RU2691634C2

RU2691634C2 - Method of using gamma-octalactone as an inhibitor of "quorum of sensing" system luxi/luxr type in bacteria

Info

Publication number: RU2691634C2
Application number: RU2017141321A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Геннадьевич Дерябин; Анна Александровна Галаджиева; Ксения Сергеевна Инчагова; Галимжан Калиханович Дускаев
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2019-06-17
Also published as: RU2017141321A; RU2017141321A3

Abstract

FIELD: medicine; pharmaceuticals.SUBSTANCE: invention relates to microbiology and pharmaceutics and can be used for application of gamma-octalactone as an inhibitor of the "quorum of sensing" LuxI/LuxR type system in bacteria.EFFECT: invention provides prevention and treatment of bacterial infections of plants, animals and humans, the causative agents of which use the "quorum of sensing" system to induce its pathogenic potential.1 cl, 1 dwg, 1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии и фармацевтике и касается молекул растительного происхождения, а также их химически синтезированных аналогов, способных подавлять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («кворум сенсинг») у бактерий. Изобретение может найти применение при контроле биотехнологических процессов, производстве средств для предупреждения порчи сельскохозяйственной продукции, а также создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для предупреждения и лечения бактериальных инфекций растений, животных и человека, возбудители которых используют систему «кворум сенсинга» для индукции своего патогенного потенциала.The invention relates to microbiology and pharmaceuticals and relates to molecules of plant origin, as well as their chemically synthesized analogues capable of suppressing density-dependent communication and the collective behavior regulated by it (“quorum sensing”) in bacteria. The invention can find application in the control of biotechnological processes, the production of means to prevent the deterioration of agricultural products, as well as the creation of new drugs intended to prevent and treat bacterial infections of plants, animals and humans whose pathogens use the sensory quorum system to induce their pathogenic potential. .

Большинство способов борьбы с патогенной микрофлорой ориентированы на развитие прямого антимикробного эффекта, что потенциально может вести к поступлению продуктов разрушения микроорганизмов во внутреннюю среду и среду обитания человека и животных с формированием токсических, аллергических и иных нежелательных эффектов.Most ways to combat pathogenic microflora are focused on the development of a direct antimicrobial effect, which can potentially lead to the entry of products of destruction of microorganisms into the internal environment and habitat of humans and animals with the formation of toxic, allergic and other undesirable effects.

В качестве альтернативы природным и химически синтезируемым бактерицидам прямого действия в настоящее время все чаще рассматривается подход, заключающийся не в уничтожении, но в изменении физиологии микроорганизма в направлении подавления (снижения) его способности к паразитированию и повреждению биологических субстратов. В частности, сказанное относится к поиску и созданию ингибиторов «кворум сенсинга» (англ. - quorum sensing) у бактерий, оцениваемых как привлекательная альтернатива традиционным средствам борьбы с инфекциями, особенно, вызываемыми полирезистентными штаммами микроорганизмов [1].As an alternative to direct-acting natural and chemically synthesized bactericides, an approach is now increasingly being considered which consists not in destroying, but in changing the physiology of the microorganism in the direction of suppressing (reducing) its ability to parasitize and damage biological substrates. In particular, this relates to the search for and creation of quorum sensing inhibitors (eng. Quorum sensing) in bacteria, which are regarded as an attractive alternative to traditional means of fighting infections, especially those caused by multi-resistant strains of microorganisms [1].

Под термином «кворум сенсинг» у бактерий понимается их плотностно-зависимая коммуникация, опосредуемая малыми диффундирующими молекулами (автоиндукторами) и при достижении пороговой плотности популяции ведущая к функциональной и морфологической дифференцировке составляющих ее клеток [2].The term “quorum sensing” in bacteria is understood to be their density-dependent communication mediated by small diffusing molecules (autoinducers) and, when the threshold population density is reached, leading to the functional and morphological differentiation of its constituent cells [2].

При этом данный феномен коллективного поведения бактерий позволил принципиально по-новому оценить целый ряд примеров функциональной и морфологической дифференцировки прокариот, включая развитие биолюминесценции, синтез пигментов и антибиотиков, образование экзоферментов и факторов вирулентности, формирование биопленок, конъюгацию и спорообразование [3].At the same time, this phenomenon of collective behavior of bacteria allowed a fundamentally new assessment of a number of examples of functional and morphological differentiation of prokaryotes, including the development of bioluminescence, the synthesis of pigments and antibiotics, the formation of exoenzymes and virulence factors, the formation of biofilms, conjugation and sporulation [3].

Первыми из описанных и, как позже оказалось, наиболее распространенным вариантом коллективного поведения оказался «кворум сенсинг» LuxI/LuxR типа, где синтезируемая под контролем гена luxl сигнальная молекула - ацилированный гомосерин лактон (АГЛ) диффундирует во внешнюю среду, а при достижении критической плотности популяции и определяемой этим собственной пороговой концентрации совершает обратное движение внутрь бактериальной клетки и, связываясь с рецепторным белком LuxR, запускает транскрипцию целевых генов.The first of these, and, as it later turned out, the LuxI / LuxR type quorum sensing was the most common variant of collective behavior, where the signal molecule synthesized under the control of the luxl gene, an acylated homoserine lactone (AHL), diffuses into the external environment, and when the critical population density is reached and the intrinsic threshold concentration determined by this reverses inside the bacterial cell and, by binding to the LuxR receptor protein, triggers the transcription of the target genes.

