RU2678090C1 - Boiled sausage products authenticity confirmation method - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.SUBSTANCE: invention relates to the analytical chemistry and can be used for the cooked sausages authenticity and quality control. To do this, conducting the two-dimensional electrophoresis in the investigated product and the reference sample polyacrylamide gel, followed by the marker proteins comparison in the resulting electrophoregrams, which are identified by the mass spectrometry after extraction from the polyacrylamide gel. As the marker proteins choosing the Tropomyosin alpha 1 (pork), Tropomyosin alpha 1 (beef), Myosin light chain (beef), myosin 3 (pork) light chain like protein, phosphorylated MKC1f (pork) myosin light chains, MYL1 (beef) myosin phosphorylated light chains, Muscular enolase (pork), Muscular enolase (beef), creatine phosphokinase M-chain (pork), creatine phosphokinase M-chain (beef), Fructose bisphosphate aldolase A (pork), beef Homolog, Fructose bisphosphate aldolase A (beef), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (pork), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (beef), Myoglobin (pork), Myoglobin (beef).EFFECT: invention enables the cooked sausages authenticity determining high accuracy.1 cl, 2 dwg

Description

Заявляемое техническое решение относится к области контроля качества вареных колбасных изделий по их протеомному профилю. Техническое решение может использоваться в пищевой и перерабатывающей промышленности, а также в системе технического контроля в научных, производственных, учебных и сертификационных лабораториях.The claimed technical solution relates to the field of quality control of cooked sausages according to their proteomic profile. The technical solution can be used in the food and processing industry, as well as in the technical control system in scientific, production, training and certification laboratories.

Известен способ идентификации белков в протеомных исследованиях с помощью технологии масс-спектрометрии MALDI TOF MS (Claydon, A.J., Grundy Н.Н., Charlton A.J., Romero M.R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs // Food Add. Cont. Part A - Chem. Anal. Contr. Expos. Risk Assessm. 2015, 32(10): 1718-1729). Способ основан на идентификации белков и пептидов при получении одномерных электрофореграммA known method for the identification of proteins in proteomic studies using MALDI TOF MS mass spectrometry technology (Claydon, AJ, Grundy N.N., Charlton AJ, Romero MR Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs // Food Add. Cont Part A - Chem. Anal. Contr. Expos. Risk Assessm. 2015, 32 (10): 1718-1729). The method is based on the identification of proteins and peptides upon receipt of one-dimensional electrophoregrams

Недостатком способа является подавление большинства анализируемых белков с потерей функциональной активности в следствии применения денатурирующих агентов, таких как додецил сульфат натрия или мочевины, которые используются при фракционировании белков методом одномерного электорофореза. В результате чего снижается достоверность аутентичности вареных колбасных изделий.The disadvantage of this method is the suppression of most of the analyzed proteins with a loss of functional activity due to the use of denaturing agents, such as sodium dodecyl sulfate or urea, which are used in the fractionation of proteins by one-dimensional electrophoresis. As a result, the authenticity of cooked sausages is reduced.

Известен метод двумерного электрофореза по О'Фарреллу для изучения белков скелетных мышц свиней и коров (Saisekhar Y., Reddy P.M. Use of Troponin for Species Identification of Cattle and Buffalo Meats // J. Food Sci. Technol., 1995, vol. 32, no. 1, pp. 68-70). Метод основан на получении общего профиля всех белков. Однако данными методами невозможно идентифицировать аутентичность белкового продукта по общему пулу белков происхождения.Known two-dimensional electrophoresis method according to O'Farrell for the study of proteins of skeletal muscle of pigs and cows (Saisekhar Y., Reddy PM Use of Troponin for Species Identification of Cattle and Buffalo Meats // J. Food Sci. Technol., 1995, vol. 32, no. 1, pp. 68-70). The method is based on obtaining a common profile of all proteins. However, using these methods, it is not possible to identify the authenticity of a protein product from a common pool of protein of origin.

Известен метод целенаправленного изучения белков теплового шока в мышцах свиней и коров методом двумерного электрофореза. Метод основан на определении постоянной и индуцибельной изоформе Hsp70 в скелетных мышцах свиней, (Van Laack R.L., Faustman С., Sebranek J.G.. Pork quality and the expression of stress protein Hsp70 in swine // J. Anim. Sci. 1993. Vol. 71. P. 2958-2964). Недостатком указанного способа является невозможность полной аутентичной идентификации по одному маркерному белку сложного белкового объекта, подвергнутого тепловой обработке.A known method for the targeted study of heat shock proteins in the muscles of pigs and cows by two-dimensional electrophoresis. The method is based on the determination of the constant and inducible isoform of Hsp70 in pig skeletal muscle, (Van Laack RL, Faustman C., Sebranek JG. Pork quality and the expression of stress protein Hsp70 in swine // J. Anim. Sci. 1993. Vol. 71. P. 2958-2964). The disadvantage of this method is the impossibility of complete authentic identification by a single marker protein of a complex protein object subjected to heat treatment.

