RU2694713C1 - Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products - Google Patents
Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694713C1 RU2694713C1 RU2018134645A RU2018134645A RU2694713C1 RU 2694713 C1 RU2694713 C1 RU 2694713C1 RU 2018134645 A RU2018134645 A RU 2018134645A RU 2018134645 A RU2018134645 A RU 2018134645A RU 2694713 C1 RU2694713 C1 RU 2694713C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ovis
- mutton
- beef
- bos
- dna
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.The invention relates to veterinary microbiology, in particular to methods for determining the species of meat using polymerase chain reaction.
Известно определение видовой принадлежности мяса для этого используют концентрированные экстракты различных групп мышц, например грудной, бедренной, голени и др. одной особи, предварительно определяют свежесть мяса по рН, затем подвергают фотометрированию, измеряют их оптическую плотность при длине волны 310-320 нм, составляют сравнительную таблицу, по которой определяют видовую принадлежность исследуемого мяса. Способ позволяет сократить сроки и повысить точность определения видовой принадлежности мяса птиц, однако - не высокая точность (патент РФ №2178169, кл. G01N 33/12. 2002).It is known to determine the species of meat for this purpose. Concentrated extracts of various muscle groups are used for this purpose, for example, chest, femur, tibia, etc. comparative table, which determines the species of the studied meat. The method allows to reduce the time and improve the accuracy of determining the species of poultry meat, however - not high accuracy (RF patent No. 2178169, class G01N 33/12. 2002).
Также известен способ идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающий выделение ДНК из баранины (Ovis) и говядины (Boss) сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции, проведение 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК баранины (Ovis) и говядины (Bos) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага и положительных контрольных образцов - содержащих фрагменты геномов ДНК баранины (Ovis) и говядины (Bos), измерение специфических сигналов и сигнала контролей и интерпретацию результатов (Сорокина М.Ю. Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции, Москва, 2004 - прототип).Also known is a method of identifying the species of mutton and beef in food raw materials, feed and food products, including the isolation of DNA from mutton (Ovis) and beef (Boss) by the sorption method, the formulation of a single-step polymerase chain reaction, conducting 45 cycles of amplification with real-time detection with using mutton-specific (Ovis) and beef (Bos) genome-specific oligonucleotide primers, probes, dyes, internal control sample in the form of bacteriophage suspension and positive control samples - containing mutton fragments of mutton (Ovis) and beef (Bos) genomes, measurement of specific signals and control signals and interpretation of results (M. Sorokina. Thesis dissertation on veterinary medicine on the development of a test system for determining the species of meat ingredients in feeds by polymerase chain reaction, Moscow, 2004 - prototype).
Однако в известном способе нуклеотидная последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, что влияет на точность диагностирования видовой принадлежности говядины или баранины в кормах. Кроме того, отсутствует возможность идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье и пищевых продуктах.However, in the known method, the nucleotide sequence is directly readable by electrophoregram. The length of the fragment that can be deciphered by this method is limited by the resolution of the gel electrophoresis method, which affects the accuracy of diagnosis of the species of beef or mutton in the feed. In addition, there is no possibility to identify the species of mutton and beef in food raw materials and food products.
Техническим результатом является повышение точности идентификации видовой принадлежности говядины или баранины и расширение функциональных возможностей.The technical result is to increase the accuracy of identification of species of beef or lamb and the expansion of functionality.
