RU2692552C1 - Method for producing site-directed translocations in saccharomyces cerevisiae cells - Google Patents
Method for producing site-directed translocations in saccharomyces cerevisiae cells Download PDFInfo
- Publication number
- RU2692552C1 RU2692552C1 RU2018113518A RU2018113518A RU2692552C1 RU 2692552 C1 RU2692552 C1 RU 2692552C1 RU 2018113518 A RU2018113518 A RU 2018113518A RU 2018113518 A RU2018113518 A RU 2018113518A RU 2692552 C1 RU2692552 C1 RU 2692552C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- translocations
- translocation
- saccharomyces cerevisiae
- ura3δ0
- Prior art date
Links
- 230000005945 translocation Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 8
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229940071257 lithium acetate Drugs 0.000 claims abstract 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 3
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 claims 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 4
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100186130 Arabidopsis thaliana NAC052 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100529509 Arabidopsis thaliana RECQL4A gene Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101100314162 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) YBL053 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035186 DNA excision repair protein ERCC-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034157 DNA mismatch repair protein Msh2 Human genes 0.000 description 1
- 102100021147 DNA mismatch repair protein Msh6 Human genes 0.000 description 1
- 102100021820 E3 ubiquitin-protein ligase RNF4 Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 101000876529 Homo sapiens DNA excision repair protein ERCC-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001134036 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh2 Proteins 0.000 description 1
- 101000968658 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh6 Proteins 0.000 description 1
- 101001107086 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF4 Proteins 0.000 description 1
- 101000650344 Homo sapiens RecQ-mediated genome instability protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000702606 Homo sapiens Structure-specific endonuclease subunit SLX4 Proteins 0.000 description 1
- 229910015837 MSH2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100025354 Macrophage mannose receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002564 Polyethylene Glycol 3500 Polymers 0.000 description 1
- 102100027431 RecQ-mediated genome instability protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150008223 SLX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150095313 SRS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100427180 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RAD6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100203168 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SGS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100099943 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TOP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150058921 Slx1b gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022826 Structure-specific endonuclease subunit SLX1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031003 Structure-specific endonuclease subunit SLX4 Human genes 0.000 description 1
- 101150016610 UBC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003024 molecular redistribution determination method Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 101150019486 slx1a gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 101150044955 tof1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области генетики и молекулярной биологии и касается способа получения транслокантов между любыми локусами, принадлежащими различным хромосомам, в клетках почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Предложенный способ может быть использован для моделирования хромосомных транслокаций в клетках эукариот в исследовательских и биотехнологических целях.The invention relates to the field of genetics and molecular biology and relates to a method for producing translocants between any loci belonging to different chromosomes in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae cells. The proposed method can be used for modeling chromosomal translocations in eukaryotic cells for research and biotechnological purposes.
Уровень техникиThe level of technology