Известен метод определения протеома длиннейшей мышцы спины свиней (m. longissimus lumborum) (Terlouw С.Pig Longissimus lumborum proteome: Part II: Relationships between protein content and meat quality // Meat Sci. 2008. Vol. 80(4). P. 982-996), суммарно включавший 220 белковых фракций. Метод основан на получении общего профиля всех белков и позволяет устанавливать существование тендерных различий в белковых профилях и давать оценку изменения белкового состава, оказывающего влияние на качество мяса. Однако данный метод не позволяет осуществлять однозначную идентификацию гомогенной смеси субстратов на основе животного сырья, подвергнутой тепловой обработке.A known method for determining the proteome of the longest muscle of the back of pigs (m. Longissimus lumborum) (Terlouw C. Pig Longissimus lumborum proteome: Part II: Relationships between protein content and meat quality // Meat Sci. 2008. Vol. 80 (4). P. 982 -996), totaling 220 protein fractions. The method is based on obtaining a common profile of all proteins and makes it possible to establish the existence of gender differences in protein profiles and to assess changes in protein composition that affect meat quality. However, this method does not allow unambiguous identification of a homogeneous mixture of substrates based on animal raw materials subjected to heat treatment.

Известны также методы видовой идентификации мяса и мясной продукции методами жидкостной хроматографии, масс-спектроскопии, ИФА, ПЦР, в том числе, идентификация тканеспецифичных белков соединительной ткани комплексным методом, объединяющим пептидный фингерпринт и жидкостную хроматографию. Эти методы устанавливают ряд видоспецифичных белков, сохраняющихся в конечных мясных продуктах (пептиды HSP27, H-FABP, АТФ-синтаза, субъединица 1-цитохромного bc-комплекса), что дает возможность использования указанных белков в качестве потенциальных биомаркеров. Недостатком данных способов является перекрестная совпадающая идентификация разных филогенетических видов сырья, по достаточно узкому набору выявленных биомаркеров, что делает невозможным однозначную видоспецифическую идентификацию.There are also known methods of species identification of meat and meat products by liquid chromatography, mass spectroscopy, ELISA, PCR, including the identification of tissue-specific proteins of connective tissue by a complex method that combines peptide fingerprint and liquid chromatography. These methods establish a number of species-specific proteins that are stored in the final meat products (peptides HSP27, H-FABP, ATP synthase, subunit of the 1-cytochrome bc complex), which makes it possible to use these proteins as potential biomarkers. The disadvantage of these methods is the cross matching identification of different phylogenetic types of raw materials, according to a fairly narrow set of identified biomarkers, which makes it impossible to uniquely species-specific identification.

Е. REED с соавторами (США) в качестве маркера иммунного статуса предлагают сравнительный анализ фрагмента 5 килодальтон (kDa) комплемента С4 анафилотоксина (С4А) опытного и контрольного образцов животных тканей, при этом в качестве маркерных также предлагаются Аполипопротеин А1 и/или терминальный фрагмент альфа-1-анти-химотрипсина С (AACT) (United States Patent Application №2017 0030928 A1). Недостатком предлагаемого решения представляется ограниченность возможностей измерения - способ пригоден только для исследований нативных тканей-биоптатов.E. REED et al. (USA) as a marker of immune status offer a comparative analysis of the 5 kilodalton (kDa) fragment of the C4 complement of anaphylotoxin (C4A) of the experimental and control animal tissue samples, while Apolipoprotein A1 and / or the terminal alpha fragment are also offered as marker -1-anti-chymotrypsin C (AACT) (United States Patent Application No. 20170030928 A1). The disadvantage of the proposed solution is the limited measurement capabilities - the method is suitable only for the study of native tissue biopsies.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу техническим решением, принимаемым за прототип является способ идентификации меченых белков (Пат. US 20050233399 А1). В данном способе используются аффинно-меченые реакционно-способные реагенты, которые позволяют селективно выделять пептидные фрагменты или продукты реакции с данным белком (например, продуктами ферментативной реакции) из сложных смесей). При этом методе фрагмент белка одного или нескольких скелетных меченых белков или аффинно-меченых фрагментов белка секвенируют с помощью тандемной масс-спектрометрии для идентификации белка или фрагмента белка. Недостатками прототипа являются получение ложного результата вследствие перекрестного наложения белков, высокая стоимость и трудоемкость метода.The closest set of essential features to the claimed method, the technical solution adopted for the prototype is a method for identifying labeled proteins (US Pat. US 20050233399 A1). This method uses affinity-labeled reactive reagents that selectively isolate peptide fragments or reaction products with this protein (for example, enzymatic reaction products) from complex mixtures). In this method, a protein fragment of one or more skeletal labeled proteins or affinity-labeled protein fragments is sequenced using tandem mass spectrometry to identify a protein or protein fragment. The disadvantages of the prototype are to obtain a false result due to the cross-overlay of proteins, the high cost and complexity of the method.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является способ подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий, обеспечивающий высокую достоверность аутентификации, применимость для выявления фальсификации вареных колбасных изделий, снижение трудоемкости и стоимости исследований.The problem to which the claimed technical solution is directed is a method of confirming the authenticity of cooked sausages, providing high authentication accuracy, applicability to detect falsification of cooked sausages, reducing the complexity and cost of research.

