RU2681439C1

RU2681439C1 - Influenza virus the virus-like particle and its obtaining method

Info

Publication number: RU2681439C1
Application number: RU2018105367A
Authority: RU
Inventors: Александр Николаевич Доронин
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек"
Priority date: 2018-02-13
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2019-03-06

Abstract

FIELD: biotechnologies.SUBSTANCE: invention relates to the biotechnology. Invention relates to the influenza virus the virus-like particle (VLP), designed for the anti-influenza vaccine development, constructed from influenza virus proteins: hemagglutinin, neuraminidase and matrix protein M1, where the neuraminidase proteins and matrix protein M1 are the A/California/04/2009 strain proteins, and hemagglutinin is the strain A/California/04/2009, A/Michigan/45/2015(H1N1), A/Novosibirsk/01/2014, A/HongKong/4801/2014(H3N2), B/Phuket/3073/2013 or B/Brisbane/60/2008, and also to its obtaining method.EFFECT: development of the anti-influenza vaccine.5 cl, 44 dwg, 6 ex, 15 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к вирусоподобной частице (ВПЧ) вируса гриппа, предназначенной для создания антигриппозной вакцины, построенной из белков вируса гриппа: гемагглютинина, нейраминидазы и матриксного белка M1 гриппа штамма A/Califomia/04/2009(H1N1); гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Novosibirsk/01/2014(H3N2), нейраминидазы и матриксного белка M1 вируса гриппа штамма A/California/04/2009(H1N1) или белков гемагглютинина вируса гриппа штамма B/Phuket/3073/2013 и нейраминидазы и матриксного белка M1 вируса гриппа штамма A/California/04/2009(H1N1), а также к способу ее получения.The invention relates to biotechnology, namely to a virus-like particle (HPV) of an influenza virus, designed to create an influenza vaccine constructed from influenza virus proteins: hemagglutinin, neuraminidase and matrix protein M1 of influenza strain A / Califomia / 04/2009 (H1N1); Hemagglutinin of influenza virus strain A / Novosibirsk / 01/2014 (H3N2), neuraminidase and matrix protein M1 of influenza virus A / California / 04/2009 (H1N1) or protein hemagglutinin of influenza virus strain B / Phuket / 3073/2013 and neuraminidase and matrix protein M1 of the influenza virus strain A / California / 04/2009 (H1N1), as well as the method for its preparation.

Грипп человека - высококонтагиозная болезнь. Передача вируса происходит воздушно-капельным путем, а также путем контакта с предметами, контаминированными патогеном (игрушки, дверные ручки и др.), с последующим попаданием в верхние дыхательные пути или конъюнктивальную слизистую. Рецепторы клеток, к которым вирусы гриппа человека имеют предпочтение, экспрессируются на эпителиальных клетках на всем протяжении дыхательных путей: в слизистой оболочке носа, околоносовых пазухах, глотке, трахее, бронхах, бронхиолах и альвеолах, но их количество различно на разных участках [1].Human influenza is a highly contagious disease. The transmission of the virus occurs by airborne droplets, as well as by contact with objects contaminated with the pathogen (toys, door handles, etc.), followed by contact with the upper respiratory tract or conjunctival mucosa. Cell receptors, to which human influenza viruses are preferred, are expressed on epithelial cells throughout the respiratory tract: in the nasal mucosa, paranasal sinuses, pharynx, trachea, bronchi, bronchioles and alveoli, but their number is different in different areas [1].

Вирус гриппа имеет негативный геном, состоящий из 8 фрагментов одноцепочечной вирионной РНК (вРНК), кодирующих по крайней мере 11 белков. Если все фрагменты расположить в порядке убывания молекулярного веса, то первые три фрагмента кодируют белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1 и РА), четвертый - гемагглютинин (НА), пятый - нуклеопротеин (NP), шестой - нейраминидазу (NA), седьмой - матриксный белок (M1) и неструктурный белок (М2), восьмой кодирует два белка (NS1 и NS2). Второй фрагмент РВ1 кодирует еще один белок PB1-F2, образующийся в результате альтернативного сплайсинга мРНК, этот белок вызывает апоптоз через нарушение структуры митохондрий [2]. В составе вириона все фрагменты вРНК находятся в виде рибонуклеопротеида (вРНП) - вРНК, ассоциированного с белком NP и белками полимеразного комплекса [3]. В состав полимеразного комплекса, проявляющего активность РНК-зависимой РНК-полимеразы, входят белки РВ1, РВ2 и РА. Проникновение вируса гриппа (ВГ) в клетку происходит путем эндоцитоза вирионов с последующим переносом всех 8 фрагментов в рибонуклеопротеид (РНП), сначала в цитоплазму, а затем в ядро инфицированной клетки [4, 5].The influenza virus has a negative genome consisting of 8 fragments of single-stranded virion RNA (vRNA) encoding at least 11 proteins. If all the fragments are arranged in decreasing order of molecular weight, then the first three fragments encode the proteins of the polymerase complex (PB2, PB1 and RA), the fourth - hemagglutinin (HA), the fifth - nucleoprotein (NP), the sixth - neuraminidase (NA), the seventh - matrix protein (M1) and non-structural protein (M2), the eighth encodes two proteins (NS1 and NS2). The second fragment of PB1 encodes another protein PB1-F2, resulting from alternative splicing of mRNA, this protein causes apoptosis through a violation of the structure of mitochondria [2]. In the virion, all vRNA fragments are in the form of a ribonucleoprotein (vRNP) - vRNA associated with the NP protein and proteins of the polymerase complex [3]. The composition of the polymerase complex exhibiting the activity of an RNA-dependent RNA polymerase includes proteins PB1, PB2 and RA. Influenza virus (HBV) penetrates the cell by endocytosis of the virions, followed by transfer of all 8 fragments to the ribonucleoprotein (RNP), first into the cytoplasm and then into the nucleus of the infected cell [4, 5].

В процессе упаковки вируса важную роль играет взаимодействие вРНП, M1, НА и NA. Сегменты вирусных РНК содержат уникальные сигналы упаковки, которые частично перекрываются рамками считывания в определенных сегментах РНК, что позволяет координировать упаковку вирусного генома. НА и NA являются важными структурами для определения формы вириона, однако механизм селективного отбора фрагментов вРНП при упаковке их в вирионы до сих пор не известен [6, 7]. Наиболее важными антигенами ВГ типов А и В, изменчивость которых способствует появлению новых эпидемий, являются НА и NA. Первый ответствен за взаимодействие вируса с поверхностью клетки и в процессе размножения в организме вызывает индукцию нейтрализующих его антител. Фермент NA в антигенном отношении отличается от НА. Антитела к NA не нейтрализуют инфекционности вируса (кроме очень высоких концентраций), но сильно замедляют освобождение вируса из инфицированных клеток, и эти антитела могут играть важную роль в снижении репликации вируса in vivo и в предотвращении распространения инфекции [8].The interaction of vRNP, M1, HA, and NA plays an important role in the packaging process of the virus. Viral RNA segments contain unique packaging signals that partially overlap the reading frames in specific RNA segments, which allows coordination of the packaging of the viral genome. HA and NA are important structures for determining the shape of the virion, however, the mechanism of selective selection of vRNP fragments upon their packing into virions is still not known [6, 7]. The most important types of HBV antigens of types A and B, whose variability contributes to the emergence of new epidemics, are HA and NA. The first is responsible for the interaction of the virus with the surface of the cell and during the process of reproduction in the body causes the induction of neutralizing antibodies. Enzyme NA is antigenically different from HA. Antibodies to NA do not neutralize the infectivity of the virus (except for very high concentrations), but they strongly slow down the release of the virus from infected cells, and these antibodies can play an important role in reducing the replication of the virus in vivo and in preventing the spread of infection [8].

Отличительной чертой ВГ является высокая изменчивость генома, что позволяет ему уклоняться от специфического иммунитета и вследствие этого вызывать ежегодные эпидемии, реже - пандемии при появлении в популяции вируса с новым генотипом, к которому большинство населения не имеют специфического иммунитета [9]. Одна из причин высокой изменчивости вируса связана с РНК-зависимой РНК-полимеразой. Этот фермент совершает одну ошибку на каждые 10000 нуклеотидов и в отличие от ДНК-зависимой ДНК-полимеразы не может исправлять их. Если единичная клетка, инфицированная ВГ, производит около 10000 новых вирусных частиц, то в теории по этому коэффициенту ошибок будет произведено 10000 новых вирусных мутантов. Последствием этого является антигенный дрейф ВГ, благодаря которому за 3-4 года поверхностные белки вируса изменяются настолько сильно, что специфический иммунитет к прежним вариантам не может защитить человека от инфицирования новыми мутантными штаммами [10]. В этом случае говорят об антигенном дрейфе ВГ. Наличие сегментированного генома является причиной другого типа антигенной изменчивости ВГ типа А - антигенного сдвига - появления вирусов с новым набором генов. Это становится возможным в результате обмена сегментами РНК между генетически различными ВГ при инфицировании ими одной клетки [11]. В настоящее время большинство исследователей разделяют точку зрения, что пандемические ВГ появляются в результате обмена генами между ВГ типа А человека и животных. Убедительное подтверждение эта гипотеза получила в 2009 г., когда молекулярно-генетический анализ показал, что новый пандемический штамм ВГ типа A(H1N1)pdm09 - это тройной реассортант, несущий гены ВГ птиц, человека и свиньи [12]. Однако остается неясным, почему из 16 подтипов НА и 9 подтипов NA, распространенных в ВГ птиц, ВГ человека содержат только три подтипа НА и два подтипа NA. Так, пандемия «испанки» 1918 г. была вызвана ВГ типа A(H1N1), пандемия «азиатского» гриппа 1957 г. - вирусом A(H2N2), пандемия «гонконгского» гриппа 1968 г. - вирусом A(H3N2). Причиной следующих двух пандемий - «русского» гриппа 1978 г. и «свиного» гриппа 2009 г. - вновь был вирус A(H1N1), хотя по молекулярно-биологическим и антигенным характеристикам эти вирусы и вирус «испанки» 1918 г. значительно отличаются друг от друга.A distinctive feature of GV is the high variability of the genome, which allows it to evade specific immunity and, as a result, cause annual epidemics, less often pandemics when a virus with a new genotype appears in the population, to which the majority of the population does not have specific immunity [9]. One of the reasons for the high variability of the virus is associated with RNA-dependent RNA polymerase. This enzyme makes one mistake for every 10,000 nucleotides and, unlike DNA-dependent DNA polymerase, cannot fix them. If a single cell infected with hepatitis B produces about 10,000 new viral particles, then, in theory, 10,000 new viral mutants will be produced by this error rate. The consequence of this is the antigenic drift of the hepatitis B virus, due to which the surface proteins of the virus change so strongly in 3-4 years that specific immunity to the previous variants cannot protect a person from infection with new mutant strains [10]. In this case, they speak of antigenic drift of the VG. The presence of a segmented genome is the cause of another type of antigenic variability of type A HB - antigenic shift - the appearance of viruses with a new set of genes. This becomes possible as a result of the exchange of RNA segments between genetically different hepatitis B viruses upon infection of a single cell by them [11]. Currently, most researchers share the view that pandemic HBs result from the exchange of genes between human and animal type A HBs. This hypothesis was convincingly confirmed in 2009, when molecular genetic analysis showed that the new pandemic strain of HBV type A (H1N1) pdm09 is a triple reassortant that carries the HBV genes of birds, humans, and pigs [12]. However, it remains unclear why, out of the 16 subtypes of HA and 9 subtypes of NA that are common in avian VH, human hepatitis V contain only three HA subtypes and two NA subtypes. So, the Spanish Spaniard pandemic of 1918 was caused by AH type H (H1N1), the Asian flu pandemic of 1957 by the A (H2N2) virus, the 1968 Hong Kong flu pandemic by the A (H3N2) virus. The cause of the following two pandemics - the “Russian” flu in 1978 and the “swine” flu in 2009 - was again virus A (H1N1), although the viruses and the Spanish flu virus of 1918 differ significantly in molecular biological and antigenic characteristics. from friend.

НА - основной поверхностный гликопротеин ВГ. Он инициирует инфекцию, связываясь с клеточным рецептором, вызывает слияние вирусной и эндосомальной мембран, необходимое для выхода РНП в цитоплазму зараженной клетки. Рецепторная специфичность НА - важный фактор в определении круга хозяев. Роль рецептора ВГ на клетках хозяина выполняют сиаловые кислоты. Сиаловая кислота - это N-ацетил-производное нейраминовой кислоты, или аминосахар, прикрепленный ко множеству различных белков на поверхности клетки. Сиаловая кислота всегда является последним остатком в цепочке Сахаров, который прикрепляется к белку; предпоследним является галактоза. ВГ человека преимущественно связываются с сиаловой кислотой, которая связана с галактозой связью а2-6 [13]. Эти рецепторы представлены в большом количестве на эпителиальных клетках в трахее человека.HA is the main surface GH glycoprotein. It initiates the infection by binding to the cellular receptor, causing the fusion of the viral and endosomal membranes, necessary for the release of RNP into the cytoplasm of the infected cell. The receptor specificity of HA is an important factor in determining the range of hosts. The role of the GH receptor on the host cells is performed by sialic acids. Sialic acid is an N-acetyl derivative of neuraminic acid, or amino sugar, attached to many different proteins on the surface of a cell. Sialic acid is always the last residue in the sugar chain that attaches to a protein; penultimate is galactose. Human HBV is predominantly associated with sialic acid, which is associated with galactose by an a2-6 bond [13]. These receptors are abundant on epithelial cells in the human trachea.

Напротив, ВГ птиц преимущественно распознают сиаловые кислоты, связанные с галактозой связью а2-3, которые распространены на эпителиальных клетках в кишечнике водоплавающей дичи (главном участке репликации ВГ птиц). По-видимому, недостаток рецепторов для ВГ птиц в верхних дыхательных путях человека может быть одним из факторов, предотвращающих продуктивную передачу ВГ птиц от человека к человеку.In contrast, avian HBs primarily recognize sialic acids associated with galactose A2-3 bonds, which are common on epithelial cells in the intestines of waterfowl (the main replication site for avian birds). Apparently, the lack of receptors for hepatitis B viruses in the human upper respiratory tract may be one of the factors preventing the productive transmission of hepatitis B viruses from person to person.

Протеолитическая активация НА - определяющий фактор патогенности ВГ А [14]. НА низкопатогенных вирусов имеют сайт расщепления, обычно являющийся агригином, но иногда - лизином [15]. Разрезание молекулы происходит при помощи трипсиноподобных протеаз, представленных лишь в эпителиальных тканях дыхательных путей и кишечного тракта. Высокопатогенные ВГ птиц имеют сайт расщепления, состоящий из 4 аминокислотных остатков, разрезание молекулы НА происходит при помощи фурина, представителя семейства серин-эндопротеаз [16]. Повсеместность этого фермента в клетках объясняет способность ВГ птиц реплицироваться в различных тканях.Proteolytic activation of HA is a determining factor in the pathogenicity of HBV A [14]. On low pathogenic viruses have a cleavage site, usually being agrigine, but sometimes lysine [15]. The molecule is cut using trypsin-like proteases, which are present only in the epithelial tissues of the respiratory tract and intestinal tract. Highly pathogenic hepatitis B viruses have a cleavage site consisting of 4 amino acid residues; the HA molecule is cut using furin, a member of the serine-endoprotease family [16]. The ubiquity of this enzyme in the cells explains the ability of the hepatitis B virus to replicate in various tissues.

Ежегодно в мире гриппом болеют от 3 до 5 млн человек. Эпидемии гриппа возникают с периодичностью 1-3 года, но эпидемические вспышки отмечаются ежегодно и наносят большой ущерб здоровью населения, приводят к огромным финансовым затратам на лечение и реабилитацию больных, особенно среди групп риска.From 3 to 5 million people get the flu every year in the world. Influenza epidemics occur with a frequency of 1-3 years, but epidemic outbreaks occur annually and cause great damage to the health of the population, leading to huge financial costs for the treatment and rehabilitation of patients, especially among high-risk groups.

Пандемия гриппа A(H1N1) в 1918-1920-х гг. («испанка»). Пандемия, названная «испанской болезнью», началась в конце Первой мировой войны - в 1918 г. Место ее появления точно установить пока не удалось, но, во всяком случае, первичным эпидемическим очагом была не Испания. Название «испанка» появилось случайно. Так как военная цензура обеих борющихся сторон не допускала сообщений о начавшейся в армии и среди населения эпидемии, то первые известия о ней появились в печати в мае -июне 1918 г. в нейтральной Испании.Influenza A (H1N1) pandemic in the 1918-1920s ("Spaniard"). The pandemic, called the “Spanish disease”, began at the end of the First World War - in 1918, it was not possible to determine exactly where it appeared, but, in any case, Spain was not the primary focus of the epidemic. The name "Spaniard" appeared by chance. Since military censorship of both struggling parties did not allow reports of an epidemic that had begun in the army and among the population, the first news of it appeared in print in May-June 1918 in neutral Spain.

Первая волна пандемии была относительно мягкой, в последующие две тяжесть возросла, и уровень смертности достиг 3% (во время обычных вспышек он бывает менее 0,1%). Основной причиной смерти была пневмония, часто осложненная бактериальной инфекцией [17].The first wave of the pandemic was relatively mild, the severity increased in the next two, and the mortality rate reached 3% (during normal outbreaks it is less than 0.1%). The main cause of death was pneumonia, often complicated by a bacterial infection [17].

Пандемия обошла земной шар трижды. Первая волна началась в конце апреля 1918 г. в Париже и почти сразу вспыхнула по всей Европе. В мае «испанка» появилась в северной Африке, а в июне - в Индии. Этим временно закончилось дальнейшее развитие эпидемии. Число случаев болезни, достигавшее довольно крупных цифр при очень малой смертности, стало убывать. В августе количество заболевших резко снизилось, что было принято за конец пандемии.A pandemic circled the globe three times. The first wave began in late April 1918 in Paris and broke out almost immediately across Europe. In May, the Spaniard appeared in northern Africa, and in June - in India. This temporarily ended the further development of the epidemic. The number of cases of the disease, which reached quite large numbers with very low mortality, began to decrease. In August, the number of cases fell sharply, which was taken as the end of the pandemic.

После нескольких месяцев затишья подошла вторая волна пандемии, во время которой заболеваемость была ниже, но смертность выше. Сначала болезнь появилась на западном побережье Африки в Сьерра-Леоне в конце августа 1918 г., откуда болезнь распространилась на все западное побережье Африки. В Северной Америке вторая волна началась в октябре 1918 г. в Бостоне, куда, как тогда считали, ее занесли возвратившиеся из Европы солдаты. К концу второй волны из населенных мест остались нетронутыми лишь Мадагаскар, Австралия и Новая Каледония, по-видимому, благодаря рациональным и строго проводимым мерам профилактики. Окончание второй волны относят на конец декабря 1918 г.After several months of calm, the second wave of the pandemic came, during which the incidence was lower, but the mortality rate was higher. First, the disease appeared on the west coast of Africa in Sierra Leone in late August 1918, from where the disease spread to the entire west coast of Africa. In North America, the second wave began in October 1918 in Boston, where, as it was believed then, it was brought by soldiers returning from Europe. By the end of the second wave of populated areas, only Madagascar, Australia and New Caledonia remained untouched, apparently due to rational and strictly implemented preventive measures. The end of the second wave is attributed to the end of December 1918.

Третья волна пандемии началась в феврале - марте 1919 г., захватив на этот раз и уцелевшие до тех пор островные территории. Эта вспышка также отличалась высокой смертностью. Окончилась она в разных местностях не одновременно, и в отдельных районах фиксировалась до июня и даже до августа 1919 г. Пандемия полностью прекратилась только в 1920 г. Невозможно было определить точное количество людей, перенесших грипп. По-видимому, болело не меньше 550 млн человек, а погибло, по разным подсчетам, от 20 до 50 млн - более 2,5% всей численности населения планеты того времени, составлявшей 1850 млн человек [17].The third wave of the pandemic began in February - March 1919, capturing this time the island territories that had survived until then. This outbreak was also characterized by high mortality. It did not end in different places at the same time, and in some areas it was recorded until June and even until August 1919. The pandemic completely stopped only in 1920. It was impossible to determine the exact number of people who had the flu. Apparently, no less than 550 million people were sick, and, according to various estimates, from 20 to 50 million people died - more than 2.5% of the total population of the planet at that time, which amounted to 1850 million people [17].

Пандемия «гонконгского гриппа» A(H3N2) (1968-1970 гг.). Эта пандемия развивалась тремя волнами (1968, 1969 и 1970 гг.) и была вызвана вирусом нового серотипа A(H3N2). Заболевание появилось в Сингапуре в начале августа 1968 г. и к сентябрю уже распространилось на другие сопредельные страны, в частности на Индию и северные территории Австралии, но в большинстве этих районов оно носило клинически легкую форму. Осенью 1968 г. новый вирус достиг Европы, но и там до начала зимы не было зарегистрировано ни одной большой вспышки. Наиболее опасной была вторая волна пандемии. Третья волна пандемии дала о себе знать в конце 1970 г. Затем эпидемические волны резко пошли на убыль. Что касается смертности, пандемия «гонконгского гриппа», как и предыдущая, была относительно мягкой [17].Hong Kong influenza pandemic A (H3N2) (1968-1970). This pandemic developed in three waves (1968, 1969 and 1970) and was caused by the new serotype A virus (H3N2). The disease appeared in Singapore in early August 1968 and by September had already spread to other neighboring countries, in particular to India and northern Australia, but in most of these areas it was clinically mild. In the fall of 1968, a new virus reached Europe, but even before the start of winter, not a single large outbreak was recorded there. The most dangerous was the second wave of the pandemic. The third wave of the pandemic made itself felt at the end of 1970. Then the epidemic waves plummeted. In terms of mortality, the Hong Kong flu pandemic, like the previous one, was relatively mild [17].

Пандемия Русского гриппа A(H1N1) (1977-1978 гг.). В мае 1977 г. вирус А(H1N1) вновь вызвал вспышку в районе российско-китайской границы, которая достигла Северной Америки в 1978 г. Вирус по антигенным и молекулярно-биологическим характеристикам был близок к изолятам 1950-х гг.[18, 19]. Эта пандемия была необычной. В начале 1978 г. вирусы серотипа (H3N2) вызвали эпидемии в Западной Европе, Африке и Азии, а на Американском континенте (США и Канада) обосновался вирус гриппа серотипа А(H1N1), но уже к марту во многих странах, в том числе и в СССР, изолировали одновременно штаммы вирусов гриппа А(H1N1), A(H3N2) и гриппа В.Pandemic of Russian influenza A (H1N1) (1977-1978). In May 1977, virus A (H1N1) again caused an outbreak in the region of the Russian-Chinese border, which reached North America in 1978. By its antigenic and molecular biological characteristics, the virus was close to isolates of the 1950s [18, 19] . This pandemic was unusual. In early 1978, serotype (H3N2) viruses caused epidemics in Western Europe, Africa and Asia, and the serotype A (H1N1) influenza virus settled on the American continent (USA and Canada), but by March in many countries, including in the USSR, strains of influenza A (H1N1), A (H3N2) and influenza B viruses were isolated simultaneously.

Подавляющее число заболевших в эпидемию 1977-1978 гг.приходилось на людей в возрасте до 20 лет, т.е. на ту часть населения, которая не имела контакта с вирусами гриппа серотипа (H1N1), исчезнувшими из циркуляции более 20 лет тому назад. Напротив, лица старше 30 лет составили только 20% больных, хотя их доля в общей численности населения превышала 50%, т.е., учитывая низкую заболеваемость в эту эпидемию вообще, люди зрелого и пожилого возраста, имевшие в прошлом контакт с вирусами гриппа H1N1, практически не болели.The vast majority of cases in the epidemic of 1977-1978 were in people under the age of 20 years, i.e. to that part of the population that did not have contact with serotype influenza viruses (H1N1) that disappeared from circulation more than 20 years ago. In contrast, people over 30 made up only 20% of patients, although their share in the total population exceeded 50%, i.e., given the low incidence in this epidemic in general, people of mature and old age who had previous contact with H1N1 flu viruses practically did not hurt.

Первая пандемия в XXI в. началась, как и прежде, неожиданно, хотя к ней готовились все последнее десятилетие. В двух образцах, независимо собранных в Южной Калифорнии в середине апреля, в Центре контроля заболеваемости (CDC), Атланта, США, идентифицировали вирус гриппа свиного происхождения, первоначально названный S-OIV (Swine-Origin Influenza Virus, который в последствии по предложению ВОЗ был назван A(H1N1)pdm09). Вирус распространился по планете с такой быстротой, что 11 июня 2009 г. ВОЗ подняла уровень готовности к пандемии гриппа до фазы 6, официально объявив первую пандемию гриппа в XXI в. [20]. К тому времени насчитывалось 30000 подтвержденных случаев заболевания в 74 странах. Менее чем через месяц ВОЗ подтвердила уже более 77000 случаев заболевания.The first pandemic in the XXI century. It began, as before, unexpectedly, although the whole decade has been preparing for it. Two samples, independently collected in Southern California in mid-April, at the Centers for Disease Control (CDC), Atlanta, USA, identified swine-derived influenza virus, originally called S-OIV (Swine-Origin Influenza Virus, which was subsequently proposed by WHO named A (H1N1) pdm09). The virus has spread around the planet with such speed that on June 11, 2009, WHO raised the level of preparedness for an influenza pandemic to phase 6, officially announcing the first influenza pandemic in the 21st century. [twenty]. By that time, there were 30,000 confirmed cases in 74 countries. In less than a month, WHO has confirmed more than 77,000 cases.

Антигенно пандемический вирус A(H1N1)pdm09 подобен классическому свиному вирусу и тройному реассортантному вирусу свиней A(H1N1), имеющему гены вирусов птиц и человека и циркулирующему в США более 10 лет. В то же время практически не было серологического перекреста пандемического вируса с вирусом сезонного гриппа A(H1N1). Характерной чертой пандемии 2009 г. было диспропорциональное поражение детей и молодых людей по сравнению со старшими возрастными группами [78; 79]. Вероятно, это возрастное распределение связано с наличием иммунитета к этому вирусу в популяции пожилых людей [82]. Так, показано, что в США 33% людей старше 60 лет имеют антитела, перекрестно реагирующие с A(H1N1)pdm09 в РТГА и реакции нейтрализации [21].The antigenic pandemic virus A (H1N1) pdm09 is similar to the classic swine virus and the triple reassorted swine virus A (H1N1), which has the genes of bird and human viruses and has been circulating in the United States for more than 10 years. At the same time, there was practically no serological intersection of the pandemic virus with seasonal influenza A (H1N1) virus. A characteristic feature of the 2009 pandemic was the disproportionate defeat of children and young people compared with older age groups [78; 79]. Probably, this age distribution is associated with the presence of immunity to this virus in the elderly population [82]. Thus, it was shown that in the USA, 33% of people over 60 have antibodies that cross-react with A (H1N1) pdm09 in RTGA and neutralization reactions [21].

Важнейшей мерой защиты от гриппозной инфекции и ограничения ее распространения является вакцинопрофилактика. Современные гриппозные вакцины индуцируют, как правило, образование антител к поверхностным антигенам вируса гриппа - гемагглютинину и нейраминидазе.The most important measure of protection against influenza infection and limiting its spread is vaccination. Modern influenza vaccines induce, as a rule, the formation of antibodies to the surface antigens of the influenza virus - hemagglutinin and neuraminidase.

Существующие гриппозные вакцины можно разделить на два вида: аттенуированные (живые) и инактивированные, включая субъединичные. Все они достаточно широко применяются при вакцинации населения и хорошо зарекомендовали себя. Аттенуированные вакцины представляют собой вирусы гриппа с ослабленной вирулентностью. При приготовлении инактивированных субъединичных вакцин также используются эпидемически актуальные штаммы вируса, хотя применение высокопатогенных штаммов ограничено высокими требованиями к биологической безопасности производства. Традиционные способы получения вакцинных штаммов вируса гриппа А имеют ряд недостатков.Existing influenza vaccines can be divided into two types: attenuated (live) and inactivated, including subunit ones. All of them are widely used in vaccination of the population and have proven themselves well. Attenuated vaccines are influenza viruses with reduced virulence. In the preparation of inactivated subunit vaccines, epidemiologically relevant strains of the virus are also used, although the use of highly pathogenic strains is limited by high biological safety requirements. Traditional methods for producing vaccine strains of influenza A virus have several disadvantages.

Использование как аттенуации, основанной на адаптации вирусов к организму гетерологичного хозяина, так и реассортации при коинфекции эпидемическими штаммами и донорами аттенуации не всегда позволяет сохранить баланс между уровнем вирулентности исходного вируса и его иммуногенностью. Чрезмерная аттенуация может привести к получению штаммов, утративших способность репродуцироваться в клетках дыхательных путей человека.The use of both attenuation based on the adaptation of viruses to the organism of a heterologous host and reassortment during coinfection with epidemic strains and attenuation donors does not always allow maintaining a balance between the level of virulence of the original virus and its immunogenicity. Excessive attenuation can lead to strains that have lost the ability to reproduce in human respiratory tract cells.

Альтернативным способом получения вакцинных штаммов является использование методов обратной генетики. Обратная генетика позволяет воссоздать биологически активную вирусную частицу путем коинфекции пермиссивных линий клеток плазмидами, содержащими гены, кодирующие вирусные белки. Внося изменения в эти гены, можно менять вирулентность и антигенные свойства вируса гриппа. С помощью методов обратной генетики можно получить реассортанты вирусов гриппа. Например, плазмидами, кодирующими сегменты генома пандемического или циркулирующего сезонного штамма и аттенуированного вакцинного штамма вируса гриппа А, трансфицируют пермиссивные эукариотические клетки. В результате происходит сборка полноценных вирионов вируса, несущих набор белков как вакцинного, так и патогенного штаммов. С помощью данного метода удалось получить и исследовать вирус гриппа A(H1N1), вызвавший в 1918 году пандемию («испанский грипп»).An alternative way to obtain vaccine strains is to use reverse genetics methods. Reverse genetics allows you to recreate a biologically active viral particle by co-infection of permissive cell lines with plasmids containing genes encoding viral proteins. By making changes to these genes, you can change the virulence and antigenic properties of the influenza virus. Using reverse genetics methods, reassortants of influenza viruses can be obtained. For example, permucid eukaryotic cells are transfected with plasmids encoding segments of the genome of a pandemic or circulating seasonal strain and an attenuated vaccine strain of influenza A virus. As a result, complete virus virions are assembled that carry a set of proteins of both the vaccine and pathogenic strains. Using this method, it was possible to obtain and study the influenza A virus (H1N1), which caused a pandemic in 1918 (the “Spanish flu”).

Методы обратной генетики позволяют снижать вирулентность вируса путем введения мутаций в различные вирусные гены. Например, мутации в двух генах, кодирующих полимеразные белки РВ1 и РВ2 вируса гриппа птиц A/guinea fowl/Hong Kong/WF 10199 (H9N2), привели к утрате патогенности вируса для кур. Делеция неструктурного белка NS1 обеспечила аттенуацию вируса гриппа А. Полученная таким способом вакцина успешно прошла первую фазу клинических испытаний. Внесения мутаций в белок М2, необходимый для формирования ионного канала, также приводят к аттенуации вируса. Изменение последовательности аминокислот в сайте нарезания НА высокопатогенного вируса гриппа А Н5 при помощи направленного мутагенеза привело к приобретению им характеристик низкопатогенных вирусов.Reverse genetics methods can reduce the virulence of a virus by introducing mutations into various viral genes. For example, mutations in two genes encoding the polymerase proteins PB1 and PB2 of the avian influenza virus A / guinea fowl / Hong Kong / WF 10199 (H9N2) led to the loss of the pathogenicity of the virus for chickens. The deletion of the non-structural protein NS1 ensured the attenuation of influenza A virus. The vaccine obtained in this way successfully passed the first phase of clinical trials. The introduction of mutations into the M2 protein, necessary for the formation of the ion channel, also leads to attenuation of the virus. A change in the amino acid sequence at the site of cutting the highly pathogenic H5 influenza A virus using targeted mutagenesis led to its acquisition of characteristics of low pathogenic viruses.

Методы обратной генетики хорошо зарекомендовали себя при получении аттенуированных штаммов вирусов гриппа. Однако использование реассортации в случае вакцинных штаммов поднимает вопрос биобезопасности в связи с возможностью мутаций, восстанавливающих или повышающих вирулентность вируса. Кроме того, широкое применение живых аттенуированных гриппозных вакцин вызывает опасение ввиду возможной реассортации живой вакцины с циркулирующими штаммами вирусов гриппа человека. В препаративных количествах вакцинные штаммы вируса гриппа чаще всего получают в куриных эмбрионах, что делает невозможным вакцинацию лиц с аллергией на куриный белок. Зависимость технологического процесса от продуктивности куриного стада также относится к недостаткам вакцин, получаемых с помощью куриных эмбрионов.Reverse genetics methods have proven themselves in obtaining attenuated strains of influenza viruses. However, the use of reassortment in the case of vaccine strains raises the issue of biosafety in connection with the possibility of mutations that restore or increase the virulence of the virus. In addition, the widespread use of live attenuated influenza vaccines is of concern because of the possible reassortment of live vaccines with circulating strains of human influenza viruses. In preparative quantities, vaccine strains of the influenza virus are most often obtained in chicken embryos, which makes it impossible to vaccinate persons allergic to chicken protein. The dependence of the technological process on the productivity of the chicken herd also refers to the disadvantages of vaccines obtained using chicken embryos.

Решить проблемы, связанные с применением куриных эмбрионов и необходимостью аттенуации патогенных штаммов вируса гриппа, можно с использованием рекомбинантных субъединичных вакцин. Одним из новых подходов к получению субъединичных вакцин против вирусов гриппа является применение различных систем экспрессии для быстрой продукции отдельных вирусных белков в препаративных количествах [22].Solving the problems associated with the use of chicken embryos and the need to attenuate pathogenic strains of the influenza virus can be done using recombinant subunit vaccines. One of the new approaches to obtaining subunit vaccines against influenza viruses is the use of various expression systems for the rapid production of individual viral proteins in preparative quantities [22].

