RU2670767C1 - Method for producing low molecular weight heparin - Google Patents
Method for producing low molecular weight heparin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670767C1 RU2670767C1 RU2017146005A RU2017146005A RU2670767C1 RU 2670767 C1 RU2670767 C1 RU 2670767C1 RU 2017146005 A RU2017146005 A RU 2017146005A RU 2017146005 A RU2017146005 A RU 2017146005A RU 2670767 C1 RU2670767 C1 RU 2670767C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- benzethonium
- heparin
- solution
- sodium acetate
- benzyl ester
- Prior art date
Links
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 title claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 70
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 61
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- SIYLLGKDQZGJHK-UHFFFAOYSA-N dimethyl-(phenylmethyl)-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethyl]ammonium Chemical compound C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SIYLLGKDQZGJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 229960003872 benzethonium Drugs 0.000 claims abstract description 27
- -1 heparin benzyl ester Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims abstract description 18
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims abstract description 16
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims abstract description 12
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 11
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005574 benzylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000032050 esterification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 7
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical class OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 abstract 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 description 16
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- MHDVGSVTJDSBDK-UHFFFAOYSA-N dibenzyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1COCC1=CC=CC=C1 MHDVGSVTJDSBDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- BQSMUQUKNCGJCT-SLPGGIOYSA-N 2-N,6-O-disulfo-D-glucosamine Chemical group OS(=O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](NS(O)(=O)=O)C=O BQSMUQUKNCGJCT-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N chlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1 MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004969 dalteparin Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229960000610 enoxaparin Drugs 0.000 description 2
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 2
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 229960003616 bemiparin Drugs 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- MTDHILKWIRSIHB-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine 6-sulfate Chemical class N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O MTDHILKWIRSIHB-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-LECHCGJUSA-N iduronic acid Chemical compound O=C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-LECHCGJUSA-N 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- GKTNLYAAZKKMTQ-UHFFFAOYSA-N n-[bis(dimethylamino)phosphinimyl]-n-methylmethanamine Chemical compound CN(C)P(=N)(N(C)C)N(C)C GKTNLYAAZKKMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 125000003003 spiro group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229960005062 tinzaparin Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates.
Изобретение относится к технологии получения фармацевтической субстанции низкомолекулярного гепарина (НМГ) щелочной деполимеризацией бензилового эфира коммерческого высокомолекулярного гепарина натрия.The invention relates to the technology of pharmaceutical substance of low molecular weight heparin (LMWH) alkaline depolymerization of benzyl ester of commercial high molecular weight heparin sodium.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На Фиг. 1 представлена структура фрагмента молекулы высокомолекулярного гепарина.FIG. Figure 1 shows the structure of a fragment of a high-molecular-weight heparin molecule.
На Фиг. 2 изображена схема получения НМГ окислительной деполимеризацией.FIG. 2 shows a scheme for the production of LMWH by oxidative depolymerization.
На Фиг. 3 показана структура дальтепарина.FIG. 3 shows the structure of dalteparin.
На Фиг. 4 приведена схема ферментативной деполимеризации в синтезе тинза-парина.FIG. 4 shows the scheme of enzymatic depolymerization in the synthesis of tinse-parin.
На Фиг. 5 показана структура фрагмента макромолекулы НМГ (эноксапарин), полученного щелочным гидролизом.FIG. 5 shows the structure of a fragment of an HMG macromolecule (enoxaparin) obtained by alkaline hydrolysis.
На Фиг. 6 изображена схема реакций, протекающих при получении гепарината бензетония.FIG. 6 shows a diagram of the reactions occurring in the preparation of heparinate benzene.
На Фиг. 7 представлена схема реакций бензилирования гепарината бензетония (ГБ) и удаления защиты сульфогрупп.FIG. 7 shows the scheme of benzylation reactions of heparinate benzethonium (GB) and removal of the protection of sulfo groups.
На Фиг. 8 дана схема реакций, протекающих при эпимеризации и циклизации.FIG. 8 given the scheme of reactions occurring during epimerization and cyclization.
Уровень техникиThe level of technology
Гепарин - органопрепарат, получаемый из легких или мукозы - слизистой оболочки крупного рогатого скота или свиней. Он является прямым антикоагулянтом и используется для приготовления лекарственных форм, применяемых для профилактики и терапии тромбоэмболических заболеваний, тромбообразования при операциях на сердце и кровеносных сосудах, при остром инфаркте миокарда, а также для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения и гемодиализа.Heparin is an organ preparation obtained from the lungs or mucose - the mucous membrane of cattle or pigs. It is a direct anticoagulant and is used for the preparation of dosage forms used for the prevention and treatment of thromboembolic diseases, thrombus formation during operations on the heart and blood vessels, in acute myocardial infarction, as well as to maintain the liquid state of the blood in cardiopulmonary bypass and hemodialysis.
Коммерческий нефракционированный гепарин (НФГ) представляет собой смесь сульфатированных полисахаридов различной структуры (Фиг. 1) с молекулярной массой от 3000 до 30000 Да. От длины молекулы гепарина и величины ее заряда зависит фармакокинетика и фармакодинамика лекарственного препарата, а также способность гепарина взаимодействовать с белками крови и клетками организма [1]. Наряду с несомненными преимуществами препараты НФГ обладают серьезными недостатками, такими как: возможность возникновения неконтролируемых кровотечений, аллергические реакции, остеопороз, необходимость повторных инъекций и др. [2].Commercial unfractionated heparin (UFH) is a mixture of sulfated polysaccharides of various structures (Fig. 1) with a molecular weight of from 3,000 to 30,000 Da. The pharmacokinetics and pharmacodynamics of the drug, as well as the ability of heparin to interact with blood proteins and body cells, depend on the length of the heparin molecule and the magnitude of its charge [1]. Along with the undoubted advantages, UFH preparations have serious disadvantages, such as: the possibility of uncontrolled bleeding, allergic reactions, osteoporosis, the need for repeated injections, etc. [2].
