RU2695336C1 - Peptide-based composition suppressing replication of influenza a virus - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine; pharmaceuticals.

SUBSTANCE: present invention refers to pharmaceutical industry, namely to an oligopeptide-based composition which suppresses replication of influenza A virus. A composition for treating influenza on the basis of oligopeptide, suppressing replication of influenza A virus, sequence 6–14 of protein of polymer complex PB1 of influenza virus, acetylated by N-terminal and amidated by C-terminal, formula Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2, which additionally contains dimethylsulphoxide, ethanol and water, taken in certain amounts.

EFFECT: disclosed oligopeptide-based composition is stable and has high solubility of the oligopeptide.

1 cl, 6 tbl

Description

Изобретение относится к медицине и фармацевтике, а именно к разработке лекарственных средств, содержащих пептиды, гомологичные функционально значимым доменам вирус-специфических белков, пригодных для интраназального применения, и может быть использовано для лечения инфекции, вызванной вирусом гриппа А человека, в частности штамма субтипа A(H1N1)pdm09.The invention relates to medicine and pharmaceuticals, namely to the development of drugs containing peptides homologous to functionally significant domains of virus-specific proteins suitable for intranasal use, and can be used to treat infections caused by human influenza A virus, in particular, subtype A strain (H1N1) pdm09.

Несмотря на десятилетия наблюдений за распространением и борьбы с заболеваемостью гриппом с применением различных методов, в том числе с использованием фармацевтических терапевтических и профилактических средств, сезонный грипп поражает 5-15 % популяции людей и является причиной гибели 250000-500000 человек ежегодно [1]. Эволюционная изменчивость вирусов гриппа позволяет циркулирующим сезонным штаммам ускользать от специфического иммунного ответа, как естественного (индуцированного перенесенной инфекцией прошлых лет), так и искусственного (индуцированного вакциной, соответствующей штаммам прошлых сезонов) [2].Despite decades of monitoring the spread and controlling the incidence of influenza using various methods, including using pharmaceutical therapeutic and prophylactic agents, seasonal flu affects 5-15% of the population and causes the death of 250,000-500,000 people annually [1]. The evolutionary variability of influenza viruses allows circulating seasonal strains to elude a specific immune response, both natural (induced by past infection) and artificial (induced by a vaccine corresponding to strains of past seasons) [2].

Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae, род Influenzavirus, типы А, В, С и D. Вирионы гриппа А представляют собой сферические или слегка вытянутые частицы диаметром 80-100 нм, покрытые липидной оболочкой с интегрированными молекулами поверхностных гликопротеинов – гемагглютинина (далее по тексту – «HA») и нейраминидазы (далее по тексту – «NA»), а также поверхностного белка М2 (далее по тексту – «белок М2»), работающего как ионный канал и ассоциированного со слоем мембранного белка M1. Нуклеоид вириона представлен 8 сегментами однонитевой РНК отрицательной полярности (вРНК), каждый из которых образует комплекс с несколькими десятками молекул нуклеопротеина (NP) и тремя молекулами субъединиц полимеразного комплекса (PA, PB1, РВ2) (далее по тексту – «RNA-dependent RNA Polymerase», «RdRP»). При встрече с вирусом гриппа организма реципиента HA отвечает за связывание с молекулами сиаловой кислоты на поверхности клеток заражаемой ткани и последующее проникновение вируса внутрь клетки посредством слияния мембран. При формировании иммунного ответа HA является основной мишенью и поэтому наиболее сильно подвергается эволюционной изменчивости, направленной на ускользание от него. NA осуществляет гидролиз связи между HA и сиаловыми кислотами, способствуя выходу новых вирионов из инфицированных клеток, что позволяет вирусу осуществлять заражение новых и новых клеток заражаемой ткани. После проникновения в клетку и «раздевания» вириона сегменты генома попадают в цитоплазму, откуда транспортируются в ядро, где RdRP осуществляет транскрипцию и репликацию вРНК. В результате образуются молекулы вирусспецифической матричной РНК (мРНК) и вРНК, входящей затем в состав вирионов потомства. мРНК транслируется при помощи клеточных ферментов с образованием структурных и неструктурных белков, первые формируют структуру вириона, а последние выполняют важные регуляторные функции в ходе жизненного цикла вируса [3]. Influenza viruses belong to the family Orthomyxoviridae, genus Influenzavirus, types A, B, C and D. Influenza A viruses are spherical or slightly elongated particles with a diameter of 80-100 nm, coated with a lipid membrane with integrated molecules of surface glycoproteins - hemagglutinin (hereinafter - “HA”) and neuraminidases (hereinafter referred to as “NA”), as well as the surface M2 protein (hereinafter referred to as “M2 protein”), which acts as an ion channel and is associated with a layer of membrane protein M1. The virion nucleoid is represented by 8 segments of single-stranded RNA of negative polarity (vRNA), each of which forms a complex with several tens of nucleoprotein (NP) molecules and three molecules of the polymerase complex subunits (PA, PB1, PB2) (hereinafter - “RNA-dependent RNA Polymerase "," RdRP "). When meeting with the body's influenza virus, the recipient HA is responsible for binding to the sialic acid molecules on the surface of the cells of the infected tissue and the subsequent penetration of the virus into the cells by fusion of the membranes. In the formation of the immune response, HA is the main target and therefore is most strongly affected by evolutionary variability, aimed at slipping away from it. NA hydrolyzes the bond between HA and sialic acids, facilitating the release of new virions from infected cells, which allows the virus to infect new and new cells of infected tissue. After penetration into the cell and “stripping” of the virion, the genome segments enter the cytoplasm, from where they are transported to the nucleus, where RdRP transcribes and replicates vRNA. As a result, molecules of virus-specific matrix RNA (mRNA) and vRNA are formed, which are then part of the progeny virions. mRNA is translated using cellular enzymes with the formation of structural and non-structural proteins, the former form the virion structure, and the latter perform important regulatory functions during the life cycle of the virus [3].

Не имеющая редакторской активности RdRP не способна исправлять ошибки в нуклеотидной последовательности сегментов в ходе репликации генома, что и приводит к возникновению изменчивости. Будучи подвергнутыми эволюционному отбору, в популяции вирусного потомства закрепляются варианты нуклеотидных последовательностей сегментов, кодирующие варианты поверхностных белков, избегающих воздействия иммунного ответа (антигенный дрифт). Кроме того, сегментированность генома вируса гриппа приводит к возможности обмена сегментами между различными штаммами (антигенный шифт) [4].Without editorial activity, RdRP is not able to correct errors in the nucleotide sequence of segments during genome replication, which leads to the occurrence of variability. Being subjected to evolutionary selection, variants of nucleotide sequences of segments encoding variants of surface proteins avoiding the effects of the immune response (antigenic drift) are fixed in the population of viral offspring. In addition, the segmentation of the genome of the influenza virus leads to the possibility of exchange of segments between different strains (antigenic shift) [4].

Вирусы гриппа А подразделяются на подтипы в зависимости от сочетания HA и NA. На сегодняшний день известно 18 подтипов по HA (у вирусов гриппа человека – Н1, Н2, Н3) и 11 подтипов по NA (у вирусов гриппа человека – N1, N2). Многие подтипы вируса гриппа А встречаются только у водоплавающих птиц, однако обладают потенциалом к межвидовой передаче. Вирус гриппа А также способен вызывать  глобальные пандемии. К числу пандемических относят штаммы вируса, вызвавшие пандемии «испанского» гриппа («испанка») в 1918 г., «свиного» гриппа в 2009 г. A(H1N1)pdm 2009, «азиатского» гриппа в 1957 г. A(H2N2), «гонгконгского» гриппа в 1968 г. A(H3N2), с последующим распространением в популяции людей в виде сезонного гриппа. В настоящее время за сезонные эпидемии гриппа ответственны преимущественно вирусы гриппа A(H1N1) и A(H3N2). Вирус A(H5N1) считают самой большой пандемической опасностью нашего времени [5].Influenza A viruses are divided into subtypes according to the combination of HA and NA. To date, 18 subtypes of HA are known (for human influenza viruses - H1, H2, H3) and 11 subtypes of NA (for human influenza viruses - N1, N2). Many subtypes of influenza A virus are found only in waterfowl, but have the potential for interspecific transmission. Influenza A virus is also capable of causing global pandemics. Among the pandemic include virus strains that caused pandemics of the “Spanish” flu (“Spanish flu”) in 1918, the “swine” flu in 2009 A (H1N1) pdm 2009, the “Asian” flu in 1957 A (H2N2) , "Hong Kong" flu in 1968, A (H3N2), with subsequent spread in the human population in the form of seasonal flu. Currently, influenza A (H1N1) and A (H3N2) viruses are primarily responsible for seasonal influenza epidemics. Virus A (H5N1) is considered the largest pandemic hazard of our time [5].

Вирус гриппа, в частности гриппа А, передается от человека к человеку воздушно-капельным путем, через прямой контакт, а также опосредованно через предметы, бывшие в контакте с патогенными микроорганизмами. При этом заражение воздушно-капельным путем происходит гораздо более эффективно, чем контактная передача. Входными воротами для вируса гриппа у человека являются клетки мерцательного эпителия верхних дыхательных путей – носа, трахеи, бронхов. В этих клетках вирус размножается и приводит к их разрушению и гибели. Этим, а также локализацией реакции организма вблизи пораженных вирусом тканей объясняется раздражение верхних дыхательных путей, кашель, чихание, заложенность носа. Общая реакция организма на проникновение и размножение вируса, а также на синтезируемые в процессе цикла размножения вируса регуляторные белки проявляется как повышение температуры, озноб, миалгия, головная боль. В тяжелых случаях вирус вызывает неадекватную реакцию иммунной системы организма («цитокиновый шторм»), респираторную недостаточность и смерть. В случае наличия у заболевшего сопутствующих сердечно-сосудистых и других хронических заболеваний велика вероятность их обострения, что также часто приводит к неблагоприятному исходу. Также при гриппе возможно возникновение осложнений, связанных с присоединением вторичной бактериальной инфекции, что связано с индуцированными гриппом изменениями в иммунной системе и разрушением эпителиальных клеток. У здоровых людей заражение гриппом приводит к развитию специфической иммунной реакции (цитотоксические Т-лимфоциты и антитела) в течение 1-2 недель [6]. Influenza virus, in particular influenza A, is transmitted from person to person by airborne droplets, through direct contact, and also indirectly through objects that have been in contact with pathogenic microorganisms. In this case, airborne infection occurs much more efficiently than contact transmission. The entry gates for the human influenza virus are cells of the ciliated epithelium of the upper respiratory tract - the nose, trachea, and bronchi. In these cells, the virus multiplies and leads to their destruction and death. This, as well as the localization of the reaction of the body near tissues affected by the virus, explains irritation of the upper respiratory tract, coughing, sneezing, nasal congestion. The general reaction of the body to the penetration and reproduction of the virus, as well as to the regulatory proteins synthesized during the virus propagation cycle, manifests itself as fever, chills, myalgia, and headache. In severe cases, the virus causes an inadequate response of the body's immune system (“cytokine storm”), respiratory failure and death. If the patient has concomitant cardiovascular and other chronic diseases, there is a high probability of their exacerbation, which also often leads to an unfavorable outcome. Also, with influenza, complications associated with the attachment of a secondary bacterial infection may occur, which is associated with influenza-induced changes in the immune system and the destruction of epithelial cells. In healthy people, influenza infection leads to the development of a specific immune response (cytotoxic T-lymphocytes and antibodies) within 1-2 weeks [6].