В одной из популярных систем экспрессии гриппозные антигены продуцируют в клетках насекомых при помощи бакуловирусных векторов, несущих гены целевых антигенов. Наиболее широко используют вирус множественного ядерного полиэдроза калифорнийской совки (AcMNPV). Для работы с AcMNPV обычно используют линии клеток Sf9, полученные из яичника гусениц Spodoptera frugiperda. В этой системе можно продуцировать различные антигены вируса гриппа А. Иммунизация мышей рекомбинантным НА вируса гриппа H5N1, полученным в бакуловирусной системе экспрессии, приводила к индукции высокого уровня вируснейтрализующих антител. Однако для достижения значимых уровней антител требовалось либо применение адъюванта, либо прайм-буст-иммунизации с помощью инактивированного вируса гриппа H5N1 или рекомбинантного аденовируса, несущего ген НА вируса гриппа.In one popular expression system, influenza antigens are produced in insect cells using baculovirus vectors carrying the genes of the target antigens. The most widely used virus is multiple nuclear polyhedrosis of the California scoop (AcMNPV). To work with AcMNPV, Sf9 cell lines obtained from the ovary of Spodoptera frugiperda caterpillars are usually used. Various influenza A antigens can be produced in this system. Immunization of mice with recombinant H5N1 influenza virus HA obtained in a baculovirus expression system resulted in the induction of a high level of neutralizing antibodies. However, to achieve significant antibody levels, either an adjuvant or prime boost immunization with an inactivated H5N1 influenza virus or recombinant adenovirus carrying the influenza HA gene was required.

Недостатком рекомбинантных субъединичных вакцин, как и традиционных субъединичных вакцин, являются низкая иммуногенность и, как следствие, необходимость многократной вакцинации и применения адъювантов.The disadvantage of recombinant subunit vaccines, as well as traditional subunit vaccines, is their low immunogenicity and, as a consequence, the need for multiple vaccinations and the use of adjuvants.

Вирусоподобные частицы (ВПЧ) представляют собой антигенные детерминанты вирионов без фрагментов геномной РНК. Благодаря отсутствию генетического материала ВПЧ не способны инфицировать клетки человека и животных, что обеспечивает их безопасность. Поверхностные белки гриппозных ВПЧ могут представлять конформационные эпитопы клеткам иммунной системы как нативные вирионы. В ряде исследований показано, что в формировании гриппозных ВПЧ ключевую роль играет участие внутреннего белка вируса гриппа - M1. Этот белок связывается с липидным участком апикального домена плазматической мембраны, взаимодействует с поверхностными гликопротеинами вируса гриппа и инициирует сборку и почкование ВПЧ, содержащих липидную мембрану клетки-хозяина с инкорпорированными в нее тремя трансмембранными белками вируса гриппа.Virus-like particles (HPVs) are antigenic determinants of virions without fragments of genomic RNA. Due to the lack of genetic material, HPVs are not able to infect human and animal cells, which ensures their safety. The surface proteins of influenza HPV can present conformational epitopes to the cells of the immune system as native virions. A number of studies have shown that the participation of the internal protein of the influenza virus, M1, plays a key role in the formation of influenza HPV. This protein binds to the lipid portion of the apical domain of the plasma membrane, interacts with the surface glycoproteins of the influenza virus and initiates the assembly and budding of the HPV containing the lipid membrane of the host cell with the three transmembrane proteins of the influenza virus incorporated into it.

Гриппозные ВПЧ получены в различных системах экспрессии. Для эффективного освобождения из клеток млекопитающих гриппозных ВПЧ, содержащих НА, необходима либо одновременная экспрессия NA, либо добавление экзогенной NA. Это связано со способностью активной NA расщеплять сиаловые кислоты на поверхности клеточной мембраны. В клетках насекомых гриппозные ВПЧ, содержащие НА, можно получить даже в отсутствие экспрессии NA, так как в этих клетках сиаловые кислоты не связываются с N-гликанами в процессе посттрансляционной модификации.Influenza HPV obtained in various expression systems. For the efficient release of influenza HPV containing HA from mammalian cells, either simultaneous expression of NA or the addition of exogenous NA is necessary. This is due to the ability of active NA to break down sialic acids on the surface of the cell membrane. In insect cells, influenza HPV containing HA can be obtained even in the absence of NA expression, since in these cells sialic acids do not bind to N-glycans during post-translational modification.

Один из подходов к получению гриппозных ВПЧ в клетках насекомых предполагает использование рекомбинантных бакуловирусов. На животных моделях показано, что поверхностные гриппозные антигены в составе ВПЧ, полученные при помощи рекомбинантных бакуловирусов, индуцировали выработку как антигемагглютинирующих и вируснейтрализующих антител, так и эффекторов клеточного иммунного ответа. Кроме того, вакцина на основе гриппозных ВПЧ индуцировала протективный иммунитет против гомологичных и гетерологичных штаммов вируса гриппа А. Вакцина на основе ВПЧ, несущих антигены пандемичного вируса гриппа A H1N1 (2009), прошла вторую фазу клинических испытаний на 4563 здоровых взрослых добровольцах и показала безопасность и иммуногенность [23].One approach to producing influenza HPV in insect cells involves the use of recombinant baculoviruses. In animal models, it was shown that surface influenza antigens in the HPV composition obtained using recombinant baculoviruses induced the production of both anti-hemagglutinating and virus-neutralizing antibodies and effectors of the cellular immune response. In addition, the influenza HPV vaccine induced protective immunity against homologous and heterologous strains of influenza A virus. The HPV vaccine carrying the pandemic influenza A H1N1 antigens (2009) passed the second phase of clinical trials in 4,563 healthy adult volunteers and showed safety and immunogenicity [23].

Использование рекомбинантных бакуловирусов для экспрессии белков вируса гриппа в клетках насекомых приводит к накоплению в культуральной жидкости не только ВПЧ, но и бакуловирусов. Поскольку эти структуры близки между собой по размерам, возникают проблемы с очисткой ВПЧ от бакуловирусных частиц. Гриппозные ВПЧ могут быть получены в клетках млекопитающих с помощью других ДНК- и РНК-вирусных векторов. Например, разработана система продукции гриппозных ВПЧ в клетках Vero при помощи ДНК-векторов, несущих гены НА, NA, белков M1 и М2 вируса гриппа. Описано использование модифицированного вируса осповакцины Анкара для получения ВПЧ, содержащих белки вируса гриппа H5N1 (НА, NA, M1) в клетках млекопитающих. Такие ВПЧ способны формировать протективный иммунный ответ у мышей.The use of recombinant baculoviruses for the expression of influenza virus proteins in insect cells leads to the accumulation of not only HPV, but also baculoviruses in the culture fluid. Since these structures are close in size, there are problems with the purification of HPV from baculovirus particles. Influenza HPV can be obtained in mammalian cells using other DNA and RNA virus vectors. For example, a system was developed for the production of influenza HPV in Vero cells using DNA vectors carrying the HA, NA, M1 and M2 proteins of the influenza virus. The use of the modified Ankara vaccinia virus for the production of HPV containing H5N1 influenza virus proteins (HA, NA, M1) in mammalian cells is described. Such HPVs are able to form a protective immune response in mice.

Таким образом, получение ВПЧ представляет перспективное направление при разработке гриппозных вакцин нового типа.Thus, obtaining HPV is a promising area in the development of a new type of influenza vaccine.

Вирусные векторы представляют собой рекомбинантные вирусы, в геном которых встроен целевой ген с набором регуляторных элементов. Среди существующих систем доставки антигенов вирусные векторы занимают особое место, поскольку обладают следующими свойствами: имеют природный механизм взаимодействия с клеткой и проникновения в нее; переносят чужеродный генетический материал в ядро клетки; способны обеспечивать длительную экспрессию антигена; вирусная оболочка защищает генетический материал, кодирующий антиген.Viral vectors are recombinant viruses in the genome of which a target gene with a set of regulatory elements is embedded. Among the existing systems for the delivery of antigens, viral vectors occupy a special place because they have the following properties: they have a natural mechanism of interaction with the cell and penetration into it; transfer foreign genetic material to the cell nucleus; able to provide long-term antigen expression; the viral envelope protects the genetic material encoding the antigen.

Вакцины на основе вирусных векторов эффективно активируют цитотоксические Т- лимфоциты, что особенно важно при вакцинации против внутриклеточных патогенов. Такие вакцины могут реализовать широкий спектр действия за счет индукции Т-клеточного ответа на консервативные эпитопы, потенциально способные обеспечить защиту от различных штаммов патогенов (в том числе, вируса гриппа).Viral vector vaccines effectively activate cytotoxic T lymphocytes, which is especially important when vaccinating against intracellular pathogens. Such vaccines can realize a wide spectrum of action due to the induction of a T-cell response to conservative epitopes that are potentially able to provide protection against various strains of pathogens (including influenza virus).

Вирусные векторы обладают способностью активировать врожденный иммунитет путем связывания генетического материала или белков их оболочки с паттерн-распознающими рецепторами (TLR, RIG-1 и др.). Вирусные векторы распознаются такими TLR, как TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9.Viral vectors have the ability to activate innate immunity by binding genetic material or their envelope proteins to pattern recognition receptors (TLR, RIG-1, etc.). Viral vectors are recognized by TLRs such as TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9.

При взаимодействии этих рецепторов с лигандами активируются различные факторы транскрипции, что приводит к формированию очага воспаления и быстрой активации защитных реакций организма.During the interaction of these receptors with ligands, various transcription factors are activated, which leads to the formation of a focus of inflammation and the rapid activation of the body's defense reactions.

При выборе вирусного вектора для генетической иммунизации необходимо руководствоваться следующими критериями: такая вакцина не должна вызывать симптомов заболевания, она должна быть безопасной для людей с ослабленным иммунитетом, пожилых и детей; собственные белки рекомбинантного вируса не должны вызывать сильного иммунного ответа; вирусный вектор должен быть простым для генетических манипуляций и позволять включать большие фрагменты чужеродной ДНК; полученные препараты должны иметь высокий титр и обеспечивать высокий уровень экспрессии целевых антигенов; при иммунизации ДНК вирусного вектора не должна интегрировать в геном клетки-хозяина, и сам вектор должен полностью выводиться из организма после индукции иммунного ответа. Кроме того, нежелательно наличие предсуществующего иммунного ответа к белкам вирусного вектора у иммунизируемых индивидов, так как он может существенно снизить уровень иммунного ответа на целевой антиген.When choosing a viral vector for genetic immunization, the following criteria should be followed: such a vaccine should not cause symptoms of the disease, it should be safe for people with weakened immune systems, the elderly and children; own recombinant virus proteins should not cause a strong immune response; the viral vector should be simple for genetic manipulation and allow large fragments of foreign DNA to be included; the resulting preparations should have a high titer and provide a high level of expression of the target antigens; upon immunization, the DNA of the viral vector must not integrate into the genome of the host cell, and the vector itself must be completely excreted after the induction of the immune response. In addition, the presence of a pre-existing immune response to the proteins of the viral vector in immunized individuals is undesirable, since it can significantly reduce the level of the immune response to the target antigen.

Не все вирусы обладают свойствами, необходимыми для создания эффективных векторов. Для создания гриппозных вакцин на основе вирусных векторов в настоящее время наиболее широко используются поксвирусы, вирус болезни Ньюкасла и аденовирусы.Not all viruses possess the properties necessary to create effective vectors. To create influenza vaccines based on viral vectors, poxviruses, Newcastle disease virus and adenoviruses are currently the most widely used.

Поксвирусы (Poxviridae) - это ДНК-содержащие вирусы с большим геномом. Среди поксвирусов, используемых в качестве вирусного вектора, наиболее популярен вирус осповакцины, к преимуществам которого относятся простота и дешевизна получения, а также высокая пакующая емкость (до 25 т.п.н.). Для получения вакцин используют аттенуированные вирусы осповакцины, такие, как модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) и аттенуированный штамм NYVAC, полученный на основе штамма Копенгаген. Аттенуирование MVA было достигнуто путем многократного пассирования в фибробластах куриных эмбрионов, что привело к потере ряда генов, не существенных для репликации в клетках птиц, и снижению репродукции в клетках человека. Аттенуация штамма NYVAC была достигнута путем делеции 18 генов, в результате чего вирус стал репликативнодефектным для клеток человека.Poxviridae are DNA viruses with a large genome. Among the poxviruses used as a viral vector, the vaccinia virus is most popular, the advantages of which include the simplicity and low cost of production, as well as its high packing capacity (up to 25 kb). For vaccines, attenuated vaccinia viruses are used, such as the modified Ankara vaccinia virus (MVA) and the attenuated NYVAC strain derived from the Copenhagen strain. Attenuation of MVA was achieved by repeated passage in chicken embryo fibroblasts, which led to the loss of a number of genes that were not essential for replication in bird cells and to a decrease in reproduction in human cells. The attenuation of the NYVAC strain was achieved by deletion of 18 genes, as a result of which the virus became replicatively defective for human cells.

Серьезный недостаток векторов на основе вируса осповакцины - предсуществующий иммунитет к этому вирусу, который сформировался в человеческой популяции в результате иммунизации против оспы. Поэтому целесообразно использовать векторы на основе таких поксвирусов, как вирус оспы канарейки (Сапагурох) и вирус оспы домашней птицы (Flowpox), к которым в человеческой популяции отсутствуют предсуществующие антитела. Иммунизация кур и уток рекомбинантным Flowpox-BHpycoM, в геном которого введен ген НА вируса гриппа А птиц, защищала птиц от заражения летальными дозами гомологичных вирусов гриппа. Высокая пакующая емкость поксвирусов позволяет вводить в геном сразу несколько трансгенов, например, гены НА и NP вируса гриппа А. Однако Сапагурох и Flowpox индуцируют более слабый иммунный ответ на целевые антигены, чем вирус осповакцины, и требуют многократного введения или использования адъювантов.A serious drawback of vaccinia virus-based vectors is the preexisting immunity to this virus that has formed in the human population as a result of immunization against smallpox. Therefore, it is advisable to use vectors based on poxviruses such as canary pox virus (Sapaguroch) and poultry pox virus (Flowpox), to which there are no pre-existing antibodies in the human population. Immunization of chickens and ducks with the recombinant Flowpox-BHpycoM, in whose genome the avian influenza A virus gene is introduced, protected the birds from infection with lethal doses of homologous influenza viruses. The high packing capacity of poxviruses allows several transgenes to be introduced into the genome, for example, the HA and NP genes of influenza A. However, Sapaguroch and Flowpox induce a weaker immune response to target antigens than the vaccinia virus and require repeated administration or use of adjuvants.

Вирус болезни Ньюкасла (NDV) относится к семейству Paramyxoviridae. Это вирус с несегментированным одноцепочечным РНК-геном, который содержит шесть генов, кодирующих семь белков: NP, Р- и V-белки, М-белок, белок слияния, или F-белок, HA-NA и большой полимеразный белок L. Так как уровень экспрессии каждого вирусного белка снижается в направлении от 3' - до 5-конца генома, при использовании NDV в качестве вектора уровень экспрессии чужеродного гена можно контролировать по его положению в вирусном геноме. Уровень вирулентности и тропизм NDV зависят от сайта нарезания протеазами F-белка, необходимого для слияния вирусной оболочки и клеточной мембраны.Newcastle disease virus (NDV) belongs to the Paramyxoviridae family. This is a virus with a non-segmented single-stranded RNA gene that contains six genes encoding seven proteins: NP, P and V proteins, M protein, fusion protein, or F protein, HA-NA and large polymerase protein L. Since the expression level of each viral protein decreases in the direction from the 3 'to the 5th end of the genome; when using NDV as a vector, the expression level of a foreign gene can be controlled by its position in the viral genome. The level of virulence and tropism of NDV depend on the site of cutting the protease F-protein, necessary for the fusion of the viral membrane and cell membrane.

NDV в природе инфицирует только птиц, поэтому антитела к этому вирусу у человека отсутствуют. Следовательно, проблема предсуществующего иммунного ответа для этого вирусного вектора не стоит. Однако существенным недостатком вакцинного вектора NDV является то, что последствия введения рекомбинантных NDV недостаточно изучены, и не ясно, безопасны ли гриппозные вакцины на основе NDV для человека. Кроме того, NDV характеризуется низкой пакующей емкостью и сложностью получения векторов, несущих несколько целевых антигенов. Препаративные количества NDV получают в куриных эмбрионах, что, как отмечено выше, имеет ряд недостатков.NDV in nature only infects birds, therefore, there are no antibodies to this virus in humans. Therefore, the problem of a preexisting immune response for this viral vector is not worth it. However, a significant drawback of the NDV vaccine vector is that the effects of the introduction of recombinant NDV are not well understood, and it is not clear whether influenza vaccines based on NDV are safe for humans. In addition, NDV is characterized by low packing capacity and the difficulty of obtaining vectors carrying several target antigens. Preparative amounts of NDV are obtained in chicken embryos, which, as noted above, has several disadvantages.

Рекомбинантные аденовирусы (Adenoviridae) - наиболее хорошо изученные и наиболее часто используемые рекомбинантные вирусные векторы. Вирионы аденовирусов состоят из молекулы двухцепочечной ДНК, окруженной белковым капсидом. Многие типы аденовирусов подробно охарактеризованы, в том числе и на генетическом уровне. Нуклеотидная последовательность геномов большинства из них полностью расшифрована. Подробные данные о структуре, физико-химических и биологических свойствах аденовирусов позволяют использовать их для создания рекомбинантных вакцин и генно-терапевтических препаратов. Среди генетических вакцин, проходящих клинические испытания, на долю вакцин на основе рекомбинантных аденовирусов приходится около 24%.Recombinant adenoviruses (Adenoviridae) are the best-studied and most commonly used recombinant viral vectors. Adenovirus virions are composed of a double-stranded DNA molecule surrounded by a protein capsid. Many types of adenoviruses are characterized in detail, including at the genetic level. The nucleotide sequence of the genomes of most of them is completely deciphered. Detailed data on the structure, physicochemical and biological properties of adenoviruses make it possible to use them to create recombinant vaccines and gene therapeutic drugs. Of the genetic vaccines undergoing clinical trials, recombinant adenovirus vaccines account for about 24%.

Аденовирусы обладают такими важными для вакцинных векторов свойствами, как способность обеспечивать высокий уровень экспрессии целевого трансгена в клетке-мишени и трансдуцировать как делящиеся, так и постмитотические клетки. При этом ДНК аденовируса остается во внехромосомной форме. Аденовирусы способны накапливаться в культуре клеток в высоких титрах. Процесс получения нового рекомбинантного аденовируса занимает несколько недель, что может позволить реагировать на меняющуюся эпидемиологическую обстановку в максимально сжатые сроки.Adenoviruses possess such important properties for vaccine vectors as the ability to provide a high level of expression of the target transgene in the target cell and to transduce both dividing and postmitotic cells. In this case, the adenovirus DNA remains in an extrachromosomal form. Adenoviruses are able to accumulate in cell culture in high titers. The process of obtaining a new recombinant adenovirus takes several weeks, which may allow you to respond to changing epidemiological conditions in the shortest possible time.

В настоящее время в различных странах ведутся разработки вакцин на основе рекомбинантных аденовирусов против различных серотипов вируса гриппа А. Одна из таких вакцин успешно прошла первую стадию клинических испытаний в США, оказалась безопасной для человека и высокоиммуногенной по отношению к вирусу гриппа A H5N2.Currently, vaccines based on recombinant adenoviruses against various serotypes of influenza A virus are being developed in various countries. One of these vaccines has successfully passed the first stage of clinical trials in the USA, proved to be safe for humans and highly immunogenic with respect to influenza A H5N2 virus.

Проблема создания гриппозных вакцин, формирующих гетеросубтипический иммунитет, способный защитить от различных вариантов вируса гриппа, актуальна, и в последние годы появились новые подходы для ее разрешения. Выявлены консервативные для различных субтипов вируса гриппа А конформационные эпитопы НА, на которые могут вырабатываться антитела широкого спектра действия как после перенесенной инфекции, так и при иммунизации живыми вакцинами. Иммунизация рекомбинантными аденовирусными векторами имитирует заражение клеток слизистой оболочки верхних дыхательных путей, обеспечивая экспрессию антигенов с нативной третичной структурой, что позволяет индуцировать образование таких перекрестных антител. Рекомбинантные аденовирусные вакцины также способны формировать сильный Т-клеточный иммунный ответ, который характеризуется более широким, чем гуморальный, спектром действия.The problem of creating influenza vaccines that form a heterosubtypic immunity that can protect against various variants of the influenza virus is relevant, and in recent years new approaches have appeared to solve it. Conformational conformational epitopes of HA were found to be conservative for various subtypes of the influenza A virus, on which antibodies of a wide spectrum of action can be produced both after the infection and during immunization with live vaccines. Immunization with recombinant adenoviral vectors imitates infection of the cells of the mucous membrane of the upper respiratory tract, providing expression of antigens with a native tertiary structure, which allows the formation of such cross-antibodies. Recombinant adenovirus vaccines are also able to form a strong T-cell immune response, which is characterized by a wider than humoral spectrum of action.

Лентивирусы индуцируют широкое разнообразие патологий у различных видов животных. Общей чертой этих вирусов является способность поражать неделящиеся и дифференцированные клетки - чрезвычайно полезное свойство для целей генной терапии. Название лентивирусов (лат. lenti = медленный) связано с длительным промежутком времени между инфицированием и завершением болезни, который может длиться нескольких месяцев или даже лет. Вирусы, принадлежащие к роду Lentivirus, представлены у приматов, копытных и кошачьих.Lentiviruses induce a wide variety of pathologies in various animal species. A common feature of these viruses is the ability to infect non-dividing and differentiated cells - an extremely useful property for gene therapy. The name lentiviruses (lat. Lenti = slow) is associated with a long period of time between infection and completion of the disease, which can last several months or even years. Viruses belonging to the genus Lentivirus are found in primates, ungulates and cats.

В целом, мишенями лентивирусов являются разнообразные типы клеток, что предполагает потенциально широкое использование этих вирусов: от противораковых стратегий до вакцинации и противовирусного иммунитета. Поскольку лентивирусы воздействуют на неделящиеся клетки, они должны обладать механизмом преодоления интактной ядерной мембраны - для доступа к клеточному геному. Среди ретровирусов лентивирусы приобрели наиболее эффективный механизм для достижения этой цели, и это свойство используется в генной терапии [24].In general, various types of cells are targets of lentiviruses, which suggests the potential widespread use of these viruses: from anti-cancer strategies to vaccination and antiviral immunity. Since lentiviruses act on non-dividing cells, they must have a mechanism for overcoming the intact nuclear membrane to access the cellular genome. Among retroviruses, lentiviruses have acquired the most effective mechanism for achieving this goal, and this property is used in gene therapy [24].

Жизненный цикл вируса разделяют на две основные фазы: первая -перенос вирусного генома в клетку хозяина, а вторая - его экспрессия и размножение вируса. Главный интерес для целей генной терапии представляет первая фаза вместе с ранними этапами вирусного жизненного цикла. Такой процесс определяют терминами генная трансдукция (в генной терапии) или однораундовая инфекция (в вирусологии). В случае ретровирусов инфекция начинается после связывания специфического клеточного рецептора с белками вирусной оболочки, а завершается интеграцией синтезированной ДНК в геном клетки хозяина. Связывание клеточного рецептора и вирусного Env-белка запускает слияние мембраны клетки и оболочки вирусной частицы, в результате в цитоплазму клетки-мишени попадает вирусный нуклеопротеиновый комплекс (вирусный геном в комплексе с вирусными и клеточными белками). Проблемой инфицирования неделящихся клеток является преодоление ядерной мембраны для доступа вирусного генома к ДНК хозяина. Этот этап, ключевой для целей генной терапии, назван ядерным импортом. При вирусной инфекции ядерная мембрана является дополнительным препятствием, которое вирусы преодолевают либо путем перемещения во время деления клетки, либо путем преодоления ядерных пор. Последний вариант является единственным в случае неделящихся клеток, впрочем, механизм до сих пор не ясен [24].The life cycle of the virus is divided into two main phases: the first is the transfer of the viral genome into the host cell, and the second is its expression and reproduction of the virus. Of primary interest for gene therapy purposes is the first phase, together with the early stages of the viral life cycle. Such a process is defined in terms of gene transduction (in gene therapy) or single-round infection (in virology). In the case of retroviruses, infection begins after the binding of a specific cell receptor to viral envelope proteins, and ends with the integration of the synthesized DNA into the genome of the host cell. The binding of the cell receptor and the viral Env protein triggers the fusion of the cell membrane and the shell of the virus particle, as a result, the viral nucleoprotein complex (the viral genome in combination with viral and cellular proteins) enters the cytoplasm of the target cell. The problem of infection of non-dividing cells is to cross the nuclear membrane for access of the viral genome to the host DNA. This phase, key for the purpose of gene therapy, is called nuclear imports. In viral infections, the nuclear membrane is an additional obstacle that viruses overcome either by moving during cell division or by overcoming nuclear pores. The latter option is the only one in the case of non-dividing cells, however, the mechanism is still not clear [24].

Несмотря на то, что большинство ретровирусов способны инфицировать неделящиеся клетки, именно лентивирусы наиболее эффективны для осуществления ядерного импорта [24].Despite the fact that most retroviruses are able to infect non-dividing cells, it is lentiviruses that are most effective for nuclear import [24].

В основе развития лентивирусных векторов лежит тенденция к оптимизации эффективности генного переноса и, в то же время, уменьшению потенциальной опасности, обусловленной использованием ретровирусных векторов. В ходе оптимизации были разработаны третье и четвертое поколения векторов, характеризующихся минимальным риском образования способных к репликации рекомбинантов. А введение SIN-мутаций не только уменьшает вероятность образования таких рекомбинантов, но и снижает неспецифическую активность энхансеров вирусного промотора [24].The development of lentiviral vectors is based on the tendency to optimize the efficiency of gene transfer and, at the same time, to reduce the potential danger associated with the use of retroviral vectors. During optimization, the third and fourth generations of vectors were developed, which are characterized by a minimal risk of formation of replicable recombinants. And the introduction of SIN mutations not only reduces the likelihood of the formation of such recombinants, but also reduces the non-specific activity of enhancers of the viral promoter [24].

Дальнейшие усилия оптимизации конструкции лентивирусных векторов направлены на улучшение интеграции целевого гена в геном клетки-мишени. Ретровирусы имеют необычную способность размещать гетерологичные оболочечные белки на своей оболочке, которая называется псевдотипированием, в результате чего вирусные частицы могут приобретать новый клеточный тропизм и внутриклеточное поведение. Псевдотипирование характерно для всех ретровирусов, но наибольший интерес представляет псевдотипирование лентивирусов, способных к трансдукции неделящихся и дифференцированных клеток [25]. Лентивирусные псевдотипированные векторы нарабатываются на культуре клеток млекопитающих путем ко-трансфекции упаковочными и собственно векторной плазмидами.Further efforts to optimize the design of lentiviral vectors are aimed at improving the integration of the target gene into the genome of the target cell. Retroviruses have an unusual ability to place heterologous envelope proteins on their envelope, called pseudotyping, as a result of which viral particles can acquire new cell tropism and intracellular behavior. Pseudotyping is characteristic of all retroviruses, but pseudotyping of lentiviruses capable of transducing non-dividing and differentiated cells is of the greatest interest [25]. Lentiviral pseudotyped vectors are produced on a mammalian cell culture by co-transfection with packaging and vector plasmids proper.

Другое свойство псевдотипированных лентивирусных векторов - это способность воздействовать на внутриклеточное поведение вируса. Для достижения эффективного воздействия на клетки в отсутствие главных сигналов активации был разработан ряд стратегий, основанных на искусственно сконструированных оболочках, отличных от VSVg. Общей чертой этих стратегий являются использование особых молекул, расположенных на поверхности вирусной частицы и запускающих сигнал активации при связывании с клеточным рецептором. Сигнал временно активирует клетку и позволяет инфицировать ее. Эта стратегия была успешно применена для трансдукции покоящихся В- и Т-клеток с помощью оболочечных белков вируса кори и лентивирусов с цитокинами на поверхности [26, 27].Another property of pseudotyped lentiviral vectors is the ability to influence the intracellular behavior of the virus. To achieve effective effects on cells in the absence of major activation signals, a number of strategies have been developed based on artificially constructed membranes other than VSVg. A common feature of these strategies is the use of special molecules located on the surface of a viral particle and triggering an activation signal upon binding to a cellular receptor. The signal temporarily activates the cell and allows it to be infected. This strategy has been successfully applied for transduction of resting B and T cells using enveloped measles virus proteins and lentiviruses with cytokines on the surface [26, 27].

Описан пример успешного использования лентивирусных векторов для ретроградного транспорта VEGF на модельных мышах с боковым амиотрофическим склерозом (ALS, болезнь Шарко) [28]. Болезнь Шарко - это заболевание, характеризующееся прогрессирующей дегенерацией мотонейронов в головном и спинном мозге. При лечении этого заболевания одним из важнейших затруднений является доставка терапевтического агента к мотонейронам, для чего была разработана лентивирусная система доставки гена непосредственно к нейтронам за счет тропизма оболочечных белков вируса бешенства. В рассматриваемом исследовании был создан вектор на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), псевдотипированный белком G вируса бешенства. Модельным мышам с нейродегенерацией проводили инъекции препарата лентивирусного вектора, обеспечивающего экспрессию VEGF, в различные мышечные ткани до начала и при прогрессирующей дегенерации нейронов. По результатам испытаний экспрессия репортерного гена была зафиксирована в спинном и головном мозге, и заметное продление развития заболевания установлено для обеих экспериментальных групп. Таким образом, было показано, что лентивирусные векторы на основе EIAV, псевдотипированные оболочечными гликопротеинами G вируса бешенства, представляют собой эффективную систему доставки генов к мотонейронам при внутримышечной инъекции. Исследование также показало терапевтическое действие VEGF на модельных мышах: даже на стадии гибели половины мотонейронов, соответствующей обычной постановке диагноза, применение вирусного вектора для переноса VEGF обеспечивало не только продление жизни экспериментальных животных, но частичное восстановление функции. А микроскопические и гистологические исследования не выявили каких-либо патологий спинного и головного мозга после инъекции препарата, в том числе, аномальной васкуляризации тканей. В дополнение, иммунный ответ на систему доставки наблюдался незначительный даже через пять недель после инъекции.An example of the successful use of lentiviral vectors for retrograde VEGF transport in model mice with amyotrophic lateral sclerosis (ALS, Charcot's disease) is described [28]. Charcot's disease is a disease characterized by progressive degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord. In the treatment of this disease, one of the most important difficulties is the delivery of the therapeutic agent to motor neurons, for which a lentiviral system for delivering the gene directly to neutrons due to the tropism of rabies virus envelope proteins has been developed. In the study in question, a vector based on equine infectious anemia virus (EIAV) was created, pseudotyped by rabies virus G protein. Model mice with neurodegeneration were injected with a lentiviral vector preparation that provides VEGF expression in various muscle tissues before and during the progressive degeneration of neurons. According to the test results, the expression of the reporter gene was recorded in the spinal cord and brain, and a noticeable extension of the development of the disease was established for both experimental groups. Thus, it was shown that lentiviral vectors based on EIAV, pseudotyped by envelope glycoproteins G of rabies virus, are an effective system for gene delivery to motoneurons during intramuscular injection. The study also showed the therapeutic effect of VEGF on model mice: even at the stage of death of half of the motor neurons, corresponding to the usual diagnosis, the use of the viral vector for VEGF transfer provided not only an extension of the life of experimental animals, but a partial restoration of function. Microscopic and histological studies did not reveal any pathologies of the spinal cord and brain after the injection of the drug, including abnormal tissue vascularization. In addition, the immune response to the delivery system was negligible even five weeks after the injection.

Таким образом, открытия и исследования в области вирусологии позволяют расширять применение технологии лентивирусных псевдотипированных векторов для получения широкого разнообразия клеток-продуцентов терапевтических препаратов и, в частности, для целей генной терапии.Thus, discoveries and research in the field of virology make it possible to expand the use of technology of lentiviral pseudotyped vectors to obtain a wide variety of producer cells of therapeutic drugs and, in particular, for the purposes of gene therapy.

В последнее время использование неинфекционных вирусоподобных частиц (ВПЧ), которые спонтанно самособираются благодаря взаимодействию вирусных структурных белков, создало хорошую перспективу для усовершенствования вакцин против широкого спектра вирусов, вызывающих заболевания у человека [29]. ВПЧ гриппа, экспрессируемая рекомбинантными бакуловирусами, которые представляют многокомпонентные антигены, включающими гемагглютинин и матриксный белок M1, совместно или без нейраминидазы, способны индуцировать иммунную реакцию против гомологичных или гетерологичных штаммов вируса гриппа, что подробно описано [30, 31, 32, 33, 34, 35, 36]. Кроме того, метод обратной генетики, лицензированный в Европе для создания вакцин против сезонного гриппа, использует систему культивирования на основе клеток млекопитающих, а не в РКЭ [37]. Использование культур клеток млекопитающих, таких как Vero или MDCK, адаптивных хозяев для вакцинных вирусов, имеет ряд преимуществ, не только в связи с увеличением гибкости и согласованности процесса производства, но и в связи с возможностью гликозилирования вирусных антигенов в естественной форме, чего не может быть достигнуто в РКЭ или бакуловирусных системах. В эукариотических клетках гликозилирование белков участвует в правильной сборке и ориентации вновь транслируемых белков, что играет важную роль в функции белка. Генерация ВПЧ гриппа в клетках млекопитающих ранее была получена в результате транзиентной ко-экспрессии гемагглютинина и нейраминидазы в клетках 293Т человека [38]. С целью улучшения производственных характеристик в состав ВПЧ гриппа были включены не только белки гемагглютинина и нейраминидазы, но и белки матрикса M1 и М2 поскольку они играют важную роль в сборке вирусных частиц и их почковании [39, 40, 41, 42, 43, 44]. Включение белков M1 и М2 в ВПЧ гриппа, производимых в клетках млекопитающих, не только увеличивает выход продукции ВПЧ, но и дополняет антигенный портрет ВПЧ антигенами, с консервативными Т- и В-клеточными эпитопами, что позволяет индуцировать иммунитет не только против гомологичных, но и гетерологичных вирусов [45, 46].Recently, the use of non-infectious virus-like particles (HPV), which spontaneously self-assemble due to the interaction of viral structural proteins, has created a good prospect for the improvement of vaccines against a wide range of viruses that cause diseases in humans [29]. Influenza HPV expressed by recombinant baculoviruses, which are multicomponent antigens including hemagglutinin and matrix protein M1, with or without neuraminidase, can induce an immune response against homologous or heterologous strains of the influenza virus, which is described in detail [30, 31, 32, 33, 34, 35, 36]. In addition, the reverse genetics method licensed in Europe for the development of seasonal influenza vaccines uses a mammalian cell culture system rather than RCE [37]. The use of mammalian cell cultures, such as Vero or MDCK, adaptive hosts for vaccine viruses, has several advantages, not only due to the increased flexibility and consistency of the production process, but also due to the possibility of glycosylation of viral antigens in their natural form, which cannot be achieved in RCE or baculovirus systems. In eukaryotic cells, protein glycosylation is involved in the proper assembly and orientation of newly translated proteins, which plays an important role in protein function. The generation of HPV influenza in mammalian cells was previously obtained as a result of transient co-expression of hemagglutinin and neuraminidase in human 293T cells [38]. In order to improve production characteristics, not only hemagglutinin and neuraminidase proteins, but also matrix proteins M1 and M2 were included in the composition of the HPV flu, since they play an important role in the assembly of viral particles and their budding [39, 40, 41, 42, 43, 44] . The inclusion of M1 and M2 proteins in influenza HPV produced in mammalian cells not only increases the output of HPV production, but also complements the antigenic portrait of HPV antigens with conserved T and B cell epitopes, which allows inducing immunity not only against homologous, but also heterologous viruses [45, 46].

