RU2688745C1 - Method for determining toxicity of samples - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology; microbiology.SUBSTANCE: disclosed is a method for determining toxicity of samples containing oil products. Method includes incubation of test microorganisms Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D in amount of 5×10up to 5×10viable cells per ml in a liquid nutrient medium for 10–20 hours at 15–25 °C in presence of tested samples and in their absence. Intensity of light (Iod), optical density (Auv) and intensity of photofluorescence (Iff) are measured. Total degree of activating or inhibiting (+/-) vital activity of test microorganisms by test samples is determined by formula: ε=(ε+0.4ε+0.6ε)/2, where ε, εεis determined by formulas ε=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc, where ΔY=Ye-Yb – differences of values Iod, Auv or Iff, recorded in beginning (Yb) and in end (Ye) incubation of test samples in presence of tested samples (ΔYt) and in their absence (ΔYc).EFFECT: method provides objectivity of assessing toxicity of samples containing oil products.1 cl, 1 tbl

Description

Изобретение относится к области биоизмерительных технологий, а именно к способам оценки с помощью тестовых микроорганизмов токсичности проб, содержащих различные нефтепродукты и другие подобные им углеводороды.The invention relates to the field of bio-measuring technologies, and in particular to methods for assessing the toxicity of samples containing various petroleum products and other similar hydrocarbons using test microorganisms.

Известен «Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам» (патент RU № 2505813, МПК G01N 33/48, дата приоритета 06.11.2012, опубликовано 27.01.2014), в котором антимикробную активность тестируемых веществ по отношению к тому или иному биоматериалу предлагается определять, исходя из количества колоний микроорганизмов, исходно содержащихся в означенном биоматериале и выросших на плотной накопительной питательной среде в присутствии тестируемого препарата, а также времени проявления видимого роста этих колоний. Недостатками этого способа являются его длительность (до 3-х суток), большая трудоемкость, большая материалоемкость по компонентам питательных сред, а также то, что антимикробная активность тестируемых веществ определяется визуально, а следовательно, достаточно субъективно.Known "Method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances" (patent RU No. 2505813, IPC G01N 33/48, priority date 06.11.2012, published 01/27/2014), in which the antimicrobial activity of the tested substances in relation to a particular biomaterial is proposed to determine based on the number of colonies of microorganisms, initially contained in the said biomaterial and grown on a dense accumulative nutrient medium in the presence of the test preparation, as well as the time of appearance of the visible growth of these colonies. The disadvantages of this method are its duration (up to 3 days), large labor intensity, high materials consumption for nutrient media components, and also the fact that the antimicrobial activity of the tested substances is determined visually, and therefore, quite subjective.

Известен «Способ определения токсичности среды по степени угнетения роста тест-культур микроорганизмов», (патент RU № 2570637, МПК C12Q, дата приоритета 14.10.2014, опубликовано 10.12.2015), в котором токсичность тестируемых веществ определяется с помощью геометрической линейки по формуле: ΔR=100-100×(D_K-D_T)/D_К, где D_T и D_К - средний диаметр колоний тестовых культур (в качестве которых используются различные виды и штаммы микромицетов), выросших на плотной питательной среде в присутствии различных концентраций тестируемого вещества, а также в отсутствие оного, по прошествии одинакового времени инкубации при одинаковой температуре. Недостатками этого способа, как и в предыдущем случае, являются его длительность (до 14-и суток), большая трудоемкость, большая материалоемкость по компонентам питательных сред, а также значительная субъективность получаемых результатов.Known "Method for determining the toxicity of the environment according to the degree of inhibition of growth of test cultures of microorganisms", (patent RU No. 2570637, IPC C12Q, priority date 14.10.2014, published 10.12.2015), in which the toxicity of the test substances is determined using a geometric ruler according to the formula: ΔR = 100-100 × (D _K –D _T ) / D _K , where D _T and D _K are the average diameter of the colonies of the test cultures (for which various types and strains of micromycetes are used) grown on a dense nutrient medium in the presence of various concentrations test substance as well as in the absence of onog , After the same time of incubation at the same temperature. The disadvantages of this method, as in the previous case, are its duration (up to 14 days), high labor intensity, high material consumption of nutrient media components, as well as significant subjectivity of the obtained results.

Известен «Способ оценки эффективности антимикробного воздействия антисептиков на бактерии, существующие в форме биопленки» (патент RU № 2603100, МПК C12Q, дата приоритета 29.10.2015, опубликовано 20.11.2016), в котором эффективность действия антисептиков на бактерии, выделенные из клинического материала пациента и существующие в жидкой питательной среде (ЖПС) в форме биопленки, предлагается определять как отношение рабочей концентрации антисептика к его минимальной подавляющей концентрации. При этом регистрацию эффективности действия той или иной концентрации тестируемого антисептика на биопленку предлагается проводить с помощью фотометра - по изменению цвета и помутнению ЖПС с тестовыми микроорганизмами, инкубируемой при заданной температуре в течение заданного времени (от 5-и суток и более) в присутствии тестируемого антисептика, взятого в упомянутой концентрации. Основными недостатками этого способа, как и в предыдущих случаях, являются его большая длительность и трудоемкость, а также невысокая объективность, поскольку рассматриваемый способ позволяет оценивать влияние тестируемых веществ лишь на скорость роста тестовых микроорганизмов, но не на интенсивность их метаболизма.The “Method for evaluating the effectiveness of antimicrobial effects of antiseptics on bacteria existing in the form of a biofilm” (RU patent No. 2603100, IPC C12Q, priority date 10/29/2015, published 11/20/2016) is known, in which the effectiveness of antiseptics on bacteria isolated from patient’s clinical material and existing in a liquid nutrient medium (RPS) in the form of a biofilm, it is proposed to determine how the ratio of the working concentration of an antiseptic to its minimum inhibitory concentration. At the same time, it is proposed to record the effectiveness of a given concentration of a test antiseptic on a biofilm using a photometer — for discoloration and clouding of RIP with test microorganisms, incubated at a given temperature for a specified time (from 5 days or more) in the presence of the test antiseptic taken in the said concentration. The main disadvantages of this method, as in the previous cases, are its long duration and laboriousness, as well as low objectivity, because this method allows to evaluate the effect of test substances only on the growth rate of test microorganisms, but not on the intensity of their metabolism.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ определения бактерицидных свойств сыворотки крови» (патент RU № 2489489, МПК C12Q 1/18, дата приоритета 26.12.2011, опубликовано 10.08.2013), в котором бактерицидные свойства проб сыворотки крови определяют по уменьшению интенсивности люминесценции инкубируемого в LB-бульоне в присутствии тестируемых проб тестового трансгенного штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, эффективно экспрессирующего luxAB-гены грамотрицательного морского микроорганизма Photobacterium leiognathi (в результате чего синтезируется фермент люцифераза, обеспечивающий активное свечение, интенсивность которого зависит от общего количества жизнеспособных тестовых микроорганизмов и активности их метаболизма). При этом анализ осуществляют следующим образом:Closest to the proposed technical solution is the "Method for determining the bactericidal properties of serum" (patent RU No. 2489489, IPC C12Q 1/18, priority date 12/26/2011, published on 10.08.2013), in which the bactericidal properties of serum samples are determined by decreasing the intensity luminescence incubated in LB-broth in the presence of test samples of the test transgenic Bacillus subtilis strain VKPM B-10548, effectively expressing the luxAB genes of the gram-negative marine microorganism Photobacterium leiognathi (as a result of which the enzyme luciferase, which provides active luminescence, the intensity of which depends on the total number of viable test microorganisms and the activity of their metabolism). When this analysis is as follows:

на первом (подготовительном) этапе выращивают штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 на LB-агаре в присутствии канамицина в конечной концентрации 40 мкг/мл (что позволяет исключить рост не люминесцирующих штаммов) при 37°С в течение 24 часов. Полученную биомассу смывают стерильным LB-бульоном, после чего полученную суспензию стандартизуют до оптической плотности 1,2 отн. ед. при 540 нм (измеряемой в кюветах с длиной оптического пути 1 см);At the first (preparatory) stage, the Bacillus subtilis VKPM B-10548 strain is grown on LB agar in the presence of kanamycin at a final concentration of 40 μg / ml (which allows to exclude the growth of non-luminescent strains) at 37 ° C for 24 hours. The resulting biomass is washed off with sterile LB-broth, after which the resulting suspension is standardized to an optical density of 1.2 rel. units at 540 nm (measured in cuvettes with an optical path length of 1 cm);

на втором (основном) этапе смешивают суспензию бактериальных клеток и исследуемого образца сыворотки крови в соотношении 1:1 и инкубируют полученную смесь при 37°С в течение 30 минут. При этом до и после инкубации из тестовой смеси производят отбор аликвот по 250 мкл в кюветы для биолюминометра. И дополнительно вносят в них по 2 мкл деканаля в конечной концентрации 7×10^-6 М (окисляемого в присутствии молекулярного кислорода ферментом люциферазой - что и обеспечивает активное свечение тестового штамма).at the second (main) stage, a suspension of bacterial cells and a test serum sample in a 1: 1 ratio are mixed and the mixture is incubated at 37 ° C for 30 minutes. At the same time, before and after incubation, 250 μl aliquots are taken from the test mixture into the cuvettes for the bioluminometer. And additionally add 2 µl of decanal in them at a final concentration of 7 × 10 ^-6 M (oxidized in the presence of molecular oxygen by the enzyme luciferase - which ensures the active luminescence of the test strain).

На завершающем этапе осуществляют регистрацию уровня свечения в пробах в видимой сине-зеленой области спектра (420-600 им). При этом в качестве измерительного прибора могут использоваться биохемилюминометр «Биоток-10М», а также прочие отечественные и зарубежные люминометры, работающие в обозначенной области спектра и обеспечивающие соответствующую чувствительность измерений.At the final stage, the emission level is measured in samples in the visible blue-green region of the spectrum (420–600). At the same time, the biochemiluminometer “Biotok-10M” can be used as a measuring instrument, as well as other domestic and foreign luminometers operating in the designated spectral region and providing appropriate measurement sensitivity.

К основным недостаткам данного технического решения можно отнести узкую область его применения (анализ бактерицидных свойств только лишь сыворотки крови человека и животных); а также то, что рассматриваемый метод обладает не очень высокой объективностью, поскольку влияние тестируемых проб (в качестве которых в данном случае выступают образцы сыворотки крови животных и человека) на тестовые организмы определяется всего лишь по одному косвенному параметру (а именно, разности интенсивностей хемилюминесценции тестовых микроорганизмов в присутствии и в отсутствие тестируемых проб).The main disadvantages of this technical solution include a narrow area of its application (analysis of the bactericidal properties of only human and animal serum); and also that the method under consideration does not have a very high objectivity, since the effect of the tested samples (which in this case are the serum samples of blood of animals and humans) on test organisms is determined only by one indirect parameter (namely, the difference between the chemiluminescence intensities of the test microorganisms in the presence and in the absence of test samples).

В связи со всё ускоряющимся развитием технологий, увеличением объемов и разнообразия производимой и потребляемой человечеством продукции, а также увеличением народонаселения и концентрацией его в отдельных районах, увеличивается всё более и антропогенная нагрузка на окружающую среду, а также усложняется её характер и территориальное распределение. Вследствие этого, всё более актуальной становится проблема разработки достаточно простых, дешевых, экспрессных, достоверных, надежных и доступных для массового применения методов оценки степени экологического неблагополучия различных водоемов и территорий и т.п. Кроме того упомянутые методы важны и для мониторинга токсической и экологической безопасности различной продукции, а также выбросов и стоков на разных этапах их очистки и утилизации и т.п.In connection with the accelerating development of technology, the increase in the volume and diversity of products manufactured and consumed by mankind, as well as an increase in population and its concentration in certain areas, the human pressure on the environment is also increasing, and its nature and territorial distribution are also complicated. As a result, the problem of developing fairly simple, cheap, express, reliable, reliable and affordable for mass application methods for assessing the degree of environmental distress of various water bodies and territories, etc., is becoming increasingly urgent. In addition, the methods mentioned are also important for monitoring the toxic and environmental safety of various products, as well as emissions and effluents at different stages of their purification and disposal, etc.