В последнее время широкие возможности для редактирования и манипулирования геномами различных организмов связаны с РНК-зависимыми эндонуклеазами семейства CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Эти белки являются сиквенс-специфичными защитными механизмами архей и бактерий против чужеродных плазмид и вирусов (Cell, 2016, 164: 29-44). Они встречаются у 50% бактерий и 90% архей. CRISPR представляют собой генетические локусы, включающие серии прямых повторов длиной 20-50 п.н. и разделяющие их уникальные спейсеры того же размера. Как оказалось, спейсеры происходят из вирусных геномов и коньюгативных плазмид, остающихся от соответствующих инфекций. Области CRISPR фланкированы cas генами. Cas-белки играют важную роль в работе указанных защитных систем. CRISPR/Cas системы можно разделить на шесть основных типов, причем наиболее важными являются первые три (Cell, 2016, 164: 29-44). Характерным маркером систем типа I являются Cas3 белки, несущие домены хеликазы и нуклеазы. Они разрезают чужеродную ДНК, в распознавании которой участвует мультибелковый комплекс Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defense). У систем типа II в разрушении чужеродной ДНК принимает участие единственный белок Cas9. Для систем типа III характерен Cas 10 белок, образующий Cascade-подобный комплекс для поиска и деградации чужеродных ДНК.Recently, opportunities for editing and manipulating the genomes of various organisms are associated with RNA-dependent endonucleases of the CRISPR / Cas family (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). These proteins are the sequence-specific defense mechanisms of archaea and bacteria against foreign plasmids and viruses (Cell, 2016, 164: 29-44). They are found in 50% of bacteria and 90% of archaea. CRISPR are genetic loci that include a series of direct repeats 20-50 bp long. and sharing their unique spacers of the same size. As it turned out, spacers originate from viral genomes and conjugative plasmids remaining from the respective infections. CRISPR regions are flanked by cas genes. Cas proteins play an important role in the operation of these protective systems. CRISPR / Cas systems can be divided into six main types, the first three being the most important (Cell, 2016, 164: 29-44). A characteristic marker of type I systems are Cas3 proteins that carry the helicase and nuclease domains. They cut foreign DNA in recognition of which the Cascade multi-protein complex (CRISPR-associated complex for antiviral defense) participates. In type II systems, the only Cas9 protein is involved in the destruction of foreign DNA. For systems of type III,
CRISPR РНК (crRNA) вместе с транс-активирующими crRNA (tracrRNA), образуют комплекс с Cas-белками для определения специфичности разрезания через Уотсон-Криковские взаимодействия между нуклеиновыми кислотами. Для наиболее простой системы типа II при формировании эффективного нуклеазного комплекса необходимы три компонента: Cas9 белок, зрелая crRNA и tracrRNA. Более того, было установлено, что crRNA и tracrRNA могут быть объеденены в единую gRNA (guide RNA) молекулу, и, модифицируя ее последоваетельность в определенном месте, можно разрезать новые сайты ДНК (Mol. Ther., 2016, doi: 10.1038/mt. 2016.10). Данная упрощенная CRISPR/Cas система получила широкое распространение для технологий редактирования генома через удаление/модификацию не желательных последовательностей ДНК (Mol. Ther., 2016, doi: 10.1038/mt.2016.10). На ее основе также были запатентованы методы получения транслокантов в геномах эукариот. Суть методов заключается в ведении gRNA-зависимого двуцепочечного разрыва в гены эукариот. Так как репарация разрыва осуществляется путем гомологичной рекомбинации (HR) или соединением не гомологичных концов (NHEJ) в результате могут образовываться транслокантные хромосомы, которые затем отбираются и подтверждаются методом ПЦР с последующим секвенированием. Недостатком этих методов является непредсказуемость выхода получаемых транслокантов, так как разрезанные CRISPR/Cas системами хромосомы могут репарироваться и рекомбинировать многими способами, выход продуктов репарации гетерогенен, и, таким образом, трудно получить сайт-специфичные транслокации. Кроме того, подготовка gRNA для разрезания новых генов достаточно трудоемка и включает мутагенез, этапы клонирования и секвенирования.CRISPR RNA (crRNA), together with trans-activating crRNA (tracrRNA), form a complex with Cas proteins to determine the specificity of cutting through Watson-Crick interactions between nucleic acids. For the simplest type II system, three components are necessary when forming an effective nuclease complex: Cas9 protein, mature crRNA and tracrRNA. Moreover, it was found that crRNA and tracrRNA can be combined into a single gRNA (guide RNA) molecule, and by modifying its sequence in a specific place, you can cut new DNA sites (Mol. Ther., 2016, doi: 10.1038 / mt. 2016.10). This simplified CRISPR / Cas system is widely used for genome editing technologies through the removal / modification of undesirable DNA sequences (Mol. Ther., 2016, doi: 10.1038 / mt.2016.10). On its basis, methods for producing translocants in the genomes of eukaryotes have also been patented. The essence of the methods lies in the management of gRNA-dependent double-stranded break in the genes of eukaryotes. Since the repair of the gap is carried out by homologous recombination (HR) or by connecting non-homologous ends (NHEJ), translocant chromosomes can be formed, which are then selected and confirmed by PCR followed by sequencing. The disadvantage of these methods is the unpredictability of the output of the resulting translocants, since chromosomes cut by CRISPR / Cas systems can be repaired and recombined in many ways, the yield of reparation products is heterogeneous, and thus it is difficult to obtain site-specific translocations. In addition, the preparation of gRNA for cutting new genes is rather laborious and includes mutagenesis, cloning and sequencing steps.