Из RU 2483751 известна ВПЧ вируса гриппа, включающая белки M1, НА и NA вируса гриппа. Однако указанная ВПЧ содержит белок M1 гриппа, полученный из штамма A/Indonesia/5/05 вируса гриппа, а НА и NA происходят из различных штаммов вируса гриппа, относящегося к типу H5N1.Influenza virus HPV is known from RU 2483751, including influenza virus M1, HA and NA proteins. However, said HPV contains influenza M1 protein derived from strain A / Indonesia / 5/05 of the influenza virus, and HA and NA come from different strains of the H5N1 type influenza virus.

Из публикаций US 20130295135 или US 20160008456 известна ВПЧ вируса гриппа, включающая белки M1, НА и NA вируса гриппа. Однако указанная ВПЧ содержит белок M1 гриппа, полученный из штамма A/Indonesia/5/05 вируса гриппа, а НА и NA происходят из штаммов вируса гриппа: A/New Calcdonia/20/99 (H1N1), A/panama/2007/99 (H3N2), A/Wellington/01/04 (H2N3) and B/Sichuan/379/99 and H5N1. Любая из указанных публикаций может быть принята за ближайший аналог.From the publications US 20130295135 or US 20160008456 known HPV influenza virus, including proteins M1, HA and NA of the influenza virus. However, this HPV contains influenza M1 protein obtained from strain A / Indonesia / 5/05 of the influenza virus, and HA and NA come from strains of the influenza virus: A / New Calcdonia / 20/99 (H1N1), A / panama / 2007/99 (H3N2), A / Wellington / 01/04 (H2N3) and B / Sichuan / 379/99 and H5N1. Any of these publications can be taken as the closest analogue.

Изобретение относится к способу получения вирусоподобных частиц частиц (ВПЧ) белков вируса гриппа, включающий наработку и очистку ВПЧ, отличающийся тем, что ВПЧ нарабатывают путем раздельного культивирования трех клеточных культур MDCK: культуры трансдуцированной генами белков гемагглютинина, нейраминидазы и матриксного белка M1 вируса гриппа (H1N1), культуры трансдуцированной генами белков гемагглютинина вируса гриппа (H3N2), нейраминидазы и матриксного белка M1 вируса гриппа (H1N1) и культуры трансдуцированной генами белков гемагглютинина вируса гриппа В, нейраминидазы и матриксного белка M1 вируса гриппа (H1N1), где указанные гены встроены в клеточную культуру MDCK через лентивирусную плазмиду pLenti6.3/TO/HA-M1-NA, а очистка включает осветление клеточного пула, обработку бензоназой, элюирование ВПЧ ступенчатым градиентом, эксклюзионную хроматографию, аффинную хроматографию, концентрирование путем ионообменной хроматографии и дополнительную очистку ВПЧ в два этапа гель-проникающей хроматографией и псевдо-аффинной хроматографией после очистки.The invention relates to a method for producing virus-like particles of particles (HPV) of influenza virus proteins, including the production and purification of HPV, characterized in that HPV is produced by separate cultivation of three cell cultures of MDCK: a culture of gene-transformed hemagglutinin, neuraminidase and matrix protein M1 of the influenza virus (H1N1 ), cultures of influenza virus (H3N2) hemagglutinin proteins transduced by genes, neuraminidase and influenza virus matrix matrix protein M1 (H1N1), and cultures of viral hemagglutinin proteins transduced by genes influenza B whisker, neuraminidase and M1 matrix protein of the influenza virus (H1N1), where these genes are inserted into the MDCK cell culture via the lentiviral plasmid pLenti6.3 / TO / HA-M1-NA, and purification includes clarification of the cell pool, treatment with benzonase, HPV elution step gradient, size exclusion chromatography, affinity chromatography, concentration by ion exchange chromatography and additional purification of HPV in two stages by gel permeation chromatography and pseudo-affinity chromatography after purification.

Предпочтительно изобретение относится к способу получения ВПЧ вируса гриппа, где инкубацию культуры MDCK клеток-продуцентов ВПЧ вируса гриппа проводят с посевной концентрацией 3×10³ клеток/мл в биореакторах при температуре 37°С в течение 2-3 суток в ростовой питательной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, до появления монослоя, затем полученные клетки-продуценты промывают фосфатным буферным раствором, вносят поддерживающую питательную среду OptiMEM с добавлением 5 мкг/мл трипсина ТРСК, наработку ВПЧ проводят при температуре (37±1)°С в течение 72 ч в режиме непрерывного перемешивания при скорости вращения 10-11 об/мин, по достижения активности РГА 1:64 и выше.Preferably, the invention relates to a method for producing HPV of influenza virus, where incubation of the MDCK culture of cells producing HPV of influenza virus is carried out with a seed concentration of 3 × 10 ³ cells / ml in bioreactors at a temperature of 37 ° C for 2-3 days in DMEM growth medium, containing 10% fetal calf serum until a monolayer appears, then the resulting producer cells are washed with phosphate buffered saline, OptiMEM supplementation medium is added with the addition of 5 μg / ml trypsin TRPC, the HPV time is done at a temperature re (37 ± 1) ° С for 72 hours in the continuous mixing mode at a rotation speed of 10-11 rpm, after reaching an activity of RGA of 1:64 and higher.

Также предпочтительно изобретение относится к способу получения ВПЧ вируса гриппа, где процедуру наработки ВПЧ гриппа повторяют многократно до тех пор, пока урожай ВПЧ в супернатанте по результатам РГА не становится менее 1:64.Also preferably, the invention relates to a method for producing HPV of influenza virus, where the procedure for producing HPV of influenza is repeated many times until the yield of HPV in the supernatant by the results of the RGA does not become less than 1:64.

Изобретение также относится к ВПЧ вируса гриппа, полученная способом по пп. 1-3, предназначенная для создания антигриппозной вакцины, построенная из белков вируса гриппа: гемагглютинина, нейраминидазы и матриксного белка M1, где белки нейраминидазы и матриксного белка M1 являются белками штамма A/Califonia/04/2009, а гемагглютинина штамма A/Califonia/04/2009, A/Michigan/45/2015(H1N1), A/Novosibirsk/01/2014, A/HongKong/4801/2014(H3N2), B/Phuket/3073/2013 или B/Brisbane/60/2008.The invention also relates to the HPV of influenza virus obtained by the method according to claims. 1-3, designed to create an influenza vaccine, constructed from proteins of the influenza virus: hemagglutinin, neuraminidase and matrix protein M1, where the proteins of neuraminidase and matrix protein M1 are proteins of strain A / Califonia / 04/2009, and hemagglutinin of strain A / Califonia / 04 / 2009, A / Michigan / 45/2015 (H1N1), A / Novosibirsk / 01/2014, A / HongKong / 4801/2014 (H3N2), B / Phuket / 3073/2013 or B / Brisbane / 60/2008.

Предпочтительно изобретение относится к ВПЧ вируса гриппа, где ДНК гена НА представляет собой SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.Preferably, the invention relates to HPV of the influenza virus, where the DNA of the HA gene is SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.

Техническим результатом является расширение арсенала средств для создания антигриппозных вакцин. Кроме того, техническим результатом является, то что ВПЧ вируса гриппа имеет большую гемагглютинирующию активность. Также способ получения ВПЧ позволяет повысить выход антигена.The technical result is the expansion of the arsenal of tools for creating anti-influenza vaccines. In addition, the technical result is that the HPV of the influenza virus has a large hemagglutinating activity. Also, the method of producing HPV can increase the yield of antigen.

Для разработки клеток-продуцентов был выбран вектор с тетрациклин регулируемой экспрессией целевых генов. Технология тетрациклин регулируемой экспрессии целевого гена в клетках млекопитающих основана на связывании тетрациклина с Tet репрессором, что приводит к дерепрессии промотора CMV/TO, контролирующего экспрессию целевого гена. Гибридный промотор CMV/TO содержит CMV промотор и два тетрациклиновых оператора. Если в клетке идет экспрессия тетрациклинового репрессора, то последний блокирует тетрациклиновый оператор. После введения тетрациклина блокируется сам тетрациклиновый репрессор, и тетрациклиновый оператор деблокируется, обеспечивая экспрессию целевого гена.For the development of producer cells, a vector with tetracycline-regulated expression of the target genes was selected. The technology of tetracycline-regulated expression of the target gene in mammalian cells is based on the binding of tetracycline to the Tet repressor, which leads to the repression of the CMV / TO promoter that controls the expression of the target gene. The CMV / TO hybrid promoter contains a CMV promoter and two tetracycline operators. If a tetracycline repressor is expressed in the cell, the latter blocks the tetracycline operator. After the introduction of tetracycline, the tetracycline repressor itself is blocked, and the tetracycline operator is released, providing expression of the target gene.

Однако при исследовании свойств клеток-продуцентов ВПЧ гриппа неожиданно оказалось, что они сохраняли жизнеспособность и высокую продуктивность целевых белков без использования регулируемой экспрессии. Поэтому в разработанных нами клетках- продуцентах белков вируса гриппа тетрациклиновый репрессор не вводился и тетрациклиновый оператор, хотя и присутствует в конструкции вектора, но деблокирован и не участвует в регуляции экспрессии. Наличие подобного элемента в конструкции вектора позволит при необходимости модифицировать клетку-продуцент и обеспечить тетрациклин регулируемую экспрессию целевых генов, если возникнет такая необходимость.However, when studying the properties of HPV influenza producing cells, it unexpectedly turned out that they retained the viability and high productivity of the target proteins without the use of controlled expression. Therefore, the tetracycline repressor was not introduced and the tetracycline operator in the cells of the influenza virus protein developed by us, although it is present in the vector construct, it is released and is not involved in the regulation of expression. The presence of such an element in the construction of the vector will allow, if necessary, to modify the producer cell and provide tetracycline regulated expression of the target genes, if necessary.

Пример 1. Метод получения лентивирусных векторовExample 1. The method of obtaining lentiviral vectors

1.1. Вирусы, бактериальные штаммы1.1. Viruses, bacterial strains

В работе использовали бактериальные штаммы Escherichia coli XL2-Blue {recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac[F' proAB lacqZΔM15 Tn10(Tet') Amy Cam']c,d} и Stb13 {F mcrB mrrhsdS20(rB'-, mB') recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (StrR)xyl-5 Kleumtl-1}; вирус гриппа штаммов А и В из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор".The bacterial strains of Escherichia coli XL2-Blue {recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [F 'proAB lacqZΔM15 Tn10 (Tet') Amy Cam '] c, d} and Stb13 {F mcrB mrrhsdS20 (rB'- mB ') recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (StrR) xyl-5 Kleumtl-1}; Influenza virus of strains A and B from the collection of FBSI SSC VB "Vector".

1. 2. Выделение вирусной РНК1. 2. Isolation of viral RNA

Вирусную РНК выделяли с помощью набора QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QLAGEN, США) в соответствии с рекомендациями производителя. К 200 мкл вируссодержащей жидкости добавляли 25 мкл Протеазы и 200 мкл раствора AL, перемешивали и помещали в термостат при 56°С на 15 минут. Затем добавляли 250 мкл этанола (96%) и перемешивали. Раствор наносили на сорбирующий слой колонки и центрифугировали при 6000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф". Элюат удаляли и сорбирующий слой колонки промывали 500 мкл раствора AW1 центрифугированием при 6000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф". Элюат удаляли и сорбирующий слой колонки промывали 500 мкл раствора AW2 центрифугированием при 6000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф". Элюат удаляли и сорбирующий слой колонки промывали 500 мкл этанола (96%) центрифугированием при 6000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф" с последующим дополнительным центрифугированием при 13000 g в течение 3 минут. РНК-материал элюировали с колонки 100 мкл раствора АЕ центрифугированием при 13000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф".Viral RNA was isolated using the QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QLAGEN, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations. To 200 μl of virus-containing liquid, 25 μl of Protease and 200 μl of AL solution were added, mixed and placed in a thermostat at 56 ° C for 15 minutes. Then, 250 μl of ethanol (96%) was added and mixed. The solution was applied to the sorbent layer of the column and centrifuged at 6000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge. The eluate was removed and the sorbent layer of the column was washed with 500 μl of AW1 solution by centrifugation at 6000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge. The eluate was removed and the sorbent layer of the column was washed with 500 μl of AW2 solution by centrifugation at 6000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge. The eluate was removed and the sorbent layer of the column was washed with 500 μl of ethanol (96%) by centrifugation at 6000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge, followed by further centrifugation at 13000 g for 3 minutes. RNA material was eluted from the column with 100 μl of AE solution by centrifugation at 13000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge.

1.3. ПЦР и ОТ-ПЦР1.3. PCR and RT-PCR

Для проведения ПЦР реакционная смесь, объемом 50 мкл, содержала буфер для проведения ПЦР (СибЭнзим, Россия) (60 мМ Tris-HCl рН 8.5, 25 мМ КС1, 1.5 мМ MgCb, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, 0.1% Тритон Х-100), 0.2 мМ каждого dNTP, олигонуклеотидные праймеры в количестве 20 пмоль каждого, 5 ед.а. Taq-полимеразы, 1 мкл раствора ДНК. Реакцию проводили в программируемом термостате GeneAmp PCR-system 6700 с использованием следующей программы:For PCR, the reaction mixture, with a volume of 50 μl, contained a buffer for PCR (SibEnzyme, Russia) (60 mM Tris-HCl pH 8.5, 25 mM KCl, 1.5 mM MgCb, UMM 2-mercaptoethanol, 0.1% Triton X-100), 0.2 mm each dNTP, oligonucleotide primers in an amount of 20 pmol each, 5 u Taq polymerase, 1 μl of DNA solution. The reaction was carried out in a programmable thermostat GeneAmp PCR-system 6700 using the following program:

ОТ-ПЦР проводили с помощью набора Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Реакционная смесь, объемом 50 мкл, содержала 1×QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer, 0.4 мМ каждого dNTP, олигонуклеотидные праймеры в количестве 30 пмоль каждого, 2.0 мкл QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix, 5 мкл вирусной РНК. Реакцию проводили в программируемом термостате GeneAmp PCR-system 6700 с использованием следующей программы:RT-PCR was performed using the Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations. The reaction mixture, with a volume of 50 μl, contained 1 × QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer, 0.4 mm each dNTP, oligonucleotide primers in an amount of 30 pmol each, 2.0 μl QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix, 5 μl viral RNA. The reaction was carried out in a programmable thermostat GeneAmp PCR-system 6700 using the following program:

1. 4. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле1. 4. Electrophoretic analysis of nucleic acids in an agarose gel

Электрофоретический анализ фрагментов ДНК проводили в горизонтальных пластинах при напряжении 6-10 V/см в течение 1 часа, используя 1.0-2.0% агарозный гель в буфере ТАЕ. Гель окрашивали бромистым этидием (0.2 мкг/мл) и фотографировали при помощи системы визуализации изображений Image Station 440CF (Kodak, США).Electrophoretic analysis of DNA fragments was carried out in horizontal plates at a voltage of 6-10 V / cm for 1 hour using 1.0-2.0% agarose gel in TAE buffer. The gel was stained with ethidium bromide (0.2 μg / ml) and photographed using an Image Station 440CF imaging system (Kodak, United States).

1.5. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля1.5. Elution of DNA fragments from agarose gel

Элюцию фрагментов ДНК из агарозного геля проводили при помощи набора Gel Extraction Kit (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. К вырезанной полосе агарозного геля, содержащей нужный фрагмент ДНК, добавляли трехкратный объем раствора QG для расплавления агарозы, перемешивали и помещали в термостат при 50°С на 10 минут до полного растворения геля. Затем добавляли один объем изопропанола и перемешивали. Раствор наносили на сорбирующий слой колонки и центрифугировали при 13000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф". Элюат удаляли и сорбирующий слой колонки промывали 750 мкл раствора РЕ центрифугированием при 13000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф". ДНК-материал элюировали с колонки 10-50 мкл раствора ТЕ центрифугированием при 13000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф".Elution of DNA fragments from agarose gel was performed using the Gel Extraction Kit (Qiagen, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations. A triple volume of QG solution was added to the excised agarose gel strip containing the desired DNA fragment to melt the agarose, mixed and placed in a thermostat at 50 ° C for 10 minutes until the gel was completely dissolved. Then, one volume of isopropanol was added and mixed. The solution was applied to the sorbent layer of the column and centrifuged at 13000 g for 1 minute in an Eppendorf type centrifuge. The eluate was removed and the sorbent layer of the column was washed with 750 μl of PE solution by centrifugation at 13000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge. DNA material was eluted from the column with 10-50 μl of TE solution by centrifugation at 13000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge.

1.6. Лигирование1.6. Ligation

Реакционная смесь, объемом 20 мкл, содержала 0.1 мкг векторной плазмидной ДНК и 0.5 мкг фрагмента ДНК, гидролизованных соответствующими рестриктазами (вектор и фрагмент, после рестрикции были очищены с помощью Gel Extraction Kit (раздел 1.6.)), 50 ед.а. ДНК-лигазы фага Т4 (СибЭнзим, Россия), 2 мкл лигазного буфера 10-кратной концентрации (СибЭнзим, Россия). Реакционную смесь инкубировали в течение 6 часов при 16°С.The reaction mixture, with a volume of 20 μl, contained 0.1 μg of vector plasmid DNA and 0.5 μg of a DNA fragment hydrolyzed with the corresponding restriction enzymes (the vector and fragment, after restriction, were purified using the Gel Extraction Kit (section 1.6.)), 50 units aa. T4 phage DNA ligases (SibEnzyme, Russia), 2 μl of 10-fold concentration ligase buffer (SibEnzyme, Russia). The reaction mixture was incubated for 6 hours at 16 ° C.

1.7. LR рекомбинация1.7. LR recombination

Реакционная смесь, объемом 10 мкл, содержала 0.15 мкг векторной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST и 0.15 мкг векторной плазмидной ДНК pEntry, содержащей целевой фрагмент ДНК, 2 мкл Gateway LR Clonase II Plus Enzyme Mix. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 часов при 25°С. Далее к реакционной смеси добавляли 1 мкл Протеиназы К с последующей инкубацией в течение 10 минут при 37°С.The reaction mixture, with a volume of 10 μl, contained 0.15 μg of pLenti6.3 / TO / V5-DEST vector plasmid DNA and 0.15 μg of pEntry vector plasmid DNA containing the target DNA fragment, 2 μl of Gateway LR Clonase II Plus Enzyme Mix. The reaction mixture was incubated for 2 hours at 25 ° C. Next, 1 μl of Proteinase K was added to the reaction mixture, followed by incubation for 10 minutes at 37 ° C.

1. 8. Приготовление компетентных клеток E. coli1. 8. Preparation of competent E. coli cells

Индивидуальную колонию, выращенную на чашке Петри на агаризованной среде, засевали в ночь в 5 мл JLB-бульона. Затем 500 мкл полученной ночной культуры добавляли в 50 мл свежего LB-бульона и инкубировали при 37°С до оптической плотности Ds65=0.8-0.85 при интенсивной аэрации. Полученную суспензию клеток охлаждали во льду в течение 30 минут, затем осаждали центрифугированием при 3000 об/мин при 4°С в течение 10 минут в роторе JA-20 в центрифуге J2-21 (Beckman, США). Супернатант тщательно удаляли, осадок ресуспендировали в 15 мл буфера RF-1 и инкубировали во льду в течение 15 минут. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин при 4°С в течение 10 минут в роторе JA-20 в центрифуге J2-21, после чего супернатант тщательно удаляли. Клетки ресуспендировали в 3 мл буфера RF-2 и инкубировали во льду 10 минут. Затем клетки расфасовывали в 1.5 мл пробирки по 200 мкл и хранили в кельвинаторе при минус 70°С.An individual colony grown on a petri dish on an agar medium was seeded overnight in 5 ml of JLB broth. Then, 500 μl of the obtained overnight culture was added to 50 ml of fresh LB broth and incubated at 37 ° C to an optical density of Ds65 = 0.8–0.85 with vigorous aeration. The resulting cell suspension was cooled in ice for 30 minutes, then precipitated by centrifugation at 3000 rpm at 4 ° C for 10 minutes in a JA-20 rotor in a J2-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was carefully removed, the pellet was resuspended in 15 ml of RF-1 buffer and incubated in ice for 15 minutes. Cells were besieged by centrifugation at 3000 rpm at 4 ° C for 10 minutes in a JA-20 rotor in a J2-21 centrifuge, after which the supernatant was carefully removed. Cells were resuspended in 3 ml of RF-2 buffer and incubated in ice for 10 minutes. Then the cells were packaged in 1.5 ml tubes of 200 μl and stored in a kelvinator at minus 70 ° C.

1.9. Трансформация компетентных клеток E. coli1.9. Transformation of competent E. coli cells

Компетентные клетки объемом 200 мкл размораживали во льду, добавляли 20 мкл лигазной смеси или 10 мкл продукта LR рекомбинации, или 5 мкл раствора, содержащего плазмидную ДНК в концентрации 0.1 мкг/мл, аккуратно перемешивали и инкубировали 30 минут во льду. Далее клетки подвергали тепловому шоку. Для этого микропробирки помещали в микротермостат с температурой 42°С на 2 минуты, затем охлаждали до 0°С на льду в течение 5 минут. Затем клетки рассевали на чашках Петри с соответствующим антибиотиком.Competent cells with a volume of 200 μl were thawed in ice, 20 μl of a ligase mixture or 10 μl of LR recombination product, or 5 μl of a solution containing plasmid DNA at a concentration of 0.1 μg / ml were added, gently mixed and incubated for 30 minutes in ice. Next, the cells were subjected to heat shock. For this, microtubes were placed in a microthermostat with a temperature of 42 ° C for 2 minutes, then cooled to 0 ° C on ice for 5 minutes. Then the cells were scattered on Petri dishes with the appropriate antibiotic.

1.10. Выделение плазмидной ДНК в аналитическом варианте1.10. The selection of plasmid DNA in the analytical version

Плазмидную ДНК очищали с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. 3 мл ночной культуры осаждали центрифугированием при 6800 g в течение 3 минут. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 250 мкл раствора Р1. Затем к лизату добавляли 250 мкл раствора Р2, аккуратно перемешивали и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. После этого к суспензии добавляли 350 мкл раствора N3, аккуратно перемешивали и осаждали при 13000 g в течение 10 минут. Супернатант наносили на сорбирующий слой колонки и центрифугировали при 13000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф". Элюат удаляли и сорбирующий слой колонки промывали 500 мкл раствора РВ центрифугированием при 13000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф". Элюат удаляли и сорбирующий слой колонки промывали 750 мкл раствора РЕ центрифугированием при 13000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф". ДНК-материал элюировали с колонки 50 мкл раствора ЕВ центрифугированием при 13000 g в течение 1 минуты в центрифуге типа "Эппендорф".Plasmid DNA was purified using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations. 3 ml of overnight culture was besieged by centrifugation at 6800 g for 3 minutes. The supernatant was removed, the pellet was resuspended in 250 μl of solution P1. Then, 250 μl of a solution of P2 was added to the lysate, gently mixed and incubated for 5 minutes at room temperature. After that, 350 μl of N3 solution was added to the suspension, gently mixed and precipitated at 13000 g for 10 minutes. The supernatant was applied to the sorbent layer of the column and centrifuged at 13000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge. The eluate was removed and the sorbent layer of the column was washed with 500 μl of PB solution by centrifugation at 13000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge. The eluate was removed and the sorbent layer of the column was washed with 750 μl of PE solution by centrifugation at 13000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge. DNA material was eluted from the column with 50 μl of EB solution by centrifugation at 13000 g for 1 minute in an Eppendorf centrifuge.

1.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции1.11. DNA hydrolysis by restriction endonucleases

Реакционная смесь содержала 0.1-5.0 мкг ДНК в объеме из расчета не менее 10 мкл на 1 мкг ДНК, эндонуклеазу рестрикции из расчета 1-5 е.а. на 1 мкг ДНК, 1/10 от общего объема реакционной смеси соответствующего буфера 10-кратной концентрации (СибЭнзим, Россия). Гидролиз проводили при 37°С в течение 2-4 часов.The reaction mixture contained 0.1-5.0 μg of DNA in a volume of at least 10 μl per 1 μg of DNA, restriction endonuclease at a rate of 1-5 e.a. per 1 μg of DNA, 1/10 of the total reaction mixture of the corresponding buffer at a 10-fold concentration (SibEnzyme, Russia). Hydrolysis was carried out at 37 ° C for 2-4 hours.

1.12. Секвенирование ДНК1.12. DNA sequencing

Реакцию секвенирования проводили с использованием набора BigDye 3.1 (Applied Biosystems, США) в соответствии с указаниями фирмы производителя. Каждая реакционная смесь объемом 5 мкл содержала следующие компоненты: 2 мкл раствора из набора для проведения секвенирующей реакции, 5 пкмоль олигонуклеотидного праймера и 0.5 мкг ДНК. Реакцию проводили в программируемом термостате GeneAmp PCR-system 6700 с использованием следующей программы:The sequencing reaction was carried out using the BigDye 3.1 kit (Applied Biosystems, USA) in accordance with the manufacturer's instructions. Each 5 μl reaction mixture contained the following components: 2 μl of the solution from the sequencing reaction kit, 5 pmol of the oligonucleotide primer, and 0.5 μg of DNA. The reaction was carried out in a programmable thermostat GeneAmp PCR-system 6700 using the following program:

После амплификации реакционную смесь очищали от не включившихся флуоресцентно меченных нуклеотидов очисткой на сефадексе G-50 superfine. Секвенирование проводили по обеим цепям ДНК. Расшифровку первичных данных секвенирования (хроматограмм) проводили с помощью программы Sequencher 4.0.5. (Gene Codes, США).After amplification, the reaction mixture was purified from unincorporated fluorescently labeled nucleotides by purification on Sephadex G-50 superfine. Sequencing was performed on both DNA strands. The decoding of the primary sequencing data (chromatograms) was performed using the Sequencher 4.0.5 program. (Gene Codes, USA).

1.13. Очистка плазмидной ДНК от эндотоксинов1.13. Purification of plasmid DNA from endotoxins

Плазмидную ДНК очищали с помощью набора EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. 100 мл ночной культуры осаждали центрифугированием при 6000 g при 4°С в течение 15 минут. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 10 мл раствора Р1. Затем к лизату добавляли 10 мл раствора Р2, аккуратно перемешивали и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. После этого к суспензии добавляли 10 мл раствора РЗ для выделения плазмидной ДНК, аккуратно перемешивали, переносили лизат в "QIAfilter Cartidge" и инкубировали 10 минут при комнатной температуре с последующим фильтрованием лизата. К осветленному лизату добавляли 2.5 мл раствора ER для удаления эндотоксинов, перемешивали и инкубировали во льду в течение 30 минут. Далее лизат переносили на предварительно уравновешенную 10 мл раствора QBT колонку "QLAGEN-tip 500". После освобождения колонки самотеком, ее промывали 60 мл раствора QC. Очищенную ДНК элюировали с колонки 15 мл раствора QN в чистую пробирку, добавляли 10.5 мл изопропанола, перемешивали и осаждали при 15000 g при 4°С в течение 30 минут. Осадок промывали 70% этанолом и осаждали при 15000 g при 4°С в течение 10 минут. Далее осадок высушивали при комнатной температуре и растворяли в подходящем объеме раствора ТЕ. Концентрация плазмидной ДНК была измерена спектрофотометрически на приборе Ultrospec 3000 pro (GE Healthcare Life Sciences, США).Plasmid DNA was purified using the EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations. 100 ml of overnight culture was besieged by centrifugation at 6000 g at 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was removed, the pellet was resuspended in 10 ml of P1 solution. Then, 10 ml of a solution of P2 was added to the lysate, gently mixed and incubated for 5 minutes at room temperature. After that, 10 ml of a solution of PZ was added to the suspension to isolate plasmid DNA, gently mixed, the lysate was transferred to a QIAfilter Cartidge and incubated for 10 minutes at room temperature, followed by filtration of the lysate. 2.5 ml of ER solution was added to the clarified lysate to remove endotoxins, mixed and incubated in ice for 30 minutes. The lysate was then transferred onto a pre-equilibrated 10 ml QLT QLAGEN-tip 500 column. After releasing the column by gravity, it was washed with 60 ml of QC solution. The purified DNA was eluted from the column with 15 ml of QN solution into a clean tube, 10.5 ml of isopropanol was added, mixed and precipitated at 15000 g at 4 ° C for 30 minutes. The precipitate was washed with 70% ethanol and precipitated at 15000 g at 4 ° C for 10 minutes. The precipitate was then dried at room temperature and dissolved in a suitable volume of TE solution. Plasmid DNA concentration was measured spectrophotometrically with an Ultrospec 3000 pro instrument (GE Healthcare Life Sciences, USA).

Пример 2. Протоколы получения векторовExample 2. Protocols for obtaining vectors

2.1. Дизайн и синтез кассеты генов НА, Ml и NA2.1. Design and synthesis of HA, Ml, and NA gene cassettes

Дизайн кассеты генов для последующего получения соответствующего лентивирусного вектора. Схематично кассета генов состоит из следующих элементов:Design of the gene cassette for subsequent production of the corresponding lentiviral vector. Schematically, the gene cassette consists of the following elements:

attL1 и attL2 - необходимые сайты в векторной плазмиде pEntry для переноса генетического материала в векторную плазмиду pLenti6.3/TO/V5-DEST по сайтам attR1 и attR2 с помощью LR рекомбинации;attL1 and attL2 are the necessary sites in the vector plasmid pEntry for transfer of genetic material to the vector plasmid pLenti6.3 / TO / V5-DEST at the attR1 and attR2 sites using LR recombination;

IRES - участок внутренней посадки рибосомы;IRES - site of the internal landing of the ribosome;

WPRE - Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element, регуляторный элемент для увеличения экспорта мРНК из ядра и усиления трансгенной экспрессии;WPRE - Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element, a regulatory element for increasing the export of mRNA from the nucleus and enhancing transgenic expression;

CMV/TO - гибридный промотор, состоящий из цитомегаловирусного промотора и двух тандемных тетрациклиновых операторов, для регулируемой высокоэффективной экспрессии целевых генов;CMV / TO - a hybrid promoter consisting of a cytomegalovirus promoter and two tandem tetracycline operators, for regulated highly efficient expression of target genes;

SalI/PstI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции для замены НА в кассете генов при необходимости;SalI / PstI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases to replace HA in the gene cassette, if necessary;

EcoRI/MluI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции для замены NA в кассете генов при необходимости;EcoRI / MluI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases to replace the NA in the gene cassette, if necessary;

XmaI/XmaI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции для удаления NA из кассеты генов при необходимости;XmaI / XmaI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases to remove NA from the gene cassette, if necessary;

AgeI/XmaI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции для удаления M1 и NA из кассеты генов при необходимости;AgeI / XmaI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases to remove M1 and NA from the gene cassette, if necessary;

НА - гемагглютинин вируса гриппа с последовательностью Козак и стоп-кодонами;HA - hemagglutinin of influenza virus with Kozak sequence and stop codons;

M1 - матриксный белок вируса гриппа с последовательностью Козак и стоп-кодонами;M1 - matrix protein of influenza virus with a Kozak sequence and stop codons;

NA - нейраминидаза вируса гриппа с последовательностью Козак и стоп-кодонами.NA - neuraminidase of influenza virus with a Kozak sequence and stop codons.

Таким образом, в разработанных конструкциях векторов после рекомбинации кассеты генов вируса гриппа в состав pLenti6.3/TO/V5-DEST, гены гемагглютинина и матриксного белка вируса гриппа экспрессируются с гибридного промотора CMV/TO, находящегося в составе векторной плазмиды, а ген нейраминидазы вируса гриппа экспрессируется с гибридного промотора CMV/TO, находящегося в составе кассеты генов. При этом мРНК с генами НА и M1 кэпирована регуляторным элементом WPRE, находящимся в составе кассеты генов, а мРНК с геном NA кэпирована регуляторным элементом WPRE, находящимся в составе векторной плазмиды. Трансляция матриксного белка осуществляется с участка внутренней посадки рибосомы. Тетрациклин зависимая регуляция экспрессии целевых генов отсутствует.Thus, in the developed constructions of vectors after recombination of the cassette of influenza virus genes into pLenti6.3 / TO / V5-DEST, the genes for hemagglutinin and matrix protein of the influenza virus are expressed from the hybrid promoter CMV / TO, which is part of the vector plasmid, and the virus neuraminidase gene influenza is expressed from the hybrid promoter CMV / TO, which is part of the gene cassette. In this case, mRNA with the HA and M1 genes is capped by the WPRE regulatory element, which is part of the gene cassette, and the mRNA with the NA gene is capped by the WPRE regulatory element, which is part of the vector plasmid. The translation of the matrix protein is carried out from the site of internal landing of the ribosome. Tetracycline-dependent regulation of the expression of target genes is absent.

Известно, что оптимизация кодонового состава генов может увеличить скорость синтеза белка на соответствующей мРНК и, как следствие, увеличить уровень синтеза целевого белка в клетках млекопитающих. Поэтому, гены НА, M1 и NA, входящие в состав кассеты генов, были рассчитаны с модификацией кодонового состава, оптимизированной для экспрессии в клетках млекопитающих.It is known that optimization of the codon composition of genes can increase the rate of protein synthesis on the corresponding mRNA and, as a result, increase the level of synthesis of the target protein in mammalian cells. Therefore, the HA, M1, and NA genes that make up the gene cassette were calculated with a modification of the codon composition optimized for expression in mammalian cells.

Кассета генов была синтезирована в составе плазмиды pEntry, подходящей для LR рекомбинации с плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST.The gene cassette was synthesized as part of the pEntry plasmid, suitable for LR recombination with plasmid DNA pLenti6.3 / TO / V5-DEST.