Некоторые подтипы гриппа, заражающие людей, в том числе большинство штаммов пандемического гриппа A(H1N1)pdm09, сезонного гриппа A(H3N2) и «птичьего» гриппа A(H5N1), являются чувствительными к этиотропной терапии. Однако высокая скорость эволюционной изменчивости вируса гриппа, которая в настоящее время уже привела к появлению штаммов с лекарственной устойчивостью к существующим препаратам, в дальнейшем будет способствовать ускорению развития устойчивости к этим лекарственным препаратам при их широком применении [7]. В этой связи для лечения и профилактики гриппозной инфекции актуальной является разработка новых терапевтических средств, активных не только в отношении циркулирующих в человеческой популяции штаммов, устойчивых к действию уже существующих препаратов, но и в отношении вновь появляющихся штаммов. Кроме того, поскольку репликация вируса гриппа протекает в первую очередь в эпителиальных тканях верхних дыхательных путей, для адресной доставки противовирусного средства целесообразно использовать интраназальную форму препарата – капли или спрей [8]. Some influenza subtypes that infect humans, including most strains of pandemic influenza A (H1N1) pdm09, seasonal flu A (H3N2), and bird flu A (H5N1), are sensitive to etiotropic therapy. However, the high rate of evolutionary variability of the influenza virus, which has now led to the emergence of strains with drug resistance to existing drugs, will further accelerate the development of resistance to these drugs with their widespread use [7]. In this regard, for the treatment and prevention of influenza infection, it is urgent to develop new therapeutic agents that are active not only against strains circulating in the human population that are resistant to existing drugs, but also against newly emerging strains. In addition, since the replication of the influenza virus occurs primarily in the epithelial tissues of the upper respiratory tract, it is advisable to use the intranasal form of the drug — drops or spray, for targeted delivery of the antiviral agent [8].

Применяемые в настоящее время антивирусные средства можно условно подразделить на две группы – препараты, действующие на клеточные мишени и этиотропные препараты прямого противовирусного действия. К первой группе могут быть отнесены, в частности лекарственные средства, действующие на клеточные системы транспорта и на синтетический аппарат клетки. Так, известен рекомбинантный человеческий белок СС10 (называемый также утероглобин), снижающий титр вируса в легочной ткани экспериментальных животных при интраназальном применении. Указанный белок подавляет репликацию вируса, препятствуя осуществлению везикулярного транспорта в клетке [9].Currently used antiviral agents can be divided into two groups - drugs that act on cellular targets and etiotropic drugs with direct antiviral effects. The first group may include, in particular, drugs acting on cellular transport systems and on the synthetic apparatus of the cell. Thus, recombinant human protein CC10 (also called uteroglobin) is known, which reduces the titer of the virus in the lung tissue of experimental animals with intranasal use. The specified protein inhibits the replication of the virus, preventing the implementation of vesicular transport in the cell [9].

Известно также лекарственное средство для профилактики и лечения вирусных болезней, содержащее метисазон, диметилсульфоксид (далее по тексту – «ДМСО») и полиэтиленгликоль-9 при соотношении компонентов, мас. %: метисазон – 2,0-2,5; ДМСО – 20-25; полиэтиленгликоль-9 – остальное [10]. Действие указанного средства направлено, в частности, на комплексы «полирибосомы-РНК», что выражается в ингибирующем влиянии препарата на репродукцию вирусов. Also known is a medicine for the prevention and treatment of viral diseases containing methisazon, dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as “DMSO”) and polyethylene glycol-9 with a ratio of components, wt. %: metisazon - 2.0-2.5; DMSO - 20-25; polyethylene glycol-9 - the rest [10]. The action of this agent is directed, in particular, to the complexes of "polyribosome-RNA", which is expressed in the inhibitory effect of the drug on the reproduction of viruses.

Общим недостатком препаратов первой группы является то, что они обладают относительно низкой специфичностью в отношении вирусов (в том числе вируса гриппа А человека), что значимо увеличивает вероятность побочных эффектов. Побочные эффекты, о6условленные, в частности, нарушением везикулярного транспорта вируса (для аналога [9]) или нарушением белкового синтеза клеточного генома (для аналога [10]), в дальнейшем могут приводить к нарушениям функционирования органов и тканей организма.A common drawback of the drugs of the first group is that they have a relatively low specificity for viruses (including human influenza A virus), which significantly increases the likelihood of side effects. Side effects, caused in particular by a violation of the vesicular transport of the virus (for analogue [9]) or a violation of the protein synthesis of the cellular genome (for analogue [10]), can subsequently lead to impaired functioning of organs and tissues of the body.

К антивирусным этиотропным средствам прямого противовирусного действия относятся лекарственные средства, направленные на конкретную молекулярную мишень, характерную для вируса и отсутствующую в клетке хозяина. На сегодняшний день известно использование в качестве мишеней для специфической химиотерапии трех структурных белков из множества вирусных белков, продуцирующихся в процессе жизненного цикла вирусов. Во-первых, это белок М2 вируса гриппа, играющий роль ионного канала в вирусной мембране, который блокируют препараты адамантанового ряда – ремантадин (а-метил-1-адамантил-метиламина гидрохлорид) и амантадин (1-аминоадамантан). Препараты адамантанового ряда эффективны в отношении вирусов гриппа А, однако их применение ограничено наличием серьезных побочных эффектов и быстрым возникновением и 100 % резистентности циркулирующих в настоящее время штаммов [11].Antiviral etiotropic agents of direct antiviral effect include drugs aimed at a specific molecular target that is characteristic of the virus and is absent in the host cell. Today, it is known to use three structural proteins from a variety of viral proteins produced during the life cycle of viruses as targets for specific chemotherapy. Firstly, it is the M2 protein of the influenza virus, which plays the role of an ion channel in the viral membrane, which is blocked by adamantane-type drugs - remantadine (a-methyl-1-adamantyl-methylamine hydrochloride) and amantadine (1-aminoadamantane). Adamantane-type drugs are effective against influenza A viruses, but their use is limited by the presence of serious side effects and the rapid onset and 100% resistance of currently circulating strains [11].

Другой мишенью для лекарственного воздействия является NA – фермент, необходимый для нормального почкования вирусных частиц и проявления инфекционных свойств вируса гриппа, против которой эффективны ингибиторы занамивир (5-(ацетиламино)-4-[(аминоиминометил)-амино]-2,6-ангидро-3,4,5-тридезокси-D-глицеро-D-галактонон-2-еноновая кислота), озельтамивир (Тамифлю™) [12] и перамивир ((1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-ацетамидо-2-этил-бутил]-4-(диаминометилиденамино)-2-гидрокси-циклопентан-1-карбоновая кислота) [13]. Первичная структура NA является низкоконсервативной, т.е. быстро изменяется в процессе эволюции вируса гриппа, что приводит к высокой вероятности появления штаммов, резистентных к действию ингибиторов NA [14]. В частности, имеются сведения о возникновении устойчивых штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 [15]. Серьезным недостатком указанных препаратов является их частичная или полная непригодность для интраназального введения. Так, занамивир выпускается в виде дискхалера – системы для вдыхания порошка [16], озельтамивир – в виде таблеток, а перамивир – в виде раствора для внутривенного применения [13].Another target for drug exposure is NA, an enzyme necessary for the normal budding of viral particles and the manifestation of the infectious properties of the influenza virus, against which zanamivir (5- (acetylamino) -4 - [(aminoiminomethyl) amino] -2,6-anhydro inhibitors are effective -3,4,5-tridesoxy-D-glycero-D-galactonone-2-enonic acid), oseltamivir (Tamiflu ™) [12] and peramivir ((1S, 2S, 3S, 4R) -3 - [(1S) -1-acetamido-2-ethyl-butyl] -4- (diaminomethylidenamino) -2-hydroxy-cyclopentane-1-carboxylic acid) [13]. The primary structure of NA is low conserved, i.e. changes rapidly during the evolution of the influenza virus, which leads to a high probability of the emergence of strains resistant to the action of NA inhibitors [14]. In particular, there is evidence of the emergence of resistant strains of the pandemic influenza A (H1N1) pdm09 virus [15]. A serious drawback of these drugs is their partial or complete unsuitability for intranasal administration. So, zanamivir is available in the form of a dishaler - a system for inhaling powder [16], oseltamivir - in the form of tablets, and peramivir - in the form of a solution for intravenous use [13].

И наконец, третьей мишенью является полимераза RdRP как фермент, катализирующий синтез вирусной РНК. RdRP является, с одной стороны, высококонсервативной среди вирусов гриппа А всех подтипов, с другой – жизненно необходимым компонентом для осуществления цикла вирусной репликации в клетке. В настоящее время в ряде работ продемонстрирована высокая противовирусная активность олигопептидов, гомологичных функционально значимым последовательностям субъединицы РВ1, конкурирующих за сайты связывания ее с другими субъединицами полимеразного комплекса. Так, известен олигопептид последовательности 531-540 белка полимеразного комплекса РВ1 вируса гриппа, имеющий аминокислотный состав H-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu-Gly-OH (KNNMINNDLG), ингибирующий репликацию вирусов. Установлено, что указанный полипептид обладает выраженной селективностью в отношении вирусов гриппа разных подтипов – H1 и Н5. Результаты исследований на модели экспериментальной гриппозной инфекции, вызванной вирусами гриппа человека A(H1N1) и гриппа птиц A(H5N2) (в культуре клеток MDCK), показали, что указанный пептид проявляет достаточно высокую антивирусную активность в отношении вируса гриппа человека A(H1N1) (50 % эффективная доза препарата /ED₅₀/ составила 28,6 мкг/мл; индекс селективности /SI/ – 43,0) и несколько меньшую активность в отношении вируса гриппа птиц A(H5N2) (ED₅₀ – 35,3 мкг/мл; SI – 34,8) при значительно меньшем (в 20 раз) уровне токсичности по сравнению препаратом ремантадином (50 % цитотоксическая концентрация /CTD₅₀/ – 1229 мкг/мл) [17]. Finally, the third target is RdRP polymerase as an enzyme that catalyzes the synthesis of viral RNA. RdRP is, on the one hand, highly conserved among influenza A viruses of all subtypes, and on the other hand, is a vital component for the implementation of the cycle of viral replication in the cell. Currently, a number of studies have demonstrated the high antiviral activity of oligopeptides homologous to functionally significant sequences of the PB1 subunit competing for its binding sites with other subunits of the polymerase complex. Thus, an oligopeptide of the sequence 531-540 of the influenza virus PB1 polymerase complex protein is known having the amino acid composition H-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu-Gly-OH (KNNMINNDLG), which inhibits viral replication. It was found that this polypeptide has a pronounced selectivity for influenza viruses of different subtypes - H1 and H5. The results of studies on a model of experimental influenza infection caused by human influenza A (H1N1) viruses and avian influenza A (H5N2) viruses (in MDCK cell culture) showed that this peptide exhibits a fairly high antiviral activity against human influenza A virus (H1N1) ( The 50% effective dose of the drug / ED ₅₀ / was 28.6 μg / ml; the selectivity index / SI / - 43.0) and a slightly lower activity against avian influenza A virus (H5N2) (ED ₅₀ - 35.3 μg / ml ; SI - 34.8) with a significantly lower (20 times) level of toxicity compared with the drug remantadi ohm (50% cytotoxic concentration / CTD ₅₀ / - 1229 g / ml) [17].