Спектр предлагаемых технических решений для ингибирования систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа включает: 1) подавление образования АГЛ; 2) ферментативную или химическую деградацию этих молекул при их поступлении во внешнюю среду; 3) ингибирование связывания АГЛ с соответствующими LuxR-подобными рецепторными белками [4]. Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что на основе данного подхода предложено несколько десятков изобретений, за последние десятилетия, нашедших отражение в международных охранных документах WO 96/29392; WO 99/27786; WO 01/85664; WO 02/102370; WO 03/106445; WO 2004/016588; WO 2006/125262; WO 2014142748 и др.The range of proposed technical solutions for inhibiting LuxI / LuxR type “quorum sensing” systems includes: 1) suppressing the formation of AHL; 2) enzymatic or chemical degradation of these molecules as they enter the environment; 3) inhibition of the binding of AHL with the corresponding LuxR-like receptor proteins [4]. The analysis of open patent sources allows us to state that on the basis of this approach several dozens of inventions have been proposed over the past decades, which are reflected in the international protection documents WO 96/29392; WO 99/27786; WO 01/85664; WO 02/102370; WO 03/106445; WO 2004/016588; WO 2006/125262; WO 2014142748 et al.

Отдельным направлением подобного поиска является обнаружение и исследование природных (растительных) соединений, в естественных условиях ингибирующих «кворум сенсинг» фитопатогенных бактерий, а при переносе в организм человека или животного способных оказывать аналогичное воздействие на стереотипно устроенные системы плотностно-зависимой коммуникации LuxI/LuxR типа у антропо- и зоопатогенных микроорганизмов.A separate direction of such a search is the detection and study of natural (vegetable) compounds that in vivo inhibit "quorum sensing" phytopathogenic bacteria, and when transferred to the human or animal body, can have a similar effect on stereotypically arranged systems of density-dependent LuxI / LuxR communication in anthropo- and zoopathogenic microorganisms.

Первым из описанных анти-кворум соединений растительного происхождения стали галогенизированные фураноны, образуемые морской красной водорослью Delisea pulchra и имеющие черты структурного сходства с АГЛ. При этом основным механизмом их действия была признана дестабилизация комплекса «АГЛ: LuxR», приводящая к ускорению оборота данного рецепторнбого белка в клетках морских бактерий Vibrio fischeri и Vibrio harveyi [5]. На данной основе был предложен патент [6], защищающий структуры соединений на основе натуральных и синтетических фуранонов, некоторые из которых по способности к подавлению систем «кворум сенсинга» даже превосходили свои природные аналоги. Однако большинство галогезированных фуранонов оказалось токсичными для человека и животных [7], что явилось существенным препятствием на пути их практического использования.The first of the compounds of plant origin that were described as anti-quorum were halogenated furanones formed by the red seaweed Delisea pulchra and having features of structural similarity with AHL. At the same time, the destabilization of the AHL: LuxR complex, leading to an acceleration of the turnover of this receptor protein in the cells of the marine bacteria Vibrio fischeri and Vibrio harveyi [5], was recognized as the main mechanism of their action. On this basis, a patent was proposed [6] that protects the structures of compounds based on natural and synthetic furanones, some of which even exceeded their natural counterparts in their ability to suppress sensory quorum systems. However, the majority of halogenated furanons turned out to be toxic to humans and animals [7], which was a significant obstacle to their practical use.

При исследовании съедобных растений внимание было обращено на чеснок Allium sativum, способность которого к продукции бактерицидов прямого действия (фитонцидов и фитоалексинов) достаточно хорошо изучена. В свою очередь поиск и идентификация анти-кворум активности данного растения позволила связать ее с присутствием аджоена - 2-пропенил-3[3-(2-пропенилсульфинил)-1-пропенил] дисульфида [8], по своей структуре напоминающего фитонцид аллицин и образующегося при его реакции с некоторыми пищевыми маслами. Полученный результат был положен в основу патента [9], однако, собственный терапевтический потенциал данного соединения оказался ограничен, а наилучший результат был достигнут при совместном использовании с антибиотиками: аджоен нарушал кворум-зависимое образование биопленки, что делало присутствующие в ней бактерии более чувствительными к антибиотику тобрамицину. Кроме того, у аджоена обнаружились и иные виды биологической активности, включающие индукцию апоптоза [10], необходимость учета которых усложняет перспективу его практического использования.In the study of edible plants, attention was drawn to Allium sativum garlic, whose ability to produce direct-acting bactericides (phytoncides and phytoalexins) has been well studied. In turn, the search and identification of the anti-quorum activity of this plant made it possible to associate it with the presence of ajoene - 2-propenyl-3 [3- (2-propenylsulfinyl) -1-propenyl] disulfide [8], in its structure resembling phytoncide allicin and the resulting when it reacts with certain edible oils. The result was the basis of the patent [9], however, the own therapeutic potential of this compound was limited, and the best result was achieved when used in conjunction with antibiotics: ajoene violated the quorum-dependent biofilm formation, which made the bacteria present in it more susceptible to the antibiotic tobramycin. In addition, other forms of biological activity, including induction of apoptosis [10], were found in adjoen, the necessity of taking into account of which complicates the prospect of its practical use.