2.2. Получение и анализ рекомбинантных плазмид pEntry, содержащих индивидуальные гены НА (H1N1), M1 и NA2.2. Obtaining and analysis of recombinant pEntry plasmids containing the individual genes HA (H1N1), M1 and NA

Для создания рекомбинантных молекул ДНК, содержащих гены НА, M1 и NA вируса гриппа, на первом этапе работы был произведен расчет олигонуклеотидных праймеров. Дизайн праймеров производился посредством программы «Oligo» (версия 6.31) фирмы «Molecular Biology Insights», США. На настоящий момент установлено, что последовательность около инициаторного кодона влияет на уровень трансляции эукариотической мРНК. Остаток аденина в - 3 положении имеет доминантный эффект для достижения высокого уровня трансляции, поэтому в нуклеотидную последовательность рассчитанных праймеров была вставлена последовательность Козак, оптимизированная для экспрессии генов в эукариотических клетках.To create recombinant DNA molecules containing the HA, M1, and NA genes of the influenza virus, the oligonucleotide primers were calculated at the first stage of work. The design of the primers was carried out using the program "Oligo" (version 6.31) of the company "Molecular Biology Insights", USA. It has now been established that the sequence near the initiator codon affects the level of translation of eukaryotic mRNA. The adenine residue at position 3 has a dominant effect to achieve a high level of translation; therefore, the Kozak sequence optimized for gene expression in eukaryotic cells was inserted into the nucleotide sequence of the calculated primers.

Также в структуру олигонуклеотидных праймеров были дополнительно введены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, позволяющие встраивать фрагменты ДНК в векторные плазмиды по «липким» концам при использовании эндонуклеаз рестрикции SalI и EcoRI. Выбор данных ферментов обусловлен отсутствием сайтов узнавания в нуклеотидной последовательности клонируемых генов (анализ нуклеотидной последовательности генов на наличие сайтов гидролиза эндонуклеаз рестрикции проводили с использованием компьютерной программы Vector NTI (версия 9.0.0) фирмы «InforMax», США).Also, restriction endonuclease recognition sites were introduced into the oligonucleotide primer structure, allowing embedding of DNA fragments into vector plasmids at the “sticky” ends using SalI and EcoRI restriction endonucleases. The choice of these enzymes is due to the lack of recognition sites in the nucleotide sequence of cloned genes (analysis of the nucleotide sequence of genes for the presence of restriction endonuclease hydrolysis sites was carried out using the Vector NTI computer program (version 9.0.0) from InforMax, USA).

Первичные последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованных в работе, приведены в таблице 1.The primary sequences of the oligonucleotide primers used in the work are shown in table 1.

GTCGAC - сайт эндонуклеазы рестрикции SalIGTCGAC - SalI restriction endonuclease site

GAATTC - сайт эндонуклеазы рестрикции EcoRI CTGCAG - сайт эндонуклеазы рестрикцииGAATTC - restriction endonuclease site EcoRI CTGCAG - restriction endonuclease site

PstI АТССАТ - сайт эндонуклеазы рестрикции Zsp2IPstI ATCCAT - Zsp2I restriction endonuclease site

Индивидуальные гены НА, M1 и NA были получены в результате проведения ПЦР или ОТ-ПЦР (фиг. 1 - Результат электрофоретического разделения в 1,5% геле агарозы амплифицированных фрагментов генов НА и M1:The individual HA, M1, and NA genes were obtained as a result of PCR or RT-PCR (Fig. 1 - The result of electrophoretic separation in 1.5% agarose gel of amplified fragments of the HA and M1 genes:

1. ПЦР-продукт для полноразмерного матриксного белка (777 п.н.);1. PCR product for a full-sized matrix protein (777 bp);

2. ПЦР-продукт для полноразмерного матриксного белка (1719 п.н.);2. PCR product for a full-sized matrix protein (1719 bp);

М.ДНК маркер, длины в п.н. показаны на левой стороне).M.DNA marker, length in bp shown on the left side).

Для получения НА использовалась пара праймеров HA_SalI_upper и HA_EcoRI_lower и плазмида, содержащая кДНК НА вируса гриппа (A/California/04/2009 (H1N1), в качестве матрицы; для M1 использовалась пара праймеров Ml_SalI_upper и Ml_EcoRI_lower и вирусная РНК (H1N1) в качестве матрицы; для NA использовалась пара праймеров NA_SalI_upper и NA_EcoRI_lower и кассета генов в качестве матрицы.To obtain HA, we used a pair of HA_SalI_upper and HA_EcoRI_lower primers and a plasmid containing influenza virus cDNA (A / California / 04/2009 (H1N1) as a template; for M1, we used a pair of primers Ml_SalI_upper and Ml_EcoRI_lower and viral RNA in H1 ( ; for NA, a pair of NA_SalI_upper and NA_EcoRI_lower primers and a gene cassette were used as template.

Далее полученные фрагменты вирусного генома встраивали в плазмиду pDrive (Qiagen, США) с использованием фирменного набора, согласно протоколу фирмы производителя. Отбор клонов осуществляли рестрикционным анализом с помощью эндонуклеаз рестрикции SalI и EcoRI (фиг. 2 - Результат электрофоретического разделения в 1,5% геле агарозы амплифицированных фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантной плазмиды pDrive_M1 SalI и EcoRI:Next, the obtained viral genome fragments were inserted into the pDrive plasmid (Qiagen, USA) using a proprietary kit according to the protocol of the manufacturer. Clones were selected by restriction analysis using restriction endonucleases SalI and EcoRI (Fig. 2 - the result of electrophoretic separation in 1.5% agarose gel of amplified DNA fragments obtained after hydrolysis of the recombinant plasmid pDrive_M1 SalI and EcoRI:

1,12. ПЦР - продукт M1 (777 п.н.);1.12. PCR - product M1 (777 bp);

2-11. Независимые клоны плазмиды pDrive_M1 (3830 п.н. + 771 п.н.);2-11. Independent clones of the plasmid pDrive_M1 (3830 bp + 771 bp);

13. Базовая плазмида pDrive (3830 п.н. + 20 п.н.);13. The base plasmid pDrive (3830 bp + 20 bp);

М.ДНК маркер, длины в п.н. показаны на левой стороне)M.DNA marker, length in bp shown on the left side)

и фиг. 3 - Результат электрофоретического разделения в 1,5% геле агарозы амплифицированных фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантной плазмиды pDrive_HA SalI и EcoRI:and FIG. 3 - The result of electrophoretic separation in 1.5% agarose gel of amplified DNA fragments obtained after hydrolysis of the recombinant plasmid pDrive_HA SalI and EcoRI:

1-6. Независимые клоны плазмиды pDrive НА (3830 п.н. + 1713 п.н.);1-6. Independent clones of the plasmid pDrive HA (3830 bp + 1713 bp);

Правильность нуклеотидных последовательностей всех рекомбинантных плазмид были подтверждены секвенированием. Определение нуклеотидной последовательности проводили на автоматическом секвенаторе 310 Genetic analyzer (Applied Biosystems, США). Для дальнейшей работы использовали клоны рекомбинантных плазмидных ДНК pDrive с подтвержденной нуклеотидной последовательностью встроенных генов НА, M1 и NA.The correct nucleotide sequences of all recombinant plasmids were confirmed by sequencing. The determination of the nucleotide sequence was carried out on an automatic sequencer 310 Genetic analyzer (Applied Biosystems, USA). For further work, we used clones of recombinant plasmid DNA pDrive with a confirmed nucleotide sequence of the inserted HA, M1, and NA genes.

Далее выделенные из рекомбинантных плазмид фрагменты НА, M1 и NA по сайтам SalI и EcoRI клонировали в плазмиду pEntry предварительно гидролизованную данными рестриктазами (фиг. 4 - Результат электрофоретического разделения в 1,5% геле агарозы независимых клонов рекомбинантной плазмиды pEntry, несущей ген NA:Further, HA, M1, and NA fragments isolated from recombinant plasmids at SalI and EcoRI sites were cloned into the pEntry plasmid previously hydrolyzed by these restriction enzymes (Fig. 4 - Electrophoretic separation of independent clones of the recombinant plasmid pEntry carrying the NA gene in 1.5% agarose gel:

1. Базовая плазмида pEntry, несущий ген NA;1. The base plasmid pEntry, carrying the NA gene;

2-6. Независимые клоны плазмиды pEntry, несущий ген NA;2-6. Independent clones of the plasmid pEntry, carrying the NA gene;

Структуру полученных плазмид подтверждали рестрикционным анализом (эндонуклеазами рестрикции SalI и EcoRI) и секвенированием.The structure of the obtained plasmids was confirmed by restriction analysis (restriction endonucleases SalI and EcoRI) and sequencing.

Получение и анализ рекомбинантной плазмиды pEntry, содержащей кассету генов НА (H3N2), M1 и NA.Obtaining and analysis of recombinant plasmids pEntry containing the gene cassette HA (H3N2), M1 and NA.

Индивидуальные гены НА (H3N2) получали с помощью ОТ-ПЦР в два раунда. В первом раунде провели независимые три реакции ОТ-ПЦР для получения трех коротких перекрывающихся фрагментов ДНК для каждого типа НА с использованием следующих пар праймеров для H3N2: HA_H3N2_SalI_upper и HA_H3N2_frl_lower, HA_H3N2_fr2_upper и HA_H3N2_fr2_lower, HA_H3N2_fr3_upper и HA_H3N2_PstI_lower; для В: HA_B_SalI_upper и HA_B_frl_lower, HA_B_fr2_upper и HA_B_fr2_lower, HA_B_fr3_upper и HA_B_Zsp2I_lower (фиг. 5 - Результат электрофоретического разделения в 1,5% геле агарозы амплифицированных фрагментов ДНК НА (H3N2) и НА (В):Individual HA (H3N2) genes were obtained by RT-PCR in two rounds. In the first round, three independent RT-PCR reactions were performed to obtain three short overlapping DNA fragments for each type of HA using the following pairs of primers for H3N2: HA_H3N2_SalI_upper and HA_H3N2_frl_lower, HA_H3N2_fr2_upper and HA_H3N2_fr2_erpper_ HArH3_2_pper for B: HA_B_SalI_upper and HA_B_frl_lower, HA_B_fr2_upper and HA_B_fr2_lower, HA_B_fr3_upper and HA_B_Zsp2I_lower (Fig. 5 - Electrophoretic separation of 1.5% agarose gel of amplified DNA fragments N2) ON and (3)

1-3. Три ПЦР-продукта для гемагглютинина H3N2 (607, 599 и 647 п.н.);1-3. Three PCR products for hemagglutinin H3N2 (607, 599 and 647 bp);

4-6. Три ПЦР-продукта для гемагглютинина В (646, 629 и 638 п.н.);4-6. Three PCR products for hemagglutinin B (646, 629 and 638 bp);

Во втором раунде провели общую ПЦР для трех перекрывающихся фрагментов ДНК для H3N2 с добавлением внешних праймеров (HA_H3N2_SalI_upper и HA_H3N2_PstI_lower) (фиг. 6 - Результат электрофоретического разделения в 1,5% геле агарозы амплифицированных фрагментов ДНК НА (H3N2):In the second round, total PCR was performed for three overlapping DNA fragments for H3N2 with the addition of external primers (HA_H3N2_SalI_upper and HA_H3N2_PstI_lower) (Fig. 6 - Electrophoretic separation of amplified DNA fragments of HA (H3N2) in 1.5% agarose gel:

1. ПЦР - продукта для полноразмерного гемагглютинина H3N2 (1719 п.н.);1. PCR - product for full-size hemagglutinin H3N2 (1719 bp);

2. М.ДНК маркер, длины в п.н. показаны на левой стороне).2. M. DNA marker, length in bp shown on the left side).

Далее полученный амплификационный продукт НА встраивали в плазмиду pDrive с последующим отбором клона без аминокислотных замен относительно референс-штамма с помощью секвенирования.Next, the obtained amplification product of HA was inserted into the pDrive plasmid, followed by selection of the clone without amino acid substitutions relative to the reference strain by sequencing.

На следующем этапе фрагмент НА (H3N2) вырезали по сайтам SalI и PstI из выбранного клона и встраивали в рекомбинантную плазмиду pEntry, несущую кассету генов, предварительно гидролизованную данными рестриктазами (взамен НА (H1N1)). Структуру полученной рекомбинантной плазмиды подтверждали рестрикционным анализом с помощью EcoRI (последовательность гемагглютинина H3N2 имеет три дополнительных сайта узнавания EcoRI в сравнении с последовательностью гемагглютинина H1N1, фиг. 7 - Результат электрофоритического разделения в 1,5% геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантной плазмиды pEntry, несущей кассету генов НА (Н3 N2), M1 и NА, эндонуклеазной рестрикции EcoRI (в скобках указаны длины образующихся фрагментов:In the next step, the HA (H3N2) fragment was excised from SalI and PstI sites from the selected clone and inserted into the recombinant pEntry plasmid carrying the gene cassette previously hydrolyzed with these restriction enzymes (instead of HA (H1N1)). The structure of the obtained recombinant plasmid was confirmed by restriction analysis using EcoRI (the H3N2 hemagglutinin sequence has three additional EcoRI recognition sites in comparison with the H1N1 hemagglutinin sequence, Fig. 7 - Electrophoretic separation of DNA fragments obtained from the 1.5% agarose gel after hydrolysis of the recombinant plasmid pE carrying a cassette of genes HA (H3 N2), M1 and NA, endonuclease restriction EcoRI (the lengths of the resulting fragments are indicated in parentheses:

1. Базовая плазмида pEntry, несущая кассету генов НА (H1 N1), M1 и NA (9875 п.н.);1. The base plasmid pEntry, carrying the gene cassette HA (H1 N1), M1 and NA (9875 bp);

2-13. Независимые клоны плазмиды pEntry, несущей кассету генов НА (Н3 N2), M1 и NA (22 п.н. + 1060 п.н. + 3033 п.н. + 5760 п.н.)2-13. Independent clones of the pEntry plasmid carrying the HA (H3 N2), M1 and NA gene cassette (22 bp + 1060 bp + 3033 bp + 5760 bp)

3. М.ДНК маркер, длины в п.н. показаны на левой стороне) и секвенированием.3. M. DNA DNA marker, length in bp shown on the left side) and sequencing.

Получение и анализ рекомбинантной плазмиды pEntry, содержащей кассету генов НА (В), M1 и NAObtaining and analysis of recombinant plasmids pEntry containing the gene cassette HA (B), M1 and NA

Синтезированный ген гемагглютинина вируса гриппа В вырезали по сайтам Sad и Pstl из выбранного клона и встраивали в рекомбинантную плазмиду pEntry, несущую кассету генов, предварительно гидролизованную данными рестриктазами (взамен НА (H1N1)). Структуру полученной рекомбинантной плазмиды подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием.The synthesized influenza B hemagglutinin gene was excised from the Sad and Pstl sites from the selected clone and inserted into the recombinant pEntry plasmid carrying the gene cassette previously hydrolyzed with these restriction enzymes (instead of HA (H1N1)). The structure of the obtained recombinant plasmid was confirmed by restriction analysis and sequencing.

Пример 3Example 3

3.1.1 Проектирование и синтез гена гемагглютинина штамм A/HongKong/4801/2014(H3N2)3.1.1 Design and synthesis of the hemagglutinin gene strain A / HongKong / 4801/2014 (H3N2)

Проектирование нуклеотидной последовательность гена гемагглютинина штамм A/HongKong/4801/2014(H3N2) осуществляли на основе имеющихся нуклеотидных последовательностей в базе данных GISAID EpiFlu (фиг. 17).The design of the nucleotide sequence of the hemagglutinin gene strain A / HongKong / 4801/2014 (H3N2) was carried out based on the available nucleotide sequences in the GISAID EpiFlu database (Fig. 17).

Далее была проведена оптимизация первичной нуклеотидной последовательности гена, кодирующего гемагглютинин, с учетом частоты встречаемости различных кодонов для повышения уровня экспрессии гена в эукариотической системе экспресии. Нуклеотидная последовательность синтезированного гена представлена SEQ ID NO: 6.Further, the primary nucleotide sequence of the gene encoding hemagglutinin was optimized, taking into account the frequency of occurrence of various codons to increase the level of gene expression in the eukaryotic expression system. The nucleotide sequence of the synthesized gene is represented by SEQ ID NO: 6.

3.1.2 Проектирование и синтез гена гемагглютинина штамма B/Brisbane/60/20083.1.2 Design and synthesis of the hemagglutinin gene of strain B / Brisbane / 60/2008

Проектирование нуклеотидной последовательность гена гемагглютинина штамм B/Brisbane/60/2008 осуществляли на основе имеющихся нуклеотидных последовательностей в базе данных GISAID EpiFlu (фиг. 18).The nucleotide sequence design of the hemagglutinin strain B / Brisbane / 60/2008 gene was carried out based on the available nucleotide sequences in the GISAID EpiFlu database (Fig. 18).

Далее была проведена оптимизация первичной нуклеотидной последовательности гена, кодирующего гемагглютинин, с учетом частоты встречаемости различных кодонов для повышения уровня экспрессии гена в эукариотической системе экспрессии. Нуклеотидная последовательность синтезированного гена представлена SEQ ID NO: 7.Then, the primary nucleotide sequence of the gene encoding hemagglutinin was optimized taking into account the frequency of occurrence of various codons to increase the level of gene expression in the eukaryotic expression system. The nucleotide sequence of the synthesized gene is represented by SEQ ID NO: 7.

3.1.3 Проектирование и синтез гена гемагглютинина штамма A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm093.1.3 Design and synthesis of the hemagglutinin gene of strain A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09

Проектирование нуклеотидной последовательность гена гемагглютинина штамм A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09 осуществляли на основе имеющихся нуклеотидных последовательностей в базе данных GISAID EpiFlu (фиг. 19).The nucleotide sequence design of the hemagglutinin gene strain A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09 was carried out based on the available nucleotide sequences in the GISAID EpiFlu database (Fig. 19).

Далее была проведена оптимизация первичной нуклеотидной последовательности гена, кодирующего гемагглютинин, с учетом частоты встречаемости различных кодонов для повышения уровня экспрессии гена в эукариотической системе экспрессии. Нуклеотидная последовательность синтезированного гена представлена SEQ ID NO: 8.Then, the primary nucleotide sequence of the gene encoding hemagglutinin was optimized taking into account the frequency of occurrence of various codons to increase the level of gene expression in the eukaryotic expression system. The nucleotide sequence of the synthesized gene is represented by SEQ ID NO: 8.

3.2.1 Клонирование гена гемагглютинина штамма A/HongKong/4801/2014 (H3N2) в вектор pLenti6.3/TO/HA-M1-NA (California/04/2009).3.2.1 Cloning of the hemagglutinin gene of strain A / HongKong / 4801/2014 (H3N2) into the vector pLenti6.3 / TO / HA-M1-NA (California / 04/2009).

Искусственный ген, кодирующий гемагглютинин штамма A/HongKong/4801/2014 (H3N2) был рассчитан и синтезирован в составе векторной плазмиды.The artificial gene encoding the hemagglutinin of strain A / HongKong / 4801/2014 (H3N2) was calculated and synthesized as part of a vector plasmid.

Далее полученную фирменную векторную плазмиду, содержащую ген, гемагглютинина штамма A/HongKong/4801/2014 (H3N2) гидролизовали эндонуклеазами рестрикции SalI и PstI и встраивали в рекомбинантную плазмиду pEntry_HA-M1-NA (California/04/2009), несущую кассету генов, предварительно гидролизованную данными эндонуклеазами рестрикции (взамен HA(California/04/2009)). Структуру полученной рекомбинантной плазмиды подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием.Next, the obtained proprietary vector plasmid containing the hemagglutinin gene of strain A / HongKong / 4801/2014 (H3N2) was hydrolyzed with restriction endonucleases SalI and PstI and inserted into the recombinant plasmid pEntry_HA-M1-NA (California / 04/2009), which previously carried the gene cassette hydrolyzed by these restriction endonucleases (instead of HA (California / 04/2009)). The structure of the obtained recombinant plasmid was confirmed by restriction analysis and sequencing.

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК. pLenti6.3/TO/HA(HongKong/4801)-M1-NA, проводили LR рекомбинацию фирменной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST (фиг. 10) с плазмидной ДНК pEntry_HA(HongKong/4801)-M1-NA. Проводили анализ продуктов рекомбинации двух плазмид при помощи электрофоретического анализа, рестрикционного анализа и секвенирования. В результате был отобран один клоновый вариант плазмиды pLenti6.3/TO/HA(A/HongKong)-M1-NA (схематическое изображение плазмиды отображено в паспорте), проведена наработка плазмиды и очистка от эндотоксинов при помощи «EndoFree Plasmid Maxi Kit» («Qiagen», Германия). Далее проводили проверку подлинности выделенной плазмидной ДНК при помощи рестрикционного анализа и секвенирования.To obtain recombinant plasmid DNA. pLenti6.3 / TO / HA (HongKong / 4801) -M1-NA, LR recombination of branded plasmid DNA pLenti6.3 / TO / V5-DEST (Fig. 10) with plasmid DNA pEntry_HA (HongKong / 4801) -M1-NA . The products of the recombination of two plasmids were analyzed by electrophoretic analysis, restriction analysis, and sequencing. As a result, one clonal variant of the plasmid pLenti6.3 / TO / HA (A / HongKong) -M1-NA was selected (a schematic representation of the plasmid is shown in the passport), the plasmid was prepared and the endotoxins were purified using the “EndoFree Plasmid Maxi Kit” (“ Qiagen ", Germany). Next, the authenticity of the isolated plasmid DNA was verified by restriction analysis and sequencing.

3.2.2 Клонирование гена гемагглютинина штамма B/Brisbane/60/2008 в вектор pLenti6.3/TO/HA-M1-NA (California/04/2009).3.2.2 Cloning of the hemagglutinin gene of strain B / Brisbane / 60/2008 into the vector pLenti6.3 / TO / HA-M1-NA (California / 04/2009).

Искусственный ген, кодирующий гемагглютинин штамма B/Brisbane/60/2008 (H3N2) был рассчитан и синтезирован в составе векторной плазмиды.An artificial gene encoding the hemagglutinin of strain B / Brisbane / 60/2008 (H3N2) was calculated and synthesized as part of a vector plasmid.

Далее полученную фирменную векторную плазмиду, содержащую ген, гемагглютинина штамма B/Brisbane/60/2008 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции SalI и PstI и встраивали в рекомбинантную плазмиду pEntry_HA-M1-NA (California/04/2009), несущую кассету генов, предварительно гидролизованную данными эндонуклеазами рестрикции (взамен HA(California/04/2009)). Структуру полученной рекомбинантной плазмиды подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием.Next, the obtained branded vector plasmid containing the gene, hemagglutinin strain B / Brisbane / 60/2008 was hydrolyzed with restriction endonucleases SalI and PstI and inserted into the recombinant plasmid pEntry_HA-M1-NA (California / 04/2009) carrying the gene cassette preliminarily hydrolyzed with data restriction (instead of HA (California / 04/2009)). The structure of the obtained recombinant plasmid was confirmed by restriction analysis and sequencing.

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/HA(B-Brisbane)-M1-NA, проводили LR рекомбинацию фирменной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST с плазмидной ДНК pEntry_HA(B-Brisbane)-M1-NA. Проводили анализ продуктов рекомбинации двух плазмид при помощи электрофоретического анализа, рестрикционного анализа и секвенирования. В результате был отобран один клоновый вариант плазмиды pLenti6.3/TO/HA(B-Brisbane)-M1-NA (схематическое изображение плазмиды отображено в паспорте), проведена наработка плазмиды и очистка от эндотоксинов при помощи «EndoFree Plasmid Maxi Kit» («Qiagen», Германия). Далее проводили проверку подлинности выделенной плазмидной ДНК при помощи рестрикционного анализа и секвенирования.To obtain recombinant plasmid DNA pLenti6.3 / TO / HA (B-Brisbane) -M1-NA, LR recombination of branded plasmid DNA pLenti6.3 / TO / V5-DEST with plasmid DNA pEntry_HA (B-Brisbane) -M1-NA was performed . The products of the recombination of two plasmids were analyzed by electrophoretic analysis, restriction analysis, and sequencing. As a result, one clonal variant of the plasmid pLenti6.3 / TO / HA (B-Brisbane) -M1-NA (a schematic representation of the plasmid is shown in the passport) was selected, the plasmid was prepared and the endotoxins were purified using the “EndoFree Plasmid Maxi Kit” (“ Qiagen ", Germany). Next, the authenticity of the isolated plasmid DNA was verified by restriction analysis and sequencing.

3.2.3 Клонирование гена гемагглютинина штамма A/Michigan/45/2015 (H1N1)pdm09 в вектор pLenti6.3/TO/HA-M1-NA (California/04/2009).3.2.3 Cloning of the hemagglutinin gene of strain A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09 into the vector pLenti6.3 / TO / HA-M1-NA (California / 04/2009).

Искусственный ген, кодирующий гемагглютинин штамма A/Michigan/45/2015 (H1N1)pdm09 был рассчитан и синтезирован в составе векторной плазмиды.The artificial gene encoding the hemagglutinin of strain A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09 was calculated and synthesized as part of a vector plasmid.

Далее полученную фирменную векторную плазмиду, содержащую ген, гемагглютинина штамма A/Michigan/45/2015 (H1N1)pdm09 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции SalI и PstI и встраивали в рекомбинантную плазмиду pEntry_HA-M1-NA (California/04/2009), несущую кассету генов, предварительно гидролизованную данными эндонуклеазами рестрикции (взамен HA(California/04/2009)). Структуру полученной рекомбинантной плазмиды подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием.Next, the obtained branded vector plasmid containing the hemagglutinin gene of strain A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09 was digested with restriction endonucleases SalI and PstI and inserted into the recombinant plasmid pEntry_HA-M1-NA (California / 04/2009) carrying the cassette previously hydrolyzed by these restriction endonucleases (instead of HA (California / 04/2009)). The structure of the obtained recombinant plasmid was confirmed by restriction analysis and sequencing.

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA, проводили LR рекомбинацию фирменной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST с плазмидной ДНК pEntry_HA(H1N1-Mich)-M1-NA. Проводили анализ продуктов рекомбинации двух плазмид при помощи электрофоретического анализа, рестрикционного анализа и секвенирования. В результате был отобран один клоновый вариант плазмиды pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA (схематическое изображение плазмиды отображено в паспорте), проведена наработка плазмиды и очистка от эндотоксинов при помощи «EndoFree Plasmid Maxi Kit» («Qiagen», Германия). Далее проводили проверку подлинности выделенной плазмидной ДНК при помощи рестрикционного анализа и секвенирования.To obtain pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA recombinant plasmid DNA, LR recombination of pLenti6.3 / TO / V5-DEST branded plasmid DNA with pEntry_HA (H1N1-Mich) -M1-NA plasmid DNA was performed . The products of the recombination of two plasmids were analyzed by electrophoretic analysis, restriction analysis, and sequencing. As a result, one clonal variant of the plasmid pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA (a schematic image of the plasmid is shown in the passport) was selected, the plasmid was prepared and the endotoxins were purified using the “EndoFree Plasmid Maxi Kit” (“ Qiagen ", Germany). Next, the authenticity of the isolated plasmid DNA was verified by restriction analysis and sequencing.

3.3.1 Получение и анализ рекомбинантной плазмиды pEntry, содержащей кассету генов НА (B/Brisbane/60/2008), M1 (California/04/2009) и NA(California/04/2009)3.3.1 Obtaining and analysis of recombinant plasmids pEntry containing the gene cassette HA (B / Brisbane / 60/2008), M1 (California / 04/2009) and NA (California / 04/2009)

В качестве векторной плазмиды в работе использовалась рекомбинантная плазмидная ДНК pEntry_HA-M1-NA (California/04/2009). Данная плазмида содержит кассету генов, состоящую из следующих структурных элементов:Recombinant plasmid DNA pEntry_HA-M1-NA (California / 04/2009) was used as a vector plasmid. This plasmid contains a gene cassette consisting of the following structural elements:

- attL1 и attL2 - нуклеотидные последовательности, необходимые для LR-рекомбинации между плазмидами pEntry и pLenti6.3/TO/V5-DEST;- attL1 and attL2 are the nucleotide sequences necessary for LR recombination between pEntry and pLenti6.3 / TO / V5-DEST plasmids;

- IRES - участок внутренней посадки рибосом;- IRES - site of the internal landing of ribosomes;

- CMV - цитомегаловирусный промотор;- CMV - cytomegalovirus promoter;

- НА - ген, кодирующий гемагглютинин вируса гриппа (California/04/2009);- HA - a gene encoding the hemagglutinin of the influenza virus (California / 04/2009);

- SalI/PstI - сайты узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции для замены HA(California/04/2009) в кассете генов при необходимости;- SalI / PstI - recognition sites of the corresponding restriction endonucleases for replacing HA (California / 04/2009) in the gene cassette, if necessary;

- M1 - ген, кодирующий матриксный белок вируса гриппа (California/04/2009);- M1 - gene encoding the matrix protein of the influenza virus (California / 04/2009);

- NA - ген, кодирующий нейраминидазу вируса гриппа (California/04/2009).- NA is a gene encoding an influenza virus neuraminidase (California / 04/2009).

Ген, кодирущий геммагглютинин штамма B/Brisbane/60/2008 (H3N2), был синтезирован в составе векторной плазмиды, при этом ген фланкирован сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции SalI/PstI для дальнейшего переклонирования в необходимый вектор. Кроме того была произведена оптимизация нуклеотидной последовательности гена для увеличения его экспрессии в эукариотических клетках. При оптимизации использовалась нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина штамма B/Brisbane/60/2008 (H3N2) из базы данных GISAID EpiFlu, оптимизация нуклеотидного состава гена не приводит к аминокислотным заменам в соответствующем белке.The gene encoding the hemmagglutinin of strain B / Brisbane / 60/2008 (H3N2) was synthesized as a part of a vector plasmid, with the gene flanked by SalI / PstI restriction endonuclease recognition sites for further cloning into the desired vector. In addition, the nucleotide sequence of the gene was optimized to increase its expression in eukaryotic cells. The nucleotide sequence of the hemagglutinin gene of strain B / Brisbane / 60/2008 (H3N2) from the GISAID EpiFlu database was used for optimization; optimization of the nucleotide composition of the gene does not lead to amino acid substitutions in the corresponding protein.

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pEntry_HA(B-Brisbane)-M1-NA, векторную плазмиду pEntry_НА-М1-NA (California/04/2009) гидролизовали эндонуклеазами рестрикции SalI и PstI. С использованием указанных эндонуклеаз рестрикции проводили гидролиз плазмидной ДНК, содержащей ген, кодирующий гемагглютинин штамма B/Brisbane/60/2008. Далее проводили очистку гидролизованной векторной плазмидной ДНК и гидролизованного фрагмента ДНК, кодирующего гемагглютинин, путем выделения соответствующих фрагментов из агарозного геля при помощи набора GelExtractionKit («QIAGEN», Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Лигировали полученные фрагменты ДНК, трансформировали компетентные клетки E. coli XL-10Gold. Далее проводили выделение плазмидной ДНК из индивидуальных колоний E. coli. Отбор клонов осуществляли рестрикционным анализом с помощью эндонуклеаз рестрикции SalI и PstI. Правильность нуклеотидных последовательностей всех рекомбинантных плазмид были подтверждены секвенированием. Определение нуклеотидной последовательности проводили на автоматическом секвенаторе 310 Geneticanalyzer («AppliedBiosystems», США). Для дальнейшей работы использовали клоны рекомбинантных плазмидных ДНК pEntry_HA(B-Brisbane)-M1-NA с подтвержденной нуклеотидной последовательностью встроенного гена, кодирующего гемагглютинин.To obtain recombinant plasmid DNA pEntry_HA (B-Brisbane) -M1-NA, the vector plasmid pEntry_HA-M1-NA (California / 04/2009) was digested with restriction endonucleases SalI and PstI. Using the indicated restriction endonucleases, the plasmid DNA containing the gene encoding the hemagglutinin of strain B / Brisbane / 60/2008 was hydrolyzed. Next, the hydrolyzed vector plasmid DNA and the hydrolyzed DNA fragment encoding hemagglutinin were purified by isolating the corresponding fragments from the agarose gel using the GelExtractionKit kit (QIAGEN, Germany) in accordance with the manufacturer's recommendations. The obtained DNA fragments were ligated, competent E. coli XL-10Gold cells were transformed. Next, plasmid DNA was isolated from individual E. coli colonies. Clones were selected by restriction analysis using restriction endonucleases SalI and PstI. The correct nucleotide sequences of all recombinant plasmids were confirmed by sequencing. The determination of the nucleotide sequence was carried out on a 310 Geneticanalyzer automatic sequencer (AppliedBiosystems, USA). For further work, we used clones of recombinant plasmid DNA pEntry_HA (B-Brisbane) -M1-NA with the confirmed nucleotide sequence of the inserted gene encoding hemagglutinin.

3.3.2 Получение и анализ рекомбинантной плазмиды pLenti6.3, содержащей кассету генов НА (B/Brisbane/60/2008), M1(California/04/2009) и NA(California/04/2009)3.3.2 Preparation and analysis of recombinant plasmid pLenti6.3 containing the gene cassette HA (B / Brisbane / 60/2008), M1 (California / 04/2009) and NA (California / 04/2009)

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pLenti6.3, содержащей кассету генов НА (B/Brisbane/60/2008), M1 (California/04/2009) и NA (California/04/2009), провели LR рекомбинацию между фирменной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST и плазмидной ДНК pEntry_HA(B-Brisbane)-M1-NA, содержащей кассету генов. Далее проводили трансформацию компетентных клеток E. coli штамм Stbl3 смесью плазмидных ДНК, полученных после рекомбинации. Затем осуществляли выделение плазмидной ДНК из индивидуальных колоний E. coli. Потенциально один клоновый вариант являлся целевым. Для подтверждения структуры полученной плазмиды проводили расширенный рестрикционный анализа с использованием эндонуклеаз рестрикции XhoI, ЕсоRI, PstI и HindIII (длины полученных ДНК-фрагментов после гидролиза соответствуют теоретическим длинам,. Кроме того правильность нуклеотидной последовательности подтверждена секвенированием. Для дальнейшей работы данная плазмида была наработана и очищена от эндотоксинов при помощи набора «EndoFreePlasmidMaxiKit» («QIAGEN», Германия).To obtain recombinant plasmid DNA pLenti6.3 containing the gene cassette HA (B / Brisbane / 60/2008), M1 (California / 04/2009) and NA (California / 04/2009), LR recombination was performed between the branded plasmid DNA pLenti6. 3 / TO / V5-DEST and plasmid DNA pEntry_HA (B-Brisbane) -M1-NA containing the gene cassette. Then, competent E. coli strain Stbl3 cells were transformed with a mixture of plasmid DNA obtained after recombination. Then, plasmid DNA was isolated from individual E. coli colonies. Potentially, one clone variant was the target. To confirm the structure of the obtained plasmid, an extended restriction analysis was performed using restriction endonucleases XhoI, EcoRI, PstI and HindIII (the lengths of the obtained DNA fragments after hydrolysis correspond to theoretical lengths. In addition, the correct nucleotide sequence was confirmed by sequencing. For further work, this plasmid was developed and purified from endotoxins using the EndoFreePlasmidMaxiKit kit (QIAGEN, Germany).