Наиболее близким к заявленной композиции является олигопептид последовательности 6-14 белка полимеразного комплекса РВ1 вируса гриппа, ацетилированный по N-концевой аминогруппе и амидированный по С-концевой карбоксильной группе формулы Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH₂ (Ac-TLLFLKVPA-NH₂) [18] (далее по тексту – «Пептид»). Испытания, проведенные на культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)pdm09, показали, что Пептид проявляет относительно высокую противовирусную активность (CTD₅₀ – 477 мкМ; ED_{50 –} 4,3 мкМ; SI – 111). Кроме того, показано, что пептид обладает противовирусной активностью, в том числе и в отношении штаммов подтипов H5 и H3. Выявлено, что Пептид способен в присутствии ДМСО проникать через плазматическую мембрану клетки, а также что основной механизм его активности не связан с инактивацией внеклеточного вируса. Предполагается, что противовирусная активность Пептида реализуется путем нарушения сборки комплекса РНК-полимеразы, возможно, за счет связывания Пептида с белком РА, то есть ингибирование вируса гриппа происходит на ранних стадиях вирусной репродукции.Closest to the claimed composition is an oligopeptide sequence of 6-14 protein of the influenza virus PB1 polymerase complex, acetylated at the N-terminal amino group and amidated at the C-terminal carboxyl group of the formula Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro Ala-NH ₂ (Ac-TLLFLKVPA-NH ₂ ) [18] (hereinafter referred to as the “Peptide”). Tests performed on an MDCK cell culture against influenza virus A / California / 07/2009 (H1N1) pdm09 showed that the Peptide exhibits relatively high antiviral activity (CTD ₅₀ - 477 μM; ED _{50 -} 4.3 μM; SI - 111 ) In addition, it was shown that the peptide has antiviral activity, including against strains of subtypes H5 and H3. It was revealed that the Peptide is able to penetrate the plasma membrane of the cell in the presence of DMSO, and also that the main mechanism of its activity is not associated with inactivation of the extracellular virus. It is assumed that the antiviral activity of the Peptide is realized by disrupting the assembly of the RNA polymerase complex, possibly due to the binding of the Peptide to the RA protein, i.e., inhibition of the influenza virus occurs in the early stages of viral reproduction.

Общим недостатком олигопептидов полимеразного комплекса, в том числе пептида-аналога [17] и пептида-прототипа [18], является их низкая растворимость в воде и водных растворах солей, что продемонстрировано, в частности для олигопептида последовательности 6-13 белка полимеразного комплекса РВ1 [19]. Экспериментально установлено, что молекулы пептида склонны к взаимодействию с образованием амилоидоподобных фибрилл, присутствие которых значимо снижает долю растворенного пептида в растворе. Это существенно затрудняет приготовление пригодной для интраназального применения у человека и животных лекарственной формы препарата, в которой бы достигалась концентрация, необходимая и достаточная для эффективного терапевтического использования. На настоящий момент сведения о подобной лекарственной форме на основе пептидов полимеразного комплекса РВ-1 (в том числе, пептида-аналога [17] и пептида-прототипа [18]) отсутствуют.A common disadvantage of oligopeptides of the polymerase complex, including the analog peptide [17] and the prototype peptide [18], is their low solubility in water and aqueous salt solutions, which has been demonstrated, in particular, for the oligopeptide sequence 6-13 of the PB1 polymerase complex protein [ nineteen]. It was experimentally established that peptide molecules are prone to interact with the formation of amyloid-like fibrils, the presence of which significantly reduces the proportion of dissolved peptide in solution. This significantly complicates the preparation of a dosage form suitable for intranasal use in humans and animals, in which a concentration is achieved that is necessary and sufficient for effective therapeutic use. Currently, there is no information on a similar dosage form based on peptides of the PB-1 polymerase complex (including peptide analogue [17] and prototype peptide [18]).

Известно применение ДМСО в медицине как самостоятельно в виде раствора, в частности в качестве противовоспалительного средства местного применения (Димексид), регистрационное удостоверение ЛП-004005, ОАО «Кемеровская фармацевтическая фабрика», Россия), так и в качестве фармацевтически приемлемого носителя в составе лекарственных средств, в частности для лечения кожи или ткани слизистой оболочки млекопитающего [20]. Установлено, что в присутствии ДМСО, как правило, значительно повышается транспорт многих веществ, в том числе лекарственных, через биологические мембраны. При подобной ускоренной доставке нередко меняется не только фармакокинетика лекарств, но может иметь место потенцирование действия препарата. Благодаря этим качествам, сочетающимся с биологической безвредностью, димексид получил широкое распространение в технологии различных лекарственных форм [21]. Способность ДМСО повышать растворимость гидрофобных веществ в воде обусловливает его использование в качестве компонента, обеспечивающего растворимость труднорастворимых субстанций, а также стабильность растворенных форм этих субстанций [22]. Так, введение в состав лекарственной композиции ДМСО в концентрации 20-25 мас. % обеспечивает лучшее растворение метисазона и способствует проникновению лекарственного средства в инфицированную вирусом клетку [10]. В евразийском патенте № 011863 [23] описан стабилизирующий эффект ДМСО в отношении ряда температурно-чувствительных пептидов (гастрина, холецистокинина, секретина), который выражается в предотвращении разложения этих пептидов и сохранении их активности в образцах млекопитающих (в сыворотке и плазме) и проявляется в диапазоне концентраций от 1 до 10 об.%, преимущественно 4-6 об.%.It is known that DMSO is used in medicine as a solution alone, in particular as a topical anti-inflammatory drug (Dimexide), registration certificate LP-004005, Kemerovo Pharmaceutical Factory OJSC, Russia), and as a pharmaceutically acceptable carrier in medicines , in particular for the treatment of skin or tissue of a mucous membrane of a mammal [20]. It was found that in the presence of DMSO, as a rule, the transport of many substances, including drugs, through biological membranes is significantly increased. With such accelerated delivery, not only the pharmacokinetics of the drugs often change, but potentiation of the drug’s effect can also occur. Due to these qualities, combined with biological harmlessness, dimexide is widely used in the technology of various dosage forms [21]. The ability of DMSO to increase the solubility of hydrophobic substances in water determines its use as a component ensuring the solubility of sparingly soluble substances, as well as the stability of the dissolved forms of these substances [22]. So, the introduction into the composition of the medicinal composition DMSO at a concentration of 20-25 wt. % provides better dissolution of methisazone and promotes the penetration of the drug into the virus-infected cell [10]. Eurasian patent No. 011863 [23] describes the stabilizing effect of DMSO with respect to a number of temperature-sensitive peptides (gastrin, cholecystokinin, secretin), which is expressed in preventing the decomposition of these peptides and maintaining their activity in mammalian samples (in serum and plasma) and is manifested in the concentration range from 1 to 10 vol.%, mainly 4-6 vol.%.

Известно использование этанола в медицине как в виде основного действующего вещества различных кожных антисептиков [24], так и в качестве одного из компонентов различных растворителей [25, 26]. Так, известно использование бинарного растворителя этанол–вода для растворения гидрофобных пептидов, а именно растворения DL-a-аланил-Р-аланина [25]. При этом любые изменения количественного состава данного растворителя влияют на его взаимодействия с пептидом. Кроме того, известно, что этанол повышает растворимость в составе трехкомпонентных растворителей, в частности растворимость мелоксикама в растворителе вода–N–метилпирролидон–этанол в сравнении с данными по растворимости мелоксикама в двухкомпонентной системе вода–N-метилпирролидон [26]. Также известно влияние этанола на повышения проницаемости мембран [27]. Однако в общедоступной литературе отсутствуют сведения о взаимодействиях в многокомпонентной системе Пептид–ДМСО–этанол–вода, которые в заявленных диапазонах концентраций обеспечивали бы повышение растворимости Пептида при стабилизации его активной формы в растворе в динамике.The use of ethanol in medicine is known both in the form of the main active substance of various skin antiseptics [24], and as one of the components of various solvents [25, 26]. Thus, it is known to use a binary ethanol – water solvent for dissolving hydrophobic peptides, namely, dissolving DL-a-alanyl-P-alanine [25]. Moreover, any changes in the quantitative composition of this solvent affect its interaction with the peptide. In addition, it is known that ethanol increases the solubility in the composition of ternary solvents, in particular, the solubility of meloxicam in a water – N – methylpyrrolidone – ethanol solvent in comparison with the data on the solubility of meloxicam in a two-component water – N-methylpyrrolidone system [26]. The influence of ethanol on increasing membrane permeability is also known [27]. However, in the public literature there is no information on interactions in the multicomponent Peptide – DMSO – ethanol – water system, which, in the claimed concentration ranges, would provide an increase in the solubility of the Peptide while stabilizing its active form in solution in dynamics.

Таким образом, при анализе патентной и научно-технической документации, определяющей уровень техники в области, к которой относится изобретение, не выявлено лекарственных средств, которым были бы присущи все признаки заявленного решения. Кроме того, при анализе указанных документов не обнаружено известности влияния признаков предложенного решения на технический результат, достигаемый при его реализации. Таким образом, заявленное изобретение соответствует, по мнению Заявителя, условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».Thus, in the analysis of patent and scientific and technical documentation that determines the level of technology in the field to which the invention relates, no drugs were identified that would have all the features of the claimed solution. In addition, the analysis of these documents did not reveal the popularity of the influence of the features of the proposed solution on the technical result achieved during its implementation. Thus, the claimed invention meets, according to the Applicant, the conditions of patentability "novelty" and "inventive step".

