolved in 10 ml of DCM and the system was purged with argon. Succinic anhydride was added 17 mg, 0.169 mmol, after which DIPEA 41 μl 0.241 mmol. Left with stirring for a day. After that, 1 ml of methanol was added and left under stirring for 1.5 hours. The resulting reaction mixture was evaporated. The dry residue was dissolved in 2 ml of DCM, DIPEA 34 μl 0.199 mmol was added. The system was purged with argon. Added NOVT 23 mg; 0.148 mmol, HBTU 56 mg; 0.148 mmol and left to mix for 30 minutes. Then, substance (33) 60 mg dissolved in 1 ml of DMF was added, 0.199 mmol. The reaction mixture was allowed to stir overnight. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (ethyl acetate / hexane from 5% to 100% ethyl acetate; methanol: ethyl acetate; from 0% to 100%). As a result, 98 mg of the expected product (43) was isolated, yield 39%.

(3S,7S,25S,28S)-три-трет-бутил 33-азидо-25,28-дибензил-12-(-4-хлорбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (44)(3S, 7S, 25S, 28S) -tri-tert-butyl 33-azido-25,28-dibenzyl-12 - (- 4-chlorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4, 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (44)

К раствору 70 мг (96,63 мкмоль) вещества (20) в 10 мл ДМФА добавили 72 мг (144,94 мкмоль) вещества (27), 22 мг (144,94 мкмоль) HOBt, 55 мг (144,94 мкмоль) HBTU, 34 мкл (193,26 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат

этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюент для ТСХ - EtOAc/MeOH=5:1.To a solution of 70 mg (96.63 μmol) of substance (20) in 10 ml of DMF was added 72 mg (144.94 μmol) of substance (27), 22 mg (144.94 μmol) HOBt, 55 mg (144.94 μmol) HBTU, 34 μl (193.26 μmol) DIPEA. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate system

ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1.

Таким образом, соединение (44) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 59 мг (51%)Thus, compound (44) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 59 mg (51%)

(3S,7S,25S,28S)-три-трет-бутил 33-азидо-25-бензил-12-(-4-хлорбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (45)(3S, 7S, 25S, 28S) -tri-tert-butyl 33-azido-25-benzyl-12 - (- 4-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26, 29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (45)

К раствору 56 мг (77,88 мкмоль) соединения (20) в 10 мл ДХМ добавили 8 мг (81,77 мкмоль) янтарного ангидрида и 27 мкл (155,76 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na2SO4 и удалили растворитель при пониженном давлении. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 58 мг (110,6 мкмоль) вещества (33), 17 мг (110,6 мкмоль) HOBt, 42 мг (110,6 мкмоль) HBTU, 26 мкл (147,6 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - AtOAc/МеОН=5:1.To a solution of 56 mg (77.88 μmol) of compound (20) in 10 ml of DCM was added 8 mg (81.77 μmol) of succinic anhydride and 27 μl (155.76 μmol) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic layer was dried over Na2SO4 and the solvent was removed under reduced pressure. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 58 mg (110.6 μmol) of substance (33), 17 mg (110.6 μmol) of HOBt, 42 mg (110.6 μmol) of HBTU, 26 μl (147.6 μmol) were added. DIPEA. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was AtOAc / MeOH = 5: 1.

Таким образом, соединение (45) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 65 мг (69%).Thus, compound (45) was isolated as a colorless oily substance; the yield was 65 mg (69%).

(3S,7S,25R,28R)-три-трет-бутил 33-азидо-25-бензил-12-(-4-хлорбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (46)(3S, 7S, 25R, 28R) -tri-tert-butyl 33-azido-25-benzyl-12 - (- 4-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26, 29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (46)

К раствору 62 мг (85,54 мкмоль) соединения (20) в 10 мл ДХМ добавили 9 мг (89,82 мкмоль) янтарного ангидрида и 30 мкл (171,08 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и удалили растворитель при пониженном давлении. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 50 мг (122,1 мкмоль) соединения (36), 19 мг (122,1 мкмоль) HOBt, 47 мг (122,1 мкмоль) HBTU, 28 мкл (162,8 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюент для ТСХ - EtOAc/МеОН=5:1.To a solution of 62 mg (85.54 μmol) of compound (20) in 10 ml of DCM was added 9 mg (89.82 μmol) of succinic anhydride and 30 μl (171.08 μmol) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and the solvent was removed under reduced pressure. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 50 mg (122.1 μmol) of compound (36), 19 mg (122.1 μmol) of HOBt, 47 mg (122.1 μmol) of HBTU, 28 μl (162.8 μmol) were added. DIPEA. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1.

Таким образом, соединение (46) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 67 мг (64%).Thus, compound (46) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 67 mg (64%).

(3S,7S,25R,28R)-три-трет-бутил 33-азидо-25,28-дибензил-12-(-4-хлорбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (47)(3S, 7S, 25R, 28R) -tri-tert-butyl 33-azido-25,28-dibenzyl-12 - (- 4-chlorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4, 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (47)

К раствору 47 мг (67,72 мкмоль) соединения (20) в 10 мл ДХМ добавили 7 мг (71,10 мкмоль) янтарного ангидрида и 27 мкл (155,76 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и удалили растворитель при пониженном давлении. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 50 мг (96,17 мкмоль) соединение (30), 15 мг (96,17 мкмоль) HOBt, 37 мг (96,17 мкмоль) HBTU, 23 мкл (128,35 мкмоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюент для ТСХ - EtOAc/МеОН=5:1.To a solution of 47 mg (67.72 μmol) of compound (20) in 10 ml of DCM was added 7 mg (71.10 μmol) of succinic anhydride and 27 μl (155.76 μmol) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and the solvent was removed under reduced pressure. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 50 mg (96.17 μmol) of compound (30), 15 mg (96.17 μmol) of HOBt, 37 mg (96.17 μmol) of HBTU, 23 μl (128.35 μmol) were added. DIPEA. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1.

Таким образом, соединение (47) было выделено в виде бесцветного маслянистого вещества, выход составил 35 мг (34%)Thus, compound (47) was isolated as a colorless oily substance, the yield was 35 mg (34%)

(3S,7S,25S,28S)-три-трет-бутил 33-азидо-25,28-дибензил-12-(3-хлорбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (48)(3S, 7S, 25S, 28S) -tri-tert-butyl 33-azido-25,28-dibenzyl-12- (3-chlorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6 12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (48)

К раствору 88 84 мг (0,069 ммоль) соединения (22) в 10 мл ДХМ добавили 7 мг (0,073 ммоль) янтарного ангидрида и 18 мкл (0,103) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и упарили. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 72 мг (0,141 ммоль) соединения (27), 16 мг (0,118 ммоль) HOBt, 72 мг (0,177 ммоль) HBTU, 24 мкл (0,141 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - EtOAc/MeOH=5:1. В результате было выделено 76 мг (0,063 ммоль) целевого продукта, выход 92%.To a solution of 88 84 mg (0.069 mmol) of compound (22) in 10 ml of DCM was added 7 mg (0.073 mmol) of succinic anhydride and 18 μl (0.103) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 72 mg (0.141 mmol) of compound (27), 16 mg (0.118 mmol) of HOBt, 72 mg (0.177 mmol) of HBTU, 24 μl (0.141 mmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1. As a result, 76 mg (0.063 mmol) of the target product were isolated, yield 92%.

Таким образом, соединение (48) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 76 мг, 0,063 ммоль. (92%)Thus, compound (48) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 76 mg, 0.063 mmol. (92%)

(3S,2S,28S)-три-трет-бутил-33-азидо-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикоарбоксилат (49)(3S, 2S, 28S) -tri-tert-butyl-33-azido-25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29- hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (49)

Соединение (22) (160 мг; 0.28 ммоль) растворили в 10 мл DCM и систему продули аргоном. Добавили янтарный ангидрид (37 мг; 0.376), после этого DIPEA (54 мкл, 0.315 ммоль). Оставили при перемешивании на сутки. После добавили 1 мл метанола и оставили при перемешивании на 1,5 часа. Полученную реакционную смесь упарили. Сухой остаток растворили в 2 мл DCM, добавили DIPEA (36 мкл 0.210 ммоль). Систему продули аргоном. Добавили НОВТ (24 мг, 0.158 ммоль), HBTU (59 мг 0.158 ммоль) и оставили перемешиваться на 30 минут. Далее добавили растворенное в 500 мкл DMF соединение (33) (83 мг, 0.158 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться на ночь. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (этилацетат/гексан от 5% до 100% этилацетата; метанол: этилацетат; от 0% до 100%).Compound (22) (160 mg; 0.28 mmol) was dissolved in 10 ml of DCM and the system was purged with argon. Succinic anhydride (37 mg; 0.376) was added, followed by DIPEA (54 μl, 0.315 mmol). Left with stirring for a day. After that, 1 ml of methanol was added and left under stirring for 1.5 hours. The resulting reaction mixture was evaporated. The dry residue was dissolved in 2 ml of DCM, DIPEA (36 μl 0.210 mmol) was added. The system was purged with argon. HOBT (24 mg, 0.158 mmol), HBTU (59 mg 0.158 mmol) were added and allowed to mix for 30 minutes. Then, compound (33) (83 mg, 0.158 mmol) dissolved in 500 μl of DMF was added. The reaction mixture was allowed to stir overnight. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (ethyl acetate / hexane from 5% to 100% ethyl acetate; methanol: ethyl acetate; from 0% to 100%).

Таким образом, соединение (49) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 109 мг.(32%).Thus, compound (49) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 109 mg. (32%).

(3S,7S,2R,28R)-три-трет-бутил-33-азидо-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикоарбоксилат (50) (3S, 7S, 2R, 28R) -tri-tert-butyl-33-azido-25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6, 12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (50)

Соединение (22) (62 мг; 0.086 ммоль) растворили в 10 мл DCM и систему продули аргоном. Добавили янтарный ангидрид (90 мг; 0.089 ммоль), после этого DIPEA (22 мкл, 0.129 ммоль). Оставили при перемешивании на сутки. После добавили 1 мл метанола и оставили при перемешивании на 1,5 часа. Полученную реакционную смесь упарили. Сухой остаток растворили в 2 мл DCM, добавили DIPEA (29 мкл 0.145 ммоль). Систему продули аргоном. Добавили НОВТ (20 мг, 0.174 ммоль), HBTU (48 мг 0.174 ммоль) и оставили перемешиваться на 30 минут. Далее добавили растворенное в 500 мкл DMF соединение (30) (64 мг, 0.127 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться на ночь. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (этилацетат/гексан от 5% до 100% этилацетата; метанол: этилацетат; от 0% до 100%).Compound (22) (62 mg; 0.086 mmol) was dissolved in 10 ml of DCM and the system was purged with argon. Succinic anhydride (90 mg; 0.089 mmol) was added, followed by DIPEA (22 μl, 0.129 mmol). Left with stirring for a day. After that, 1 ml of methanol was added and left under stirring for 1.5 hours. The resulting reaction mixture was evaporated. The dry residue was dissolved in 2 ml of DCM, DIPEA (29 μl 0.145 mmol) was added. The system was purged with argon. HOBT (20 mg, 0.174 mmol), HBTU (48 mg 0.174 mmol) were added and allowed to mix for 30 minutes. Then, compound (30) dissolved in 500 μl of DMF (64 mg, 0.127 mmol) was added. The reaction mixture was allowed to stir overnight. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (ethyl acetate / hexane from 5% to 100% ethyl acetate; methanol: ethyl acetate; from 0% to 100%).

Таким образом, соединение (50) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 84 мг.(82%).Thus, compound (50) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 84 mg. (82%).

(3S,7S,2R,28R)-три-трет-бутил-33-азидо-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикоарбоксилат (51)(3S, 7S, 2R, 28R) -tri-tert-butyl-33-azido-25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26, 29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatritriacontane-1,3,7-tricarboxylate (51)

Соединение (22) (62 мг; 0.086 ммоль) растворили в 10 мл DCM и систему продули аргоном. Добавили янтарный ангидрид (90 мг; 0.091), после этого DIPEA (22 мкл, 0.129 ммоль). Оставили при перемешивании на сутки. После добавили 1 мл метанола и оставили при перемешивании на 1,5 часа. Полученную реакционную смесь упарили. Сухой остаток растворили в 2 мл DCM, добавили DIPEA (29 мкл 0.172 ммоль). Систему продули аргоном. Добавили НОВТ (20 мг, 0.158 ммоль), HBTU (48 мг 0.158 ммоль) и оставили перемешиваться на 30 минут. Далее добавили растворенное в 500 мкл DMF соединение (40) (53 мг, 0.158 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться на ночь. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (этилацетат/гексан от 5% до 100% этилацетата; метанол: этилацетат; от 0% до 100%).Compound (22) (62 mg; 0.086 mmol) was dissolved in 10 ml of DCM and the system was purged with argon. Succinic anhydride (90 mg; 0.091) was added, followed by DIPEA (22 μl, 0.129 mmol). Left with stirring for a day. After that, 1 ml of methanol was added and left under stirring for 1.5 hours. The resulting reaction mixture was evaporated. The dry residue was dissolved in 2 ml of DCM, DIPEA (29 μl 0.172 mmol) was added. The system was purged with argon. HOBT (20 mg, 0.158 mmol), HBTU (48 mg 0.158 mmol) were added and allowed to mix for 30 minutes. Then, compound (40) (53 mg, 0.158 mmol) dissolved in 500 μl of DMF was added. The reaction mixture was allowed to stir overnight. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (ethyl acetate / hexane from 5% to 100% ethyl acetate; methanol: ethyl acetate; from 0% to 100%).

Таким образом, соединение (51) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 80 мг (76%).Thus, compound (51) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 80 mg (76%).

(3S,7S,2R,28R)-три-трет-бутил-33-азидо-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-28-(3-бром-4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриацонат-1,3,7-трикоарбоксилат (52)(3S, 7S, 2R, 28R) -tri-tert-butyl-33-azido-25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -28- (3-bromo-4-hydroxybenzyl) -5,13,20, 23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triaconate-1,3,7-tricoarboxylate (52)

Соединение (22) (52 мг; 0.071 ммоль) растворили в 10 мл DCM и систему продули аргоном. Добавили янтарный ангидрид (75 мг; 0.074 ммоль) после этого DIPEA (18 мкл, 0.106 ммоль). Оставили при перемешивании на сутки. После добавили 1 мл метанола и оставили при перемешивании на 1,5 часа. Полученную реакционную смесь упарили. Сухой остаток растворили в 2 мл DCM, добавили DIPEA (24 мкл 0.145 ммоль). Систему продули аргоном. Добавили НОВТ (17 мг, 0.109 ммоль), HBTU (41 мг 0.109 ммоль) и оставили перемешиваться на 30 минут. Далее добавили растворенный в 500 мкл DMF (R)-2-амино-N-((R)-1-((3-азидопропил)амино-3-(3-бром-4-гидроксифени)-1-оксопропан-2-ил)-3-фенилпропанамид (53 мг, 0.109 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться на ночь. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (этилацетат/гексан от 5% до 100% этилацетата; метанол: этилацетат; от 0% до 100%).Compound (22) (52 mg; 0.071 mmol) was dissolved in 10 ml of DCM and the system was purged with argon. Succinic anhydride (75 mg; 0.074 mmol) was added after this DIPEA (18 μl, 0.106 mmol). Left with stirring for a day. After that, 1 ml of methanol was added and left under stirring for 1.5 hours. The resulting reaction mixture was evaporated. The dry residue was dissolved in 2 ml of DCM, DIPEA (24 μl 0.145 mmol) was added. The system was purged with argon. HOBT (17 mg, 0.109 mmol), HBTU (41 mg 0.109 mmol) were added and allowed to mix for 30 minutes. Next, DMF (R) -2-amino-N - ((R) -1 - ((3-azidopropyl) amino-3- (3-bromo-4-hydroxypheny) -1-oxopropan-2- dissolved in 500 μl was added il) -3-phenylpropanamide (53 mg, 0.109 mmol). The reaction mixture was allowed to stir overnight. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was carried out by column chromatography (ethyl acetate / hexane from 5% to 100% ethyl acetate; methanol: ethyl acetate; from 0 % to 100%).

Таким образом, соединение (52) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 78 мг. (84%).Thus, compound (52) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 78 mg. (84%).

(3S,7S,25S,28S)-три-трет-бутил 33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-хлор-2-фторбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (53)(3S, 7S, 25S, 28S) -tri-tert-butyl 33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-chloro-2-fluorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo -4.6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (53)

К раствору 86 мг (0,116 ммоль) соединения (23) в 10 мл ДХМ добавили 13 мг (0,127 ммоль) янтарного ангидрида и 22 мкл (0,127) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и упарили. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 60 мг (0,152 ммоль) вещества (27), 21 мг (0,152 ммоль) HOBt, 58 мг (0,152 ммоль) HBTU, 27 мкл (0,152 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - EtOAc/MeOH=5:1. В результате было выделено 70 мг (0,057 ммоль) целевого продукта (53), выход 49%.To a solution of 86 mg (0.116 mmol) of compound (23) in 10 ml of DCM was added 13 mg (0.127 mmol) of succinic anhydride and 22 μl (0.127) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 60 mg (0.152 mmol) of substance (27), 21 mg (0.152 mmol) of HOBt, 58 mg (0.152 mmol) of HBTU, 27 μl (0.152 mmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1. As a result, 70 mg (0.057 mmol) of the desired product (53) were isolated, 49% yield.

(3S,7S,25S,28S)-три-трет-бутил 33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-хлор-3-фторбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (54)(3S, 7S, 25S, 28S) -tri-tert-butyl 33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-chloro-3-fluorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo -4.6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (54)

К раствору 130 мг (0,175 ммоль) соединения (24) в 10 мл ДХМ добавили 18 мг (0,184 ммоль) янтарного ангидрида и 46 мкл (0,265 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и упарили. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 98 мг (0,192 ммоль) вещества (27), 22 мг (0,160 ммоль) HOBt, 91 мг (0,240 ммоль) HBTU, 33 мкл (0,192 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - EtOAc/MeOH=5:1. В результате было выделено 65 мг (0,053 ммоль) целевого продукта (54), выход 30%.To a solution of 130 mg (0.175 mmol) of compound (24) in 10 ml of DCM was added 18 mg (0.184 mmol) of succinic anhydride and 46 μl (0.265 mmol) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 98 mg (0.192 mmol) of substance (27), 22 mg (0.160 mmol) of HOBt, 91 mg (0.240 mmol) of HBTU, 33 μl (0.192 mmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1. As a result, 65 mg (0.053 mmol) of the desired product (54) were isolated, yield 30%.

(3S,7S,25R,28R)-три-трет-бутил 33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-хлорбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (55)(3S, 7S, 25R, 28R) -tri-tert-butyl 33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-chlorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6 12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (55)

К раствору 156 мг (0,210 ммоль) соединения (24) в 10 мл ДХМ добавили 22 мг (0,221 ммоль) янтарного ангидрида и 55 мкл (0,318 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и упарили. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 106 мг (0,208 ммоль) соединения (30), 48 мг (0,311 ммоль) HOBt, 118 мг (0,311 ммоль) HBTU, 71 мкл (0,311 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% AtOAc в течение 15 минут, 100% AtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - EtOAc/МеОН=5:1. В результате было выделено 217 мг (0,178 ммоль) целевого продукта (55), выход 85%.To a solution of 156 mg (0.210 mmol) of compound (24) in 10 ml of DCM was added 22 mg (0.221 mmol) of succinic anhydride and 55 μl (0.318 mmol) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 106 mg (0.208 mmol) of compound (30), 48 mg (0.311 mmol) of HOBt, 118 mg (0.311 mmol) of HBTU, 71 μl (0.311 mmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated using column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol system, 5% EtOAc to 100% AtOAc for 15 minutes, 100% AtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1. As a result, 217 mg (0.178 mmol) of the expected product (55) were isolated, yield 85%.

(3S,7S,25S,28S)-три-трет-бутил 33-азидо-25-бензил-12-(4-хлор-3-фторбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (56)(3S, 7S, 25S, 28S) -tri-tert-butyl 33-azido-25-benzyl-12- (4-chloro-3-fluorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23 26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatriacontane-1,3,7-tricarboxylate (56)

К раствору 156 мг (0,210 ммоль) соединения (24) в 10 мл ДХМ добавили 22 мг (0,221 ммоль) янтарного ангидрида и 55 мкл (0,318 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали сутки. Далее добавили 5 мл метанола и перемешивали 30 минут. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и растворили сухой остаток в 20 мл ДХМ. Раствор промыли трижды 10 мл 0,1 М раствора HCl. Органическую фракцию высушили над Na₂SO₄ и упарили. Сухой остаток растворили в 10 мл ДМФА и добавили 63 мг (0,120 ммоль) соединения (33), 14 мг (0,100 ммоль) HOBt, 57 мг (0,150 ммоль) HBTU, 21 мкл (0,120 ммоль) DIPEA. Смесь перемешивали 24 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении. Продукт выделяли с помощью метода колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут). Элюента для ТСХ - EtOAc/МеОН=5:1. В результате было выделено 217 мг (0,178 ммоль) целевого продукта (56), выход 85%.To a solution of 156 mg (0.210 mmol) of compound (24) in 10 ml of DCM was added 22 mg (0.221 mmol) of succinic anhydride and 55 μl (0.318 mmol) of DIPEA. The mixture was stirred for a day. Next, 5 ml of methanol was added and stirred for 30 minutes. The solvent was then removed under reduced pressure and the dry residue was dissolved in 20 ml of DCM. The solution was washed three times with 10 ml of a 0.1 M HCl solution. The organic fraction was dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated. The dry residue was dissolved in 10 ml of DMF and 63 mg (0.120 mmol) of compound (33), 14 mg (0.100 mmol) of HOBt, 57 mg (0.150 mmol) of HBTU, 21 μl (0.120 mmol) of DIPEA were added. The mixture was stirred for 24 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure. The product was isolated by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol, 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, 0% methanol to 100% methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes). The eluent for TLC was EtOAc / MeOH = 5: 1. As a result, 217 mg (0.178 mmol) of the expected product (56) were isolated, yield 85%.

(3S,7S,2R,28R)-три-трет-бутил-33-азидо-25-бензил-12-(4-хлор-3-фтор-бензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикоарбоксилат (57)(3S, 7S, 2R, 28R) -tri-tert-butyl-33-azido-25-benzyl-12- (4-chloro-3-fluoro-benzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5.13, 20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (57)

Соединение (24) (159 мг; 0.21 ммоль) растворили в 10 мл DCM и систему продули аргоном. Добавили янтарный ангидрид (22 мг; 0.22 ммоль), после этого DIPEA (54 мкл, 0.315 ммоль). Оставили при перемешивании на сутки. После добавили 1 мл метанола и оставили при перемешивании на 1,5 часа. Полученную реакционную смесь упарили. Сухой остаток растворили в 2 мл DCM, добавили DIPEA (26 мкл, 0.152 ммоль). Систему продули аргоном. Добавили HOBT (17 мг 0.114 ммоль), HBTU (43 мг, 0.114 ммоль) и оставили перемешиваться на 30 минут. Далее добавили растворенное в 500 мкл соединение (35) (60 мг, 0.114 ммоль). Реакционную смесь оставили перемешиваться на ночь. Растворитель упарили при пониженном давлении. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (Puriflash 50μ 4g, элюент: система петролейный эфир/этилацетат => этилацетат/метанол, от 5% EtOAc до 100% EtOAc в течение 15 минут, 100% EtOAc в течение 1 минуты, от 0% метанола до 100% метанола в течение 5 минут, 100% метанола в течение 5 минут).Compound (24) (159 mg; 0.21 mmol) was dissolved in 10 ml of DCM and the system was purged with argon. Succinic anhydride (22 mg; 0.22 mmol) was added, followed by DIPEA (54 μl, 0.315 mmol). Left with stirring for a day. After that, 1 ml of methanol was added and left under stirring for 1.5 hours. The resulting reaction mixture was evaporated. The dry residue was dissolved in 2 ml of DCM, DIPEA (26 μl, 0.152 mmol) was added. The system was purged with argon. HOBT (17 mg 0.114 mmol), HBTU (43 mg, 0.114 mmol) were added and allowed to mix for 30 minutes. Then, compound (35) (60 mg, 0.114 mmol) dissolved in 500 μl was added. The reaction mixture was allowed to stir overnight. The solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed by column chromatography (Puriflash 50μ 4g, eluent: petroleum ether / ethyl acetate => ethyl acetate / methanol system, from 5% EtOAc to 100% EtOAc for 15 minutes, 100% EtOAc for 1 minute, from 0% methanol to 100 % methanol for 5 minutes, 100% methanol for 5 minutes).