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах, включающем выделение ДНК из баранины (Ovis) и говядины (Bos) сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции, проведение 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК баранины (Ovis) и говядины (Bos) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага и положительных контрольных образцов - содержащих фрагменты геномов ДНК баранины (Ovis) и говядины (Bos), измерение специфических сигналов и сигнала контролей и интерпретацию результатов, согласно изобретению дополнительно исследуют продовольственное сырье и пищевые продукты, содержащие ДНК баранины (Ovis) и говядины (Bos), проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для баранины (Ovis); ROX/Orange - для говядины (Bos) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца, интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, при этом для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца - смесь содержащую фрагменты геномов баранины (Ovis), говядины (Bos) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:The technical result is achieved in that in the method of identifying the species of mutton and beef in food raw materials, feed and food products, including the isolation of DNA from mutton (Ovis) and beef (Bos) by the sorption method, the formulation of a single-step polymerase chain reaction, 45 cycles of amplification with by real-time detection using the mutton-specific Ovine and beef (Bos) genome-specific oligonucleotide primers, probes, dyes, internal control sample in suspension b kteriofag and positive control samples containing mutton DNA fragments (Ovis) and beef (Bos) genomes, measurement of specific signals and control signals and interpretation of results, according to the invention, food raw materials and food products containing mutton DNA (Ovis) and beef (Bos ), conduct polymerase chain reaction with fluorescence detection using a thermal cycler type Rotor-Gene Q and measure the accumulation of fluorescent signals through the channels of the corresponding fluorescent dyes: JOE / Yello w for a specific mutton signal (Ovis); ROX / Orange - for beef (Bos) and Cy5 / Red - for the internal control sample, interpretation of the results is carried out based on the presence or absence of intersection of the fluorescence curve with the threshold line, if the fluorescence signal accumulation curves go up to 35 cycles, the response is considered positive, and if the curves do not intersect or cross the
Новизна заявляемого способа состоит в идентификации видовой принадлежности баранины и говядины с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.The novelty of the proposed method consists in identifying the species of mutton and beef using a polymerase chain reaction (PCR) with fluorescent detection in real time, which in turn allows determining the presence of their ingredients in food raw materials, feed and food products with high accuracy.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».Signs that distinguish the claimed technical solution from the prototype, aimed at achieving a technical result and not identified in the study of this and related areas of science and technology and, therefore, meet the criterion of "inventive step".
Заявляемый способ рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».The inventive method is recommended to use in specialized veterinary, sanitary-epidemiological, livestock, agricultural enterprises, which meets the criterion of "industrial applicability".
Сущность изобретения поясняется чертежом, где на рисунках 1-6 представлены скриншоты с дисплея прибора Rotor-Gene Q: рис. 1 - представлен график канала Су5 для внутреннего контрольного образца (ВКО); рис. 2 - таблица количественных данных для Cycling A.Red (ВКО); рис. 3 - представлен график канала JOE/Yellow для специфического сигнала баранины (Ovis); рис. 4 - представлен график канала ROX/Orange - для говядины (Bos); рис. 5 - таблица количественных данных для Cycling A.Yellow (Ovis) и A.Orange (Bos.).The invention is illustrated in the drawing, where Figures 1-6 show screenshots from the display of the device Rotor-Gene Q: fig. 1 shows a graph of the channel Cy5 for the internal control sample (ASD); rice 2 - quantitative table for Cycling A.Red (CTP);
Способ идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах осуществляется следующим образом.The method of identification of the species of mutton and beef in food raw materials, feed and food products is as follows.