Технической проблемой является необходимость разработки лекарственного средства, обладающего высокой активностью в отношении устойчивых к действию существующих препаратов штаммов вируса гриппа А, а также вновь возникающих штаммов, пригодного для интраназального применения при лечении гриппа у людей и животных.A technical problem is the need to develop a drug with high activity against resistant to existing drugs strains of influenza A virus, as well as newly emerging strains suitable for intranasal use in the treatment of influenza in humans and animals.

Техническим результатом является повышение растворимости Пептида и агрегативной стабильности раствора для достижения и сохранения в динамике концентрации активного компонента, необходимой и достаточной для эффективного интраназального применения. The technical result is to increase the solubility of the Peptide and the aggregative stability of the solution to achieve and maintain the dynamics of the concentration of the active component, necessary and sufficient for effective intranasal use.

Технический результат достигается тем, что композиция на основе пептида, подавляющего репликацию вируса гриппа А, последовательности 6-14 белка полимеразного комплекса РВ1 вируса гриппа, ацетилированного по N-концу и амидированного по С-концу, формулы Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH₂ для лечения гриппа, согласно изобретению дополнительно содержит диметилсульфоксид, этанол и воду, при следующих соотношениях компонентов, мас. %:The technical result is achieved in that a composition based on a peptide that inhibits the replication of influenza A virus, sequence 6-14 of the protein of the polymerase complex PB1 of influenza virus, acetylated at the N-end and amidated at the C-end, of the formula Ac-Thr-Leu-Leu-Phe -Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH ₂ for the treatment of influenza, according to the invention additionally contains dimethyl sulfoxide, ethanol and water, in the following ratios of components, wt. %:

олигопептидoligopeptide 0,04-0,080.04-0.08 диметилсульфоксидdimethyl sulfoxide 5,5-8,35.5-8.3 этанолethanol 3,93.9 водаwater остальноеrest

Выбор оптимальных параметров заявленной композиции включал: подбор оптимального растворителя (состоящего из одного или несколько компонентов), выбор и обоснование оптимальных диапазонов концентраций растворителя (из одного или нескольких компонентов), а также выбор и обоснование терапевтически эффективной концентрации Пептида. The selection of the optimal parameters of the claimed composition included: the selection of the optimal solvent (consisting of one or more components), the selection and justification of the optimal ranges of solvent concentrations (of one or more components), as well as the selection and justification of a therapeutically effective concentration of the Peptide.

Используемый в экспериментах Пептид синтезировали, как это описано в работе [18], твердофазным методом на 2-Cl-тритилхлоридной смоле (емкостью 1,55 ммоль/г) по Fmoc-/t-Bu стратегии с использованием стандартных методик последовательного наращивания цепи. Очистку Пептида проводили методом препаративной обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в градиентном режиме в системе ацетонитрил (AN)–вода–трифторуксусная кислота (TFA). Фракции, содержащие целевой компонент, после объединения и концентрирования в вакууме подвергали лиофилизации. Чистота Пептида составила не менее 95 %. ВЭЖХ проводили в условиях: жидкостный хроматограф с УФ-детектором, колонка из нержавеющей стали с размерами 2,0х150 мм, заполненная сорбентом октадецилсиликагелем Triart C18 (YMC) с размером зерна 3 мк, в градиенте подвижной фазы: фаза А: 1,0 мл TFA в 1000 мл воды очищенной; фаза Б: 1,0 мл TFA в 1000 мл AN при скорости 0,2 мл/мин. Хроматографировали 5,0 мкл испытуемого раствора препарата. Структура Пептида подтверждена масс-спектрометрически (MALDI-TOF).The peptide used in the experiments was synthesized, as described in [18], by the solid-phase method on a 2-Cl-trityl chloride resin (1.55 mmol / g capacity) according to the Fmoc- / t-Bu strategy using standard methods of sequential chain extension. The peptide was purified by preparative reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) in the gradient mode in the acetonitrile (AN) –water – trifluoroacetic acid (TFA) system. Fractions containing the target component, after combining and concentration in vacuo, were lyophilized. The peptide purity was at least 95%. HPLC was carried out under the conditions of: a liquid chromatograph with a UV detector, a stainless steel column with a size of 2.0x150 mm, filled with a Triart C18 octadecyl silica gel sorbent (YMC) with a grain size of 3 microns, in the gradient of the mobile phase: phase A: 1.0 ml TFA in 1000 ml of purified water; phase B: 1.0 ml TFA in 1000 ml AN at a rate of 0.2 ml / min. Chromatographic 5.0 μl of the test solution of the drug. Peptide structure confirmed by mass spectrometry (MALDI-TOF).

В результате предварительных исследований авторов заявленного решения в экспериментах на культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)pdm09 было установлено, что эффективная концентрация Пептида при его применении in vitro составляла 50 мкг/мл (ED₅₀ – 4,3 мкМ) [18]. As a result of preliminary studies of the authors of the claimed solution in experiments on cell culture of MDCK against influenza virus A / California / 07/2009 (H1N1) pdm09, it was found that the effective concentration of the Peptide when used in vitro was 50 μg / ml (ED₅₀- 4.3 μM) [18].

Учитывая, что Пептид практически нерастворим в воде и в водных растворах солей, были проведены исследования в отношении двух потенциальных растворителей – диметилсульфоксида (Димексид, концентрат для приготовления растворов для наружного применения, регистрационное удостоверение ЛСР-001906/08-180308, 2017, ООО «Тульская фармацевтическая фабрика», Россия) и этанола (Спирт этиловый медицинский ректифицированный, ФС.2.1.0036.15; ООО «Росбио», Россия). Для разбавления использовали воду очищенную (по ФС.2.2.00.20.15).Considering that the Peptide is practically insoluble in water and in aqueous solutions of salts, studies were carried out on two potential solvents - dimethyl sulfoxide (Dimexide, concentrate for the preparation of solutions for external use, registration certificate LSR-001906 / 08-180308, 2017, Tulskaya LLC pharmaceutical factory ”, Russia) and ethanol (rectified medical ethyl alcohol, FS.2.1.0036.15; LLC“ Rosbio ”, Russia). For dilution used purified water (according to FS.2.2.00.20.15).

Разведение веществ проводили в поддерживающей питательной среде для клеток MDCK. Состав поддерживающей среды: на 100 мл среды альфа-МЕМ (Питательная среда альфа-МЕМ с глутамином, ООО «Биолот», Санкт-Петербург) вносили 1,0 мл раствора антибиотика ципрофлоксацина («Синтез», Курган) и 0,1 мл раствора TPCK-трипсина (конечная концентрация в среде 2,0 мкг/мл, кат. номер Т1426, «Sigma», Германия).Dilution of substances was carried out in a supportive nutrient medium for MDCK cells. The composition of the supporting medium: per 100 ml of alpha-MEM medium (Alpha-MEM nutrient medium with glutamine, Biolot LLC, St. Petersburg), 1.0 ml of ciprofloxacin antibiotic solution (Synthesis, Kurgan) and 0.1 ml of solution were added TPCK-trypsin (final concentration in the medium of 2.0 μg / ml, Cat. No. T1426, Sigma, Germany).

Готовили серию разведений препаратов (10,0; 7,5; 5,0 и 2,5 об. %). Опыт проводили в 3 повторах для каждой концентрации. A series of dilutions of the preparations was prepared (10.0; 7.5; 5.0 and 2.5 vol.%). The experiment was carried out in 3 repetitions for each concentration.

Односуточную культуру клеток MDCK-FR, выращенную на 96-луночных планшетах («Orange Scientific», Китай), концентрация клеток 6Ч104/лунку планшета, проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. В работу отбирали планшеты, где сомкнутость клеток составляла 95 % и выше. Планшеты двукратно отмывали теплой средой альфа-МЕМ, не содержащей сыворотки, после чего на клетки монослоя в планшете вносили разведения биназы в соответствующей концентрации в объеме 100 мкл в каждую лунку в 3 повторах на каждую тестируемую концентрацию. Планшеты инкубировали 24 ч при температуре 37°С в присутствии 5 % СО₂. На конечном сроке проводили оценку результата визуально в инвертированном микроскопе, оценивая состояние монослоя в присутствии разных концентраций препарата по сравнению с клетками в контрольных лунках. A one-day MDCK-FR cell culture grown on 96-well plates (Orange Scientific, China), a cell concentration of 6 × 104 / well, was examined visually using an inverted microscope for monolayer integrity. Tablets were selected for the work, where the cell closeness was 95% and higher. The plates were washed twice with warm serum-free alpha-MEM medium, after which dilutions of binase were added to the monolayer cells in the plate in an appropriate concentration in a volume of 100 μl to each well in 3 replicates for each concentration tested. The plates were incubated 24 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO ₂ . At the final date, the result was evaluated visually in an inverted microscope, assessing the state of the monolayer in the presence of different concentrations of the drug compared to cells in control wells.

На первом этапе для определения рабочего диапазона параметров раствора Пептида в ДМСО оценивали проникновение Пептида в клетки и цитотоксичность при различных концентрациях ДМСО. Для исследования проникновения Пептида использовали FITC–модифицированную производную этого пептида. Учитывая, что противовирусные свойства данного соединения не отличались от свойств Пептида, считали, что кинетика проникновения модельного флуоресцентно меченного соединения не отличается от кинетики проникновения Пептида в клетки на модели клеточной культуры А549. Растворы пептида добавляли к клеточной культуре A549 до конечной концентрации по Пептиду 50 мкг/мл. Проникновение Пептида в клетку детектировали при помощи конфокальной микроскопии, фиксируя флуоресценцию FITC-красителя внутри клетки. В экспериментах использовали растворы FITC-меченого Пептида в концентрации 50 мкг/мл в водном растворе, содержащем 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 об. % ДМСО. At the first stage, to determine the working range of the parameters of the Peptide solution in DMSO, the penetration of the Peptide into the cells and cytotoxicity at various concentrations of DMSO were evaluated. To study the penetration of the Peptide, a FITC-modified derivative of this peptide was used. Considering that the antiviral properties of this compound did not differ from the properties of the Peptide, it was believed that the kinetics of penetration of the model fluorescently labeled compound did not differ from the kinetics of penetration of the Peptide into cells in the A549 cell culture model. Peptide solutions were added to A549 cell culture to a final Peptide concentration of 50 μg / ml. Penetration of the Peptide into the cell was detected by confocal microscopy, fixing the fluorescence of the FITC dye inside the cell. In the experiments, solutions of FITC-labeled Peptide at a concentration of 50 μg / ml in an aqueous solution containing 2.5 were used; 5.0; 7.5 and 10.0 vol. % DMSO.