Этого недостатка лишены подходы, в которых транслокации происходят между короткими гомологичными последовательностями, расположенными в различных участках генома (Nature, 2009, 460(7258):984-9; PloS Genetics, 2011, 7(5): е1002089). На основе предложенных систем была установлена роль многих клеточных факторов, включая, например, SGS1, ТОР3, RMI1, SRS2, RAD6, SLX1, SLX4, SLX5, MSH2, MSH6, RAD10, MRC1 и TOF1 в поддержании стабильности генома. Однако в этом случае сайты транслокаций ограничены расположением гомологичных последовательностей.This deficiency lacks approaches in which translocations occur between short homologous sequences located in different regions of the genome (Nature, 2009, 460 (7258): 984-9; PloS Genetics, 2011, 7 (5): е1002089). Based on the proposed systems, the role of many cellular factors was established, including, for example, SGS1, TOR3, RMI1, SRS2, RAD6, SLX1, SLX4, SLX5, MSH2, MSH6, RAD10, MRC1 and TOF1 in maintaining genome stability. However, in this case, the translocation sites are limited by the location of homologous sequences.
Известна методика мост-индуцируемых транслокаций (Chromosoma, 2005, 114(1): 15-27; PNAS, 2008, 105(28): 2703-8; Genetics, 2010, 186(3): 775-90), заключающаяся в интеграции гена устойчивости к канамицину в локусы, принадлежащие разным хромосомам в клетках почкующихся дрожжей S. cerevisiae с образованием транслокантной хромосомы. По данной методике можно получать транслоканты между любыми участками генома, которые определяются 5'- и 3'-концами используемых кассет для интеграции. Суть метода заключается в проведении литиево-ацетатной трансформации клеток S. cerevisiae кассетой, несущей ген устойчивости к канамицину, фланкированный короткими (30-65 п.н.) участками гомологии, принадлежащими разным хромосомам; отбора транслокантов по устойчивости к канамицину и проверки правильности интеграции кассеты с помощью ПЦР и секвенирования полученного ПЦР-продукта. Минусами данного метода является не возможность отрицательной селекции, что затрудняет отслеживание дальнейшей судьбы транслокантной хромосомы и последующие генетические манипуляции с маркером устойчивости к канамицину; а также не возможность повторного использования этого маркера (гена устойчивости к канамицину) для генетических манипуляций с клетками транслокантов. Следует учесть, что перечень используемых селективных маркеров для клеток S. cerevisiae очень ограничен. Эти недостатки преодолевает предлагаемый новый подход, сохраняя основное преимущество метода мост-индуцируемых транслокаций - возможность осуществления транслокаций между любыми локусами генома по желанию.A known technique is bridge-induced translocations (Chromosoma, 2005, 114 (1): 15-27; PNAS, 2008, 105 (28): 2703-8; Genetics, 2010, 186 (3): 775-90), which consists in integrating kanamycin resistance gene to loci belonging to different chromosomes in budding yeast S. cerevisiae cells with the formation of a translocant chromosome. By this method, translocants can be obtained between any regions of the genome, which are determined by the 5'- and 3'-ends of the used cassettes for integration. The essence of the method consists in carrying out lithium acetate transformation of S. cerevisiae cells with a cassette carrying the kanamycin resistance gene, flanked by short (30-65 bp) sections of homology belonging to different chromosomes; selection of translocants for kanamycin resistance and verification of the correct integration of the cassette using PCR and sequencing of the obtained PCR product. The disadvantages of this method are not the possibility of negative selection, which makes it difficult to track the further fate of the translocated chromosome and subsequent genetic manipulations with the kanamycin resistance marker; and also the possibility of reuse of this marker (kanamycin resistance gene) for genetic manipulation of translocant cells. It should be noted that the list of selective markers used for S. cerevisiae cells is very limited. These shortcomings are overcome by the proposed new approach, retaining the main advantage of the bridge-induced translocation method - the possibility of translocation between any genome loci at will.
Раскрытие изобретенияDISCLOSURE OF INVENTION
Задачей настоящего изобретения является создание способа для осуществления транслокаций между любыми двумя геномными локусами в клетках почкующихся дрожжей S. cerevisiae с последующей возможностью как положительной, так и отрицательной селекции транслокантных хромосом.The present invention is the creation of a method for the implementation of translocations between any two genomic loci in budding yeast S. cerevisiae cells with the subsequent possibility of both positive and negative selection of translocant chromosomes.