Результат электрофоретического разделения в 1.5% геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантной плазмиды pLenti6.3/TO/HA(B-Brisbane)-M1-NA, эндонуклеазами рестрикции XhoI, ЕсоRI, PstI и HindIII. В таблице приведены теоретические длины фрагментов ДНК, образующихся после гидролиза соответствующими эндонуклеазами рестрикции.The result of electrophoretic separation in a 1.5% agarose gel of DNA fragments obtained after hydrolysis of the recombinant plasmid pLenti6.3 / TO / HA (B-Brisbane) -M1-NA, restriction endonucleases XhoI, EcoRI, PstI and HindIII. The table shows the theoretical lengths of DNA fragments formed after hydrolysis by the corresponding restriction endonucleases.

1: плазмида pLenti6.3/TO/HA(B-Brisbane)-M1-NA, гидролизованная HindIII;1: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (B-Brisbane) -M1-NA, hydrolyzed by HindIII;

2: плазмида pLenti6.3/TO/HA(B-Brisbane)-M1-NA, гидролизованная EcoRI;2: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (B-Brisbane) -M1-NA, hydrolyzed by EcoRI;

3: плазмида pLenti6.3/TO/HA(B-Brisbane)-M1-NA, гидролизованная XhoI;3: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (B-Brisbane) -M1-NA, hydrolyzed by XhoI;

4: плазмида pLenti6.3/TO/HA(B-Brisbane)-M1-NA, гидролизованная PstI;4: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (B-Brisbane) -M1-NA, hydrolyzed by PstI;

М.ДНК маркер 1 Kb («СибЭнзим», Россия).M.DNA marker 1 Kb (SibEnzyme, Russia).

3.3.3 Получение и анализ рекомбинантной плазмиды pEntry, содержащей кассету генов НА (A/HongKong/4801/2014 (H3N2)), M1 (California/04/2009) и NA (California/04/2009)3.3.3 Preparation and analysis of recombinant plasmid pEntry containing the gene cassette HA (A / HongKong / 4801/2014 (H3N2)), M1 (California / 04/2009) and NA (California / 04/2009)

Схема получения рекомбинантной плазмидной ДНК pEntry_HA(HongKong/4801)-M1-NA аналогична схеме получения pEntry_HA(B-Brisbane)-M1-NA.The scheme for producing recombinant plasmid DNA pEntry_HA (HongKong / 4801) -M1-NA is similar to that for pEntry_HA (B-Brisbane) -M1-NA.

В качестве векторной плазмиды также использовалась плазмидная ДНК pEntry__HA-M1-NA (California/04/2009), в которой ген, кодирующий гемагглютинин штамма California/04/2009 заменяли на ген, кодирующий гемагглютинин штамма A/HongKong/4801/2014(H3N2).PEntry__HA-M1-NA plasmid DNA (California / 04/2009) was also used as a vector plasmid, in which the gene encoding the hemagglutinin of strain California / 04/2009 was replaced by the gene encoding the hemagglutinin of strain A / HongKong / 4801/2014 (H3N2) .

Ген, кодирущий гемагглютинин штамма A/HongKong/4801/2014(H3N2), был спроектирован с оптимизацией кодонового состава, для увеличения уровня экспрессии гена в эукариотических клетках. Информация о природной нуклеотидной последовательности гена, кодирующего гемагглютинин, получена из базы данных GISAID EpiFlu.The gene encoding the hemagglutinin of strain A / HongKong / 4801/2014 (H3N2) was designed with optimization of the codon composition to increase the level of gene expression in eukaryotic cells. Information on the natural nucleotide sequence of the hemagglutinin encoding gene is obtained from the EpiFlu GISAID database.

Плазмидную ДНК pEntry_HA-M1-NA (California/04/2009) и синтезированную плазмиду, содержащую ген гемагглютинина необходимого штамма, гидролизовали эндонуклеазами рестрикции SalI и PstI. После чего проводили очистку векторной плазмиды и гена, кодирующего гемагглютинин, из агарозного геля. Лигировали два полученных фрагмента ДНК, затем трансформировали компетентные клетки E. coli штамма XL-10Gold лигазной смесью. Далее из индивидуальных колоний E. coli проводили выделение плазмидных ДНК. Подлинность полученной плазмидной ДНК подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием. Для дальнейшей работы был отобран клон без нуклеотидных замен.Plasmid DNA pEntry_HA-M1-NA (California / 04/2009) and a synthesized plasmid containing the hemagglutinin gene of the desired strain were digested with SalI and PstI restriction endonucleases. After that, the vector plasmid and the gene encoding hemagglutinin were purified from agarose gel. Two obtained DNA fragments were ligated, then competent E. coli cells of strain XL-10Gold were transformed with a ligase mixture. Further, plasmid DNA was isolated from individual E. coli colonies. The authenticity of the obtained plasmid DNA was confirmed by restriction analysis and sequencing. For further work, a clone without nucleotide substitutions was selected.

3.3.4 Получение и анализ рекомбинантной плазмиды pLenti6.3, содержащей кассету генов НА (A/HongKong/4801/2014(H3N2)), M1 (California/04/2009) и NA (California/04/2009)3.3.4 Preparation and analysis of recombinant plasmid pLenti6.3 containing the gene cassette HA (A / HongKong / 4801/2014 (H3N2)), M1 (California / 04/2009) and NA (California / 04/2009)

Для получения плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/HA(A/HongKong)-M1-NA была проведена LR-рекомбинация между плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST и плазмидной ДНК pEntry_HA(HongKong/4801)-М1-NA. Трансформировали компетентные клетки E. coli штамм Stbl3 продуктами реакции рекомбинации. Далее проводили выделение плазмидной ДНК из индивидуальных клонов E. coli. В результате электрофоретического анализы выделенных плазмидных ДНК, установлено, что потенциально 4 клона, являются целевыми продуктами рекомбинации. Далее один из клонов секвенировали и проводили рестрикционный анализа с использованием эндонуклеаз рестрикции XhoI, ЕсоRI, PstI и HindIII. Выбранные клоновый вариант pLenti6.3/TO/HA(A/HongKong)-M1-NA не содержит нуклеотидных замен, относительно теоретической последовательности, кроме того длины ДНК-фрагментов, полученных после гидролиза указанными эндонуклеазами рестрикции, соответствуют теоретическим длинам. Для дальнейшей работы данная плазмида была наработана и очищена от эндотоксинов при помощи набора «EndoFreePlasmidMaxiKit» («QIAGEN», Германия).To obtain plasmid DNA pLenti6.3 / TO / HA (A / HongKong) -M1-NA, LR recombination was performed between plasmid DNA pLenti6.3 / TO / V5-DEST and plasmid DNA pEntry_HA (HongKong / 4801) -M1-NA . Competent cells of E. coli strain Stbl3 were transformed with the products of a recombination reaction. Next, plasmid DNA was isolated from individual E. coli clones. As a result of electrophoretic analysis of the isolated plasmid DNA, it was found that potentially 4 clones are the target products of recombination. Next, one of the clones was sequenced and restriction analysis was performed using restriction endonucleases XhoI, EcoRI, PstI and HindIII. The selected clonal variant pLenti6.3 / TO / HA (A / HongKong) -M1-NA does not contain nucleotide substitutions with respect to the theoretical sequence, in addition, the lengths of DNA fragments obtained after hydrolysis by the indicated restriction endonucleases correspond to theoretical lengths. For further work, this plasmid was developed and purified from endotoxins using the EndoFreePlasmid MaxiKit kit (QIAGEN, Germany).

Результат электрофоретического разделения в 1.5% геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантной плазмиды pLenti6.3/TO/HA(A/HongKong)-M1-NA, эндонуклеазами рестрикции XhoI, EcoRI, PstI и HindIII. В таблице приведены теоретические длины фрагментов ДНК, образующихся после гидролиза соответствующими эндонуклеазами рестрикции.The result of electrophoretic separation in a 1.5% agarose gel of DNA fragments obtained after hydrolysis of the recombinant plasmid pLenti6.3 / TO / HA (A / HongKong) -M1-NA, restriction endonucleases XhoI, EcoRI, PstI and HindIII. The table shows the theoretical lengths of DNA fragments formed after hydrolysis by the corresponding restriction endonucleases.

1: плазмида pLenti6.3/TO/HA(A/HongKong)-M1-NA, гидролизованная PstI;1: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (A / HongKong) -M1-NA hydrolyzed by PstI;

2: плазмида pLenti6.3/TO/HA(A/HongKong)-M1-NA, гидролизованная HindIII;2: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (A / HongKong) -M1-NA hydrolyzed with HindIII;

3: плазмида pLenti6.3/TO/HA(A/HongKong)-M1-NA, гидролизованная EcoRI;3: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (A / HongKong) -M1-NA, hydrolyzed by EcoRI;

4: плазмида pLenti6.3/TO/HA(A/HongKong)-M1-NA, гидролизованная XhoI;4: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (A / HongKong) -M1-NA hydrolyzed by XhoI;

М.ДНК маркер 1 Kb («СибЭнзим», Россия)M.DNA marker 1 Kb (SibEnzyme, Russia)

3.3.5. Получение и анализ рекомбинантной плазмиды pEntry, содержащей кассету генов НА (A/Michigan/45/2015 (H1N1)pdm09), M1 (California/04/2009) и NA (California/04/2009)3.3.5. Preparation and analysis of recombinant plasmid pEntry containing the gene cassette HA (A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09), M1 (California / 04/2009) and NA (California / 04/2009)

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA на первом этапе работы был произведен синтез гена, кодирующего гемагглютинин штамма A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09. Информация о нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина была получена из базы данных GISAID EpiFlu. Далее была проведена работа по оптимизации кодонового состава, указанного гена, с целью повышения уровня его экспрессии в эукариотических клетках. Ген был рассчитан и синтезирован в составе плазмидной ДНК. Затем проводили гидролиз полученной плазмидной ДНК по сайтам эндонуклеаз рестрикции SalI и PstI. Кроме того, гидролизовали плазмидную ДНК pEntry_HA-M1-NA (California/04/2009) указанными эндонуклеазами рестрикции. После гидролиза векторную ДНК и фрагмент, кодирующий гемаглютинин штамма A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09, выделяли из агарозного геля при помощи набора GelExtractionKit («QIAGEN», Германия), лигировали выделенные фрагменты и лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli штамма XL-10Gold. Проводили выделение клоновых вариантов плазмидной ДНК из индивидуальных колоний E. coli. Подлинность выделенной плазмидной ДНК подтверждали рестрикционным анализом (гидролиз эндонуклеазами рестрикции SalI и PstI, и секвенированим. Клон без нуклеотидных замен использовался для дальнейшей работы.To obtain recombinant plasmid DNA pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA, at the first stage of the work, a gene encoding the hemagglutinin of strain A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09 was synthesized. Hemagglutinin gene nucleotide sequence information was obtained from the EpiFlu GISAID database. Further, work was done to optimize the codon composition of the indicated gene in order to increase its expression level in eukaryotic cells. The gene was calculated and synthesized as part of plasmid DNA. Then, the obtained plasmid DNA was hydrolyzed at the SalI and PstI restriction endonucleases sites. In addition, plasmid DNA pEntry_HA-M1-NA (California / 04/2009) was hydrolyzed with the indicated restriction endonucleases. After hydrolysis, vector DNA and a fragment encoding the hemagglutinin of strain A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09 were isolated from an agarose gel using the GelExtractionKit kit (QIAGEN, Germany), the isolated fragments were ligated, and competent E. coli cells were transformed with a ligase mixture strain XL-10Gold. Clonal plasmid DNA variants were isolated from individual E. coli colonies. The authenticity of the isolated plasmid DNA was confirmed by restriction analysis (hydrolysis with restriction endonucleases SalI and PstI, and sequenced. A clone without nucleotide substitutions was used for further work.

3.3.6. Получение и анализ рекомбинантной плазмиды pLenti6.3, содержащей кассету генов НА (A/Michigan/45/2015 (H1N1)pdm09), M1 (California/04/2009) и NA (California/04/2009).3.3.6. Preparation and analysis of recombinant plasmid pLenti6.3 containing the gene cassette HA (A / Michigan / 45/2015 (H1N1) pdm09), M1 (California / 04/2009) and NA (California / 04/2009).

Рекомбинантная плазмидная ДНК pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA была получена по схеме, описанной выше. На первом этапе работы проводили LR рекомбинацию между полученной плазмидной ДНК pEntry_HA-M1-NA (California/04/2009) и плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST, затем смесью плазмид, полученной после реакции рекомбинации проводили трансформацию компетентных клеток E. coli штамм Stbl3. Проводили выделение клоновых вариантов плазмидной ДНК из индивидуальных колоний E. coli. В результате электрофоретического анализа установлено, что потенциально два клоновых варианта плазмидной ДНК являются целевыми плазмидами pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA. Один из клонов плазмидной ДНК гидролизовали эндонуклеазами рестрикции XhoI, EcoRI, PstI и HindIII. В результате показано, что длина фрагментов ДНК, полученных после гидролиза, соответствует теоретическим длинам продуктов гидролиза. Правильность нуклеотидной последовательности рекомбинантной плазмиды были подтверждены секвенированием. Для дальнейшей работы данная плазмида была наработана и очищена от эндотоксинов при помощи набора «EndoFreePlasmidMaxiKit» («QIAGEN», Германия).Recombinant plasmid DNA pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA was obtained according to the scheme described above. At the first stage of the work, LR recombination was performed between the obtained plasmid DNA pEntry_HA-M1-NA (California / 04/2009) and plasmid DNA pLenti6.3 / TO / V5-DEST, then the competent E. cells were transformed with a mixture of plasmids obtained after the recombination reaction. coli strain Stbl3. Clonal plasmid DNA variants were isolated from individual E. coli colonies. As a result of electrophoretic analysis, it was found that potentially two clonal variants of plasmid DNA are the target plasmids pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA. One of the plasmid DNA clones was hydrolyzed with restriction endonucleases XhoI, EcoRI, PstI and HindIII. As a result, it was shown that the length of DNA fragments obtained after hydrolysis corresponds to the theoretical lengths of hydrolysis products. The correct nucleotide sequence of the recombinant plasmid was confirmed by sequencing. For further work, this plasmid was developed and purified from endotoxins using the EndoFreePlasmid MaxiKit kit (QIAGEN, Germany).

Результат электрофоретического разделения в 1.5% геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантной плазмиды pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA, эндонуклеазами рестрикции XhoI, EcoRI, PstI и HindIII. В таблице приведены теоретические длины фрагментов ДНК, образующихся после гидролиза соответствующими эндонуклеазами рестрикции.The result of electrophoretic separation in a 1.5% agarose gel of DNA fragments obtained after hydrolysis of the recombinant plasmid pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA, restriction endonucleases XhoI, EcoRI, PstI and HindIII. The table shows the theoretical lengths of DNA fragments formed after hydrolysis by the corresponding restriction endonucleases.

1: плазмида pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA, гидролизованная PstI;1: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA, hydrolyzed by PstI;

2: плазмида pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA, гидролизованная HindIII;2: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA, hydrolyzed with HindIII;

3: плазмида pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA, гидролизованная EcoRI;3: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA, hydrolyzed by EcoRI;

4: плазмида pLenti6.3/TO/HA(H1N1-Mich)-M1-NA, гидролизованная XhoI;4: plasmid pLenti6.3 / TO / HA (H1N1-Mich) -M1-NA hydrolyzed by XhoI;

Пример 4. Протоколы исследования физико-химических и молекулярно-биологических свойств лентивирусных векторовExample 4. Protocols for the study of physico-chemical and molecular biological properties of lentiviral vectors

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/HA(H1N1)-M1-NA, содержащей кассету генов НА, M1 и NA, провели LR рекомбинацию фирменной плазмидной ДНК pLenti6.3/TO/V5-DEST и синтезированной ранее плазмидной ДНК pEntry, содержащей кассету генов (фиг. 8 - Результат электрофоритического разделения в 1,5% геле агарозы независимых клонов плазмиды pLenti, содержащей кассету генов НА, M1 и NA:To obtain recombinant plasmid DNA pLenti6.3 / TO / HA (H1N1) -M1-NA containing the HA, M1, and NA gene cassette, LR recombination of the proprietary plasmid DNA pLenti6.3 / TO / V5-DEST and previously synthesized plasmid DNA pEntry containing the gene cassette (Fig. 8 - The result of electrophoretic separation in 1.5% agarose gel of independent clones of the plasmid pLenti containing the gene cassette HA, M1 and NA:

1-4, 6-8, 10, 11. Базовая плазмида pLenti6.3/TO/V5-DEST;1-4, 6-8, 10, 11. Base plasmid pLenti6.3 / TO / V5-DEST;

5-9. Независимые клоны плазмиды pLenti, содержащей кассету генов НА,M1 и NA;5-9. Independent clones of the plasmid pLenti containing the gene cassette HA, M1 and NA;

При отборе клонов с помощью ПЦР-анализа (праймеры CMV_upper и HA_lower - ПЦР-продукт длиной 1869 п.н.; праймеры NA_upper и V5 (С-term)_lower - ПЦР-продукт длиной 1538 п.н.) и расширенного рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз рестрикции XhoI, EcoRI, PstI и HindIII (таблица 2) выявили 2 целевых клона из 40 проанализированных (фиг. 9 - Результат электрофоритического разделения в 1,5% геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантной плазмиды pLenti, содержащей кассету генов НА (H1 N1), M1 и NА, эндонуклеазной рестрикции XhoI, EcoRI, PstI и HindIII (в скобках указаны длины образующихся фрагментов указаны в таблице 2):When selecting clones using PCR analysis (primers CMV_upper and HA_lower - PCR product with a length of 1869 bp; primers NA_upper and V5 (C-term) _lower - PCR product with a length of 1538 bp) and extended restriction analysis with Using restriction endonucleases XhoI, EcoRI, PstI, and HindIII (Table 2), 2 target clones of 40 analyzed were identified (Fig. 9 - Electrophoretic separation of DNA fragments obtained after hydrolysis of recombinant plasmid pLenti containing the HA gene cassette in 1.5% agarose gel). (H1 N1), M1 and NA, endonuclease restriction XhoI, EcoRI, PstI and HindIII (in parentheses are the lengths The resulting fragments are shown in table 2):

1,2. Независимые клоны плазмиды pLenti, содержащей кассету генов НА, M1 и NA, гидролизованной XhoI;1,2. Independent clones of the plasmid pLenti containing the gene cassette HA, M1 and NA, hydrolyzed by XhoI;

3,4. Независимые клоны плазмиды pLenti, содержащей кассету генов НА, M1 и NA, гидролизованной PstI;3.4. Independent clones of the plasmid pLenti containing the gene cassette HA, M1 and NA, hydrolyzed by PstI;

5,6. Независимые клоны плазмиды pLenti, содержащей кассету генов НА, M1 и NA, гидролизованной EcoRI;5,6. Independent clones of the plasmid pLenti containing the gene cassette HA, M1 and NA, hydrolyzed EcoRI;

7,8. Независимые клоны плазмиды pLenti, содержащей кассету генов НА, M1 и NA, гидролизованной HindIII;7.8. Independent clones of the plasmid pLenti containing the gene cassette HA, M1 and NA, hydrolyzed by HindIII;

Правильность нуклеотидной последовательности подтверждена секвенированием.The correctness of the nucleotide sequence is confirmed by sequencing.

Таким образом, был создан лентивирусный плазмидный вектор, несущий кассету генов гемагглютинина, нейраминидазы и белка M1 вируса гриппа A (H1N1pdm09), и экспрессирующей полипротеин, состоящий из белков НА (H1), NA (N1) и M1.Thus, a lentiviral plasmid vector was created that carried a cassette of the hemagglutinin, neuraminidase and M1 protein genes for influenza A virus (H1N1pdm09) and expressing a polyprotein consisting of HA (H1), NA (N1) and M1 proteins.

Плазмидная конструкция H1N1M1 включает в себя три участка белков вируса гриппа, соединенных вместе с помощью двух линкеров 2А. В результате достигается экспрессия одного длинного белка, который затем разделяется в процессе переработки на три функциональных белка. Эталонными последовательностями белков вируса гриппа являются:The H1N1M1 plasmid construct includes three sections of influenza virus proteins linked together using two 2A linkers. As a result, expression of one long protein is achieved, which is then divided into three functional proteins during processing. Reference sequences for influenza virus proteins are:

- Белок НА = H1: № банка генов ACS45035 (H1N1)- HA protein = H1: gene bank No. ACS45035 (H1N1)

- Белок NA = N1: № банка генов AGU92835 (H1N1)Protein NA = N1: Gene Bank No. AGU92835 (H1N1)

- Белок Ml = Ml: № банка генов ААТ70589 (H5N1)- Protein Ml = Ml: gene bank No. AAT70589 (H5N1)

Полученные три лентивирусных вектора использовались в дальнейшем для создания клеток-продуцентов вирусоподобных частиц (ВПЧ) вируса гриппа.The resulting three lentiviral vectors were subsequently used to create producer cells of virus-like particles (HPV) of the influenza virus.

В плазмидах используют следующие последовательности нуклеиновых/аминокислот:The following nucleic / amino acid sequences are used in plasmids:

SEQ ID NO: 1 - Последовательность гемагглютинина H1 ДНК;SEQ ID NO: 1 — Sequence of hemagglutinin H1 DNA;

SEQ ID NO: 2 - Последовательность нейраминидазы N1 ДНК;SEQ ID NO: 2 — Sequence of Neuraminidase N1 DNA;

SEQ ID NO: 3 - Последовательность белка М ДНК;SEQ ID NO: 3 - The sequence of protein M DNA;

SEQ ID NO: 4 - Последовательность нуклеиновых кислот гемагглютинина НА (H3N2) из штамма (H3N2);SEQ ID NO: 4 - The nucleic acid sequence of hemagglutinin HA (H3N2) from strain (H3N2);

SEQ ID NO:5 - Последовательность нуклеиновых гемагглютинина вируса гриппа В из штамма.SEQ ID NO: 5 - The sequence of the nucleic hemagglutinin of influenza virus B from strain.

Пример 5. Селекция линий клеток-продуцентов ВПЧ гриппа на основе клеточных линий высших млекопитающих (HEK293FT, Vero, MDCK). Создание промышленного штамма-продуцента для синтеза ВПЧ.Example 5. Selection of cell lines producing HPV influenza based on cell lines of higher mammals (HEK293FT, Vero, MDCK). Creation of an industrial producer strain for the synthesis of HPV.

Было использовано три упаковочных плазмиды, содержащих гены белков ВИЧ. Лентивирусный вектор - плазмида pLenti6.3 - доставляется в клетку мишень путем трансфекции комплексов с липофектамином, она содержит только неструктурные элементы генома ВИЧ. Отказ от использования упаковочных плазмид полностью исключает возможность формирования лентивирусной частицы.Three packaging plasmids containing HIV protein genes were used. The lentiviral vector, plasmid pLenti6.3, is delivered to the target cell by transfection of complexes with lipofectamine, it contains only non-structural elements of the HIV genome. Refusal to use packaging plasmids completely eliminates the possibility of the formation of lentiviral particles.

В качестве клеток-мишеней для трансдукции генами белков вируса гриппа были использованы клетки млекопитающих НЕК293FT, Vero и MDCK.The mammalian HEK293FT, Vero, and MDCK mammalian cells were used as target cells for transduction of influenza virus proteins by genes.

Культура клеток MDCK была выделена из клеток почки взрослой здоровой самки коккерспаниеля в 1958 году.The MDCK cell culture was isolated from the kidney cells of an adult healthy female Cocker Spaniel in 1958.

Культура клеток НЕК293 получена в начале 70-х годов в Нидерландах в результате трансформации нормальных клеток почки эмбриона человека генетическим материалом аденовируса 5-го типа, размер вставки вирусного генома в геном клетки составляет примерно 4500 п.н. Ген Е1А аденовируса экспрессируется в этих клетках и участвует в трансактивации некоторых вирусных промоторов, в связи с чем данные клетки продуцируют большое количество белка. Широкое использование клеток НЕК293 в научных целях связано с их высочайшей способностью к трансфекции, которая достигает эффективности 100%. Вариант клеток НЕК293FT содержит большой Т-антиген вируса SV40, который обеспечивает эписомальную репликацию плазмид, содержащих SV40ori сайт репликации. Это свойство обеспечивает высокий уровень амплификации трансфецированных плазмид внутри клеток 293FT и последующую временную экспрессию продукта целевого гена. Культура клеток НЕК293 широко не применяется при производстве вирусных вакцин.HEK293 cell culture was obtained in the early 70s in the Netherlands as a result of the transformation of normal human embryonic kidney cells with genetic material of type 5 adenovirus, the size of the insertion of the viral genome into the cell genome is approximately 4,500 bp The adenovirus E1A gene is expressed in these cells and is involved in the transactivation of certain viral promoters, and therefore these cells produce a large amount of protein. The widespread use of HEK293 cells for scientific purposes is associated with their highest transfection ability, which reaches an efficiency of 100%. The HEK293FT cell variant contains a large T-antigen of the SV40 virus, which provides episomal replication of plasmids containing the SV40ori replication site. This property provides a high level of amplification of transfected plasmids inside 293FT cells and subsequent transient expression of the target gene product. HEK293 cell culture is not widely used in the production of viral vaccines.

5.1. Методы трансфекции, трансдукции и протоколы описания процедуры5.1. Methods of transfection, transduction and protocols describing the procedure

5.1.1 Метод ФОЕ определения количества трансдуцирующих единиц иммунохимическим окрашиванием трансдуцированных клеток5.1.1 the method of determining the number of transducing units immunochemical staining of transduced cells

Монослой культуры клеток-мишеней, предназначенных для трансдукции, выращивается в 96-ти луночных планшетах в поддерживающей среде (ДМЕМД00 ед/мл пенецилина, 100 мкг/мл стрептомицина, 300 мкг/мл L-глютамин, 10 мкг/мл ДЕАЕ-декстрана (Sigma), 5 мкг/мл трипсина ТРСК). Отдельно в стерильных микропробирках готовятся 10-кратные серийные разведения суспензии псевдовируса путем добавления 50 мкл суспензии псевдовируса к 450 мкл разводящей поддерживающей среды. В лунки планшета с монослоем клеток MDCK вносятся 10-ти кратные разведения псевдовирусной суспензии. Каждое разведение псевдовируса вносится в 4 лунки по 100 мкл. Через 18 час инкубации в СO2 атмосфере при температуре 37°С удаляется среда из лунок и планшет 2 раза промывается ФБР. Добавляется по 100 мкл охлажденного ацетона (80%) на 10-15 мин, после чего ацетон удаляется, планшет ополаскивается дважды ФБР. Готовится разведение 1:5000 моноклональных антител к белку НА1 вируса гриппа А в ФБР, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.1% Твин 20, и по 100 мкл добавляется на 60 мин в каждую лунку, после чего лунки промываются 4 раза и покрываются аффинно очищенными конъюгированными пероксидазой хрена антителами козы против IgG мыши. Через 60 мин инкубации лунки промываются 4 раза, вносится раствор субстрата 3-amino-9-ethylcarbazole (АЕС). Через 30 мин инкубации субстратный раствор удаляется, планшет промывается 1 раз ФБР, и инфицированные клетки, окрашенные в розово-коричневый цвет, подсчитываются в инвертированном микроскопе. Количество трансдуцирующих единиц рассчитывается после усреднения количества фокусобразующих единиц (окрашенных инфекционных центров) по 4-м лункам по формуле Т=ФОЕ_Ср*10^N+1 ФОЕ/мл, где N - номер 10-кратного разведения псевдовируса, в котором проводился учет ФОБ.A monolayer of the culture of target cells intended for transduction is grown in 96-well plates in a support medium (DMEMD00 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 300 μg / ml L-glutamine, 10 μg / ml DEAE-dextran (Sigma ), 5 μg / ml trypsin TRSK). Separately, 10-fold serial dilutions of the pseudovirus suspension are prepared in sterile microtubes by adding 50 μl of the pseudovirus suspension to 450 μl of dilution support medium. 10-fold dilutions of the pseudovirus suspension are added to the wells of a plate with a monolayer of MDCK cells. Each dilution of the pseudovirus is introduced into 4 wells of 100 μl. After 18 hours of incubation in a CO2 atmosphere at a temperature of 37 ° C, the medium is removed from the wells and the plate is washed 2 times with the PBS. 100 μl of chilled acetone (80%) is added for 10-15 minutes, after which acetone is removed, the plate is rinsed twice with the FBI. A 1: 5000 dilution of monoclonal antibodies to the HA1 protein of influenza A virus is prepared in the FBI containing 1% bovine serum albumin and 0.1% Tween 20, and 100 μl is added for 60 min in each well, after which the wells are washed 4 times and covered with affinity purified horseradish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG antibodies. After 60 minutes of incubation, the wells are washed 4 times, a substrate solution of 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) is introduced. After 30 minutes of incubation, the substrate solution is removed, the plate is washed 1 time with the FBI, and infected pink-brown colored cells are counted in an inverted microscope. The number of transducing units is calculated after averaging the number of focus-forming units (stained infectious centers) over 4 wells according to the formula T = FOE _With p * 10 ^{N + 1} FOE / ml, where N is the number of 10-fold dilution of the pseudovirus in which FOB was counted .

5.1.2 Протокол описания процедуры получения клеток-продуцентов ВПЧ гриппа путем трансдукции клеток млекопитающих (HEK293FT, Vero, MDCK)5.1.2 Protocol describing the procedure for producing HPV influenza producing cells by transduction of mammalian cells (HEK293FT, Vero, MDCK)

Клетки млекопитающих (HEK293FT, Vero, MDCK), которые предполагается трансдуцировать, выращивают в полной питательной среде. В день трансдукции вынимают из никотемператрурного холодильника пробирку с псевдовирусом, оттаивают и, если необходимо, разбавляют до необходимой множественности заражения. Суспензию псевдовируса не взбалтывать. Удаляют культуральную среду с клеток, осторожно добавляют суспензию псевдовируса к монослою клеток. Для увеличения трансдуцирующей активности можно добавить Polybrene® до конечной концентрации до 10 мкг/мл. Аккуратно покачивают планшеклетками и инкубируют при 37°С в увлажненной 5% С02-атмосфере в течение ночи. На следующий день удаляют вируссодержащую суспензию и заменяют свежей полной питательной средой, продолжают инкубацию при 37°С в течение ночи. На следующий день удаляют питательную среду и заменяют ее на среду, содержащую бластицидин. Замену среды проводят каждые 3-4 дня до тех пор, пока устойчивые к антибиотикам колонии могут быть идентифицированы (обычно через 10-12 дней). Выбирают, по крайней, мере 5 устойчивых к антибиотикам колоний и каждую пересевают в отдельный культуральный флакон. После формирования монослоя проводят оценку продукции ВПЧ в супернатанте для каждого клона в реакции гемагглютинации (РГА) и в электронном микроскопе.Mammalian cells (HEK293FT, Vero, MDCK) to be transduced are grown in complete culture medium. On the day of transduction, the pseudovirus tube is removed from the nicotemperature refrigerator, thawed and, if necessary, diluted to the required multiplicity of infection. Do not shake up the suspension of the pseudovirus. The culture medium is removed from the cells, a suspension of pseudovirus is carefully added to the monolayer of cells. To increase transduction activity, Polybrene® can be added to a final concentration of up to 10 μg / ml. Gently shake the tablets and incubate at 37 ° C in a humidified 5% CO2 atmosphere overnight. The next day, the virus-containing suspension is removed and replaced with fresh complete nutrient medium, incubation is continued at 37 ° C overnight. The next day, the culture medium is removed and replaced with a medium containing blasticidin. The medium is replaced every 3-4 days until antibiotic-resistant colonies can be identified (usually after 10-12 days). At least 5 antibiotic-resistant colonies are selected and each is transferred to a separate culture vial. After the formation of the monolayer, HPV production in the supernatant is evaluated for each clone in the hemagglutination reaction (RGA) and in an electron microscope.

5.2 Методы оценки клеточных культур и имеющихся в них экспрессирующих конструкций (анализ экспрессии репортерного гена, интеграция генетической конструкции в геном клеток-мишеней) в производстве иммунобиологических препаратов5.2 Methods for evaluating cell cultures and their expression constructs (analysis of reporter gene expression, integration of the genetic construct into the genome of target cells) in the production of immunobiological preparations

5.2.1 Метод определения концентрации ВПЧ гриппа в реакции гемагглютинации5.2.1 Method for determining the concentration of influenza HPV in the hemagglutination reaction

Для постановки РГА используют 1%-ную суспензию отмытых эритроцитов петуха. Для приготовления суспензии отмытых эритроцитов используют 1 мл свежей крови петуха, к которой добавляется 9 мл ФБР, суспензия центрифугируется при 1200 об/мин, супернатант и осадок клеток «белой» крови удаляется, процедура повторяется еще 2 раза. Для получения 1%-ной суспензии эритроцитов из 1 мл крови необходимо отмытые эритроциты развести в 60 мл ФБР, что соответствует концентрации 60 ООО клеток/мл.For the production of RGA, a 1% suspension of washed rooster erythrocytes is used. To prepare a suspension of washed red blood cells, 1 ml of fresh blood of a rooster is used, to which 9 ml of FBI is added, the suspension is centrifuged at 1200 rpm, the supernatant and the sediment of white blood cells are removed, the procedure is repeated 2 more times. To obtain a 1% suspension of red blood cells from 1 ml of blood, the washed red blood cells must be diluted in 60 ml of the FBI, which corresponds to a concentration of 60,000 cells / ml.

В 96-луночные круглодонные планшеты добавляется по 50 мкл фосфатного буферного раствора (ФБР) в каждую лунку. Готовятся серийные двукратные разведения исследуемых образцов супернатанта культуры клеток-продуцентов ВПЧ гриппа, путем переноса 50 мкл пробы, из лунок последнего ряда удаляется 50 мкл. Во все лунки планшета добавляется по 50 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов петуха, планшет слегка покачивается для перемешивания проб в лунках, закрывается и инкубируется 60 мин при комнатной температуре, после чего проводится учет результатов агглютинации. Титром РГА считается наибольшее разведение исследуемой сыворотки, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов («зонтик»).In 96-well round-bottom plates, 50 μl of phosphate buffered saline (PBS) is added to each well. Serial twofold dilutions of the studied samples of the culture supernatant of the HPV influenza producing cells are prepared by transferring 50 μl of the sample, 50 μl is removed from the wells of the last row. 50 μl of a 1% suspension of rooster erythrocytes is added to all wells of the plate, the plate is slightly swayed to mix the samples in the wells, closed and incubated for 60 minutes at room temperature, after which the results of agglutination are recorded. The RGA titer is considered the largest dilution of the test serum, in which erythrocyte agglutination (“umbrella”) is observed.