Нефтепродукты (включая природную нефть) являются на сегодняшний день одними из наиболее значимых загрязнителей окружающей среды. Наиболее приемлемым и адекватным из методов оценки их токсичности в настоящее время признано использование тестовых биосистем. Использование в качестве последних многоклеточных организмов позволяет более адекватно моделировать человеческий организм. В то же время, биотестирование с помощью микроорганизмов делает проведение таких анализов значительно более простым, доступным, дешевым, экспрессным и объективным в оценке результатов.Petroleum products (including natural oil) are today among the most significant environmental pollutants. The use of test biosystems is currently recognized as the most acceptable and adequate method for assessing their toxicity. Use as the last multicellular organisms allows us to more adequately model the human body. At the same time, biotesting with the help of microorganisms makes carrying out such analyzes much simpler, affordable, cheap, rapid and objective in evaluating the results.

В связи с вышесказанным, целью заявляемого изобретения стало создание способа, позволяющего, по сравнению с прототипом, с большей объективностью оценивать токсичность более широкого круга тестируемых проб (включая пробы, содержащие значительные количества различных нефтепродуктов и других подобных им углеводородов).In connection with the foregoing, the purpose of the claimed invention was to create a method that, compared to the prototype, more objectively assess the toxicity of a wider range of tested samples (including samples containing significant amounts of various petroleum products and other similar hydrocarbons).

Цель эта достигается за счёт того, что в предлагаемом способе (который включает такие операции как подготовка тестовых образцов, инкубирование этих образцов как в присутствии тестируемых проб, так и в их отсутствие, сопровождающееся измерением свойств этих образцов в начале и в конце их инкубации, и последующее определение токсичности тестируемых проб на основании упомянутых измерений) тестовые образцы перед началом их инкубирования представляют собой суспензии Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D в количестве от 5×10⁵ до 5×10⁶ жизнеспособных клеток на мл водного раствора, изначально содержащего 4-10 г/л сахарозы + 1,5-1,7 г/л NH4NO3 + 0,4-0,6 г/л KH₂PO₄ + 0,4-0,6 г/л NaH₂PO₄ + 0,6-0,8 г/л (NH₄)₂SO₄ + 0,18-0,22 г/л Mg(NO₃)₂ + 0,05-0,07 г/л FeCl₃ + 0,018-0,022 г/л CaCl₂ и имеющего рН 6,6-7,4; инкубирование этих образцов в присутствии тестируемых объектов (в качестве которых могут выступать пробы, содержащие различные нефтепродукты и другие подобные им углеводороды) проводят в течение 10-20 часов при 15-25°С; свойства тестовых образцов определяют при этом путем измерения для них интенсивности света, упруго рассеиваемого на длине волны 540±10 нм (Iod), интенсивности светопоглощения на длине волны 300±10 нм (Auv) и интенсивности фотофлуоресценции на длине волны 465±10 нм при возбуждении оной на длине волны 380±10 нм (Iff); после чего общую степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми объектами определяют по формуле: ε_s=(ε_Iod+0,4ε_Auv+0,6ε_Iff)/2, где ε_Iod, ε_Auv и ε_Iff определяют по формулам ε_Y=100×(ΔYt-ΔYc )/ΔYc, где ΔY=Ye-Yb - разности значений Iod, Auv или Iff, регистрируемых в начале (Yb) и в конце (Ye) инкубации тестовых образцов в присутствии тестируемых объектов (AYt) и в их отсутствие (AYc).This goal is achieved due to the fact that in the proposed method (which includes such operations as preparing test samples, incubating these samples both in the presence and absence of the test samples, accompanied by measuring the properties of these samples at the beginning and end of their incubation, and subsequent determination of toxicity of the test samples on the basis of said measurements) test samples before incubating them are suspensions Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D in an amount of from 5 × ¹⁰ May to ¹⁰ June 5 × viable cells per ml a solution initially containing 4-10 g / l sucrose + 1.5-1.7 g / l NH4NO3 + 0,4-0,6 g / l KH ₂ PO ₄ + 0.4-0.6 g / l NaH ₂ PO ₄ + 0.6-0.8 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ + 0.18-0.22 g / l Mg (NO ₃ ) ₂ + 0.05-0.07 g / l FeCl ₃ + 0,018-0,022 g / l CaCl ₂ and having a pH of 6.6-7.4; incubation of these samples in the presence of test objects (which can be samples containing various petroleum products and other similar hydrocarbons) is carried out for 10–20 hours at 15–25 ° C; properties of test samples are determined by measuring the intensity of light elastically scattered at a wavelength of 540 ± 10 nm (Iod), the light absorption intensity at a wavelength of 300 ± 10 nm (Auv) and the photofluorescence intensity at a wavelength of 465 ± 10 nm under excitation thereof at a wavelength of 380 ± 10 nm (Iff); then the total degree of activation or inhibition (+/-) of the life of the test microorganisms by the test objects is determined by the formula: ε _s = (ε _Iod + 0.4ε _Auv + 0.6 _{ε Iff} ) / 2, where ε _Iod , ε _Auv and ε _Iff determined by the formulas ε _Y = 100 × (ΔYt-ΔYc) / ΔYc, where ΔY = Ye-Yb are the differences of the values of Iod, Auv or Iff recorded at the beginning (Yb) and at the end (Ye) of the incubation of test samples in the presence of test objects (AYt) and in their absence (AYc).

При этом, для длительного хранения Р. yamanorum (на скошенном агаре, при 1-6°С, с пересевом через каждые 2 месяца ) рекомендуется питательная среда следующего состава: 20 г/л белкового гидролизата + 3 г/л NaNO₃ + 1 г/л KH₂PO₄ + 0,5 г/л KCl + 0,5 г/л MgSO₄ + 20 г/л агар-агара.At the same time, for long-term storage of R. yamanorum (on canted agar, at 1-6 ° C, with subculture every 2 months), a nutrient medium of the following composition is recommended: 20 g / l of protein hydrolyzate + 3 g / l of NaNO ₃ + 1 g / l KH ₂ PO ₄ + 0.5 g / l KCl + 0.5 g / l MgSO ₄ + 20 g / l agar-agar.