Остается актуальной задача получения генетического маркера транслокантной хромосомы, позволяющего проводить как положительную (выживают клетки, несущие этот маркер), так и отрицательную селекцию (клетки, несущие этот маркер, погибают); а также различных генетических манипуляций с ним с отбором продуктов манипуляций с помощью отрицательной селекции; в клетках транслокантов должна сохраняться возможность использования маркера устойчивости к канамицину для генетических манипуляций, в том числе новых мост-индуцируемых транслокаций.It remains an urgent task to obtain a genetic marker of a translocant chromosome that allows for both positive (cells carrying this marker survive) and negative selection (cells carrying this marker die); and also various genetic manipulations with him with selection of products of manipulations with the help of negative selection; The ability of the kanamycin resistance marker to be used for genetic manipulations, including new bridge-induced translocations, should remain in the cells of translocants.
Поставленная задача решается способом получения сайт-направленных транслокаций в клетках Saccharomyces cerevisiae, заключающимся в трансформации клеток ura3Δ0/ura3Δ0 штамма почкующихся дрожжей S.cerevisiae (Yeast, 1998, 14(2): 115-32) кассетой для транслокации, содержащей ген URA3, фланкированный последовательностями ДНК длиной более 30 п.н. с гомологией к произвольным локусам разных хромосом. Далее высевают клетки на селективные среды без урацила, выращивают в течение ночи, с последующим отбором выросших колоний и проведением ПЦР-реакции для подтверждения правильности транслокации. Предпочтительно трансформацию клеток проводить литиево-ацетатным методом.The problem is solved by a method of obtaining site-directed translocations in Saccharomyces cerevisiae cells, consisting in the transformation of ura3Δ0 / ura3Δ0 cells of the budding yeast strain S.cerevisiae (Yeast, 1998, 14 (2): 115-32) with a translocation cassette containing the URA3 gene, flanked DNA sequences longer than 30 p. with homology to arbitrary loci of different chromosomes. Next, cells are seeded on selective media without uracil, grown overnight, followed by selection of the grown colonies and carrying out a PCR reaction to confirm the correctness of the translocation. Preferably, the transformation of cells is carried out by the lithium acetate method.
Техническим результатом изобретения является получение заявляемым способом транслокантной хромосомы, состоящих из двух частей, принадлежащих до транслокации различным хромосомам, которая пригодна для повторного использования, а также позволяет проводить как положительную, так и отрицательную селекцию. Также полученная транслокантная хромосома позволяет проводить различные генетические манипуляции с отбором продуктов манипуляций с помощью отрицательной селекции. В клетках транслокантов сохраняется возможность использования маркера устойчивости к канамицину для генетических манипуляций, в том числе новых мост-индуцируемых траснлокаций между другими хромосомами, которых в диплоидных клетках S. cerevisiae 16 пар.The technical result of the invention is to obtain the claimed method of a translocant chromosome consisting of two parts belonging to different chromosomes prior to translocation, which is suitable for reuse, and also allows for both positive and negative selection. Also, the resulting translocant chromosome allows various genetic manipulations with the selection of manipulation products using negative selection. In translocant cells, the possibility of using a kanamycin resistance marker for genetic manipulation, including new bridge-induced translocations between other chromosomes, which are 16 pairs in S. cerevisiae diploid cells, is retained.
По сравнению с начальной методикой предлагаемый способ обладает следующими преимуществами:Compared with the initial method, the proposed method has the following advantages:
1) Ген URA3 позволяет проводить как положительную, так и отрицательную селекцию: в присутствии 5-флуорооротатной кислоты клетки с этим геном погибают, что позволяет отслеживать судьбу транслокантной хромосомы;1) The URA3 gene allows for both positive and negative selection: cells are killed with this gene in the presence of 5-fluororotatic acid, which makes it possible to track the fate of the translocant chromosome;
2) Предложенное изобретение позволяет использовать ген устойчивости к канамицину для дополнительных манипуляций с генами и хромосомами, включая траснлокаций;2) The proposed invention allows the use of the kanamycin resistance gene for additional manipulations with genes and chromosomes, including translocations;
3) Присутствие уникального гена URA3 с возможностью отрицательной селекции позволяет интегрировать в транслокантную хромосому дополнительные гены и/или генетические элементы и модифицировать место транслокации.3) The presence of a unique URA3 gene with the possibility of negative selection allows integrating additional genes and / or genetic elements into the translocation chromosome and modifying the site of translocation.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.