Для исследования кормов, продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание ДНК баранины (Ovis) и говядины (Bos) проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для баранины (Ovis); ROX/Orange - для говядины (Bos) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный. Для повышения точности идентификации мяса для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь содержащую фрагменты геномов баранины (Ovis), говядины (Bos) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:To study mutton DNA (Ovis) and beef (Bos) feed, food raw materials and foodstuffs, they conduct a polymerase chain reaction with fluorescence detection using a thermal cycler of the Rotor-Gene Q type under appropriate time-temperature amplification modes and measure the accumulation of fluorescent signals through the channels appropriate fluorescent dyes: JOE / Yellow for a specific mutton signal (Ovis); ROX / Orange for beef (Bos) and Cy5 / Red for internal control sample. Interpretation of the results is carried out on the basis of the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line, if the fluorescent signal accumulation curves go up to 35 cycles, the reaction result is considered positive, and if the curves do not cross the threshold line or cross it after 35 cycles, the reaction result is negative . To improve the accuracy of meat identification for the internal control sample, bacteriophage T4 suspension with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide sequences per 1 μl is used; if the concentration of copies of nucleotide sequences deviates up or down, then repetitive doubtful samples are observed. For a positive control sample, a mixture containing fragments of mutton genomes (Ovis), beef (Bos) and bacteriophage T4 taken in a 1: 1: 1 ratio with the following nucleotide sequences is used:
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: суспензии и фрагмента генома со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.The use of different forms of bacteriophage T4 material for different types of control: suspensions and a fragment of the genome with primers and probe specific to it is due to the fact that this allows controlling the correct passage of the reaction in each tube, as well as controlling the stage of DNA extraction from the samples.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.When designing primers and probes, the main requirements were: the degree of homology (complementarity) with the selected gene region; lack of semicontinuous regions inside oligonucleotides and complementarity with each other in order to prevent the emergence of stable secondary structures (dimers); proximity of primer annealing temperature values.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.The design of specific primers and probe was carried out using computer programs based on the analysis of nucleotide sequences of reference strains and isolates published on GenBank and selection of conditions for real-time PCR using the developed primers and probe bearing fluorophore and quencher, and a complementary part of amplified co specific fragment primers.
Праймеры, специфичные для барана (Ovis aries) и быка (говядины) (Bos taurus) были отобраны на основе митохондриальных последовательностей ДНК геномов барана (Ovis aries isolate SH21 ATP synthase F0 subunit 6 (ATP6) gene, partial cds; mitochondrial, код доступа KY453456.1 complete genome, участок между 122 и 353) и быка (Bos taurus mitochondrion, complete genome, код доступа MF925711, участок между 4724 и 4957). Праймеры спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации подобраны олигонуклеотидные флуоресцентно-меченные зонды Ovis Р (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Ovis F и Ovis R) и BosP (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров BosF и Bos R). Зонды были помечены красителями FAM и HEX. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геноме любых видов растений и животных, которые потенциально встречаются вблизи тех, которые определены в кормах и пищевых продуктах.Primers specific for ram (Ovis aries) and bull (beef) (Bos taurus) were selected based on the mitochondrial DNA sequences of the ram's genomes (Ovis aries isolate SH21 ATP synthase F0 subunit 6 (ATP6) gene, partial cds; mitochondrial, access code KY453456 .1 complete genome, section between 122 and 353) and a bull (Bos taurus mitochondrion, complete genome, access code MF925711, section between 4724 and 4957). Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and examined using BLAST to confirm their specificity. For the detection of amplification products, oligonucleotide fluorescently labeled Ovis P probes were selected (complementary to the nucleotide sequence portion limited by the annealing positions of the Ovis F and Ovis R primers) and BosP (complementary to the nucleotide sequence portion, and limited by the annealing positions of the BosF and Bos R primers). The probes were labeled with FAM and HEX dyes. Using the program "Oligo 6.0" describes the main properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR. None of the selected sequences are found in the genome of any plant and animal species that are potentially found in the vicinity of those identified in feed and food.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.As an internal control, bacteriophage T4 was used, having genomic DNA of the order of 169 thousand base pairs (Enterobacteria phage T4T, complete genome GenBank: HM137666.1). As a result of the analysis, a region between 400 and 500 nucleotides was selected, containing unique nucleotide sequences, and the primary structures of oligonucleotide primers flanking the selected region of the genome were calculated. Primers were designed using Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) and examined using BLAST to confirm their specificity.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.For the detection of amplification products, an oligonucleotide fluorescently-labeled T4P probe was selected, complementary to the region of the nucleotide sequence bounded by the annealing positions of the primers T4F and T4R. The probe was labeled with the dye Su5. Using the program "Oligo 6.0" describes the main properties of the calculated oligonucleotides, which determined the possibility of their use in PCR.
Пример конкретного осуществления способа идентификации видовой принадлежности баранины и говядины в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах.An example of a specific implementation of the method of identifying the species of lamb and beef in food raw materials, feed and food products.
Для подтверждения эффективности способа были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.To confirm the effectiveness of the method were used dry feed in the form of fish and meat meal; raw and thermally processed meat products, i.e. meat semi-finished products.