О цитотоксичности растворов ДМСО судили по результатам микротетразолиевого теста (МТТ) [28]. МТТ-тест основан на восстановлении МТТ (желтый водорастворимый тетразолиевый краситель) под действием дегидрогеназ живых клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется спектрофотометрически. Раствор МТТ готовили в физиологическом растворе в концентрации 0,5 мг/мл. Перед внесением раствора МТТ клетки промывали 0,1 мл физиологического раствора. Далее вносили 0,1 мл раствора МТТ в каждую лунку. После 1,5 ч контакта МТТ при З7°С при концентрации СО₂ 5 % с клетками лунки промывали и заливали 0,1 мл этилового спирта 96 %, после чего оптическую плотность в лунках измеряли на ридере Victor 2 1440 (Perkin Elmer, США) при длине волны 535 нм. Основываясь на полученных данных рассчитывали ЦТД₅₀ (дозу препарата в лунке, при которой погибает 50 % клеток).The cytotoxicity of DMSO solutions was judged by the results of microtetrazolium test (MTT) [28]. The MTT test is based on the restoration of MTT (yellow water-soluble tetrazolium dye) under the action of living cell dehydrogenases to form blue formazan crystals, the amount of which is measured spectrophotometrically. The MTT solution was prepared in saline at a concentration of 0.5 mg / ml. Before introducing the MTT solution, the cells were washed with 0.1 ml of physiological saline. Next, 0.1 ml of MTT solution was added to each well. After 1.5 h of MTT contact at 3 ° C at a CO2 concentration _of 5% with cells, the wells were washed and 0.1 ml of ethanol 96% was added, and the optical density in the wells was measured on a Victor 2 1440 reader (Perkin Elmer, USA) at a wavelength of 535 nm. Based on the obtained data, the CTD _{50 was} calculated (the dose of the drug in the well at which 50% of the cells die).

В табл. 1 представлены результаты качественной оценки проникновения Пептида в клетку и процентное содержание клеток, инкубировавшихся в присутствии различных концентраций ДМСО, определенное по оптической плотности раствора формазана, образовавшегося под действием дыхательных ферментов клеток, получавших вещества.In the table. Figure 1 shows the results of a qualitative assessment of the penetration of the Peptide into the cell and the percentage of cells incubated in the presence of various concentrations of DMSO, determined by the optical density of the formazan solution formed by the respiratory enzymes of the cells receiving the substance.

Данные табл. 1 показывают, что при концентрации ДМСО в исходном растворе менее 5,0 об. %, а также при его отсутствии при проведении конфокальной микроскопии наблюдали гранулы нерастворенного пептида, сорбировавшегося на поверхности клеток, при отсутствии характерной флуоресценции красителя внутри клеток. В диапазоне концентраций 5,0-7,5 об. % по ДМСО отмечали характерную флуоресценцию красителя внутри клеток, свидетельствовавшую о проникновении Пептида. При концентрации 10,0 об. % также выявлено проникновение красителя внутрь клеток. Однако значимое снижение (в 1,7 раза) содержания выживших клеток по сравнению с аналогичными показателями диапазона 2,5-7,5 об. % (достоверно не различавшихся в пределах диапазона), свидетельствовало о токсичности ДМСО в концентрации 10,0 об. %. Таким образом, был определен рабочий диапазон концентраций ДМСО в композиции (5-10 %), в котором имело место проникновение пептида внутрь клеток при отсутствии токсического действия ДМСО. The data table. 1 show that when the concentration of DMSO in the initial solution is less than 5.0 vol. %, and also in its absence, confocal microscopy observed granules of undissolved peptide adsorbed on the surface of the cells in the absence of characteristic fluorescence of the dye inside the cells. In the concentration range of 5.0-7.5 vol. % by DMSO noted the characteristic fluorescence of the dye inside the cells, indicating the penetration of the Peptide. At a concentration of 10.0 vol. % also revealed the penetration of the dye into the cells. However, a significant decrease (1.7 times) in the content of surviving cells compared with similar indicators in the range of 2.5-7.5 vol. % (not significantly different within the range), testified to the toxicity of DMSO at a concentration of 10.0 vol. % Thus, the working range of DMSO concentrations in the composition was determined (5-10%), in which the peptide penetrated into the cells in the absence of the toxic effect of DMSO.

На втором этапе при переходе от исследований на культуре клеток к интраназальному применению у экспериментальных животных (мышей) принимали во внимание следующие факторы. Авторами изобретения было экспериментально установлено, что максимально допустимый суммарный объем раствора для разового введения в нос мыши составил 50 мкл (по 25 мкл в каждую ноздрю). На основании проведенных опытов оптимальный суммарный объем раствора для однократного введения в нос был определен как 30 мкл (по 15 мкл в каждую ноздрю). Первоначальную расчетную эффективную дозу для скрининга на мышах вычисляли с использованием однокамерной модели фармакокинетики лекарственного препарата при однократном введении [29]. Расчетная эффективная доза для мыши при оптимальном суммарном объеме введения составила 20 мг/мл, что значимо превышает эффективную дозу, установленную на культуре клеток. At the second stage, when switching from studies on cell culture to intranasal use in experimental animals (mice), the following factors were taken into account. The inventors experimentally established that the maximum allowable total solution volume for a single injection into the nose of the mouse was 50 μl (25 μl in each nostril). Based on the experiments, the optimal total solution volume for a single injection into the nose was determined to be 30 μl (15 μl in each nostril). The initial calculated effective dose for screening in mice was calculated using a single-chamber model of the pharmacokinetics of a drug with a single injection [29]. The calculated effective dose for the mouse at the optimal total volume of administration was 20 mg / ml, which significantly exceeds the effective dose established on the cell culture.

В связи с тем, что гидрофобный Пептид склонен к образованию фибрилл молекулярных размеров, то оценить подлинную растворимость Пептида затруднительно. Количество растворенного Пептида при различных концентрациях (2,5-10,0 об. %) ДМСО оценивали, проводя серию последовательных разведений препаратов. Due to the fact that the hydrophobic Peptide is prone to the formation of molecular size fibrils, it is difficult to assess the true solubility of the Peptide. The amount of dissolved Peptide at various concentrations (2.5-10.0 vol.%) DMSO was evaluated by conducting a series of serial dilutions of the preparations.

При этом приготовление образцов, не содержащих ДМСО, осуществляли следующим образом. Для контроля полной растворимости Пептида: навеску Пептида растворили в 40 % AN до концентрации 5,0 мг/мл; затем выполнили серию последовательных разбавлений до концентраций 2,0; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мг/мл раствором 40 % AN. Для контроля растворимости Пептида без ДМСО: навеску пептида растворили в H₂O до концентрации 5,0 мг/мл. Затем выполнили серию последовательных разбавлений полученной суспензии до концентраций 2,0; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мг/мл в H₂O.In this case, the preparation of samples not containing DMSO was carried out as follows. To control the complete solubility of the Peptide: a portion of the Peptide was dissolved in 40% AN to a concentration of 5.0 mg / ml; then a series of successive dilutions were performed to concentrations of 2.0; 1.0; 0.5; 0.2; 0.1 mg / ml with a solution of 40% AN. To control the solubility of the Peptide without DMSO: a weighed portion of the peptide was dissolved in H ₂ O to a concentration of 5.0 mg / ml. Then a series of successive dilutions of the resulting suspension was performed to concentrations of 2.0; 1.0; 0.5; 0.2; 0.1 mg / ml in H ₂ O.

Приготовление образцов, содержащих ДМСО, осуществляли следующим образом. Навеску Пептида растворили в 100 % ДМСО. Приготовили исходный раствор с концентрацией 10 мг/мл, также из него получили растворы 5,0; 2,0 и 1,0 мг/мл в 100 % ДМСО. В пробирки поместили необходимое количество мкл раствора Пептида, добавили 100 % ДМСО (для достижения необходимой итоговой концентрации), а затем H₂O до конечного объема 100 мкл. Samples containing DMSO were prepared as follows. A portion of the Peptide was dissolved in 100% DMSO. An initial solution with a concentration of 10 mg / ml was prepared; solutions of 5.0 were also obtained from it; 2.0 and 1.0 mg / ml in 100% DMSO. The required amount of μl of the Peptide solution was placed in the tubes, 100% DMSO was added (to achieve the required final concentration), and then H ₂ O to a final volume of 100 μl.

Все подготовленные образцы (содержащие и не содержащие ДМСО) центрифугировали при 20000g, 40 мин, +4°C для осаждения нерастворившегося Пептида. Надосадочную жидкость отобрали и провели обращенно-фазную хроматографию (колонка – YMC-Triart C18, 2,0х150 мм, размер гранул 3 мк; подвижная фаза А – 0,1 % TFA в деионизованной воде, подвижная фаза В – 0,1 % TFA в AN; скорость подвижной фазы – 0,2 мл/мин; элюция линейным градиентом 10-80 % «В» в течение 15 мин; детекция по длине волны 214 нм; объем вводимой пробы – 10 мкл). Пики, соответствующие времени выхода Пептида (время удерживания Rt составило /13,7±0,03/ мин), интегрировали. Сравнили площади пиков Пептида в растворителе и в AN, считая растворимость Пептида в AN равной 100 %. All prepared samples (containing and not containing DMSO) were centrifuged at 20,000 g, 40 min, + 4 ° C to precipitate the insoluble Peptide. The supernatant was taken and reverse phase chromatography (column — YMC-Triart C18, 2.0 × 150 mm, granule size 3 μm; mobile phase A — 0.1% TFA in deionized water, mobile phase B — 0.1% TFA in AN; the speed of the mobile phase is 0.2 ml / min; elution with a linear gradient of 10-80% "B" for 15 min; detection at a wavelength of 214 nm; the volume of the injected sample is 10 μl). Peaks corresponding to the peptide exit time (retention time Rt was / 13.7 ± 0.03 / min) were integrated. Peak areas of the Peptide in the solvent and in AN were compared, assuming that the solubility of the Peptide in AN was 100%.

Доли Пептида в растворенной форме в зависимости от концентрации исходного раствора и концентрации ДМСО представлены в табл. 2. Shares of the Peptide in dissolved form, depending on the concentration of the initial solution and the concentration of DMSO, are presented in table. 2.

Из данных табл. 2 видно, что в рабочем диапазоне концентраций ДМСО (5,0-7,5 об. %) наблюдаются низкие значения исследуемого параметра – доля растворенного Пептида превышает 50 % только при исходной концентрации Пептида 0,1 мг/мл. Увеличение исходной концентрации Пептида свыше 0,4 об. % приводит к резкому уменьшению исследуемого параметра (2,9-5,4 %), что свидетельствует о низкой растворимости Пептида в ДМСО в рабочем диапазоне концентраций ДМСО. Таким образом, при использовании в качестве растворителя только ДМСО достижение эффективной концентрации, которая оказалась бы необходимой и достаточной для эффективного интраназального применения не представляется возможным.From the data table. Figure 2 shows that in the working range of DMSO concentrations (5.0–7.5 vol.%), Low values of the studied parameter are observed — the fraction of the dissolved Peptide exceeds 50% only at the initial Peptide concentration of 0.1 mg / ml. The increase in the initial concentration of the Peptide over 0.4 vol. % leads to a sharp decrease in the studied parameter (2.9-5.4%), which indicates the low solubility of the Peptide in DMSO in the working range of DMSO concentrations. Thus, when using only DMSO as a solvent, it is not possible to achieve an effective concentration that would be necessary and sufficient for effective intranasal use.