5.2.2 Метод ФОЕ определения количества клеток, экспрессирующих репортерный (целевой) ген, иммунохимическим окрашиванием трансдуцированных клеток5.2.2 Method of FOE to determine the number of cells expressing the reporter (target) gene, immunochemical staining of transduced cells

Монослой культуры клеток-продуцентов ВПЧ гриппа выращивается в 96-ти луночных планшетах в поддерживающей среде (ДМЕМД00 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 300 мкг/мл L-глютамин, 10 мкг/мл ДЕАЕ-декстрана (Sigma), 5 мкг/мл трипсина ТРСК) путем инкубации в СO2 атмосфере при температуре 37°С. Удаляется среда из лунок и планшет 2 раза промывается ФБР. Добавляется по 100 мкл охлажденного ацетона (80%) на 10-15 мин, после чего ацетон удаляется, планшет ополаскивается дважды ФБР. Готовится разведение 1:5000 моноклональных антител к белку вируса гриппа в ФБР, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.1% Твин 20, и по 100 мкл добавляется на 60 мин в каждую лунку, после чего лунки промываются 4 раза и покрываются аффинно очищенными конъюгированными пероксидазой хрена антителами козы против IgG мыши. Через 60 мин инкубации лунки промываются 4 раза, вносится раствор субстрата 3-amino-9-ethylcarbazole (АБС). Через 30 мин инкубации субстратный раствор удаляется, планшет промывается 1 раз ФБР, и трансдуцированные клетки, окрашенные в розово-коричневый цвет, подсчитываются в инвертированном микроскопе.A monolayer culture of influenza HPV producing cells is grown in 96-well plates in a support medium (DMEMD00 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 300 μg / ml L-glutamine, 10 μg / ml DEAE-dextran (Sigma), 5 μg / ml trypsin TRSC) by incubation in a CO2 atmosphere at a temperature of 37 ° C. The medium is removed from the wells and the plate is washed 2 times with the FBI. 100 μl of chilled acetone (80%) is added for 10-15 minutes, after which acetone is removed, the plate is rinsed twice with the FBI. A 1: 5000 dilution of monoclonal antibodies to the influenza virus protein is prepared in the FBI containing 1% bovine serum albumin and 0.1% Tween 20, and 100 μl is added for 60 min to each well, after which the wells are washed 4 times and covered with affinity purified conjugated peroxidase horseradish goat antibodies against mouse IgG. After 60 minutes of incubation, the wells are washed 4 times, a substrate solution of 3-amino-9-ethylcarbazole (ABS) is introduced. After 30 minutes of incubation, the substrate solution is removed, the plate is washed once with PBS, and the transduced pink-brown colored cells are counted in an inverted microscope.

5.2.3 Метод электронной микроскопии клеток-продуцентов ВПЧ гриппа5.2.3 Electron microscopy method for producing HPV influenza cells

Образцы клеток-продуцентов ВПЧ гриппа фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида при +4°С в течение 48 ч. Затем, дополнительно фиксировали 1%-ным раствором осмиевой кислоты, обезвоживали по стандартной методике в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы готовили на микротоме Райхерт-Янг (Австрия). Полученные срезы и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Ультратонкие срезы исследовали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония), фотосъемку и анализ изображения проводили с помощью встроенной цифровой камеры Veleta (SIS, Германия) и программного пакета iTEM (SIS, Германия).Samples of HPV influenza producing cells were fixed in a 4% solution of paraformaldehyde at + 4 ° C for 48 hours. Then, they were additionally fixed with a 1% solution of osmium acid, dehydrated according to standard methods in increasing concentration of ethyl alcohol and acetone, and poured into the mixture of epon-araldite. Ultrathin sections were prepared on a Reichert-Young microtome (Austria). The obtained sections were contrasted with uranyl acetate and lead citrate. Ultrathin sections were examined with a JEM 1400 electron microscope (Jeol, Japan), photographing and image analysis were performed using the built-in digital camera Veleta (SIS, Germany) and the iTEM software package (SIS, Germany).

5.2.4 Метод ПЦР для определения целевых генов НА, NA, интегрированных в геном клеток-продуцентов5.2.4 PCR Method for Determining Target HA, NA Genes Integrated in the Genome of Producer Cells

Для выделения клеточных ядер клетки соскабливаются с монослоя, примерно 10⁶-10⁷ клеток, промываются в холодном ФБР дважды, используя центрифугирование при 1500 об/мин. Осадок клеток ресуспендируют в 500 мкл гипотонического буферного раствора, пипетируя несколько раз, и инкубируют на льду в течение 15 минут (20 mM Tris-HCl, рН 7.4, 10 mМ NaCl, 3 mМ MgCl₂). Добавляется 25 мкл детергента (10% NP4O) и встряхивается на вортексе 10 секунд. После чего гомогенат центрифугируют в течение 10 минут при 10000 об/мин при 4°С, супернатант удаляют, а осадок, содержащий ядерную фракцию, используют для экстракции геномной ДНК клеток-продуцентов.To isolate cell nuclei, cells are scraped off from a monolayer, approximately 10 ⁶ -10 ⁷ cells, washed twice in a cold FBI, using centrifugation at 1500 rpm. The cell pellet was resuspended in 500 μl of hypotonic buffer solution, pipetting several times, and incubated on ice for 15 minutes (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl ₂ ). 25 μl of detergent (10% NP4O) is added and vortexed for 10 seconds. After that, the homogenate is centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm at 4 ° C, the supernatant is removed, and the precipitate containing the nuclear fraction is used to extract the genomic DNA of producer cells.

Экстракция геномной ДНК из ядерной фракции клеток-продуцентов ВПЧ гриппа проводится с использованием набора реагентов «АмплиСенс РИБО-сорб». Добавяют в пробирки по 450 мкл лизирующего раствора. Вносят в пробирки с лизирующим раствором по 100 мкл исследуемых образцов клеток-продуцентов, используя для каждого образца отдельный наконечник с фильтром. Перемешивают пипетированием. Инкубируют при комнатной температуре 3 мин. Плотно закрыв крышки, тщательно перемешивают на вортексе. Осаждают капли на вортексе. Помещают пробирки в термостат с температурой 60°С на 10 мин. Перемешивают, затем осаждают капли на вортексе. Ресуспендируют сорбент, интенсивно перемешивая на вортексе. Добавляют в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента, плотно закрывают крышки. Перемешивают на вортексе, ставят в штатив на 1 мин, еще раз перемешивают и оставляют в штативе на 5 мин. Центрифугируют пробирки на микроцентрифуге в течение 1 мин при 7000 g. Не захватывая сорбент, удаляют надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником без фильтра на 200 мкл, используя вакуумный отсасыватель. Добавляют в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки, плотно закрывают крышки, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугируют пробирки на микроцентрифуге в течение 30 с при 7000 g. Не захватывая сорбент, удаляют надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником без фильтра на 200 мкл, используя вакуумный отсасыватель. Добавляют в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки, плотно закрывают крышки, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Центрифугируют пробирки на микроцентрифуге в течение 30 с при 7000 g. Не захватывая сорбент, удаляют надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником без фильтра на 200 мкл, используя вакуумный отсасыватель. Повторяют процедуру отмывки. Помещают пробирки с открытыми крышками в термостат с температурой 60°С на 15 мин для подсушивания сорбента. Добавляют в пробирки по 50 мкл буфера для элюции А. Перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Помещают в термостат с температурой 60°С на 5 мин. Допускается увеличение объема элюции до 120 мкл. Центрифугируют пробирки на микроцентрифуге в течение 2 мин при 12 тыс g. Надосадочная жидкость содержит очищенные ДНК. Пробы готовы к постановке реакции ПЦР.Genomic DNA is extracted from the nuclear fraction of HPV influenza producing cells using the AmpliSens RIBO-sorb reagent kit. 450 μl of lyse solution are added to the tubes. Pipette 100 μl of test samples of producer cells into test tubes with a lysing solution using a separate filter tip for each sample. Mix by pipetting. Incubate at room temperature for 3 minutes. Tightly closing the lids, mix thoroughly on a vortex. Precipitated drops on a vortex. Place the tubes in a thermostat with a temperature of 60 ° C for 10 minutes. Mix, then precipitate drops on a vortex. Resuspend the sorbent, vigorously mixing on a vortex. 25 μl of a resuspended sorbent is added to each tube with a separate tip, and the caps are tightly closed. Mix on a vortex, put in a tripod for 1 min, mix again and leave in a tripod for 5 minutes. Centrifuge the tubes in a microcentrifuge for 1 min at 7000 g. Without capturing the sorbent, remove the supernatant from each tube with a separate tip without a 200 μl filter, using a vacuum aspirator. Add 400 μl of washing solution to the tubes, close the lids tightly, mix on a vortex until the sorbent is fully resuspended. Centrifuge the tubes in a microcentrifuge for 30 s at 7000 g. Without capturing the sorbent, remove the supernatant from each tube with a separate tip without a 200 μl filter, using a vacuum aspirator. Add 400 μl of washing solution to the tubes, close the lids tightly, mix on a vortex until the sorbent is fully resuspended. Centrifuge the tubes in a microcentrifuge for 30 s at 7000 g. Without capturing the sorbent, remove the supernatant from each tube with a separate tip without a 200 μl filter, using a vacuum aspirator. Repeat the washing procedure. Place the tubes with open caps in a thermostat with a temperature of 60 ° C for 15 minutes to dry the sorbent. 50 μl of elution buffer A are added to the tubes. Vortex is mixed until the sorbent is fully resuspended. They are placed in a thermostat with a temperature of 60 ° C for 5 minutes. Allowed to increase the volume of elution to 120 μl. Centrifuge the tubes in a microcentrifuge for 2 min at 12 thousand g. The supernatant contains purified DNA. Samples are ready for the PCR reaction.

Проведение ПЦР-амплификации с детекцией в режиме «реального времени» осуществляется на наборах реагентов производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Общий объем реакционной смеси - 30 мкл, включая объем пробы клеточной ДНК - 10 мкл. Отбирают необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-FL для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. На поверхность воска вносят по 10 мкл ПЦР-буфера-А, при этом он не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-FL. В подготовленные пробирки вносят по 10 мкл проб ДНК. Ставят контрольные реакции. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплектов реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы ДНК - 10 мкл. Размораживают необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-FL. Перемешивают содержимое пробирок с ПЦР-смесью-FL, ПЦР-буфером-В и полимеразой (TaqF) и осаждают капли кратковременным центрифугированием (1-2 с) с помощью центрифуги/вортекса. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации к ДНК исследуемых и контрольных проб. Для проведения N реакций смешивают в отдельной пробирке 10*(N+1) мкл ПЦР-смеси-FL, 5*(N+1) мкл ПЦР-буфера-В, и 0,5*(N+1) MKN полимеразы (TaqF). Перемешивают подготовленную смесь на вортексе и осаждают капли кратковременным центрифугированием с помощью центрифуги/вортекса. Вносят в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной смеси. В подготовленные пробирки вносят по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК. Ставят контрольные реакции. Проведение амплификации с детекцией осуществляется в режиме «реального времени». Следует запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени») для выполнения амплификации и детекции флуоресцентного сигнала в соответствии с инструкцией к набору реагентов, учитывая рекомендованные каналы для флуорофоров. Установливают пробирки в ячейки реакционного модуля прибора. Перед установкой в амплификатор планшетного типа необходимо осадить капли со стенок пробирок кратковременным (1-3 с) центрифугированием на центрифуге/вортексе. Запускают выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала. По окончании выполнения программы приступают к анализу и интерпретации результатов.Real-time PCR amplification with detection is carried out on reagent kits manufactured by the Central Research Institute of Epidemiology of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare. The total volume of the reaction mixture is 30 μl, including the sample volume of cell DNA is 10 μl. The required number of tubes with the PCR mixture-FL is selected to amplify the DNA of the studied and control samples. On the surface of the wax, 10 μl of PCR buffer A is added, and it should not fall through the wax and mix with the PCR mixture-FL. 10 μl of DNA samples are added to the prepared tubes. They put control reactions. Preparation of tubes for amplification using PCR-kit reagent kits option FRT-50 F. The total volume of the reaction mixture is 25 μl, including the volume of DNA sample - 10 μl. Defrost the required number of tubes with PCR mixture-FL. The contents of the tubes are mixed with PCR mixture-FL, PCR buffer-B and polymerase (TaqF) and the droplets are precipitated by short-time centrifugation (1-2 s) using a centrifuge / vortex. Select the required number of tubes or strips for amplification to the DNA of the studied and control samples. To conduct N reactions, 10 * (N + 1) μl of PCR mixture-FL, 5 * (N + 1) μl of PCR buffer-B, and 0.5 * (N + 1) MKN polymerase (TaqF) are mixed in a separate tube ) Mix the prepared mixture on a vortex and precipitate drops by short-term centrifugation using a centrifuge / vortex. Pipette 15 μl of the prepared mixture into each tube. 10 μl of cDNA obtained in the RNA reverse transcription reaction is added to the prepared tubes. They put control reactions. Amplification with detection is carried out in the "real time" mode. You should program the device (an amplifier with a real-time detection system) to perform amplification and detection of the fluorescent signal in accordance with the instructions for the reagent kit, taking into account the recommended channels for fluorophores. Set the tubes in the cells of the reaction module of the device. Before installation in a plate type amplifier, it is necessary to precipitate droplets from the walls of the tubes by short-term (1-3 s) centrifugation on a centrifuge / vortex. Run the amplification program with the detection of the fluorescent signal. At the end of the program, they begin to analyze and interpret the results.

Результаты. Протоколы исследования полученных клеточных культур-продуцентовResults. The research protocols of the obtained cell cultures-producers

5.3.2.1 Анализ продукции ВПЧ гриппа клонами H1N1M1 методом электронной микроскопии5.3.2.1 Electron microscopy analysis of HPV production of influenza H1N1M1 clones

Дальнейшее подтверждение максимальной продуктивности ВПЧ в клетках MDCK было получено при проведении исследований культур клеток MDCK и HEK-293FT на наличие вирусоподобных частиц (ВПЧ) методом электронной микроскопии. На ультратонких срезах клетки имеют крупные ядра и полный набор цитоплазматических органоидов, отличительной особенностью морфологии клеток MDCK является наличие большого количества эндосомальных структур, формирование многочисленных выростов цитоплазмы разнообразной формы и микроворсинок. Клетки сохраняют эпителиоидный тип строения. В ядрах некоторых клеток выявляются агрегаты электронно-плотных частиц, придающие ядру «пятнистый» вид (фиг. 10 - В ядре клеток MDCK (верхний рисунок) обнаруживаются электронно-плотные зернистые включения (стрелка), придающие ему «пятнистый» вид, характерный для пораженных вирусом гриппа клеток. Продукция ВПЧ в клетках HEK293FT значительно менее выражена по сравнению с клетками MDCK (нижний рисунок)).Further confirmation of the maximum HPV productivity in MDCK cells was obtained by examining the presence of virus-like particles (HPV) in MDCK and HEK-293FT cell cultures by electron microscopy. On ultrathin sections, cells have large nuclei and a complete set of cytoplasmic organoids, a distinctive feature of the morphology of MDCK cells is the presence of a large number of endosomal structures, the formation of numerous outgrowths of the cytoplasm of various shapes and microvilli. Cells retain the epithelioid type of structure. In the nuclei of some cells, aggregates of electron-dense particles are identified, giving the nucleus a “spotted” appearance (Fig. 10 - In the nucleus of MDCK cells (upper figure), electron-dense granular inclusions (arrow) are found, giving it a “spotted” appearance characteristic of the affected cell influenza virus: HPV production in HEK293FT cells is significantly less pronounced compared to MDCK cells (bottom figure)).

На поверхности и в окружающем пространстве примерно 40% клеток MDCK и 5% клеток HEK293FT обнаруживаются частицы, морфологически напоминающие вирус гриппа (фиг. 10). Различаются два типа вирусоподобных частиц: сферические и нитевидные (фиг. 11 - Основные морфологические формы вирусоподобных частиц: сферические 9 белая стрелка) и нитевидные (черная стрелка) в клетках MDCK). Нитевидная форма частиц преобладает. Кроме того, в некоторых участках обнаруживаются группы частиц, имеющих плеоморфную форму (фиг. 12 - Разнообразные формы вирусоподобных частиц (стрелки) в клетках MDCK).On the surface and in the surrounding area of approximately 40% of MDCK cells and 5% of HEK293FT cells, particles morphologically resemble the influenza virus are detected (Fig. 10). Two types of virus-like particles are distinguished: spherical and filiform (Fig. 11 - The main morphological forms of virus-like particles: spherical 9 white arrow) and filiform (black arrow) in MDCK cells). The filamentous form of particles prevails. In addition, groups of particles having a pleomorphic shape are found in some areas (Fig. 12 - Various forms of virus-like particles (arrows) in MDCK cells).

Размер сферических частиц типичен для вируса гриппа и составляет 80-120 нм, нитевидные ВПЧ диаметром 90-100 нм и длиной (на срезах) до микрометра. Вирусоподобные частицы имеют хорошо выраженную мембранную оболочку, на которой видны шипики (spikes) длиной приблизительно 15 нм и диаметром около 5 нм. Характерной особенностью являлось значительное, по сравнению с типичным для вируса гриппа, снижение электронной плотности внутренней части «вириона», соответствующей расположению вирусного генома.The size of the spherical particles is typical for the influenza virus and is 80-120 nm, filiform HPV with a diameter of 90-100 nm and a length (on sections) up to a micrometer. Virus-like particles have a well-defined membrane membrane, on which spikes are visible with a length of approximately 15 nm and a diameter of about 5 nm. A characteristic feature was a significant decrease in the electron density of the inner part of the “virion” corresponding to the location of the viral genome, compared with the typical influenza virus.

Около 10% клеток в культуре повреждены, в них накапливались многочисленные аутофагосомы, прослеживалось уплотнение хроматина, фрагментация ядер и формирование апоптозных телец. Гибель клеток путем апоптоза была основной (фиг. 13 - Апоптоз клетки MDCK. Многочисленные ВПЧ вокруг и на поверхности гибнущей клетки).About 10% of the cells in the culture are damaged, numerous autophagosomes accumulated in them, chromatin compaction, fragmentation of nuclei, and the formation of apoptotic bodies were traced. Cell death by apoptosis was the main (Fig. 13 - MDCK cell apoptosis. Numerous HPVs around and on the surface of the dying cell).

Результаты проведенного исследования методом электронной микроскопии показывают, что морфология вирусоподобных частиц в культуре клеток MDCK и НЕК-293FT принципиально не отличается от морфологии вируса гриппа, культивированного на тех же культурах клеток. Особенностью строения ВПЧ является снижение электронной плотности их внутренней части.The results of the study by electron microscopy show that the morphology of virus-like particles in the cell culture of MDCK and HEK-293FT is not fundamentally different from the morphology of the influenza virus cultured on the same cell cultures. A feature of the structure of HPV is a decrease in the electron density of their inner part.

Пример 6. Протоколы определения в ПЦР целевых генов HI, N1, интегрированных в геном клетки-продуцентаExample 6. Protocols for determining in PCR target genes HI, N1, integrated into the genome of the producer cell

В таблицах 3, 4, приведены результаты ПЦР детекции наличия целевых генов HI, N1, соответственно, в ядерной фракции клеток-продуцентов ВПЧ. Измеренное пороговое значение Ct для пяти изученных клонов существенно меньше значения, выявляемого для положительного контрольного образца, что указывает на наличие встроенных генов вируса гриппа в геном клетки-продуцента. Основываясь на данных о максимальной продуктивности ВПЧ гриппа на культуре MDCK, определение в ПЦР целевых генов было выполнено только для этой культуры.Tables 3, 4 show the results of PCR detection of the presence of target genes HI, N1, respectively, in the nuclear fraction of HPV producing cells. The measured threshold value Ct for the five studied clones is significantly less than the value detected for a positive control sample, which indicates the presence of built-in genes of the influenza virus in the genome of the producer cell. Based on data on the maximum productivity of HPV influenza on an MDCK culture, the determination of target genes in PCR was performed only for this culture.

Таким образом, приведенные результаты ПЦР диагностики клеточной ДНК свидетельствуют об интеграции генов вируса гриппа в геном изученных клонов клеток-продуцентов ВПЧ.Thus, the results of PCR diagnostics of cell DNA indicate the integration of influenza virus genes into the genome of the studied clones of HPV producing cells.

Далее в качестве клеток-мишеней для трансдукции генов вируса гриппа использовали только клетки MDCK, которые продемонстрировали максимальную продуктивность среди трех изученных линий клеток млекопитающих - НЕК293FT, Vero и MDCK. В качестве лентивирусного вектора использовалась только плазмида pLenti6.3, три упаковочные плазмиды не использовались. На этом этапе для получения клеток продуцентов ВПЧ вируса гриппа субтипов A(H1N1) и A(H3N2) и типа В использовали три векторных плазмиды pLenti6.3/TO/HA(H1N1)-M1-NA, pLenti6.3/TO/HA(H3N2)-M1-NA, pLenti6.3/TO/HA(B-Phuket)-M1-NA, структура которых описана выше.Further, only MDCK cells were used as target cells for the transduction of influenza virus genes, which showed maximum productivity among the three studied mammalian cell lines — HEK293FT, Vero, and MDCK. As the lentiviral vector, only the plasmid pLenti6.3 was used; three packaging plasmids were not used. At this stage, three vector plasmids pLenti6.3 / TO / HA (H1N1) -M1-NA, pLenti6.3 / TO / HA (3) were used to obtain cells of HPV producers of influenza virus subtypes A (H1N1) and A (H3N2) and type B. H3N2) -M1-NA, pLenti6.3 / TO / HA (B-Phuket) -M1-NA, the structure of which is described above.

Протокол описания процедуры получения клеток-продуцентов.Protocol describing the procedure for producing producer cells.

За день до проведения трансфекции проводится посев 1-3*10⁵ клеток MDCK на культуральный флакон Т25. Согласно протоколу для трансфецирующего реагента Липофектамин 2000, готовится смесь плазмиды и трансфектанта в 200 мкл поддерживающей среды и инкубируется при комнатной температуре 10-15 минут. После этого однократно промывается монослой клеток фосфатным буферным раствором и наносится приготовленный комплекс липофектамина и плазмиды на монослой клеток. Инкубация осуществляется в термостате (37°С) в течение 3 часов, после чего в культуральный флакон добавляется 5 мл поддерживающей среды. На 3 - сутки после трансфекции монослой клеток пересевается в несколько 24-луночных планшетов. Через 3, 5, 7 и 9 суток инкубации планшетов атмосфере СО₂ при 37°С из каждой лунки забирается аликвота питательной среды для оценки продукции ВПЧ в РГА. Лунка, в которой наблюдается наибольший уровень продукции рассевается предельными разведениями в несколько 96-луночных планшетов. Через 1-2 недели выбирается 10-15 клонов с максимальной продукцией по РГА.The day before transfection, 1-3 * 10 ⁵ MDCK cells are plated on a T25 culture flask. According to the protocol for the transfecting reagent Lipofectamine 2000, a mixture of plasmid and transfectant is prepared in 200 μl of maintenance medium and incubated at room temperature for 10-15 minutes. After this, the cell monolayer is washed once with a phosphate buffer solution and the prepared complex of lipofectamine and plasmid is applied to the cell monolayer. Incubation is carried out in a thermostat (37 ° C) for 3 hours, after which 5 ml of support medium is added to the culture vial. On the 3rd day after transfection, the monolayer of cells is transplanted into several 24-well plates. After 3, 5, 7, and 9 days of incubation of the plates in a CO ₂ atmosphere at 37 ° C, an aliquot of the nutrient medium was taken from each well to evaluate the production of HPV in the RGA. The hole in which the highest level of production is observed is seeded by limiting dilutions into several 96-well plates. After 1-2 weeks, 10-15 clones with maximum production by RGA are selected.

Каждый из выбранных клонов рассевается в несколько лунок 96-луночного планшета, проводится подтверждение наличия продуктов экспрессии всех трех генов методом иммунохимического окрашивания монослоя. Выбранные несколько клонов с максимальной продукцией ВПЧ рассеваются на флаконы, проводится оценка продукции ВПЧ методом электронной микроскопии. Выбирается наиболее продуктивный по данным РГА, иммунохимического окрашивания и электронной микроскопии клон, который рассевается на флаконы 75 см², и суспензия клеток передается для формирования банка клеток продуцентов ВПЧ вируса гриппа. Клоны, выделенные селекцией предельными разведениями, сохраняли свою способность продуцировать ВПЧ гриппа на том же уровне, что и в случае трансдукции лентивирусными псевдовирусами. В таблице 5 приведены результаты оценки продуктивности ВПЧ пятнадцати клонов MDCK.Each of the selected clones is seeded into several wells of a 96-well plate, and the presence of expression products of all three genes is confirmed by immunochemical staining of the monolayer. Selected several clones with maximum HPV production are scattered into vials, and HPV production is evaluated by electron microscopy. The most productive clone is selected according to the RGA, immunochemical staining and electron microscopy, which is scattered on 75 cm ² vials, and the cell suspension is transmitted to form a cell bank of influenza virus HPV producers. Clones isolated by limiting dilutions retained their ability to produce HPV influenza at the same level as in the case of transduction with lentiviral pseudoviruses. Table 5 shows the results of the HPV productivity assessment of the fifteen MDCK clones.

Пять клонов, трансфецированных плазмидой pLenti6.3/TO/HA(HlNl)-Ml-NA, продуцируют ВПЧ с титром в диапазоне от 1:16 до 1:64. ВПЧ вируса гриппа субтипа A(H3N2) нарабатываются с большей гемагглютинирующей активностью, титр в РГА варьирует от 1:32 до 1:128. Наименьшую продуктивность показали пять клонов, трансфецированных плазмидой pLenti6.3/TO/HA(B-Phuket)-M1-NA. Таким образом, клоны клеток-продуцентов ВПЧ, полученные из клеток MDCK путем трансфекции одной векторной плазмидой, сохраняют продуктивность по ВПЧ близкую к таковой на клонах, полученных в результате инфицирования лентивирусными псевдовирусами.Five clones transfected with plasmid pLenti6.3 / TO / HA (HlNl) -Ml-NA produce HPV with a titer in the range from 1:16 to 1:64. HPV of the influenza virus subtype A (H3N2) is produced with greater hemagglutinating activity, the titer in the RGA varies from 1:32 to 1: 128. Five clones transfected with plasmid pLenti6.3 / TO / HA (B-Phuket) -M1-NA showed the least productivity. Thus, clones of HPV producing cells obtained from MDCK cells by transfection with a single vector plasmid retain HPV productivity similar to that of clones obtained as a result of infection with lentiviral pseudoviruses.

Проведенное исследование показало возможность получения высокопродуктивных по ВПЧ гриппа клонов клеток MDCK без использования лентивирусных псевдовирусных частиц в качестве системы доставки целевого гена в геном клетки-мишени.The study showed the possibility of obtaining highly productive HPV flu influenza MDCK cell clones without the use of lentiviral pseudovirus particles as a system for delivering the target gene to the genome of the target cell.

На первом этапе исследования по результатам иммунохимического окрашивания было установлено, что 99,5-99,9% клеток, подвергнутых трехкратной ко-инфекции псевдовирусами, содержали продукты экспрессии генов гемагглютинина, нейраминидазы и белка M1. Исследованные клоны культур клеток MDCK, Vero и НЕК293FT, трансдуцированных с помощью лентивирусных псевдовирусов генами гемагглютинина, нейраминидазы и белка M1 вируса гриппа A(H1N1) демонстрировали наличие продукции ВПЧ гриппа, определяемой в РГА супернатанта этих клеток. Только в составе ВПЧ молекулы гемагглютинина способны обеспечить поливалентность конструкции по отношению к сиалозидам на мембране эритроцита и вызвать агглютинацию последних.At the first stage of the study, according to the results of immunochemical staining, it was found that 99.5-99.9% of cells subjected to triple co-infection with pseudoviruses contained the expression products of the hemagglutinin, neuraminidase and M1 protein genes. The studied clones of MDCK, Vero, and HEK293FT cell cultures transduced with lentiviral pseudoviruses with the genes hemagglutinin, neuraminidase, and influenza A (H1N1) M1 protein showed the presence of influenza HPV production determined in the RGA of the supernatant of these cells. Only in the composition of HPV hemagglutinin molecules are able to ensure the polyvalency of the construct with respect to sialosides on the erythrocyte membrane and cause the agglutination of the latter.

Также исследования показали, что клетки MDCK являются наилучшими продуцентами ВПЧ вируса гриппа, обеспечивая достижение титра ВПЧ в РГА в диапазоне от 1:64 до 1:256, тогда как клоны, полученные из клеток HEK293FT и Vero, характеризуются низкой продуктивностью. Результаты проведенного исследования методом электронной микроскопии показывают, что морфология вирусоподобных частиц, продуцируемых в культуре клеток MDCK и HEK-293FT, принципиально не отличается от морфологии вируса гриппа. На поверхности и в окружающем пространстве примерно 40% клеток MDCK и 5% клеток HEK293FT обнаруживаются частицы, морфологически напоминающие вирус гриппа. Различаются два типа вирусоподобных частиц: сферические и нитевидные. Особенностью строения ВПЧ является снижение электронной плотности их внутренней части. Результаты исследования клеточной ДНК клеток MDCK методом ПЦР свидетельствуют об интеграции генов вируса гриппа в геном изученных клонов клеток-продуцентов ВПЧ.Studies have also shown that MDCK cells are the best producers of HPV for the influenza virus, providing an HPV titer of RGA in the range of 1:64 to 1: 256, while clones derived from HEK293FT and Vero cells are characterized by low productivity. The results of the study by electron microscopy show that the morphology of the virus-like particles produced in the culture of MDCK and HEK-293FT cells is not fundamentally different from the morphology of the influenza virus. On the surface and in the surrounding area of approximately 40% of MDCK cells and 5% of HEK293FT cells, particles are morphologically reminiscent of the influenza virus. Two types of virus-like particles are distinguished: spherical and filiform. A feature of the structure of HPV is a decrease in the electron density of their inner part. The results of the study of cellular DNA of MDCK cells by PCR indicate the integration of influenza virus genes into the genome of the studied clones of HPV producing cells.

5.4 Методы контроля качества культуры клеток-продуцентов и ВПЧ гриппа5.4 Methods of quality control of the culture of producer cells and HPV flu

Д ля контроля качества культур клеток-продуцентов были выбраны двенадцать клонов по интенсивности продукции НА и характеристикам роста. Эти клоны были обозначены как: 5Е4, 7F4, 10С12, 10Е7, 3С5, 6D6, 9В3, 5G75G7, 6D12,1F1. Часть популяции каждого клона подвергалась криоконсервации, а другая часть культивировалась для дальнейшего анализа ВПЧ гриппа.To control the quality of producer cell cultures, twelve clones were selected according to the intensity of NA production and growth characteristics. These clones were designated as: 5E4, 7F4, 10C12, 10E7, 3C5, 6D6, 9B3, 5G75G7, 6D12,1F1. Part of the population of each clone was cryopreserved, and the other part was cultured for further analysis of the HPV flu.

Белки ВПЧ гриппа разделялись на 4-12% геле Bis-Tris с буфером из морфолинпропансульфоновой кислоты (далее IX MOPS) (реагенты Invitrogen). Гель переносился на мембраны из ПВДФ и блокировался. В Таблице 7 перечислены реагенты и концентрации, которые использовались для обнаружения белков вируса гриппа с помощью вестерн-блоттинга.The HPV flu proteins were separated on a 4-12% Bis-Tris gel with morpholine propanesulfonic acid buffer (hereinafter IX MOPS) (Invitrogen reagents). The gel was transferred to PVDF membranes and blocked. Table 7 lists the reagents and concentrations that were used to detect influenza virus proteins by Western blotting.

На фиг. 14А и 14Б - показаны результаты анализа экспрессии НА клонами-кандидатами методом вестерн-блоттиига. Отрицательный контроль (лизат клеток MDCK, не подвергнутых трансдукции) использовался для выявления неспецифического связывания антител. Ожидаемая молекулярная масса белка НА после лизирования составляет примерно 80 кДа (показано стрелкой). Ожидаемая масса нелизированного полипротеина составляет примерно 140 кДа. Отрицательный контроль - лизат клеток MDCK демонстрирует неспецифическое связывание. Отрицательный контроль использовался для выявления неспецифического связывания антител. Отрицательный контроль - лизат клеток MDCK демонстрирует неспецифическое связывание, и полоса положительного контроля NA свидетельствует об активном связывании антител. Белки, синтезированные в клетках MDCK, гликозилированы, поэтому они будут подниматься выше, чем негликозилированные белки. На фиг. 15А - показана активная экспрессия НА клонами-кандидатами 1F1, ЗС5, 5G7, а на фиг. 15Б - показана активная экспрессия NA клоном-кандидатом 6D12. На фиг. 16А и 16Б показаны результаты анализа экспрессии M1 клонами-кандидатами методом вестерн-блоттинга. Отрицательный контроль (лизат клеток MDCK, не подвергнутых трансдукции) использовался для выявления неспецифического связывания антител. Ожидаемая молекулярная масса обработанного белка M1 составляет примерно 25 кДа (показано стрелкой). На фиг. 16А показана активная экспрессия M1 клонами-кандидатами ЗС5, 6D6 и слабая экспрессия M1 клонами-кандидатами 1F1 и 5G7. Отрицательный контроль клон 7 MDCK демонстрирует неспецифическое связывание. Вместе с тем, видны массивные полосы нелизированного белка. Это может быть связано с тем, что обработка белков трансфецированной базовой клеточной линии может быть неэффективной. На фиг. 16Б показана активная экспрессия M1 клоном-кандидатом 6D12. Отрицательный контроль лизат клеток MDCK демонстрирует отсутствие специфического связывания.In FIG. 14A and 14B show the results of analysis of HA expression by candidate clones by Western blotting method. A negative control (lysate of non-transduced MDCK cells) was used to detect non-specific antibody binding. The expected molecular weight of HA protein after lysis is approximately 80 kDa (arrow). The expected mass of non-lysed polyprotein is approximately 140 kDa. Negative control - MDCK cell lysate shows non-specific binding. A negative control was used to detect non-specific antibody binding. Negative control - MDCK cell lysate shows non-specific binding, and the NA positive control band indicates active antibody binding. The proteins synthesized in MDCK cells are glycosylated, so they will rise higher than non-glycosylated proteins. In FIG. 15A shows the active expression of HA by candidate clones 1F1, 3C5, 5G7, and in FIG. 15B - Active expression of NA by candidate clone 6D12 is shown. In FIG. 16A and 16B show the results of an analysis of M1 expression by candidate clones by Western blotting. A negative control (lysate of non-transduced MDCK cells) was used to detect non-specific antibody binding. The expected molecular weight of the processed M1 protein is approximately 25 kDa (arrow). In FIG. 16A shows active expression of M1 by candidate clones ZC5, 6D6 and weak expression of M1 by candidate clones 1F1 and 5G7. The negative control clone 7 MDCK shows non-specific binding. At the same time, massive bands of non-lysed protein are visible. This may be due to the fact that treatment of proteins of the transfected baseline cell line may be ineffective. In FIG. 16B shows the active expression of M1 by the 6D12 candidate clone. The negative control of MDCK cell lysate shows a lack of specific binding.

В Таблице 6 обобщаются данные по экспрессии гемагглютинина, нейраминидазы и белка M1 клонами-кандидатами. Знаки плюс обозначают уровень экспрессии. Дополнительные плюсы обозначают более активную экспрессию.Table 6 summarizes the expression of hemagglutinin, neuraminidase, and M1 protein by candidate clones. Plus signs indicate the level of expression. Additional advantages indicate more active expression.

5.5 Протокол исследования биологических свойств клеток-продуцентов ВПЧ гриппа5.5 Protocol for the study of the biological properties of producer cells of HPV influenza

5.5.1. Оценка параметров роста клеток.5.5.1. Assessment of cell growth parameters.

Целью данного анализа является определение параметров роста клеток. В частности, определялось время удвоения популяции клеток (время удвоения). Каждый клон-кандидат культивировался в 6 лунках 12-луночного планшета. В каждую лунку помещались 2*10⁵ клеток. Каждые 24 часа производили сбор и подсчет клеток в двух лунках. После высева клетки из каждой лунки собирались через 24 часа, 48 часов и 72 часа. В каждой точке времени определялись средние показатели двух лунок, и полученное значение отражало общее количество клеток, образовавшихся в течение 24 часов. Сбор клеток через 24 часа считался точкой времени 0 для стандартизации дня посева клеток в предыдущий день. Показатели времени удвоения рассчитывались на веб-сайте doubling-time, com, используя все временные точки.The purpose of this analysis is to determine cell growth parameters. In particular, the cell population doubling time was determined (doubling time). Each candidate clone was cultured in 6 wells of a 12-well plate. 2 x 10 ⁵ cells were placed in each well. Every 24 hours, cells were collected and counted in two wells. After plating, cells from each well were harvested after 24 hours, 48 hours and 72 hours. At each time point, the average values of two wells were determined, and the obtained value reflected the total number of cells formed within 24 hours. Harvesting cells after 24 hours was considered time point 0 to standardize the day of seeding of cells on the previous day. Doubling times were calculated on the doubling-time, com website using all time points.

Удвоения колеблется в широком диапазоне - от примерно 18 часов до 41 часа. Так как эти клетки будут выращиваться в биореакторе, производство будет более эффективным в случае быстрого размножения клеток и, наоборот. Наилучшие показатели были у клонов 5G7, 1F1, 6D12. 4.3.2. Рейтинг отдельных клеточных клонов.Doubling ranges in a wide range - from about 18 hours to 41 hours. Since these cells will be grown in a bioreactor, production will be more efficient in the case of rapid cell multiplication and vice versa. The best performance was in clones 5G7, 1F1, 6D12. 4.3.2. Rating of individual cell clones.

Данные по экспрессии белка и характеристикам роста обобщаются в Таблице 8. В таблице показаны уровни экспрессии белков HA/NA/M1 и скорость роста клонов в форме времени удвоения.Data on protein expression and growth characteristics are summarized in Table 8. The table shows the expression levels of HA / NA / M1 proteins and the growth rate of clones in the form of doubling time.

Рейтинг клонов-кандидатов определяется по двум факторам. Первым фактором является наличие всех трех белков ВГТЧ (НА, NA, M1) по данным вестерн-блоттинга. ВПЧ не будут формироваться без этих трех белков. Вторым фактором является время удвоения. Это связано с культивированием клеточной линии в биореакторе. Медленный рост клеточной линии будет ограничивать использование реактора. По этим двум показателям клон-кандидат 5G7 был наилучшим, так как он демонстрировал активную экспрессию всех трех белков и наилучшее время удвоения. Клоны 6D12 и 1F1 имели рейтинг 2 и 3. Клон-кандидат 3С5 был интересен в связи с высоким уровнем экспрессии белка. Вместе с тем, время удвоения клона 3С5 было самым худшим.The rating of candidate clones is determined by two factors. The first factor is the presence of all three HSPT proteins (HA, NA, M1) according to Western blotting. HPV will not form without these three proteins. The second factor is the doubling time. This is due to the cultivation of the cell line in the bioreactor. Slow cell line growth will limit the use of the reactor. According to these two indicators, the 5G7 clone candidate was the best, as it showed active expression of all three proteins and the best doubling time. Clones 6D12 and 1F1 were rated 2 and 3. Clone candidate 3C5 was interesting due to the high level of protein expression. However, the doubling time for clone 3C5 was the worst.

5.6. Оценка клонов-продуцентов ВПЧ H1N1M1.5.6. Evaluation of clones producing HPV H1N1M1.

Каждый из клонов H1N1M1 с наилучшим рейтингом оценивался на стерильность, жизнеспособность после размораживания и контаминацию микоплазмой. Было установлено, что каждый из клонов не был контаминирован бактериями, грибками и микоплазмой, а также их показатель жизнеспособности после размораживания был больше, чем 85%. 5.6.1. Посев клеток, продуцирующих ВПЧ гриппа, в биореактор.Each of the H1N1M1 clones with the best rating was evaluated for sterility, viability after thawing and mycoplasma contamination. It was found that each of the clones was not contaminated by bacteria, fungi and mycoplasma, and their viability after thawing was more than 85%. 5.6.1. Inoculation of HPV-producing cells in the bioreactor.

Использовался биореактор FibraStage, который является недорогой, нетрудоемкой системой культивирования клеток одноразового использования, предназначенной для получения белков, вирусов или клеточной массы из субстрат-зависимых и суспензионных клеточных культур. В системе используются одноразовые бутылки объемом 500 мл, с предварительно помещенными дисками FibraCel, которые являются уникальной твердой матрицей для роста клеток. Клетки остаются фиксированными в слое дисков на протяжении всего процесса, что упрощает замену среды и извлечение конечного продукта. Система исключает автоклавирование, очищение, длительное обучение, дорогостоящий запуск, перекрестную контаминацию между партиями и требует только применения стандартного СО₂-инкубатора.We used the FibraStage bioreactor, which is an inexpensive, non-laborious, single-use cell culture system designed to produce proteins, viruses, or cell mass from substrate-dependent and suspension cell cultures. The system uses 500 ml disposable bottles with pre-placed FibraCel discs, which are a unique solid matrix for cell growth. Cells remain fixed in the disc layer throughout the process, which makes it easy to replace the medium and extract the final product. The system excludes autoclaving, purification, lengthy training, costly startup, cross-contamination between batches and requires only the use of a standard CO ₂ incubator.

Стабильная клеточная линия из клона 6D12, экспрессирующая ВПЧ гриппа, была использована для посева в двух системах Fibra-Stage. Клетки культивировались в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Hyclone) с добавлением 10% ФБС/4 мМ глутамина/1 мМ пирувата натрия. В каждую систему Fibra-Stage помещались 2110⁸ клеток. Общий объем среды составлял 450 мл. В одной емкости системы Fibra-Stage содержится 10 г Fibra-дисков. Плотность посева клеток на Fibra-диски составляет 2*10⁷. На пульте управления были установлены следующие параметры: 1,5 мм/с с положением вверху 10 секунд и положением внизу 2 минуты. СО₂-инкубатор был настроен на температуру 37°С и концентрацию СО₂ 5%. После посева клеток в Fibra-Stage была добавлена следующая среда: DMEM с высоким содержанием глюкозы (Hyclone) с добавлением 5% ФБС, 4 мМ глутамина/1 мМ пирувата натрия/1 мМ HEPES.A stable cell line from clone 6D12 expressing HPV flu was used for plating in two Fibra-Stage systems. Cells were cultured in high glucose DMEM (Hyclone) supplemented with 10% PBS / 4 mM glutamine / 1 mM sodium pyruvate. 2110 ⁸ cells were placed in each Fibra-Stage system. The total volume of the medium was 450 ml. One capacity of the Fibra-Stage system contains 10 g of Fibra-drives. The cell culture density on Fibra discs is 2 * 10 ⁷ . The following parameters were set on the control panel: 1.5 mm / s with a position at the top of 10 seconds and a position at the bottom of 2 minutes. The CO ₂ incubator was set to a temperature of 37 ° C and a CO ₂ concentration _of 5%. After plating the cells, the following medium was added to the Fibra-Stage: high glucose DMEM (Hyclone) supplemented with 5% PBS, 4 mM glutamine / 1 mM sodium pyruvate / 1 mM HEPES.

5.6.2. Рост и поддержание клеток, продуцирующих ВПЧ гриппа.5.6.2. Growth and maintenance of cells producing HPV flu.

Для контроля условий и жизнеспособности клеток, ежедневно брались образцы среды и оценивались с помощью анализатора Bio Profile компании «NOVA». Тщательно контролировались уровни глюкозы/глютамина/лактата/рН. Данные параметры поддерживались в следующих пределах:To control the conditions and viability of the cells, daily medium samples were taken and evaluated using a NOVA Bio Profile analyzer. The glucose / glutamine / lactate / pH levels were carefully monitored. These parameters were supported in the following limits:

По мере роста клеток концентрация глюкозы станет ниже 1,5 г/л до смещения других параметров за указанные пределы нормы. Когда уровень глюкозы становится ниже 1,5 г/л, среда полностью заменяется. В дальнейшем по мере роста клеток вся глюкоза будет потребляться в течение 24 часов. Это произошло примерно через 3 недели после помещения клеток в Fibra-Stage. В этот момент температура понижается с 37°С до 34°С. Настройка инкубатора изменяется с 5% СО₂ до 2,5%. Целью изменений является усиление продукции ВПЧ и торможение роста клеток. Данные изменения условий приведут к замедлению роста клеток на несколько дней. Тем не менее, потребление глюкозы снова начнет расти. В этот момент концентрация ФБС в среде также изменяется с 5% до 2,5%. В течение 24 часов рН с 7,2 понизится до 6,8. Полная замена среды приведет к восстановлению рН 7.2.As the cells grow, the glucose concentration will fall below 1.5 g / l until other parameters shift beyond the specified limits of the norm. When the glucose level drops below 1.5 g / l, the medium is completely replaced. Subsequently, as the cells grow, all glucose will be consumed within 24 hours. This occurred approximately 3 weeks after placement of the cells in the Fibra-Stage. At this point, the temperature drops from 37 ° C to 34 ° C. The incubator setting changes from 5% CO ₂ to 2.5%. The aim of the changes is to increase the production of HPV and inhibit cell growth. These changes in conditions will slow down cell growth for several days. However, glucose intake will start to rise again. At this point, the concentration of PBS in the medium also changes from 5% to 2.5%. Within 24 hours, the pH from 7.2 will drop to 6.8. Complete replacement of the medium will restore pH 7.2.

В каждом реакторе Fibra-stage содержится 10 граммов fibra-дисков. Начальным уровнем глюкозы является количество глюкозы в свежей среде. Клетки растут в течение приблизительно 24 часов без замены среды. В течение этого времени измеряется и регистрируется концентрация глюкозы. На фиг. 26 показано количество миллиграммов глюкозы, потреблявшейся в расчете на один грамм дисков в час в емкости №1 FibraStage.Each Fibra-stage reactor contains 10 grams of fiber discs. The initial glucose level is the amount of glucose in the fresh medium. Cells grow for approximately 24 hours without changing the medium. During this time, glucose concentration is measured and recorded. In FIG. Figure 26 shows the number of milligrams of glucose consumed per gram of disks per hour in FibraStage container No. 1.

5.6.3. Сбор клеток и количественный анализ образцов из Fibra-Stage на содержание НА.5.6.3. Cell collection and quantification of Fibra-Stage samples for HA.

Пробы были взяты после двух недель культивирования клеток в Fibra-Stage. Через две недели, содержание НА в образцах было низким, но через три недели РГА титр был 1:128, что является приемлемой концентрацией НА для проведения очистки. К концу рабочего цикла Fibra-Stage титр в РГА был примерно 1:256.Samples were taken after two weeks of cell culture in the Fibra-Stage. After two weeks, the HA content in the samples was low, but after three weeks the RGA titer was 1: 128, which is an acceptable concentration of HA for purification. By the end of the Fibra-Stage cycle, the RGA titer was approximately 1: 256.

Для очищения были подготовлены два отдельных клеточных пула, полученных из каждого устройства - №1 и №2.For purification, two separate cell pools prepared from each device — No. 1 and No. 2 — were prepared.

Пример 6. Доработка технологии очистки ВПЧ гриппа для получения моновалентных балков из супернатанта клеток-продуцентов ВПЧ гриппа 6.1 Протоколы выбора и обоснования параметров процесса очистки ВПЧ гриппа для получения моновалентных балков из супернатанта MDCK клеток-продуцентов ВПЧ гриппаExample 6. Refinement of the technology for purification of HPV influenza to obtain monovalent beams from the supernatant of the HPV influenza producing cells 6.1 Protocols for the selection and justification of the parameters of the process of purification of HPV influenza to obtain monovalent beams from the supernatant of the MDCK influenza HPV producing cells

6.1.1 Протокол 16.1.1 Protocol 1

Принципиальная схема выделения ВПЧ из клеточного пула после культивирования:Schematic diagram of the isolation of HPV from the cell pool after cultivation:

1. Материал клеточного пула 3,5 л1. Cell pool material 3.5 L

2. Осветление Фильтр Sartopore 22. Lightening Filter Sartopore 2

3. Обработка бензоназой 10 Ед/мл на протяжении ночи при +4°С3. Treatment with benzonase 10 U / ml overnight at + 4 ° C

4. Прямая загрузка в капсулу 5 мл ионообменного хроматографа Mustang Q4. Direct loading into a capsule 5 ml Mustang Q ion exchange chromatograph

5. ЭХ, S-5005. EC, S-500

6. Аффинная хроматография Cellufine S6. Cellufine S Affinity Chromatography

Осветление. Материал клеточного пула осветляж^сТюмощью фильтра Sartopore 2 0,8/0,45 мкм и обрабатывался бензоназой (10 Ед/мл) в течение ночи при температуре 4°С. После обработки бензоназой концентрация NaCl в осветленном материале доводилась до 250 мМ.Lightening The cell pool material was clarified with a Sartopore filter of 0.8 / 0.45 μm and treated with benzonase (10 U / ml) overnight at 4 ° C. After treatment with benzonase, the concentration of NaCl in the clarified material was adjusted to 250 mM.

Mustang Q. 3580 мл кондиционированного и осветленного материала загружали в капсулу 5 мл Mustang Q XT 5MSTGQPM6 («Раll Соrр.»). Скорость загрузки была 20 мл/мин, а скорость элюирования 10 мл/мин. Захваченные ВПЧ элюировали ступенчатым градиентом В 40% (В = 3 М NaCl в 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4).Mustang Q. 3580 ml of conditioned and clarified material was loaded into a 5 ml capsule of Mustang Q XT 5MSTGQPM6 (“Rall Corp.”). The loading rate was 20 ml / min and the elution rate was 10 ml / min. Trapped HPV was eluted with a step gradient of 40% (B = 3 M NaCl in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4).

Профиль элюции ВПЧ в колонке Mustang Q представлен на фиг. 17.The HPV elution profile in the Mustang Q column is shown in FIG. 17.

Эксклюзионная хроматография (ЭХ). Элюированный материал из колонки Mustang Q подвергался ЭХ для обмена буфера и дальнейшей очистки. 15 мл материала из колонки Мустанг Q с максимальной концентрацией вещества было загружено в колонку К16 с 120 мл Sephacryl 8-500. Скорость загрузки и разрешение составляли 2 мл/мин. Трис-HCI 50 мМ +100 мМ буфера NaCI использовали в качестве подвижной фазы. На Рисунке 5.3 показан профиль ЭХ пикового материала капсулы Mustang Q XT. Был получен образец с максимальным показателем Vo. Фиг. 18 показывает профиль элюции материала из Mustang Q с помощью ЭХSize exclusion chromatography (SEC). The eluted material from the Mustang Q column was subjected to EC for buffer exchange and further purification. 15 ml of material from the Mustang Q column with the maximum concentration of the substance was loaded into the K16 column with 120 ml of Sephacryl 8-500. The loading speed and resolution were 2 ml / min. Tris-HCI 50 mM +100 mM NaCI buffer was used as the mobile phase. Figure 5.3 shows the EC profile of the peak material of the Mustang Q XT capsule. A sample with a maximum Vo score was obtained. FIG. 18 shows an elution profile of material from Mustang Q using EC

Аффинная хроматография. В колонку Cellufine S с объемом 1 мл были загружены 2 мл образца ЭХ с максимальным показателем Vo. После того, как был получен несвязанный материал, был применен ступенчатый градиент 40% для вытеснения связанного материала. Пиковый образец после обработки ступенчатым градиентом 40% диализировался с помощью 1 л буфера А (50 мМ Трис НС1 + 100 мМ NaCl, рН 7,4). На фиг. 19 показан профиль Cellufine S обработки пикового материала, полученного с помощью ЭХ. Был получен пиковый материал после обработки ступенчатым градиентом 40%. Пиковый образец после обработки ступенчатым градиентом 40% диализировали с помощью 1 л буфера А (50 мМ Трис НС1 + 100 мМ NaCl, рН 7,4).Affinity chromatography. A 1 ml SEC column with a maximum Vo value was loaded onto a Cellufine S column with a volume of 1 ml. After the unbound material was obtained, a 40% step gradient was applied to displace the bound material. The peak sample after treatment with a step gradient of 40% was dialyzed using 1 L of buffer A (50 mM Tris HCl + 100 mM NaCl, pH 7.4). In FIG. 19 shows a Cellufine S profile for processing peak material obtained by EC. Peak material was obtained after treatment with a step gradient of 40%. The peak sample after treatment with a step gradient of 40% was dialyzed using 1 L of buffer A (50 mM Tris HCl + 100 mM NaCl, pH 7.4).

На фиг. 20 показан профиль 2 мл материала ЭХ с пиковым значением Vo, загруженного в колонку Cellufine 1 мл. Для того, чтобы выявить перегрузку колонки, было проведено несколько прогонов через одну и ту же колонку (с промывками между прогонами) различных объемов материала ЭХ с пиковым показателем Vo.In FIG. 20 shows a profile of 2 ml of EC material with a peak value of Vo loaded onto a 1 ml Cellufine column. In order to identify the overload of the column, several runs were carried out through the same column (with leaks between runs) of different volumes of EC material with a peak value of Vo.

В прогоне с загрузкой 0,5 мл второй (ВПЧ) максимальный показатель оптической плотности (ОД) составил 10 милли-единиц в условиях элюции 2 мл. В прогоне с загрузкой 1 мл, второй (ВПЧ) максимальный показатель ОД составлял 20 милли-единиц в условиях элюции 2,3 мл, и в прогоне с загрузкой 2 мл второй (ВПЧ) максимальный показатель ОД составлял 40 мили-единиц в условиях элюции 3,5 мл. Существует прямая зависимость между загруженным объемом и значением, что означает отсутствие перегрузки колонки насыщения ВПЧ. На каждом этапе брались образцы и анализировались на активность НА. Полученные результаты отражены вIn a run with a load of 0.5 ml of the second (HPV), the maximum optical density (OD) was 10 milli units in an elution of 2 ml. In a run with a load of 1 ml, second (HPV), the maximum OD value was 20 milli-units under elution conditions of 2.3 ml, and in a run with a load of 2 ml second (HPV), the maximum OD was 40 mil units in elution conditions 3 5 ml. There is a direct correlation between the loaded volume and the value, which means there is no overload of the HPV saturation column. At each stage, samples were taken and analyzed for NA activity. The results are reflected in

Количество НА может быть рассчитано с помощью положительного контроля НА, который использовался на каждой пластине. Выход (%) рассчитывался по общему количеству антигена после каждого этапа относительно предыдущего. Также было учтено, что на последнем этапе было загружено 2 мл в колонку Cellufine S из 37 мл материала после колонки ЭХ. Нормализация показывает, что в процессе очищения активность НА уменьшилась после колонки Mustang Q до 78%, после ЭХ - до 42%, потери практически отсутствовали после колонки Cellufine S (выход - 97%). Таким образом, общие потери антигена при очистке и концентрировании по протоколу 1 составили 67%.The amount of HA can be calculated using the positive control of HA that was used on each plate. The yield (%) was calculated by the total amount of antigen after each stage relative to the previous one. It was also noted that in the last step, 2 ml was loaded into the Cellufine S column from 37 ml of material after the SEC column. Normalization shows that during the purification, the activity of HA decreased after the Mustang Q column to 78%, after EC - to 42%, there were practically no losses after the Cellufine S column (yield - 97%). Thus, the total loss of antigen during purification and concentration according to Protocol 1 was 67%.

6.1.2 Протокол 2.6.1.2 Protocol 2.

С целью увеличения выхода антигена при хроматографической очистке и концентрировании были введены некоторые модификации в процесс.In order to increase the yield of antigen during chromatographic purification and concentration, some modifications were introduced into the process.

Ультрафильтрация супернатанта клеток-продуцентов.Ultrafiltration of the supernatant of producer cells.

Ультрафильтрацию супернатанта клеток-продуцентов, содержащего ВПЧ гриппа H1N1 Ml проводят в два этапа путем прокачки материала через напорную емкость объемом 1 Л насосом под давлением 2 bar. На первом этапе на выходе из напорной емкости устанавливается фильтровальная капсула Sartopure GF+ 1.2 pm компании Sartorius stedim biotech, через которую прокачивается материал. На втором этапе материал прокачивается через фильтровальную капсулу Sartopure GF+ 0.65 pm компании Sartorius stedim biotech. Процедура ультрафильтрования происходит при комнатной температуре. Отбирают пробу объемом 1 мл для последующего анализа.Ultrafiltration of the supernatant of producer cells containing HPV H1N1 Ml influenza is carried out in two stages by pumping the material through a 1 L pressure tank with a pump under a pressure of 2 bar. At the first stage, at the outlet of the pressure vessel, the Sartorius stedim biotech filter capsule Sartopure GF + 1.2 pm is installed, through which the material is pumped. In a second step, the material is pumped through a Sartorius stedim biotech Sartopure GF + 0.65 pm filter capsule. The ultrafiltration procedure takes place at room temperature. A 1 ml sample was taken for subsequent analysis.

Концентрирование ВПЧ гриппа.Concentration of HPV flu.

Концентрирование ВПЧ гриппа H1N1M1 проводят методом ионообменной хроматографии. Ионообменную хроматографию осуществляют с помощью хроматографической системы GE Akta Purifier, состоящей из градиентных насосов Р-900, детектора UV-900, блока рН-метрии и кондуктометрии рН/С-900 и системы вводы пробы с вводными и выводными клапанами Вох-900. Управление системой ведется путем программного обеспечения Unicorn software. В качестве сорбционной хроматографической колонки используется ионно-обменная капсула Mustang Q ХТ5 объемом 5 ml компании Pall Corporation. Детектирование ведут при двух длинах волн - 210 нм и 280 нм.Concentration of HPV influenza H1N1M1 is carried out by ion exchange chromatography. Ion exchange chromatography is carried out using the GE Akta Purifier chromatographic system, consisting of P-900 gradient pumps, a UV-900 detector, a pH / C-900 pH meter and conductometry, and a Poh-900 inlet and outlet valve system. The system is managed by the Unicorn software. A 5 ml Mustang Q XT5 ion exchange capsule from Pall Corporation is used as a sorption chromatographic column. Detection is carried out at two wavelengths - 210 nm and 280 nm.

Условия проведения ионно-обменной хроматографии (ИОХ).Conditions for ion exchange chromatography (IOX).

Общее давление в хроматографической системе не превышает 0.8 МПа. Максимальная скорость потока элюента 10 мл/мин. Раствор A1: 1 М NaOH, Раствор А2: 50 шМ Tris-HCl, рН 7.5, Раствор В1: ультрафильтрованный супернатант с клеток, содержащий ВПЧ гриппа, Раствор В2: 50 mМ Tris-HCl, рН 7.5 + 1М NaCl.The total pressure in the chromatographic system does not exceed 0.8 MPa. The maximum flow rate of the eluent is 10 ml / min. Solution A1: 1 M NaOH, Solution A2: 50 hM Tris-HCl, pH 7.5, Solution B1: ultrafiltered cell supernatant containing influenza HPV, Solution B2: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 + 1M NaCl.

Перед началом хроматографии капсулу уравновешивают раствором А1 (не менее 6 объемов колонки) до постоянных значений оптической плотности, рН и кондуктивности, после чего поток элюата останавливают на 30 минут. После выдерживания капсулы в растворе А1 по истечении 30 минут капсулу промывают раствором А2 (не менее 10 объемов колонки) до наступления постоянных значений оптической плотности, рН и кондуктивности. После промывки через капсулу продавливают раствор В1, содержащий ВПЧ гриппа, в объеме, не превышающим 100 объемов капсулы. Сорбированный на капсулу биологический материал элюируется раствором В2. Формируемый хроматографический пик собирают в отдельную емкость в объем, не превышающий 15 мл (не более 3-х объемов колонки). Из собранного концентрата отбирают пробу объемом 500 мкл для последующего анализа. Промежуточный анализ концентрата ВПЧ и проскока после ИОХ. Концентрат и проскок от ИОХ анализируют в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами петуха. В конических лунках планшета смешивают 50 мкл анализируемой пробы и 50 мкл раствора эритроцитов в 0.01 фосфатно-солевом буфере с добавлением 0.135 М NaCl, рН 6.5-7. В результате серийных двукратных разведений анализируемой пробы в эритроцитах определяется РГА-титр ВПЧ. Заполненный планшет выдерживается 30 минут при температурном режиме +4С. РГА-титр определяют в трех пробах: ультрафильтрофанный супернатант, концентрат после ИОХ, проскок после ИОХ.Before chromatography begins, the capsule is equilibrated with A1 solution (at least 6 column volumes) to constant values of optical density, pH and conductivity, after which the flow of the eluate is stopped for 30 minutes. After keeping the capsule in solution A1 after 30 minutes, the capsule is washed with solution A2 (at least 10 column volumes) until constant values of optical density, pH and conductivity occur. After washing through a capsule, solution B1 containing HPV flu is pushed through in a volume not exceeding 100 volumes of the capsule. The biological material adsorbed onto the capsule is eluted with solution B2. The formed chromatographic peak is collected in a separate container in a volume not exceeding 15 ml (not more than 3 column volumes). A sample of 500 μl was taken from the collected concentrate for subsequent analysis. Intermediate analysis of HPV concentrate and breakthrough after IOC. The concentrate and the breakthrough from the IOX are analyzed in a hemagglutination reaction (RGA) with rooster red blood cells. In the conical wells of the plate, 50 μl of the analyzed sample and 50 μl of a erythrocyte solution in 0.01 phosphate-saline buffer with the addition of 0.135 M NaCl, pH 6.5-7 are mixed. As a result of serial two-fold dilutions of the analyzed sample in red blood cells, the HPA RGA titer is determined. The filled tablet is maintained for 30 minutes at a temperature of + 4C. The RGA titer is determined in three samples: ultrafiltrofan supernatant, concentrate after IOX, slip after IOX.

Первичная хроматографическая очистка ВПЧ гриппа.Primary chromatographic purification of HPV flu.

Первичную очистку ВПЧ гриппа из концентрата проводят методом Гель-проникающей хроматографии (Гель-фильтрация) с помощью хроматографической системы GE Akta Purifier, состоящей из градиентных насосов Р-900, детектора UV-900, блока рН-метрии и кондуктометрии рН/С-900 и системы вводы пробы с вводными и выводными клапанами Вох-900. Управление системой ведется путем программного обеспечения Unicom software. В качестве препаративной колонки используется Pharmacia Fine Chemicals 250×25 мм, которая заполняется сорбентом типа Sepharose CL-4 В (компания Pharmacia Fine Chemicals). Детектирование ведут при двух длинах волн - 210 и 280 нм.The initial purification of influenza HPV from the concentrate is carried out by gel permeation chromatography (Gel filtration) using a GE Akta Purifier chromatographic system consisting of P-900 gradient pumps, a UV-900 detector, a pH meter and conductivity meter pH / C-900, and Sample inlet systems with Voh-900 inlet and outlet valves. The system is managed by Unicom software. As a preparative column, Pharmacia Fine Chemicals 250 × 25 mm is used, which is filled with a Sepharose CL-4 B sorbent (Pharmacia Fine Chemicals). Detection is carried out at two wavelengths - 210 and 280 nm.

Условия проведения хроматографии.Chromatography conditions.

Скорость потока элюента 5 мл/мин. Раствор А1: 50 mM Tris-HCl, рН 7.5. Раствор А2: концентрат ВПЧ гриппа. Перед началом очистки хроматографическую колонку уравновешивают посредством пропускания раствора А1 до постоянных значений оптической плотности, рН и кондуктивности.The flow rate of the eluent is 5 ml / min. Solution A1: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5. Solution A2: HPV flu concentrate. Before cleaning, the chromatographic column is balanced by passing solution A1 to constant values of optical density, pH and conductivity.

Сбор целевой фракции с ВПЧ гриппа.Collect the target fraction with the HPV flu.

В колонку вводят не более 5 мл (0.04 объема сорбента) раствора А2 и начинают хроматографический процесс, используя в качестве элюента раствор А1 и наблюдая за оптической плотностью. Фракции собирают в отдельные емкости - всего три фракции, первая из которых содержит ВПЧ гриппа. По 500 мкл каждой фракции отбирается на анализ в РГА.No more than 5 ml (0.04 sorbent volume) of solution A2 is introduced into the column and the chromatographic process is started using solution A1 as eluent and observing the optical density. Fractions are collected in separate containers - only three fractions, the first of which contains HPV flu. 500 μl of each fraction is selected for analysis in the RGA.

Вторичная хроматографическая очистка ВПЧ гриппа.Secondary chromatographic purification of HPV flu.

Вторичную очистку ВПЧ гриппа из первично выделенной фракции ВПЧ проводят методом Псевдо-аффинной хроматографии с помощью хроматографической системы GE Akta Purifier, состоящей из градиентных насосов Р-900, детектора UV-900, блока рН-метрии и кондуктометрии рН/С-900 и системы вводы пробы с вводными и выводными клапанами Вох-900. Управление системой ведется путем программного обеспечения Unicorn software. В качестве препаративной колонки используется Thermo Scientific объемом 10 мл, которая заполняется сорбентом Cellufine Sulfate (компания JNC Corporation). Детектирование ведут при двух длинах волн - 210 и 280 нм.Secondary purification of the HPV flu from the initially isolated HPV fraction is carried out by the method of Pseudo-affinity chromatography using a GE Akta Purifier chromatographic system consisting of P-900 gradient pumps, a UV-900 detector, a pH / C-900 pH meter and conductometry, and an input system samples with inlet and outlet valves Вох-900. The system is managed by the Unicorn software. A 10 ml Thermo Scientific column is used as a preparative column, which is filled with a Cellufine Sulfate sorbent (JNC Corporation). Detection is carried out at two wavelengths - 210 and 280 nm.

Раствор А1: 2 М NaCl, Раствор А2: 50 mМ Tris-HCl, рН 7.5, Раствор В1: Фракционированная на этапе гель-фильтрации проба с ВПЧ гриппа. Раствор В2: 50 шМ Tris-HCl, рН 7.5+0.6 М NaCl. Перед началом хроматографии колонку промывают раствором А1 (не менее 2 объемов колонки) до постоянных значений оптической плотности и кондуктивности. Далее колонку промывают раствором А2 (не менее 2-х объемов колонки) до наступления постоянных значений оптической плотности, рН и кондуктивности. Скорость потока меняют с 5 мл/мин на 1.5 мл/мин. После промывки через колонку пропускают раствор В1, содержащий ВПЧ гриппа, в объеме, не превышающим 2.5 объема колонки. Сорбированный на колонку биологический материал элюируется раствором В2. Формируемый хроматографический пик собирают в отдельную емкость в объем, не превышающий 10 мл (не более 1-го объема колонки). Из собранного концентрата отбирают пробу объемом 500 мкл для последующего анализа. Анализ очищенного препарата.Solution A1: 2 M NaCl, Solution A2: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, Solution B1: Sample with HPV influenza fractionated at the stage of gel filtration. Solution B2: 50 cM Tris-HCl, pH 7.5 + 0.6 M NaCl. Before chromatography begins, the column is washed with A1 solution (at least 2 column volumes) to constant values of optical density and conductivity. Next, the column is washed with A2 solution (at least 2 column volumes) until constant values of optical density, pH and conductivity occur. The flow rate is changed from 5 ml / min to 1.5 ml / min. After washing, a solution of B1 containing HPV flu is passed through the column in a volume not exceeding 2.5 column volumes. The biological material adsorbed onto the column is eluted with solution B2. The formed chromatographic peak is collected in a separate container in a volume not exceeding 10 ml (not more than 1 column volume). A sample of 500 μl was taken from the collected concentrate for subsequent analysis. Analysis of the purified preparation.

Готовая проба анализируется на степень концентрирования, гемагглютинирующую и нейраминидазную активности, а также на степень очистки в аналитической гель-фильтрации и ступенчатом электрофорезе.The finished sample is analyzed for the degree of concentration, hemagglutinating and neuraminidase activity, as well as for the degree of purification in analytical gel filtration and step electrophoresis.

6.2 Итоговые результаты очистки ВПЧ гриппа6.2 Final HPV flu treatment results

В таблицах 9 и 10 представлены результаты оценки концентрирования и активности ВПЧ трех типов. Во всех трех случаях концентрирование происходило в 200 раз, при этом максимальная активность в РГА составляла 1:2048 для ВПЧ-H1N1М1 и ВПЧ-HA(B)N1M1, при концентрации гемагглютинина 450 и 540 мкг/мл, соответственно. ВПЧ-Н3N1М1 при концентрации по гемагглютинину 450 мкг/мл, проявляли меньшую агглютинирующую активность - 1:1024.Tables 9 and 10 show the results of evaluating the concentration and activity of HPV of three types. In all three cases, concentration was 200 times, while the maximum activity in the RGA was 1: 2048 for HPV-H1N1M1 and HPV-HA (B) N1M1, with hemagglutinin concentrations of 450 and 540 μg / ml, respectively. HPV-H3N1M1 at a hemagglutinin concentration of 450 μg / ml showed less agglutinating activity - 1: 1024.