Выбор Pseudomonas в качестве тестовых микроорганизмов связан с тем, что эти аэробные, не образующие спор, палочковидные бактерии, обладая развитой ферментной системой (позволяющей им использовать в процессе своего метаболизма в качестве источника углерода самые различные органические субстраты), активной подвижностью (обеспечиваемой двумя жгутиками, полярно расположенными на концах вытянутой клетки Pseudomonas) и малыми размерами, широко распространены в естественных условиях в почве, различных водоемах, воздухе и т.п. А кроме того, штамм Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, предлагаемый к использованию в качестве тестового в описываемом изобретении, способен активно деструктурировать различные нефтепродукты и другие подобные им углеводороды, используя их в качестве источника углерода в процессах своего метаболизма (см. патент RU № 2615458 от 04.04.2017). При том, что в местах достаточно активного и длительного нефтезагрязнения практически всегда происходит изменение состава природных биоценозов, приводящее к преобладанию в них тех видов и штаммов живых организмов (среди которых микроорганизмы, как правило, представляют наиболее существенную часть - модельную, к тому же, в отношении большинства других живых организмов), которые способны наиболее эффективно использовать загрязняющие вещества для своего метаболизма. В результате, всё это обеспечивает наиболее объективную оценку хронического влияния тестируемых проб, содержащих нефтепродукты и другие подобные им углеводороды, на природную микрофлору и биоценозы, в целом.The choice of Pseudomonas as test microorganisms is related to the fact that these aerobic, non-spore-forming, rod-shaped bacteria possess an advanced enzyme system (allowing them to use various organic substrates as a carbon source in their metabolism), active mobility (provided by two flagellae, polarly located at the ends of an elongated cell (Pseudomonas) and small in size, widely distributed in natural conditions in the soil, various water bodies, air, etc. And besides, the Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D strain, proposed for use as a test in the described invention, can actively destructurize various petroleum products and other similar hydrocarbons, using them as a carbon source in their metabolic processes (see patent RU No. 2615458 dated 04/04/2017). Despite the fact that in places of rather active and long-term oil pollution almost always there is a change in the composition of natural biocenoses, leading to the predominance of those species and strains of living organisms (among which microorganisms, as a rule, represent the most significant part - the model one, most other living organisms), which are able to most effectively use pollutants for their metabolism. As a result, all this provides the most objective assessment of the chronic effect of the tested samples containing petroleum products and other similar hydrocarbons on the natural microflora and biocenoses, in general.

Выбор количества жизнеспособных тестовых микроорганизмов, которое должно присутствовать в тестовых образцах перед началом их инкубации в присутствии и в отсутствие тестируемых объектов (от 5×10⁵ до 5×10⁶ кл/мл), определяется тем, что при меньшем количестве таковых микроорганизмов увеличивается длительность инкубации, необходимая для достижения максимальной чувствительности заявляемого способа анализа; а при большем количестве тестовых микроорганизмов снижается интенсивность их роста и метаболизма, что приводит к уменьшению чувствительности анализа.The choice of the number of viable test microorganisms that must be present in the test samples before they are incubated in the presence and absence of test objects (from 5 × 10 ⁵ to 5 × 10 ⁶ cells / ml) is determined by the fact that with a smaller number of such microorganisms, the duration increases. incubation required to achieve maximum sensitivity of the proposed method of analysis; and with a larger number of test microorganisms, the intensity of their growth and metabolism decreases, which leads to a decrease in the sensitivity of the analysis.

Выбор исходного состава жидкой питательной среды, входящей в состав тестовых образцов (водный раствор с рН 6,6-7,4, содержащий 4-10 г/л сахарозы + 1,6±0,2 г/л NH₄NO₃ + 0,5±0,1 г/л KH₂PO₄ + 0,5±0,1 г/л NaH₂PO₄ + 0,7±0,1 г/л (NH4)₂SO₄ + 0,2±0,02 г/л Mg(NO₃)₂ + 0,06±0,01 г/л FeCl₃ + 0,02±0,002 г/л CaCl₂) связан с необходимостью обеспечения оптимальных условий как для развития в этой среде микроорганизмов, используемых в качестве тестовых, так и для измерения параметров этой среды, используемых в заявляемом способе в качестве аналитических (а именно, Iod, Auv и Iff) - что, как и в предыдущем случае, нужно для увеличения чувствительности и снижения продолжительности анализа.The choice of the initial composition of the liquid nutrient medium, which is part of the test samples (aqueous solution with pH 6.6-7.4, containing 4-10 g / l sucrose + 1.6 ± 0.2 g / l NH ₄ NO ₃ + 0 , 5 ± 0.1 g / l KH ₂ PO ₄ + 0.5 ± 0.1 g / l NaH ₂ PO ₄ + 0.7 ± 0.1 g / l (NH4) ₂ SO ₄ + 0.2 ± 0.02 g / l Mg (NO ₃ ) ₂ + 0.06 ± 0.01 g / l FeCl ₃ + 0.02 ± 0.002 g / l CaCl ₂ is associated with the need to ensure optimal conditions for the development of microorganisms in this environment used as a test, and for measuring the parameters of this environment, used in the present method as analytical (namely, Iod, Auv and Iff) - which, as in the previous case, you need to increase sensitivity and reduce the duration of the analysis.

Выбор режима инкубирования тестовых образцов (10-20 часов при 15-25°С) связан с тем, что при более длительном инкубировании интенсивность роста и метаболизма тестовых микроорганизмов снижается (что приводит к уменьшению чувствительности анализа); при других температурах инкубирования интенсивность роста и метаболизма тестовых микроорганизмов также снижается (что приводит к уменьшению чувствительности анализа либо увеличению его длительности); а при меньшем времени инкубирования тестовые микроорганизмы не успевают в достаточной степени среагировать на изменения в окружающей их среде, вызванные присутствием там тестируемых объектов (что приводит к снижению как чувствительности, так и объективности анализа).The choice of incubation of test samples (10-20 hours at 15-25 ° C) is due to the fact that with longer incubation the growth rate and metabolism of test microorganisms decrease (which leads to a decrease in the sensitivity of the analysis); at other incubation temperatures, the growth rate and metabolism of test microorganisms also decrease (which leads to a decrease in the sensitivity of the analysis or an increase in its duration); and with less incubation time, the test microorganisms do not have enough time to react to changes in their environment caused by the presence of the test objects there (which leads to a decrease in both sensitivity and objectivity of the analysis).