На фиг. 1 показана принципиальная схема сайт-направленных транслокаций. Клетки ura3Δ0/ura3Δ0 S.cerevisiae (Yeast, 1998, 14(2): 115-32) трансформируются кассетой для транслокации. Области кассеты для транслокации, гомологичные двум разным хромосомам выделены пунктиром различной длины.FIG. 1 shows a schematic diagram of site-directed translocations. The ura3Δ0 / ura3Δ0 S.cerevisiae cells (Yeast, 1998, 14 (2): 115-32) are transformed with a translocation cassette. Areas of translocation cassettes homologous to two different chromosomes are indicated by dotted lines of various lengths.
На фиг. 2 представлена фотография клеток транслокантов, окрашенных FITC-фаллоидином для визуализации цитоскелета.FIG. 2 is a photograph of FITC phalloidin-translocant cells for visualization of the cytoskeleton.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C.All reagents used are commercially available, all procedures, unless otherwise specified, were carried out at room or ambient temperature, that is, in the range from 18 to 25 ° C.
Для выращивания колоний ura3Δ0/ura3Δ0 штамма S.cerevisiae возможно использование любых питательных сред, жидких или агаризованных, поддерживающих рост этих клеток. При селекции транслокантных клеток, несущих интегрированный ген URA3, также возможно использование любых жидких или агаризованных питательных сред, принципиальным требованием к ним является отсутствие урацила.For growing the ura3Δ0 / ura3Δ0 colonies of S.cerevisiae strain, it is possible to use any nutrient media, liquid or agar, supporting the growth of these cells. When selecting translocant cells carrying the integrated URA3 gene, it is also possible to use any liquid or agar nutrient media, the basic requirement for them is the absence of uracil.
Для получения кассеты для трансформации должны использоваться праймеры, обладающие гомологией не менее 30 п. н. к двум различным хромосомам и не менее 25 п.н - к гену URA3 (фиг. 1).To obtain a cassette for transformation, primers with a homology of at least 30 bp should be used. to two different chromosomes and at least 25 bp to the URA3 gene (Fig. 1).
Для проведения отрицательной селекции необходимо использовать в селективной среде для отбора желаемых мутаций/делеций/инсерций 5-флуорооротатную кислоту: клетки с геном URA3 погибают в ее присутствии (Methods Enzymol, 1987, 154: 164-75), а выживут лишь колонии клеток, в которых этот ген был инактивирован в результате генетических манипуляций.For negative selection, it is necessary to use 5-fluorotatic acid to select the desired mutations / deletions / insertions: cells with the URA3 gene die in its presence (Methods Enzymol, 1987, 154: 164-75), and only colonies of cells will survive, which this gene has been inactivated as a result of genetic manipulation.
Приведенные примеры конкретного осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, и подразумевают, что приведенные примеры не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.Examples of a specific embodiment of the invention are given to provide specialists in the art with a full description of the conduct and application of the analysis according to the invention, and imply that the examples given do not limit the scope of the invention intended by the inventors.
1. Провести литиево-ацетатную трансформацию (PNAS, 2008, 105(28): 2703-8) ura3Δ0/ura3Δ0 штамма почкующихся дрожжей кассетой для транслокации, содержащей ген URA3, фланкированный последовательностями ДНК длиной более 30 п. н. с гомологией к произвольным локусам разных хромосом (фиг. 1).1. Carry out lithium acetate transformation (PNAS, 2008, 105 (28): 2703-8) of the ura3Δ0 / ura3Δ0 strain of budding yeast with a translocation cassette containing the URA3 gene, flanked by DNA sequences longer than 30 bp. with homology to arbitrary loci of different chromosomes (Fig. 1).
2. После появления колоний провести проверку правильности интеграции кассеты с помощью ПЦР и секвенирования полученного ПЦР-продукта. Фотография клеток транслокантов приведена на фиг. 2.2. After the appearance of the colonies, verify the correct integration of the cassette using PCR and sequencing of the obtained PCR product. A photograph of translocant cells is shown in FIG. 2
Принципиально важной стадией изобретения является трансформация ura3Δ0/ura3Δ0 клеток S.cerevisiae кассетой для транслокации с геном URA3, обладающей областями гомологии более 30 п.н двум разным хромосомам. Районы гомологии определяют место интеграции кассеты (фиг. 1). Транслоканты, несущие ген URA3, способны расти на среде без урацила, что позволяет провести селективный отбор этих клеток. Однако в присутствии 5-флуорооротатной кислоты клетки с этим геном погибают, что позволяет проводить отрицательную селекцию. Последняя возможность может быть важна для осуществления генетических манипуляций в точке транслокации: инсерции/делеции последовательностей ДНК, а также ее точечного мутагенеза.A fundamentally important stage of the invention is the transformation of the ura3Δ0 / ura3Δ0 S.cerevisiae cells with a translocation cassette with the URA3 gene, which has regions of homology greater than 30 p. Homology regions determine the place of cassette integration (Fig. 1). Translocators carrying the URA3 gene are able to grow on a medium without uracil, which allows for selective selection of these cells. However, in the presence of 5-fluororotatic acid, the cells with this gene perish, which allows for negative selection. The latter possibility may be important for the implementation of genetic manipulations at the translocation point: insertions / deletions of DNA sequences, as well as its point mutagenesis.