Результаты электрофореза по Леммли.Lemmley electrophoresis results.

Процесс очистки и концентрирования ВПЧ контролировали в электрофорезе как для отдельных стадий процесса, так и только очищенных проб (фиг. 21). Пробы денатурировались в SDS и бета-меркаптоэтаноле с кипячением 10 минут. Верхний гель - 5%, Нижний гель - 15%. На представленных рисунках электрофореграммы видно, что исходный продукт достаточно чистый, после концентрирования видно проявление примесных белков, которые исчезают после гель-фильтрации. На фиг. 22 представлены результаты очистки трех типов ВПЧ в одном электрофорезе. Следы примесных белков не регистрируются, а максимальная оптическая плотность полос гемагглютинина соответствует ВПЧ-HA(B)N1M1, затем меньшая оптическая плотность соответствует ВПЧ-H1N1М1, а наименьшая из трех ВПЧ регистрируется для ВПЧ-H3N1M1.The process of purification and concentration of HPV was controlled in electrophoresis for both individual stages of the process and only purified samples (Fig. 21). Samples were denatured in SDS and beta-mercaptoethanol with boiling for 10 minutes. Upper gel - 5%, Lower gel - 15%. The electrophoregram figures show that the initial product is quite clean, after concentration, the manifestation of impurity proteins is visible, which disappear after gel filtration. In FIG. 22 presents the results of the purification of three types of HPV in one electrophoresis. Traces of impurity proteins are not recorded, and the maximum optical density of hemagglutinin bands corresponds to HPV-H (B) N1M1, then the lower optical density corresponds to HPV-H1N1M1, and the smallest of the three HPVs is recorded for HPV-H3N1M1.

Определение количества остаточной клеточной ДНК в очищенном концентрате трех типов ВПЧ гриппа. Измерение концентрации ДНК проводили двумя методами.Determination of the amount of residual cellular DNA in a purified concentrate of three types of HPV flu. DNA concentration was measured by two methods.

Метод 1 (флюориметрический) с использованием Qubit© dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit, ThermoFisher Scientific, USA и флюориметр Qubit (1.0). ДНК из суспензии ВПЧ была выделена с использованием PureLink Genomic DNA Mini kit (Invitrogen).Method 1 (fluorimetric) using Qubit © dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit, ThermoFisher Scientific, USA and Qubit fluorimeter (1.0). DNA from an HPV suspension was isolated using the PureLink Genomic DNA Mini kit (Invitrogen).

Метод 2 (RT-PCR) с использованием ПЦР-набора resDNASEQ Quantitative MDCK DNA Kit, AB-4464335 для количественного определения ДНК собаки, 100 реакций ДНК из суспензии ВПЧ была выделена с использованием PureLink Genomic DNA Mini kit (Invitrogen). В таблице 11 представлены результаты измерения остаточной клеточной ДНК в ВПЧ после всех стадий концентрирования и очистки. Измерения по методу 1 дают достаточно высокие значения примесной ДНК для ВПЧ-H1N1M1 и ВПЧ-H3N1M1 равные 87 и 98 нг/мл соответственно, в концентрате ВПЧ HA(B)N1M1 уровень примесной ДНК находится ниже предела обнаружения для этого метода (<10). ПЦР метод является более чувствительным и специфичным при обнаружении клеточной ДНК, в наших измерениях мы использовали специальный набор для обнаружения ДНК клеток MDCK. Результаты указывают на хорошее соответствие измерений, полученных методом 1 и методом 2, для Bn4-H3N1M1 и ВПЧ-HA(B)N1M1, и существенно более низкие значения по примесной клеточной ДНК для концентрата ВПЧ-H1N1M1. Такое различие возможно связано с наличием двуспиральной клеточной РНК, которая в методе 1 также флюоресцирует. Пересчет на одну дозу вакцины показывает, что суммарная масса ДНК трех типов ВПЧ в одной дозе составляет 3.39 нг, что не превышает порогового значения 10 нг. Следует обратить внимание на тот факт, что в готовой ЛФ клеточная ДНК вообще не обнаруживается, что возможно связано с тем, что ДНК сорбируется на алюминия гидроксиде.Method 2 (RT-PCR) using a resDNASEQ Quantitative MDCK DNA Kit PCR kit, AB-4464335 to quantify dog DNA, 100 DNA reactions from an HPV suspension were isolated using a PureLink Genomic DNA Mini kit (Invitrogen). Table 11 presents the results of measuring residual cell DNA in HPV after all stages of concentration and purification. Measurements according to method 1 give rather high values of impurity DNA for HPV-H1N1M1 and HPV-H3N1M1 equal to 87 and 98 ng / ml, respectively; in the HPV concentrate HA (B) N1M1, the level of impurity DNA is below the detection limit for this method (<10). The PCR method is more sensitive and specific for the detection of cellular DNA, in our measurements we used a special kit for the detection of DNA of MDCK cells. The results indicate a good agreement between the measurements obtained by method 1 and method 2 for Bn4-H3N1M1 and HPV-HA (B) N1M1, and significantly lower values for impurity cell DNA for HPV-H1N1M1 concentrate. This difference is possibly due to the presence of double-stranded cellular RNA, which also fluoresces in method 1. Recalculation per vaccine dose indicates that the total DNA mass of the three HPV types in a single dose is 3.39 ng, which does not exceed the threshold value of 10 ng. Attention should be paid to the fact that in the finished LF, cellular DNA is not detected at all, which is probably due to the fact that DNA is adsorbed on aluminum hydroxide.

Электронно-микроскопическая характеризация очищенного концентрата трех типов ВПЧ гриппа.Electron microscopic characterization of the purified concentrate of three types of HPV flu.

На фиг. 23-25 представлены результаты анализа концентрата очищенных ВПЧ методом электронной микроскопии. На ВПЧ H1N1M1 (фиг. 23) присутствуют в изобилии шипики гемагглютинина. ВПЧ имеют неправильную форму гантелей, с шипиками на головках гантелей, диаметр головок - 100 нм, длина гантелей - 200-300 нм. Концентрация ВПЧ H1N1M1-10¹⁰ штук/мл. На ВПЧ H3N1M1 (фиг. 24) присутствуют в изобилии шипики гемагглютинина. ВПЧ имеют неправильную форму гантелей, с шипиками на головках гантелей, диаметр головок - 100 нм, длина гантелей -200-300 нм. Концентрация ВПЧ - 10⁹ штук/мл. На ВПЧ H3N1M1 (фиг. 25) присутствуют в изобилии шипики гемагглютинина. ВПЧ имеют неправильную форму гантелей, с шипиками на головках гантелей, диаметр головок -100 нм, длина гантелей - 200-300 нм. Концентрация ВПЧ - 10⁹ штук/мл.In FIG. 23-25 show the results of the analysis of the purified HPV concentrate by electron microscopy. On HPV H1N1M1 (Fig. 23) spines of hemagglutinin are abundant. HPVs have an irregular shape of dumbbells, with spikes on the heads of dumbbells, the diameter of the heads is 100 nm, the length of the dumbbells is 200-300 nm. The concentration of HPV H1N1M1-10 ¹⁰ pieces / ml. On HPV, H3N1M1 (Fig. 24) has an abundant spike of hemagglutinin. HPVs have an irregular shape of dumbbells, with spikes on the heads of the dumbbells, the diameter of the heads is 100 nm, the length of the dumbbells is 200-300 nm. The concentration of HPV is 10 ⁹ pieces / ml. On HPV H3N1M1 (Fig. 25) spikes of hemagglutinin are present in abundance. HPVs have an irregular shape of dumbbells, with spikes on the heads of dumbbells, the diameter of the heads is 100 nm, the length of the dumbbells is 200-300 nm. The concentration of HPV is 10 ⁹ pieces / ml.

После завершения разработки технологии получения и культивирования клеток-продуцентов ВПЧ важнейшим этапом создания готовой лекарственной формы становится технология очистки ВПЧ гриппа для получения моновалентых балков из супернатанта клеток-продуцентов ВПЧ гриппа. Мы исследовали два протокола концентрирования и очистки ВПЧ гриппа из супернатанта клеток-продуцентов с целью обеспечения максимального выхода ВПЧ и минимального содержания примесных клеточных белков и ДНК. Оба протокола содержат основные этапы очистки - осветление фильтрованием, концентрирование в ионообменной хроматографии, очистка концентрата гель-фильтрацией и псевдоаффинной хроматографией. Полученный полуфабрикат ВПЧ проходит концентрирование по объему в 200-400 раз. Очищенный по протоколу №1 препарат ВПЧ активен в РГА с титром 1:512, тогда как концентрирование и очистка по протоколу №2 обеспечивает больший титр в РГА от 1:1024 до 1:2048, концентрацию по гемагглютинину около 500 мкг/мл, при этом примесные клеточные белки не регистрируются в электрофорезе моновалентных балков ВПЧ. Уровень примесной клеточной ДНК в препаратах, очищенных по протоколу №2 в пересчете на одну дозу ГЛФ составляет 3.4 нг. Электронно-микроскопическое исследование ВПЧ показало, что после концентрирования и очистки по протоколу №2 достигается концентрация ВПЧ 10⁹-10¹⁰ штук/мл, сами ВПЧ имеют неправильную форму преимущественно в виде булав и гантелей, редко встречаются ВПЧ сферической или икосаэдрической формы.After the development of the technology for producing and culturing HPV producing cells, the most important step in creating the finished dosage form is the technology for purifying HPV influenza to obtain monovalent beams from the supernatant of the HPV influenza producing cells. We examined two protocols for the concentration and purification of HPV flu from the supernatant of producer cells in order to ensure maximum yield of HPV and a minimum content of impurity cellular proteins and DNA. Both protocols contain the main stages of purification - clarification by filtration, concentration in ion exchange chromatography, purification of the concentrate by gel filtration and pseudo-affinity chromatography. The resulting HPV semi-finished product is concentrated by volume in 200-400 times. Purified by protocol No. 1, the HPV preparation is active in RGA with a titer of 1: 512, while concentration and purification according to protocol No. 2 provides a greater titer in RGA from 1: 1024 to 1: 2048, the concentration of hemagglutinin is about 500 μg / ml, while impurity cell proteins are not detected in the electrophoresis of monovalent HPV beams. The level of impurity cellular DNA in the preparations purified according to protocol No. 2 in terms of a single dose of GLF is 3.4 ng. Electron microscopic examination of HPV showed that after concentration and purification according to protocol No. 2, an HPV concentration of 10 ⁹ -10 ¹⁰ pieces / ml is achieved, the HPV itself has an irregular shape mainly in the form of clubs and dumbbells, and there are rarely spherical or icosahedral HPVs.

Таким образом, разработанные и примененные методы концентрирования и очистки ВПЧ из супернатанта клеток-продуцентов позволяют создать продукт фармакопейного качества.Thus, the developed and applied methods for the concentration and purification of HPV from the supernatant of producer cells make it possible to create a pharmacopoeial product.

Список использованных источниковList of sources used

1. Shinya К, Ebina М, Yamada S, Ono М, Kasai N, Kawaoka Y. Influenza virus receptors in the human airway. Nature. 2006;440: 435-6.1. Shinya K, Ebina M, Yamada S, Ono M, Kasai N, Kawaoka Y. Influenza virus receptors in the human airway. Nature. 2006; 440: 435-6.

2. Henklein P, Bruns K, Nimtz M, Wray V, Tessmer U, Schubert U. Influenza A vims protein PB1-F2: synthesis and characterization of the biologically active full length protein and related peptides. J Pept Sci. 2005; 11l(8): 481-90.2. Henklein P, Bruns K, Nimtz M, Wray V, Tessmer U, Schubert U. Influenza A vims protein PB1-F2: synthesis and characterization of the biologically active full length protein and related peptides. J Pept Sci. 2005; 11l (8): 481-90.

3. Noda T, Sagara H, Yen A, Takada A, Kida H, Cheng RH, et al. Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles. Nature. 2006; 439: 490-2.3. Noda T, Sagara H, Yen A, Takada A, Kida H, Cheng RH, et al. Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles. Nature. 2006; 439: 490-2.

4. Deng T, Sharps J, Fodor E, Brownlee GG. In vitro assembly of PB2 with a PB1-PA dimer supports a new model of assembly of influenza A vims polymerase subunits into a functional trimeric complex. J Virol. 2005; 79: 8669-74.4. Deng T, Sharps J, Fodor E, Brownlee GG. In vitro assembly of PB2 with a PB1-PA dimer supports a new model of assembly of influenza A vims polymerase subunits into a functional trimeric complex. J Virol. 2005; 79: 8669-74.

5. Lakadamyali M, Rust MJ, Zhuang X. Endocytosis of influenza viruses. Microbes Infect. 2004; 6: 929-36.5. Lakadamyali M, Rust MJ, Zhuang X. Endocytosis of influenza viruses. Microbes Infect. 2004; 6: 929-36.

6. Zhang J, Leser GP, Pekosz A, Lamb RA. The cytoplasmic tails of the influenza virus spike glycoproteins are required for normal genome packaging. Virology. 2000; 269: 325-34.6. Zhang J, Leser GP, Pekosz A, Lamb RA. The cytoplasmic tails of the influenza virus spike glycoproteins are required for normal genome packaging. Virology. 2000; 269: 325-34.

7. Bancroft CT, Parslow TG. Evidence for segment-nonspecific packaging of the influenza a virus genome. J Virol. 2002; 76(14): 7133-9.7. Bancroft CT, Parslow TG. Evidence for segment-nonspecific packaging of the influenza a virus genome. J Virol. 2002; 76 (14): 7133-9.

8. Sandbulte MR, Jimenez GS, Boon AC, Smith LR, Treanor JJ, Webby RJ. Crossreactive neuraminidase antibodies afford partial protection against H5N1 in mice and are present in unexposed humans. PLoS Med. 2007; 4: e59.8. Sandbulte MR, Jimenez GS, Boon AC, Smith LR, Treanor JJ, Webby RJ. Crossreactive neuraminidase antibodies afford partial protection against H5N1 in mice and are present in unexposed humans. PLoS Med. 2007; 4: e59.

9. Hay AJ, Gregory V, Douglas AR, Lin YP. The evolution of human influenza viruses. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 2001; 356: 1861-70.9. Hay AJ, Gregory V, Douglas AR, Lin YP. The evolution of human influenza viruses. Philos Trans R Soc Lond In Biol Sci. 2001; 356: 1861-70.

10. Boni MF. Vaccination and antigenic drift in influenza. Vaccine. 2008;26 (Suppl 3): C8-14. Reid AH, Taubenberger JK. The origin of the 1918 pandemic influenza virus: a continuing enigma. Journal of General Virology. 2003; 84: 2285-92.10. Boni MF. Vaccination and antigenic drift in influenza. Vaccine 2008; 26 (Suppl 3): C8-14. Reid AH, Taubenberger JK. The origin of the 1918 pandemic influenza virus: a continuing enigma. Journal of General Virology. 2003; 84: 2285-92.

11. Smith GJ, Vijaykrishna D, Bahl J, Lycett SJ, Worobey M, Pybus OG, et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature. 2009; 459: 1122-5.11. Smith GJ, Vijaykrishna D, Bahl J, Lycett SJ, Worobey M, Pybus OG, et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature. 2009; 459: 1122-5.

12. Rogers GN, Paulson JC. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: Differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin. Virology. 1983; 127: 361-73.12. Rogers GN, Paulson JC. Receptor determinants of human and animal influenza virus isolates: Differences in receptor specificity of the H3 hemagglutinin based on species of origin. Virology. 1983; 127: 361-73.

13. Guenther I, Glatthaar B, Doller G, Garten W. A HI hemagglutinin of a human influenza A virus with a carbohydrate-modulated receptor binding site and an unusual cleavage site. Virus Res. 1993; 27: 147-60.13. Guenther I, Glatthaar B, Doller G, Garten W. A HI hemagglutinin of a human influenza A virus with a carbohydrate-modulated receptor binding site and an unusual cleavage site. Virus Res. 1993; 27: 147-60.

14. Stieneke-Groeber A, Vey M, Angliker H, Shaw E, Thomas G, Roberts C, et al. Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease. EMBO J. 1992; 11: 2407-14.14. Stieneke-Groeber A, Vey M, Angliker H, Shaw E, Thomas G, Roberts C, et al. Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease. EMBO J. 1992; 11: 2407-14.

15. Klenk H.D. et al., 2011. Molecular mechanisms of interspecies trans-mission and pathogenicity of influenza viruses: Lessons from the 2009 pandemic // Bioessays. - V. 33 Issue: 3. - P. 180-188.15. Klenk H.D. et al., 2011. Molecular mechanisms of interspecies trans-mission and pathogenicity of influenza viruses: Lessons from the 2009 pandemic // Bioessays. - V. 33 Issue: 3. - P. 180-188.

16. Nakajima K., et al., 1978. Recent human influenza A (H1N1) viruses are closely related genetically to strains isolated in 1950 // Nature. - V. 274. - P. 334-339.16. Nakajima K., et al., 1978. Recent human influenza A (H1N1) viruses are closely related genetically to strains isolated in 1950 // Nature. - V. 274. - P. 334-339.

17. Scholtissek С, et al., 1978. Genetic relatedness between the new 1977 epidemic strains (H1N1) of influenza and human influenza strains isolated between 1947 and 1957 (H1N1) // Virology. - V. 89. - P. 613-617.17. Scholtissek C, et al., 1978. Genetic relatedness between the new 1977 epidemic strains (H1N1) of influenza and human influenza strains isolated between 1947 and 1957 (H1N1) // Virology. - V. 89. - P. 613-617.

18. Kilbourne E.D., 1977. Influenza pandemics in perspective // J. Am. Med. Assoc.. - V. 237. P. 1225-1228.18. Kilbourne E. D., 1977. Influenza pandemics in perspective // J. Am. Med. Assoc .. - V. 237. P. 1225-1228.

19. Pyle G.F., 1986. The Diffusion of Influenza: Patterns and Paradigms. New Jersey: Rowan & Littlefield.19. Pyle G.F., 1986. The Diffusion of Influenza: Patterns and Paradigms. New Jersey: Rowan & Littlefield.

20. WHO, 2009. World now at the start of 2009 influenza pandemic. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/hlnl_pandemic_phase6_20090611/en/index.html (Дата обращения: 19.10.2012).20. WHO, 2009. World now at the start of 2009 influenza pandemic. [Electronic resource]. - Access mode: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/hlnl_pandemic_phase6_20090611/en/index.html (Date of access: 19.10.2012).

21. Киселев О.И., 2011. Геном пандемического вируса гриппа A/H1N1 v - 2009. - М.: Изд-во «Димитрейд График Групп». - 164 с.21. Kiselev OI, 2011. The genome of the pandemic influenza virus A / H1N1 v - 2009. - M .: Publishing house "Dimitrade Graph Group". - 164 p.

22. Kwan-Gett T.S., et al., 2009. Spring 2009 H1N1 influenza outbreak in King country Washington // Disaster Med Pub Health Preparedness. - V. 3. - P. SI09 - 116.22. Kwan-Gett T. S., et al., 2009. Spring 2009 H1N1 influenza outbreak in King country Washington // Disaster Med Pub Health Preparedness. - V. 3. - P. SI09 - 116.

23. Garten R.J., et al., 2009. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science. - V. 325. - P. 197-201.23. Garten R.J., et al., 2009. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A (H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science. - V. 325. - P. 197-201.

24. Седова E.С., Щербинин Д.H., Мигунов А.И., Смирнов Ю.А., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Цыбалова Л.М., Народицкий Б.С, Киселев О.И., Гинцбург А.Л. Гриппозные рекомбинантные вакцины. // Acta naturae. - 2012. - Т. 4 - №4 (15) - С. 17-27.24. Sedova E.S., Scherbinin D.N., Migunov A.I., Smirnov Yu.A., Logunov D.Yu., Shmarov M.M., Tsybalova L.M., Naroditsky B.S., Kiselev O.I., Gunzburg A.L. Flu recombinant vaccines. // Acta naturae. - 2012. - T. 4 - No. 4 (15) - S. 17-27.

25. Lopez-Macias С.Virus-like particle (VLP)-based vaccines for pandemic influenza: performance of a VLP vaccine during the 2009 influenza pandemic. // Hum. Vaccin. Immunother. 2012. V. 8. №3. P. 411-414.25. Lopez-Macias C. Virus-like particle (VLP) -based vaccines for pandemic influenza: performance of a VLP vaccine during the 2009 influenza pandemic. // Hum. Vaccin. Immunother. 2012. V. 8. No. 3. P. 411-414.

26. Durand, S., Cimarelli, A. The Inside Out of Lentiviral Vectors // Viruses. - 2011. - N 3. - P. 132-159. Sandrin, V., Russell, S., Cosset, F. Targeting retroviral and lentiviral vectors // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2003. N281. - P. 137-178.26. Durand, S., Cimarelli, A. The Inside Out of Lentiviral Vectors // Viruses. - 2011. - N 3. - P. 132-159. Sandrin, V., Russell, S., Cosset, F. Targeting retroviral and lentiviral vectors // Curr. Top Microbiol. Immunol. - 2003. N281. - P. 137-178.

27. Frecha, C., Costa, C., Levy, C., Negre, D., Russell, S., Maisner, A., Salles, G., Peng, K., Cosset, F., Verhoeyen, E. Efficient and stable transduction of resting В lymphocytes and primary chronic lymphocyte leukemia cells using measles virus gp displaying lentiviral vectors // Blood. - 2009. - N114. - P. 3173-3180.27. Frecha, C., Costa, C., Levy, C., Negre, D., Russell, S., Maisner, A., Salles, G., Peng, K., Cosset, F., Verhoeyen, E Efficient and stable transduction of resting in lymphocytes and primary chronic lymphocyte leukemia cells using measles virus gp displaying lentiviral vectors // Blood. - 2009. - N114. - P. 3173-3180.

28. Verhoeyen, E., Dardalhon, V., Ducrey-Rundquist, O., Trono, D., Taylor, N., Cosset, F. IL-7 surface-engineered lentiviral vectors promote survival and efficient gene transfer in resting primary T lymphocytes // Blood. - 2003. - N101. - P. 2167-2174.28. Verhoeyen, E., Dardalhon, V., Ducrey-Rundquist, O., Trono, D., Taylor, N., Cosset, F. IL-7 surface-engineered lentiviral vectors promote survival and efficient gene transfer in resting primary T lymphocytes // Blood. - 2003. - N101. - P. 2167-2174.

29. Azzouz, M., Ralph, G.S., Storkebaum, E., Walmsley, L., Mitrophanous, K., Kingsman, S., Carmeliet, P., Mazarakis, N. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model // Nature. - 2004. - N 429. - P. 413-17.29. Azzouz, M., Ralph, GS, Storkebaum, E., Walmsley, L., Mitrophanous, K., Kingsman, S., Carmeliet, P., Mazarakis, N. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model // Nature. - 2004 .-- N 429. - P. 413-17.

30. Kang SM, Yoo DG, Lipatov AS, Song JM, Davis CT, et al. (2009) Induction of long-term protective immune responses by influenza H5N1 vims-like particles. PLoS One 4: e4667.30. Kang SM, Yoo DG, Lipatov AS, Song JM, Davis CT, et al. (2009) Induction of long-term protective immune responses by influenza H5N1 vims-like particles. PLoS One 4: e4667.

31. Bright RA, Carter DM, Daniluk S, Toapanta FR, Ahmad A, et al. (2007) Influenza vims-like particles elicit broader immune responses than whole virion inactivated influenza virus or recombinant hemagglutinin. Vaccine 25: 3871-3878.31. Bright RA, Carter DM, Daniluk S, Toapanta FR, Ahmad A, et al. (2007) Influenza vims-like particles elicit broader immune responses than whole virion inactivated influenza virus or recombinant hemagglutinin. Vaccine 25: 3871-3878.

32. Bright RA, Carter DM, Crevar CJ, Toapanta FR, Steckbeck JD, et al. (2008) Cross-clade protective immune responses to influenza vimses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One 3: el501.32. Bright RA, Carter DM, Crevar CJ, Toapanta FR, Steckbeck JD, et al. (2008) Cross-clade protective immune responses to influenza vimses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One 3: el501.

33. Galarza JM, Latham T, Сиро A (2005) Virus-like particle vaccine conferred complete protection against a lethal influenza vims challenge. Viral Immunol 18: 365-372.33. Galarza JM, Latham T, Shiro A (2005) Virus-like particle vaccine conferred complete protection against a lethal influenza vims challenge. Viral Immunol 18: 365-372.

34. Mahmood K, Bright RA, Mytle N, Carter DM, Crevar CJ, et al. (2008) H5N1 VLP vaccine induced protection in ferrets against lethal challenge with highly pathogenic H5N1 influenza vimses. Vaccine 26: 5393-5399.34. Mahmood K, Bright RA, Mytle N, Carter DM, Crevar CJ, et al. (2008) H5N1 VLP vaccine induced protection in ferrets against lethal challenge with highly pathogenic H5N1 influenza vimses. Vaccine 26: 5393-5399.

35. Tao P, Luo M, Zhu D, Qu S, Yang Z, et al. (2009) Virus-like particle vaccine comprised of the HA, NA, and M1 proteins of an avian isolated H5N1 influenza virus induces protective immunity against homologous and heterologous strains in mice. Viral Immunol 22: 273-281.35. Tao P, Luo M, Zhu D, Qu S, Yang Z, et al. (2009) Virus-like particle vaccine comprised of the HA, NA, and M1 proteins of an avian isolated H5N1 influenza virus induces protective immunity against homologous and heterologous strains in mice. Viral Immunol 22: 273-281.

36. Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM (2007) Vims-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous strains of influenza virus. J Virol 81: 3514-3524.36. Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM (2007) Vims-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous strains of influenza virus. J Virol 81: 3514-3524.

37. Sambhara S, Stephenson I (2009) Moving influenza vaccines forward. Expert Rev Vaccines 8: 375-377.37. Sambhara S, Stephenson I (2009) Moving influenza vaccines forward. Expert Rev Vaccines 8: 375-377.

38. Chen ВJ, Leser GP, Morita E, Lamb RA (2007) Influenza vims hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles. J Virol 81: 7111-7123.38. Chen BJ, Leser GP, Morita E, Lamb RA (2007) Influenza vims hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles. J Virol 81: 7111-7123.

39. Ali A, Avalos RT, Ponimaskin E, Nayak DP (2000) Influenza vims assembly: effect of influenza vims glycoproteins on the membrane association of Ml protein. J Virol 74: 8709-8719.39. Ali A, Avalos RT, Ponimaskin E, Nayak DP (2000) Influenza vims assembly: effect of influenza vims glycoproteins on the membrane association of Ml protein. J Virol 74: 8709-8719.

40. Enami M, Enami К (1996) Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase glycoproteins stimulate the membrane association of the matrix protein. J Virol 70: 6653-6657.40. Enami M, Enami K (1996) Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase glycoproteins stimulate the membrane association of the matrix protein. J Virol 70: 6653-6657.

41. Gregoriades A, Frangione В (1981) Insertion of influenza M protein into the viral lipid bilayer and localization of site of insertion. J Virol 40: 323-328.41. Gregoriades A, Frangione B (1981) Insertion of influenza M protein into the viral lipid bilayer and localization of site of insertion. J Virol 40: 323-328.

42. Gomez-Puertas P, Albo C, Perez-Pastrana E, Vivo A, Portela A (2000) Influenzavirus matrix protein is the major driving force in vims budding. J Virol 74: 11538-11547.42. Gomez-Puertas P, Albo C, Perez-Pastrana E, Vivo A, Portela A (2000) Influenzavirus matrix protein is the major driving force in vims budding. J Virol 74: 11538-11547.

43. McCown MF, Pekosz A (2006) Distinct domains of the influenza a virus M2 protein cytoplasmic tail mediate binding to the Ml protein and facilitateinfectious virus production. J Virol 80: 8178-8189.43. McCown MF, Pekosz A (2006) Distinct domains of the influenza a virus M2 protein cytoplasmic tail mediate binding to the Ml protein and facilitateinfectious virus production. J Virol 80: 8178-8189.

44. Ruigrok RW, Barge A, Durrer P, Bmnner J, Ma K, et al. (2000) Membraneinteraction of influenza virus Ml protein. Virology 267: 289-298.44. Ruigrok RW, Barge A, Durrer P, Bmnner J, Ma K, et al. (2000) Membraneinteraction of influenza virus Ml protein. Virology 267: 289-298.

45. Johansson BE, Bucher DJ, Рокоту В A, Mikhail A, Kilboume ED (1989) Identification of PR8 Ml protein in influenza virus high-yield reassortants byMl-specific monoclonal antibodies. Virology 171: 634-636.45. Johansson BE, Bucher DJ, Rokotu B A, Mikhail A, Kilboume ED (1989) Identification of PR8 ML protein in influenza virus high-yield reassortants by ML-specific monoclonal antibodies. Virology 171: 634-636.

46. McMurry JA, Johansson BE, De Groot AS (2008) A call to cellular & humoral arms: enlisting cognate T cell help to develop broad-spectmm vaccines againstinfluenza A. Hum Vaccin 4: 148-157.46. McMurry JA, Johansson BE, De Groot AS (2008) A call to cellular & humoral arms: enlisting cognate T cell help to develop broad-spectmm vaccines against influenza A. Hum Vaccin 4: 148-157.

Claims

1. Способ получения вирусоподобных частиц (ВПЧ) белков вируса гриппа, включающий наработку и очистку ВПЧ, отличающийся тем, что ВПЧ нарабатывают путем раздельного культивирования трех клеточных культур MDCK: культуры, трансдуцированной генами белков гемагглютинина, нейраминидазы и матриксного белка Ml вируса гриппа (H1N1), культуры, трансдуцированной генами белков гемагглютинина вируса гриппа (H3N2), нейраминидазы и матриксного белка M1 вируса гриппа (H1N1), и культуры, трансдуцированной генами белков гемагглютинина вируса гриппа В, нейраминидазы и матриксного белка M1 вируса гриппа (H1N1), где указанные гены встроены в клеточную культуру MDCK через лентивирусную плазмиду pLenti6.3/TO/HA-M1-NA, а очистка включает осветление клеточного пула, обработку бензоназой, элюирование ВПЧ ступенчатым градиентом, эксклюзионную хроматографию, аффинную хроматографию, концентрирование путем ионообменной хроматографии и дополнительную очистку ВПЧ в два этапа гельпроникающей хроматографией и псевдоаффинной хроматографией после очистки.1. A method of producing virus-like particles (HPV) of influenza virus proteins, including the production and purification of HPV, characterized in that HPV is produced by separate cultivation of three cell cultures of MDCK: a culture transduced with the genes for hemagglutinin, neuraminidase and matrix protein protein Ml of the influenza virus (H1N1) a culture transduced with influenza virus hemagglutinin (H3N2) protein genes, neuraminidase and matrix influenza virus M1 protein (H1N1), and a culture transduced with influenza B virus hemagglutinin protein genes, neuraminidase matrix protein M1 of influenza virus (H1N1), where these genes are inserted into the MDCK cell culture via the lentiviral plasmid pLenti6.3 / TO / HA-M1-NA, and purification includes clarification of the cell pool, benzonase treatment, HPV elution with step gradient, size exclusion chromatography, affinity chromatography, concentration by ion exchange chromatography and additional purification of HPV in two stages by gel permeation chromatography and pseudo-affinity chromatography after purification.

2. Способ получения ВПЧ белков вируса гриппа по п. 1, где инкубацию культуры MDCK клеток-продуцентов ВПЧ вируса гриппа проводят с посевной концентрацией 3×10³ клеток/мл в биореакторах при температуре 37°С в течение 2-3 суток в ростовой питательной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, до появления монослоя, затем полученные клетки-продуценты промывают фосфатным буферным раствором, вносят поддерживающую питательную среду OptiMEM с добавлением 5 мкг/мл трипсина ТРСК, наработку ВПЧ проводят при температуре (37±1)°С в течение 72 ч в режиме непрерывного перемешивания при скорости вращения 10-11 об/мин по достижения активности РГА 1:64 и выше.2. The method of producing HPV proteins of the influenza virus according to claim 1, wherein the incubation of the MDCK culture of the cells producing the HPV influenza virus is carried out with a seed concentration of 3 × 10 ³ cells / ml in bioreactors at a temperature of 37 ° C for 2-3 days in growth nutrient DMEM medium containing 10% fetal calf serum until a monolayer appears, then the resulting producer cells are washed with phosphate buffered saline, OptiMEM supplemented culture medium is added with the addition of 5 μg / ml trypsin TRSC, the HPV run is performed at a temperature of (37 ± 1) ° С for 72 hours in dir IU continuous stirring at r / min rotation rate activity achieve 10-11 WGA 1:64 and higher.

3. Способ получения ВПЧ белков вируса гриппа по п. 2, где процедуру наработки ВПЧ гриппа повторяют многократно до тех пор, пока урожай ВПЧ в супернатанте по результатам РГА не становится менее 1:64.3. The method of producing HPV proteins of the influenza virus according to claim 2, where the procedure for producing the HPV flu is repeated many times until the HPV yield in the supernatant by the results of the RGA does not become less than 1:64.

4. ВПЧ вируса гриппа, полученная способом по пп. 1-3, предназначенная для создания антигриппозной вакцины, построенная из белков вируса гриппа: гемагглютинина, нейраминидазы и матриксного белка M1, где белки нейраминидазы и матриксного белка M1 являются белками штамма A/California/04/2009, а гемагглютинина - штамма A/California/04/2009, A/Michigan/45/2015(H1N1), A/Novosibirsk/01/2014, A/HongKong/4801/2014(H3N2), B/Phuket/3073/2013 или B/Brisbane/60/2008.4. HPV of influenza virus obtained by the method according to claims. 1-3, designed to create an influenza vaccine, constructed from proteins of the influenza virus: hemagglutinin, neuraminidase and matrix protein M1, where the proteins of neuraminidase and matrix protein M1 are proteins of strain A / California / 04/2009, and hemagglutinin is of strain A / California / 04/2009, A / Michigan / 45/2015 (H1N1), A / Novosibirsk / 01/2014, A / HongKong / 4801/2014 (H3N2), B / Phuket / 3073/2013 or B / Brisbane / 60/2008.

5. ВПЧ вируса гриппа по п. 4, где ДНК гена НА представляет собой SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.5. The HPV of the influenza virus according to claim 4, wherein the DNA of the HA gene is SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.