При исследовании лекарственных растений наиболее обширные сведения накоплены по эллагитанинам: вескалагину и его изомеру касталагину, изолированным из листьев произрастающего во Флориде (США) лекарственного растения Conocarpus erectus [11]. Экстракты названного растения и выделенные из него полифенольные соединения демонстрируют выраженную способность к ингибированию системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у широкого спектра фитопатогенных и зоопатогенных бактерий от Agrobacterium tumefaciens до Pseudomonas aeruginosa, что нашло свое отражение в материалах патента [12]. Однако ограниченный ареал распространения растения Conocarpus erectus, технологическая сложность выделения эллагитанинов при невозможности их химического синтеза, делают практическое применение названных соединений высоко затратным и экономически неэффективным.In the study of medicinal plants, the most extensive information has been accumulated on ellagitannins: Vescalagin and its isomer, Castalaguinum, isolated from the leaves of the medicinal plant Conocarpus erectus growing in Florida (USA) [11]. Extracts of the named plant and polyphenolic compounds isolated from it demonstrate a pronounced ability to inhibit LuxI / LuxR type quorum sensing in a wide range of phytopathogenic and zoopathogenic bacteria from Agrobacterium tumefaciens to Pseudomonas aeruginosa, which is reflected in the patent materials [12]. However, the limited distribution area of the plant Conocarpus erectus, the technological difficulty of isolating ellagitannins when it is impossible to synthesize them chemically, make the practical application of these compounds highly costly and economically inefficient.

Таким образом, анализ открытых источников научной и патентной литературы свидетельствует как о всевозрастающем интересе к поиску растительных ингибиторов «кворум сенсинга» бактериальных патогенов, так и о существовании ряда препятствий для их практического использования.Thus, the analysis of open sources of scientific and patent literature indicates both the growing interest in the search for plant inhibitors "quorum sensing" of bacterial pathogens, and the existence of a number of obstacles to their practical use.

В этой связи задачей данного изобретения является применение имеющих растительное происхождение, нетоксичных, лишенных серьезных побочных эффектов и доступных для химического синтеза органических молекул, способных ингибировать различные варианты систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий.In this regard, the objective of this invention is the use of plant-derived, non-toxic, devoid of serious side effects and available for chemical synthesis of organic molecules capable of inhibiting various variants of LuxI / LuxR type “quorum sensing” systems in bacteria.

В настоящем изобретении эта задача решается способом применением соединения на основе гамма-окталактона (название по IUPAC 5-butyloxolan-2-one), полностью описываемого формулой 1:In the present invention, this problem is solved by a method using a compound based on gamma-octalactone (named after IUPAC 5-butyloxolan-2-one), fully described by formula 1:

В данном изобретении раскрывается структурная формула соединения формулы 1 и способы его практического применения для регуляции коллективного поведения («кворум сенсинга) у бактерий.This invention discloses the structural formula of a compound of formula 1 and methods for its practical application for regulating collective behavior (“quorum sensing”) in bacteria.

В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на основе гамма-окталактона содержит по весу от 0,0001 до 100% соединений формулы 1, остальное - нейтральные компоненты или вещества, позитивно модифицирующие (повышающие биодоступность, увеличивающие сроки действия и т.д.) свойства данной композиции.In accordance with the present invention, the regulatory drug (composition) based on gamma-octalactone contains by weight from 0.0001 to 100% of the compounds of formula 1, the rest is neutral components or substances that positively modify (increase bioavailability, increase the duration of action, etc. ) properties of this composition.

Наиболее близким известным аналогом изобретения является патент [13], оговаривающий структуру, синтез и использование регуляторов «чувства кворума» общей формулы 2:The closest known analogue of the invention is a patent [13], specifying the structure, synthesis and use of the regulators of the "feeling of quorum" of general formula 2:

По сравнению с соединениями формулы 2 заявляемое соединение общей формулы 1 имеют ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.Compared to compounds of formula 2, the claimed compound of general formula 1 has a number of significant differences that meet the requirement of novelty.