А увеличение (по сравнению с прототипом) объективности и спектра применимости заявляемого способа анализа обеспечивается тем, что в ходе него осуществляется точная, инструментальная, количественная оценка изменения как интенсивности роста (оцениваемой нефелометрическим методом по изменению у тестовых образцов значений Iod), так и метаболической активности (оцениваемой по изменению у тестовых образцов значений Auv и Iff) тестовых микроорганизмов, являющихся типичными представителями естественной микрофлоры территорий, подвергающихся активному хроническому загрязнению различными нефтепродуктами и другими подобными им углеводородами. В то время как в прототипе влияние тестируемых объектов на тестовые микрорганизмы определялось всего лишь по одному параметру тестовых образцов (а именно, интенсивности их хемилюминесценции), достаточно косвенно характеризующему метаболическую активность тестовых микроорганизмов. Причем данным способом предлагалось оценивать токсичность весьма узкого круга тестируемых объектов (а именно, сыворотки крови человека и животных), и к тому же, с помощью тестовых микроорганизмов с достаточно нетипичным метаболизмом.And the increase (compared to the prototype) of objectivity and applicability of the proposed method of analysis is ensured by the fact that during it an accurate, instrumental, quantitative assessment of changes in both the growth rate (as measured by the neodometry method for changes in test samples Iod values) and metabolic activity is carried out (estimated by the change in test samples of the values of Auv and Iff) of test microorganisms, which are typical representatives of the natural microflora of territories exposed to chronic contamination with various petroleum products and other similar hydrocarbons. While in the prototype, the effect of the test objects on the test microorganisms was determined by only one parameter of the test samples (namely, the intensity of their chemiluminescence), rather indirectly characterizing the metabolic activity of test microorganisms. Moreover, this method was proposed to assess the toxicity of a very narrow range of test objects (namely, the blood serum of humans and animals), and besides, using test microorganisms with a rather atypical metabolism.

Реализация предлагаемого способа определения токсичности проб, содержащих различные нефтепродукты и другие подобные им углеводороды, осуществляется следующим образом:The implementation of the proposed method of determining the toxicity of samples containing various petroleum products and other similar hydrocarbons, as follows:

Этап 1. Готовится питательная среда (ПС), представляющая собой стерильный водный раствор с рН 6,6-7,4, содержащий 4-10 г/л сахарозы + 1,5-1,7 г/л NH4NO3 + 0,4-0,6 г/л KH₂PO₄ + 0,4-0,6 г/л NaH₂PO₄ + 0,6-0,8 г/л (NH₄)₂SO₄ + 0,18-0,22 г/л Mg(NO₃)₂ + 0,05-0,07 г/л FeCl₃ + 0,018-0,022 г/л CaCl₂. После чего все емкости с ПС хранятся в герметично закрытом виде, в отсутствие света, при 2-4°С.Step 1. Preparing a nutrient medium (PS), which is a sterile aqueous solution with a pH of 6.6-7.4, containing 4-10 g / l sucrose + 1.5-1.7 g / l NH4NO3 + 0.4- 0.6 g / l KH ₂ PO ₄ + 0.4-0.6 g / l NaH ₂ PO ₄ + 0.6-0.8 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ + 0.18-0, 22 g / l Mg (NO ₃ ) ₂ + 0.05-0.07 g / l FeCl ₃ + 0.018-0.022 g / l CaCl ₂ . Then all containers with PS are stored in a tightly closed form, in the absence of light, at 2-4 ° C.

Этап 2. Отбираются тестируемые пробы (ТП); после чего доставляются в лабораторию и хранятся там до начала анализа в темном месте, в герметически закрытом виде, при 2-4°С.Stage 2. Selected test samples (TP); after which they are delivered to the laboratory and stored there until the beginning of the analysis in a dark place, in hermetically sealed form, at 2-4 ° C.

Этап 3. Подготавливается исходный тестовый образец (ТО). Для чего в одну большую емкость с ПС стерильно вносится 1-10 об. % закваски, содержащей суспендированные в ПС жизнеспособные клетки Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D. После чего упомянутая емкость закрывается и инкубируется при 15-25 °С в течение 48 ч с обеспечением достаточного уровня циркуляции воздуха и питательных веществ (с помощью шейкера и ватно-марлевых пробок либо иными способами).Step 3. Prepare the initial test sample (TO). For which, 1-10 vol. Sterile is inserted into one large container with PS. % starter containing PS suspended in viable cells of Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D. After that, the mentioned container is closed and incubated at 15-25 ° C for 48 hours with ensuring sufficient level of air and nutrient circulation (using a shaker and cotton-gauze plugs or by other means).

Затем в упомянутой емкости измеряется интенсивность света, упруго рассеиваемого ТО на длине волны 540±10 нм (Iod). И по предварительно построенному калибровочному графику (представляющему собой зависимость Iod ТО от концентрации содержащихся в нем клеток Р. yamanorum) удостоверяется, что полученное значение Iod соответствует концентрации Р. yamanorum в ТО от 5×10⁵ до 5×10⁶ клеток на мл (кл/мл).Then, in the above-mentioned capacitance, the intensity of the light, elastically dissipated by TO at a wavelength of 540 ± 10 nm (Iod) is measured. And according to the previously constructed calibration graph (representing the dependence of Iod MOT on the concentration of P. yamanorum cells contained in it), it is confirmed that the obtained Iod value corresponds to the concentration of P. yamanorum in MOT from 5 × 10 ⁵ to 5 × 10 ⁶ cells per ml (cl / ml).

После этого, если измеренная Iod соответствует концентрации Р. yamanorum в ТО меньше 5×10⁵ кл/мл; то емкость с ТО инкубируется в тех же условиях, что и ранее в течение ещё 24 ч; после чего для неё проводится повторное определение Iod. А если измеренная Iod соответствует концентрации Р. yamanorum в ТО больше 5×10⁶ кл/мл; то ТО в той же емкости разбавляется необходимым количеством ПС.After that, if the measured Iod corresponds to the concentration of P. yamanorum in TO less than 5 × 10 ⁵ cells / ml; the container with TO is incubated under the same conditions as before for another 24 hours; after which Iod is repeated for it. And if the measured Iod corresponds to the concentration of P. yamanorum in TO greater than 5 × 10 ⁶ cells / ml; then THEN in the same container is diluted with the required amount of PS.

Этап 4. Если нас интересует концентрационная зависимость токсического действия тестируемых проб, либо эти пробы имеют слишком высокую исходную токсичность (так что ожидается, что в неразведенном виде они будут слишком сильно ингибировать развитие тестовых микроорганизмов), то делается необходимое количество разведений исходных проб. После чего каждая проба или каждое ее разведение делится на 3-5 равных частей, каждая из которых помещается в отдельную емкость, куда также добавляется заданное количество ТО, подготовленного на 3 этапе анализа.Step 4. If we are interested in the concentration dependence of the toxic effect of the tested samples, or these samples have too high initial toxicity (so it is expected that, undiluted, they will inhibit the development of test microorganisms too much), then the required dilution of the original samples is made. After that, each sample or its dilution is divided into 3-5 equal parts, each of which is placed in a separate container, which also adds a specified amount of TO, prepared in 3 stages of analysis.

Этап 5. Все емкости, приготовленные на 4-м этапе анализа, плюс некоторое количество контрольных емкостей, содержащих ТО без добавок тестируемых проб (а также, в случае необходимости, ТО с заданным количеством вещества или смеси веществ, про- или антимикробная активность которых известны заранее) закрываются, перемешиваются и помещаются в термостат, где инкубируются в течение 10-20 часов при температуре 15-25°С. При этом непосредственно перед началом и после окончания этой инкубации во всех упомянутых емкостях регистрируются значения таких параметров ТО (изменяющихся вследствие роста и размножения там тестовых микроорганизмов, а также преобразования ими в ходе метаболической активности одних веществ, входящих в состав ТО, в другие) как интенсивность света, упруго рассеиваемого на длине волны 540±10 нм (Iod), оптическая плотность на длине волны 300±10 нм (Auv) и интенсивность фотофлуоресценции на длине волны 465±10 нм при возбуждения оной на длине волны 380±10 нм (Iff).Stage 5. All containers prepared at the 4th stage of the analysis, plus a certain number of control containers containing THAT without the addition of test samples (and, if necessary, THAT with a specified amount of a substance or mixture of substances whose pro- or antimicrobial activity is known in advance) are closed, mixed and placed in a thermostat, where they are incubated for 10-20 hours at a temperature of 15-25 ° C. At the same time, immediately before the start and after the end of this incubation, the values of such TO parameters (changing as a result of the growth and reproduction of test microorganisms there, as well as their conversion during the metabolic activity of some substances that make up the TO) into others, are recorded in all the mentioned containers. light elastically diffused at a wavelength of 540 ± 10 nm (Iod), optical density at a wavelength of 300 ± 10 nm (Auv) and photofluorescence intensity at a wavelength of 465 ± 10 nm when excited at a wavelength of 380 ± 1 0 nm (Iff).

Этап 6. После этого общая степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми пробами рассчитывается по формуле ε_s=(ε_Iod+0,4ε_Auv+0,6ε_Iff)/2,Step 6. After that, the total degree of activation or inhibition (+/-) of the vital activity of the test microorganisms by the tested samples is calculated using the formula ε _s = (ε _Iod + 0.4ε _Auv + 0.6 _{ε Iff} ) / 2,

где ε_Iod, ε_Auv и ε_Iff определяют по формулам ε_Y=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc, где ΔY=Ye-Yb - разности значений Iod, Auv или Iff, регистрируемых в начале (Yb) и в конце (Ye) инкубации ТО в присутствии тестируемых проб (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc).where ε _Iod , ε _Auv and ε _{Iff are} determined by the formulas ε _Y = 100 × (ΔYt-ΔYc) / ΔYc, where ΔY = Ye-Yb are the differences of the values of Iod, Auv or Iff recorded at the beginning (Yb) and at the end ( Ye) incubating TO in the presence of test samples (ΔYt) and in their absence (ΔYc).

Упомянутый способ может быть реализован с применением фотофлуориметра «СМ-2203» или иного, позволяющего с достаточной степенью чувствительности измерять для жидких, водных образцов интенсивность света, упруго рассеиваемого на длине волны 540±10 нм, оптическую плотность на длине волны 300±10 нм и интенсивность фотофлуоресценции на длине волны 465±10 нм при возбуждения оной на длине волны 380±10 нм.The above method can be implemented using a “CM-2203” photo fluorimeter or another method that allows, with a sufficient degree of sensitivity, to measure for liquid, aqueous samples the intensity of light elastically scattered at a wavelength of 540 ± 10 nm, and the optical density at a wavelength of 300 ± 10 nm and photofluorescence intensity at a wavelength of 465 ± 10 nm with excitation thereof at a wavelength of 380 ± 10 nm.

Более детально настоящее изобретение описывается следующим конкретным примером.In more detail, the present invention is described in the following specific example.

Для анализа было взято три образца, содержащих неразведенные дизельное топливо (ДТ, представляющее собой одну из наиболее тяжелых фракций, получаемых при прямой дистилляции нефти и имеющих в своем составе от 15 до 30% ароматических углеводородов при 20-60% циклических и 10-40% ациклических насыщенных углеводородов), уайт-спирит (УС, представляющий собой легкий сорт керосина, получаемый прямой дистилляцией нефти и содержащий смесь различных жидких алифатических и ароматических углеводородов, причем последних не более 16% по массе) и ОП-10 (ОП, смесь ароматических углеводородов, достаточно активно применяемая в настоящее время в качестве смачивающей и эмульгирующей неионогенной поверхностно-активной добавки в нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей, химической, текстильной, горно-рудной, сельскохозяйственной и других отраслях промышленности, а также в качестве активного вещества при производстве различных технических и бытовых моющих средств).For the analysis, three samples were taken containing undiluted diesel fuel (DT), which is one of the heaviest fractions obtained by direct distillation of oil and having from 15 to 30% aromatic hydrocarbons at 20-60% cyclic and 10-40% acyclic saturated hydrocarbons), white spirit (CS, which is a light grade of kerosene, obtained by direct distillation of oil and containing a mixture of various liquid aliphatic and aromatic hydrocarbons, the latter not more than 16% by weight) and OP-10 (OP, mixture aromatic hydrocarbons, which are currently being actively used as a wetting and emulsifying non-ionic surfactant in oil-producing, oil-refining, chemical, textile, mining, agricultural and other industries, as well as an active substance in the production of various technical and domestic detergents).