Решение данной задачи, с достижением указанного технического результата обеспечивается тем, что из полиакриламидного геля извлекаются маркерные белки, с последующей масс-спектрометрической идентификацией, на: Тропомиозин альфа 1 (свинина), Тропомиозин альфа 1 (говядина), Миозиновая легкая цепь (говядина), Белок подобный легкой цепи миозина 3 (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MLC1f (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MYL1 (говядина), Мышечная енолаза (свинина), Мышечная енолаза (говядина), М-цепь креатинфосфокиназы (свинина), М-цепь креатинфосфокиназы (говядина), Фруктозобисфосфат альдолаза А (свинина) Гомолог говядины, Фруктозобисфосфат альдолаза А (говядина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (свинина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (говядина), Миоглобин (свинина), Миоглобин (говядина); полученная двумерная электрофореграмма геля сравнивается с двумерной электрофореграммой геля эталонного образца.The solution to this problem, with the achievement of the specified technical result, is ensured by the fact that marker proteins are extracted from the polyacrylamide gel, followed by mass spectrometric identification, for: Tropomyosin alpha 1 (pork), Tropomyosin alpha 1 (beef), Myosin light chain (beef), Protein-like myosin 3 light chain (pork), phosphorylated myosin light chains MLC1f (pork), phosphorylated myosin light chains MYL1 (beef), muscle enolase (pork), muscular enolase (beef), creatine phosphokinase M chain ( , Creatine phosphokinase M-chain (beef), Fructose bisphosphate aldolase A (pork) Beef homolog, Fructose bisphosphate aldolase A (beef), Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase (pork), Glycerohydrogen dehydrogenase (dehydrogen) ), Myoglobin (beef); the obtained two-dimensional electrophoregram of the gel is compared with the two-dimensional electrophoregram of the gel of the reference sample.

Выбор маркерных белков Тропомиозин альфа 1 (свинина), Тропомиозин альфа 1 (говядина), Миозиновая легкая цепь (говядина), Белок подобный легкой цепи миозина 3 (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MKC1f (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MYL1 (говядина), Мышечная енолаза (свинина), Мышечная енолаза (говядина), М-цепь креатинфосфокиназы (свинина), М-цепь креатинфосфокиназы (говядина), Фруктозобисфосфат альдолаза А (свинина) Гомолог говядины, Фруктозобисфосфат альдолаза А (говядина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (свинина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (говядина), Миоглобин (свинина), Миоглобин (говядина) объясняется их стабильностью в технологии приготовления вареных колбасных изделий. Использование иного состава маркерных белков, согласно научным исследованиям, не обеспечивало достижение технического результата, прежде в обеспечении точности аутентификации.Selection of marker proteins Tropomyosin alpha 1 (pork), Tropomyosin alpha 1 (beef), Myosin light chain (beef), Protein-like myosin 3 light chain (pork), phosphorylated myosin light chains MKC1f (pork), phosphorylated myosin light chains (MYL1 ), Muscular enolase (pork), Muscular enolase (beef), Creatine phosphokinase M-chain (pork), Creatine phosphokinase M-chain (beef), Fructose-bisphosphate aldolase A (pork) Beef homolog, Fructose-golisolase phosphate dehydrogenase (pork), G itseraldegid-3-phosphate dehydrogenase (bovine), myoglobin (pork), Myoglobin (beef) due to their stability in the technology of preparation of cooked sausages. The use of a different composition of marker proteins, according to scientific research, did not ensure the achievement of a technical result, primarily in ensuring the accuracy of authentication.

Заявляемый способ подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий по их протеомному профилю иллюстрируется схемой определения аутентичности вареных колбасных изделий на фиг. 1. Вареное колбасное изделие подвергают двумерному электрофорезу в полиакриламидном геле. Извлекаются маркерные белки с последующей масс-спектрометрической идентификациейя, с использованием например автоматической системы распознавания белков по международной автоматической базе данных. Идентификация осуществляется в отношении следующих маркерных белков: Тропомиозин альфа 1 (свинина), Тропомиозин альфа 1 (говядина), Миозиновая легкая цепь (говядина), Белок подобный легкой цепи миозина 3 (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MLC1f (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MYL1 (говядина), Мышечная енолаза (свинина), Мышечная енолаза (говядина), М-цепь креатинфосфокиназы (свинина), М-цепь креатинфосфокиназы (говядина), Фруктозобисфосфат альдолаза А (свинина) Гомолог говядины, Фруктозобисфосфат альдолаза А (говядина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (свинина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (говядина), Миоглобин (свинина), Миоглобин (говядина). Затем двумерная электрофореграмма геля исследуемого образца сравнивается с эталонной электрофореграммой геля вареного колбасного изделия.The inventive method for confirming the authenticity of cooked sausages according to their proteomic profile is illustrated by the scheme for determining the authenticity of cooked sausages in FIG. 1. Cooked sausage product is subjected to two-dimensional electrophoresis in polyacrylamide gel. Marker proteins are recovered, followed by mass spectrometric identification, using, for example, an automatic protein recognition system using an international automatic database. Identification is performed for the following marker proteins: Tropomyosin alpha 1 (pork), Tropomyosin alpha 1 (beef), Myosin light chain (beef), Myosin 3 light chain-like protein (pork), phosphorylated light chains of myosin MLC1f (pork), phosphorylated light chains myosin chains MYL1 (beef), muscle enolase (pork), muscle enolase (beef), creatine phosphokinase M-chain (pork), creatine phosphokinase M-chain (beef), fructose-bisphosphate aldolase A (pork goat meat), homolog , Ch tseraldegid-3-phosphate dehydrogenase (pork), glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (bovine), myoglobin (pork), Myoglobin (beef). Then, the two-dimensional electrophoregram of the gel of the test sample is compared with the reference gel electrophoregram of the cooked sausage product.

На Фиг. 2. (а, б, в) демонстрируется подтверждение применимости выбранного метода для подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий по протеомному профилю. Так на двумерной электрофореграмме (а) образца колбасы вареной подтверждается присутствие только свинины и говядины в соответствии с рецептурой; на 2-ДЭ (б и в) обнаруживаются также не заявленные компоненты - немышечные белки (соевые) и белок курицы, что отмечено пунктирными прямоугольниками. При этом, присутствие дополнительных белков дает менее интенсивное окрашивание других белков в маркерной группе, означающее весомое количество не заявленных белков в образце при неизменном общем содержании белка в пробе.In FIG. 2. (a, b, c) demonstrates the confirmation of the applicability of the selected method to confirm the authenticity of cooked sausages along the proteomic profile. So on a two-dimensional electrophoregram (a) of a sample of cooked sausage, the presence of only pork and beef is confirmed in accordance with the recipe; 2-DE (b and c) also reveal undeclared components — non-muscle proteins (soy) and chicken protein, which is indicated by dashed rectangles. At the same time, the presence of additional proteins gives a less intense staining of other proteins in the marker group, which means a significant amount of unclaimed proteins in the sample with a constant total protein content in the sample.

Claims (1)

Способ подтверждения аутентичности вареных колбасных изделий, включающий двумерный электрофорез в полиакриламидном геле исследуемого изделия и эталонного образца с последующим сравнением маркерных белков в полученных электрофореграммах, которые идентифицируют масс-спектрометрически после извлечения из полиакриламидного геля, отличающийся тем, что в качестве маркерных белков выбирают Тропомиозин альфа 1 (свинина), Тропомиозин альфа 1 (говядина), Миозиновую легкую цепь (говядина), Белок, подобный легкой цепи миозина 3 (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MKC1f (свинина), фосфорилируемые легкие цепи миозина MYL1 (говядина), Мышечную енолазу (свинина), Мышечную енолазу (говядина), М-цепь креатинфосфокиназы (свинина), М-цепь креатинфосфокиназы (говядина), Фруктозобисфосфат альдолазу А (свинина) Гомолог говядины, Фруктозобисфосфат альдолазу А (говядина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (свинина), Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (говядина), Миоглобин (свинина), Миоглобин (говядина).A method of confirming the authenticity of cooked sausage products, including two-dimensional electrophoresis in a polyacrylamide gel of the test product and a reference sample, followed by comparison of marker proteins in the obtained electrophoregrams, which are identified by mass spectrometry after extraction from polyacrylamide gel, characterized in that Tropomyosin al 1 is selected as marker proteins (pork), tropomyosin alpha 1 (beef), myosin light chain (beef), protein similar to myosin 3 light chain (pork), phosphory MKC1f myosin light chains (pork), MYL1 phosphorylated myosin light chains (beef), muscle enolase (pork), muscular enolase (beef), creatine phosphokinase M-chain (pork), creatine phosphine phospholase (G-chain phospholase) pork) Beef homolog, Fructose bisphosphate aldolase A (beef), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (pork), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (beef), Myoglobin (pork), meat.

Images