Во-первых, данный патент US patent 7910622, 2011, созданный на основе синтетических лигандов, способных интерферировать с гомосеринлактонами (ГСЛ) за связывание с соответствующими рецепторными белками, построен по «зонтичному» принципу и содержит сведения о многочисленных соединениях с аналогичным природным ГСЛ лактонным кольцом, ковалентно модифицированным ацильными группами различного строения и состава. В нашем случае, заявляемое соединение представляет собой соединение естественного природного происхождения, в большом количестве находящееся в растениях пищевого и лекарственного предназначения. Из доступной научной и патентной литературы регуляторы «чувства кворума» на основе гамма-окталактона не известны. Гамма-окталактон является ароматизирующим ингредиентом, активно используется в косметалогии как ароматизатор с низкой степенью токсичности [14]First, this US patent patent 7910622, 2011, created on the basis of synthetic ligands that can interfere with homoserinactones (GSL) for binding to the corresponding receptor proteins, is built according to the “umbrella” principle and contains information on numerous compounds with a similar natural GSL lactone ring , covalently modified by acyl groups of different structure and composition. In our case, the claimed compound is a compound of natural origin, in large quantities in plants for food and medicinal purposes. From the available scientific and patent literature, the regulators of the “quorum sense” based on gamma octalactone are not known. Gamma-octalactone is a flavoring ingredient, is widely used in cosmetology as a fragrance with a low degree of toxicity [14]

Во-вторых, благодаря структурному сходству с природными авторегуляторными молекулами, проявляющими активность во многих luxI/luxR - подобных системах, заявляемое соединение общей формулы 1 обладает регуляторной активностью в отношении cvil/cviR - регулируемой системы биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum (см. пример 1), а также других биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих, бактерий. При этом вероятной причиной активного действия соединения общей формулы 1 в названных системах «чувства кворума» лежит их избирательное взаимодействие с регуляторным белком CviR и его близкими гомологами и другими LuxR-подобными белками. В свою очередь наиболее тонкие механизмы определяются конформационным соответствием гамма-окталактона участку регуляторного белка, в естественных условиях ответственного за связывание лактонного кольца в молекуле ГСЛ. Для понимания сути изобретения также необходимо указать, что достигаемая применением соединения общей формулы 1 регуляция чувства кворума включает, но не исчерпывается только воздействием на продукцию виолацеина, т.к. под контролем регуляторного белка CviR находится ряд целевых генов (оперонов), в том числе ответственных за продукцию экзоферментов и образование биопленок. Использование же теста индукции или ингибирования биосинтеза виолацеина в настоящем изобретении определяется простотой и информативностью регистрируемого проявления регуляторной активности соединений общей формулы 1.Secondly, due to the structural similarity with natural autoregulatory molecules that are active in many luxI / luxR-like systems, the claimed compound of general formula 1 has a regulatory activity against cvil / cviR - the regulated Chromobacterium violacein biosynthesis system (see Example 1), as well as other biotechnologically beneficial, putrid and pathogenic violacein-producing bacteria. At the same time, the probable reason for the active action of the compound of general formula 1 in these “quorum feelings” systems is their selective interaction with the regulatory protein CviR and its close homologues and other LuxR-like proteins. In turn, the most subtle mechanisms are determined by the conformational correspondence of gamma-octalactone to the region of the regulatory protein, which under natural conditions is responsible for the binding of the lactone ring in the GSL molecule. In order to understand the essence of the invention, it is also necessary to point out that the regulation of the feeling of quorum achieved by using a compound of general formula 1 includes, but is not limited to, only the effect on the production of violacein, since under the control of the regulatory protein CviR is a number of target genes (operons), including those responsible for the production of exoenzymes and the formation of biofilms. Using the same test induction or inhibition of the biosynthesis of violacein in the present invention is determined by the simplicity and informativeness of the recorded manifestations of the regulatory activity of compounds of general formula 1.

Защищаемое применение соединения общей формулы 1 подразумевает, в том числе, его использование для управления биотехнологическими процессами, реализуемыми с использованием виолацеин-продуцирующих микроорганизмов (справочно: виолацеин - производное индола, образующееся при окислении триптофана, сине-фиолетовый пигмент с антибактериальной, протистоцидной, противовирусной и другими биотехнологически и фармакологически полезными активностями). В этом случае соединение общей формулы 1 может вводиться в плотные или жидкие питательные среды в виде растворов, а также применяться в виде чистых веществ или иммобилизованными на различных носителях.Protected use of a compound of general formula 1 implies, inter alia, its use for controlling biotechnological processes implemented using violacein-producing microorganisms (for reference: violacein is an indole derivative formed during tryptophan oxidation, a blue-violet pigment with an antibacterial, procytocidal, antiviral, and other biotechnological and pharmacologically beneficial activities). In this case, the compound of general formula 1 can be introduced into solid or liquid nutrient media in the form of solutions, and also be used in the form of pure substances or immobilized on various carriers.