Каждый из этих образцов помещался в 6 пробирок (так, чтобы в 3-х из них конечная концентрация тестируемого образца составила 2×10^-3 об. %, а в других 3-х - 2×10^-5 об. %), в которые затем дополнительно было налито по 6 мл тестовой среды (ТС), в качестве которой использовалась суспензия, содержащая около 10⁶ жизнеспособных клеток Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D в 1 мл водного раствора, исходно стерильного, имевшего рН 7,0±0,2 и содержавшего 6±0,1 г/л сахарозы + 1,6±0,1 г/л NH₄NO₃ + 0,5±0,1 г/л KH₂PO₄ + 0,5±0,1 г/л NaH₂PO₄ + 0,7+0,05 г/л (NH₄)₂SO₄ + 0,2+0,02 г/л Mg(NO₃)₂ + 0,06±0,003 г/л FeCl₃ + 0,02+0,001 г/л CaCl₂.Each of these samples was placed in 6 tubes (so that in 3 of them the final concentration of the test sample was 2 × 10 ^-3 % by volume, and in the other 3 - 2 × 10 ^-5 % by volume), in which were then additionally poured in 6 ml of test medium (TC), which was used as a suspension containing about 10 ⁶ viable cells of Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D in 1 ml of an aqueous solution, initially sterile, having a pH of 7.0 ± 0.2 and containing 6 ± 0.1 g / l sucrose + 1.6 ± 0.1 g / l NH ₄ NO ₃ + 0.5 ± 0.1 g / l KH ₂ PO ₄ + 0.5 ± 0.1 g / l / l NaH ₂ PO ₄ + 0.7 + 0.05 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ + 0.2 + 0.02 g / l Mg (NO ₃ ) ₂ + 0.06 ± 0.003 g / l FeCl ₃ + 0.02 + 0.001 g / l CaCl ₂ .

Затем все эти пробирки (включая 3-й контрольные, содержавшие ту же ТС, но без добавления какой-либо из тестируемых проб) перемешивались, закрывались ватно-марлевыми пробками и инкубировались на шейкере при комнатной температуре в течение 8-и часов. При этом непосредственно перед началом инкубации и сразу после ее окончания последовательно у ТС в каждой из пробирок с помощью спектрофлуориметра «СМ-2203» регистрировались интенсивность света, упруго рассеиваемого на длине волны 540±10 нм (Iod), оптическая плотность на длине волны 300±10 нм (Auv) и интенсивность фотофлуоресценции на длине волны 465±10 нм при возбуждения оной на длине волны 380±10 нм (Iff).Then all these tubes (including the 3rd control tubes containing the same TS, but without adding any of the tested samples) were mixed, closed with cotton-gauze plugs and incubated on a shaker at room temperature for 8 hours. At the same time, immediately before the start of incubation and immediately after its completion, the intensity of light elastically dissipated at a wavelength of 540 ± 10 nm (Iod), the optical density at a wavelength of 300 ± 1 were recorded successively at the vehicle in each of the tubes using an SM-2203 spectrofluorometer. 10 nm (Auv) and photofluorescence intensity at a wavelength of 465 ± 10 nm with excitation thereof at a wavelength of 380 ± 10 nm (Iff).

Далее, изменения каждого из измеренных параметров ТС рассчитывались по формуле: ΔY=Ye-Yb (где Yb и Ye - значения Iod, Auv или Iff, зарегистрированные в каждой из контрольных и тестовых пробирок в начале и в конце их инкубирования). Затем все полученные значения AY,- усреднялись (по пробиркам, содержащим одни и те же концентрации одних и тех же образцов), и для каждого из усредненных значений рассчитывался 95% доверительный интервал. После чего общая степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми пробами рассчитывалась по формулеFurther, changes in each of the measured TS parameters were calculated using the formula: ΔY = Ye-Yb (where Yb and Ye are Iod, Auv or Iff values recorded in each of the control and test tubes at the beginning and end of their incubation). Then all the obtained values of AY, were averaged (for test tubes containing the same concentrations of the same samples), and for each of the averaged values, a 95% confidence interval was calculated. Then the total degree of activation or inhibition (+/-) of the life of the test microorganisms by the tested samples was calculated by the formula

ε_s=(ε_Iod+0,4ε_Auv+0,6ε_Iff)/2,ε _s = (ε _Iod + 0,4ε _Auv + 0,6ε _Iff ) / 2,

где ε_Y=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc,where ε _Y = 100 × (ΔYt-ΔYc) / ΔYc,

a ΔYt и ΔYc - изменения значений Iod, Auv или Iff, произошедшие за время инкубирования ТС в присутствии различных количеств тестируемых проб (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc).a ΔYt and ΔYc are changes in the values of Iod, Auv or Iff that occurred during the incubation of the TS in the presence of various amounts of the tested samples (ΔYt) and in their absence (ΔYc).

Результаты этих расчетов представлены в таблице 1.The results of these calculations are presented in table 1.

Таблица 1. Степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D в присутствии различных количеств тестируемых проб (ТП).Table 1. The degree of activation or inhibition (+/-) of the vital activity of Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D in the presence of different amounts of test samples (TP).

Примечания. Здесь индексами «р3» и «р5» обозначены концентрации тестируемых материалов, равные 2×10^-3 и 2×10^-5 об. % соответственно. ДТ - дизельное топливо, УС - уайт-спирит, ОП - ОП-10.Notes. Here, the indices “p3” and “p5” denote the concentrations of the tested materials equal to 2 × 10 ^-3 and 2 × 10 ^-5 vol. % respectively. DT - diesel fuel, US - white spirit, OP - OP-10.

