RU2669691C1 - Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью - Google Patents
Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2669691C1 RU2669691C1 RU2017128861A RU2017128861A RU2669691C1 RU 2669691 C1 RU2669691 C1 RU 2669691C1 RU 2017128861 A RU2017128861 A RU 2017128861A RU 2017128861 A RU2017128861 A RU 2017128861A RU 2669691 C1 RU2669691 C1 RU 2669691C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptides
- extraction
- acetone
- biologically active
- solution
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 16
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims abstract description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 7
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 101000741065 Bos taurus Beta-casein Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100029251 Phagocytosis-stimulating peptide Human genes 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- UEJYSALTSUZXFV-SRVKXCTJSA-N Rigin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O UEJYSALTSUZXFV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108010084754 Tuftsin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000007193 modulation by symbiont of host erythrocyte aggregation Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- OFSHRWCWYJBWJP-CMAHKSKVSA-N neocasomorphin Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)N=C(O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](CCC(O)=O)N=C(O)[C@H](C(C)C)N=C(O)[C@@H]1N(C(=O)[C@H](N)CC=2C=CC(O)=CC=2)CCC1 OFSHRWCWYJBWJP-CMAHKSKVSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 description 1
- OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;hydrate Chemical compound O.CC(C)=O OVARTBFNCCXQKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 108010091078 rigin Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 1
- 229940035670 tuftsin Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения комплекса биологически активных пептидов. Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающего иммуностимулирующей активностью, из вилочковой железы крупного рогатого скота, включающий измельчение и гомогенизацию ткани, экстракцию гомогената раствором кислоты уксусной, содержащей цинк хлористый и раствор уксусной кислоты, обработку надосадочной жидкости ацетоном, промывку образовавшегося осадка ацетоном, высушивание осадка, экстракцию пептидов из высушенного порошка водой для инъекций и добавление фермента - сериновой эндопротеазы, далее экстракт выдерживают при нагревании и постоянном перемешивании, инактивируют фермент, охлаждают, сепарируют или фильтруют и лиофилизируют, при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет увеличить выход и качество целевого продукта. 3 табл.
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается выделения биологически активных веществ из органов животных. Выделенный целевой продукт представляет комплекс биологически активных пептидов проявляющих иммуностимулирующую активность.
Биологически активные пептиды проявляющие иммуностимулирующее действие широко и успешно используется в медицине в качестве лекарственных препаратов для усиления неспецифической резистентности организма и в терапии иммунодефицитных состояний различного генеза у взрослых и детей.
Изобретение может использоваться при получении пептидных препаратов из ткани вилочковой (зобной) железы в промышленных масштабах.
Известно несколько способов получения биологически активного пептидов из ткани вилочковой железы копытных сельскохозяйственных животных. Все они предусматривают операции измельчения ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка и выделение из него целевого продукта (см., например (Патент РФ №1522485, кл. А61К 35/30, 1994 г., Авторское свидетельство СССР №1112606, кл. А61К 37/24, 1982). Способы различаются условиями проведения технологических операций и веществами применяемые на данных стадиях. Известные способы не позволяют получать биологически активные пептиды из ткани вилочковой железы в достаточном количестве и высокого качества, а так же являются слишком сложными и длительными.
Наиболее близким решением к предлагаемому изобретению являются способ получения пептидов обладающих иммуностимулирующей активностью по авторскому свидетельству СССР №1112606. В соответствии с патентом исходное количество тимуса (вилочковой железы) молодняка крупного рогатого скота подвергают измельчению на волчке с диаметром отверстий решетки 2 мм. Проводят экстракцию 3%-ным раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,0 г/л при массовом соотношении измельченной массы и раствора уксусной кислоты 1:5 - 1:6. Экстракцию проводят в течение 48-72 ч с перемешиванием по 1 часу 3 раза в день. После окончания экстракции субстрат центрифугируют в течение 20 мин со скоростью 3000 об/мин. Осветленный экстракт обрабатывают охлажденным ацетоном при температуре -3 - -5°С и массовом соотношении экстракта и ацетона 1:5. Смесь перемешивают и оставляют на 20-24 часа для формирования осадка при температуре -3 - -5°С. Полученный осадок высушивают, измельчают и растворяют в дистиллированной воде при 20°С из расчета 20 г порошка в 1 л воды (2%) при рН 6,0-7,0. Водную экстракцию проводят 1-3 ч при непрерывном перемешивании и при комнатной температуре. Удаляют балластные вещества путем фильтрации. В отфильтрованный прозрачный слегка желтоватый раствор добавляют уксусной кислоты до рН 4,0. В раствор добавляют гликокол (на 1 г порошка 3 г гликокола), стерильно фильтруют через пластины EKS, разливают во флаконы и лиофилизируют.