В состав патентуемого изобретения входит также применение соединения общей формулы 1 для регуляции активности других целевых генов (оперонов), в том числе вовлеченных в процессы порчи сельскохозяйственной продукции, а также развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данное соединение может вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Соединение может использоваться в виде твердых веществ, растворов или суспензий в воде или других растворителях, а также нанесенными на различные носители. Возможно также использование соединения общей формулы 1 в составе композиций с другими веществами, в том числе позитивно модифицирующими (повышающими биодоступность, увеличивающими сроки действия и т.д.) проявления их биологической активности.The patented invention also includes the use of a compound of general formula 1 for regulating the activity of other target genes (operons), including those involved in the deterioration of agricultural products, as well as the development of infectious diseases of plants, animals and humans. To this end, this compound can be injected into the body to ensure a systemic effect, and also be applied topically to affect certain areas (for example, as part of wound dressing materials, while processing the surgical field, etc.). The compound can be used in the form of solids, solutions or suspensions in water or other solvents, as well as applied to various carriers. It is also possible to use a compound of general formula 1 in compositions with other substances, including positively modifying (increasing bioavailability, increasing periods of action, etc.) of the manifestation of their biological activity.

Так же по сравнению с упомянутыми выше техническими решениями [6, 9, 12] заявляемое изобретение имеет ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.Also in comparison with the above-mentioned technical solutions [6, 9, 12], the claimed invention has a number of significant differences that meet the requirement of novelty.

1) В отличие от патента US 20110105421 [12] способность к подавлению систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий установлена у соединения, выделяемого не из внесенного в Международную Красную книгу тропического растения Conocarpus erectus, но из широко распространенных в различных климатических поясах растений, в том числе произрастающих и в северных широтах: гамма-окталактон присутствует в чернике, персиках, абрикосах и других фруктах, а так же в эвкалипте, где он был нами обнаружен методами хромато-масс-спектрометрии, что снимает ресурсные (сырьевые) ограничения при получении присутствующих в них биологически активных компонентов. Данные растения произрастают на территории Российской Федерации, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных источников получения природных соединений общей формулы 1.1) Unlike patent US 20110105421 [12], the ability to suppress LuxI / LuxR type “quorum sensing” systems in bacteria is found in a compound isolated not from the tropical plant Conocarpus erectus entered into the International Red Book, but widely distributed in different climatic zones plants, including those growing in the northern latitudes: gamma-octalactone is present in blueberries, peaches, apricots and other fruits, as well as in eucalyptus, where it was discovered by us using chromatography-mass spectrometry, which removes resource (raw) materials bounds in obtaining the biologically active components present in them. These plants grow on the territory of the Russian Federation, which allows us to consider them as potential sources for the production of natural compounds of general formula 1.

2) В отличие от патента WO 2004016588 [6], соединение общей формулы2) Unlike patent WO 2004016588 [6], the compound of the general formula

1 не проявляют выраженной токсичности в отношении человека и животных (ЛД50=4400 мг/кг) [15]. В соответствии с заключением Европейского агентства по безопасности продуктов питания (EFSA) от 06.10.2004 г. гамма-окталактон признан нетоксичным соединением, пригодным для использования в парфюмерии и косметике, а так же разрешено его включение в продукты питания (например, кондитерские изделия и алкоголь) [14, 15].1 do not show pronounced toxicity towards humans and animals (LD50 = 4400 mg / kg) [15]. In accordance with the conclusion of the European Food Safety Authority (EFSA) of 10/06/2004, gamma-octalactone is recognized as a non-toxic compound suitable for use in perfumery and cosmetics, as well as its inclusion in foodstuffs (for example, confectionery and alcohol). ) [14, 15].

3) В отличие от патента WO 2012076016 [9], соединение общей формулы 1 не имеет выраженных побочных эффектов, способных осложнить его практическое применение.3) Unlike patent WO 2012076016 [9], a compound of general formula 1 does not have pronounced side effects that can complicate its practical application.

4) Предлагаемый способ применения соединения общей формулы 1 в качестве ингибитора систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий ранее не описано.4) The proposed method of using a compound of general formula 1 as an inhibitor of LuxI / LuxR type “quorum sensing” systems in bacteria has not been previously described.

Известное применение данного соединения в микробиологии и фармацевтике, широко отражено в патентных обзорах, например: US 20150104399, US 2014178444, US 9125936, US 9334371, US 8623340, US 2014179645 и др., которые описывают вспомогательные (в качестве компонента, входящего в состав композиции) или прямые антибактериальные эффекты гамма-окталактона. В частности, патентом [16] оговаривается применение окта-лактона в качестве очищенного соединения в антимикробной композиции, а патент [14] оговаривает состав антибактериальной композиции с участием гамма-окталактона, но в большей степени как ароматизирующий агент на ряду с кумаринами и ванилинами, противмикробные свойства которых давно известны [17; 18]The known use of this compound in microbiology and pharmaceuticals is widely reflected in patent reviews, for example: US 20150104399, US 2014178444, US 9125936, US 9334371, US 8623340, US 2014179645, etc., which describe the auxiliary (as a component included in ) or direct antibacterial effects of gamma octalactone. In particular, the patent [16] specifies the use of octa-lactone as a purified compound in an antimicrobial composition, and the patent [14] specifies the composition of an antibacterial composition with gamma-octalactone, but more as a flavoring agent along with coumarins and vanillins, antimicrobial the properties of which have long been known [17; 18]

Сказанное позволяет утверждать, что из открытых патентных и научных источников применение гамма-окталактона и его производных в качестве ингибиторов систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий не известно.This suggests that from open patent and scientific sources, the use of gamma-octalactone and its derivatives as inhibitors of LuxI / LuxR-type sensory quorum systems in bacteria is not known.