Из представленных данных можно сделать следующие выводы. В присутствии любой из тестируемых проб в концентрации 2×10^-3 об. % наблюдалась ингибирование жизнедеятельности тестовых микроорганизмов. При этом увеличение токсичности тестируемых проб наблюдалось в следующем ряду УС<ДТ<ОП. И ингибирование наблюдалось в большей степени для активности метаболизма Р. yamanorum (выражаемой значениями Auv и Iff) нежели для интенсивности роста и размножения таковых микроорганизмов (выражаемой значениями Iod).From the presented data we can draw the following conclusions. In the presence of any of the tested samples at a concentration of 2 × 10 ^-3 vol. % was observed inhibition of the life of the test microorganisms. At the same time, an increase in the toxicity of the tested samples was observed in the following series: CD <DT <OP. And inhibition was observed more for the activity of the metabolism of P. yamanorum (expressed by the values of Auv and Iff) rather than for the intensity of growth and reproduction of such microorganisms (expressed by the values of Iod).

В то же время, в концентрации 2×10^-5 об. % все тестируемые пробы активировали жизнедеятельность тестовых микроорганизмов. При этом уменьшение пробиотических свойств тестируемых проб наблюдалось в следующем ряду ОП>УС>ДТ. И активирование наблюдалось в большей степени для интенсивности метаболизма Р. yamanorum нежели для скорости ее роста и размножения.At the same time, at a concentration of 2 × 10 ^-5 vol. % all tested samples activated the vital activity of test microorganisms. At the same time, a decrease in the probiotic properties of the tested samples was observed in the next row OP>CM> DT. And activation was observed to a greater extent for the intensity of the metabolism of P. yamanorum than for the rate of its growth and reproduction.

Таким образом, заявляемый способ может обеспечить повышение объективности и расширение области применения определения токсичности проб (включая пробы, содержащие значительные количества различных нефтепродуктов и других подобных им углеводородов).Thus, the inventive method can provide an increase in objectivity and expansion of the scope of determining the toxicity of samples (including samples containing significant amounts of various petroleum products and other hydrocarbons like them).

Claims (1)

Способ определения токсичности проб, включающий подготовку тестовых образцов, содержащих достаточное количество жизнедеятельных тестовых микроорганизмов, суспендированных в изначально стерильной жидкой питательной среде, инкубирование этих образцов как в присутствии тестируемых проб, так и в их отсутствие, сопровождающееся измерением свойств тестовых образцов в начале и в конце их инкубирования, и последующее определение токсичности тестируемых проб, отличающийся тем, что тестируемые пробы содержат нефтепродукты или другие подобные им углеводороды, тестовые микроорганизмы представляют собой штамм Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, количество которого в тестовых образцах перед началом инкубации последних должно составлять от 5×10⁵ до 5×10⁶ жизнеспособных клеток на мл, жидкая питательная среда, используемая для приготовления тестовых образцов, представляет собой стерильный водный раствор с pH 6,6-7,4, содержащий 4-10 г/л сахарозы + 1,5-1,7 г/л NH₄NO₃ + 0,4-0,6 г/л KH₂PO₄ + 0,4-0,6 г/л NaH₂PO₄ + 0,6-0,8 г/л (NH₄)₂SO₄ + 0,18-0,22 г/л Mg(NO₃)₂ + 0,05-0,07 г/л FeCl₃ + 0,018-0,022 г/л CaCl₂, инкубирование тестовых образцов проводят в течение 10-20 ч при 15-25°C, свойства образцов определяют путем измерения интенсивности света, упруго рассеиваемого на длине волны 540±10 нм (Iod), оптической плотности на длине волны 300±10 нм (Auv) и интенсивности фотофлуоресценции на длине волны 465±10 нм при возбуждении оной на длине волны 380±10 нм (Iff), после чего общую степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми пробами определяют по формуле: ε_S = (ε_Iod + 0,4ε_Auv + 0,6ε_Iff) / 2, где ε_Iod, ε_Auv и ε_Iff определяют по формулам ε_Y = 100 × (ΔYt - ΔYc) / ΔYc, где ΔY = Ye - Yb - разности значений Iod, Auv или Iff, регистрируемых в начале (Yb) и в конце (Ye) инкубации тестовых образцов в присутствии тестируемых проб (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc).The method of determining the toxicity of samples, including the preparation of test samples containing a sufficient number of vital test microorganisms suspended in initially sterile liquid nutrient medium, incubation of these samples both in the presence of test samples, and in their absence, followed by measuring the properties of test samples at the beginning and end their incubation, and the subsequent determination of the toxicity of the tested samples, characterized in that the tested samples contain oil products or other similar It’s hydrocarbons, test microorganisms are a strain of Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D, the number of which in test samples before incubation of the latter should be from 5 × 10 ⁵ to 5 × 10 ⁶ viable cells per ml, liquid nutrient medium used for the preparation of test samples, is a sterile aqueous solution with a pH of 6.6-7.4, containing 4-10 g / l sucrose + 1.5-1.7 g / l NH ₄ NO ₃ + 0.4-0.6 g / l KH ₂ PO ₄ + 0.4-0.6 g / l NaH ₂ PO ₄ + 0.6-0.8 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ + 0.18-0.22 g / l Mg (NO ₃ ) ₂ + 0.05-0.07 g / l FeCl ₃ + 0.018-0.022 g / l CaCl ₂ , incubation of test samples is carried out for 10 -20 h at 15-25 ° C, the properties of the samples are determined by measuring the intensity of light elastically scattered at a wavelength of 540 ± 10 nm (Iod), optical density at a wavelength of 300 ± 10 nm (Auv) and photofluorescence intensity at a wavelength of 465 ± 10 nm upon excitation of this at a wavelength of 380 ± 10 nm (Iff), after which the total degree of activation or inhibition (+/-) of the life of the test microorganisms by the tested samples is determined by the formula: ε _S = (ε _Iod + 0.4ε _Auv + 0.6 ε _Iff ) / 2, where ε _Iod , ε _Auv and ε _{Iff are} determined by the formulas ε _Y = 100 × (ΔYt - ΔYc) / ΔYc, where ΔY = Ye - Yb is the difference s Iod, Auv or Iff, recorded at the beginning (Yb) and at the end (Ye) of the incubation of test samples in the presence of test samples (ΔYt) and in their absence (ΔYc).