Таким образом, соединение (57) было выделено в виде желтоватого маслянистого вещества, выход составил 93 мг.(36%).Thus, compound (57) was isolated as a yellowish oily substance, the yield was 93 mg (36%).

(3S,7S,23S,26S)-31-азидо-12,23,26-трибензил-5,13,18,21,24,27-гексаоксо-4,6,12,17,22,25,28-гептаазагентриаконтан 1,3,7-трикарбоксилат (58)(3S, 7S, 23S, 26S) -31-azido-12,23,26-tribenzyl-5,13,18,21,24,27-hexaoxo-4,6,12,17,22,25,28- heptaazagentriacontane 1,3,7-tricarboxylate (58)

34 мг соединения (37) растворили в 3 мл ДХМ и добавили 335 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 13 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и трижды переупарили с ДХМ. Продукт осадили эфиром. В результате было выделено 24 мг целевого продукта, выход 83%.34 mg of compound (37) was dissolved in 3 ml of DCM and 335 μl of trifluoroacetic acid was added. The mixture was stirred for 13 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and three times re-evaporated with DCM. The product was precipitated with ether. As a result, 24 mg of the expected product was isolated, yield 83%.

Спектр ЯМР 1Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.):1H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

8.25-8.27 (м, 1Н, NH), 8.15 (т, J=7.8 Гц, 1Н, NH), 7.96-7.97 (м, 1Н, NH), 7.61-7.62 (м, 1Н, NH), 7.16-7.32 (м, 15Н, Ar), 6.33 (д, J=8.7 Гц, 1Н, CH2Ar), 6.28 (д, J=8.4 Гц, 1Н, CH2Ar), 4.48 (д, J=13.6 Гц, 2Н, СН), 4.37-4.39 (м, 1Н, СН), 4.31 (м, 1Н, CH2), 4.04-4.09 (м, 2Н, СН), 4.00-4.03 (м, 1Н, CH2), 3.16-3.22 (м, 4Н, CH2), 3.02-3.12 (м, 7Н, CH2), 2.18-2.36 (м, 7Н, CH2), 1.89-1.91 (м, 1Н, CH2), 1.56-1.72 (м, 6Н, CH2), 1.44-1.49 (м, 3Н, CH2), 1.16-1.22 (м, 3Н, CH2)8.25-8.27 (m, 1H, NH), 8.15 (t, J = 7.8 Hz, 1H, NH), 7.96-7.97 (m, 1H, NH), 7.61-7.62 (m, 1H, NH), 7.16-7.32 (m, 15H, Ar), 6.33 (d, J = 8.7 Hz, 1H, CH2Ar), 6.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H, CH2Ar), 4.48 (d, J = 13.6 Hz, 2H, CH), 4.37-4.39 (m, 1H, CH), 4.31 (m, 1H, CH2), 4.04-4.09 (m, 2H, CH), 4.00-4.03 (m, 1H, CH2), 3.16-3.22 (m, 4H, CH2), 3.02-3.12 (m, 7H, CH2), 2.18-2.36 (m, 7H, CH2), 1.89-1.91 (m, 1H, CH2), 1.56-1.72 (m, 6H, CH2), 1.44-1.49 (m, 3H, CH2), 1.16-1.22 (m, 3H, CH2)

ИК-спектр (ZnSe, см-1): 3305.87 (NH), 3086 (С-Нвал), 2959.79 (Ar), 2098.17 (N3), 1702.84 (C(O)), 1641.61 (С(O) (мочевина)), 1536.51 (С(O)).IR spectrum (ZnSe, cm -1): 3305.87 (NH), 3086 (C-Nval), 2959.79 (Ar), 2098.17 (N3), 1702.84 (C (O)), 1641.61 (C (O) (urea) ), 1536.51 (C (O)).

ESI-LCMS для C48H62N10O12: m/z рассчитано для [М+Н]+: 971.45, найдено: 971.40ESI-LCMS for C48H62N10O12: m / z calculated for [M + H] +: 971.45, found: 971.40

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-12,25,28-трибензил-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (59)(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-12,25,28-tribenzyl-5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30- heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (59)

40 мг (0,035 ммоль) соединения (38) растворили в 2.7 мл ДХМ и добавили 300 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и трижды переупарили с ДХМ. Продукт осадили эфиром. В результате было выделено 32 мг (0,032 ммоль) целевого продукта, выход 91%.40 mg (0.035 mmol) of compound (38) was dissolved in 2.7 ml of DCM and 300 μl of trifluoroacetic acid was added. The mixture was stirred for 16 hours. Then, the solvent was removed under reduced pressure and three times re-evaporated with DCM. The product was precipitated with ether. As a result, 32 mg (0.032 mmol) of the target product were isolated, yield 91%.

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.43 (уш.с, 3Н, СООН), 8.30 (д, 1Н, J=7.2 Гц, C(O)NH), 8.17 (м, 1Н, C(O)NH), 7.93 (м, 1Н, C(O)NH), 7.58 (м, 1Н, C(O)NH), 7.40-7.10 (м, 16Н, C(O)NH + Ar), 6.30 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.54-4.43 (м, 2Н, ArCH₂), 4.45-4.22 (м, 2Н, СН (Phe)), 4.13-3.96 (м, 2Н, СН (Glu, Lys)), 4.08 (м, 2Н, СН, СН), 3.26-2.83 (м, 11Н, CH₂), 2.81-2.57 (м, 2Н, CH₂), 2.41-2.08 (м, 7Н, CH₂), 1.89 (м, 1Н, CH₂), 1.70 (м, 1Н, CH₂), 1.65-1.33 (м, 8Н, CH₂), 1.33-1.11 (м, 5Н, CH₂)12.43 (br.s, 3H, COOH), 8.30 (d, 1H, J = 7.2 Hz, C (O) NH), 8.17 (m, 1H, C (O) NH), 7.93 (m, 1H, C ( O) NH), 7.58 (m, 1H, C (O) NH), 7.40-7.10 (m, 16H, C (O) NH + Ar), 6.30 (m, 2H, NH (urea)), 4.54-4.43 (m, 2H, ArCH ₂ ), 4.45-4.22 (m, 2H, CH (Phe)), 4.13-3.96 (m, 2H, CH (Glu, Lys)), 4.08 (m, 2H, CH, CH), 3.26-2.83 (m, 11H, CH ₂ ), 2.81-2.57 (m, 2H, CH ₂ ), 2.41-2.08 (m, 7H, CH ₂ ), 1.89 (m, 1H, CH ₂ ), 1.70 (m, 1H, CH ₂ ), 1.65-1.33 (m, 8H, CH ₂ ), 1.33-1.11 (m, 5H, CH ₂ )

ИК спектр 3316 (NH), 3086 (С-Н_вал), 2935 (Ar), 2102 (N₃), 1729 (C(O)), 1644 (C(O) (мочевина)), 1551 (С(O)), 1293 (Ar)IR spectrum 3316 (NH), 3086 (CH _shaft ), 2935 (Ar), 2102 (N ₃ ), 1729 (C (O)), 1644 (C (O) (urea)), 1551 (C (O) )), 1293 (Ar)

ESI-LCMS для C₅₀H₆₆N₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [M+H]⁺ 999.49, найдено: 999.40ESI-LCMS for C ₅₀ H ₆₆ N ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 999.49, found: 999.40

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-бромобензил)-5,13,20,23,26, 29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (60)(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-bromobenzyl) -5,13,20,23,26, 29-hexaoxo-4,6,12,19, 24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (60)

К раствору 23 мг соединения (39) в 3 мл ДХМ добавили 335 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром. В результате было выделено 17 мг целевого соединения, выход 85%.335 μl of trifluoroacetic acid was added to a solution of 23 mg of compound (39) in 3 ml of DCM. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether. As a result, 17 mg of the target compound was isolated, yield 85%.

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.43 (уш. с, 2Н, СООН), 8.30-8.38 (м, 1Н, CH(Ph)), 8.08-8.19 (м, 1Н, CH(Ph)), 7.53 (д, J=8.1 Гц, 1Н, CH(Ph)), 7.48 (д, J=7.7 Гц, 1Н, CH(Ph)), 7.19-7.27 (м, 5Н, CH(Ph)), 7.07-7.16 (М, 5Н, CH(Ph)), 6.27-6.34 (м, 2Н, NH), 4.49 (с, 1Н, CH₂(Bz)), 4.43 (с, 1Н, CH₂(Bz)), 4.37-4.39 (м, 1Н, СН), 4.28-4.39 (м, 2Н, СН), 4.01-4.09 (м, 2Н, СН), 3.34-3.39 (м, 6Н, CH₂), 3.22-3.26 (м, 2Н, CH₂), 3.13-320 (м, 2Н, CH₂), 2.88-3.09 (м, 6Н, CH₂), 2.72-2.79 (м, 1Н, CH₂), 2.52-2.67 (м, 1Н, CH₂), 2.28-2.35 (м, 2Н, CH₂), 2.18-2.25 (м, 4Н, CH₂), 1.88-1.91 (м, 1Н, CH₂), 1.66-1.76 (м, 1Н, CH₂), 1.54-1.61 (м, 3Н, CH₂), 1.36-1.49 (м, 6Н, CH₂), 1.14-1.30 (м, 4Н, CH₂)12.43 (br.s, 2H, COOH), 8.30-8.38 (m, 1H, CH (Ph)), 8.08-8.19 (m, 1H, CH (Ph)), 7.53 (d, J = 8.1 Hz, 1H, CH (Ph)), 7.48 (d, J = 7.7 Hz, 1H, CH (Ph)), 7.19-7.27 (m, 5H, CH (Ph)), 7.07-7.16 (M, 5H, CH (Ph)) , 6.27-6.34 (m, 2H, NH), 4.49 (s, 1H, CH ₂ (Bz)), 4.43 (s, 1H, CH ₂ (Bz)), 4.37-4.39 (m, 1H, CH), 4.28 -4.39 (m, 2Н, СН), 4.01-4.09 (m, 2Н, СН), 3.34-3.39 (m, 6Н, CH ₂ ), 3.22-3.26 (m, 2Н, CH ₂ ), 3.13-320 (m , 2H, CH ₂ ), 2.88-3.09 (m, 6H, CH ₂ ), 2.72-2.79 (m, 1H, CH ₂ ), 2.52-2.67 (m, 1H, CH ₂ ), 2.28-2.35 (m, 2H , CH ₂ ), 2.18-2.25 (m, 4H, CH ₂ ), 1.88-1.91 (m, 1H, CH ₂ ), 1.66-1.76 (m, 1H, CH ₂ ), 1.54-1.61 (m, 3H, CH ₂ ), 1.36-1.49 (m, 6H, CH ₂ ), 1.14-1.30 (m, 4H, CH ₂ )

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 1639 (NHC(O)NH), 2097 (N₃)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 1639 (NHC (O) NH), 2097 (N ₃ )

ESI-LCMS для C₅₀H₆₅BrN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [M+H]⁺: 1079.42, найдено: 1079.35.ESI-LCMS for C ₅₀ H ₆₅ BrN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ : 1079.42, found: 1079.35.

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-бромбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (61)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-bromobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19, 24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (61)

В 4 мл 10% (по объему) раствора трифторуксусной кислоты в DCM растворили 60 мг (0.048 ммоль) соединения (40) и перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Растворитель упарили при пониженном давлении. Добавили 4 мл DCM с последующим упариванием для удаления трифторуксусной кислоты, процедуру повторили 5 раз. К полученному маслянистому осадку добавили 5 мл диэтилового эфира, в результате чего выделился белый твердый продукт. Эфир декантировали, процедуру повторили еще 2 раза. Масса полученного вещества 40 мг (0,037 ммоль), выход 77%.60 mg (0.048 mmol) of compound (40) were dissolved in 4 ml of a 10% (by volume) solution of trifluoroacetic acid in DCM and stirred for 16 hours at room temperature. The solvent was evaporated under reduced pressure. Added 4 ml of DCM, followed by evaporation to remove trifluoroacetic acid, the procedure was repeated 5 times. 5 ml of diethyl ether was added to the resulting oily precipitate, whereupon a white solid was isolated. The ether was decanted, the procedure was repeated 2 more times. The mass of the obtained substance is 40 mg (0.037 mmol), yield 77%.

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.36 (уш.с, 3Н, СООН), 8.30 (дд, 1Н, C(O)NH), 8.17 (дд, 1Н, C(O)NH), 7.79 (м, 1Н, C(O)NH), 7.59-7.47 (м, 3Н, C(O)NH + ArH), 7.21-7.09 (м, 14Н, ArH), 6.29 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.49 (с, 1Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.42 (с, 1Н, PhCH ₂ NC(О)), 4.07 (м, 1Н, СН, СН), 4.42 (с, 2Н, CH₂Ar), 4.39-4.27 (м, 2Н, CH₂Ar), 3.22-2.88 (м, 2Н, CH₂), 2.76-2.58 (м, 2Н, CH₂), 2.31-2.21 (м, 2Н, CH₂), 1.89 (с, 1Н, CH₂), 1.22 (м, 18Н, CH ₂CH)12.36 (br.s, 3H, COOH), 8.30 (dd, 1H, C (O) NH), 8.17 (dd, 1H, C (O) NH), 7.79 (m, 1H, C (O) NH), 7.59-7.47 (m, 3H, C (O) NH + ArH), 7.21-7.09 (m, 14H, ArH), 6.29 (m, 2H, NH (urea)), 4.49 (s, 1H, PhC H ₂ NC (O)), 4.42 (s, 1H, PhC H ₂ NC (O)), 4.07 (m, 1H, CH, CH), 4.42 (s, 2H, CH ₂ Ar), 4.39-4.27 (m, 2H, CH ₂ Ar), 3.22-2.88 (m, 2H, CH ₂ ), 2.76-2.58 (m, 2H, CH ₂ ), 2.31-2.21 (m, 2H, CH ₂ ), 1.89 (s, 1H, CH ₂ ) , 1.22 (m, 18H, C H ₂ CH)

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (100 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

207.79 (СООН), 174.55 (C(O)NR₂), 174.13 (С(О)NR₂), 173.10 (PhCH ₂ NC(O)), 172.48 (PhCH ₂ NC(O)), 171.97 (PhCH ₂ NC(O)), 171.49 (PhCH ₂ NC(O)), 157.66 (NHC(O)NH), 138.37 (Ar), 131.99 (Ar), 131.94 (Ar), 131.60 (Ar), 130.11 (Ar), 129.86 (Ar), 129.57 (Ar), 129.41 (Ar), 129.40 (Ar), 128.57 (Ar), 128.46 (Ar), 126.70 (Ar), 52.06 (CH), 50.95 (СН), 48.63 (CH₂NR₂), 48.55 (CH₂Ar), 47.40 (CH₂Ar), 38.10 (CH₂), 37.44 (CH₂), 36.28 (CH₂), 34.37 (CH₂), 33.28 (CH₂), 33.72 (CH₂), 30.90 (CH₂), 29.11 (CH₂), 28.56 (CH₂), 28.14 (CH₂), 27.78 (CH₂), 25.12 (CH₂), 17.61 (CH₂), 15.68 (CH₂), 14,38 (CH₂).207.79 (COOH), 174.55 ( C (O) NR ₂ ), 174.13 ( C (O) NR ₂ ), 173.10 (PhC H ₂ NC (O)), 172.48 (PhC H ₂ NC (O)), 171.97 (PhC H ₂ NC (O)), 171.49 (PhC H ₂ NC (O)), 157.66 (NH C (O) NH), 138.37 (Ar), 131.99 (Ar), 131.94 (Ar), 131.60 (Ar), 130.11 (Ar), 129.86 (Ar), 129.57 (Ar), 129.41 (Ar), 129.40 (Ar), 128.57 (Ar), 128.46 (Ar), 126.70 (Ar), 52.06 (CH), 50.95 (CH), 48.63 (CH ₂ NR ₂ ), 48.55 (CH ₂ Ar), 47.40 (CH ₂ Ar), 38.10 (CH ₂ ), 37.44 (CH ₂ ), 36.28 (CH ₂ ), 34.37 (CH ₂ ), 33.28 (CH ₂ ) , 33.72 (CH ₂ ), 30.90 (CH ₂ ), 29.11 (CH ₂ ), 28.56 (CH ₂ ), 28.14 (CH ₂ ), 27.78 (CH ₂ ), 25.12 (CH ₂ ), 17.61 (CH ₂ ), 15.68 (CH ₂ ), 14.38 (CH ₂ ).

ESI-LCMS для C₆₂H₈₉BrN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [М+Н]⁺: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1078.61, найдено: 1079.30.ESI-LCMS for C ₆₂ H ₈₉ BrN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1078.61, found: 1079.30.

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25-бензил-12-(4-бромбензил)-28-(-4-гидроксибензил-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (62)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25-benzyl-12- (4-bromobenzyl) -28 - (- 4-hydroxybenzyl-5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4, 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (62)

К раствору 90 мг (71,29 мкмоль) соединения (41) в 3,6 мл ДХМ добавили 400 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром и промыли дважды по 10 мл эфира.To a solution of 90 mg (71.29 μmol) of compound (41) in 3.6 ml of DCM was added 400 μl of trifluoroacetic acid. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether and washed twice with 10 ml of ether.

Таким образом, соединение (62) было выделено в виде белого аморфного порошка, выход составил 61 мг (77%).Thus, compound (62) was isolated as a white amorphous powder, the yield was 61 mg (77%).

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.42 (уш.с, 3Н, СООН), 9.17 (уш.с, 1Н, ОН) 8.38-8.20 (м, 1Н, C(O)NH), 8.15-8.00 (м, 1Н, C(O)NH), 7.99-7.85 (м, 1Н, C(O)NH), 7.83-7.67 (м, 1Н, C(O)NH), 7.61-7.43 (м, 2Н, Ar), 7.35-7.04 (м, 9Н, Ar), 7.04-6.92 (м, 2Н, Ar), 6.40-6.20 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.53-4.39 (м, 2Н, ArCH₂), 4.37-4.23 (м, 2Н, CH) 4.17-3.95 (м, 2Н, CH), 3.28-2.55 (м, 13Н, CH₂), 2.42-2.10 (м, 9Н, CH₂), 1.98-1.82 (м, 1Н, CH₂), 1.70-1.34 (м, 8Н, CH₂), 1.32-1.10 (м, 5Н, CH₂).12.42 (br.s, 3H, COOH), 9.17 (br.s, 1H, OH) 8.38-8.20 (m, 1H, C (O) NH), 8.15-8.00 (m, 1H, C (O) NH) , 7.99-7.85 (m, 1H, C (O) NH), 7.83-7.67 (m, 1H, C (O) NH), 7.61-7.43 (m, 2H, Ar), 7.35-7.04 (m, 9H, Ar), 7.04-6.92 (m, 2H, Ar), 6.40-6.20 (m, 2H, NH (urea)), 4.53-4.39 (m, 2H, ArCH ₂ ), 4.37-4.23 (m, 2H, CH) 4.17-3.95 (m, 2H, CH), 3.28-2.55 (m, 13H, CH ₂ ), 2.42-2.10 (m, 9H, CH ₂ ), 1.98-1.82 (m, 1H, CH ₂ ), 1.70-1.34 (m, 8H, CH ₂ ), 1.32-1.10 (m, 5H, CH ₂ ).

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (100 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

174.9 (СООН), 174.6 (C(O)NH), 174.2 (C(O)NH), 172.5 (C(O)NH) 171.5 (C(O)NH), 157.7 (C(O) (мочевина)), 138.5 (Ar), 132.0 (Ar), 131.7 (Ar), 130.5 (Ar), 130.4 (Ar), 130.1 (Ar), 129.6 (Ar), 129.5 (Ar), 129.1 (Ar), 128.5 (Ar), 128.4 (Ar), 115.4 (Ar), 115.3 (Ar), 55.2 (CH), 54.8 (СН), 52.1 (CH), 48.7 (CH), 48.6 (CH), 37.2 (CH2), 36.3 (CH₂), 32.2 (CH₂), 31.1 (CH₂), 30.4 (CH₂), 29.5 (CH₂), 28.7 (CH₂), 28.2 (CH₂), 28.0 (CH₂), 22.9 (CH₂).174.9 (COOH), 174.6 (C (O) NH), 174.2 (C (O) NH), 172.5 (C (O) NH) 171.5 (C (O) NH), 157.7 (C (O) (urea)) , 138.5 (Ar), 132.0 (Ar), 131.7 (Ar), 130.5 (Ar), 130.4 (Ar), 130.1 (Ar), 129.6 (Ar), 129.5 (Ar), 129.1 (Ar), 128.5 (Ar) , 128.4 (Ar), 115.4 (Ar), 115.3 (Ar), 55.2 (CH), 54.8 (CH), 52.1 (CH), 48.7 (CH), 48.6 (CH), 37.2 (CH2), 36.3 (CH ₂ ), 32.2 (CH ₂ ), 31.1 (CH ₂ ), 30.4 (CH ₂ ), 29.5 (CH ₂ ), 28.7 (CH ₂ ), 28.2 (CH ₂ ), 28.0 (CH ₂ ), 22.9 (CH ₂ ).

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3313 (NH), 3088 (С-Н вал), 2937 (Ar), 2100 (N3), 1728 (C(O)), 1643 (C(O)), 1554 (C(O)), 1296 (Ar).IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3313 (NH), 3088 (С-Н shaft), 2937 (Ar), 2100 (N3), 1728 (C (O)), 1643 (C (O)), 1554 (C (O)), 1296 (Ar).

ESI-LCMS для C₅₀H₆₅BrN₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [М+Н]⁺: 1093.39, найдено: 1093.40.ESI-LCMS for C ₅₀ H ₆₅ BrN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ : 1093.39, found: 1093.40.

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25-бензил-28-(-3-бром-4-гидроксибензил)-12-(4-бромбензил)- -5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (63)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25-benzyl-28 - (- 3-bromo-4-hydroxybenzyl) -12- (4-bromobenzyl) - -5,13,20,23,26, 29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (63)

К раствору 49 мг (36,53 мкмоль) соединения (42) в 3,6 мл ДХМ добавили 400 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром и промыли дважды по 10 мл эфира.To a solution of 49 mg (36.53 μmol) of compound (42) in 3.6 ml of DCM was added 400 μl of trifluoroacetic acid. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether and washed twice with 10 ml of ether.

Таким образом, соединение (63) было выделено в виде белого аморфного порошка, выход составил 38 мг (88%).Thus, compound (63) was isolated as a white amorphous powder, the yield was 38 mg (88%).

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.42 (уш.с, 3Н, СООН), 9.98 (уш.с, 1Н, ОН) 8.40-8.21 (м, 1Н, C(O)NH), 8.21-8.01 (м, 1Н, C(O)NH), 8.00-7.85 (м, 1Н, C(O)NH), 7.84-7.60 (м, 1Н, C(O)NH), 7.58-7.43 (м, 2Н, Ar), 7.41-7.04 (м, 9Н, Ar), 7.04-6.95 (м, 1Н, Ar), 6.88-6.76 (м, 1Н, Ar), 6.43-6.19 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.54-4.22 (м, 4Н, ArCH₂ + СН), 4.18-3.90 (м, 2Н, СН), 3.32-2.51 (м, 13Н, CH₂), 2.42-2.09 (м, 8Н, CH₂), 1.90-1.82 (м, 1Н, CH₂), 1.77-1.35 (м, 8Н, CH₂), 1.31-1.11 (м, 5Н, CH₂).12.42 (br.s, 3H, COOH), 9.98 (br.s, 1H, OH) 8.40-8.21 (m, 1H, C (O) NH), 8.21-8.01 (m, 1H, C (O) NH) , 8.00-7.85 (m, 1Н, C (O) NH), 7.84-7.60 (m, 1Н, C (O) NH), 7.58-7.43 (m, 2Н, Ar), 7.41-7.04 (m, 9Н, Ar), 7.04-6.95 (m, 1H, Ar), 6.88-6.76 (m, 1H, Ar), 6.43-6.19 (m, 2H, NH (urea)), 4.54-4.22 (m, 4H, ArCH ₂ + CH), 4.18-3.90 (m, 2H, CH), 3.32-2.51 (m, 13H, CH ₂ ), 2.42-2.09 (m, 8H, CH ₂ ), 1.90-1.82 (m, 1H, CH ₂ ), 1.77-1.35 (m, 8H, CH ₂ ), 1.31-1.11 (m, 5H, CH ₂ ).

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (100 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

174.6 (C(O)NH), 174.2 (C(O)NH), 171.5 (C(O)NH), 157.7 (C(0) (мочевина)), 138.5 (Ar), 138.4 (Ar),133.8 (Ar), 132.0 (Ar), 131.7 (Ar), 130.6 (Ar), 130.2 (Ar), 129.6 (Ar), 129.1 (Ar), 128.4 (Ar), 54.7 (CH), 52.1 (СН), 48.7 (СН), 48.6 (СН), 36.3 (CH₂), 32.3 (CH₂), 32.2 (CH₂), 31.2 (CH₂), 31.1 (CH₂), 30.3 (CH₂), 29.5 (CH₂), 28.7 (CH₂), 28.0 (CH₂), 25.05 (CH₂).174.6 (C (O) NH), 174.2 (C (O) NH), 171.5 (C (O) NH), 157.7 (C (0) (urea)), 138.5 (Ar), 138.4 (Ar), 133.8 ( Ar), 132.0 (Ar), 131.7 (Ar), 130.6 (Ar), 130.2 (Ar), 129.6 (Ar), 129.1 (Ar), 128.4 (Ar), 54.7 (CH), 52.1 (CH), 48.7 ( CH), 48.6 (CH), 36.3 (CH ₂ ), 32.3 (CH ₂ ), 32.2 (CH ₂ ), 31.2 (CH ₂ ), 31.1 (CH ₂ ), 30.3 (CH ₂ ), 29.5 (CH ₂ ), 28.7 (CH ₂ ), 28.0 (CH ₂ ), 25.05 (CH ₂ ).

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3313 (NH), 3086 (С-Н вал), 2937 (Ar), 2100 (N₃), 1724 (C(O)), 1643 (C(O)), 1554 (C(O)), 1290 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3313 (NH), 3086 (С-Н shaft), 2937 (Ar), 2100 (N ₃ ), 1724 (C (O)), 1643 (C (O)), 1554 (C (O)), 1290 (Ar)

ESI-LCMS для C₅₀H₆₄Br₂N₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [М+Н]⁺: 1071.31, найдено: 1071.30.ESI-LCMS for C ₅₀ H ₆₄ Br ₂ N ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ : 1071.31, found: 1071.30.

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25-бензил-12-(4-бромбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,317-трикарбоксилат (64)(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25-benzyl-12- (4-bromobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24, 27,30-heptaazatritri triacontane-1,317-tricarboxylate (64)

К раствору 86 мг (0,068 ммоль) соединения (43) в 3,6 мл ДХМ добавили 400 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром. В результате было выделено 68 мг (0,062 ммоль) целевого соединения, выход 91%.To a solution of 86 mg (0.068 mmol) of compound (43) in 3.6 ml of DCM was added 400 μl of trifluoroacetic acid. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether. As a result, 68 mg (0.062 mmol) of the target compound were isolated, yield 91%.

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.52 (уш.с, 3Н, СООН), 8.31 (с, 1Н, C(O)NH), 8.09 (с, 1Н, C(O)NH), 7.91 (с, 1Н, C(O)NH), 7.79 (с, 1Н, C(O)NH), 7.54-7.47 (с, 2Н, C(O)NH + Ar), 7.54-7.47 (с, 2Н, C(O)NH + Ar), 7.15 (м, 7Н, C(O)NH + ArH), 6.30 (м, 1Н, NH(мочевина)), 4.51-4.43 (м, 4Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.08 (м, 2Н, СН, СН), 3.26-2.93 (м, 8Н, CH₂Ar), 2.71 (м, 2Н, CH₂Ar), 2.22 (м, 6Н, CH₂), 2.19 (м, 4Н, CH₂), 1.90 (с, 1Н, CH₂), 1.47 (м, 9Н, CH₂), 1.16 (м, 5Н, CH ₂CH).12.52 (br s, 3H, COOH), 8.31 (s, 1H, C (O) NH), 8.09 (s, 1H, C (O) NH), 7.91 (s, 1H, C (O) NH), 7.79 (s, 1H, C (O) NH), 7.54-7.47 (s, 2H, C (O) NH + Ar), 7.54-7.47 (s, 2H, C (O) NH + Ar), 7.15 (m 7H, C (O) NH + ArH), 6.30 (m, 1H, NH (urea)), 4.51-4.43 (m, 4H, PhC H ₂ NC (O)), 4.08 (m, 2H, CH, CH ), 3.26-2.93 (m, 8H, CH ₂ Ar), 2.71 (m, 2H, CH ₂ Ar), 2.22 (m, 6H, CH ₂ ), 2.19 (m, 4H, CH ₂ ), 1.90 (s, 1H, CH ₂ ), 1.47 (m, 9H, CH ₂ ), 1.16 (m, 5H, C H ₂ CH).

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (100 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

207.18 (СООН), 174.92 (C(O)NR₂), 174.63 (C(O)NR₂), 174.19 (C(O)NR₂), 174.55 (PhCH ₂ NC(O)), 172.48 (PhCH ₂ NC(О)), 171.49 (PhCH ₂ NC(O)), 171.30 (PhCH ₂ NC(O)), 157.71 (NHC(O)NH), 138.47 (Ar), 138.74 (Ar), 131.98 (Ar), 131.66 (Ar), 130.54 (Ar), 130.36 (Ar), 130.15 (Ar), 129.60 (Ar), 129.47 (Ar), 129.08 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 126.68 (Ar), 54.04 (СН), 52.08 (СН), 48.66 (CH₂NR₂), 36.27 (CH₂), 32.34 (CH₂), 32.21 (CH₂), 31.07 (CH₂), 30.33 (CH₂), 29.47 (CH₂), 28.55 (CH₂), 27.97 (CH₂), 26.68 (CH₂), 25.14 (CH₂).207.18 (COOH), 174.92 ( C (O) NR ₂ ), 174.63 ( C (O) NR ₂ ), 174.19 ( C (O) NR ₂ ), 174.55 (PhC H ₂ NC (O)), 172.48 (PhC H ₂ NC (O)), 171.49 (PhC H ₂ NC (O)), 171.30 (PhC H ₂ NC (O)), 157.71 (NH C (O) NH), 138.47 (Ar), 138.74 (Ar), 131.98 (Ar), 131.66 (Ar), 130.54 (Ar), 130.36 (Ar), 130.15 (Ar), 129.60 (Ar), 129.47 (Ar), 129.08 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 126.68 (Ar), 54.04 (CH), 52.08 (CH), 48.66 (CH ₂ NR ₂ ), 36.27 (CH ₂ ), 32.34 (CH ₂ ), 32.21 (CH ₂ ), 31.07 (CH ₂ ), 30.33 (CH ₂ ), 29.47 (CH ₂ ), 28.55 (CH ₂ ), 27.97 (CH ₂ ), 26.68 (CH ₂ ), 25.14 (CH ₂ ).

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3311 (NH), 2935 (Ar), 2100 (N₃), 1643 (C(O)NH), 1292 (Ar), 700 (CH₂).IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3311 (NH), 2935 (Ar), 2100 (N ₃ ), 1643 (C (O) NH), 1292 (Ar), 700 (CH ₂ ).

ESI-LCMS для C₅₀H₆₅BrN₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [M+H]⁺ 1094.01, найдено: 1095.25..ESI-LCMS for C ₅₀ H ₆₅ BrN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1094.01, found: 1095.25 ..

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25,28-бензил-12-(4-хлорбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (65).(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25,28-benzyl-12- (4-chlorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19, 24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (65).

57 мг (28,77 мкмоль) соединения (44) растворили в 3 мл ДХМ и добавили 330 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 13 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и трижды переупарили с ДХМ. Продукт осадили эфиром и трижды промыли 10 мл диэтилового эфира. В результате было выделено 49 мг целевого продукта, выход 100%.57 mg (28.77 μmol) of compound (44) was dissolved in 3 ml of DCM and 330 μl of trifluoroacetic acid was added. The mixture was stirred for 13 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and three times re-evaporated with DCM. The product was precipitated with ether and washed three times with 10 ml of diethyl ether. As a result, 49 mg of the expected product was isolated, yield 100%.

Таким образом, соединение (65) было выделено в виде белого аморфного порошка, выход составил 49 мг (100%).Thus, compound (65) was isolated as a white amorphous powder, the yield was 49 mg (100%).

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.36 (уш. с, 2Н, СООН), 8.29-8.37 (м, 1Н, NH), 8.17 (д, J=7.6 Гц, 1Н, NH), 8.02-8.10 (м, 1Н, NH), 7.93 (м, 1Н, NH), 7.40 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Ar), 7.34 (д, J=7.9 Гц, 1Н, Ar), 7.23-7.25 (м, 2Н, Ar), 7.19-7.21 (м, 5Н, Ar), 7.17 (м, 3Н, Ar), 6.27-6.33 (м, 1Н, NH), 4.51 (с, 1Н, CH₂(Bz)), 4.44 (с, 1Н, CH₂(Bz)), 4.29-4.40 (м, 2Н, СН), 4.03-4.08 (м, 2Н, СН), 3.44-3.60 (м, 4Н, CH₂), 3.18-3.26 (м, 3Н, CH₂), 3.12-3.15 (м, 2Н, CH₂), 3.02-3.06 (м, 2Н, CH₂), 2.89-3.00 (м, 3Н, CH₂), 2.74-2.79 (м, 1Н, CH₂), 2.56-2.67 (м, 1Н, CH₂), 2.28-2.32 (м, 3Н, CH₂), 2.22-2.26 (м, 4Н, CH₂), 1.90-1.91 (м, 1Н, CH₂), 1.69-1.72 (м, 1Н, CH₂), 1.58-1.60 (м, 3Н, CH₂), 1.36-1.49 (м, 5Н, CH₂), 1.18-1.26 (м, 8Н, CH₂)12.36 (br.s, 2H, COOH), 8.29-8.37 (m, 1H, NH), 8.17 (d, J = 7.6 Hz, 1H, NH), 8.02-8.10 (m, 1H, NH), 7.93 (m , 1Н, NH), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 1Н, Ar), 7.34 (d, J = 7.9 Hz, 1Н, Ar), 7.23-7.25 (m, 2Н, Ar), 7.19-7.21 (m , 5H, Ar), 7.17 (m, 3H, Ar), 6.27-6.33 (m, 1H, NH), 4.51 (s, 1H, CH ₂ (Bz)), 4.44 (s, 1H, CH ₂ (Bz) ), 4.29-4.40 (m, 2H, CH), 4.03-4.08 (m, 2H, CH), 3.44-3.60 (m, 4H, CH ₂ ), 3.18-3.26 (m, 3H, CH ₂ ), 3.12- 3.15 (m, 2H, CH ₂ ), 3.02-3.06 (m, 2H, CH ₂ ), 2.89-3.00 (m, 3H, CH ₂ ), 2.74-2.79 (m, 1H, CH ₂ ), 2.56-2.67 ( m, 1H, CH ₂ ), 2.28-2.32 (m, 3H, CH ₂ ), 2.22-2.26 (m, 4H, CH ₂ ), 1.90-1.91 (m, 1H, CH ₂ ), 1.69-1.72 (m, 1H, CH ₂ ), 1.58-1.60 (m, 3H, CH ₂ ), 1.36-1.49 (m, 5H, CH ₂ ), 1.18-1.26 (m, 8H, CH ₂ )

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (100 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

174.85 (С(О)ОН), 174.57 (С(О)ОН), 172.41 (С(О)ОН), 172.25 (С(О)ОН), 171.97 (С(О)ОН), 171.66 (С(О)ОН), 171.50 (С(О)ОН), 171.43 (C(O)N), 157.66 (С(O) мочевина), 138.45 (Ar), 138.38 (Ar), 138.45, 130.38 (Ar), 137.51 (Ar), 132.06, 131.81 (Ar), 129.74 (Ar), 129.58 (Ar), 129.52 (Ar), 129.41 (Ar), 128.70, 128.57 (Ar), 128.46 (Ar), 128.37 (Ar), 54.81 (СН), 54.72 (СН), 54.00 (СН), 52.61, 52.49 (СН), 52.05 (СН), 48.64, 48.54 (CH₂), 46.74 (CH₂), 42.26 (CH₂), 38.93 (CH₂), 37.99 (CH₂), 37.20 (CH₂), 36.26 (CH₂), 32.20, 32.19 (CH₂), 31.09, 31.05 (CH₂), 30.31 (CH₂), 29.49 (CH₂), 28.59 (CH₂), 28.55 (CH₂), 28.14 (CH₂), 27.95 (CH₂), 26.65 (CH₂), 26.57 (CH₂), 25.11 (CH₂), 24.98 (CH₂), 22.74 (CH₂), 19.24 (CH₂).174.85 (C (O) OH), 174.57 (C (O) OH), 172.41 (C (O) OH), 172.25 (C (O) OH), 171.97 (C (O) OH), 171.66 (C (O) ) OH), 171.50 (C (O) OH), 171.43 (C (O) N), 157.66 (C (O) urea), 138.45 (Ar), 138.38 (Ar), 138.45, 130.38 (Ar), 137.51 ( Ar), 132.06, 131.81 (Ar), 129.74 (Ar), 129.58 (Ar), 129.52 (Ar), 129.41 (Ar), 128.70, 128.57 (Ar), 128.46 (Ar), 128.37 (Ar), 54.81 (CH ), 54.72 (CH), 54.00 (CH), 52.61, 52.49 (CH), 52.05 (CH), 48.64, 48.54 (CH ₂ ), 46.74 (CH ₂ ), 42.26 (CH ₂ ), 38.93 (CH ₂ ), 37.99 (CH ₂ ), 37.20 (CH ₂ ), 36.26 (CH ₂ ), 32.20, 32.19 (CH ₂ ), 31.09, 31.05 (CH ₂ ), 30.31 (CH ₂ ), 29.49 (CH ₂ ), 28.59 (CH ₂ ), 28.55 (CH ₂ ), 28.14 (CH ₂ ), 27.95 (CH ₂ ), 26.65 (CH ₂ ), 26.57 (CH ₂ ), 25.11 (CH ₂ ), 24.98 (CH ₂ ), 22.74 (CH ₂ ), 19.24 (CH ₂ ).

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3291 (NH), 3062 (С-Н_вал), 2930 (Ar), 2097 (N₃), 1722 (C(O)), 1639 (С(O) (мочевина)), 1552 (С(O)), 1252 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3291 (NH), 3062 (С-Н _shaft ), 2930 (Ar), 2097 (N ₃ ), 1722 (C (O)), 1639 (С (O) (urea )), 1552 (C (O)), 1252 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₅ClN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [M+H]⁺: 1035.4515, найдено: 1035.4551; m/z рассчитано для [M+Na]⁺: 1056.4398, найдено: 1056.4364.ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₅ ClN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ : 1035.4515, found: 1035.4551; m / z calculated for [M + Na] ⁺ : 1056.4398, found: 1056.4364.

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25-бензил-12-(4-хлорбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-триокарбоксилат (66)(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25-benzyl-12- (4-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4, 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-triocarboxylate (66)

62 мг (50.96 мкмоль) соединения (45) растворили в 3 мл ДХМ и добавили 330 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 13 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и трижды переупарили с ДХМ. Продукт осадили эфиром и трижды промыли 10 мл диэтилового эфира.62 mg (50.96 μmol) of compound (45) was dissolved in 3 ml of DCM and 330 μl of trifluoroacetic acid was added. The mixture was stirred for 13 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and three times re-evaporated with DCM. The product was precipitated with ether and washed three times with 10 ml of diethyl ether.

Таким образом, соединение (66) было выделено в виде белого аморфного порошка, выход составил 53 мг (99%).Thus, compound (66) was isolated as a white amorphous powder, the yield was 53 mg (99%).

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.40 (уш. с, 3Н, СООН), 8.74-8.81 (м, 1Н, NH), 8.09-8.21 (м, 2Н, NH), 7.79 (м, 1Н, NH), 7.41 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Ar), 7.35 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Ar), 7.27-7.29 (м, 1Н, Ar), 7.20-7.23 (м, 5Н, Ar), 6.99 (d, J=7.6 Гц, 2Н, Ar), 6.62-6.66 (м, 1Н, Ar), 6.29-6.35 (м, 2Н, Ar), 4.53 (с, 1Н, CH₂Ar), 4.46 (с, 1Н, CH₂Ar), 4.39-4.41 (м, 1Н, СН), 4.03-4.09 (м, 3Н, СН), 3.14-3.21 (м, 4Н, CH₂), 2.95-3.04 (м, 5Н, CH₂), 2.54-2.63 (м, 1Н, CH₂), 2.49 (м, 6Н, CH₂), 2.38-2.40 (м, 2Н, CH₂), 2.32-2.35 (м, 1Н, CH₂), 2.20-2.29 (м, 4Н, CH₂), 1.90-1.92 (м, 1Н, CH₂), 1.67-1.72 (м, 1Н, CH₂), 1.57-1.60 (м, 2Н, CH₂), 1.44-1.55 (м, 4Н, CH₂), 1.36-1.40 (м, 2Н, CH₂), 1.15-1.30 (м, 5Н, CH₂)12.40 (br.s, 3H, COOH), 8.74-8.81 (m, 1H, NH), 8.09-8.21 (m, 2H, NH), 7.79 (m, 1H, NH), 7.41 (d, J = 8.2 Hz , 1Н, Ar), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 1Н, Ar), 7.27-7.29 (m, 1Н, Ar), 7.20-7.23 (m, 5Н, Ar), 6.99 (d, J = 7.6 Hz , 2H, Ar), 6.62-6.66 (m, 1H, Ar), 6.29-6.35 (m, 2H, Ar), 4.53 (s, 1H, CH ₂ Ar), 4.46 (s, 1H, CH ₂ Ar), 4.39-4.41 (m, 1H, CH), 4.03-4.09 (m, 3H, CH), 3.14-3.21 (m, 4H, CH ₂ ), 2.95-3.04 (m, 5H, CH ₂ ), 2.54-2.63 ( m, 1H, CH ₂ ), 2.49 (m, 6H, CH ₂ ), 2.38-2.40 (m, 2H, CH ₂ ), 2.32-2.35 (m, 1H, CH ₂ ), 2.20-2.29 (m, 4H, CH ₂ ), 1.90-1.92 (m, 1H, CH ₂ ), 1.67-1.72 (m, 1H, CH ₂ ), 1.57-1.60 (m, 2H, CH ₂ ), 1.44-1.55 (m, 4H, CH ₂ ), 1.36-1.40 (m, 2H, CH ₂ ), 1.15-1.30 (m, 5H, CH ₂ )

Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (100 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

174.68 (С(О)ОН), 174.57 (С(О)ОН), 172.45 (С(О)ОН), 172.22 (С(О)ОН), 171.95 (С(О)ОН), 171.58 (С(О)ОН), 171.37, 171.26 (C(O)N), 157.67 (С(O) мочевина), 156.21 (С(O) мочевина), 138.40 (Ar), 138.00 (Ar), 130.49 (Ar), 130.33 (Ar), 129.74 (Ar), 129.55 (Ar), 129.43 (Ar), 129.02 (Ar), 128.70 (Ar), 128.45 (Ar), 128.37 (Ar), 127.79 (Ar), 126.63 (Ar), 115.36 (Ar), 115.25 (Ar), 65.34 (CH), 55.20 (СН), 54.72 (СН) 52.50 (СН), 52.05 (CH₂), 51.69 (CH₂), 48.63, 48.56 (CH₂), 47.11 (CH₂), 37.62, 37.22 (CH₂), 36.24 (CH₂), 32.72 (CH₂), 32.31, 32.19 (CH₂), 31.07 (CH₂), 30.31 (CH₂), 29.43 (CH₂), 28.61, 28.57 (CH₂), 28.01, 27.95 (CH₂), 26.69 (CH₂), 25.11, 24.98 (CH₂), 22.90 (CH₂),15.59 (CH₂).174.68 (C (O) OH), 174.57 (C (O) OH), 172.45 (C (O) OH), 172.22 (C (O) OH), 171.95 (C (O) OH), 171.58 (C (O) ) OH), 171.37, 171.26 (C (O) N), 157.67 (C (O) urea), 156.21 (C (O) urea), 138.40 (Ar), 138.00 (Ar), 130.49 (Ar), 130.33 ( Ar), 129.74 (Ar), 129.55 (Ar), 129.43 (Ar), 129.02 (Ar), 128.70 (Ar), 128.45 (Ar), 128.37 (Ar), 127.79 (Ar), 126.63 (Ar), 115.36 ( Ar), 115.25 (Ar), 65.34 (CH), 55.20 (CH), 54.72 (CH) 52.50 (CH), 52.05 (CH ₂ ), 51.69 (CH ₂ ), 48.63, 48.56 (CH ₂ ), 47.11 (CH ₂ ), 37.62, 37.22 (CH ₂ ), 36.24 (CH ₂ ), 32.72 (CH ₂ ), 32.31, 32.19 (CH ₂ ), 31.07 (CH ₂ ), 30.31 (CH ₂ ), 29.43 (CH ₂ ), 28.61 , 28.57 (CH ₂ ), 28.01, 27.95 (CH ₂ ), 26.69 (CH ₂ ), 25.11, 24.98 (CH ₂ ), 22.90 (CH ₂ ), 15.59 (CH ₂ ).

ИК-спектр (ZnSe, см^-1): 3238 (NH), 3066 (С-Н_вал), 2931 (Ar), 2097 (N₃), 1722 (C(O)), 1643 (С(0) (мочевина)), 1548 (С(O)), 1205 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3238 (NH), 3066 (С-Н _shaft ), 2931 (Ar), 2097 (N ₃ ), 1722 (C (O)), 1643 (С (0) ( urea)), 1548 (C (O)), 1205 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₅ClN₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [М+Н]⁺: 1052.4498, найдено: 1052.4486.ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₅ ClN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ : 1052.4498, found: 1052.4486.