5) При обосновании настоящего изобретения заявителями получены оригинальные экспериментальные данные, доказывающие возможность применения соединения общей формулы 1 для ингибирования широкого спектра систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий, включающих индуцируемые различными по структуре ацилированными гомосерин-лактонами (АГЛ) системы LuxI/LuxR Vibrio fischeri, Cvil/CviR Chromobacterium violaceum, а также присутствующие у Pseudomonas aeruginosa системы Rhll/RhlR и LasI/LasR. При этом в некоторых случаях зафиксирована и прямая антибактериальная активность гамма-окталактона на фоне которой способность к подавлению «кворум сенсинга» проявляют субингибиторные концентрации тестируемого соединения.5) At the substantiation of the present invention, the applicants obtained original experimental data proving the possibility of using the compound of general formula 1 for inhibiting a wide range of LuxI / LuxR type quorum sensing systems in bacteria, including LuxI induced system-induced homoserine-lactones (AHL) of different structure LuxR Vibrio fischeri, Cvil / CviR Chromobacterium violaceum, as well as the Rhll / RhlR and LasI / LasR systems present in Pseudomonas aeruginosa. At the same time, in some cases, the direct antibacterial activity of gamma-octalactone, on the background of which, the ability to suppress "quorum sensing" is shown to show subinhibitory concentrations of the test compound, is also recorded.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.The invention is illustrated, but not limited to the following examples.

Пример 1. Способ применения гамма-окталактона для ингибирования различных систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий.Example 1. The method of using gamma octalactone for inhibiting various LuxI / LuxR type “quorum sensing” systems in bacteria.

В качестве ингибитора «кворум сенсинга» у бактерий было использовано соединение, соответствующее общей формуле 1.As an inhibitor of "quorum sensing" in bacteria, a compound corresponding to general formula 1 was used.

Определение способности данного соединения к ингибированию «чувства кворума» проводилось с использованием четырех различных бактериальных тест-систем LuxI/LuxR типа, каждая из которых индуцировалась определенным АГЛ и содержала соответствующие ему LuxR-подобный рецепторный белок. При этом три из них были сформированы на основе Escherichia coli JLD271 с мутацией в гене sdiA, ответственном за восприятие экзогенных АГЛ, что исключало интерференцию с клонированными в данном хозяйском штамме генноинженерными биолюминесцентными конструкциями [19]. В свою очередь сами подобные генетические конструкции были представлены плазмидами с последовательностями генов rhlRrhllr.luxCDABE, luxRlux!':iluxCDABE и lasRdasIwluxCDABE, специфически реагирующими развитием свечения при появлении в среде культивирования С4-АГЛ (N-бутаноил-L-гомосеринлактона), С6-оксо-АГЛ (N-(оксогексаноил)-L-гомосеринлактона) и С12-оксо-АГЛ (N-(оксододеканоил)-L-гомосеринлактона), соответственно. Четвертая тест-система была представлена Chromobacterium violaceum NCTC 13274, особенностью которого являлась инсерция транспозона Tn5 в ген cvil, ответственного за синтез С6-АГЛ (N-гексаноил-L-гомосеринлактона), с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им рецепторного белка, ответственного за восприятие данного автоиндуктора [20]. Вследствие подобной генетической организации данный штамм в присутствии экзогенно вносимого С6-АГЛ образовывал доступный для оптической регистрации (575 нм) сине-фиолетовый пигмент виолацеин.Determination of the ability of this compound to inhibit the "feeling of quorum" was carried out using four different LuxI / LuxR type bacterial test systems, each of which was induced by a specific AHL and contained its corresponding LuxR-like receptor protein. At the same time, three of them were formed on the basis of Escherichia coli JLD271 with a mutation in the sdiA gene responsible for the perception of exogenous AHL, which excluded interference with genetically engineered bioluminescent structures cloned in this host strain [19]. In turn, similar genetic constructions themselves were represented by plasmids with the rhlRrhllr.luxCDABE, luxRlux! 'Gene sequences: iluxCDABE and lasRdasIwluxCDABE, specifically reacting to the development of luminescence when C4-AHL (N-butanoyl-L-homoserine lacto), x-butanoyl-L-homoserine lactone), x-butanoyl-L-homoserine lactone, I-0, I-0, I-luso-l-homoserctinone), C-AHL ()) -AGHL (N- (oxohexanoyl) -L-homoserinactone) and C12-oxo-AHL (N- (oxododecanoyl) -L-homoserinelactone), respectively. The fourth test system was presented by Chromobacterium violaceum NCTC 13274, a feature of which was the insertion of the transposon Tn5 into the cvil gene, which is responsible for the synthesis of C6-AHL (N-hexanoyl-L-homoserine lactone), with the retention of the functionally active cviR gene and its receptor protein, which is responsible for the perception of this autoinductor [20]. Due to a similar genetic organization, this strain in the presence of exogenously introduced C6-AHL formed the blue-violet pigment violacein available for optical recording (575 nm).