На основании полученных данных была испытана трехкомпонентная система растворителей – ДМСО+этанол+вода. На третьем этапе была исследована цитотоксичность растворителя, содержащего два активных компонента, при варьировании концентрации этанола. Цитотоксичность растворов ДМСО+этанол+вода оценивали с помощью МТТ-теста (по количеству выживших клеток) аналогично описанному на первом этапе. Based on the data obtained, a three-component solvent system was tested - DMSO + ethanol + water. At the third stage, the cytotoxicity of the solvent containing two active components was studied with varying ethanol concentrations. The cytotoxicity of DMSO + ethanol + water solutions was evaluated using the MTT test (by the number of surviving cells) as described in the first stage.

Результаты представлены в табл. 3.The results are presented in table. 3.

Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что начиная с концентрации 7,5 об. %, проявляются токсические эффекты этанола – количество выживших клеток достоверно снижается с 98 до 84 %. The data table. 3 indicate that starting from a concentration of 7.5 vol. %, the toxic effects of ethanol are manifested - the number of surviving cells significantly decreases from 98 to 84%.

Количество растворенного Пептида при концентрациях ДМСО 5,0 об. % и 7,5 об. % и концентрации этанола 5,0 об. % оценивали аналогично описанному на втором этапе, проводя последовательно растворение в смеси растворителей при каждой определенной концентрации Пептида. При этом для контроля полной растворимости Пептида в AN образец приготовили, как это описано на втором этапе. Для приготовления растворов Пептида в воде навеску пептида растворили в 5,0 об. % этаноле, 5,0 об. % ДМСО до концентрации 5,0 мг/мл, затем выполнили серию последовательных разбавлений полученной суспензии до концентраций 2,0; 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мг/мл. Аналогичным образом готовили растворы Пептида в 5,0 об. % этаноле, 7,5 об. % ДМСО в воде.The amount of dissolved Peptide at DMSO concentrations of 5.0 vol. % and 7.5 vol. % and ethanol concentration of 5.0 vol. % was evaluated as described in the second stage, sequentially dissolving in a solvent mixture at each specific concentration of the Peptide. Moreover, to control the complete solubility of the Peptide in AN, a sample was prepared as described in the second stage. To prepare solutions of the Peptide in water, a weighed portion of the peptide was dissolved in 5.0 vol. % ethanol, 5.0 vol. % DMSO to a concentration of 5.0 mg / ml, then a series of successive dilutions of the resulting suspension was performed to concentrations of 2.0; 1.0; 0.5; 0.2; 0.1 mg / ml. Similarly prepared solutions of the Peptide in 5.0 vol. % ethanol, 7.5 vol. % DMSO in water.

Через 2, 24, 72 и 144 ч после приготовления растворов, подвергавшихся инкубации при комнатной температуре, образцы перемешивали и отбирали из них по 100 мкл, центрифугировали и проводили обращенно-фазную хроматографию, как описано во втором этапе. Доли Пептида в растворенной форме в зависимости от концентрации исходного раствора и концентрации смеси ДМСО-этанол через 2 ч после инкубации представлены в табл. 4, а зависимость содержания Пептида в растворенной форме по отношению к его общей массе в растворе в смеси ДМСО–этанол от времени инкубации выборочно приведена в табл. 5.After 2, 24, 72, and 144 hours after the preparation of the solutions, which were incubated at room temperature, the samples were mixed and 100 μl were taken from them, centrifuged, and reverse phase chromatography was performed as described in the second stage. The fractions of the Peptide in dissolved form, depending on the concentration of the initial solution and the concentration of the DMSO-ethanol mixture 2 hours after incubation, are presented in table. 4, and the dependence of the content of the Peptide in dissolved form in relation to its total mass in solution in a DMSO – ethanol mixture on the incubation time is shown selectively in Table. five.

Данные табл. 4 показывают, что применение трех-компонентной системы растворителей – ДМСО (5,0-7,5 об. %; 5,5-8,3 мас. %)–этанол (5,0 об. %; 3,9 мас. %)–вода повышает (в сравнении с двух-компонентной системой растворителей ДМСО-вода в тех же концентрациях) растворимость Пептида, увеличивая значение верхней границы диапазона рабочих исходных концентраций до 0,8 мг/мл (доля растворенного Пептида 68,4-68,7 мас. %). Из табл. 5 видно, что при исходных концентрациях Пептида свыше 1,0 мас. % имеет место достоверное снижение доли растворенного Пептида при инкубации свыше 72 ч, тогда как в диапазоне исходных концентраций Пептида 0,4-0,8 мас. % раствор сохраняет стабильность в течение периода наблюдения (144 ч). Это позволяет рассматривать вышеуказанные параметры как оптимальные для лекарственной композиции для интраназального применения. The data table. 4 show that the use of a three-component solvent system - DMSO (5.0-7.5 vol.%; 5.5-8.3 wt.%) - ethanol (5.0 vol.%; 3.9 wt. %) - water increases (in comparison with the two-component solvent system DMSO-water at the same concentrations) the solubility of the Peptide, increasing the value of the upper limit of the range of working initial concentrations to 0.8 mg / ml (the proportion of the dissolved Peptide 68.4-68, 7 wt.%). From the table. 5 shows that at initial concentrations of the Peptide in excess of 1.0 wt. % there is a significant decrease in the proportion of dissolved Peptide during incubation over 72 hours, while in the range of initial concentrations of the Peptide 0.4-0.8 wt. % solution remains stable during the observation period (144 h). This allows us to consider the above parameters as optimal for the medicinal composition for intranasal use.

Следует также отметить, что растворы Пептида в 5,0 об. % и 7,5 об. % ДМСО при содержании этанола менее 5,0 об. % были неустойчивы и количество растворенного пептида через 2 ч после растворения была ниже предела детектирования используемого метода (в таблицах не приведено).It should also be noted that solutions of the Peptide in 5.0 vol. % and 7.5 vol. % DMSO with an ethanol content of less than 5.0 vol. % were unstable and the amount of dissolved peptide 2 hours after dissolution was below the detection limit of the method used (not shown in tables).

Заявленная композиция поясняется примером.The claimed composition is illustrated by example.

ПримерExample

Определяли противовирусную активность композиции при оптимальных концентрациях ДМСО и этанола в смеси, варьируя при этом концентрацию Пептида. The antiviral activity of the composition was determined at optimal concentrations of DMSO and ethanol in the mixture, while varying the concentration of the Peptide.

Мышей Balb/c линии (самки) массой 16-20 г (возраст 5-7 недель) получали из питомника «Столбовая» (Московская обл.). Животных содержали в стандартных условиях, соответствующих требованиям действующих нормативных и методических документов как РФ, так и международных. В период акклиматизации и эксперимента мышей размещали в поликарбонатных клетках (BENEX а.с., Чешская республика, тип Т3А, S=1200 см²), группами по 21 особь. Кормление животных проводили в соответствии с требованиями действующих в РФ нормативно-методических документов с использованием гранулированного корма для содержания мышей (ООО «Лабораторкорм», Москва) и воды, очищенной и нормированной в соответствии с требованиями действующих в РФ нормативных документов. Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды (температуры 18-22°C и относительной влажности воздуха 50-70 %), NH₃=0,001 мг/м³, CO₂=0,1 %. Световой режим составлял 12 ч света и 12 ч темноты. Никаких существенных отклонений этих параметров в период акклиматизации и в ходе эксперимента не зафиксировано. Лабораторных животных до начала исследования содержали 7 дней для адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных каждый день контролировали клиническое состояние путем визуального осмотра. Животных с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями в экспериментальные группы не включали. Mice Balb / c line (female) weighing 16-20 g (age 5-7 weeks) were obtained from the nursery "Stolbovaya" (Moscow region). The animals were kept in standard conditions that meet the requirements of the current regulatory and methodological documents of both the Russian Federation and international. During acclimatization and experiment, mice were placed in polycarbonate cells (BENEX A.C., Czech Republic, type T3A, S = 1200 cm ² ), in groups of 21 individuals. Feeding of animals was carried out in accordance with the requirements of normative and methodological documents in force in the Russian Federation using granulated feed for keeping mice (LLC “Laboratoryorm”, Moscow) and water purified and normalized in accordance with the requirements of normative documents in force in the Russian Federation. The animals were kept under controlled environmental conditions (temperatures of 18-22 ° C and relative humidity of 50-70%), NH ₃ = 0.001 mg / m ³ , CO ₂ = 0.1%. The light regime was 12 hours of light and 12 hours of darkness. No significant deviations of these parameters were recorded during the acclimatization and during the experiment. Laboratory animals were kept for 7 days before the start of the study for adaptation when grouped in cells. During this period, the clinical condition of the animals was monitored daily by visual inspection. Animals with deviations found during the examination were not included in the experimental groups.

В исследовании использовали штамм вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09, адаптированный к мышам, из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.The study used a strain of influenza virus A / California / 07/09 (H1N1) pdm09, adapted to mice, from the collection of the FSBI “Research Institute of Influenza named after A.A. Smorodintseva "Ministry of Health of Russia.

Исследуемые образцы содержащей Пептид лекарственной формы композиции представляли собой растворы в смеси ДМСО (5,0 об. %) этанол (5,0 об. %) (при концентрации Пептида 1,0 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,4 мг/мл и 0.2 мг/мл). В качестве базового препарата (препарата сравнения) был применен Осельтамивира фосфат («Тамифлю») («LaRoche», Швейцария), лекарственная форма: капсулы для приема внутрь по 75 мг.The test samples containing the peptide dosage form of the composition were solutions in a mixture of DMSO (5.0 vol.%) Ethanol (5.0 vol.%) (At a concentration of Peptide 1.0 mg / ml, 0.8 mg / ml, 0, 6 mg / ml, 0.4 mg / ml and 0.2 mg / ml). Oseltamivir phosphate (“Tamiflu”) (“LaRoche”, Switzerland) was used as the base drug (comparison drug), dosage form: 75 mg oral capsules.