От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.From a sample of dense consistency, a total sample weighing 10-50 g is selected for testing. Granulated or canned products before the study (10-20 g) are ground in a mortar to a homogeneous state.
Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.Laboratory samples (20-40 mg) are taken for research in disposable microtubes with a capacity of 1.5 ml in two repetitions. Selected laboratory samples are directed to DNA extraction.
Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-БАРАНИНА-ГОВЯДИНА-ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)The study is carried out using a set of reagents "PCR-LAMBER-BEEF-FACTOR". The kit consists of a set of reagents for multiplex PCR (kit No. 1) and a set of control samples (kit No. 2). The kit is available in two versions: 1) For analysis of 55 samples (including control samples)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).2) To analyze 110 samples (including control samples).
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-БАРАНИНА-ГОВЯДИНА-ФАКТОР» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных видов Ovis aries (бараны) и Bos taurus (быки) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени ТУ21.10.60-152-51062356-2018, http.7/www.vetfaktor.ru/.The kits are used in accordance with the instructions for use of the PCR-BARANINA-BEEF-FACTOR reagent kit to determine the species of the ruminant tissues of Ovis aries (rams) and Bos taurus (bulls) tissues using the polymerase chain reaction (PCR) with fluorescent detection in the mode real time TU21.10.60-152-51062356-2018, http.7 / www.vetfaktor.ru /.
Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.The kit is shown in Tables 1 and 2.
Исследования состоит из трех этапов:The research consists of three stages:
- экстракция нуклеиновая кислота (НК);- extraction of nucleic acid (NC);
- проведение реакции ПЦР РВ;- carrying out the reaction of RT PCR;
- учет результатов анализа.- accounting of the results of the analysis.
* Возможна легкая опалесценция* Light opalescence is possible.
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательный контрольный образец (ОКО), вносят по 10 мкл внутренний контрольный образец (ВКО) для баранины и говядины (БГ) в качестве которого используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл.For the extraction (isolation) of NK, the required number of 1.5 ml disposable tubes, including the negative control of excretion, is taken from the studied samples. All test tubes with the test samples, including the test tube for the negative control sample (EAD), make 10 μl of an internal control sample (ASD) for mutton and beef (GD), which is used as a suspension of bacteriophage T4 with a concentration of 5 × 10 3 copies of nucleotide sequences on 1 mkl.
Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР.The next stage is the preparation of samples for PCR.
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.The total volume of the reaction mixture is 25 μl, the volume of the DNA sample is 10 μl.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительный контрольный образец (ПКО) БГ, ВКО БГ и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов баранины (Ovis), говядины (Bos) и бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1.Successful completion of the reaction is controlled using a positive control sample (FFP) BG, EKB BG and DNA buffer. As FFP, use a mixture containing fragments of the genomes of lamb (Ovis), beef (Bos) and bacteriophage T4 taken in a 1: 1: 1 ratio.
В отдельной пробирке смешать компоненты набора из расчета на каждую реакцию:In a separate test tube, mix the components of the kit for each reaction:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ БГ;5 μl PCR MIXTURE BG;
10 мкл ПЦР БУФЕР БГ;10 µl PCR BUFFER BG;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE0.5 µl TAQ POLYMERASE
Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.Stir the mixture on the vortex and drop the drops by brief centrifugation.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.Select the required number of tubes for DNA amplification of the studied and control samples. Add 15 µl of the prepared reaction mixture.
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.Place the test tubes prepared for PCR in the cells of the amplifier and use the instrument software. Next, carry out PCR RV with fluorescence detection.
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.The parameters of temperature-time amplification on the device "Rotor-Gene Q" are presented in table 3.
Интерпретация результатов анализа.Interpretation of analysis results.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.The data obtained - the accumulation curves of the fluorescent signal are analyzed using the software used by the instrument for carrying out PCR in accordance with the manufacturer's instructions for the instrument.
Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).Recording of PCR RT results is carried out by the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at an appropriate level (which corresponds to the presence or absence of the threshold value of the Ct cycle for the sample under study).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.The result is considered reliable if the positive and negative controls of amplification and extraction of DNA are correctly passed in accordance with Table 4.
Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на каналах ROX/Orange и JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов (рис 1, 2). В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.The appearance of any Ct value in Table 4 results for negative control of the VK extraction stage on the ROX / Orange and JOE / Yellow channels and for negative control of the PCR stage K- on any of the channels indicates the presence of contamination of reagents or samples (Figure 1, 2). In this case, the analysis results for all samples are considered invalid. It is required to repeat the analysis of all samples, as well as to take measures to identify and eliminate the source of contamination.
Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на каналах JOE/Yellow и/или ROX/Orange) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.Samples for which the Ct value on the Cy5 / Red channel is missing or exceeds the 35th cycle (and a positive result was not obtained on the JOE / Yellow and / or ROX / Orange channels) require repeated research from the DNA extraction stage. The delay in the values of threshold cycles for the samples under study indicates the presence of inhibitors in the sample (s) or errors in the extraction of DNA or in the formulation of the RT PCR reaction.
В образце обнаружена ДНК Ovis aries баранины, если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис. 3, 5).Ovis aries mutton DNA was detected in the sample if the signal is observed exponentially on the JOE / Yellow channel, and the Ct values of the control samples are within the normal range (Table 4, Fig. 3, 5).
В образце обнаружена ДНК Bos taurus говядины, если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале Rox/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис. 4, 5).Bostaurus beef DNA was detected in the sample if the signal is growing exponentially on the Rox / Orange channel, while the Ct values of the control samples are within the normal range (Table 4, fig. 4, 5).
Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow и/или ROX/Orange значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным (содержание целевой ДНК ниже предела обнаружения метода).If for the JOE / Yellow and / or ROX / Orange channels, the Ct value is determined later than the 37th cycle with correct positive and negative controls, the sample is re-examined from the DNA extraction stage. If at repeated Ct setting more than 37 results are considered negative (the content of the target DNA is below the detection limit of the method).
Образец считается отрицательным (ДНК Ovis aries и/или Bos taurus не обнаружена) если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале Rox/Orange и/или JOE/Yellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4, рис 3, 4, 5), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.A sample is considered negative (Ovis aries and / or Bos taurus DNA is not detected) if the Ct value is not determined (no specific signal growth is observed) on the Rox / Orange and / or JOE / Yellow channel while the Ct values of control samples are within the normal range (Table 4, fig 3, 4, 5), and the Ct value on the Cy5 / Red channel is less than 35.
Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания баранины и говядины представлен в таблице 5.For the studied samples (dry food and meat semi-finished products) the limit of accuracy of the content of mutton and beef is presented in table 5.
Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с электрофоретической детекцией. Оказалось чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при обнаружении примеси тканей баранины и говядины в кормах в 10 раз выше, чем ПЦР с электрофоретической детекцией.To prove the effectiveness of using PCR with fluorescent detection in real time, a comparative sensitivity analysis was performed with the prototype using a PCR method with electrophoretic detection. It turned out that the sensitivity of PCR with fluorescence detection when detecting the impurity of mutton and beef tissues in feed is 10 times higher than that of PCR with electrophoretic detection.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134645A RU2694713C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018134645A RU2694713C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2694713C1 true RU2694713C1 (en) | 2019-07-16 |
Family
ID=67309458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018134645A RU2694713C1 (en) | 2018-10-01 | 2018-10-01 | Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2694713C1 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2726248C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for detection of dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products |
| RU2726433C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of common hedgehog (erinaceus europaeus) dna tissue in dry fodder and semi-finished meat |
| RU2726427C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of bear tissue (ursus) in dry fodder and semi-finished meat products |
| RU2728612C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of dna of domestic dog tissue (canis lupus familiaris) in dry fodder and meat semi-products |
| RU2728662C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of domestic cat tissue dna (felis silvestris catus) in dry fodders and semi-finished meat products |
| RU2742952C1 (en) * | 2019-10-16 | 2021-02-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of rat and mouse tissue species in dry feed and semi-fenished meat products |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2177830C2 (en) * | 1996-12-06 | 2002-01-10 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс | Reactors |
-
2018
- 2018-10-01 RU RU2018134645A patent/RU2694713C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2177830C2 (en) * | 1996-12-06 | 2002-01-10 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс | Reactors |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| СОРОКИНА М.Ю, Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции, авто диссертации, Москва, 2004. * |
| СОРОКИНА М.Ю, Разработка тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции, автореферат диссертации, Москва, 2004. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2726248C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for detection of dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products |
| RU2726433C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of common hedgehog (erinaceus europaeus) dna tissue in dry fodder and semi-finished meat |
| RU2726427C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of bear tissue (ursus) in dry fodder and semi-finished meat products |
| RU2728612C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of dna of domestic dog tissue (canis lupus familiaris) in dry fodder and meat semi-products |
| RU2728662C1 (en) * | 2019-10-16 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of domestic cat tissue dna (felis silvestris catus) in dry fodders and semi-finished meat products |
| RU2742952C1 (en) * | 2019-10-16 | 2021-02-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for identification of rat and mouse tissue species in dry feed and semi-fenished meat products |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2694713C1 (en) | Method for identification of species identity of mutton and beef in food raw materials, fodder and food products | |
| RU2700480C1 (en) | Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
| Sawyer et al. | Real-time PCR for quantitative meat species testing | |
| RU2645263C1 (en) | Test system of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction | |
| CN110551851A (en) | CAMP primer group for amplifying ASFV, kit and application | |
| CN111876502B (en) | Method for identifying Brucella S2 vaccine strain by dual real-time fluorescent quantitative PCR and kit used by same | |
| CN103773896B (en) | The fluorescence quantitative RT-PCR detecting agent of west nile virus, test kit and detection method thereof | |
| CN113718063A (en) | Multi-chip digital PCR primer, kit and detection method for simultaneously detecting ASFV, PCV2 and PRV viruses | |
| RU2726555C1 (en) | Test system for detecting dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2700479C1 (en) | Method for determining species identity of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products | |
| RU2725539C1 (en) | Test system for identification of dna tissues of rats and mice in dry fodder and meat semi-products | |
| RU2645262C1 (en) | Method of detecting dna of african swine fever virus by real-time polymerase chain reaction | |
| RU2702858C1 (en) | Test system for identification of mutton and beef species identity in food raw material, fodder and food products | |
| RU2725216C1 (en) | Test system for determination of woodpecker (picidae) dna in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2726248C1 (en) | Method for detection of dna of donkey (equus asinus) tissue in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2726242C1 (en) | Test system for detecting dna of lumpy skin disease virus (lsdv) in biological material of animals using a polymerase chain reaction in real time | |
| RU2814552C1 (en) | Method of identifying dna tissue of japanese mackerel (scomber japonicus) in fish products, meat and bone fish meal and feed using real-time polymerase chain reaction | |
| RU2726429C1 (en) | Test system for identification of bear tissue (ursus) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2714287C1 (en) | Method for woodpecker (picidae) tissue dna determination in dry feed and semi-finished meat products | |
| RU2726427C1 (en) | Method for identification of bear tissue (ursus) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2728612C1 (en) | Method for identification of dna of domestic dog tissue (canis lupus familiaris) in dry fodder and meat semi-products | |
| RU2726433C1 (en) | Method for identification of common hedgehog (erinaceus europaeus) dna tissue in dry fodder and semi-finished meat | |
| RU2725215C1 (en) | Test system for identification of common hedgehog (erinaceus europaeus) tissue dna in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2728639C1 (en) | Test system for identification of dna of domestic cat tissue (felis silvestris catus) in dry fodder and semi-finished meat products | |
| RU2728662C1 (en) | Method for identification of domestic cat tissue dna (felis silvestris catus) in dry fodders and semi-finished meat products |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201002 |