Возможность применения соединения 1 для ингибирования перечисленных систем «кворум сенсинга» проводилась путем внесения серий их двукратных разведений в жидкие питательные среды, содержащие бактериальный биотест и соответствующий ему автоиндуктор (АГЛ). Характеристикой ингибирующего эффекта служили выраженные в мМ величины ЕС50 - концентрации исследованного соединения общей формулы 1, вызывающие подавление биолюминесценции или нарушение образования пигмента виолацеина на 50% от максимально возможного выраженного эффекта, рассчитанного относительно соответствующих контролей: 0% - в отсутствие АГЛ; 100% - в присутствии только АГЛ. Результаты анализа зависимости «доза-эффект», иллюстрирующие ингибирующий эффект соединения 1 в отношении различных вариантов системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий отображены на Фиг. 1, а в обобщенном виде приведены в таблице 1.The possibility of using compound 1 for inhibiting the aforementioned quorum sensing systems was carried out by introducing a series of their two-fold dilutions into liquid nutrient media containing a bacterial biotest and its corresponding autoinductor (AHL). Characteristics of the inhibitory effect were expressed in mM EC50 values — concentrations of the investigated compounds of general formula 1, causing bioluminescence suppression or impaired pigment formation of volacein by 50% of the maximum pronounced effect calculated relative to the corresponding controls: 0% - in the absence of AHL; 100% - in the presence of only AHL. The results of the dose-effect analysis illustrating the inhibitory effect of compound 1 on various variants of LuxI / LuxR type quorum sensing in bacteria are shown in FIG. 1, and in the generalized form are given in table 1.

Из приведенных значений видно, что способ применения гамма-окталактона позволяет проявлять ярко выраженное ингибирующее воздействие на все исследованные системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа, характеризуемое величинами ЕС50 от 0,15 до 0,4 мМ.These values show that the method of using gamma-octalactone allows for a pronounced inhibitory effect on all LuxI / LuxR type quorum sensing systems, characterized by EC50 values from 0.15 to 0.4 mM.

Положительным результатом подобного способа использования заявляемого изобретения является возможность подавления систем «кворум сенсинга» фитопатогенных и зоопатогенных бактерий.A positive result of this method of using the claimed invention is the possibility of suppressing quorum sensing systems of phytopathogenic and zoopathogenic bacteria.

Список литературыBibliography

1. Bhardwaj А.K., Vinothkumar K., Rajpara N. Bacterial Quorum sensing inhibitors: attractive alternatives for control of infectious pathogens showing multiple drug resistance // Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery. 2013. V. 8. P. 68-83.1. Bhardwaj A.K., Vinothkumar K., Rajpara N. Bacterial Quorum sensing inhibitors: showing multiple drug resistance // Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery. 2013. V. 8. P. 68-83.

2. Jiang Т., Li M. Quorum sensing inhibitors: a patent review. Expert Opin. Ther. Pat. 2013, V. 23(7), P. 867-894.2. Jiang T., Li M. Quorum sensing inhibitors: a patent review. Expert Opin. Ther. Pat. 2013, V. 23 (7), p. 867-894.

3. Waters С.М., Bassler B.L. Quorum-sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Ann. Rev. Cell and Developmental Biol, 2005, V. 21, P. 319-346.3. Waters C.M., Bassler B.L. Quorum-sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Ann. Rev. Cell and Developmental Biol, 2005, V. 21, P. 319-346.

4. Bhardwaj A.K, Vinothkumar K. Rajpara N. Bacterial quorum sensing inhibitors: attractive alternatives for control of infectious pathogens showing multiple drug resistance. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 2013, V. 8, P. 68-83.4. Bhardwaj A.K., Vinothkumar K. Rajpara N. Bacterial quorum sensing inhibitors: showing multiple drug resistance. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 2013, V. 8, P. 68-83.

5. Manefield M., Rasmussen T.B., Henzter M., Andersen J.B., Steinberg P., Kjelleberg S., Givskov M. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover // J. Microbiolody (UK), 2002, V. 148, P. 1119-1127.5. Manefield, M., Rasmussen, TB, Henzter, M., Andersen, JB, Steinberg, P., Kjelleberg, S., Givskov, M. Halogenated furanones LuxR turnover // J. Microbiolody (UK), 2002, V. 148 , P. 1119-1127.

6. WO 2004016588, Furanone derivatives and methods of making same.6. WO 2004016588, Furanone derivatives and methods of making same.

7. Hentzer M., Givskov M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections. // J. Clin. Invest., 2003, V. 112, P. 1300-1307.7. Hentzer M., Givskov M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections. // J. Clin. Invest., 2003, V. 112, P. 1300-1307.