Исследуемые образцы были приготовлены следующим образом. Навески Пептида (0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мг) помещали в пробирку типа Eppendorf объёмом 1,5 мл, затем добавляли водный раствор 5,0 об. % ДМСО 5,0 об. % этанола. После добавления раствор тщательно пипетировали, а затем подвергали перемешиванию при комнатной температуре (25°С) на перемешивателе ELMI Intellimixer RM1L в режиме С1 30 об/мин в течение 60 мин. Полученные растворы затем передавали в виварий для интраназального введения мышам. Хранение растворов между введениями в течение недели осуществляли при +4°С.The test samples were prepared as follows. Weighed portions of the Peptide (0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 mg) were placed in a 1.5 ml Eppendorf tube, then an aqueous solution of 5.0 vol. % DMSO 5.0 vol. % ethanol. After addition, the solution was thoroughly pipetted, and then subjected to stirring at room temperature (25 ° C) on an ELMI Intellimixer RM1L stirrer in C1 mode at 30 rpm for 60 minutes. The resulting solutions were then transferred to the vivarium for intranasal administration to mice. Storage of solutions between injections for a week was carried out at + 4 ° C.

Исследуемые образцы композиции вводили животным интраназально раз в день в объеме 0,01 мл по лечебной (через 1, 2, 3 и 4 дня после инфицирования) схеме. Базовый препарат «Тамифлю» применяли для контроля специфичности патологического процесса. Навеску препарата растирали в фарфоровой ступке с 50 мкл Tween-20, добавляли необходимый объем физиологического раствора и вводили животным перорально при помощи желудочного зонда один раз в сутки в объеме 0,2 мл из расчета 20 мг/кг/сут по лечебной схеме (через 1, 2, 3 и 4 дня после инфицирования). Животным из группы отрицательного контроля вводили растворитель (смесь 5,0 % ДМСО и 5,0 % этанол) в том же объеме и по той же схеме, что и исследуемый пептид. Мышей заражали интраназально под легким эфирным наркозом вирусом в дозе 4,1Ч10⁵ ТИД₅₀ (50 % тканевая ингибирующая доза) на мышь в объеме 15 мкл, что составило 1,2 ЛД₅₀ (21 мышь в группе). На 3-й день после заражения по 6 животных из каждой группы подвергали эвтаназии, вскрывали и изолировали их легкие и ткань носовой полости. Легкие и носовые полости гомогенизировали и использовали для титрования вируса.The studied samples of the composition were administered intranasally to animals once a day in a volume of 0.01 ml according to the treatment schedule (1, 2, 3 and 4 days after infection). The basic drug “Tamiflu” was used to control the specificity of the pathological process. A weighed sample of the preparation was ground in a porcelain mortar with 50 μl Tween-20, the required volume of physiological saline was added, and the animals were orally administered with a gastric tube once a day in a volume of 0.2 ml at the rate of 20 mg / kg / day according to the treatment schedule (after 1 , 2, 3 and 4 days after infection). The animals from the negative control group were injected with a solvent (a mixture of 5.0% DMSO and 5.0% ethanol) in the same volume and according to the same scheme as the studied peptide. Mice were infected intranasally under mild ether anesthesia with a virus in a dose of 4.1 × 10 ⁵ TID ₅₀ (50% tissue inhibitory dose) per mouse in a volume of 15 μl, which amounted to 1.2 LD ₅₀ (21 mice in the group). On the 3rd day after infection, 6 animals from each group were euthanized, their lungs and nasal cavity tissue were opened and isolated. The lungs and nasal cavities were homogenized and used for titration of the virus.

Образцы ткани, изолированные на третий день после заражения у 5 животных из каждой группы, гомогенизировали в физиологическом растворе с помощью прибора TissueLyserII («Qiagen», США) и определяли в гомогенатах инфекционную активность вируса, как описано ниже.Tissue samples isolated on the third day after infection in 5 animals from each group were homogenized in physiological saline using a TissueLyserII instrument (Qiagen, USA) and the infectious activity of the virus was determined in homogenates as described below.

Для оценки уровня репродукции вируса в образцах ткани животных проводили титрование его инфекционной активности в культуре клеток MDCK (4 лунки на каждое разведение). С этой целью клетки MDCK (105 кл./мл) рассевали в лунки культуральных планшетов с плоским дном «Corning», США, (Кат.№ 3585) и выдерживали в течение 24 ч в CO₂-инкубаторе при 36°С в атмосфере 5 % CO₂ до формирования монослоя. Клетки промывали 5 мин средой MEM (ООО «Биолот», Санкт-Петербург) и далее использовали для культивирования вируса. To assess the level of virus reproduction in animal tissue samples, titration of its infectious activity was carried out in an MDCK cell culture (4 wells for each dilution). To this end, MDCK cells (105 cells / ml) were scattered into the wells of Corning flat bottom culture plates, USA (Cat. No. 3585) and incubated for 24 hours in a CO ₂ incubator at 36 ° C in atmosphere 5 % CO ₂ before monolayer formation. Cells were washed for 5 min with MEM medium (Biolot LLC, St. Petersburg) and then used to cultivate the virus.

Из гомогената образцов ткани готовили серию 10-кратных разведений (10^-1 – 10^-7) на среде AlphaМЕМ с добавлением трипсина (1 мкг/мл) и 20 мкг/мл ципрофлоксацина и вносили их в лунки планшета с клетками MDCK. Планшеты инкубировали в течение 72 ч при 36°С в атмосфере 5 % СО₂. По окончании срока инкубации культуральную жидкость (100 мкл на лунку) переносили в лунки планшетов с круглым дном для иммунологических реакций («Медполимер», Санкт-Петербург) и добавляли по 100 мкл на лунку 1 % суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Планшеты выдерживали 1 ч при 20°С, после чего визуально оценивали наличие или отсутствие гемагглютинации в лунках. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в ТИД₅₀ на 100 мкл объема.A series of 10-fold dilutions (10 ^-1 - 10 ^-7 ) on AlphaMEM medium with the addition of trypsin (1 μg / ml) and 20 μg / ml ciprofloxacin were prepared from the homogenate of tissue samples and introduced into the wells of an MDCK cell plate. The plates were incubated for 72 hours at 36 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ . At the end of the incubation period, the culture fluid (100 μl per well) was transferred to the wells of round-bottom plates for immunological reactions (Medpolymer, St. Petersburg) and 100 μl per well of a 1% suspension of chicken red blood cells in physiological solution was added. The plates were kept for 1 h at 20 ° C, after which the presence or absence of hemagglutination in the wells was visually assessed. The virus titer was calculated by the method of Reed and Mench and expressed in TID ₅₀ per 100 μl of volume.

Результаты исследований противовирусной активности заявляемой композиции представлены в табл. 6.The results of studies of the antiviral activity of the claimed composition are presented in table. 6.

Из данных табл. 6 следует, что при интраназальном применении Пептид (в концентрациях 0,4-0,8 мг/мл) в растворителе 5,0 об. % этанол 5,0 об. % ДМСО действует более эффективно, чем препарат сравнения озельтамивира фосфат. From the data table. 6 it follows that with intranasal use of the Peptide (in concentrations of 0.4-0.8 mg / ml) in a solvent of 5.0 vol. % ethanol 5.0 vol. % DMSO is more effective than oseltamivir phosphate comparison drug.

Таким образом, проведенная оценка противовирусной активности заявленной лекарственной композиции показала её высокую эффективность при интраназальном применении у мышей.Thus, the evaluation of the antiviral activity of the claimed drug composition showed its high efficacy in intranasal use in mice.

Источники информацииInformation sources

1. V. N. Petrova and C. A. Russell, “The evolution of seasonal influenza viruses”, Nat. Rev. Microbiol., vol. 16, no. 1, pp. 47–60, 2018.1. V. N. Petrova and C. A. Russell, “The evolution of seasonal influenza viruses”, Nat. Rev. Microbiol., Vol. 16, no. 1, pp. 47-60, 2018.

2. T. M. Sokolova, A. N. Shuvalov, V. V Poloskov, I. M. Shapoval, and M. P. Kostinov, “Grippol, Vaxigrip and influvac vaccines--inductors of innate and adaptive immunity factor genes in human blood cells.”, Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol., no. 5, pp. 37–43, Jan.2. T. M. Sokolova, A. N. Shuvalov, V. V Poloskov, I. M. Shapoval, and M. P. Kostinov, “Grippol, Vaxigrip and influvac vaccines - inductors of innate and adaptive immunity factor genes in human blood cells.”, Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol., No. 5, pp. 37–43, Jan.

3. S. Chang et al., “Cryo-EM structure of influenza virus RNA polymerase complex at 4.3 Е resolution”, Mol. Cell, vol. 57, no. 5, pp. 925–35, Mar. 2015.3. S. Chang et al., “Cryo-EM structure of influenza virus RNA polymerase complex at 4.3 E resolution”, Mol. Cell, vol. 57, no. 5, pp. 925–35, Mar. 2015.

4. A. V Vasin, O. A. Temkina, V. V Egorov, S. A. Klotchenko, M. A. Plotnikova, and O. I. Kiselev, “Molecular mechanisms enhancing the proteome of influenza A viruses: an overview of recently discovered proteins,” Virus Res., vol. 185, pp. 53–63, Jun. 2014.4. A. V Vasin, O. A. Temkina, V. V Egorov, S. A. Klotchenko, M. A. Plotnikova, and O. I. Kiselev, “Molecular mechanisms enhancing the proteome of influenza A viruses: an overview of recently discovered proteins,” Virus Res., Vol. 185, pp. 53–63, Jun. 2014.

5. J. Romanova et al., “Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNS1 H5N1 influenza vaccine,” PLoS One, vol. 4, no. 6, p. e5984, Jun. 2009.5. J. Romanova et al., “Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNS1 H5N1 influenza vaccine,” PLoS One, vol. 4, no. 6, p. e5984, Jun. 2009.

6. О. И. Киселев, “Иммуносупрессия при беременности и риски при вирусных инфекциях”, vol. 85, no. 6, 2013.6. O. I. Kiselev, “Immunosuppression during pregnancy and the risks of viral infections”, vol. 85, no. 6, 2013.

7. A. Moscona, “Global Transmission of Oseltamivir-Resistant Influenza”, N. Engl. J. Med., vol. 360, no. 10, pp. 953–956, 2009.7. A. Moscona, “Global Transmission of Oseltamivir-Resistant Influenza”, N. Engl. J. Med., Vol. 360, no. 10, pp. 953–956, 2009.

8. J. P. Wong et al., “Aerosol and nasal delivery of vaccines and antiviral drugs against seasonal and pandemic influenza”, Expert Rev. Respir. Med., vol. 4, no. 2, pp. 171–177, 2010.8. J. P. Wong et al., “Aerosol and nasal delivery of vaccines and antiviral drugs against seasonal and pandemic influenza”, Expert Rev. Respir. Med., Vol. 4, no. 2, pp. 171–177, 2010.

9. Рекомбинантный человеческий белок СС10 для лечения гриппа: патент 2554745, Рос. Федерация. № 2012120671; заявл. 13.10.10; опубл. 27.06.15, Бюл. № 18. 9. Recombinant human protein CC10 for the treatment of influenza: patent 2554745, Ros. Federation. No. 2012120671; declared 10/13/10; publ. 06/27/15, Bull. Number 18.

10. Лекарственное средство для профилактики и лечения вирусных болезней животных: патент 2168988, Рос. Федерация. № 99116456; заявл. 29.07.99; опубл. 10.06.01, Бюл. № 17.10. A drug for the prevention and treatment of viral diseases of animals: patent 2168988, Ros. Federation. No. 99116456; declared 07/29/99; publ. 06/10/01, Bull. Number 17.

11. C. Scholtissek, G. Quack, H. D. Klenk, and R. G. Webster, “How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives”, Antiviral Res., vol. 37, no. 2, pp. 83–95, 1998.11. C. Scholtissek, G. Quack, H. D. Klenk, and R. G. Webster, “How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives”, Antiviral Res., Vol. 37, no. 2, pp. 83–95, 1998.

12. A. Moscona, “Neuraminidase Inhibitors for Influenz”, N. Engl. J. Med., vol. 353, no. 13, pp. 1363–1373, Sep. 2005.12. A. Moscona, “Neuraminidase Inhibitors for Influenz”, N. Engl. J. Med., Vol. 353, no. 13, pp. 1363–1373, Sep. 2005.

13. C. E. Mancuso, M. P. Gabay, L. M. Steinke, and S. J. VanOsdol, “Peramivir: An intravenous neuraminidase inhibitor for the treatment of 2009 H1N1 influenza”, Ann. Pharmacother., vol. 44, no. 7–8, pp. 1240–1249, 2010.13. C. E. Mancuso, M. P. Gabay, L. M. Steinke, and S. J. VanOsdol, “Peramivir: An intravenous neuraminidase inhibitor for the treatment of 2009 H1N1 influenza”, Ann. Pharmacother., Vol. 44, no. 7–8, pp. 1240–1249, 2010.

14. T. C. M. Li, M. C. W. Chan, and N. Lee, “Clinical Implications of Antiviral Resistance in Influenza”, Viruses, vol. 7, no. 9, pp. 4929–4944, Jan. 2015.14. T. C. M. Li, M. C. W. Chan, and N. Lee, “Clinical Implications of Antiviral Resistance in Influenza,” Viruses, vol. 7, no. 9, pp. 4929–4944, Jan. 2015.

15. Y. Abed and G. Boivin, “A Review of Clinical Influenza A and B Infections With Reduced Susceptibility to Both Oseltamivir and Zanamivir”, Open Forum Infect. Dis., vol. 4, no. 3, pp. 1–10, 2017.15. Y. Abed and G. Boivin, “A Review of Clinical Influenza A and B Infections With Reduced Susceptibility to Both Oseltamivir and Zanamivir”, Open Forum Infect. Dis., Vol. 4, no. 3, pp. 1-10, 2017.

16. M. Elliott, “Zanamivir: From drug design to the clinic”, Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci., vol. 356, no. 1416, pp. 1885–1893, 2001.16. M. Elliott, “Zanamivir: From drug design to the clinic”, Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci., Vol. 356, no. 1416, pp. 1885–1893, 2001.

17. Противовирусный пептид, подавляющий репликацию вируса гриппа: патент 2492178, Рос. Федерация. № 2012115794/10; заявл. 19.04.12; опубл.10.09.13, Бюл. № 25.17. Antiviral peptide that inhibits the replication of influenza virus: patent 2492178, Ros. Federation. No. 2012115794/10; declared 04/19/12; publ. 10.09.13, Bull. Number 25.

18. O. V Matusevich et al., “Synthesis and antiviral activity of PB1 component of the influenza A RNA polymerase peptide fragments”, Antiviral Res., vol. 113, pp. 4–10, Jan. 2015.18. O. V Matusevich et al., “Synthesis and antiviral activity of PB1 component of the influenza A RNA polymerase peptide fragments”, Antiviral Res., Vol. 113, pp. 4-10, Jan. 2015.

19. Y. A. Zabrodskaya et al., “The amyloidogenicity of the influenza virus PB1-derived peptide sheds light on its antiviral activity”, Biophys. Chem., vol. 234, pp. 16–23, 2018.19. Y. A. Zabrodskaya et al., “The amyloidogenicity of the influenza virus PB1-derived peptide sheds light on its antiviral activity”, Biophys. Chem., Vol. 234, pp. 16-23, 2018.

20. Короткие биоактивные пептиды для ускорения заживления ран: патент 2606753 Рос. Федерация. № 2015138925; заявл. 21.01.2014; опубл. 10.01.2017.20. Short bioactive peptides to accelerate wound healing: patent 2606753 Ros. Federation. No. 2015138925; declared 01/21/2014; publ. 01/10/2017.

21. Григорович Н.А. и др. “Нанотехнологический лекарственный препарат – димексид. Химические, биологические свойства. Клиническое применение. Обзор литературы”, Н.А. Григорович, С.Ф. Дорофтиенко, Т.М. Григорович. URL: https://mductor.weebly.com/uploads/1/0/8/4/10843070/dmso.pdf (дата обращения 25.06.2018).21. Grigorovich N.A. and others. “Nanotechnological drug - dimexide. Chemical, biological properties. Clinical application. Literature Review ”, N.A. Grigorovich, S.F. Doroftienko, T.M. Grigorovich. URL: https://mductor.weebly.com/uploads/1/0/8/4/10843070/dmso.pdf (accessed June 25, 2018).

22. Гулякин И.Д. и др., “Основные методы повышения растворимости гидрофобных и труднорастворимых веществ”, Разработка и регистрация лекарственных средств, №2 (15). Фармконтракт, М, 52-59, 2016.22. Gulyakin I.D. et al., “Basic methods for increasing the solubility of hydrophobic and sparingly soluble substances,” Development and Registration of Medicines, No. 2 (15). Pharmcontract, M, 52-59, 2016.

23. Применение диметилсульфоксида (ДМСО) для стабилизации гастрина, холецистокинина, секретина и способ стабилизации указанных пептидов: патент 011863, Евразийская патентная организация, № 200602088; заявл. 09.05.2005, опубл. 30.06.2009.23. The use of dimethyl sulfoxide (DMSO) for stabilizing gastrin, cholecystokinin, secretin and a method for stabilizing these peptides: Patent 011863, Eurasian Patent Organization, No. 200602088; declared 05/09/2005, publ. 06/30/2009.

24. Волкова С.В. “Этиловый спирт как основное действующее вещество кожных антисептиков”, Поликлиника. –2008. –С.108.24. Volkova S.V. “Ethyl alcohol as the main active ingredient of skin antiseptics”, Polyclinic. –2008. –P.108.

25. Смирнов, В.И. “Энтальпии растворения DL–α–аланина в смесях вода–спирты при 298.15 К,” В.И. Смирнов, И.Н. Межевой, В.Г. Баделин, Журн. физ. хим. –2004. –Т.78, №2. – С. 280–283.25. Smirnov, V.I. “The enthalpies of the dissolution of DL – α – alanine in water – alcohol mixtures at 298.15 K,” V.I. Smirnov, I.N. Megevoi, V.G. Badelin, Journal. physical Chem. –2004. –T.78, No. 2. - S. 280–283.

26. Ляпунов А.Н. “Исследование вязкости смешанных растворителей, состоящих из воды, этанола, n-метилпирролидона и растворимости в них мелоксикама”, А.Н. Ляпунов, Е.П. Безуглая, А.П. Краснопёрова, Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. –2015. –№ 22 (219). Выпуск 32 –С.138–145.26. Lyapunov A.N. “Study of the viscosity of mixed solvents consisting of water, ethanol, n-methylpyrrolidone and the solubility of meloxicam in them”, A.N. Lyapunov, E.P. Bezuglaya, A.P. Krasnopyorova, Scientific reports of Belgorod State University. Series Medicine. Pharmacy. 2015. –№ 22 (219). Issue 32 –C.138–145.

27. Михайлова Р.В. “Влияние этанола на образование внеклеточной и клеточно-связанной каталаз Penicillium Piceum БИМ F-371 Д”, Р.В. Михайлова, И.В. Мороз, А.Г. Лобанок, А. Радукан, Вестник национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук. –2013. –№1, – С. 43-47.27. Mikhailova R.V. “The effect of ethanol on the formation of extracellular and cell-bound catalases of Penicillium Piceum BIM F-371 D”, R.V. Mikhailova, I.V. Frost, A.G. Lobanok, A. Radukan, Bulletin of the National Academy of Sciences of Belarus. A series of biological sciences. 2013. –№1, - S. 43-47.

28. Киселев О.И. “Оценка метаболических показателей in vitro как модельная система тестирования цитотоксичности противовирусных препаратов”, О.И. Киселев, Е.М. Еропкина, Т.Д. Смирнова, М.Ю. Еропкин, Е.В. Ильинская, В.П. Сухинин, А.Р. Прочуханова, В.В. Зарубаев, Экспериментальная и клиническая фармакология. 2006. Т. 69. № 1. С. 65-70.29. 28. Kiselev O.I. “In vitro metabolic assessment as a model system for testing the cytotoxicity of antiviral drugs”, O.I. Kiselev, E.M. Eropkina, T.D. Smirnova, M.Yu. Eropkin, E.V. Ilyinskaya, V.P. Sukhinin, A.R. Prochukhanova, V.V. Zarubaev, Experimental and Clinical Pharmacology. 2006.V. 69. No. 1. S. 65-70.29.

29. “Фармакология”, Под ред. проф. Р.Н. Аляутдина. - 4-е изд., перераб. и доп. - 2008. - 832 с. : ил.29. “Pharmacology”, Ed. prof. R.N. Alayautdina. - 4th ed., Revised. and add. - 2008 .-- 832 s. : ill.

Claims (2)

Композиция на основе олигопептида, подавляющего репликацию вируса гриппа А, последовательности 6-14 белка полимеразного комплекса РВ1 вируса гриппа, ацетилированного по N-концу и амидированного по С-концу, формулы Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH₂ для лечения гриппа, отличающаяся тем, что дополнительно содержит диметилсульфоксид, этанол и воду, при следующих соотношениях компонентов, мас.%:A composition based on an oligopeptide that inhibits the replication of influenza A virus, sequence 6-14 of the protein of the polymerase complex of the influenza virus PB1, acetylated at the N-end and amidated at the C-end, of the formula Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val -Pro-Ala-NH ₂ for the treatment of influenza, characterized in that it further comprises dimethyl sulfoxide, ethanol and water, in the following ratios of components, wt.%: ОлигопептидOligopeptide 0,04-0,080.04-0.08 ДиметилсульфоксидDimethyl sulfoxide 5,5-8,35.5-8.3 ЭтанолEthanol 3,93.9 ВодаWater ОстальноеRest