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25-бензил-12-(4-хлорбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (67)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25-benzyl-12- (4-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4, 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (67)

35 мг (28,77 мкмоль) соединения (46) растворили в 3 мл ДХМ и добавили 330 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 13 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и трижды переупарили с ДХМ. Продукт осадили эфиром и трижды промыли 10 мл диэтилового эфира.35 mg (28.77 μmol) of compound (46) was dissolved in 3 ml of DCM and 330 μl of trifluoroacetic acid was added. The mixture was stirred for 13 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and three times re-evaporated with DCM. The product was precipitated with ether and washed three times with 10 ml of diethyl ether.

Таким образом, соединение (67) было выделено в виде белого аморфного порошка, выход составил 27 мг (90%)Thus, compound (67) was isolated as a white amorphous powder, the yield was 27 mg (90%)

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.35 (уш. с, 3Н, СООН), 9.22 (д, J=17 Гц, 1Н, NH), 8.81-8.74 (м, 1Н, NH), 8.21-8.09 (м, 2Н, NH), 7.79 (м, 1Н, NH), 7.41 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Ar), 7.35 (д, J=8.2 Гц, 1Н, Ar), 7.29-7.27 (m, 1Н, Ar), 7.23-7.20 (м, 5Н, Ar), 6.99 (д, J=7.6 Гц, 2Н, Ar), 6.66-6.62 (м, 1Н, Ar), 6.35-6.29 (м, 2Н, Ar), 4.53 (с, 1Н, CH₂(Bz)), 4.46 (с, 1Н, CH₂(Bz)), 4.41-4.39(м, 1Н, СН), 4.09-4.03 (м, 3Н, СН), 3.21-3.14 (м, 4Н, CH₂), 3.04-2.95 (м, 5Н, CH₂), 2.63 -2.54 (м, 1Н, CH₂), 2.49 (м, 6Н, CH₂), 2.40-2.38 (м, 2Н, CH₂), 2.35-2.32 (м, 1Н, CH₂), 2.29-2.20 (м, 4Н, CH₂), 1.90-1.92 (м, 1Н, CH₂), 1.72-1.67 (м, 1H, CH₂), 1.60-1.57 (м, 2Н, CH₂), 1.55-1.44 (м, 4Н, CH₂), 1.40-1.436 (м, 2Н, CH₂), 1.30-1.15 (м, 5Н, CH₂)12.35 (br.s, 3H, COOH), 9.22 (d, J = 17 Hz, 1H, NH), 8.81-8.74 (m, 1H, NH), 8.21-8.09 (m, 2H, NH), 7.79 (m , 1H, NH), 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar), 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar), 7.29-7.27 (m, 1H, Ar), 7.23-7.20 (m , 5H, Ar), 6.99 (d, J = 7.6 Hz, 2H, Ar), 6.66-6.62 (m, 1H, Ar), 6.35-6.29 (m, 2H, Ar), 4.53 (s, 1H, CH ₂ (Bz)), 4.46 (s, 1H, CH ₂ (Bz)), 4.41-4.39 (m, 1H, CH), 4.09-4.03 (m, 3H, CH), 3.21-3.14 (m, 4H, CH ₂ ), 3.04-2.95 (m, 5H, CH ₂ ), 2.63 -2.54 (m, 1H, CH ₂ ), 2.49 (m, 6H, CH ₂ ), 2.40-2.38 (m, 2H, CH ₂ ), 2.35- 2.32 (m, 1H, CH ₂ ), 2.29-2.20 (m, 4H, CH ₂ ), 1.90-1.92 (m, 1H, CH ₂ ), 1.72-1.67 (m, 1H, CH ₂ ), 1.60-1.57 ( m, 2H, CH ₂ ), 1.55-1.44 (m, 4H, CH ₂ ), 1.40-1.436 (m, 2H, CH ₂ ), 1.30-1.15 (m, 5H, CH ₂ )

ИК-спектр (ZnSe, см^-1): 3305.97 (NH), 3159.79 (С-Н_вал), 2934.16 (Ar), 2098.17 (N₃), 1702.84 (C(O)), 1649.20 (С(O) (мочевина)), 1536.51 (С(O)), 1200.47 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3305.97 (NH), 3159.79 (С-Н _shaft ), 2934.16 (Ar), 2098.17 (N ₃ ), 1702.84 (C (O)), 1649.20 (С (O) ( urea)), 1536.51 (C (O)), 1200.47 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₅ClN₁₀O₁₃: м/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1051.4464, найдено 1051.4419.ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₅ ClN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1051.4464, found 1051.4419.

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25-бензил-12-(4-хлорбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (68)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25-benzyl-12- (4-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4, 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (68)

35 мг (29.15 мкмоль) соединения (47) растворили в 3 мл ДХМ и добавили 330 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 13 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и трижды переупарили с ДХМ. Продукт осадили эфиром и трижды промыли 10 мл диэтилового эфира.35 mg (29.15 μmol) of compound (47) was dissolved in 3 ml of DCM and 330 μl of trifluoroacetic acid was added. The mixture was stirred for 13 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and three times re-evaporated with DCM. The product was precipitated with ether and washed three times with 10 ml of diethyl ether.

Таким образом, соединение (68) было выделено в виде белого аморфного порошка, выход составил 23 мг (76%).Thus, compound (68) was isolated as a white amorphous powder, the yield was 23 mg (76%).

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-д6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.46 (уш.с., 2Н, СООН), 8.29-8.34 (м, 1H, NH), 8.07-8.14 (м, 2Н, NH), 7.92 (м, 1H, NH), 7.78 (м, 1H, NH), 7.58 (м, 1H, NH), 7.39 (м, 1H, Ar), 7.33 (м, 1H, Ar), 7.21 (м, 10Н, Ar), 7.08 (м, 1H, Ar), 6.28-6.31 (м, 1H, Ar), 4.39-4.51 (м, 4Н, СН + CH₂(Ar)), 4.08 (м, 3Н, СН), 3.74 (м, 8Н, CH₂), 3.14-3.24 (м, 5Н, CH₂), 2.97-3.06 (м, 5Н, CH₂), 2.65-2.76 (м, 2Н, CH₂), 2.21-2.31 (м, 6Н, CH₂), 1.91 (м, 1H, CH₂), 1.49-1.70 (м, 8Н, CH₂), 1.22 (м, 4Н, CH₂) (Рисунок 1.276)12.46 (br.s, 2H, COOH), 8.29-8.34 (m, 1H, NH), 8.07-8.14 (m, 2H, NH), 7.92 (m, 1H, NH), 7.78 (m, 1H, NH ), 7.58 (m, 1H, Ar), 7.39 (m, 1H, Ar), 7.33 (m, 1H, Ar), 7.21 (m, 10H, Ar), 7.08 (m, 1H, Ar), 6.28-6.31 (m, 1H, Ar), 4.39-4.51 (m, 4H, CH + CH ₂ (Ar)), 4.08 (m, 3H, CH), 3.74 (m, 8H, CH ₂ ), 3.14-3.24 (m, 5H, CH ₂ ), 2.97-3.06 (m, 5H, CH ₂ ), 2.65-2.76 (m, 2H, CH ₂ ), 2.21-2.31 (m, 6H, CH ₂ ), 1.91 (m, 1H, CH ₂ ), 1.49-1.70 (m, 8H, CH ₂ ), 1.22 (m, 4H, CH ₂ ) (Figure 1.276)

ИК-спектр (ZnSe, см^-1): 3311 (NH), 3064 (С-Н_вал), 2935 (Ar), 2100 (N₃), 1725 (C(O)), 1644 (С(O) (мочевина)), 1554 (С(O)), 1201 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3311 (NH), 3064 (С-Н _shaft ), 2935 (Ar), 2100 (N ₃ ), 1725 (C (O)), 1644 (С (O) ( urea)), 1554 (C (O)), 1201 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₅ClN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1035.4515, найдено 1035.4554ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₅ ClN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1035.4515, found 1035.4554

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25,28-дибензил-12-(3-хлорбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (69)(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25,28-dibenzyl-12- (3-chlorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19, 24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (69)

К раствору 77 мг (0,064 ммоль) соединения (48) в 2,7 мл ДХМ добавили 300 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром. В результате было выделено 56 (0,054 ммоль) мг целевого соединения, выход 84%.To a solution of 77 mg (0.064 mmol) of compound (48) in 2.7 ml of DCM was added 300 μl of trifluoroacetic acid. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether. As a result, 56 (0.054 mmol) mg of the target compound was isolated, yield 84%.

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

8.45-8.25 (м, 1Н, C(O)NH), 8.21-8.05 (м, 1Н, C(O)NH), 8,00-7.85 (м, 1Н, C(O)NH), 7.83-7.50 (м, 1Н, C(O)NH), 7.40-7.00 (м, 14Н, Ar), 6.39-6.21 (с, 2Н, NH(мочевина)), 4.58-4.40 (м, 2Н, PhCH ₂ ), 4.44-4.22 (м, 2Н, СН), 4.15-3.98 (м, 2Н, СН), 3.29-2.83 (м, 11Н, CH₂), 2.82-2.51 (м, 2Н, CH₂), 2.41-2.08(м, 7Н, CH₂), -1.98-1.84 (м, 1Н, CH₂), 1.76-0.93 (м, 17Н, CH ₂)8.45-8.25 (m, 1H, C (O) NH), 8.21-8.05 (m, 1H, C (O) NH), 8.00-7.85 (m, 1H, C (O) NH), 7.83-7.50 (m, 1H, C (O) NH), 7.40-7.00 (m, 14H, Ar), 6.39-6.21 (s, 2H, NH (urea)), 4.58-4.40 (m, 2H, PhC H ₂ ), 4.44-4.22 (m, 2H, CH), 4.15-3.98 (m, 2H, CH), 3.29-2.83 (m, 11H, CH ₂ ), 2.82-2.51 (m, 2H, CH ₂ ), 2.41-2.08 ( m, 7H, CH ₂ ), -1.98-1.84 (m, 1H, CH ₂ ), 1.76-0.93 (m, 17H, C H ₂ )

Спектр ЯМР ¹³С (90 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (90 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

174.91 (C(O)NH), 174.62 (C(O)NH), 174.18 (C(O)NH), 138.42 (Ar), 133.48 (Ar), 130.67 (Ar), 129.56 (Ar), 129.45 (Ar), 128.61 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 127.62 (Ar), 127.62 (Ar), 127.26 (Ar), 126.74 (Ar), 126.51 (Ar), 85.05 (СН), 54.76 (СН), 52.08 (СН), 48.57 (СН), 45.79 (СН), 36.29 (CH₂), 32.30 (CH₂), 31.13 (CH₂), 30.33 (CH₂), 28.58 (CH₂), 27.98 (CH₂), 26.67 (CH₂), 13.03 (CH₂)174.91 ( C (O) NH), 174.62 ( C (O) NH), 174.18 ( C (O) NH), 138.42 (Ar), 133.48 (Ar), 130.67 (Ar), 129.56 (Ar), 129.45 (Ar ), 128.61 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 127.62 (Ar), 127.62 (Ar), 127.26 (Ar), 126.74 (Ar), 126.51 (Ar), 85.05 (CH), 54.76 (CH ), 52.08 (CH), 48.57 (CH), 45.79 (CH), 36.29 (CH ₂ ), 32.30 (CH ₂ ), 31.13 (CH ₂ ), 30.33 (CH ₂ ), 28.58 (CH ₂ ), 27.98 (CH ₂ ), 26.67 (CH ₂ ), 13.03 (CH ₂ )

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3311 (NH), 3087 (С-Н вал), 2935 (Ar), 2100 (N₃), 1727 (С(O)), 1645 (С(O) (мочевина)), 1556 (С(O)), 1292 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3311 (NH), 3087 (С-Н shaft), 2935 (Ar), 2100 (N ₃ ), 1727 (С (O)), 1645 (С (O) (urea )), 1556 (C (O)), 1292 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₅ClN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [M+H]⁺ 1035.4983, найдено: 1035.4515.ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₅ ClN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1035.4983, found: 1035.4515.

52(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-28-(4-гидроксобензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (70)52 (3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4 , 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (70)

В 4 мл 10% (по объему) раствора трифторуксусной кислоты в DCM растворили соединение (49) (109 мг 0.089 ммоль) и перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Растворитель упарили при пониженном давлении. Добавили 4 мл DCM с последующим упариванием для удаления трифторуксусной кислоты, процедуру повторили 5 раз. К полученному маслянистому осадку добавили 5 мл диэтилового эфира, в результате чего выделился белый твердый продукт. Эфир декантировали, процедуру повторили еще 2 раза.Compound (49) (109 mg 0.089 mmol) was dissolved in 4 ml of a 10% (by volume) solution of trifluoroacetic acid in DCM and stirred for 16 hours at room temperature. The solvent was evaporated under reduced pressure. Added 4 ml of DCM, followed by evaporation to remove trifluoroacetic acid, the procedure was repeated 5 times. 5 ml of diethyl ether was added to the resulting oily precipitate, whereupon a white solid was isolated. The ether was decanted, the procedure was repeated 2 more times.

Таким образом, соединение (70) было выделено в виде белого осадка, выход составил 75 мг (80%).Thus, compound (70) was isolated as a white precipitate, the yield was 75 mg (80%).

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.33 (уш.с, 3Н, С(О)ОН), 8.28 (с, 1Н, C(O)NH), 8.07 (с, 1Н, C(O)NH), 7.89 (с, 1Н, C(O)NH), 7.78-7.55 (м, 2Н, C(O)NH + ArH), 7.30-6.99 (м, 13Н, C(O)NH + ArH), 6.67-6.62 (м, 2Н, C(O)NH + ArH), 6.29 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.54 (с, 1Н, PhCH ₂ NC(О)), 4.46 (с, 1Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.08 (м, 2Н, СН, СН), 3.62-3.37 (м, 4Н, CH₂Ar), 3.51 (м, 9Н, CH₂), 3.26-2.93 (м, 2Н, CH₂Ar), 3.26-2.99 (м, 16Н, CH₂), 2.22 (м, 8Н, CH₂), 1.90 (с, 1Н, CH₂), 1.24 (м, 18Н, CH ₂CH)12.33 (br s, 3H, C (O) OH), 8.28 (s, 1H, C (O) NH), 8.07 (s, 1H, C (O) NH), 7.89 (s, 1H, C (O) ) NH), 7.78-7.55 (m, 2Н, C (O) NH + ArH), 7.30-6.99 (m, 13Н, C (O) NH + ArH), 6.67-6.62 (m, 2Н, C (O) NH + ArH), 6.29 (m, 2H, NH (urea)), 4.54 (s, 1H, PhC H ₂ NC (O)), 4.46 (s, 1H, PhC H ₂ NC (O)), 4.08 (m , 2H, CH, CH), 3.62-3.37 (m, 4H, CH ₂ Ar), 3.51 (m, 9H, CH ₂ ), 3.26-2.93 (m, 2H, CH ₂ Ar), 3.26-2.99 (m, 16H, CH ₂ ), 2.22 (m, 8H, CH ₂ ), 1.90 (s, 1H, CH ₂ ), 1.24 (m, 18H, C H ₂ CH)

Спектр ЯМР ¹³С (101 МГц, ДМСО-d6, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (101 MHz, DMSO-d6, ppm):

175.27 (С(О)ОН), 174.98 (C(O)NR₂), 174.56 (C(O)NR₂), 171.85 (PhCH ₂ NC(O)), 172.98 (PhCH ₂ NC(O)), 172.37 (PhCH ₂ NC(O)), 171.87 (PhCH ₂ NC(O)), 158.09 (NHC(O)NH), 138.82 (Ar), 131.39 (Ar), 131.04 (Ar), 130.90 (Ar), 130.75 (Ar), 129.96 (Ar), 129.83 (Ar), 128.87 (Ar), 128.79 (Ar), 127.99 (Ar), 127.63 (Ar), 125.08 (Ar), 126.87 (Ar), 115.77 (Ar), 54.41 (СН), 52.46 (СН), 49.04 (CH₂NR₂), 48.96 (CH₂Ar), 47.76 (CH₂Ar), 42.67 (CH₂), 36.65 (CH₂), 32.67 (CH₂), 30.72 (CH₂), 29.90 (CH₂), 29.02 (CH₂), 28.59 (CH₂), 28.36 (CH₂), 27.04 (CH₂), 25.53 (CH₂), 18.89 (CH₂), 17.53 (CH₂), 13.30 (CH₂)175.27 (C (O) OH), 174.98 ( C (O) NR ₂ ), 174.56 ( C (O) NR ₂ ), 171.85 (PhC H ₂ NC (O)), 172.98 (PhC H ₂ NC (O)) , 172.37 (PhC H ₂ NC (O)), 171.87 (PhC H ₂ NC (O)), 158.09 (NH C (O) NH), 138.82 (Ar), 131.39 (Ar), 131.04 (Ar), 130.90 ( Ar), 130.75 (Ar), 129.96 (Ar), 129.83 (Ar), 128.87 (Ar), 128.79 (Ar), 127.99 (Ar), 127.63 (Ar), 125.08 (Ar), 126.87 (Ar), 115.77 ( Ar), 54.41 (CH), 52.46 (CH), 49.04 (CH ₂ NR ₂ ), 48.96 (CH ₂ Ar), 47.76 (CH ₂ Ar), 42.67 (CH ₂ ), 36.65 (CH ₂ ), 32.67 (CH ₂ ), 30.72 (CH ₂ ), 29.90 (CH ₂ ), 29.02 (CH ₂ ), 28.59 (CH ₂ ), 28.36 (CH ₂ ), 27.04 (CH ₂ ), 25.53 (CH ₂ ), 18.89 (CH ₂ ) , 17.53 (CH ₂ ), 13.30 (CH ₂ )

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3314 (NH), 2932 (Ar), 2099 (N₃), 1642 (С(O) (мочевина), 1291 (Ar), 699 (CH₂)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3314 (NH), 2932 (Ar), 2099 (N ₃ ), 1642 (C (O) (urea), 1291 (Ar), 699 (CH ₂ )

ESI-HRMS для C₅₀H₆₅ClN₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1050.4527, найдено: 1050.4583.ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₅ ClN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1050.4527, found: 1050.4583.

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтат-1,3,7-трикарбоксилат (71)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24, 27.30-heptaazatritri triacontate-1,3,7-tricarboxylate (71)

В 4 мл 10% (по объему) раствора трифторуксусной кислоты в DCM растворили соединение (50) (66 мг 0.055 ммоль) и перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Растворитель упарили при пониженном давлении. Добавили 4 мл DCM с последующим упариванием для удаления трифторуксусной кислоты, процедуру повторили 5 раз. К полученному маслянистому осадку добавили 5 мл диэтилового эфира, в результате чего выделился белый твердый продукт. Эфир декантировали, процедуру повторили еще 2 раза.Compound (50) (66 mg 0.055 mmol) was dissolved in 4 ml of a 10% (by volume) solution of trifluoroacetic acid in DCM and stirred for 16 hours at room temperature. The solvent was evaporated under reduced pressure. Added 4 ml of DCM, followed by evaporation to remove trifluoroacetic acid, the procedure was repeated 5 times. 5 ml of diethyl ether was added to the resulting oily precipitate, whereupon a white solid was isolated. The ether was decanted, the procedure was repeated 2 more times.

Таким образом, соединение (71) было выделено в виде белого осадка, выход составил 52 мг.(70%).Thus, compound (71) was isolated as a white precipitate, the yield was 52 mg (70%).

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.44 (уш.с, 3Н, СООН), 8.78 (с, 1Н, C(O)NH), 8.33 (с, 3Н, C(O)NH + Ar), 7.78 (с, 1Н, C(O)NH), 7.18 (м, 14Н, C(O)NH + ArH), 6.27 (м, 1Н, NH(мочевина)), 4.51-4.35 (м, 4Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.05 (м, 2Н, СН, СН), 3.19-3.13 (м, 4Н, CH₂Ar), 3.10-2.78 (м, 2Н, CH₂Ar), 2.30 (м, 4Н, CH₂), 2.19 (м, 4Н, CH₂), 1.87 (с, 2Н, CH₂), 1.47 (м, 9Н, CH₂), 1.21 (м, 6Н, CH ₂CH).12.44 (br s, 3H, COOH), 8.78 (s, 1H, C (O) NH), 8.33 (s, 3H, C (O) NH + Ar), 7.78 (s, 1H, C (O) NH ), 7.18 (m, 14H, C (O) NH + ArH), 6.27 (m, 1H, NH (urea)), 4.51-4.35 (m, 4H, PhC H ₂ NC (O)), 4.05 (m, 2H, CH, CH), 3.19-3.13 (m, 4H, CH ₂ Ar), 3.10-2.78 (m, 2H, CH ₂ Ar), 2.30 (m, 4H, CH ₂ ), 2.19 (m, 4H, CH ₂ ), 1.87 (s, 2H, CH ₂ ), 1.47 (m, 9H, CH ₂ ), 1.21 (m, 6H, C H ₂ CH).

Спектр ЯМР ¹³С (101 МГц, ДМСО-d6, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (101 MHz, DMSO-d6, ppm):

186.35 (С(О)ОН), 174.97 (C(O)NR₂), 174.54 (C(O)NR₂), 171.84 (C(O)NR₂), 171.84 (PhCH ₂ NC(O)), 169.59 (PhCH ₂ NC(O)), 167.01 (PhCH ₂ NC(O)), 158.07 (NHC(O)NH), 138.81 (Ar), 131.01 (Ar), 129.97 (Ar), 129.92 (Ar), 129.80 (Ar), 128.96 (Ar), 128.87 (Ar), 128.79 (Ar), 127.99 (Ar), 127.99 (Ar), 127.62 (Ar), 127.09 (Ar), 126.87 (Ar), 55.14 (СН), 52.48 (СН), 49.03 (CH₂NR₂), 49.00 (CH₂Ar), 48.94 (CH₂Ar), 36.70 (CH₂), 36.68 (CH₂), 36.32 (CH₂), 33.10 (CH₂), 32.61 (CH₂), 31.51 (CH₂), 31.46 (CH₂), 31.43 (CH₂), 30.72 (CH₂), 30.56 (CH₂), 29.89 (CH₂), 29.56 (CH₂), 29.10 (CH₂), 29.01 (CH₂), 28.95 (CH₂), 28.60 (CH₂), 28.37 (CH₂), 27.02 (CH₂), 25.52 (CH₂), 23.12 (CH₂).186.35 (C (O) OH), 174.97 ( C (O) NR ₂ ), 174.54 ( C (O) NR ₂ ), 171.84 ( C (O) NR ₂ ), 171.84 (PhC H ₂ NC (O)), 169.59 (PhC H ₂ NC (O)), 167.01 (PhC H ₂ NC (O)), 158.07 (NH C (O) NH), 138.81 (Ar), 131.01 (Ar), 129.97 (Ar), 129.92 (Ar ), 129.80 (Ar), 128.96 (Ar), 128.87 (Ar), 128.79 (Ar), 127.99 (Ar), 127.99 (Ar), 127.62 (Ar), 127.09 (Ar), 126.87 (Ar), 55.14 (CH ), 52.48 (CH), 49.03 (CH ₂ NR ₂ ), 49.00 (CH ₂ Ar), 48.94 (CH ₂ Ar), 36.70 (CH ₂ ), 36.68 (CH ₂ ), 36.32 (CH ₂ ), 33.10 (CH ₂ ), 32.61 (CH ₂ ), 31.51 (CH ₂ ), 31.46 (CH ₂ ), 31.43 (CH ₂ ), 30.72 (CH ₂ ), 30.56 (CH ₂ ), 29.89 (CH ₂ ), 29.56 (CH ₂ ) 29.10 (CH ₂ ), 29.01 (CH ₂ ), 28.95 (CH ₂ ), 28.60 (CH ₂ ), 28.37 (CH ₂ ), 27.02 (CH ₂ ), 25.52 (CH ₂ ), 23.12 (CH ₂ ).

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3315.03 (NH), 2933.20 (Ar), 2100.10 (N₃), 1643.05 (C(O) (мочевина)), 1292.07 (Ar), 700.03 (CH₂)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3315.03 (NH), 2933.20 (Ar), 2100.10 (N ₃ ), 1643.05 (C (O) (urea)), 1292.07 (Ar), 700.03 (CH ₂ )

ESI-LCMS для C₅₀H₆₅ClN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [М+Н]⁺1033.45, найдено: 1033.35ESI-LCMS for C ₅₀ H ₆₅ ClN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1033.45, found: 1033.35

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-28-(4-гидроксобензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (72)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4, 6,12,19,24,27,30-heptaazatritri triacontane-1,3,7-tricarboxylate (72)

В 4 мл 10% (по объему) раствора трифторуксусной кислоты в DCM растворили соединение (51) (72 мг 0.089 ммоль) и перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Растворитель упарили при пониженном давлении. Добавили 4 мл DCM с последующим упариванием для удаления трифторуксусной кислоты, процедуру повторили 5 раз. К полученному маслянистому осадку добавили 5 мл диэтилового эфира, в результате чего выделился белый твердый продукт. Эфир декантировали, процедуру повторили еще 2 раза.Compound (51) (72 mg 0.089 mmol) was dissolved in 4 ml of a 10% (by volume) solution of trifluoroacetic acid in DCM and stirred for 16 hours at room temperature. The solvent was evaporated under reduced pressure. Added 4 ml of DCM, followed by evaporation to remove trifluoroacetic acid, the procedure was repeated 5 times. 5 ml of diethyl ether was added to the resulting oily precipitate, whereupon a white solid was isolated. The ether was decanted, the procedure was repeated 2 more times.

Таким образом, соединение (72) было выделено в виде белого осадка, выход составил 52 мг.(84%).Thus, compound (72) was isolated as a white precipitate, the yield was 52 mg (84%).

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.44 (уш.с, 3Н, СООН), 8.26 (с, 1Н, C(O)NH), 8.06 (с, 1Н, C(O)NH), 7.87 (с, 1Н, C(O)NH), 7.26-6.97 (м, 16Н, C(O)NH + ArH), 6.60 (м, 1Н, C(O)NH + ArH), 6.27 (м, 1Н, NH(мочевина)), 4.44-4.28 (м, 3Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.05 (м, 2Н, СН, СН), 3.50 (м, 4Н, CH₂Ar), 3.10-2.78 (м, 2Н, CH₂Ar), 2.19 (м, 4Н, CH₂), 1.87 (с, 1Н, CH₂), 1.47 (м, 5Н, CH₂), 1.21 (м, 17Н, CH ₂CH)12.44 (br s, 3H, COOH), 8.26 (s, 1H, C (O) NH), 8.06 (s, 1H, C (O) NH), 7.87 (s, 1H, C (O) NH), 7.26-6.97 (m, 16H, C (O) NH + ArH), 6.60 (m, 1H, C (O) NH + ArH), 6.27 (m, 1H, NH (urea)), 4.44-4.28 (m, 3H, PhC H ₂ NC (O)), 4.05 (m, 2H, CH, CH), 3.50 (m, 4H, CH ₂ Ar), 3.10-2.78 (m, 2H, CH ₂ Ar), 2.19 (m, 4H, CH ₂ ), 1.87 (s, 1H, CH ₂ ), 1.47 (m, 5H, CH ₂ ), 1.21 (m, 17H, C H ₂ CH)

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3313 (NH), 3070 (С-Н_вал), 2938 (Ar), 2100.10 (N₃), 1646 (С(O) (мочевина)), 1261 (Ar), 700 (CH₂).IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3313 (NH), 3070 (С-Н _shaft ), 2938 (Ar), 2100.10 (N ₃ ), 1646 (С (O) (urea)), 1261 (Ar), 700 (CH ₂ ).

ESI-HRMS для C₅₀H₆₅ClN₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1049.4494, найдено: 1049.4498.ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₅ ClN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1049.4494, found: 1049.4498.

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-28-(3-бром-4-гидроксобензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (73)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -28- (3-bromo-4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29- hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (73)

В 4 мл 10% (по объему) раствора трифторуксусной кислоты в DCM растворили вещество (52) (80 мг 0.061 ммоль) и перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Растворитель упарили при пониженном давлении. Добавили 4 мл DCM с последующим упариванием для удаления трифторуксусной кислоты, процедуру повторили 5 раз. К полученному маслянистому осадку добавили 5 мл диэтилового эфира, в результате чего выделился белый твердый продукт. Эфир декантировали, процедуру повторили еще 2 раза.In 4 ml of a 10% (by volume) solution of trifluoroacetic acid in DCM, substance (52) (80 mg 0.061 mmol) was dissolved and stirred for 16 hours at room temperature. The solvent was evaporated under reduced pressure. Added 4 ml of DCM, followed by evaporation to remove trifluoroacetic acid, the procedure was repeated 5 times. 5 ml of diethyl ether was added to the resulting oily precipitate, whereupon a white solid was isolated. The ether was decanted, the procedure was repeated 2 more times.

Таким образом, соединение (73) было выделено в виде белого осадка, выход составил 53 мг.(77%).Thus, compound (73) was isolated as a white precipitate, the yield was 53 mg (77%).

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.) ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm)

12.40 (уш.с, 3Н, С(О)ОН), 8.38 (с, 1Н, C(O)NH), 8.07 (с, 3Н, C(O)NH+Ar), 7.93 (с, 1Н, C(O)NH), 7.34-7.09 (м, 14Н, C(O)NH + ArH), 6.29-6.26 (м, 1Н, NH(мочевина)), 4.54-4.31 (м, 4Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.08-4.05 (м, 2Н, СН, СН), 3.59-3.28 (м, 4Н, CH₂Ar), 3.17-2.71 (м, 2Н, CH₂Ar), 2.21-2.07 (м, 8Н, CH₂), 1.62-1.49 (с, 2Н, CH₂), 1.29-1.24 (м, 9Н, CH₂).12.40 (br s, 3H, C (O) OH), 8.38 (s, 1H, C (O) NH), 8.07 (s, 3H, C (O) NH + Ar), 7.93 (s, 1H, C (O) NH), 7.34-7.09 (m, 14H, C (O) NH + ArH), 6.29-6.26 (m, 1H, NH (urea)), 4.54-4.31 (m, 4H, PhC H ₂ NC ( O)), 4.08-4.05 (m, 2H, CH, CH), 3.59-3.28 (m, 4H, CH ₂ Ar), 3.17-2.71 (m, 2H, CH ₂ Ar), 2.21-2.07 (m, 8H , CH ₂ ), 1.62-1.49 (s, 2H, CH ₂ ), 1.29-1.24 (m, 9H, CH ₂ ).

Спектр ЯМР ¹³С (101 МГц, ДМСО-d6, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (101 MHz, DMSO-d6, ppm):

207.18 (С(О)ОН), 203.53 (С(О)ОН), 198.85 (С(О)ОН), (C(O)NR₂), 175.27 (C(O)NR₂), 174.98 (С(О)NR₂), 174.55 (PhCH ₂ NC(O)), 172.97 (PhCH ₂ NC(O)), 171.67 (PhCH ₂ NC(O)), 158.07 (NHC(O)NH), 139.80 (Ar), 138.74 (Ar), 137.90 (Ar), 131.03 (Ar), 130.91 (Ar), 129.96 (Ar), 129.83 (Ar), 128.87 (Ar), 128.74 (Ar), 127.99 (Ar), 127.63 (Ar), 126.94 (Ar), 126.67 (Ar), 55.05 (СН), 52.46 (СН), 48.96 (CH₂NR₂), 36.70 (CH₂), 30.72 (CH₂), 29.91 (CH₂), 29.05 (CH₂), 28.35 (CH₂), 26.96 (CH₂), 25.38 (CH₂), 24.80 (CH₂), 24.01 (CH₂), 23.18 (CH₂), 23.12 (CH₂), 18.78 (CH₂), 18.09 (CH₂), 17.55 (CH₂).207.18 (C (O) OH), 203.53 (C (O) OH), 198.85 (C (O) OH), ( C (O) NR ₂ ), 175.27 ( C (O) NR ₂ ), 174.98 ( C ( O) NR ₂ ), 174.55 (PhC H ₂ NC (O)), 172.97 (PhC H ₂ NC (O)), 171.67 (PhC H ₂ NC (O)), 158.07 (NH C (O) NH), 139.80 (Ar), 138.74 (Ar), 137.90 (Ar), 131.03 (Ar), 130.91 (Ar), 129.96 (Ar), 129.83 (Ar), 128.87 (Ar), 128.74 (Ar), 127.99 (Ar), 127.63 (Ar), 126.94 (Ar), 126.67 (Ar), 55.05 (CH), 52.46 (CH), 48.96 (CH ₂ NR ₂ ), 36.70 (CH ₂ ), 30.72 (CH ₂ ), 29.91 (CH ₂ ), 29.05 (CH ₂ ), 28.35 (CH ₂ ), 26.96 (CH ₂ ), 25.38 (CH ₂ ), 24.80 (CH ₂ ), 24.01 (CH ₂ ), 23.18 (CH ₂ ), 23.12 (CH ₂ ), 18.78 ( CH ₂ ), September 18 (CH ₂ ), 17.55 (CH ₂ ).

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3311.18 (NH), 2935.13 (Ar), 2100.10 (N₃), 1643.05 (C(O)NH), 1292.01 (Ar), 700.03 (CH₂)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3311.18 (NH), 2935.13 (Ar), 2100.10 (N ₃ ), 1643.05 (C (O) NH), 1292.01 (Ar), 700.03 (CH ₂ )

ESI-HRMS для C₅₀H₆₅ClBrN₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1131.3690, найдено: 1131.3624; m/z рассчитано для [M+Na]⁺ 1152.3476, найдено: 1152.3442.ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₅ ClBrN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1131.3690, found: 1131.3624; m / z calculated for [M + Na] ⁺ 1152.3476, found: 1152.3442.

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-хлор-2-фторбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (74)(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-chloro-2-fluorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6, 12,19,24,27,30-heptaazatriacontane-1,3,7-tricarboxylate (74)

К раствору 70 мг (0,059 ммоль) соединения (53) в 2,7 мл ДХМ добавили 300 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром. В результате было выделено 58 мг (0,055 ммоль) мг целевого соединения, выход 93%.To a solution of 70 mg (0.059 mmol) of compound (53) in 2.7 ml of DCM was added 300 μl of trifluoroacetic acid. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether. As a result, 58 mg (0.055 mmol) mg of the target compound were isolated, yield 93%.

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

8.31 (d, 1Н, J=7.1 Гц, C(O)NH), 8.18 (d, 1H, J=8.3 Гц, C(O)NH), 7,96-7.90 (м, 1Н, C(O)NH), 7,64-7.54 (м, 1Н, C(O)NH), 7,45-7.35 (м, 1Н, Ar), 7.30-7.10 (м, 12Н, Ar), 6,36-6.20 (м, 2H, NH(мочевина)), 4.58-4.43 (м, 2H, ArCH ₂ ), 4.42-4.25 (м, 2Н, СН), 4.12-3.95 (м, 2Н, СН), 3.37-2.83 (м, 12Н, CH₂), 2.74-2.58 (м, 1Н, CH₂), 2.41-2.08 (м, 8Н, CH₂), 1.98-1.85 (м, 1Н, CH₂), 1.76-1.10 (м, 15Н, CH ₂)8.31 (d, 1H, J = 7.1 Hz, C (O) NH), 8.18 (d, 1H, J = 8.3 Hz, C (O) NH), 7.96-7.90 (m, 1H, C (O) NH), 7.64-7.54 (m, 1H, C (O) NH), 7.45-7.35 (m, 1H, Ar), 7.30-7.10 (m, 12H, Ar), 6.36-6.20 ( m, 2H, NH (urea)), 4.58-4.43 (m, 2H, ArC H ₂ ), 4.42-4.25 (m, 2Н, С Н ), 4.12-3.95 (m, 2Н, С Н ), 3.37-2.83 (m, 12H, CH ₂ ), 2.74-2.58 (m, 1H, CH ₂ ), 2.41-2.08 (m, 8H, CH ₂ ), 1.98-1.85 (m, 1H, CH ₂ ), 1.76-1.10 (m , 15H, C H ₂ )

Спектр ЯМР ¹³С (90 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (90 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

176.81 (С(О)ОН), 174.95 (С(О)ОН), 174.61 (C(O)NH), 174.19 (C(O)NH), 173.27 (C(O)NH), 172.02 (C(O)NH), 171.55 (C(O)NH), 171.14 (C(O)NH), 157.70 (C(O) (мочевина)), 138.50 (Ar), 138.42 (Ar), 129.45 (Ar), 128.61 (Ar), 128.50 (Ar), 126.75 (Ar), 126.68 (Ar), 55.36 (СН), 52.59 (СН), 48.57 (СН), 36.29 (CH₂), 32.22 (CH₂), 31.06 (CH₂), 30.34 (CH₂), 29.45 (CH₂), 28.57 (CH₂), 26.65 (CH₂), 25.05 (CH₂)176.81 ( C (O) OH), 174.95 ( C (O) OH), 174.61 ( C (O) NH), 174.19 ( C (O) NH), 173.27 ( C (O) NH), 172.02 ( C (O ) NH), 171.55 ( C (O) NH), 171.14 ( C (O) NH), 157.70 ( C (O) (urea)), 138.50 (Ar), 138.42 (Ar), 129.45 (Ar), 128.61 ( Ar), 128.50 (Ar), 126.75 (Ar), 126.68 (Ar), 55.36 (CH), 52.59 (CH), 48.57 (CH), 36.29 (CH ₂ ), 32.22 (CH ₂ ), 31.06 (CH ₂ ) , 30.34 (CH ₂ ), 29.45 (CH ₂ ), 28.57 (CH ₂ ), 26.65 (CH ₂ ), 25.05 (CH ₂ )

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3313 (NH), 3084 (С-Н_вал), 2932 (Ar), 2098 (N₃), 1726 (C(O)), 1641 (С(O) (мочевина)), 1549 (С(O)), 1290 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3313 (NH), 3084 (С-Н _shaft ), 2932 (Ar), 2098 (N ₃ ), 1726 (C (O)), 1641 (С (O) (urea )), 1549 (C (O)), 1290 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₄ClFN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [M+H]⁺ 1052.4484, найдено: 1052.4484ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₄ ClFN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1052.4484, found: 1052.4484

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-хлор-3-фторбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (75)(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-chloro-3-fluorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6, 12,19,24,27,30-heptaazatriacontane-1,3,7-tricarboxylate (75)

К раствору 80 мг (0,065 ммоль) соединения (54) в 2,7 мл ДХМ добавили 300 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром. В результате было выделено 65 мг (0,062 ммоль) мг целевого соединения, выход 95%.To a solution of 80 mg (0.065 mmol) of compound (54) in 2.7 ml of DCM was added 300 μl of trifluoroacetic acid. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether. As a result, 65 mg (0.062 mmol) mg of the target compound were isolated, yield 95%.

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.43 (уш.с, 3Н, СООН), 8.40-8.27 (m, 1Н, C(O)NH), 8.22-8.07 (m, 1H, C(O)NH), 7.97-7.89 (м, 1H, C(O)NH), 7.84-7.73 (м, 1H, C(O)NH), 7,62-7.52 (м, 1H, Ar), 7.52-7.45 (м, 1H, Ar), 7.30-6.97 (м, 11Н, Ar), 6,36-6.22 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.58-4.43 (м, 2Н, ArCH ₂ ), 4.43-4.20 (м, 2Н, СН), 4.12-3.95 (м, 2Н, СН), 3.30-2.82 (м, 10Н, CH₂), 2.83-2.70 (м, 1H, CH₂), 2.70-2.52 (м, 1H, CH₂), 2.41-2.08 (м, 7Н, CH₂), 1.98-1.85 (м, 1H, CH₂), 1.80-1.11 (м, 16Н, CH ₂)12.43 (br.s, 3H, COOH), 8.40-8.27 (m, 1H, C (O) NH), 8.22-8.07 (m, 1H, C (O) NH), 7.97-7.89 (m, 1H, C (O) NH), 7.84-7.73 (m, 1H, C (O) NH), 7.62-7.52 (m, 1H, Ar), 7.52-7.45 (m, 1H, Ar), 7.30-6.97 (m , 11H, Ar), 6.36-6.22 (m, 2H, NH (urea)), 4.58-4.43 (m, 2H, ArC H ₂ ), 4.43-4.20 (m, 2H, C H ), 4.12-3.95 (m, 2H, C H ), 3.30-2.82 (m, 10H, CH ₂ ), 2.83-2.70 (m, 1H, CH ₂ ), 2.70-2.52 (m, 1H, CH ₂ ), 2.41-2.08 (m , 7H, CH ₂ ), 1.98-1.85 (m, 1H, CH ₂ ), 1.80-1.11 (m, 16H, C H ₂ )

Спектр ЯМР ¹³С (90 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (90 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

174.92 (C(O)NH), 174.62 (C(O)NH), 174.19 (C(O)NH), 173.28 (C(O)NH), 172.66 (C(O)NH), 172.31 (C(O)NH), 172.03 (C(O)NH), 171.55 (C(O)OH), 171.48 (С(О)ОН), 171.32 (С(О)ОН), 171.14 (С(О)ОН), 157.71 (С(O) (мочевина)), 156.33 (С(O) (мочевина)), 138.50 (Ar), 138.42 (Ar), 131.30 (Ar), 130.91 (Ar), 129.62 (Ar), 129.56 (Ar), 129.45 (Ar), 128.61 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 126.74 (Ar), 126.68 (Ar), 125.05 (Ar), 125.02 (Ar), 55.36 (СН), 54.76 (СН), 52.53 (СН), 52.09 (СН), 48.65 (СН), 48.58 (СН), 47.39 (СН), 36.29 (CH₂), 32.29 (CH₂), 32.23 (CH₂), 31.03 (CH₂), 30.34 (CH₂), 29.47 (CH₂), 28.62 (CH₂), 28.22 (CH₂), 27.98 (CH₂), 26.68 (CH₂), 25.10 (CH₂), 24.99 (CH₂), 22.91 (CH₂), 22.74 (CH₂), 15.63 (СН₂)174.92 ( C (O) NH), 174.62 ( C (O) NH), 174.19 ( C (O) NH), 173.28 ( C (O) NH), 172.66 ( C (O) NH), 172.31 ( C (O ) NH), 172.03 ( C (O) NH), 171.55 (C (O) OH), 171.48 (C (O) OH), 171.32 (C (O) OH), 171.14 (C (O) OH), 157.71 ( C (O) (urea)), 156.33 ( C (O) (urea)), 138.50 (Ar), 138.42 (Ar), 131.30 (Ar), 130.91 (Ar), 129.62 (Ar), 129.56 (Ar) , 129.45 (Ar), 128.61 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 126.74 (Ar), 126.68 (Ar), 125.05 (Ar), 125.02 (Ar), 55.36 (CH), 54.76 (CH) , 52.53 (CH), 52.09 (CH), 48.65 (CH), 48.58 (CH), 47.39 (CH), 36.29 (CH ₂ ), 32.29 (CH ₂ ), 32.23 (CH ₂ ), 31.03 (CH ₂ ), 30.34 (CH ₂ ), 29.47 (CH ₂ ), 28.62 (CH ₂ ), 28.22 (CH ₂ ), 27.98 (CH ₂ ), 26.68 (CH ₂ ), 25.10 (CH ₂ ), 24.99 (CH ₂ ), 22.91 ( CH ₂ ), 22.74 (CH ₂ ), 15.63 (CH ₂ )

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3311 (NH), 3086 (С-Н_вал), 2934 (Ar), 2099 (N₃), 1727 (C(O)), 1642 (С(O) (мочевина)), 1554 (С(O)), 1291 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3311 (NH), 3086 (С-Н _shaft ), 2934 (Ar), 2099 (N ₃ ), 1727 (C (O)), 1642 (С (O) (urea )), 1554 (C (O)), 1291 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₄ClFN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1054.4499, найдено: 1054.4503; m/z рассчитано для [М+K]⁺ 1091.4121, найдено: 1091.4088ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₄ ClFN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1054.4499, found: 1054.4503; m / z calculated for [M + K] ⁺ 1091.4121, found: 1091.4088

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25,28-дибензил-12-(4-хлор-3-фторбензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (76)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25,28-dibenzyl-12- (4-chloro-3-fluorobenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6, 12,19,24,27,30-heptaazatriacontane-1,3,7-tricarboxylate (76)

К раствору 217 мг (0,178 ммоль) соединения (55) в 2,7 мл ДХМ добавили 300 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром. В результате было выделено 170 мг (0,161 ммоль) мг целевого соединения, выход 90%.To a solution of 217 mg (0.178 mmol) of compound (55) in 2.7 ml of DCM was added 300 μl of trifluoroacetic acid. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether. As a result, 170 mg (0.161 mmol) mg of the target compound were isolated, yield 90%.

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.44 (уш.с, 3Н, СООН), 8.41-8.27 (м, 1Н, C(O)NH), 8.22-8.05 (м, 1Н, C(O)NH), 7.99-7.89 (м, 1Н, C(O)NH), 7.84-7.73 (м, 1Н, C(O)NH), 7.64-7.52 (м, 1Н, Ar), 7.52-7.43 (м, 1Н, Ar), 7.30-6.97 (м, 11Н, Ar), 6.37-6.22 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.58-4.43 (м, 2Н, ArCH ₂ ), 4.43-4.21 (м, 2Н, СН), 4.13-3.96 (м, 2Н, СН), 3.30-2.82 (м, 10Н, CH₂), 2.80-2.52 (м, 2Н, CH₂), 2.41-2.08 (м, 7Н, CH₂), 1.98-1.80 (м, 1Н, CH₂), 1.79-1.10 (м, 16Н, CH₂)12.44 (br.s, 3H, COOH), 8.41-8.27 (m, 1H, C (O) NH), 8.22-8.05 (m, 1H, C (O) NH), 7.99-7.89 (m, 1H, C (O) NH), 7.84-7.73 (m, 1H, C (O) NH), 7.64-7.52 (m, 1H, Ar), 7.52-7.43 (m, 1H, Ar), 7.30-6.97 (m, 11H , Ar), 6.37-6.22 (m, 2H, NH (urea)), 4.58-4.43 (m, 2H, ArC H ₂ ), 4.43-4.21 (m, 2H, C H ), 4.13-3.96 (m, 2H , С Н ), 3.30-2.82 (m, 10Н, CH ₂ ), 2.80-2.52 (m, 2Н, CH ₂ ), 2.41-2.08 (m, 7Н, CH ₂ ), 1.98-1.80 (m, 1Н, CH ₂ ), 1.79-1.10 (m, 16H, CH ₂ )

Спектр ЯМР ¹³С (90 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (90 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

177.46 (С(О)ОН), 174.92 (С(О)ОН), 174.63 (C(O)NH), 174.19 (C(O)NH), 172.01 (C(O)NH), 171.48 (C(O)NH), 171.13 (C(O)NH), 157.69 (C(O) (мочевина)), 138.42 (Ar), 130.92 (Ar), 129.62 (Ar), 129.57 (Ar), 129.45 (Ar), 128.61 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 126.74 (Ar), 125.05 (Ar), 52.07 (СН), 48.64 (СН), 48.57 (СН), 47.34 (СН), 36.29 (CH₂), 31.07 (CH₂), 30.34 (CH₂), 28.62 (CH₂), 27.97 (CH₂), 25.09 (CH₂), 22.74 (CH₂), 20.98 (CH₂)177.46 (C (O) OH), 174.92 (C (O) OH), 174.63 ( C (O) NH), 174.19 ( C (O) NH), 172.01 ( C (O) NH), 171.48 ( C (O ) NH), 171.13 ( C (O) NH), 157.69 ( C (O) (urea)), 138.42 (Ar), 130.92 (Ar), 129.62 (Ar), 129.57 (Ar), 129.45 (Ar), 128.61 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 126.74 (Ar), 125.05 (Ar), 52.07 (CH), 48.64 (CH), 48.57 (CH), 47.34 (CH), 36.29 (CH ₂ ), 31.07 (CH ₂ ), 30.34 (CH ₂ ), 28.62 (CH ₂ ), 27.97 (CH ₂ ), 25.09 (CH ₂ ), 22.74 (CH ₂ ), 20.98 (CH ₂ )

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3314 (NH), 3084 (С-Н_вал), 2932 (Ar), 2099 (N₃), 1727 (C(O)), 1642 (С(O) (мочевина)), 1549 (С(O)), 1291 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3314 (NH), 3084 (С-Н _shaft ), 2932 (Ar), 2099 (N ₃ ), 1727 (C (O)), 1642 (С (O) (urea )), 1549 (C (O)), 1291 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₄ClFN₁₀O₁₂: m/z рассчитано для [M+H]⁺1051.4450, найдено: 1051.4406ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₄ ClFN ₁₀ O ₁₂ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1051.4450, found: 1051.4406

(3S,7S,25S,28S)-33-азидо-25-бензил-12-(4-хлор-3-фторбензил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (77)(3S, 7S, 25S, 28S) -33-azido-25-benzyl-12- (4-chloro-3-fluorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29- hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatriacontane-1,3,7-tricarboxylate (77)

К раствору 63 мг (0,051 ммоль) соединения (56) в 2,7 мл ДХМ добавили 300 мкл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивали 16 ч. Далее удалили растворитель при пониженном давлении и переупарили с ДХМ трижды. Продукт высадили эфиром. В результате было выделено 43 мг (0,040 ммоль) мг целевого соединения, выход 78%.To a solution of 63 mg (0.051 mmol) of compound (56) in 2.7 ml of DCM was added 300 μl of trifluoroacetic acid. The mixture was stirred for 16 hours. Next, the solvent was removed under reduced pressure and re-evaporated with DCM three times. The product was landed with ether. As a result, 43 mg (0.040 mmol) mg of the target compound were isolated, 78% yield.

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

8.41-8.25 (м, 1Н, C(O)NH), 8.21-8.02 (м, 1Н, C(O)NH), 7.99-7.87 (м, 1Н, C(O)NH), 7.84-7.69 (м, 1Н, C(O)NH), 7.65-7.43 (м, 2Н, Ar), 7.30-6.90 (м, 10Н, Ar), 6.69-6.53 (м, 2Н, Ar), 6.42-6.19 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.58-4.40 (м, 2Н, ArCH ₂ ), 4.40-4.21 (м, 2Н, СН), 4.13-3.96 (м, 2Н, СН), 3.31-2.52 (м, 14Н, CH₂), 2.41-1.98 (м, 8Н, CH₂), 1.98-1.80 (м, 1Н, CH₂), 1.79-1.10 (м, 17Н, CH ₂)8.41-8.25 (m, 1H, C (O) NH), 8.21-8.02 (m, 1H, C (O) NH), 7.99-7.87 (m, 1H, C (O) NH), 7.84-7.69 (m , 1H, C (O) NH), 7.65-7.43 (m, 2H, Ar), 7.30-6.90 (m, 10H, Ar), 6.69-6.53 (m, 2H, Ar), 6.42-6.19 (m, 2H , NH (urea)), 4.58-4.40 (m, 2Н, ArC H ₂ ), 4.40-4.21 (m, 2Н, С Н ), 4.13-3.96 (m, 2Н, С Н ), 3.31-2.52 (m, 14H, CH ₂ ), 2.41-1.98 (m, 8H, CH ₂ ), 1.98-1.80 (m, 1H, CH ₂ ), 1.79-1.10 (m, 17H, C H ₂ )

Спектр ЯМР ¹³С (90 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (90 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

174.91 (C(O)NH), 174.62 (C(O)NH), 174.18 (C(O)NH), 171.48 (C(O)NH), 171.30 (C(O)NH), 157.72 (C(O) (мочевина)), 156.26 (C(O) (мочевина)), 131.29 (Ar), 130.91 (Ar), 130.53 (Ar), 130.37 (Ar), 129.60 (Ar), 129.47 (Ar), 128.50 (Ar), 128.42 (Ar), 126.68 (Ar), 126.60 (Ar), 125.01 (Ar), 119.59 (Ar), 115.40 (Ar), 115.28 (Ar), 52.08 (СН), 48.67 (СН), 48.59 (СН), 47.40 (СН), 36.27 (CH₂), 32.30 (CH₂), 32.22 (CH₂), 30.34 (CH₂), 28.64 (CH₂), 28.20 (CH₂), 27.96 (CH₂), 25.09 (CH₂), 15.62 CH₂)174.91 ( C (O) NH), 174.62 ( C (O) NH), 174.18 ( C (O) NH), 171.48 ( C (O) NH), 171.30 ( C (O) NH), 157.72 ( C (O ) (urea)), 156.26 ( C (O) (urea)), 131.29 (Ar), 130.91 (Ar), 130.53 (Ar), 130.37 (Ar), 129.60 (Ar), 129.47 (Ar), 128.50 (Ar ), 128.42 (Ar), 126.68 (Ar), 126.60 (Ar), 125.01 (Ar), 119.59 (Ar), 115.40 (Ar), 115.28 (Ar), 52.08 (CH), 48.67 (CH), 48.59 (CH ), 47.40 (CH), 36.27 (CH ₂ ), 32.30 (CH ₂ ), 32.22 (CH ₂ ), 30.34 (CH ₂ ), 28.64 (CH ₂ ), 28.20 (CH ₂ ), 27.96 (CH ₂ ), 25.09 (CH ₂ ), 15.62 CH ₂ )

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3310 (NH), 3086 (С-Н_вал), 2933 (Ar), 2098 (N₃), 1726 (C(O)), 1643 (C(O) (мочевина)), 1555 (C(O)), 1290 (Ar)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3310 (NH), 3086 (CH _shaft ), 2933 (Ar), 2098 (N ₃ ), 1726 (C (O)), 1643 (C (O) (urea )), 1555 (C (O)), 1290 (Ar)

ESI-HRMS для C₅₀H₆₄ClFN₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1070.4404, найдено: 1070.4406ESI-HRMS for C ₅₀ H ₆₄ ClFN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1070.4404, found: 1070.4406

(3S,7S,25R,28R)-33-азидо-25-бензил-12-(4-хлор-3-фторбензил)-28-(4-гидроксобензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (78)(3S, 7S, 25R, 28R) -33-azido-25-benzyl-12- (4-chloro-3-fluorobenzyl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29- hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (78)

В 4 мл 10% (по объему) раствора трифторуксусной кислоты в DCM растворили соединение (57) (72 мг 0.058 ммоль) и перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Растворитель упарили при пониженном давлении. Добавили 4 мл DCM с последующим упариванием для удаления трифторуксусной кислоты, процедуру повторили 5 раз. К полученному маслянистому осадку добавили 5 мл диэтилового эфира, в результате чего выделился белый твердый продукт. Эфир декантировали, процедуру повторили еще 2 раза. Масса полученного вещества 56 мг, выход 89%.Compound (57) (72 mg 0.058 mmol) was dissolved in 4 ml of a 10% (by volume) solution of trifluoroacetic acid in DCM and stirred for 16 hours at room temperature. The solvent was evaporated under reduced pressure. Added 4 ml of DCM, followed by evaporation to remove trifluoroacetic acid, the procedure was repeated 5 times. 5 ml of diethyl ether was added to the resulting oily precipitate, whereupon a white solid was isolated. The ether was decanted, the procedure was repeated 2 more times. The mass of the obtained substance 56 mg, yield 89%.

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.42 (уш.с, 3Н, СООН), 9.15 (с, 1Н, C(O)NH), 8.28 (с, 1Н, C(O)NH), 8.09 (дд, 1Н, C(O)NH), 7.90-7.78 (м, 2Н, C(O)NH + ArH), 7.55-7.79 (м, 1Н, C(O)NH + ArH), 7.20-6.99 (м, 12Н, C(O)NH + ArH), 6.30 (м, 2Н, NH(мочевина)), 4.53 (с, 1Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.45 (с, 1Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.08 (м, 1Н, СН, СН), 3.51 (м, 9Н, CH₂), 4.39-4.27 (м, 2Н, CH₂Ar), 4.08 (м, 2Н, СН, СН), 3.51 (м, 9Н, CH₂), 3.26-2.99 (м, 16Н, CH₂), 2.22 (м, 8Н, CH₂), 1.90 (с, 1Н, CH₂), 1.24 (м, 18Н, CH ₂CH).12.42 (br s, 3H, COOH), 9.15 (s, 1H, C (O) NH), 8.28 (s, 1H, C (O) NH), 8.09 (dd, 1H, C (O) NH), 7.90-7.78 (m, 2H, C (O) NH + ArH), 7.55-7.79 (m, 1H, C (O) NH + ArH), 7.20-6.99 (m, 12H, C (O) NH + ArH) 6.30 (m, 2H, NH (urea)), 4.53 (s, 1H, PhC H ₂ NC (O)), 4.45 (s, 1H, PhC H ₂ NC (O)), 4.08 (m, 1H, CH , CH), 3.51 (m, 9H, CH ₂ ), 4.39-4.27 (m, 2H, CH ₂ Ar), 4.08 (m, 2H, CH, CH), 3.51 (m, 9H, CH ₂ ), 3.26- 2.99 (m, 16H, CH ₂ ), 2.22 (m, 8H, CH ₂ ), 1.90 (s, 1H, CH ₂ ), 1.24 (m, 18H, C H ₂ CH).

Спектр ЯМР ¹³С (101 МГц, ДМСО-d6, м.д.): ¹³ C NMR spectrum (101 MHz, DMSO-d6, ppm):

208.22 (СООН), 204.88 (СООН), 175.27 (C(O)NR₂), 174.98 (C(O)NR₂), 174.56 (C(O)NR₂), 171.85 (PhCH ₂ NC(O)), 171.68 (PhCH ₂ NC(O)), 158.09 (NHC(O)NH), 138.80 (Ar), 131.66 (Ar), 131.28 (Ar), 130.90 (Ar), 130.74 (Ar), 130.40 (Ar), 129.96 (Ar), 128.83 (Ar), 129.31 (Ar), 128.87 (Ar), 128.79 (Ar), 125.37 (Ar), 116.60 (Ar), 55.72 (СН), 55.46 (СН), 49.04 (CH₂NR₂), 48.96 (CH₂Ar), 47.76 (CH₂Ar), 36.55 (CH₂), 32.67 (CH₂), 32.58 (CH₂), 31.51 (CH₂), 31.48 (CH₂), 30.72 (CH₂), 29.88 (CH₂), 29.84 (CH₂), 29.79 (CH₂), 29.02 (CH₂), 28.96 (CH₂), 31.51 (CH₂), 28.34 (CH₂), 27.05 (CH₂), 25.45 (CH₂), 23.11 (CH₂), 17.53 (CH₂).208.22 (COOH), 204.88 (COOH), 175.27 ( C (O) NR ₂ ), 174.98 ( C (O) NR ₂ ), 174.56 ( C (O) NR ₂ ), 171.85 (PhC H ₂ NC (O)) , 171.68 (PhC H ₂ NC (O)), 158.09 (NH C (O) NH), 138.80 (Ar), 131.66 (Ar), 131.28 (Ar), 130.90 (Ar), 130.74 (Ar), 130.40 (Ar ), 129.96 (Ar), 128.83 (Ar), 129.31 (Ar), 128.87 (Ar), 128.79 (Ar), 125.37 (Ar), 116.60 (Ar), 55.72 (CH), 55.46 (CH), 49.04 (CH ₂ NR ₂ ), 48.96 (CH ₂ Ar), 47.76 (CH ₂ Ar), 36.55 (CH ₂ ), 32.67 (CH ₂ ), 32.58 (CH ₂ ), 31.51 (CH ₂ ), 31.48 (CH ₂ ), 30.72 (CH ₂ ), 29.88 (CH ₂ ), 29.84 (CH ₂ ), 29.79 (CH ₂ ), 29.02 (CH ₂ ), 28.96 (CH ₂ ), 31.51 (CH ₂ ), 28.34 (CH ₂ ), 27.05 (CH ₂ ), 25.45 (CH ₂ ), 23.11 (CH ₂ ), 17.53 (CH ₂ ).

ИК спектр (ZnSe, см^-1): 3312 (NH), 2938 (Ar), 2099 (N₃), 1646 (C(O) (мочевина)), 1293 (Ar), 699 (CH₂)IR spectrum (ZnSe, cm ^-1 ): 3312 (NH), 2938 (Ar), 2099 (N ₃ ), 1646 (C (O) (urea)), 1293 (Ar), 699 (CH ₂ )

ESI-LCMS для C₅₀H₆₄ClFN₁₀O₁₃: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1067.55, найдено: 1067.35ESI-LCMS for C ₅₀ H ₆₄ ClFN ₁₀ O ₁₃ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1067.55, found: 1067.35

Примеры синтеза конъюгатов.Examples of the synthesis of conjugates.

(3S,7S,25S,28S)-25-бензил-12-(3-хлорбензил)-33-(4-((3',6'-дигидрокси-3-оксо-3H-спиро[изобензофуран-1,9'-ксантен]-5-илкарбоксамидо)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)-28-(4-гидроксибензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоновая кислота (79).(3S, 7S, 25S, 28S) -25-benzyl-12- (3-chlorobenzyl) -33- (4 - ((3 ', 6'-dihydroxy-3-oxo-3H-spiro [isobenzofuran-1.9 '-xanthene] -5-ylcarboxamido) methyl) -1H-1,2,3-triazol-1-yl) -28- (4-hydroxybenzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4 , 6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylic acid (79).

Соединение (70) (32 мг, 0,03 мммоль) растворяли в 5 мл ДМФА и 5 мл воды. Колбу заполняли аргоном. Далее добавляли Fam-5 алкин (12 мг, 0,033 мкмоль), аскорбат натрия (2 мг, 0,012 мкмоль) и пентагидрат сульфата меди (3 мг, 0,012 мкмоль). Смесь перемешивали 24 часа. Далее упаривали растворитель. Дальнейшую очистку проводили с помощью метода обращенной фазовой хроматографии: Puriflash 15C18HP-F0012, система вода/ацетонитрил, от 5% ацетонитрила до 100% ацетонитрила в течение 25 минут, далее 5 минут промывали метанолом, скорость потока - 20 мл/мин. Таким образом, соединение (79) было выделено в виде желтого аморфного порошка, выход составил 35 мг (80%).Compound (70) (32 mg, 0.03 mmol) was dissolved in 5 ml of DMF and 5 ml of water. The flask was filled with argon. Then Fam-5 Alkin (12 mg, 0.033 μmol), sodium ascorbate (2 mg, 0.012 μmol) and copper sulfate pentahydrate copper (3 mg, 0.012 μmol) were added. The mixture was stirred for 24 hours. Then the solvent was evaporated. Further purification was carried out using the reverse phase chromatography method: Puriflash 15C18HP-F0012, water / acetonitrile system, from 5% acetonitrile to 100% acetonitrile for 25 minutes, then washed with methanol for 5 minutes, flow rate 20 ml / min. Thus, compound (79) was isolated as a yellow amorphous powder, the yield was 35 mg (80%).

Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, DMSO-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR Spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.44 (уш.с, 3Н, СООН), 10.17 (уш. с, 1Н, СОН), 9.38 (с, 1Н, C(O)NH), 8.48 (с, 1Н, C(O)NH), 8.30-8.24 (м, 2Н, C(O)NH) 8.10-8.02 (м, 3Н, C(O)NH), 7.77-7.65 (м, 2Н, C(O)NH + ArH), 7.65-7.64 (м, 2Н, C(O)NH + ArH), 7.35-7.30 (м, 5Н, C(O)NH + ArH), 7.18-7.15 (м, 3Н, C(O)NH + ArH), 4.67-4.54 (м, 5Н, C(O)NH + ArH), 4.31-4.29 (м, 2Н, NH(urea)), 4.55-4.45 (м, 4Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.28 (с, 3Н, PhCH ₂ NC(O)), 4.07-4.05 (м, 3Н, СН, СН), 3.17-3.16 (м, 3Н, CH₂), 3.00-2.98 (м, 6Н, CH₂), 2.70-2.65 (м, 3Н, CH₂), 2.23-2.19 (м, 8Н, CH₂), 1.91-1.88 (м, 3Н, CH₂), 1.49-1.10 (м, 11Н, CH₂) (Рисунок 4.8).12.44 (br.s, 3H, COOH), 10.17 (br.s, 1H, СОН), 9.38 (s, 1H, C (O) NH), 8.48 (s, 1H, C (O) NH), 8.30- 8.24 (m, 2H, C (O) NH) 8.10-8.02 (m, 3H, C (O) NH), 7.77-7.65 (m, 2H, C (O) NH + ArH), 7.65-7.64 (m, 2H, C (O) NH + ArH), 7.35-7.30 (m, 5H, C (O) NH + ArH), 7.18-7.15 (m, 3H, C (O) NH + ArH), 4.67-4.54 (m 5H, C (O) NH + ArH), 4.31-4.29 (m, 2H, NH (urea)), 4.55-4.45 (m, 4H, PhC H ₂ NC (O)), 4.28 (s, 3H, PhC H ₂ NC (O)), 4.07-4.05 (m, 3H, CH, CH), 3.17-3.16 (m, 3H, CH ₂ ), 3.00-2.98 (m, 6H, CH ₂ ), 2.70-2.65 (m , 3H, CH ₂ ), 2.23-2.19 (m, 8H, CH ₂ ), 1.91-1.88 (m, 3H, CH ₂ ), 1.49-1.10 (m, 11H, CH ₂ ) (Figure 4.8).

ESI-LCMS для C₇₄H₈₀ClN₁₁O₁₉: m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1462.94; найдено: 1462.55ESI-LCMS for C ₇₄ H ₈₀ ClN ₁₁ O ₁₉ : m / z calculated for [M + H] ⁺ 1462.94; found: 1462.55

(3S,7S,25S,28S)-25,28-дибензил-12-(3-хлорбензил)-33-(4-((3',6'-дигидрокси-3-оксо-3Н-спиро[изобензофуран-1,9'-ксантен]-5-илкарбоксамидо)метил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоновая кислота (80)(3S, 7S, 25S, 28S) -25,28-dibenzyl-12- (3-chlorobenzyl) -33- (4 - ((3 ', 6'-dihydroxy-3-oxo-3H-spiro [isobenzofuran-1 , 9'-xanthene] -5-ylcarboxamido) methyl) -1H-1,2,3-triazol-1-yl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19 , 24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylic acid (80)

Соединение (74) (33 мг, 0,03 мммоль) растворяли в 5 мл ДМФА и 5 мл воды. Колбу заполняли аргоном. Далее добавляли Fam-5 алкин (12 мг, 0,03 мкмоль), аскорбат натрия (2 мг, 0,012 мкмоль) и пентагидрат сульфата меди (3 мг, 0,012 мкмоль). Смесь перемешивать 24 часа. Далее упарить растворитель. Дальнейшую очистку проводить с помощью метода обращенной фазовой хроматографии: Puriflash 15C18HP-F0012, система вода/ацетонитрил, от 5% ацетонитрила до 100% ацетонитрила в течение 25 минут, далее 5 минут промывка метанолом, скорость потока - 20 мл/мин. Таким образом, соединение (79) было выделено в виде желтого аморфного порошка, выход составил 34 мг (75%).Compound (74) (33 mg, 0.03 mmol) was dissolved in 5 ml of DMF and 5 ml of water. The flask was filled with argon. Then Fam-5 Alkin (12 mg, 0.03 μmol), sodium ascorbate (2 mg, 0.012 μmol) and copper sulfate pentahydrate copper (3 mg, 0.012 μmol) were added. Stir the mixture for 24 hours. Next, evaporate the solvent. Further purification is carried out using the reverse phase chromatography method: Puriflash 15C18HP-F0012, water / acetonitrile system, from 5% acetonitrile to 100% acetonitrile for 25 minutes, then 5 minutes washing with methanol, flow rate 20 ml / min. Thus, compound (79) was isolated as a yellow amorphous powder, the yield was 34 mg (75%).

Образование конъюгата с лекарственным соединением - доцетакселем (DOCETAXEL). Образование конъюгата с заявляемьм средством представлено на схеме на фиг. 18 и 19.The formation of a conjugate with a drug compound - docetaxel (DOCETAXEL). The formation of the conjugate with the inventive agent is shown in the diagram of FIG. 18 and 19.

(2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-12b-ацетокси-9-(((2R,3S)-3-(трет-бутоксикарбонил)амино)-2-(гекс-5-иноилокси)-3-фенилпропанол)окси)-4,6,11-тригидрокси-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-2а,3,4,4а,5,6,9,10,11,12,12а,12b-додесагидро-1Н-7,11-метаноциклодека[3,4]бензо[1,2-b]октет-12-ил бензоат (81)(2aR, 4S, 4aS, 6R, 9S, 11S, 12S, 12aR, 12bS) -12b-acetoxy-9 - (((2R, 3S) -3- (tert-butoxycarbonyl) amino) -2- (hex-5 -inoyloxy) -3-phenylpropanol) oxy) -4,6,11-trihydroxy-4a, 8,13,13-tetramethyl-5-oxo-2a, 3,4,4a, 5,6,9,10,11 , 12,12a, 12b-dodesahydro-1H-7,11-methanocyclodec [3,4] benzo [1,2-b] octet-12-yl benzoate (81)

Раствор гексиновой кислоты (114 мг; 1.392 ммоль), доцетаксела (750 мг; 0.932 ммоль) и DMAP (5 мг; 0.044 ммоль) в 50 мл DCM охлаждают до 0°С на ледяной бане. После этого прикалывают DIC 215 мкл; 1.393 ммоль. Реакционную смесь выдерживают 2 часа при 0°С, затем оставляют перемешиваться при комнатной температуре на сутки. После чего упаривают. Очистку проводили методом колоночной хроматографии (система этилацетат : гексан, градиент от 5% до 100% этилацетата). В результате получили 487 мг целевого продукта (81), выход 38%.A solution of hexinic acid (114 mg; 1.392 mmol), docetaxel (750 mg; 0.932 mmol) and DMAP (5 mg; 0.044 mmol) in 50 ml of DCM was cooled to 0 ° C in an ice bath. DIC 215 μl was then pinned; 1.393 mmol. The reaction mixture was kept for 2 hours at 0 ° C, then left to mix at room temperature for a day. Then evaporated. Purification was performed by column chromatography (ethyl acetate: hexane system, gradient from 5% to 100% ethyl acetate). The result was 487 mg of the target product (81), yield 38%.

(3S,7S,25R,28S)-33-(4-(4-(((2R,3S)-l-(((2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-12b-ацетокси-12-(бензилокси)-4,6,11-тригидрокси-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-2а,3,4,4а,5,6,9,10,11,12,12а,12b-додекагидро-1Н-7,11-метаноциклодека[3,4]бензол[1,2-b]оксет-9-ил)окси)-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)окси)-4-оксобутил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)-12,25,28-трибензил-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (82)(3S, 7S, 25R, 28S) -33- (4- (4 - (((2R, 3S) -l - (((2aR, 4S, 4aS, 6R, 9S, 11S, 12S, 12aR, 12bS) - 12b-acetoxy-12- (benzyloxy) -4,6,11-trihydroxy-4a, 8,13,13-tetramethyl-5-oxo-2a, 3,4,4a, 5,6,9,10,11, 12,12a, 12b-dodecahydro-1H-7,11-methanocyclodec [3,4] benzene [1,2-b] oxet-9-yl) oxy) -3 - ((tert-butoxycarbonyl) amino) -1- oxo-3-phenylpropan-2-yl) oxy) -4-oxobutyl) -1H-1,2,3-triazol-1-yl) -12,25,28-tribenzyl-5,13,20,23,26 , 29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (82)

Модифицированный доцетаксел (81) (22 мг; 0.024 ммоль) растворили в 2 мл DMF, добавили соединение (59) (16 мг 0.016 ммоль) и 0,4 мл воды. Систему продули аргоном. Далее к расвору добавили раствор солей аскорбата натрия 2,5 мг 0.0128 ммоль и сульфата меди 1,5 мг; 0.0064. (строго в данной последовательности). Оставили на сутки при перемешивании. Раствор упарили при пониженном давлении. Полученную маслянистую фракцию далее очищали при помощи препаративной обращенно-фазовой хроматографии. Масса полученного вещества 11 мг, выход 90%.Modified docetaxel (81) (22 mg; 0.024 mmol) was dissolved in 2 ml of DMF, compound (59) (16 mg 0.016 mmol) and 0.4 ml of water were added. The system was purged with argon. Next, a solution of salts of sodium ascorbate 2.5 mg and 0.0128 mmol and copper sulfate 1.5 mg was added to the solution; 0.0064. (strictly in this sequence). Left for a day with stirring. The solution was evaporated under reduced pressure. The resulting oily fraction was further purified by preparative reverse phase chromatography. The mass of the obtained substance is 11 mg, yield 90%.

Масс-спектр ESI-MS для C₉₉H₁₂₅N₁₁O₂₇ ESI-MS mass spectrum for C ₉₉ H ₁₂₅ N ₁₁ O ₂₇

m/z рассчитано для [М+Н]⁺ 1901.11; найдено: 1902.00 (фиг. 15)m / z calculated for [M + H] ⁺ 1901.11; found: 1902.00 (Fig. 15)

(3S,7S,25R,28S)-33-(4-(4-(((2R,3S)-1-(((2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-12b-ацетокси-12-(бензилокси)-4,6,11-тригидрокси-4а,8,13,13-тетраметил-5-оксо-2а,3,4,4а,5,6,9,10,11,12,12а,12b-додекагидро-1Н-7,11-метаноциклодека[3,4]бензо[1,2-b]оксе-9-ил)окси)-3-((трет-бутоксикарбонил)амино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)оху)-4-оксобутил)-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)-25,28-дибензил-12-(4-хлоро-3-фтор6ензил)-5,13,20,23,26,29-гексаоксо-4,6,12,19,24,27,30-гептаазатритриаконтан-1,3,7-трикарбоксилат (83)(3S, 7S, 25R, 28S) -33- (4- (4 - (((2R, 3S) -1 - (((2aR, 4S, 4aS, 6R, 9S, 11S, 12S, 12aR, 12bS) - 12b-acetoxy-12- (benzyloxy) -4,6,11-trihydroxy-4a, 8,13,13-tetramethyl-5-oxo-2a, 3,4,4a, 5,6,9,10,11, 12,12a, 12b-dodecahydro-1H-7,11-methanocyclodec [3,4] benzo [1,2-b] ox-9-yl) oxy) -3 - ((tert-butoxycarbonyl) amino) -1- oxo-3-phenylpropan-2-yl) oxy) -4-oxobutyl) -1H-1,2,3-triazol-1-yl) -25,28-dibenzyl-12- (4-chloro-3-fluoro6enzyl) -5,13,20,23,26,29-hexaoxo-4,6,12,19,24,27,30-heptaazatrite triacontane-1,3,7-tricarboxylate (83)

Модифицированный доцетаксел (81) (160 мг; 0.177 ммоль) растворили в 10 мл DMF, добавили соединение (75) (155 мг 0.147 ммоль) и 3 мл воды. Систему продули аргоном. Далее к раствору добавили раствор солей аскорбата натрия 23 мг и сульфата меди 15 мг. Оставили на сутки при перемешивании. Раствор упарили при пониженном давлении. Полученную маслянистую фракцию далее очищали при помощи препаративной обращенно-фазовой хроматографии. Масса полученного вещества 155 мг, выход 90%.Modified docetaxel (81) (160 mg; 0.177 mmol) was dissolved in 10 ml of DMF, compound (75) (155 mg 0.147 mmol) and 3 ml of water were added. The system was purged with argon. Next, a solution of salts of sodium ascorbate 23 mg and copper sulfate 15 mg was added to the solution. Left for a day with stirring. The solution was evaporated under reduced pressure. The resulting oily fraction was further purified by preparative reverse phase chromatography. The mass of the obtained substance is 155 mg, yield 90%.

Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.): ¹ H NMR spectrum (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm):

12.50 (с, 3Н, СООН), 7.00-8.51 (м, 2Н, NH+Ar), 6.23-6.40 (м, 2Н, NH), 5.70-5.88 (м, 2Н, СН), 5.38 (д, J=7.1 Гц, 1Н, CHOC(O)Ph), 4.95-5,18 (м, 4Н), 4.75-4.95 (м, 2Н), 4.15-4.65 (м, 7Н), 3.92-4.15 (м, 5Н), 3.61 (д, J=6.8 Гц, 1Н, R₃CH), 2.85-3.23 (м, 9Н), 2.58-2.85 (м, 4Н, CH₂), 2.13-2.41 (м, 12Н, CH₂), 1.79-1.99 (м, 6Н, CH₂), 1.58-1.75 (м, 6Н, CH₂+СН₃), 1.43-1.58 (м, 8Н, CH₂+СН₃), 1.28-1.42 (м, 11Н, CH₂+СН₃), 1.08-1.27 (м, 6Н, CH₂+СН₃), 0.96 (с, 6Н, СН₃), (фиг. 16-17).12.50 (s, 3H, COOH), 7.00-8.51 (m, 2H, NH + Ar), 6.23-6.40 (m, 2H, NH), 5.70-5.88 (m, 2H, CH), 5.38 (d, J = 7.1 Hz, 1H, CHOC (O) Ph), 4.95-5.18 (m, 4H), 4.75-4.95 (m, 2H), 4.15-4.65 (m, 7H), 3.92-4.15 (m, 5H), 3.61 (d, J = 6.8 Hz, 1H, R ₃ CH), 2.85-3.23 (m, 9H), 2.58-2.85 (m, 4H, CH ₂ ), 2.13-2.41 (m, 12H, CH ₂ ), 1.79 -1.99 (m, 6H, CH ₂ ), 1.58-1.75 (m, 6H, CH ₂ + CH ₃ ), 1.43-1.58 (m, 8H, CH ₂ + CH ₃ ), 1.28-1.42 (m, 11H, CH ₂ + CH ₃ ), 1.08-1.27 (m, 6H, CH ₂ + CH ₃ ), 0.96 (s, 6H, CH ₃ ), (Figs. 16-17).

Масс-спектр ESI-MS для C₉₉H₁₂₃ClFN₁₁O₂₇ ESI-MS mass spectrum for C ₉₉ H ₁₂₃ ClFN ₁₁ O ₂₇

m/z рассчитано для [М+Н]⁺1952.83, найдено: 1952.90m / z calculated for [M + H] ⁺ 1952.83, found: 1952.90

Биологические испытания.Biological tests.

Использованные клеточные линииUsed cell lines

LNCaP - андроген-чувствительная клеточная линия аденокарциномы человека, являются адгерентными эпителиальными клетками, растут в виде агрегатов и одиночных клеток. ПСМА-положительные.LNCaP - androgen-sensitive cell line of human adenocarcinoma, are adherent epithelial cells, grow in the form of aggregates and single cells. PSMA-positive.

Клетки линии LNCaP культивировались в среде RPMI с 10% FBS (Gibco), 1xGlutamax (Gibco) и 1x смесью пенициллин-стрептомицин (Gibco).LNCaP cells were cultured in RPMI medium with 10% FBS (Gibco), 1xGlutamax (Gibco) and 1x penicillin-streptomycin (Gibco).

Получение ПСМА-содержащего клеточного экстракта.Obtaining PSMA-containing cell extract.

Для суспендирования клеток с 25 см² флакона убирали культуральную среду, промывали клетки буфером PBS и инкубировали 5 минут с 0,25% трипсином (1 мл). Трипсин инактивировали полной культуральной средой (2 мл), промывали PBS, переносили 10⁶ клеток в пробирку и добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,5% Triton Х-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1x Proteinase Inhibition cocktail). Суспензию инкубировали 30 минут во льду и обрабатывали ультразвуком (7 раз по 7 сек с интервалами 20-30 сек) во льду во избежание перегрева. Центрифугировали 10 мин 1000g на 4°С и надосадочный раствор использовали в дальнейшем анализе.To suspend cells from a 25 cm ² vial, the culture medium was removed, the cells were washed with PBS buffer and incubated for 5 minutes with 0.25% trypsin (1 ml). Trypsin was inactivated with complete culture medium (2 ml), washed with PBS, transferred to 10 ⁶ cells per tube and 500 μl of lysis buffer (0.5% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1x Proteinase Inhibition was added cocktail). The suspension was incubated for 30 minutes in ice and sonicated (7 times for 7 seconds at intervals of 20-30 seconds) in ice to avoid overheating. Centrifuged for 10 min 1000g at 4 ° C and the supernatant was used in further analysis.

Протокол проведения измерения активности ПСМА.Protocol for measuring PSMA activity.

Анализ ингибирования препаратами ПСМА проводился по нерадиоактивному протоколу с детекцией высвобождаемого в ходе реакции глутамата. Экстракт клеток линии LNCaP (10 μL) смешивался с 2 μL препарата соответствующего разведения. Для первичного тестирования использовалась серия разведении препаратов 2 нМ-100 мкМ с шагом разведения 3-5 раз. К полученной смеси добавлялся 1 μL 100 μМ раствора NAAG. Полученная смесь инкубировалась 2 часа при 37°С. После инкубации смесь разводилась вдвое реакционным буфером (13 μL) из набора Amplex Red Glutamic Acid Kit (Molecular Probes Inc., Eugene) и добавлялась многокомпонентная реакционная смесь для детекции глутамата, приготовленная в соответствии с протоколом производителя (26 μl). Рабочий раствор Amplex Red: 5 мкл Amplex® Red reagent stock solution, 1,25 мкл HRP stock solution, 8 мкл L-glutamate oxidase, 2,5 мкл L-glutamate-pyruvate transaminase, 0,5 мкл L-alanine, 483 мкл 1X Reaction Buffer. Проводилась инкубация 1 час при 37°С. Флуоресценция резоруфина, полученного в результате сопряженных реакций глутамат-детектирующего набора детектировалась на планшетном мультидетекторе VICTORX5 (Perkin Elmer Inc.) при длине возбуждения 555 нм и детекции при 580 нм. В качестве контроля эндогенного уровня глутамата с заменой раствора NAAG на воду.Analysis of inhibition by PSMA was carried out according to a non-radioactive protocol with the detection of glutamate released during the reaction. LNCaP cell extract (10 μL) was mixed with 2 μL of the appropriate dilution preparation. For initial testing, a series of dilution of preparations of 2 nM-100 μM with a dilution step of 3-5 times was used. To the resulting mixture was added 1 μL of 100 μM NAAG solution. The resulting mixture was incubated for 2 hours at 37 ° C. After incubation, the mixture was diluted twice with the reaction buffer (13 μL) from the Amplex Red Glutamic Acid Kit (Molecular Probes Inc., Eugene) and a multicomponent glutamate detection reaction mixture prepared according to the manufacturer's protocol (26 μl) was added. Amplex Red stock solution: 5 μl Amplex® Red reagent stock solution, 1.25 μl HRP stock solution, 8 μl L-glutamate oxidase, 2.5 μl L-glutamate-pyruvate transaminase, 0.5 μl L-alanine, 483 μl 1X Reaction Buffer. Conducted an incubation of 1 hour at 37 ° C. The fluorescence of resorufin obtained as a result of the conjugate reactions of the glutamate detection kit was detected on a VICTORX5 plate multidetector (Perkin Elmer Inc.) at an excitation length of 555 nm and detection at 580 nm. As a control of the endogenous glutamate level with replacing the NAAG solution with water.

Оценка ингибированияInhibition score

Препарат DCL трифторацетат (84) представляет собой известную модификацию вещества DUPA с повышенной растворимостью и является генетическим предшественником большинства протестированных препаратов. Его ингибирующее действие аналогично DUPA и он использовался как контрольный ингибитор в последующих анализах.DCL trifluoroacetate (84) is a known modification of the DUPA substance with increased solubility and is the genetic precursor of most of the tested drugs. Its inhibitory effect is similar to DUPA and it was used as a control inhibitor in subsequent assays.

Ниже приведено описание ингибирования ПСМА рецептора разработанными соединениями. Чем меньше IC 50 при ингибировании, тем лучше аффинность.The following is a description of the inhibition of the PSMA receptor by the developed compounds. The lower the IC 50 upon inhibition, the better the affinity.

Наибольшее ингибирующее действие показало соединение формулы (70) с линкером, содержащим фрагмент L-Phe-L-Tyr между ядром ингибитора и арильным фрагментом и производным 3-хлорбензальдегида при ε-атоме азота лизина. Также сильным ингибитором является соединение формулы (64) с линкером, содержащим фрагмент L-Phe-L-Tyr между ядром ингибитора и арильным фрагментом и производным 4-бромбензальдегида при ε-атоме азота лизина. В таблице 1 приведены концентрации половинного ингибирования IC₅₀ (нМ) ПСМА протестированными препаратами.The greatest inhibitory effect was shown by the compound of formula (70) with a linker containing the L-Phe-L-Tyr fragment between the inhibitor core and the aryl fragment and the 3-chlorobenzaldehyde derivative at the ε-atom of lysine nitrogen. Also a strong inhibitor is a compound of formula (64) with a linker containing an L-Phe-L-Tyr fragment between the inhibitor core and an aryl fragment and a 4-bromobenzaldehyde derivative at the ε-atom of lysine nitrogen. Table 1 shows the concentration of half inhibition of IC ₅₀ (nM) PSMA tested drugs.

Соединения МА-256, МА-232 - соединения для сравнения, содержащие не модифицированный ПСМА лиганд DCL, и соединение (70) с одним ароматическим фрагментом при ε-NH₂ группе, с двумя ароматическими фрагментами в линкере соответственно, формулы которых представлены ниже.Compounds MA-256, MA-232 are compounds for comparison containing the unmodified PSMA DCL ligand and compound (70) with one aromatic fragment at the ε-NH ₂ group, with two aromatic fragments in the linker, respectively, the formulas of which are presented below.

Определение эффективности заявляемого средства в экспериментах in vitro.Determination of the effectiveness of the claimed drug in in vitro experiments.

Оценка дифференциальной способности конъюгатов на основе заявляемого средства накапливаться в клетках в зависимости от представленности ПСМА на поверхности клеток. Интернализацию флуоресцентного лиганда в клетках детектировали, анализируя интенсивность флуоресцентного сигнала в клетках с использованием изображений, полученных системой визуализации EVOS FL Cell Imaging System с последующей обработкой сигнала в ImageJ. Была проведена оценка эффективности заявялемого средства, включающего флуоресцентную метку FAM и соответствующего структуре коньюгатов (79) и (80). Накопление сигнала флуоресценции, ассоциированного с поступлением меченого FAM конъюгата, проанализировано в трех клеточных линияхAssessment of the differential ability of conjugates based on the claimed agent to accumulate in cells depending on the presence of PSMA on the cell surface. The internalization of the fluorescent ligand in the cells was detected by analyzing the intensity of the fluorescent signal in the cells using images obtained with the EVOS FL Cell Imaging System, followed by signal processing in ImageJ. The effectiveness of the claimed agent was evaluated, including the FAM fluorescent label and the corresponding conjugate structure (79) and (80). The accumulation of the fluorescence signal associated with the receipt of labeled FAM conjugate was analyzed in three cell lines

Для проведения анализа использовали следующие реактивы: PBS (фосфатно-солевой буфер) (Gibco), Glutamax (Gibco), FBS (фетальная телячья сыворотка), RPMI 1640 (Gibco), Pen Strep (Gibco), витамины для среды RPMI (100×) (Sigma), Paraformaldehyde, 95% (Sigma Aldrich).The following reagents were used for analysis: PBS (phosphate buffered saline) (Gibco), Glutamax (Gibco), FBS (fetal calf serum), RPMI 1640 (Gibco), Pen Strep (Gibco), vitamins for RPMI medium (100 ×) (Sigma), Paraformaldehyde, 95% (Sigma Aldrich).

Выбраны три клеточные линии с разным уровнем экспрессии ПСМА на поверхности клеток LNCaP, 22Rv1, PC3. В соответствии с литературными данными наибольший уровень экспрессии ПСМА характерен для LNCaP, низкий уровень экспрессии ПСМА характерен для 22Rv1, PC3 клеточная линия не несет ПСМА, является ПСМА негативной. Использованные клеточные линии: LNCaP - андроген-чувствительная клеточная линия аденокарциномы человека, являются адгерентными эпителиальными клетками, растут в виде агрегатов и одиночных клеток (ПСМА-положительные). 22Rv1 -клеточная линия карциномы человека, являются адгерентными эпителиальными клетками (ПСМА-положительные). PC3 - клеточная линия аденокарциномы человека, являются адгерентными эпителиальными клетками (ПСМА-отрицательные).Three cell lines with different levels of PSMA expression on the surface of LNCaP, 22Rv1, PC3 cells were selected. According to published data, the highest level of PSMA expression is characteristic of LNCaP, the low level of PSMA expression is characteristic of 22Rv1, the PC3 cell line does not carry PSMA, and PSMA is negative. Used cell lines: LNCaP - androgen-sensitive cell line of human adenocarcinoma, are adherent epithelial cells, grow in the form of aggregates and single cells (PSMA-positive). 22Rv1 cell line of human carcinoma are adherent epithelial cells (PSMA-positive). PC3 - the cell line of human adenocarcinoma, are adherent epithelial cells (PSMA-negative).

При рутинном ведении клетки линии LNCaP, PC3, 22Rv1 культивировали в среде RPMI без фенолового красного с 10% FBS (Gibco), 1xGlutamax (Gibco), 1× смесью пенициллин-стрептомицин (Gibco), 1× смесью витаминов для RPMI среды. Клетки культивировали в матрасиках Т25 в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и температуре 37°С до достижения 80% конфлюэнтного монослоя. Для визуализации накопления флуорисцентного сигнала анализируемых коньюгатов с использованием микроскопии были подготовлены препараты стекол с клетками клеточных линий LNCaP, PC3, 22Rv1. Для этого стекла (Corning) покрывали L-полилизином (Sigma) в течении 1 часа, после чего промывали стекла PBS дважды. В лунки 6-луночного планшета помещали покрытое L-полилизином стекло, в каждую лунку вносили клетки (клеточные культуры LNCaP, 22Rv1, PC3) 3×105 клеток в 1,5 мл среды RPMI, инкубировали в стандартных условиях культивирования в течение ночи. Далее клетки отмывали холодной средой RPMI, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки. Для каждого коньюгата в анализ включали клетки LNCaP, клетки 22Rv1, клетки РС3. В лунки, содержащие стекла вносили среду RPMI, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки, с коньюгатами (80 (МА-332), 79 (AY-79)) в концентрации 4 мкМ. Проводили инкубацию в стандартных условиях культивирования в течении 60 минут. В качестве контрольных образцов включали клетки, которые инкубировали со средой RPMI (1% FBS) с эквивалентным содержанием DMSO в течение 60 мин. По истечению 60 мин клетки отмывали холодной средой RPMI, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки и проводили фиксацию клеток при комнатной температуре в течении 8 мин 3,7% парафармальдегидом. Фиксированные клетки отмывали PBS дважды, проводили окраску ядер клеток 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) в соответствии с рекомендациями производителя, после заключительной отмывки PBS (дважды) препараты заключали в Mowiol-488.In routine management, LNCaP, PC3, 22Rv1 cells were cultured in RPMI medium without phenol red with 10% FBS (Gibco), 1xGlutamax (Gibco), 1 × penicillin-streptomycin (Gibco), 1 × vitamin mixture for RPMI medium. Cells were cultured in T25 mattresses in a CO2 incubator at 5% CO2 and a temperature of 37 ° C until an 80% confluent monolayer was reached. To visualize the accumulation of the fluorescent signal of the analyzed conjugates using microscopy, glass preparations with LNCaP, PC3, 22Rv1 cell line cells were prepared. For this, the glasses (Corning) were coated with L-polylysine (Sigma) for 1 hour, after which the PBS glasses were washed twice. L-polylysine-coated glass was placed in the wells of a 6-well plate, cells (LNCaP, 22Rv1, PC3 cell cultures) 3 × 105 cells in 1.5 ml RPMI medium were added to each well, incubated under standard culture conditions overnight. Then the cells were washed with cold RPMI medium containing 1% fetal bovine serum. For each conjugate, LNCaP cells, 22Rv1 cells, and PC3 cells were included in the analysis. RPMI medium containing 1% fetal bovine serum, with conjugates (80 (MA-332), 79 (AY-79)) at a concentration of 4 μM, was added to wells containing glass. Conducted incubation under standard culture conditions for 60 minutes. Cells that were incubated with RPMI medium (1% FBS) with an equivalent DMSO content for 60 minutes were included as control samples. After 60 minutes, the cells were washed with cold RPMI medium containing 1% fetal bovine serum and the cells were fixed at room temperature for 8 minutes with 3.7% parapharmaldehyde. The fixed cells were washed with PBS twice, stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) cell nuclei in accordance with the manufacturer's recommendations, and after final washing with PBS (twice), the preparations were enclosed in Mowiol-488.

Анализировали интенсивность флуоресцентного сигнала в клетках с использованием изображений, полученных системой визуализации EVOS FL Cell Imaging System с последующей обработкой сигнала в ImageJ. Результаты исследования представлены на фиг. 4. Как видно на фиг. 4 интенсивность флуоресцентного сигнала при воздействии коньюгатами (80) (МА-332), (79) (AY-79) была наибольшей для клеток LNCaP, наибольшие значения флуоресценции были достигнуты для коньюгата (79). Низкий сигнал флуоресценции, однако отличный от базового уровня автофлуорисценции клеток, был характерен для клеточной линии 22RV1. Для РС3 воздействие коньюгатами не приводило к статистически значимому повышению уровня флуорисценции по сравнению с уровнем автофлуорисценции. Таким образом, для коньюгатов (80) и (79) характерно специфичное проникновение в клетки разных клеточных культур в зависимости от представленности ПСМА на поверхности клеток.The intensity of the fluorescent signal in the cells was analyzed using images obtained by the EVOS FL Cell Imaging System imaging system, followed by signal processing in ImageJ. The results of the study are presented in FIG. 4. As seen in FIG. 4, the fluorescence signal intensity upon exposure to conjugates (80) (MA-332), (79) (AY-79) was the highest for LNCaP cells; the highest fluorescence values were achieved for conjugate (79). A low fluorescence signal, but different from the baseline level of cell autofluorescence, was characteristic of the 22RV1 cell line. For PC3, exposure to conjugates did not result in a statistically significant increase in fluorescence compared to autofluorescence. Thus, conjugates (80) and (79) are characterized by specific penetration into cells of different cell cultures depending on the presence of PSMA on the cell surface.

Микрофотографии трех клеточных линий после воздействия исследуемыми коньюгатами на основе заявляемых средств доставки представлены на фиг. 5-10.Micrographs of three cell lines after exposure to the studied conjugates based on the inventive delivery vehicles are shown in FIG. 5-10.

В соответствии с проведенными исследованиями по оценке накопления в клетках в зависимости от представленности ПСМА на поверхности клетки, показано, что конъюгаты (80) и (79) являются эффективными ПСМА-векторами, конъюгат (79) обладает выраженной способностью накапливаться в клетках, несущих ПСМА.In accordance with studies on the accumulation in cells depending on the presence of PSMA on the cell surface, it was shown that conjugates (80) and (79) are effective PSMA vectors, conjugate (79) has a pronounced ability to accumulate in cells carrying PSMA.

Оценка дифференциальной способности анализируемых конъюгатов проникать в клетки.Assessment of the differential ability of the analyzed conjugates to penetrate into the cells.

Проведена оценка дифференциальной способности конъюгатов на основе заявляемого средства проникать в клетки в зависимости от представленности ПСМА на поверхности. Интернализацию флуоресцентного лиганда в клетках детектировали с использованием метода проточной цитофлуориметрии.The differential ability of the conjugates based on the claimed agent to penetrate the cells was evaluated depending on the presence of PSMA on the surface. The internalization of the fluorescent ligand in the cells was detected using flow cytometry method.

Для оценки вклада ПСМА опосредованного захвата лиганда клетками в общую, фиксируемую проточным цитофлуориметром, флуоресценцию, проведено частичное блокирование ПСМА. Частичное блокирование ПСМА было достигнуто путем инкубации анализируемых клеток с избытком лиганда, тождественного по строению, но свободного от флюорисцентной метки.To assess the contribution of PSMA mediated ligand uptake by cells into the total fluorescence recorded by a flow cytometer, a partial block of PSMA was performed. Partial blocking of PSMA was achieved by incubating the analyzed cells with an excess of ligand, identical in structure, but free of fluorescent labels.

Выбраны три клеточные линии с разным уровнем экспрессии ПСМА на поверхности клеток LNCaP, 22Rvl, PC3. Для культивирования клеток использовали следующие реактивы: PBS (фосфатно-солевой буфер) (Gibco), Glutamax (Gibco), FBS (фетальная телячья сыворотка), RPMI (Gibco), Pen Strep (Gibco)Three cell lines with different levels of PSMA expression on the surface of LNCaP, 22Rvl, PC3 cells were selected. The following reagents were used for cell cultivation: PBS (phosphate buffered saline) (Gibco), Glutamax (Gibco), FBS (fetal calf serum), RPMI (Gibco), Pen Strep (Gibco)

При рутинном ведении клетки линии LNCaP, PC3, 22Rvl культивировали в среде RPMI без фенолового красного с 10% FBS (Gibco), IxGlutamax (Gibco), 1× смесью пенициллин-стрептомицин (Gibco), 1× смесью витаминов для RPMI среды. Клетки культивировали в матрасиках Т25 в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и температуре 37°С до достижения 80% конфлюэнтного монослоя.In routine management, LNCaP, PC3, 22Rvl cells were cultured in RPMI medium without phenol red with 10% FBS (Gibco), IxGlutamax (Gibco), 1 × penicillin-streptomycin mixture (Gibco), 1 × vitamin mixture for RPMI medium. Cells were cultured in T25 mattresses in a CO2 incubator at 5% CO2 and a temperature of 37 ° C until an 80% confluent monolayer was reached.

Протокол проведения анализа на проточном цитофлюориметре.Protocol for analysis on a flow cytometer.

Лунки 12-луночного планшета для дальнейшего культивирования LNCaP клеток покрывали L-полилизином (Sigma) в течении 1 часа, после чего промывали лунки PBS дважды.Wells of a 12-well plate for further cultivation of LNCaP cells were coated with L-polylysine (Sigma) for 1 hour, after which the wells were washed with PBS twice.

Клетки (клеточные культуры Lncap, 22Rv1, PC3) рассаживали в 12-луночный планшет, в лунку помещали 2×105 клеток в 800 мкл среды RPMI, инкубировали в стандартных условиях культивирования в течение ночи. Далее клетки отмывали холодной средой RPMI, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки.Cells (Lncap, 22Rv1, PC3 cell cultures) were seeded into a 12-well plate, 2 × 105 cells were placed in a well in 800 μl of RPMI medium, and incubated under standard culture conditions overnight. Then the cells were washed with cold RPMI medium containing 1% fetal bovine serum.

Для каждого коньюгата в анализ включали клетки LNCaP (три повторности), клетки 22Rv1 (три повторности), клетки PC3 (три повторности).For each conjugate, LNCaP cells (three replicates), 22Rv1 cells (three replicates), PC3 cells (three replicates) were included in the analysis.

Эксперимент проводили в трех повторностях как при частичном блокировании ПСМА (при внесении избытка анализируемого соединения), так и в эксперименте без дополнительной нагрузки избытком лиганда.The experiment was carried out in triplicate, both with partial blocking of PSMA (with the addition of an excess of the analyte), and in the experiment without additional load with an excess of ligand.

Избыток лиганда достигался внесением к клеткам 720 мкл среды RPMI (1% FBS), содержащей 400 мкМ (100-кратное превышение по концентрации) флуоресцентно немеченого лиганда тождественного по строению анализируемому, инкубацию проводили в стандартных условиях культивирования в течение одного часа В качестве образцов сравнения использовали лунки с клетками, в которые вносили 720 мкл среды RPMI (1% FBS), эти лунки с клетками также инкубировали в стандартных условиях культивирования в течении 1 часа. По истечение времени инкубации в каждую лунку вносили 80 мкл среды RPMI (1% FBS), содержащую анализируемый коньюгат в концентрации 40 мкМ для достижения конечной концентрации в лунке 4 мкМ. Проводили инкубацию в стандартных условиях культивирования в течении 30 минут. В качестве контрольных образцов включали клетки, которые инкубировали со средой RPMI (1% FBS) с эквивалентным содержанием DMSO в течении 30 мин.The excess ligand was achieved by adding 720 μl of RPMI medium (1% FBS) to the cells containing 400 μM (100-fold excess in concentration) of a fluorescently unlabeled ligand identical in structure to the analyte, incubation was carried out under standard culturing conditions for one hour. wells with cells into which 720 μl of RPMI medium (1% FBS) was added, these wells with cells were also incubated under standard culture conditions for 1 hour. At the end of the incubation time, 80 μl of RPMI medium (1% FBS) containing the analyzed conjugate at a concentration of 40 μM was added to each well to achieve a final well concentration of 4 μM. Conducted incubation under standard culture conditions for 30 minutes. The control samples included cells that were incubated with RPMI medium (1% FBS) with an equivalent DMSO content for 30 minutes.

Клетки снимали с поверхности пластика трипсинизацией, инактивацию трипсина проводили с использованием PBS, содержащего 10% FBS. Клетки центрифугировали и отмывали дважды в PBS (10% FBS), полученные клетки ресуспендировали в 500 мкл PBS и использовали далее для проточной цитофлуориметрии (Becton Dickinson FACSAria III).Cells were removed from the surface of the plastic by trypsinization, trypsin inactivation was performed using PBS containing 10% FBS. Cells were centrifuged and washed twice in PBS (10% FBS), the resulting cells were resuspended in 500 μl of PBS and then used for flow cytometry (Becton Dickinson FACSAria III).

Накопление сигнала флюорисценции, ассоциированного с поступлением меченого FAM коньюгата 80, проанализировано в трех клеточных линиях. Результаты проведения анализа с использованием проточной цитофлюорометрии представлены на фиг. 11 и 12.The accumulation of fluorescence signal associated with the arrival of labeled FAM conjugate 80 was analyzed in three cell lines. The results of the analysis using flow cytofluorometry are presented in FIG. 11 and 12.

Как видно на представленных фигурах процент клеток, накопивших флуоресцентный сигнал, был наибольшим для клеточной линии LNCaP (62,3% клеток), для клеточной линии 22RV1 26,4% клеточной популяции несли флуоресцентный сигнал, наименьшее значение анализируемого параметра было характерно для клеток РС3 (13%). Таким образом, для коньюгата (80) характерно специфичное проникновение в клетки разных клеточных культур в зависимости от представленности ПСМА на поверхности клеток. В эксперименте при частичном блокировании ПСМА путем предварительной инкубации с лигандом ПСМА (69) показано, что в клеточной линии LNCaP, обладающей максимальной представленностью ПСМА на поверхности клеток, наблюдалось выраженное снижение накопления конъюгата (80) клетками (падение накопления сигнала клетками в 10,4 раза). Снижение проникновения коньюгата (80) также было характерно и для клеток 22RV1, однако не столь выраженное. Для клеточной линии РС3 для которой характерно отсутствие ПСМА внесение избытка заявляемого средства - соединения формулы (69) практически не влияло на проникновение в клетки меченого коньюгата (80). Таким образом, в эксперименте с частичным блокированием ПСМА подтверждено избирательное накопление коньюгата (80) клетками в зависимости от представленности на ее поверхности ПСМА.As can be seen in the figures, the percentage of cells that accumulated a fluorescent signal was the largest for the LNCaP cell line (62.3% of cells), for the 22RV1 cell line 26.4% of the cell population carried a fluorescent signal, the lowest value of the analyzed parameter was characteristic of PC3 cells ( 13%). Thus, conjugate (80) is characterized by specific penetration into cells of different cell cultures depending on the presence of PSMA on the cell surface. In the experiment, when PSMA was partially blocked by preliminary incubation with the PSMA ligand (69), it was shown that in the LNCaP cell line with the maximum PSMA representation on the cell surface, a marked decrease in the conjugate accumulation (80) by the cells was observed (a 10.4-fold decrease in signal accumulation by the cells) ) A decrease in conjugate penetration (80) was also characteristic of 22RV1 cells, but not so pronounced. For the PC3 cell line, which is characterized by the absence of PSMA, the introduction of an excess of the claimed agent, the compound of formula (69), had practically no effect on the penetration of labeled conjugate into the cells (80). Thus, in the experiment with partial blocking of PSMA, selective accumulation of conjugate (80) by cells was confirmed depending on the presence of PSMA on its surface.

Накопление сигнала флюорисценции, ассоциированного с поступлением меченого FAM коньюгата (79), проанализировано в трех клеточных линиях. Результаты проведения анализа с использованием проточной цитофлюорометрии представлены на фиг. 13 и 14.The accumulation of fluorescence signal associated with the arrival of labeled FAM conjugate (79) was analyzed in three cell lines. The results of the analysis using flow cytofluorometry are presented in FIG. 13 and 14.

Как видно из фиг. 13 при воздействии коньюгатом (79) процент клеток, накопивших флуоресцентный сигнал, был наибольшим для клеточной линии LNCaP (83,8% клеток), для клеточной линии 22RV1 14,4% клеточной популяции несли флуоресцентный сигнал, наименьшее значение анализируемого параметра было характерно для клеток РС3 (7,6%). Таким образом, для коньюгата (79) характерно специфичное проникновение в клетки разных клеточных культур в зависимости от представленности ПСМА на поверхности клеток. В эксперименте при частичном блокировании ПСМА путем предварительной инкубации с лигандом ПСМА (69) показано, что в клеточной линии LNCaP, обладающей максимальной представленностью ПСМА на поверхности клеток, наблюдалось снижение накопления коньюгата (79) клетками, однако не столь выраженное как это было показано для коньюгата (80). Снижение проникновения коньюгата (79) также было характерно и для клеток 22RV1 и РС3. Таким образом, в эксперименте с частичным блокированием ПСМА подтверждено избирательное накопление коньюгата (79) клетками в зависимости от представленности на ее поверхности ПСМА. Однако в случае коньюгата (79) частичное блокирование ПСМА не было столь эффективным как для коньюгата (80).As can be seen from FIG. 13, when exposed to conjugate (79), the percentage of cells that accumulated a fluorescent signal was the largest for the LNCaP cell line (83.8% of cells), for the 22RV1 cell line, 14.4% of the cell population carried a fluorescent signal, the lowest value of the analyzed parameter was characteristic of cells PC3 (7.6%). Thus, conjugate (79) is characterized by specific penetration into cells of different cell cultures depending on the presence of PSMA on the cell surface. In an experiment with partial blocking of PSMA by preliminary incubation with a PSMA ligand (69), it was shown that in the LNCaP cell line with the maximum PSMA representation on the cell surface, a decrease in the conjugate accumulation (79) by cells was observed, but not as pronounced as was shown for the conjugate (80). A decrease in conjugate penetration (79) was also characteristic of 22RV1 and PC3 cells. Thus, in an experiment with partial blocking of PSMA, selective accumulation of conjugate (79) by cells was confirmed depending on the presence of PSMA on its surface. However, in the case of conjugate (79), partial blocking of PSMA was not as effective as for conjugate (80).

В соответствие с проведенными исследованиями по оценке накопления в клетках в зависимости от представленности ПСМА на поверхности клетки, показано, что коньюгаты (80) и (79) являются эффективными ПСМА-векторами.In accordance with studies on the accumulation in cells depending on the presence of PSMA on the cell surface, it was shown that conjugates (80) and (79) are effective PSMA vectors.

Оценка токсичности анализируемых конъюгатов.Assessment of toxicity of the analyzed conjugates.

Клеточные культурыCell culture

В данной работе использовались клеточные линии: иммортализованные клетки почки эмбриона человека Hek293T, клетки иммортализованных фибробластов легкого VA-13, рака молочной железы MCF-7 и клетки аденокарциномы легкого человека А549. Клетки культивировались в среде DMEM/F-12 (Gibco, США) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки FBS (Gibco, США), стрептомицином (0.05 мг/мл) и пенициллином (50 ед/мл). Культивирование проводилось при 37°С и 5% CO2. Клеточные культуры были проверены на отсутствие микоплазмы.In this work, we used cell lines: immortalized kidney cells of the human embryo Hek293T, cells of immortalized fibroblasts of the lung VA-13, breast cancer MCF-7, and human lung adenocarcinoma cells A549. Cells were cultured in DMEM / F-12 medium (Gibco, USA) with 10% fetal calf serum FBS (Gibco, USA), streptomycin (0.05 mg / ml) and penicillin (50 units / ml). Cultivation was carried out at 37 ° C and 5% CO2. Cell cultures were tested for the absence of mycoplasma.

Проведение тестов на цитотоксичностьCytotoxicity tests

МТТ-тест (3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)2,5-дифенил тетразолиум бромид - тест) основан на [Ferrari, M., Fomasiero, М.С., and Isetta, А.М. (1990). МТТ colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity in vitro. J Immunol Methods 131, 165-172.] Клетки Hek293T, А549, MCF7 рассевались в количестве 2500 на лунку 96-луночного планшета, клетки линии VA-13 по 4000 на лунку в среде DMEM/F-12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки FBS (Gibco, США), стрептомицином (0.05 мг/мл) и пенициллином (50 ед/мл). Через 24 часа после посева клеток к ним добавлялись химические препараты, разведенные в соответствующей культуральной среде. Для каждой концентрации препарата использовали три технических реплики. Далее клетки инкубировались 72 часа с препаратами при 37°С и 5% CO2. Затем к клеткам прибавлялся МТТ до 0,5 г/л (использовался 10х кратный раствор в стандартном буфере PBS) и клетки инкубировались еще 2 часа. После инкубации среда отбиралась и осадок растворялся в 140 мкл ДМСО (ООО «Фармамед», Россия) в течение 15 минут при перемешивании на орбитальном шейкере (60 об/мин). Измеряли оптическую плотность каждой лунки при длине волны 565 нм. Каждый эксперимент проводился в трех репликах. Данные обрабатывали с помощью ПО "GraphPad Prism 5" (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), строя зависимости доза-ответ и определяя СС50.The MTT test (3- (4,5-dimethyltriazol-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide test) is based on [Ferrari, M., Fomasiero, M.S., and Isetta, A.M. (1990). MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity in vitro. J Immunol Methods 131, 165-172.] Hek293T, A549, MCF7 cells were scattered at 2500 per well of a 96-well plate, VA-13 cells at 4000 per well in DMEM / F-12 medium with 10% fetal calf serum FBS (Gibco, USA), streptomycin (0.05 mg / ml) and penicillin (50 units / ml). 24 hours after plating the cells, chemicals diluted in the appropriate culture medium were added to them. Three technical replicas were used for each concentration of the drug. Then the cells were incubated for 72 hours with preparations at 37 ° C and 5% CO2. Then MTT was added to the cells up to 0.5 g / L (a 10x solution in standard PBS buffer was used) and the cells were incubated for another 2 hours. After incubation, the medium was taken and the precipitate was dissolved in 140 μl of DMSO (Farmamed LLC, Russia) for 15 minutes with stirring on an orbital shaker (60 rpm). The optical density of each well was measured at a wavelength of 565 nm. Each experiment was carried out in three replicas. Data was processed using GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), plotting dose-response relationships and determining CC50.

Для ряда лигандов было показано, что данные молекулы не обладают выраженной токсичностью на клеточных линиях Hek293T (эмбриональные клетки почек человека), VA-13 (фибробласты легких), MCF7 (аденокарцинома груди), А549 (карцинома легких), значения поулумаксимальной клеточной токсичности (СС₅₀) на данных клеточных культурах оказывается >50 мкМ.For a number of ligands, it was shown that these molecules do not have pronounced toxicity on the cell lines Hek293T (human kidney embryonic cells), VA-13 (lung fibroblasts), MCF7 (breast adenocarcinoma), A549 (lung carcinoma), values of maximal cell toxicity (CC) ₅₀ ) on these cell cultures is> 50 μm.

Claims (83)

1. Вещество общей формулы1. The substance of the General formula

(I),

(I) где n=3-5;where n = 3-5; X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н;X, Y, Z independently of each other are F, Cl, Br, H; R = ОН, Н;R = OH, H; R₁ = Н, Br.R ₁ = H, Br. 2. Вещество по п. 1, выбранное из группы:2. The substance according to claim 1, selected from the group:

3. Вещество по п. 1 или 2, отличающееся тем, что оно способно связываться с простатическим специфическим мембранным антигеном.3. A substance according to claim 1 or 2, characterized in that it is capable of binding to a specific prostatic membrane antigen. 4. Способ получения вещества по п. 1, включающий синтез тритретбутилового производного ПСМА-связывающего лиганда формулы (2):4. A method of obtaining a substance according to claim 1, including the synthesis of a tritrebutyl derivative of a PSMA-binding ligand of the formula (2):

с последующим алкилированием полученного тритретбутилового производного ПСМА-связывающего лиганда с получением соединения формулы (II):followed by alkylation of the obtained tritrebutyl derivative of the PSMA binding ligand to obtain a compound of formula (II):

где X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Нwhere X, Y, Z independently of each other represent F, Cl, Br, H с последующим ацилированием производными азида бутаной или пентановой или гексановой кислот с получением азидного производного алкилированного производного ПСМА-лиганда с дальнейшей реакцией восстановления азида до аминогруппы в присутствии трифенилфосфина и воды в растворе ТГФ или в растворе метанола с использованием водорода в присутствии палладия на углероде в качестве катализатора и получением соединения формулы (III):followed by acylation of azide derivatives with butane or pentanoic or hexanoic acids to obtain an azide derivative of an alkylated derivative of a PSMA ligand with a further reduction reaction of azide to an amino group in the presence of triphenylphosphine and water in a THF solution or in a methanol solution using hydrogen in the presence of palladium on carbon as a catalyst and obtaining the compounds of formula (III):

где X, Y, Z представляют собой F, Cl, Br, Н, n=3-5,where X, Y, Z are F, Cl, Br, H, n = 3-5, которое модифицируют янтарным ангидридом в присутствии диизопропилэтиламина или триэтиламина, с получением производного соединения ацилированного янтарным ангидридом, далее осуществляют получение дипептидов производных ароматических аминокислот, представляющих собой фенилаланил-фенилаланин или фенилаланил-тирозин формулы (IV), для связывания с модифицированным фрагментом линкера,which is modified with succinic anhydride in the presence of diisopropylethylamine or triethylamine to obtain a derivative of the acylated compound with succinic anhydride, then dipeptides of aromatic amino acid derivatives representing phenylalanyl-phenylalanine or phenylalanyl-tyrosine of formula (IV) are prepared to bind to the modified linker fragment

затем получают реакцией ацилирования производным соединения (III), ацилированного янтарным ангидридом, дипептида формулы (IV) тритретбутил производное конъюгата радикала ПСМА-связывающего лиганда и модифицированного гидрофобного пептидного линкера, включающего фрагменты 6-аминогексановой или 5-аминопентановой или 4-аминобутановой кислот, фрагмент фенилаланина или его производное, фрагмент тирозина или его производное общей формулы (V):then obtained by an acylation reaction with a derivative of compound (III), acylated with succinic anhydride, a dipeptide of formula (IV), a tritetbutyl derivative of the PSMA-binding ligand radical conjugate and a modified hydrophobic peptide linker comprising fragments of 6-aminohexanoic or 5-aminopentanoic or 4-aminobutane or its derivative, a tyrosine fragment or its derivative of the general formula (V):

,

, где n=3-5;where n = 3-5; X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н;X, Y, Z independently of each other are F, Cl, Br, H; R = OH, Н;R = OH, H; R₁ = Н, BrR ₁ = H, Br с последующим удалением тритретбутильных защитных групп соединения формулы (VI) с получением ковалентно-связанных ПСМА-связывающего лиганда и модифицированного гидрофобного пептидного линкера общей формулы (I).followed by removal of the tritrebutyl protective groups of the compounds of formula (VI) to obtain covalently bound PSMA binding ligand and a modified hydrophobic peptide linker of the general formula (I). 5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что получение алкилированного тритретбутил производного ПСМА-лиганда осуществляют путем восстановительного аминирования замещенными бензальдегидами.5. The method according to p. 4, characterized in that the production of the alkylated tritrebutyl derivative of the PSMA ligand is carried out by reductive amination with substituted benzaldehydes. 6. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что удаление тритретбутильных защитных групп проводят в присутствии 9-11% ТФУ в течение 15-17 часов в дихлорметане.6. The method according to p. 4, characterized in that the removal of tritrebutyl protective groups is carried out in the presence of 9-11% TFU for 15-17 hours in dichloromethane. 7. Применение вещества по п. 1 для получения конъюгата с лекарственным или диагностическим агентом для диагностики или лечения заболеваний, вызванных клетками, экспрессирующими простатический специфический мембранный антиген.7. The use of a substance according to claim 1 for the preparation of a conjugate with a medicinal or diagnostic agent for the diagnosis or treatment of diseases caused by cells expressing a prostatic specific membrane antigen. 8. Применение по п. 7, характеризующееся тем, что вещество выбрано из группы:8. The use according to claim 7, characterized in that the substance is selected from the group:

9. Применение по п. 7, характеризующееся тем, что лекарственным агентом является доцетаксел.9. The use according to claim 7, characterized in that the medicinal agent is docetaxel. 10. Применение по п. 7, характеризующееся тем, что таким заболеванием является рак предстательной железы.10. The use according to claim 7, characterized in that the disease is prostate cancer. 11. Конъюгат вещества по п. 1 с лекарственным или диагностическим агентом для диагностики или лечения заболеваний, вызванных клетками, экспрессирующими простатический специфический мембранный антиген11. The conjugate of a substance according to claim 1 with a drug or diagnostic agent for the diagnosis or treatment of diseases caused by cells expressing a prostatic specific membrane antigen

,

, где n=3-5;where n = 3-5; X, Y, Z независимо друг от друга представляют собой F, Cl, Br, Н;X, Y, Z independently of each other are F, Cl, Br, H; R = ОН, Н;R = OH, H; R₁ = Н, Br;R ₁ = H, Br; R₂ = лекарственный или диагностический агент.R ₂ = drug or diagnostic agent. 12. Конъюгат по п. 11, выбранный из группы:12. The conjugate according to claim 11, selected from the group:

..

Images