8. Jakobsen Т.Н., Van Gennip M., Phipps R.K., Shanmugham M.S., Christensen L.D., Alhede M., Skindersoe M.E., Friedrich K., Uthe F., Jensen P.O., Moser C, Nielsen K.F., Eberl L., Larsen Т.О., Tanner D., Hoiby N., Bjarnsholt Т., Rasmussen T.B., Givskov M. Ajoene, a sulfur-rich molecule from garlic, inhibits genes controlled by quorum sensing // Antimicrob. Agents Chemother., 2012, V. 56(5), P. 2314-2325.8. Jakobsen TN, Van Gennip M., Phipps RK, Shanmugham MS, Christensen LD, Alhede M., Skindersoe ME, Friedrich K., Uthe F., Jensen PO, Moser C, Nielsen KF, Eberl L., Larsen, TO, Tanner, D., Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Rasmussen TB, Givskov, M. Ajoene, a sulfur-rich molecule from garlic, inhibits genes controlled by quorum sensing, Antimicrob. Agents Chemother., 2012, V. 56 (5), P. 2314-2325.

9. WO 2012076016, Process for the manufacture of ajoene derivatives.9. WO 2012076016, Process for the manufacture of ajoene derivatives.

10. Dirsch V.M., Gerbes A.L., Vollmar A.M. Ajoene, a compound of garlic, induces apoptosis in human promyeloleukemic cells, accompanied by generation of reactive oxygen species and activation of nuclear factor kappaB. // Molecular Pharmacology, 1998, V. 53(3), P. 402-407.10. Dirsch V.M., Gerbes A.L., Vollmar A.M. Ajoene, a compound of garlic, an induce apoptosis in human promyelolekemic cells, accompanied by a generation of reactive species and an associated nuclear factor kappaB. // Molecular Pharmacology, 1998, V. 53 (3), P. 402-407.

11. Adonizio A., Dawlaty J., Ausubel F.M., Clardy J., Mathee K. Ellagitannins from Conocarpus erectus exhibit anti-quorum sensing activity against Pseudomonas aeruginosa // Planta Med., 2008, V. 74, DOI: 10.1055/s-0028-1084373.11. Adonizio A., Dawlaty J., Ausubel FM, Clardy J., Mathee K. Ellagitannins from Conocarpus erectus exhibit anti-quorum sensation activity against Pseudomonas aeruginosa // Planta Med., 2008, V. 74, DOI: 10.1055 / s -0028-1084373.

12. US 20110105421, Ellagitannins as inhibitors of bacterial quorum sensing12. US 20110105421, Ellagitannins as inhibitors of bacterial quorum sensing

13. Blackwell H.E., Geske G.D., Campbell J.C. Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands. US patent 7910622, 2011.13. Blackwell H.E., Geske G.D., Campbell J.C. Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands. US patent 7910622, 2011.

14. Food and Cosmetics Toxicology. V. 14, P. 821, 1976.14. Food and Cosmetics Toxicology. V. 14, P. 821, 1976.

15. Duke, James. '

Phytochemical and Ethnobotanical Databases. United States Department of Agriculture.' Agricultural Research Service, Accessed April 27 (2004).15. Duke, James. '

Phytochemical and Ethnobotanical Databases. United States Department of Agriculture. ' Agricultural Research Service, Accessed April 27 (2004).

16. US2014179645, Antimicrobial compositions16. US2014179645, Antimicrobial compositions

17. Kontogiorgis C., Detsi A., Hadjipavlou-Litina D. Coumarin-based drugs: a patent review (2008 - present) // Expert Opin. Ther. Pat, 2012, V. 22(4), P. 437-454;17. Kontogiorgis C., Detsi A., Hadjipavlou-Litina D. Coumarin-based drugs: a patent review (2008 - present) // Expert Opin. Ther. Pat, 2012, V. 22 (4), P. 437-454;

18. Ponnusamy K., Paul D., Kweon J.H. Inhibition of quorum sensing mechanism and Aeromonas hydrophila biofilm formation by Vanillin // Environ. Eng. Sci., 2009, V. 26(8), P. 1359-1363.18. Ponnusamy K., Paul D., Kweon J.H. Inhibition of the quorum sensing mechanism and Aeromonas hydrophila biofilm formation by Vanillin // Environ. Eng. Sci., 2009, V. 26 (8), P. 1359-1363.

19. Lindsay A., Ahmer B.M. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones // J.Bacteriol, 2005, V. 187(14), P. 5054-5058.19. Lindsay A., Ahmer B.M. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones // J.Bacteriol, 2005, V. 187 (14), P. 5054-5058.

20. McClean K.H., et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones // Microbiology, 1997, V. 143, P. 3703-3711.20. McClean K.H., et al. Quorum sensing and chromobacterium violaceum: Microbiology, 1997, V. 143, P. 3703-3711.

Claims

Применение гамма-окталактона в качестве ингибитора системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий:The use of gamma-octalactone as an inhibitor of LuxI / LuxR type “quorum sensing” in bacteria: