RU2670889C1 - Способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина - Google Patents
Способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670889C1 RU2670889C1 RU2017124160A RU2017124160A RU2670889C1 RU 2670889 C1 RU2670889 C1 RU 2670889C1 RU 2017124160 A RU2017124160 A RU 2017124160A RU 2017124160 A RU2017124160 A RU 2017124160A RU 2670889 C1 RU2670889 C1 RU 2670889C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- recombinant glycoprotein
- insulin
- culture medium
- glycoprotein
- microorganism
- Prior art date
Links
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 68
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 33
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 94
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 47
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 36
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 claims description 21
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 17
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims description 17
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 16
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 16
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 8
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 6
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 11
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 11
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 11
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000015806 constitutional megaloblastic anemia with severe neurologic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RBMGJIZCEWRQES-DKWTVANSSA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RBMGJIZCEWRQES-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000801232 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940033655 asparagine monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- XXWCODXIQWIHQN-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NCCCCN XXWCODXIQWIHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-IQFXPAJWSA-L cobalt(3+);[5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2s)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7,12,17-tetrahyd Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@H](C)OP([O-])(=O)OC3C(C(OC3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-IQFXPAJWSA-L 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000013331 inoculum cultivation Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SZQUEWJRBJDHSM-UHFFFAOYSA-N iron(3+);trinitrate;nonahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Fe+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O SZQUEWJRBJDHSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- A61K38/1741—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals alpha-Glycoproteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, включающий культивирование микроорганизма, содержащего полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гликопротеин, в культуральной среде, содержащей инсулин. Предложен способ контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, включающий (а) культивирование микроорганизма, содержащего полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гликопротеин, в культуральной среде для выращивания микроорганизма и (б) добавление инсулина в культуральную среду и культивирование указанного микроорганизма с получением гликопротеина. Группа изобретений позволяет контролировать и снижать содержание N-гликанов или О-гликанов в рекомбинантном гликопротеине по мере повышения концентрации инсулина в культуральной среде, что может быть полезно при получении фармацевтического рекомбинантного гликопротеина. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 5 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Как слитый белок TNFR-Fc, в котором лиганд-связывающая часть человеческого рецептора TNF-α р75 (TNFR, рецептор TNF-α) связана с Fc-фрагментом человеческого IgG1, этанерцепт был представлен компанией Amgen под торговым названием Энбрел (Enbrel) в 2002 г. Этанерцепт конкурентно ингибирует связывание с рецепторами TNF-α на поверхности клетки in vivo, ингибируя посредством этого связанный с TNF-α иммунный ответ. Соответственно, этанерцепт используют как ингибитор TNF-α при ревматоидном артрите, псориазе, анкилозирующем спондилите и так далее, и в настоящее время проводятся клинические исследования по его применению при васкулите, болезни Альцгеймера и болезни Крона.
В то же время, генный рекомбинантный фармацевтический продукт представляет собой фармацевтический продукт, содержащей в качестве активного ингредиента пептид, белок и так далее, полученный с использованием методики генетических манипуляций. Применение биотехнолоии обеспечивает преимущества, состоящие в возможности получения большого числа высоко чистых рекомбинантных белков, которые трудно получить в естественном состоянии, но сама экспрессионная структура может быть нестабильной, поскольку ген целевого белка вводят в клетку-хозяина извне. Кроме того, белки получают экспрессией гена в микроорганизме или клетке животного или растения, но не в организме человека, рекомбинантные белки могут отличаться от нативных белков по структурным, физико-химическим, иммунохимическим и биологическим свойствам и особенностям (Kwon, et al., FDC Legislation Research V, vol. 1, 2, 13-21, 2010).
В частности, в случае гликопротеина, гликозилирование и структура или форма гликоформы (сахарной цепи) могут различаться в зависимости от условий культивирования. Иными словами, в процессе получения гликопротеинов различия в структурах гликоформ или количествах сахаридов, составляющих структуру гликоформы, ведут к различным типам гликоформ, приводя посредством этого к неоднородности в зависимости от различий в условиях получения. В случае гликопротеинов с отличающимися структурами гликоформ, они отличаются от нативных форм по перемещениям или распределению в тканях in vivo или являются антагонистами нативных форм, приводя к нежелательной реакции. При продолжительном введении в течение длительного периода времени они действуют как антигены и могут приводить к иммунологическим проблемам.
Как описано выше, поскольку гликоформы могут быть важным фактором, который может влиять на фармацевтический эффект и перемещения in vivo, контроль структур гликопротеинов очень важен в области разработки рекомбинантных гликопротеиновых продуктов для лекарственных средств и разработки технологий массового производства.
В этом отношении, в публикации патента Кореи №2011-0139292, в качестве предшествующего уровня техники, раскрыт контроль гликозилирования белка и связанные с этим композиции и способы, и в публикации патента Кореи №2012-0134116 раскрыт способ увеличения числа занятых сайтов N-гликозилирования на терапевтических гликопротеинах.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
С учетом описанного выше предшествующего уровня техники, авторы настоящего изобретения приложили значительные усилия, чтобы найти способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, и в результате подтвердили, что гликозилирование рекомбинантного гликопротеина можно контролировать путем использования культуральной среды, содержащей инсулин, завершив посредством этого настоящее изобретение.
Техническое решение
Основной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, включающего культивирование микроорганизма, содержащего полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гликопротеин, в культуральной среде, содержащей инсулин.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, включающего: (а) культивирование микроорганизма, содержащего полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гликопротеин, в культуральной среде для выращивания микроорганизма; и (б) добавление инсулина в культуральную среду и культивирование указанного микроорганизма с получением гликопротеина.
Полезный эффект
Способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина по настоящему изобретению позволяет контролировать активность, фолдинг, секрецию, стабильность, период полувыведения рекомбинантого гликопротеина из плазмы и иммунный ответ на него.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На ФИГ. 1 показана карта расщепления pCUCBin-mSig-TNFcept.
На ФИГ. 2 показаны число жизнеспособных клеток (единица измерения: 105 клеток/мл) и жизнеспособность (%) в зависимости от продолжительности культивирования клеток (единица измерения: сутки) в типичном воплощении настоящего изобретения.
НАИЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В качестве аспекта, направленного на выполнение указанных выше задач, согласно настоящему изобретению предложен способ контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, включающий культивирование микроорганизма, содержащего полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гликопротеин, в культуральной среде, содержащей инсулин.
Гликопротеин относится к белку, в котором сахарид связан с определенной аминокислотой полипептида, и сахарид может относиться к гликоформе, например, гликоформе, в которой связаны по меньшей мере один или два моносахарида. В качестве примера, гликоформа, как олигосахарид, где с гликопротеином связаны различные моносахариды, может содержать такие моносахариды, как фукоза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, галактоза, манноза, сиаловая кислота, глюкоза, ксилозы, маннозо-6-фосфат и так далее, их разветвленные формы и так далее.
В качестве примера, рекомбинантный гликопротеин может представлять собой слитый белок иммуноглобулина. Слитый белок иммуноглобулина может содержать Fc-область, представляющую собой часть иммуноглобулина, содержащую константный домен 2 тяжелой цепи (CH2), константный домен 3 тяжелой цепи (CH3) и шарнирную область, без вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, константного домена 1 тяжелой цепи (CH1) и константного домена легкой цепи (CL1) иммуноглобулина (Ig).
В качестве еще одного примера, рекомбинантный гликопротеин может представлять собой слитый белок TNFR-Fc.
Рецептор фактора некроза опухоли (TNFR) относится к рецепторному белку, связывающемуся с TNF-α. Белок TNFR может представлять собой, без ограничения, белок TNFRI(p55) или белок TNFRII(p75), предпочтительно белок TNFRII. Кроме того, TNFRII может быть использован альтернативно с представителем 1 В суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли (TNFRSF1B). Белок TNFRII разделяют на 4 домена и трансмембранную область, например, без ограничения, белок TNFRII, состоящий из 235 аминокислот, включая 4 домена и трансмембранную область. Информация о белках TNFRI и TNFRII может быть получена из известных баз данных, таких как GenBank Национальных институтов здравоохранения США. Например, белки TNFRI и TNFRII могут представлять собой, без ограничения, белки с регистрационным номером NP_001056 или Р20333.
Обладая биологической активностью по связыванию с TNF-α, сверхэкспрессия которого in vivo, как известно, приводит к различным заболеваниям, белок TNFR может быть использован для лечения заболеваний, опосредованных TNF-α. Для применения в указанных целях белок TNFR может быть получен и использован в форме слитого белка, период полувыведения которого увеличен слиянием Fc-области иммуноглобулина и белка TNFR.
Слитый белок «рецептор фактора некроза опухоли (TNFR) - Fc» относится к слитому белку, где весь белок TNFR или его часть связаны с Fc-областью иммуноглобулина посредством ферментативной реакции, или к продукту, где эти два полипептида экспрессированы с получением одного полипептида посредством генетических манипуляций. Слитый белок TNFR-Fc может иметь белок TNFR и Fc-область иммуноглобулина, связанные друг с другом, без ограничения, непосредственно или через пептидный линкер. Неограничивающим примером слитого белка TNFR-Fc может быть этанерцепт (патент США 7915225; 5605690; Re. 36755).
Слитый белок TNFR-Fc может быть получен слиянием всего белка TNFR или его части с Fc-областью иммуноглобулина, например, без ограничения, 232 аминокислот Fc-области иммуноглобулина, включая шарнирную область, и аминокислотных сайтов 1-235 TNFRII. Кроме того, кодоны слитого белка TNFR-Fc могут быть оптимизированы в соответствии с клетками-хозяевами для экспрессии, и слитый белок TNFR-Fc может, например, без ограничения, представлять собой слитый белок TNFR-Fc, кодоны которого оптимизированы специально для клеток СНО. Слитый белок TNFR-Fc представляет собой не только какую-либо одну аминокислотную последовательность, но также аминокислотные последовательности, на 70% или более, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более, наиболее предпочтительно на 98% аналогичны этой аминокислотной последовательностью, и включает все белки, обладающие активностью по существенному связыванию с TNF-α. Очевидно, при условии, что последовательность, обладающая таким сходством, представляет собой аминокислотную последовательность, идентичную слитому белку TNFR-Fc, или аминокислотную последовательность, обладающую соответствующей биологической активностью, объем настоящего изобретения включает белковые мутанты с аминокислотными последовательностями, часть которых удалена, модифицирована, заменена или добавлена.
Fc относится к части иммуноглобулина, содержащей константный домен 2 тяжелой цепи CH2), константный домен 3 тяжелой цепи (CH3) и шарнирную область, без вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, константного домена 1 тяжелой цепи CH1) и константного домена легкой цепи (CL1) иммуноглобулина (Ig). Кроме того, Fc-область по настоящему изобретению включает не только нативную форму аминокислотной последовательности, но также ее производные аминокислотные последовательности. Производная аминокислотная последовательность означает, что один или более чем один аминокислотный остаток нативной формы аминокислотной последовательности отличается в силу делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены или их комбинации. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может представлять собой Fc-область, имеющую происхождение от IgG, IgM, IgE, IgA или IgD, или их комбинаций или гибридов. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина предпочтительно имеет происхождение от IgG, который, как известно, увеличивает период полувыведения связывающего белка, и более предпочтительно имеет происхождение от IgG1, но не ограничена этим подклассом и может быть получена из IgG любого подкласса (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4).
Fc-область может быть получена генетически или получением гена, кодирующего Fc-область, с использованием рекомбинантного вектора или расщеплением очищенных поликлональных антител или моноклональных антител подходящим ферментом, таким как папаин, пепсин и так далее, соответственно.
Слитый белок TNFR-Fc может быть получен ведением вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий слитый белок, в клетку-хозяина и его экспрессией. В типичном воплощении настоящего изобретения в качестве вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий слитый белок TNFR-Fc, использовали вектор pCUCBin-mSig-TNFcept, и трансформировали им клетки СНО для экспрессии слитого белка TNFR-Fc.
В настоящем изобретении микроорганизм может быть использован в том же значении, что клетка-хозяин или трансформант.Неограничивающим примером может быть линия животных клеток, растительная или дрожжевая клетка-хозяин. В типичном воплощении настоящего изобретения в качестве микроорганизма использовали клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО), но без ограничения ими, при условии, что микроорганизм может быть трансформирован полинуклеотидом, кодирующим рекомбинантный гликопротеин.
Полинуклеотид, при условии, что его можно экспрессировать в микроорганизме, может быть введен в хромосому и расположен в ней или расположен вне хромосомы. Полинуклеотид включает РНК и ДНК, кодирующие целевой белок. Способ введения полинуклеотида не ограничен, при условии, что его применяют в данной области. В качестве примера, полинуклеотид может быть введен в микроорганизм в форме экспрессионной кассеты, генной конструкции, содержащей все обязательные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. В качестве еще одного примера, может быть использован способ модификации вектором экспрессии, содержащим последовательность полинуклеотида, кодирующую целевой белок, функционально связанный с подходящей регуляторной последовательностью таким образом, что целевой белок может быть экспрессирован в подходящей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность содержит промотор, инициирующий транскрипцию, случайную операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий домен связывания с рибосомами на мРНК, и последовательность для регуляции транскрипции и трансляции. После трансформации подходящей клетки-хозяина вектор может быть реплицирован или функционировать независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в сам геном хозяина. Относительно вектора, используемого в настоящем изобретении, может не быть конкретных ограничений, при условии, что вектор может быть реплицирован в клетке-хозяине, и может быть использован любой вектор, известный в данной области.
Паттерн гликозилирования рекомбинантного гликопротеина означает паттерн экспрессии гликоформы, проявляющийся при гликозилировании гликопротеина. Примеры паттерна гликозилирования включают наличие гликозилирования, связывающего сахарид с белком, тип сахарида, тип гликозилирования, содержание сахарида, состав моносахарида (сахаридов), включая молярное соотношение, расположение гликоформы, структуру гликоформы, включая последовательность, место гликозилирования, количество занятых сайтов гликозилирования, число гликоформ и относительное содержание в соответствии со структурой. В зависимости от паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина возможны различия по биологической активности или стабильности in vivo.
В настоящем изобретении инсулин может контролировать N-связанное гликозилирование рекомбинантного гликопротеина. В настоящем изобретении N-связанное гликозилирование может быть использовано в том же значении, что N-гликозилирование. В качестве примера, инсулин может снижать содержание N-гликанов в рекомбинантном гликопротеине. В настоящем изобретении N-гликан может быть использован в том же значении, что N-гликоформа, и может относиться к случаю, когда сахарид связан с аспарагином белка.
В настоящем изобретении инсулин может контролировать О-связанное гликозилирование рекомбинантного гликопротеина. В настоящем изобретении N-связанное гликозилирование может быть использовано в том же значении, что О-гликозилирование. В качестве еще одного примера, инсулин может снижать содержание О-гликанов в рекомбинантном гликопротеине. В настоящем изобретении О-гликан может быть использован в том же значении, что О-гликоформа, и может относиться к случаю, когда сахарид связан с серином или треонином белка.
В настоящем изобретении инсулин может контролировать N-связанное гликозилирование и О-связанное гликозилирование рекомбинантного гликопротеина.
В типичном воплощении настоящего изобретения было обнаружено, что добавление инсулина влияет на паттерн гликозилирования гликопротеина (Таблица 2). Конкретно, было подтверждено, что добавление инсулина контролирует и снижает содержание N-гликанов и/или О-гликанов. В частности, было подтверждено, что в процессе культивирования клеток, способных продуцировать гликопротеин, добавление инсулина в фазе продуцирования играет важную роль в контроле паттерна гликозилирования.
Концентрация инсулина может составлять от 0,0001 мг/л до 1 г/л относительно общего объема культуральной среды. В типичном воплощении настоящего изобретения было подтверждено, что содержание N-гликанов и/или О-гликанов можно контролировать и снижать по мере повышения концентрации инсулина (Таблица 2).
Ограничений относительно культуральной среды нет, при условии, что ее используют в данной области для культивирования микроорганизма или клетки-хозяина, содержащих полинуклеотид, кодирующий гликопротеин. Например, культуральная среда может содержать аминокислоту, такую как L-глутамин, тимидин, аланин, моногидрохлорид аргинина, моногидрат аспарагина, аспарагиновую кислоту, цистеин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, моногидрохлорид лизина, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин (динатриевую соль, дигидрат) и валин. В качестве еще одного примера, культуральная среда может содержать глюкозу, бикарбонат натрия, хлорид натрия, безводный хлорид кальция, пентагидрат сульфата меди, нонагидрат нитрата железа, гептагидрат сульфата железа, хлорид калия, безводный сульфат магния, безводный хлорид магния, фосфат натрия (одноосновный или двухосновный, моногидрат), гептагидрат сульфата цинка, гипоксантин, дигидрохлорид путресцина, пируват натрия, биотин, D-пантотенат кальция, хлорид холина, цианкобаламин, фолиевую кислоту, i-инозит, никотинамид, моногидрохлорид пиридоксаля, моногидрохлорид пиридоксина, рибофлавин, моногидрохлорид тиамина, безводную глюкозу, хлорид калия, фосфат натрия (NaH2PO4⋅H2O), гидрокарбонат натрия (NaHCO3), HEPES (свободная кислота), сульфат декстрана, хлорид натрия, аскорбиновую кислоту, D-биотин, Нурер 1510 или комбинацию из двух или более. Исходная культура для посева может также содержать МТХ для повышения уровня экспрессии.
Культивирование может представлять собой метод перфузионного культивирования. Культивирование может представлять собой метод культивирования перфузией культуральной жидкости вокруг микроорганизма. Метод перфузионного культивирования позволяет легко контролировать концентрацию инсулина в соответствии с целевым паттерном гликозилирования.
В качестве еще одного аспекта, согласно настоящему изобретению предложен способ контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, включающий: (а) культивирование микроорганизма, содержащего полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гликопротеин, в культуральной среде для выращивания микроорганизма; и (б) добавление инсулина в культуральную среду и культивирование указанного микроорганизма с получением гликопротеина.
В качестве примера, рекомбинантный гликопротеин может представлять собой слитый белок иммуноглобулина. В качестве еще одного примера, рекомбинантный гликопротеин может представлять собой слитый белок TNFR-Fc, описанный выше.
Стадия (а), представляющая собой стадию роста, может дополнительно включать культивирование для посева.
Культуральная среда по стадии (а) не может содержать инсулин.
Стадия (б) может представлять собой стадию добавления инсулина в различных концентрациях в соответствии с целевым паттерном гликозилирования. В типичном воплощении настоящего изобретения было обнаружено, что в фазе роста содержание N-гликанов и/или О-гликанов варьировало в зависимости от добавления инсулина. В частности, было подтверждено, что добавление инсулина позволяет контролировать и снижать содержание N-гликанов и/или О-гликанов. В частности, было подтверждено, что в процессе культивирования клеток, способных продуцировать гликопротеин, добавление инсулина в фазе продуцирования играет важную роль в контроле паттерна гликозилирования.
Концентрация инсулина может составлять от 0,0001 мг/л до 1 г/л относительно общего объема культуральной среды. Было подтверждено, что содержание N-гликанов и/или О-гликанов можно контролировать и снижать по мере повышения концентрации инсулина (Таблица 2).
Инсулин может контролировать N-связанное гликозилирование и О-связанное гликозилирование рекомбинантного гликопротеина. В качестве примера, инсулин может снижать содержание N-гликанов в рекомбинантном гликопротеине. В качестве еще одного примера, инсулин может снижать содержание О-гликанов в рекомбинантном гликопротеине.
В качестве еще одного аспекта, согласно настоящему изобретению предложен состав культуральной среды для контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина. Инсулин можно включать в концентрации от 0,0001 мг/л до 1 г/л относительно общего объема культуральной среды.
Например, в процессе культивирования микроорганизма эту культуральную среду можно использовать только в фазе продуцирования.
ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет подробно описано следующими типичными воплощениями. Тем не менее, типичные воплощения раскрыты здесь исключительно в иллюстративных целях, и их не следует толковать как ограничение объема настоящего изобретения.
Пример 1: Получение клеточной линии для получения гликопротеина
1-1. Получение вектора
Применяли методы, чаще всего используемые в молекулярной биологии, такие как обработка рестрикционными ферментами, очистка плазмидной ДНК, конъюгация участков ДНК и трансформация Е. coli, с минимальными модификациями способов, описанных в Molecular Cloning (2nd edition), Sambrook etal.
Ген человеческого рецептора TNF р75 (TNFR) клонировали с использованием библиотеки кДНК, где в качестве матрицы была использована мРНК, выделенная из клеточной линии HUVEC, и проводили слияние клонированного гена с Fc-областью человеческого IgGi, получая TNFR-IgGi. С использованием вектора pTOP-BA-RL-pA (публикация патента Кореи №10-2012-0059222; содержит «CMVe», «СВ» и «интрон бета-актина») в качестве матрицы и TNFR-IgG1 получали вектор pCUCBin-mSig-TNFcept.
1-2. Культивирование материнских клеток
В качестве материнских клеток использовали CHO/dhfr- (CHODXB11). CHO/dhfr- представляют собой клетки с дефицитом дигидрофолатредуктазы (DHFR), выделенные из клеток СНО.
1-3. Трансформация и выбор клеточной линии-продуцента
Трансформированные клетки получали с использованием CHO/dhfr- (CHODXB11) и вектора pCUCBin-mSig-TNFcept, содержащего ген рецептора TNF р75 (TNFR), и ген амплифицировали, используя концентрацию МТХ. Клетки идентифицировали как трансформированные клетки и отбирали отдельные клоны в качестве клеточной линии-продуцента. Затем клеточные линии помещали в стеклянную емкость и хранили в жидком азоте.
Пример 2: Культивирование клеточной линии для получения гликопротеина и сбор белка
Использовали разные культуральные среды в зависимости от фазы культивирования. Для получения основной культуральной среды инсулин, 5,8 г/л, добавляли в среду X011SB (Merck Millipore, номер по каталогу 102443). В фазе культивирования для посева использовали среду (Media EC-SI), где в основную культуральную среду были добавлены Юг/л безводной глюкозы (Sigma) и 0,584 г/л глутамина, глицина и серина (Sigma). В фазе роста использовали среду (EC-GM), где в основную культуральную среду были добавлены 5 г/л безводной глюкозы и 0,584 г/л L-глутамина, глицина и серина. В фазе продукции использовали среду (ЕС-РМ), где в основную культуральную среду были добавлены 15 г/л безводной глюкозы и 0,584 г/л L-глутамина, глицина и серина.
Стеклянную емкость с клеточной линией, полученной в Примере 1, быстро размораживали на водяной бане и содержащиеся в ней клетки перемещали в пробирку Falcon, содержащую 10 мл культуральной среды. Полученные клетки центрифугировали и удаляли супернатант. Затем клетки ресуспендировали в 10 мл среды ЕС-SI и высевали их в колбу Эрленмейера до конечного объема 50 мл. Клетки культивировали с использованием биореактора для клеточных культур CelliGen310 объемом 5 л, получая 2 л по рабочему объему. По достижении числа жизнеспособных клеток 2×106 клеток/мл после пятикратного культивирования инокулята, культуральную среду начинали заменять на EC-GM посредством перфузионного культивирования. По мере роста числа жизнеспособных клеток повышали скорость смены культуральной среды для эффективного разделения клеток. Когда число жизнеспособных клеток достигало 1,5×107 клеток/мл (Фиг. 2), культуральную среду меняли на ЕС-РМ, переходя от фазы роста к фазе продуцирования. Сбор повторяли в общей сложности четыре раза и собранный белок очищали. Полученное значение представляло собой среднее значение четырех сборов.
Пример 3: Анализ содержания гликанов 3-1. Анализ содержания О-гликанов Образец, очищенный в Примере 2, разбавляли буфером с 25 мМ фосфатом натрия и рН 6,3 до 100 мкл и концентрации 1,0 мг/мл. К каждому образцу добавляли по 4 мкл N-гликозидазы F (1 ЕД/мкл Roche), 2 мкл нейраминидазы (1 ЕД/100 мкл) и 2 мкл трипсина (1 мг/мл, Promega) и проводили взаимодействие при 37°С в течение 18 часов. Затем проводили LC-MS-анализ.
Вносили 80 мкл образца и триптические пептиды затем анализировали с использованием C18RP (4,6 мм × 250 мм, 5 мкм, 300 A; Vydac, номер по каталогу 218ТР54). В качестве подвижной фазы А использовали 0,1% TFA в воде и в качестве подвижной фазы В использовали 0,1% TFA в 80%-м холодном CAN. Анализ проводили в условиях градиента на протяжении 150 минут.Используя UV-детектор, пептид выявляли на 215 нм, и исследуемый материал, разделенный посредством LC, соединяли с масс-спектрометром (LTQXL, Thermo) для MS-анализа и расчета относительной площади (%) О-гликопептидов.
3-2. Анализ содержания N-гликанов
Образец, очищенный в Примере 2, и стандартный образец (этанерцепт, Pfizer) разбавляли разбавителем для образцов (25 мМ фосфат натрия (буфер с рН 6,3)) до 3,0 мг/мл. Смешивали по 100 мкл каждого образца и 6 мкл раствора N-гликозидазы F и проводили взаимодействие при 37°С в течение 20 часов.
После взаимодействия в раствор добавляли 400 мкл этанола и перемешивали на вихревой мешалке. Полученный раствор центрифугировали, после чего супернатант переносили в пробирку типа Эппендорф и полностью высушивали с использованием концентратора SpeedVac. После добавления 10 мкл агента для мечения 2-АА к высушенному образцу и их перемешивания смесь подвергали взаимодействию при 45°С и охлаждали до комнатной температуры.
На одноразовую пробирку для культивирования помещали картридж GlycoClean S, после чего последовательно пропускали дистиллированную воду, 30%-й ацетат и ацетонитрил. Охлажденный образец вносили в центр мембраны картриджа и пропускали с ацетонитрилом. Для элюирования N-гликанов в картридж вносили дистиллированную воду, собирая элюат в пробирку типа Эппендорф. Полученный раствор гликанов лиофилизировали и хранили до анализа.
Анализ проводили, используя колонку для HPLC (AsahiPak NH2P-50 4Е, 4,6×250 мм) в условиях градиента в течение 130 минут с использованием 0,5 мМ ацетата аммония (рН 6,7) и 250 мМ ацетата аммония (рН 5,6) в качестве подвижных фаз А и В, соответственно. Для выявления использовали флуорометрический детектор и рассчитывали суммарную площадь пиков по числу сиаловых кислот, присутствующих на конце N-гликана. В случае отсутствия сиаловой кислоты его отмечали как нейтральный. В случае одной (моносиалил) и двух (дисиалил) их отмечали как -1 и -2, соответственно.
Экспериментальный пример 1. Культивирование клеточной линии с использованием культуральной среды без инсулина, добавляемого в фазе продуцирования
Для культивирования клеточной линии использовали такую же культуральную среду, как в фазе продукции в Примере 2, но без инсулина. Анализировали содержание N-гликанов (%) и долю относительной площади (%) О-гликопептидов при разной температуре, и они показаны в Таблице 1 ниже.
Экспериментальный пример 2. Сравнение изменений в паттернах гликозилирования в зависимости от добавления инсулина в фазе продукции
Сравнивали паттерны гликозилирования в зависимости от добавления инсулина, и они показаны в Таблице 2 ниже.
В результате было показано, что в процессе культивирования клеток, способных продуцировать гликопротеин, добавление инсулина в фазе продукции влияло на паттерн гликозилирования. В частности, было показано, что содержание N-гликанов и/или О-гликанов изменялось в зависимости от добавления инсулина. Конкретно, было подтверждено, что добавление инсулина позволяет контролировать и снижать содержание N-гликанов и/или О-гликанов.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные иллюстративные воплощения, специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение, будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без выхода за рамки технической сущности или существенных характеристик настоящего изобретения. Таким образом, описанные выше воплощения во всех отношениях являются иллюстративными и не являются ограничивающими. Кроме того, объем настоящего изобретения определен приложенной формулой изобретения, но не подробным описанием, и следует понимать, что все модификации или варианты, имеющие происхождение от значений и объема настоящего изобретения и его эквивалентов, включены в объем приложенной формулы изобретения.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Поскольку он позволяет изменять содержание N-гликанов и/или О-гликанов в зависимости от добавления инсулина, особенно в фазе роста, способ контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина по настоящему изобретению может быть очень полезен при получении фармацевтического рекомбинантного гликопротеина, где единообразие связывания сахаридных молекул играет важную роль.
Claims (14)
1. Способ контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, включающий культивирование микроорганизма, содержащего полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гликопротеин, в культуральной среде, содержащей инсулин, где инсулин снижает содержание N-гликана или О-гликана в рекомбинантном гликопротеине.
2. Способ по п.1, где рекомбинантный гликопротеин представляет собой слитый белок иммуноглобулина.
3. Способ по п.1, где рекомбинантный гликопротеин представляет собой слитый белок TNFR (рецептор фактора некроза опухоли)-Fc.
4. Способ по п.1, где концентрация инсулина составляет от 0,0001 до 0,03 мг/л относительно общего объема культуральной среды.
5. Способ по п.1, где инсулин контролирует N-связанное гликозилирование и О-связанное гликозилирование.
6. Способ по п.1, где культивирование представляет собой метод перфузионного культивирования.
7. Способ контроля паттерна гликозилирования рекомбинантного гликопротеина, включающий:
(а) культивирование микроорганизма, содержащего полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный гликопротеин, в культуральной среде для выращивания микроорганизма; и
(б) добавление инсулина в культуральную среду и культивирование указанного микроорганизма с получением гликопротеина, где инсулин снижает содержание N-гликана или О-гликана в рекомбинантном гликопротеине.
8. Способ по п.7, где стадия (б) представляет собой стадию добавления инсулина в различных концентрациях в соответствии с заданным паттерном гликозилирования.
9. Способ по п.7, где рекомбинантный гликопротеин представляет собой слитый белок иммуноглобулина.
10. Способ по п.7, где рекомбинантный гликопротеин представляет собой слитый белок TNFR-Fc.
11. Способ по п.7, где концентрация инсулина составляет от 0,0001 до 0,03 мг/л относительно общего объема культуральной среды.
12. Способ по п.7, где культивирование представляет собой метод перфузионного культивирования.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2014-0195976 | 2014-12-31 | ||
KR1020140195976A KR102007930B1 (ko) | 2014-12-31 | 2014-12-31 | 재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법 |
PCT/KR2015/014512 WO2016108638A1 (ko) | 2014-12-31 | 2015-12-30 | 재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2670889C1 true RU2670889C1 (ru) | 2018-10-25 |
RU2670889C9 RU2670889C9 (ru) | 2018-12-11 |
Family
ID=56284687
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017124160A RU2670889C9 (ru) | 2014-12-31 | 2015-12-30 | Способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10131891B2 (ru) |
EP (1) | EP3241908B1 (ru) |
JP (1) | JP6502505B2 (ru) |
KR (1) | KR102007930B1 (ru) |
AU (1) | AU2015372704B2 (ru) |
BR (1) | BR112017014252A2 (ru) |
IL (1) | IL253217B (ru) |
MX (1) | MX2017008634A (ru) |
RU (1) | RU2670889C9 (ru) |
SA (1) | SA517381863B1 (ru) |
WO (1) | WO2016108638A1 (ru) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999061650A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | Genentech, Inc. | Cell culture process for producing glycoproteins |
KR20090029841A (ko) * | 2006-07-13 | 2009-03-23 | 와이어쓰 | 당단백질의 생산 |
KR20110139292A (ko) * | 2009-04-20 | 2011-12-28 | 화이자 인코포레이티드 | 단백질 글리코실화의 제어 및 그와 관련된 조성물 및 방법 |
US20120276631A1 (en) * | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Abbott Laboratories | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5705364A (en) * | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
JPH0947284A (ja) * | 1995-08-07 | 1997-02-18 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 動物細胞の培養方法 |
US7294481B1 (en) | 1999-01-05 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Method for producing recombinant proteins |
CA2469724A1 (en) * | 2001-10-22 | 2004-06-17 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Mutant glycoproteins |
TWI364458B (en) | 2004-08-27 | 2012-05-21 | Wyeth Res Ireland Ltd | Production of tnfr-lg |
WO2007034809A1 (ja) * | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | 組み換え蛋白質産生のための宿主細胞 |
WO2007070315A2 (en) | 2005-12-08 | 2007-06-21 | Amgen Inc. | Improved production of glycoproteins using manganese |
BRPI0716762A2 (pt) * | 2006-09-13 | 2013-09-24 | Abbott Lab | melhorias da cultura celular |
PT2115126E (pt) | 2007-03-02 | 2015-08-24 | Wyeth Llc | Utilização de cobre e glutamato na cultura de células para a produção de polipeptídeos |
ES2670368T3 (es) * | 2008-09-15 | 2018-05-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Composiciones y procedimientos para regular la osmolaridad celular |
AU2010254215A1 (en) | 2009-05-26 | 2011-12-01 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Production of glycoproteins |
WO2011099028A1 (en) * | 2010-02-10 | 2011-08-18 | Biocon Limited | Method of reducing glycosylation of proteins, processes and proteins thereof |
KR101930961B1 (ko) | 2010-02-24 | 2018-12-19 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 피키아 파스토리스에서 생산된 치료 당단백질 상의 n-글리코실화 부위 점유를 증가시키는 방법 |
KR101868139B1 (ko) | 2010-11-30 | 2018-06-15 | 주식회사 엘지화학 | 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 |
WO2013006479A2 (en) | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Amgen Inc. | Mammalian cell culture |
AR095348A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-10-07 | Genentech Inc | Medios de cultivo celular y métodos de producción de anticuerpos |
EP3004156A1 (en) | 2013-06-07 | 2016-04-13 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
EP3916081A3 (en) | 2013-08-19 | 2022-03-23 | Biogen MA Inc. | Control of protein glycosylation by culture medium supplementation and cell culture process parameters |
US20160237399A1 (en) * | 2015-02-18 | 2016-08-18 | Biogen Ma Inc. | Control of Protein Glycosylation by Culture Medium Supplementation and Cell Culture Process Parameters |
-
2014
- 2014-12-31 KR KR1020140195976A patent/KR102007930B1/ko active IP Right Grant
-
2015
- 2015-12-30 AU AU2015372704A patent/AU2015372704B2/en active Active
- 2015-12-30 MX MX2017008634A patent/MX2017008634A/es unknown
- 2015-12-30 EP EP15875732.8A patent/EP3241908B1/en not_active Revoked
- 2015-12-30 JP JP2017535399A patent/JP6502505B2/ja active Active
- 2015-12-30 RU RU2017124160A patent/RU2670889C9/ru active
- 2015-12-30 BR BR112017014252A patent/BR112017014252A2/pt active Search and Examination
- 2015-12-30 IL IL253217A patent/IL253217B/en unknown
- 2015-12-30 US US15/541,123 patent/US10131891B2/en active Active
- 2015-12-30 WO PCT/KR2015/014512 patent/WO2016108638A1/ko active Application Filing
-
2017
- 2017-07-04 SA SA517381863A patent/SA517381863B1/ar unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999061650A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | Genentech, Inc. | Cell culture process for producing glycoproteins |
KR20090029841A (ko) * | 2006-07-13 | 2009-03-23 | 와이어쓰 | 당단백질의 생산 |
RU2463345C2 (ru) * | 2006-07-13 | 2012-10-10 | Вайет | Получение гликопротеинов |
KR20110139292A (ko) * | 2009-04-20 | 2011-12-28 | 화이자 인코포레이티드 | 단백질 글리코실화의 제어 및 그와 관련된 조성물 및 방법 |
US20120276631A1 (en) * | 2011-04-27 | 2012-11-01 | Abbott Laboratories | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MARIE-CLAIRE BIOL-N’GARAGBA et al., Regulation of the intestinal glycoprotein glycosylation during postnatal development: role of hormonal and nutritional factors, Biochimie Vol. 85, pp. 331-352, 2003. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112017014252A2 (pt) | 2018-01-02 |
KR20160081699A (ko) | 2016-07-08 |
EP3241908B1 (en) | 2020-08-05 |
WO2016108638A1 (ko) | 2016-07-07 |
RU2670889C9 (ru) | 2018-12-11 |
US10131891B2 (en) | 2018-11-20 |
AU2015372704B2 (en) | 2018-09-20 |
EP3241908A4 (en) | 2018-06-20 |
MX2017008634A (es) | 2018-04-26 |
IL253217B (en) | 2022-08-01 |
JP6502505B2 (ja) | 2019-04-17 |
US20170342392A1 (en) | 2017-11-30 |
JP2018500041A (ja) | 2018-01-11 |
AU2015372704A1 (en) | 2017-07-20 |
IL253217A0 (en) | 2017-08-31 |
SA517381863B1 (ar) | 2020-06-23 |
EP3241908A1 (en) | 2017-11-08 |
KR102007930B1 (ko) | 2019-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2324046T5 (es) | Procedimiento para controlar la sialilación de proteínas producidas por un cultivo de células de mamíferos | |
US7544784B2 (en) | Increased recovery of active proteins | |
US20220348636A1 (en) | Method for producing fusion protein having igg fc domain | |
AU2002255600A1 (en) | Efficient recovery of correctly refolded proteins | |
JP2007500016A (ja) | 培養においてタンパク質生成を増大させるための方法 | |
US20070099266A1 (en) | Process for the production of tumor necrosis factor-binding proteins | |
Ozgur et al. | Therapeutic proteins: A to Z | |
CN115023422A (zh) | 糖基化多肽 | |
RU2698671C2 (ru) | КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТОГО TNFR2:Fc | |
RU2670889C9 (ru) | Способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина | |
NZ733430A (en) | A method for controlling glycosylation of recombinant glycoprotein | |
NZ752502B2 (en) | A Method For Controlling Glycosylation Of Recombinant Glycoprotein | |
NZ752502A (en) | A Method For Controlling Glycosylation Of Recombinant Glycoprotein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TH4A | Reissue of patent specification |