В результате многочисленных экспериментов были выявлены следующие недостатки данного способа получения - низкий выход и качество целевого продукта
Таким образом, приведенные выше способ-прототип позволяет получать целевой продукт, содержащий пептиды обладающие иммуностимулирующей активностью, пригодные для производства фармацевтических препаратов, однако в технологическом отношении является менее предпочтительным.
Задача настоящего изобретения состоит в способе получения целевого продукта, содержащий пептиды обладающие иммуностимулирующей активностью, обеспечивающий высокий процента выход и качества продукта, что делает его наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.
Техническим результатом настоящего изобретения является: увеличение выхода, активности и качества целевого продукта, оптимизация технологического процесса.
Для достижения указанного технического результата предложен способ который включает в себя следующие стадии:
Вилочковую железу убойных животных обрабатывают с удалением жировой ткани, сгустков крови и замораживают, замороженную ткань измельчают, гомогенизируют и проводят экстракцию 3% раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:5. Значение рН раствора должно быть рН 3.5. Для экстракции гомогенат выдерживают при температуре не выше +20°С при постоянном перемешивании в течение 48 часов. По окончании экстракции гомогенат сепарируют, отделяют твердую и жидкую фазы. К надосадочной жидкости добавляют охлажденный ацетон (температура не выше +5°С) в соотношении 1:5. Смесь перемешивают в течение 4 часов при температур +5°С. Образовавшийся осадок отделяют на центрифуге и несколько раз промывают охлажденным ацетоном. Полученный влажный осадок сушат в вакуум-сушильном шкафу. Получают ацетоновый порошок. Ацетоновый порошок растворяют в воде для инъекций и устанавливают рН 7,0. Добавляют фермент - сериновую эндопротеазу, выдерживают при постоянном перемешивании до +65°С в течение 3 часов. Для инактивации фермента температуру реакционной массы увеличивается до +90°С и выдерживают в течение 30 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры, сепарируют или фильтруют. Далее проводят стерилизующую фильтрацию путем пропускания раствора через мембрану с диаметром пор 0,22 мм. Раствор разливают в емкости, замораживают и лиофилизируют. Целевой продукт представляет лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета и содержит комплекс биологически активных пептидов.
Для производства используют вилочковую железу телят и молодняка крупного рогатого скота. Замороженную вилочковую железу используют не позднее чем через 8-10 месяцев.
Использование повышенной концентрации хлористого цинка (1,2 г/л) способствует более полному извлечению активных фракций из гомогенизированной ткани вилочковой железы. Применение протеолитического фермента сериновой эндопротеазы, обладающей широкой субстрат - специфичностью, при высокой ионной силе, способствует более полному высвобождению и накоплению биологически активных пептидов из ацетонового порошка. Конечная концентрация фермента при ферментативном гидролизе составляет 0,3%. Проведенными нами исследованиями, по кинетики высвобождения пептидов из ацетонового порошка при ферментативном гидролизе, установлено, что максимальное количество пептидов накапливается в гидролизате в течение 3 часов. В течение данного времени интенсивно протекает протеолиз и происходит максимальное накопление продуктов промежуточного гидролиза белково-пептидных субстратов. Применение ограниченного ферментативного гидролиза способствует полному удалению высокомолекулярных белковых примесей из целевого продукта, которые могут вызывать негативные последствия, такие как аллергические реакции и прионные заболевания. В данном случае ферментативный гидролиз можно рассматривать, как альтернативный вариант методу ультрафильтрации с целью удаления белковых веществ проявляющие побочные свойства. Отсутствие белковых примесей в целевом продукте подтверждено методами ВЭЖХ и электрофореза по Леммли (Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклемновых кислот Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот М.: Наука, 1985. 536 с, Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.).
Согласно литературным данным при ограниченном протеолизе белков происходит высвобождение низкомолекулярных пептидов, которые обладают выраженными биологически активными свойствами. Например, при протеолизе казеина (белок содержащийся в молоке) высвобождаются пептиды, которые обладают анальгетическими свойствами - казоморфины, при протеолизе иммуноглобулинов, в частности иммуноглобулинов G, образуются иммуномодулируюшие пептиды - тафцин, ригин, пептиды коллагена и фибронектина участвующие в тканевом и клеточном гомеостазе (Структурные основы действия пептидных и белковых иммунорегуляторовлод ред. Чипенса Г.И. Рига: Зинатне, 1990. 324 с, Jinsmaa Y, Yoshikawa М, 1999; «Enzymatic release of neocasomorphin and beta-casomorphhinfrom bovine beta-casein»; Peptides 20:957-962.,).
Использование ацетона на одной из стадий технологического процесса позволяет не только удалить липиды, пигменты и полисахариды, но и значительно сократить содержание уксусной кислоты и цинка хлористого в готовом продукте. Необходимо подчеркнуть, что из ацетонового порошка в основном извлекаются водорастворимые полипептиды и белки, что особенно важно при учете их фармакокинетики и биодоступности.