Фракционирование природного гепарина известными методами (гельфильтрация, диализ и др.) дает низкий выход целевой фракции с низкой молекулярной массой и высокой антикоагулянтной активностью. Более эффективна в этом отношении так называемая контролируемая деполимеризация гепарина [3] под действием неорганических или органических веществ, ферментов или радиационного излучения. Реализуемые в настоящее время способы контролируемой деполимеризации можно свести к процессам гидролиза, окислительной, радикальной или ферментативной деструкции.Fractionation of natural heparin by known methods (gel filtration, dialysis, etc.) gives a low yield of the target fraction with a low molecular weight and high anticoagulant activity. The so-called controlled depolymerization of heparin [3] under the action of inorganic or organic substances, enzymes or radiation is more effective in this respect. Currently implemented methods of controlled depolymerization can be reduced to the processes of hydrolysis, oxidative, radical or enzymatic degradation.
Окислительная деполимеризация НФГ заключается в обработке его водных растворов различными окислителями, из которых чаще всего используют нитрит натрия [4]. В результате действия выделяющейся азотистой кислоты на НФГ происходит разрыв гликозидных связей основной цепи [5] с образованием гидроксильных и альдегидных групп которые восстанавливают, например, боргидридом натрия [6] как схематично показано на Фиг. 2. Таким образом получают, например, дальтепарин, который имеет среднюю молекулярную массу около 6,0 кДа и ангидроманнозные концевые фрагменты (Фиг. 3).Oxidative depolymerization of UFH consists in the treatment of its aqueous solutions with various oxidizing agents, of which sodium nitrite is most often used [4]. As a result of the release of nitrous acid on UFH, the breaking of glycosidic bonds of the main chain occurs [5] with the formation of hydroxyl and aldehyde groups which are reduced, for example, with sodium borohydride [6] as schematically shown in FIG. 2. In this way, for example, dalteparin is obtained, which has an average molecular weight of about 6.0 kDa and anhydro terminal terminal fragments (Fig. 3).
Ферментативную деполимеризацию осуществляют при воздействии, например, микробных гепариназ (гепарин-лиазы), специфически разрушающих α-гликозидные связи между N-сульфатированным D-глюкозамин-6-сульфатом и 2-О-сульфатом идуроновой кислоты. Таким образом получают НМГ тинзапарин со средней молекулярной массой около 4,5 кДа и концевыми 2-N,6-O-дисульфо-D-глюкозаминовым и 4,5-ненасыщенным уроновокислым фрагментами [7] (Фиг. 4) В настоящее время известны способы ферментативной деполимеризации НФГ с помощью и других гепариназ [8]. К достоинствам ферментативной деполимеризации относятся мягкие условия синтеза и высокая селективность процесса.The enzymatic depolymerization is carried out under the influence of, for example, microbial heparinases (heparin lyase), specifically destroying the α-glycosidic bonds between N-sulfated D-glucosamine-6-sulfate and 2-O-sulfate of iduronic acid. In this way, LMWH tinzaparin is obtained with an average molecular weight of about 4.5 kDa and terminal 2-N, 6-O-disulfo-D-glucosamine and 4,5-unsaturated acid-acid fragments [7] (Fig. 4) At present, methods are known enzymatic depolymerization of UFH with the help of other heparinases [8]. The advantages of enzymatic depolymerization include mild synthesis conditions and high selectivity of the process.
Гидролитическая деполимеризация представляет собой специфический метод направленной деструкции НФГ, который подразумевает получение производных НФГ с их последующим щелочным гидролизом. Обычно процесс такого рода включает в себя предварительную защиту сульфогрупп НФГ реакцией с хлоридом бензетония и последующее преобразование карбоксильных групп в сложноэфирные за счет этерификации полученного продукта бензилхлоридом. Получаемый в результате бензиловый эфир гепарината бензетония осаждают, например, этанолом [9] с последующим удалением защиты с групп SO3 -, и полученный неполный сложный эфир подвергают щелочному гидролизу [5]. При этом образуются молекулы НМГ с 2-O-сульфо-4-енопиранозуроновым и 2-N, 6-О-дисульфо-D-глюкозаминовым концевыми фрагментами (Фиг. 5). Таким образом получают ультранизкомолекулярный семулопарин, а также такие НМГ, как бемипарин и эноксапарин. Дополнительно деполимеризацию такого рода можно стимулировать микроволновым облучением.Hydrolytic depolymerization is a specific method of targeted destruction of UFH, which involves the preparation of derivatives of UFH with their subsequent alkaline hydrolysis. Typically, a process of this kind involves the preliminary protection of the sulfo groups of UFH by reaction with benzene chloride and the subsequent conversion of carboxyl groups to ester due to the esterification of the resulting product with benzyl chloride. The resulting benzyl ester of heparinate benzethonium is precipitated, for example, with ethanol [9], followed by removal of protection from the SO 3 - groups, and the resulting partial ester is subjected to alkaline hydrolysis [5]. At the same time, NMH molecules are formed with 2-O-sulfo-4-enopyranosuronic and 2-N, 6-O-disulfo-D-glucosamine terminal fragments (Fig. 5). In this way, ultra low molecular weight semloparin is obtained, as well as such LMWHs as bemiparin and enoxaparin. Additionally, depolymerization of this kind can be stimulated by microwave irradiation.
Производное НФГ получают аналогичным способом - реакцией с хлоридом бензетония и последующей этерификации бензилхлоридом. Полученный продукт подвергают гидролитической деполимеризации в органических растворителях таких как: формамид, диметилформамид или метиленхлорид, а в качестве катализатора применяют сильные основания семейства фосфазенов. Считается, что процесс в неводной среде проходит в сравнительно мягких условиях, благодаря чему снижается доля побочных реакций и сохраняется биологическая активность гепарина.Derivative NFG is obtained in a similar way - by reaction with benzene chloride and subsequent esterification with benzyl chloride. The resulting product is subjected to hydrolytic depolymerization in organic solvents such as formamide, dimethylformamide or methylene chloride, and strong bases of the phosphazene family are used as a catalyst. It is believed that the process in a non-aqueous medium takes place in relatively mild conditions, thereby reducing the proportion of adverse reactions and preserving the biological activity of heparin.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения, раскрытый в описании и формуле изобретения к патенту [9], включающий стадии получения бензетониевой соли гепарина, бензилирования этой соли в неводном растворителе, спиртового осаждения неполного бензилового эфира бензетониевой соли гепарина и щелочной деполимеризации этого продукта, отличающийся тем, что бензетониевую соль нефракционированного гепарина получают в 0,05-0,5 М водном растворе натрия хлорида при температуре 50-60°С, рН в интервале 8,2-8,8 и массовом соотношении гепарин/бензетоний хлорид 1/(2,35-2,70), бензилирование бензетониевой соли гепарина проводят в течение 2-3 часов в среде биполярного апротонного растворителя бензилхлоридом в соотношении гепаринат/бензилхлорид 1/(0,2-1,0), который предварительно подвергают активированию в апротонном растворителе в течение 15-20 минут, осаждение бензилового эфира гепарина проводят методом Спиро этиловым спиртом, предварительно насыщенным безводным натрия ацетатом, с последующим удалением защиты с сульфогрупп, проведение β-элиминирования бензилового эфира со степенью этерификации гепарина 9-13% 1±0,5 N щелочью NaOH при температуре 55±5°С, длительности процесса 40-60 минут и массовым соотношением реагентов бензиловый эфир/щелочь 1/(0,5-2).The closest to the technical nature of the claimed invention is a method of obtaining, disclosed in the description and claims to the patent [9], including the stage of obtaining benzethonium salt of heparin, benzylation of this salt in a non-aqueous solvent, alcohol precipitation of partial benzyl ether of benzethonium salt of heparin and alkaline depolymerization product, characterized in that the benzethonium salt of unfractionated heparin receive 0.05-0.5 M aqueous solution of sodium chloride at a temperature of 50-60 ° C, pH in the range of 8.2 -8.8 and a mass ratio of heparin / benzethonium chloride 1 / (2.35-2.70), benzylation of the benzethonium salt of heparin is carried out for 2-3 hours in a bipolar aprotic solvent medium with benzyl chloride in a ratio of heparin / benzyl chloride 1 / (0, 2-1.0), which is preliminarily subjected to activation in an aprotic solvent for 15–20 minutes, precipitation of heparin benzyl ester is carried out by the Spiro method with ethyl alcohol, previously saturated with anhydrous sodium acetate, followed by removal of the protection from the sulfo groups, β-elimination benzyl ester with a degree of esterification of the heparin 9-13% 1 ± 0.5 N NaOH alkali at a temperature of 55 ± 5 ° C, the processing time of 40-60 minutes and a weight ratio of benzyl ester reactants / alkali 1 / (0.5-2).
Стадию бензилирования проводят в смеси апротонных растворителей. Выделение бензилового эфира бензетониевой соли проводят осаждением этанолом в присутствии соосадителя ацетата натрия, удаление защиты сульфогрупп осуществляют действием насыщенного этанольного раствора того же реактива. Процесс отмывки бензетониевой соли от примесей проводят обработкой дистиллированной водой.The benzylation step is carried out in a mixture of aprotic solvents. Isolation of the benzyl ester of the benzethonium salt is carried out by precipitation with ethanol in the presence of a sodium acetate co-precipitator, and the removal of the sulfo group protection is carried out with a saturated ethanolic solution of the same reagent. The process of washing benzethonium salt from impurities is carried out by treatment with distilled water.
Среди недостатков этого способа следует отметить:Among the disadvantages of this method should be noted:
- большой расход воды для отмывки гепарината бензетония от избытка бензетония хлорида, остаточное количество которого на последующих стадиях синтеза НМГ значительно осложняет технологический процесс и приводит к значительным потерям целевого продукта, поскольку продукты реакции представляют собой липкие тестообразные вещества;- high water consumption for washing heparinate benzethonium from excess benzethonium chloride, the residual amount of which at subsequent stages of the synthesis of LMWH significantly complicates the process and leads to significant losses of the target product, since the reaction products are sticky pasty substances;
- проведение процессов осаждения бензилового эфира бензетониевой соли и последующей процедуры удаления защиты сульфогрупп гепарина одним и тем же реагентом без выделения промежуточного продукта не приводит к получению структурированного продукта и увеличивает суммарную продолжительность процесса;- carrying out the processes of precipitating the benzyl ether of the benzethonium salt and the subsequent procedure of removing the protection of heparin sulfo groups with the same reagent without isolating the intermediate product does not result in a structured product and increases the total duration of the process;
- выделение готового продукта 96%-м этанолом осложнено высокой гигроскопичностью порошка.- isolation of the finished product with 96% ethanol is complicated by the high hygroscopicity of the powder.
Целью настоящего изобретения является преодоление недостатков ближайшего аналога, в частности - снижение содержания примесей в готовом продукте, увеличение выхода полупродуктов на отдельных стадиях производства, сокращение расхода промывочной воды. Преимуществами предлагаемого технического решения являются снижение трудоемкости способа и затрат на производство готового НМГ.The aim of the present invention is to overcome the shortcomings of the closest analogue, in particular, a decrease in the content of impurities in the finished product, an increase in the yield of intermediates at certain stages of production, a reduction in the consumption of wash water. The advantages of the proposed technical solution are the reduction of the complexity of the method and the cost of producing the finished LMWH.
Раскрытие сущности изобретения.Disclosure of the invention.
Цель настоящего изобретения достигается с помощью способа получения низкомолекулярного гепарина, включающего стадии:The purpose of the present invention is achieved by using the method of obtaining low molecular weight heparin, which includes stages:
(а) формирования защиты сульфогрупп взаимодействием высокомолекулярного гепарина с бензетония хлоридом с образованием гепарината бензетония (ГБ),(a) the formation of protection of sulfo groups by the interaction of high molecular weight heparin with benzethonium chloride to form benzethonium heparinate (GB),
(б) этерификации полученной соли бензилированием в апротонном растворителе,(b) the esterification of the resulting salt by benzylation in an aprotic solvent,
(в) выделения сложного бензилового эфира гепарина осаждением и удаления защиты сульфогрупп насыщенным раствором ацетата натрия в метиловом спирте,(c) isolating heparin benzyl ester by precipitating and removing the sulfo group protection with a saturated solution of sodium acetate in methyl alcohol,
(г) щелочной деполимеризации макромолекулы гепарина и(d) alkaline depolymerization of the heparin macromolecule and
(д) формирования концевых 1,6-ангидрогрупп β-элиминированием при взаимодействии с сильным восстановителем,(e) the formation of terminal 1,6-anhydrogroups by β-elimination when interacting with a strong reducing agent,
в котором на стадии (а) отмывку гепарината бензетония от избытка непрореаги-ровавшего бензетония хлорида производят многократной дробной промывкой водой очищенной с применением ультразвука рабочей частоты 30-40 кГц, мощностью излучения 200-400 Вт и на стадии (в) выделение сложного бензилового эфира гепарина осаждением и удаление защиты сульфогрупп проводят как две последовательные операции, а применяемым спиртом является метанол.wherein in stage (a) hepatinate benzethonium is washed from excess unreacted benzethonium chloride by repeated fractional washing with purified water using ultrasound operating frequency 30-40 kHz, radiation power 200-400 W and at stage (c) separation of heparin benzyl ester sedimentation and removal of the protection of sulfo groups are carried out as two successive operations, and the alcohol used is methanol.
Предпочтительно многократную дробную промывку с применением ультразвука осуществляют водой очищенной при массовом соотношении ГБ/вода равном 1/(50-60) и температуре 40-60°С при продолжительности каждого цикла ультразвукового воздействия 10-35 минут.Preferably, multiple fractional washing with the use of ultrasound is carried out with purified water at a mass ratio of GB / water equal to 1 / (50-60) and a temperature of 40-60 ° C for a duration of each ultrasound cycle of 10-35 minutes.
Также предпочтительно выделение неполного сложного бензилового эфира гепарината бензетония из раствора производят осаждением 1,5-2,5 объемами 8-10% метанольного раствора натрия ацетата при температуре от -2 до 4°С при перемешивании в течение 4-6 часов.It is also preferable to separate the partial benzyl ester of heparinate benzene from the solution by precipitation with 1.5-2.5 volumes of 8-10% methanolic sodium acetate solution at a temperature of -2 to 4 ° C with stirring for 4-6 hours.
Далее предпочтительно удаление бензетониевой защиты сульфогрупп производят после отделения осадка взаимодействием с 4-6-кратным массовым количеством насыщенного метанольного раствора безводного натрия ацетата при температуре 18-24°С при перемешивании в течение 8-10 часов.Next, it is preferable to remove the benzethonium protection of the sulfo groups after separation of the precipitate by reacting with a 4-6-fold mass amount of a saturated methanolic solution of anhydrous sodium acetate at a temperature of 18-24 ° C with stirring for 8-10 hours.
Кроме того, предпочтительно стадию щелочной деполимеризации проводят в присутствии инертного носителя перлита при массовом соотношении бензиловый эфир гепарина/перлит 1/(0,25-0,5).In addition, preferably the alkali depolymerization step is carried out in the presence of an inert perlite carrier at a mass ratio of heparin benzyl ether / perlite 1 / (0.25-0.5).
В результате проведенных обширных исследований авторы изобретения неожиданно установили, что при проведении отмывки бензетония хлорида с применением ультразвука его частота и мощность имеют решающее значение для качества получаемого полупродукта. При рабочей частоте выше 40 кГЦ и мощности излучения более 400 Вт существует опасность непредсказуемой деструкции не только в полимерной цепи, но также и в отдельных звеньях моносахаридов, что приводит к потере активности готового продукта.As a result of extensive research conducted, the inventors unexpectedly found that when washing benzethonium chloride using ultrasound, its frequency and power are crucial to the quality of the semi-product obtained. With an operating frequency higher than 40 kHz and a radiation power of more than 400 W, there is a danger of unpredictable destruction not only in the polymer chain, but also in individual links of monosaccharides, which leads to a loss of activity of the finished product.
Природа спиртового растворителя также имеет большое значение для достижения технического результата изобретения. В ближайшем аналоге [9] для выделения полупродуктов из рабочих растворов на различных стадиях процесса применяется 96% этанол. При этом первоначально выделяется маслоподобная, липкая и вязкая гигроскопичная субстанция, которую невозможно извлечь из технологического оборудования без значительных потерь. Для получения порошка необходимо многократно перетирать это вещество с осадителем до получения аморфного порошка удовлетворительного качества.The nature of the alcohol solvent is also of great importance to achieve the technical result of the invention. In the closest analogue [9], 96% ethanol is used to isolate intermediates from working solutions at different stages of the process. At the same time, an oil-like, sticky and viscous hygroscopic substance is initially released, which cannot be extracted from the process equipment without significant losses. To obtain a powder, it is necessary to repeatedly grind this substance with a precipitant to obtain a satisfactory quality amorphous powder.
В предлагаемом способе на стадии получения бензилового эфира бензетониевой соли процесс выделения из раствора продукта бензилирования с неудаленной бензетониевой защитой сульфогрупп осаждением метанолом проводят как отдельную операцию, причем в качестве соосадителя используют небольшое количество ацетата натрия.In the proposed method, at the stage of obtaining benzyl ester of benzethonium salt, the process of separating the benzylation product from the solution with unremoved benzethonium protection of the sulfo groups by precipitation with methanol is carried out as a separate operation, with a small amount of sodium acetate being used as co-precipitant.
В соответствии с изобретением процесс удаления бензетониевой защиты выделяют в отдельную стадию. Химизм этой реакции заключается во взаимодействии бензетониевого соединения с ацетатом натрия. В аналоге [9] процессы выделения и удаления защиты проводят многократной промывкой этанолом, насыщенным натрия ацетатом (его максимальная концентрация составляет 2,33% масс.). Для этого требуется трех-четырехкратная обработка продукта этим раствором с промежуточным выделением субстанции, т.к. в одной порции раствора реагента недостаточно.In accordance with the invention, the process of removing benzethonium protection is isolated in a separate stage. The chemistry of this reaction is the interaction of the benzethonium compound with sodium acetate. In the analogue of [9], the processes of isolation and removal of protection are carried out by repeated washing with ethanol, saturated with sodium acetate (its maximum concentration is 2.33% by weight). This requires three to four times the treatment of the product with this solution with an intermediate release of the substance, since in one portion of the reagent solution is not enough.
Основомоль гепарина содержит три сульфогруппы и, в соответствии с этим, для удаления бензетониевой защиты с макромолекулы необходимо израсходовать три эквивалента натрия ацетата. В метаноле растворимость натрия ацетата составляет 16,22% масс., что в семь раз больше, чем в этаноле. Поэтому расход осадителя значительно меньший. Кроме того, неожиданно достигается существенно лучшее качество осадка.The basis of heparin contains three sulfo groups, and accordingly, three equivalents of sodium acetate must be consumed to remove the benzethonium protection from the macromolecule. In methanol, the solubility of sodium acetate is 16.22% by weight, which is seven times greater than in ethanol. Therefore, the precipitator consumption is much smaller. In addition, significantly better sediment quality is unexpectedly achieved.
Таким образом, техническим результатом предлагаемого изобретения является усовершенствованный способ получения низкомолекулярного гепарина с улучшенными показателями чистоты и общего выхода субстанции при существенном снижении расхода отмывочной воды и образующихся стоков.Thus, the technical result of the present invention is an improved method for producing low molecular weight heparin with improved purity and overall yield of the substance, with a significant reduction in the flow of wash water and the resulting effluent.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Далее возможность осуществления изобретения с достижением технического результата будет показана на неограничивающих примерах.Further, the possibility of carrying out the invention with the achievement of the technical result will be shown in non-limiting examples.
Пример 1. Синтез гепарината бензетонияExample 1. Synthesis of heparinate benzene
Схема превращений приведена на Фиг. 6. В стеклянную двугорлую колбу вместимостью 250 мл, помещенную в водяную баню на платформе магнитной термостатируемой мешалки, наливают 50 мл воды очищенной и при перемешивании загружают 8,4 г бензетония хлорида (Hyamine 1622, Lonza Group Ltd.). После полного растворения устанавливают рН в интервале 6,0-6,7.The transformation scheme is shown in FIG. 6. In a 250 ml glass two-neck flask placed in a water bath on a magnetic thermostatted agitator platform, 50 ml of purified water is poured and 8.4 g of benzethonium chloride (Hyamine 1622, Lonza Group Ltd.) are loaded with stirring. After complete dissolution, the pH is adjusted to 6.0-6.7.
В другом стакане готовят раствор 3,2 г гепарина мукозного в 30 мл 0,2 М раствора NaCl при комнатной температуре. После полного растворения гепарина устанавливают рН в интервале 8,5-8,7.In another glass, a solution of 3.2 g of mucosal heparin in 30 ml of 0.2 M NaCl solution is prepared at room temperature. After complete dissolution of heparin, the pH is adjusted in the range of 8.5-8.7.
Температуру водяной бани повышают до 60±1°С и с помощью капельной воронки в реактор при перемешивании, избегая вспенивания содержимого колбы, приливают раствор гепарина в течение 30-40 минут. После прибавления всего количества раствора реакцию продолжают еще 50-60 минут. Образовавшийся осадок горячим отделяют фильтрацией на воронке Бюхнера или центрифугируют. Жидкую фазу отбрасывают, предварительно измерив ее объем и оптическую плотность для количественного определения содержания примесей.The temperature of the water bath is raised to 60 ± 1 ° C and using a dropping funnel into the reactor with stirring, avoiding foaming of the contents of the flask, the heparin solution is poured in for 30-40 minutes. After adding the total amount of solution, the reaction is continued for another 50-60 minutes. The resulting precipitate is hot separated by filtration on a Buchner funnel or centrifuged. The liquid phase is discarded, pre-measuring its volume and optical density for the quantitative determination of impurities.
Осадок переносят в стакан вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды очищенной и помещают его в ультразвуковую ванну (тип УЗВ, Сапфир). Экстракцию избытка непрореагировавших реагентов (отмывку) производят при температуре 40-60°С и воздействии ультразвуком с рабочей частотой 30-40 кГц и мощностью излучения 200-400 Вт при продолжительности каждого цикла ультразвукового воздействия 10-35 минут. Степень отмывки и содержание примесей в промывочной воде определяют измерением оптической плотности раствора (D270) спектрофотометрически (Cary 60 UV-Vis, Agilent) при длине волны 270 нм по калибровочному графику. Промывку повторяют до достижения оптической плотности промывной воды менее 1,5. Результаты эксперимента с применением ультразвука (УЗ) приведены в таблице 1. Как видно из этих данных удовлетворительный результат достигается уже за 7 циклов промывки, на что расходуется 430 мл воды очищенной. Промытый продукт - гепаринат бензетония (ГБ) лиофильно высушивают (лиофильная сушилка Иней-6, ФГБУН ИБП РАН). Выход ГБ составляет 8,23 г при влагосодержании 5,3%. Расход воды очищенной в расчете на 1 г порошка составляет 52,2 мл.The precipitate is transferred to a glass with a capacity of 100 ml, 50 ml of purified water is added and placed in an ultrasonic bath (type UZV, Sapphire). Extraction of excess unreacted reagents (washing) is carried out at a temperature of 40-60 ° C and exposure to ultrasound with an operating frequency of 30-40 kHz and a radiation power of 200-400 W for the duration of each ultrasound cycle of exposure to 10-35 minutes. The degree of washing and the content of impurities in the wash water is determined by measuring the optical density of the solution (D 270 ) spectrophotometrically (Cary 60 UV-Vis, Agilent) at a wavelength of 270 nm according to a calibration graph. Washing is repeated until the optical density of the wash water is less than 1.5. The results of the experiment with the use of ultrasound (US) are shown in Table 1. As can be seen from these data, a satisfactory result is achieved in already 7 washing cycles, which consumes 430 ml of purified water. The washed product - heparinate benzethonium (GB) is freeze dried (lyophilic dryer Iney-6, FSBUN IBP RAS). The output of GB is 8.23 g with a moisture content of 5.3%. The consumption of purified water per 1 g of powder is 52.2 ml.
*в том числе промывочных вод 350 мл.* including flushing water 350 ml.
**в том числе с промывной водой 3,035 г.** including with wash water 3.035 g.
Параллельно проводят промывку при тех же условиях без применения УЗ (таблица 2). При этом для достижения требуемого результата необходимо провести 14-15 циклов промывки, причем расход воды очищенной составляет 700 мл. Выход порошка ГБ составляет 7,9 г при влагосодержании 5,1%. Расход воды очищенной в расчете на 1 г продукта составляет 88,6 мл.In parallel, carry out the washing under the same conditions without the use of ultrasound (table 2). At the same time, to achieve the desired result, it is necessary to carry out 14-15 washing cycles, and the purified water consumption is 700 ml. The output of the powder GB is 7.9 g with a moisture content of 5.1%. The consumption of purified water per 1 g of the product is 88.6 ml.
*в том числе промывочных вод 700 мл.* including wash water 700 ml.
**в том числе с промывной водой 3,424 г.** including with wash water 3,424 g.
Как видно из приведенных данных, применение отмывки с помощью УЗ обработки приводит к значительной интенсификации процесса, снижению расхода воды очищенной на отмывку ГБ, количества стоков и трудозатрат на проведение процесса в два раза.As can be seen from the above data, the use of washing with ultrasonic treatment leads to a significant intensification of the process, reducing the consumption of purified water for washing GB, the amount of wastewater and labor costs for carrying out the process twice.
Пример 2. Синтез неполного бензилового эфира гепаринаExample 2. Synthesis of incomplete benzyl ester of heparin
Схема синтеза приведена на Фиг. 7.The synthesis scheme is shown in FIG. 7
2.1. Синтез бензилового эфира гепарината бензетония2.1. Synthesis of benzyl ester heparinate benzethonium
В трехгорлую колбу вместимостью 1 л, снабженную механической мешалкой и гидрозатвором, помещенную в термостатируемую водяную баню при температуре 37±1°С, наливают 250 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) и прибавляют при перемешивании 45,0 г гепарината бензетония, полученного по методике изложенной в примере 1. После полного растворения ГБ в колбу с раствором с помощью капельной воронки прибавляют 40 мл бензилхлорида. Реакцию продолжают при температуре 37±1°С и перемешивании в течение 8 часов после чего содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры. Выделение бензилового эфира гепарината бензетония из раствора производят осаждением 525 мл 9% метанольного раствора натрия ацетата при температуре 2-4°С при перемешивании в течение 4-6 часов. Осадок отделяют на воронке Бюхнера и влажным используют на стадии удаления бензетониевой защиты.In a three-neck flask with a capacity of 1 l, equipped with a mechanical stirrer and hydrolock, placed in a thermostatically controlled water bath at 37 ± 1 ° C, pour 250 ml of N, N-dimethylformamide (DMF) and add with stirring 45.0 g of heparinate benzene prepared using method described in example 1. After complete dissolution of GB in a flask with a solution using a dropping funnel, add 40 ml of benzyl chloride. The reaction is continued at a temperature of 37 ± 1 ° C and stirring for 8 hours after which the contents of the flask are cooled to room temperature. Separation of benzyl ester of heparinate benzethonium from the solution is carried out by precipitation of 525 ml of 9% methanolic sodium acetate solution at a temperature of 2-4 ° C with stirring for 4-6 hours. The precipitate is separated on a Buchner funnel and wet is used at the stage of removal of benzethonium protection.
Выход влажного бензилового эфира гепарината бензетония 24,4 г с содержанием бензилового эфира гепарина 16,8 г.The yield of wet benzyl ester of heparinate benzethonium 24.4 g with a content of heparin benzyl ester of 16.8 g
2.2. Удаление защиты сульфогрупп бензилового эфира гепарината бензетония2.2. Removing the protection of the sulfo groups of the benzyl ester of heparinate benzene
В коническую плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, помещенную на платформу магнитной мешалки, загружают 24.0 г влажного бензилового эфира гепарината бензетония, полученного по примеру 2.1, и приливают 100 мл насыщенного метанольного раствора безводного натрия ацетата. В колбу помещают якорь магнитной мешалки и закрывают ее притертой пробкой. Реакцию проводят при комнатной температуре при перемешивании в течение 8-10 часов. После окончания процесса осадок отделяют на воронке Бюхнера, и высушивают в вакуумном сушильном шкафу при температуре не выше 40С°.In a conical flat-bottomed flask with a capacity of 500 ml, placed on a magnetic stirrer platform, 24.0 g of the benzyl heparinate benzethonium benzyl ester prepared according to Example 2.1 was charged and 100 ml of a saturated methanolic solution of anhydrous sodium acetate was poured. An anchor of the magnetic stirrer is placed in the flask and closed with a ground stopper. The reaction is carried out at room temperature with stirring for 8-10 hours. After the process is completed, the precipitate is separated on a Buchner funnel, and dried in a vacuum oven at a temperature not higher than 40 ° C.
Выход неполного бензилового эфира гепарина равен 16,2 г, что составляет 96% от теоретического.The yield of partial benzyl ester of heparin is 16.2 g, which is 96% of the theoretical.
Пример 3. Гидролиз бензилового эфира гепарина натрияExample 3. Hydrolysis of benzyl ester of heparin sodium
Схема синтеза приведена на Фиг. 8. В стакан вместимостью 250 мл, помещенный в водяную баню на платформе магнитной термостатируемой мешалки, наливают 75 мл воды очищенной и при перемешивании загружают 16,0 г бензилового эфира гепарина, полученного как описано в примере 2. Устанавливают температуру 60±1°С и перемешивают до полного растворения порошка. Затем в растворе устанавливают рН равным 11,0-11,1 с помощью свежеприготовленного 1 М раствора NaOH и прибавляют 8 мл 1 М раствора натрия гидроксида. Далее с помощью капельной воронки в течение 30-45 минут дозируют еще 8 мл того же раствора. Реакцию продолжают в течение 45 минут, поддерживая рН не ниже 11,0.The synthesis scheme is shown in FIG. 8. In a glass with a capacity of 250 ml, placed in a water bath on the platform of a magnetic thermostatically controlled stirrer, 75 ml of purified water is poured and 16.0 g of heparin benzyl ester, prepared as described in Example 2, are added with stirring. The temperature is set to 60 ± 1 ° C and stirred until complete dissolution of the powder. Then the solution is adjusted to pH 11.0-11.1 with freshly prepared 1 M NaOH solution and 8 ml of 1 M sodium hydroxide solution are added. Then, using an additional funnel, another 8 ml of the same solution is dosed out within 30-45 minutes. The reaction is continued for 45 minutes, maintaining the pH not lower than 11.0.
По окончании выдержки охлаждают реакционную массу до комнатной температуры, устанавливают рН равным 6,0±0,2 добавлением соляной кислоты (1:3), и раствор фильтруют. К прозрачному желтоватому фильтрату прибавляют 1,6 г безводного ацетата натрия и при необходимости корректируют рН до 6,0±0,2. Полученный раствор фильтруют через мембрану с размером пор 0,45 мкм, фильтрат охлаждают до температуры 0-4°С в течение 30-60 минут и осаждают продукт охлажденным метанолом (250-300 мл). Раствор помещают в холодильник и оставляют для созревания осадка на 3-4 часа. Надосадочную жидкость декантируют, а образовавшийся осадок дополнительно промывают 50-60 мл метанола. Осадок отделяют на воронке Бюхнера и высушивают в вакуумном сушильном шкафу при температуре не выше 40С°. Выход гидролизованого гепарина составляет 11,3 г, что составляет 84,3% от теоретического.At the end of the exposure, cool the reaction mass to room temperature, adjust the pH to 6.0 ± 0.2 by adding hydrochloric acid (1: 3), and filter the solution. 1.6 g of anhydrous sodium acetate are added to the clear yellowish filtrate and the pH is adjusted to 6.0 ± 0.2, if necessary. The resulting solution is filtered through a membrane with a pore size of 0.45 μm, the filtrate is cooled to a temperature of 0-4 ° C for 30-60 minutes and the product is precipitated with chilled methanol (250-300 ml). The solution is placed in a fridge and left to mature for 3-4 hours. The supernatant is decanted, and the precipitate formed is further washed with 50-60 ml of methanol. The precipitate is separated on a Buchner funnel and dried in a vacuum oven at a temperature not higher than 40 ° C. The yield of hydrolyzed heparin is 11.3 g, which is 84.3% of the theoretical.
Пример 4. Боргидрирование сырца низкомолекулярного гепарина натрияExample 4. Borgohydriana raw low molecular weight sodium heparin
В стакан вместимостью 100 мл, снабженный мешалкой, наливают 50 мл воды очищенной и при перемешивании прибавляют 11,0 г продукта, полученного в примере 3. После полного растворения порошка устанавливают рН равным 8,4±0,2 и прибавляют 0,20 г боргидрида натрия. Реакцию продолжают в течение 50-60 мин. По окончании реакции устанавливают рН равным 4,0±0,2 добавлением соляной кислоты (1:3) при перемешивании в течение 10 минут, после чего добавлением 1 М раствора гидроксида натрия устанавливают рН равным 6,0±0,2. Полученный раствор фильтруют через мембрану с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат охлаждают до температуры 0-4°С в течение 30-60 минут. Охлажденный фильтрат помещают в стакан вместимостью 200 мл и осаждают продукт охлажденным метанолом (150-200 мл). Раствор помещают в холодильник и оставляют для созревания осадка на 3 часа. Надосадочную жидкость декантируют, и образовавшийся осадок дополнительно промывают 30 мл метанола. Осадок отделяют на воронке Бюхнера и высушивают в вакууме при температуре не выше 40С°. Масса готового продукта составляет 9,7 г.In a glass with a capacity of 100 ml, equipped with a stirrer, 50 ml of purified water are poured and 11.0 g of the product obtained in Example 3 is added with stirring. After the powder is completely dissolved, the pH is set to 8.4 ± 0.2 and 0.20 g of borohydride is added sodium. The reaction is continued for 50-60 minutes. At the end of the reaction, the pH is adjusted to 4.0 ± 0.2 by adding hydrochloric acid (1: 3) with stirring for 10 minutes, after which by adding 1 M sodium hydroxide solution the pH is set to 6.0 ± 0.2. The resulting solution is filtered through a 0.45 µm membrane. The filtrate is cooled to a temperature of 0-4 ° C for 30-60 minutes. The cooled filtrate is placed in a 200 ml beaker and the product is precipitated with cooled methanol (150-200 ml). The solution is placed in the fridge and left to mature for 3 hours. The supernatant is decanted, and the precipitate formed is further washed with 30 ml of methanol. The precipitate is separated on a Buchner funnel and dried in vacuum at a temperature not higher than 40 ° C. The mass of the finished product is 9.7 g.
Полученная субстанция охарактеризована показателями, приведенными в таблице 3.The resulting substance is characterized by the indicators given in table 3.
ЛитератураLiterature
1. Hirsh J. et al. Clinicalof Chest Physicians Evidence-Based Parenteral Anticoagulants: American College Practice Guidelines (8th Edition) / Chest, 2008, V. 133, pp. 141S-159S.1. Hirsh J. et al. Clinicalof Chest Physicians Evidence-Based Parenteral Anticoagulants: American College Practice Guidelines (8th Edition) / Chest, 2008, V. 133, pp. 141S-159S.
2. Макаров B.A. и др. Применение гепаринов в клинической практике / РМЖ, 1998, №3, с. 4.2. Makarov B.A. et al. Use of Heparins in Clinical Practice / Breast Cancer, 1998, No. 3, p. four.
3. Кудрявцев В.Н. / Химия высоких энергий, 1993, Т. 27, №1, С. 41.3. Kudryavtsev V.N. / Chemistry of High Energies, 1993, Vol. 27, No. 1, p. 41.
4. Авторское свидетельство SU 1570651 A3, опубл. 07.06.1990.4. Copyright certificate SU 1570651 A3, publ. 06/07/1990.
5.Linhardt R.J. et. al. Production and chemical processing of low molecular weight heparins / Seminars in Thrombosis and Hemostasi, 1999, V. 25, N. 3, pp. 5-16; патент US 6384021 B1, опубл. 07.05.2002.5.Linhardt R.J. et. al. Heparins / Seminars in Thrombosis and Hemostasi, 1999, V. 25, N. 3, pp. 5-16; US patent 6384021 B1, publ. 05.07.2002.
6. Linhardt R.J. et. al. Differential anticoagulant activity of heparin fragments prepared using microbial heparinase / Journal of Biological Chemistry, 1982, V. 257, N. 13, pp. 7310-7313.6. Linhardt R.J. et. al. Differential anticoagulant activity of heparin fragments prepared using microbial heparinase / Journal of Biological Chemistry, 1982, V. 257, N. 13, pp. 7310-7313.
7. Патент RU 2295538 C2, опубл. 20.03.2007.7. Patent RU 2295538 C2, publ. 03/20/2007.
8. Патент RU 2396282 C1, опубл. 10.08.2010.8. Patent RU 2396282 C1, publ. 08/10/2010
9. Патент RU 2512768 C1, опубл. 10.04.2014.9. Patent RU 2512768 C1, publ. 04/10/2014.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017146005A RU2670767C9 (en) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Method for producing low molecular weight heparin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017146005A RU2670767C9 (en) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Method for producing low molecular weight heparin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670767C1 true RU2670767C1 (en) | 2018-10-25 |
| RU2670767C9 RU2670767C9 (en) | 2018-11-26 |
Family
ID=63923439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017146005A RU2670767C9 (en) | 2017-12-26 | 2017-12-26 | Method for producing low molecular weight heparin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670767C9 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019116217A2 (en) | 2017-12-11 | 2019-06-20 | Biological E Limited | Process for the preparation of low molecular weight heparin |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2725545C1 (en) * | 2020-01-30 | 2020-07-02 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА-Российский технологический университет" | Method of producing low-molecular heparin |
| CN115043959A (en) * | 2022-05-25 | 2022-09-13 | 湖北亿诺瑞生物制药有限公司 | Preparation method of high-yield enoxaparin sodium |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2295538C2 (en) * | 2005-03-01 | 2007-03-20 | Гематологический научный центр РАМН | Method for preparing heparins of low molecular mass |
| RU2396282C1 (en) * | 2009-04-02 | 2010-08-10 | Государственное учреждение гематологический научный центр Российской академии медицинских наук (ГУ ГНЦ РАМН) | Method for preparing heparin with low molecular weight and anticoagulant activity |
| RU2512768C1 (en) * | 2012-12-18 | 2014-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение "Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов (ФБУ "ГИКиМП") | Method of obtaining low-molecular heparin |
-
2017
- 2017-12-26 RU RU2017146005A patent/RU2670767C9/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2295538C2 (en) * | 2005-03-01 | 2007-03-20 | Гематологический научный центр РАМН | Method for preparing heparins of low molecular mass |
| RU2396282C1 (en) * | 2009-04-02 | 2010-08-10 | Государственное учреждение гематологический научный центр Российской академии медицинских наук (ГУ ГНЦ РАМН) | Method for preparing heparin with low molecular weight and anticoagulant activity |
| RU2512768C1 (en) * | 2012-12-18 | 2014-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение "Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов (ФБУ "ГИКиМП") | Method of obtaining low-molecular heparin |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019116217A2 (en) | 2017-12-11 | 2019-06-20 | Biological E Limited | Process for the preparation of low molecular weight heparin |
| US11299558B2 (en) | 2017-12-11 | 2022-04-12 | Biological E Limited | Process for the preparation of low molecular weight heparin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2670767C9 (en) | 2018-11-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1658820A3 (en) | Method for preparing mucopolysaccharides | |
| RU2670767C1 (en) | Method for producing low molecular weight heparin | |
| CN101735336B (en) | Oligomeric fucosylated glycosaminoglycan and preparation method thereof | |
| EP0116801A1 (en) | Depolymerized and supersulfated heparin, process for its preparation and pharmaceutical compositions containing them | |
| EP3298047B1 (en) | Process for the preparation of polysaccharides | |
| EA005995B1 (en) | Heparin-derived polysaccharide mixtures, preparation method and pharmaceutical compositions containing same | |
| EP1412391B1 (en) | Chitosan preparation | |
| RU2512768C1 (en) | Method of obtaining low-molecular heparin | |
| JP2006291028A (en) | Low-molecular heparin or salt thereof, and manufacturing method thereof | |
| JP2587268B2 (en) | Method for producing low-viscosity hyaluronic acid or salt thereof | |
| CN104829750A (en) | Refining process of heparin lithium | |
| EP3724235B1 (en) | Process for the preparation of low molecular weight heparin | |
| CN108484792B (en) | Dextran sulfate and method for preparing dextran sulfate | |
| CN116515013A (en) | Ultralow molecular heparin and preparation method and application thereof | |
| RU2441025C1 (en) | Method of producing low-molecular pectin | |
| US2638470A (en) | Process for the production of alginic acid sulfate | |
| JP2006077227A (en) | Method for sulfating chondroitin | |
| RU2725545C1 (en) | Method of producing low-molecular heparin | |
| CN102585034B (en) | Method for sulfonating pectin | |
| CN104725532A (en) | Method for precisely and quantitatively controlling chondroitin sulfate and dermatan sulfate contents of heparin/heparinoid | |
| RU2441024C1 (en) | Method of producing low-molecular pectin | |
| JP4221946B2 (en) | Low average polymerization degree polygalacturonic acid production method | |
| BR102016014767A2 (en) | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF FERTILIZABLE MONOSACARIDES FROM CHITINE AND / OR CHITOSAN BY CHEMICAL AND / OR ENZYMATIC HYDROLYSIS AND ITS USES | |
| KR0139615B1 (en) | Preparation process of o-carboxymethyl chitin | |
| JPH03220202A (en) | Chitosan oligomer and its production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Reissue of patent specification |