Модифицируемым параметром изобретения являются 5'- и 3'-концы последовательности кассеты для транслокации, которые могут быть гомологичными любым двум локусам в геноме, но принадлежать двум разным хромосомам. Диплоидные клетки S.cerevisiae обладают 16 парами хромосом.The modifiable parameter of the invention is the 5'- and 3'-ends of the translocation cassette sequence, which may be homologous to any two loci in the genome, but belong to two different chromosomes. Diploid cells of S.cerevisiae possess 16 pairs of chromosomes.
В качестве примера осуществления изобретения были проведены следующие действия:As an example of the invention, the following steps were taken:
1. Инокулировали свежую колонию ura3Δ0/ura3Δ0 штамма S.cerevisiae в 2 мл питательной среды без урацила. Растили в течение ночи при 30°C.1. Inoculate fresh colony of S.cerevisiae strain ura3Δ0 / ura3Δ0 in 2 ml of culture medium without uracil. Raised overnight at 30 ° C.
2. Инокулировали 200 μl ночной культуры в 50 мл той же питательной среды. Растили культуру до OD600=0.7-0.8 (~7 ч). Собрали клетки центрифугированием при 2-3 g.2. Inoculate 200 μl of the overnight culture in 50 ml of the same nutrient medium. Raised culture to OD600 = 0.7-0.8 (~ 7 h). Collected cells by centrifugation at 2-3 g.
3. Ресуспендировали клетки в 5 мл раствора, содержащего 100 мМ трис-HCl, рН 7.5; 50 мМ ЭДТА, рН 8.0 и 100 мМ ацетата лития. Собрали клетки центрифугированием при 2-3g.3. Resuspend cells in 5 ml of solution containing 100 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM EDTA, pH 8.0 and 100 mM lithium acetate. Collected cells by centrifugation at 2-3g.
4. Ресуспендировали клетки в 0.5 мл того же раствора, перенесли в пластиковую пробирку с закрывающейся крышкой. Инкубировали 60 мин при комнатной температуре на шейкере с перемешиванием.4. Resuspend cells in 0.5 ml of the same solution, transferred to a plastic tube with a closable lid. Incubated for 60 min at room temperature on a shaker with stirring.
5. Смешали 10 μл 10 мг/мл ДНК из спермы лосося, ~5-10 μг в ~10 μл ДНК кассеты для транслокации и 200 μл клеток. Инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере с перемешиванием. Кассету для транслокации получали заранее с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы ДНК штаммов S.cerevisiae с геном URA3, как, например, S288C, и праймеры с последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.5.
Реакция ПЦР включала следующие стадии:The PCR reaction included the following stages:
Последовательность используемой кассеты приведена в SEQ ID NO:3.The sequence of the cassette used is shown in SEQ ID NO: 3.
6. Добавили 1 мл раствора, содержащего 100 мМ трис-HCl, рН 7.5; 50 мМ ЭДТА, рН 8.0; 100 мМ ацетата лития и ПЭГ 3500. Инкубировали 10 мин при 42°C. Собрали клетки центрифугированием при 2-3 g.6. Add 1 ml of a solution containing 100 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM EDTA, pH 8.0; 100 mM lithium acetate and PEG 3500. Incubated for 10 min at 42 ° C. Collected cells by centrifugation at 2-3 g.
7. Удалили все следы супенатанта с помощью пипетки. Ресуспендировали клетки в 200 ил раствора, содержащего 100 мМ трис-HCl, рН 7.5 и 50 мМ ЭДТА, рН 8.0, и высеяли клетки на селективную среду без урацила.7. Remove all traces of supernatant with a pipette. The cells were resuspended in 200 ml of a solution containing 100 mM Tris-HCl, pH 7.5 and 50 mM EDTA, pH 8.0, and the cells were seeded on a selective medium without uracil.
8. После появления колоний провели проверку правильности интеграции кассеты с помощью ПЦР и секвенирования полученных ПЦР-продуктов. Фотография клеток транслокантов приведена на фиг. 2.8. After the appearance of the colonies, we checked the correctness of cassette integration using PCR and sequencing of the obtained PCR products. A photograph of translocant cells is shown in FIG. 2
В результате предлагаемого способа были получены транслоканты с интегрированным геном URA3.As a result of the proposed method, translocants with the integrated URA3 gene were obtained.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018113518A RU2692552C1 (en) | 2018-04-13 | 2018-04-13 | Method for producing site-directed translocations in saccharomyces cerevisiae cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018113518A RU2692552C1 (en) | 2018-04-13 | 2018-04-13 | Method for producing site-directed translocations in saccharomyces cerevisiae cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2692552C1 true RU2692552C1 (en) | 2019-06-25 |
Family
ID=67038217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018113518A RU2692552C1 (en) | 2018-04-13 | 2018-04-13 | Method for producing site-directed translocations in saccharomyces cerevisiae cells |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2692552C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015138855A1 (en) * | 2014-03-14 | 2015-09-17 | The Regents Of The University Of California | Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9 |
| RU2015147236A (en) * | 2013-04-05 | 2017-05-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INTEGRATING EXOGENOUS SEQUENCE IN PLANT GENE |
-
2018
- 2018-04-13 RU RU2018113518A patent/RU2692552C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2015147236A (en) * | 2013-04-05 | 2017-05-10 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INTEGRATING EXOGENOUS SEQUENCE IN PLANT GENE |
| WO2015138855A1 (en) * | 2014-03-14 | 2015-09-17 | The Regents Of The University Of California | Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BRACHMANN CB Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications, Yeast. 1998 Jan 30;14(2):115-32. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107858346B (en) | Method for knocking out saccharomyces cerevisiae chromosome | |
| Foster et al. | CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein-mediated co-editing and counterselection in the rice blast fungus | |
| Shan et al. | Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system | |
| US10301613B2 (en) | Targeted remodeling of prokaryotic genomes using CRISPR-nickases | |
| Böttcher et al. | Efficient chromosomal gene modification with CRISPR/cas9 and PCR-based homologous recombination donors in cultured Drosophila cells | |
| JP2020062044A5 (en) | ||
| Gonzalez-Ballester et al. | Reverse genetics in Chlamydomonas: a platform for isolating insertional mutants | |
| Benders et al. | Cloning whole bacterial genomes in yeast | |
| CN106119269B (en) | Method for preparing linear single-stranded DNA in escherichia coli | |
| Stuckey et al. | In vivo site-specific mutagenesis and gene collage using the delitto perfetto system in yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| CN110358767B (en) | Zymomonas mobilis genome editing method based on CRISPR-Cas12a system and application thereof | |
| JPWO2015006290A5 (en) | ||
| Ebersole et al. | Rapid generation of long synthetic tandem repeats and its application for analysis in human artificial chromosome formation | |
| WO2020083083A1 (en) | Method for cloning dna large fragment | |
| US20240182927A1 (en) | Methods for genomic integration for kluyveromyces host cells | |
| RU2692552C1 (en) | Method for producing site-directed translocations in saccharomyces cerevisiae cells | |
| Wang et al. | Targeted mutagenesis in hexaploid bread wheat using the TALEN and CRISPR/Cas systems | |
| Agier et al. | A versatile protocol to generate translocations in yeast genomes using CRISPR/Cas9 | |
| Wang et al. | Strategies for gene disruptions and plasmid constructions in fission yeast | |
| CN111662932B (en) | Method for improving homologous recombination repair efficiency in CRISPR-Cas9 gene editing | |
| Murata | Minichromosomes and artificial chromosomes in Arabidopsis | |
| WO2021068779A1 (en) | Method for site-directed integration of large-fragment foreign dna | |
| Puchta | Breaking DNA in plants: how I almost missed my personal breakthrough | |
| Bruschi et al. | Yeast artificial chromosomes | |
| Bentley et al. | A yeast‐based recombinogenic targeting toolset for transgenic analysis of human disease genes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210414 |