Сопоставимый анализ предлагаемого способа показал, что определяющим отличием заявляемого технического решения от прототипа является то, что биологически активные водорастворимые пептиды выделяют на стадии экстракции из ацетонового порошка при ферментативном гидролизе, при этом значительно повышается выход и качество целевого продукта (таблица 1).
Изобретение иллюстрируется примером конкретного выполнения способа: Предварительно размороженное сырье в количестве 20 кг подвергают измельчению с помощью волчка с диаметром отверстий решетки 3 мм. Далее проводят экстракцию 3% раствором кислоты уксусной при рН 3,5, содержащий цинк хлористый в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении измельченной массы и экстракционного раствора 1:5. В начале процесса экстракции смесь гомогенизируют погружным диспергатором при частоте вращения ротора 3000 об/мин в течение 20 минут и далее экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течении 48 часов при температуре не более +20°С. По окончании процесса экстракции проводят отделение жидкой и твердой части экстракционной смеси при помощи сепаратора. Режим сепарации 2000-3000 об/мин.
Отфильтрованный раствор экстракта охлаждается при перемешивании в течение 24 часов, после чего начинается процесс осаждения. К охлажденному экстракту добавляют в соотношении 1:5 охлажденный ацетон при температура не выше +5°С. Далее смесь перемешивают и выдерживают в течение 4 часов для формирования осадка. Осадок отделяется от жидкой фазы при помощи центрифуги. Твердая фаза несколько раз (2-3 раза) промывается охлажденным ацетоном до тех пор, пока осадок не приобретет светлосерый или белый цвет. Полученный влажный осадок ацетонового порошка направляют в вакуумно-сушильный шкаф для сушки при температуре не выше +20°С. Время высушивания составляет 2,5-3,0 часа. Получают ацетоновый порошок в количестве 1,26 кг. Водно-ацетоновая смесь направляют на регенерацию ацетона.
К ацетоновому порошку добавляют расчетное количество воды для инъекций при рН 7,0. Затем вносят сериновую эндопротеазу (0,3% от общего объема раствора полупродукта). После внесения фермента раствор полупродукта нагревают при постоянном перемешивании до +65°С. Нагрев осуществляют в течение 3 часов. Затем температуру реакционной массы увеличивают до +90°С и выдерживается в течение 30 минут для инактивации фермента.
После окончания ферментативного гидролиза реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и подают на сепаратор для удаления твердой фазы. Режим сепарирования при 2000-3000 об/мин. Полученный фильтрат собирают и передают на стадию стерилизующей фильтрации.
Процессы стадии стерилизующей фильтрации осуществляют в помещении класса чистоты В. Полученный стерильный раствор разливают в предварительно подготовленные стерильные поддоны и передают на стадию лиофильной сушки.
Процессы стадии осуществляются в помещении класса чистоты В с локальной зоной А в зоне загрузки/выгрузки сушки. Процесс производства осуществляют на лиофильной сушке в автоматическом режиме.
Высушенный готовый продукт представляет собой хорошо сформированный порошок белого или желтовато-белого цвета, потери в массе при высушивании не должны превышать 10%. Выход готового продукта составляет 0,380 кг сухого порошка. Высушенный готовый продукт упаковывается в первичную упаковку и передается в помещение для хранения, где маркируется и временно хранится в холодильнике.
Далее проводят контроль параметров полученного продукта (таблица 2 и таблица 3): Полученный заявляемым способом целевой продукт был проверен на биологическую активность. Биологическую активность оценивают по иммунологической активности выделенных лимфоцитов крови с использованием метода розеткообразования (РО). Тест розеткообразования основан на различиях рецепторной структуры лейкоцитов (лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов), которые при взаимодействии с эритроцитами могут спонтанно присоединять последние к своей поверхности. При этом образуются фигуры, напоминающие розетки, в центре которых находится лейкоцит, а вокруг него располагаются не менее 3-5 эритроцитов. В формировании розеток участвуют антигены самих эритроцитов, которые образуют спонтанные и иммунные розетки: спонтанные розетки - между лимфоцитами животных и эритроцитами кролика.
Испытание проводят в реакции «активного» розеткообразования (РОК) обработанных трипсином тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика. Время проведения опыта на одном животном от момента его умерщвления и извлечения тимуса до подсчета процентного содержания розеткообразующих клеток (РОК) не должно превышать 2 часа.
В опыт берут последовательно 5 морских свинок с массой тела 150-250 г. От каждого животного, умервщленного в камере для эфтаназии, отбирали тимус. Одну долю тимуса помещают в 5 мл среды 199, затем в стеклянный гомогенизатор, тщательно гомогенизируют. Затем гомогенат фильтруют через 4 слоя марли, предварительно смоченной средой 199, в центрифужную пробирку. Пробирку с суспензией клеток центрифугируют при 1500 об/мин (400 g) в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют и к осадку прибавляют 1 мл среды 199, суспензируют. В сухую центрифужную пробирку вносят 0,33 мл 3% раствора кислоты уксусной и 0,02 мл взвеси тимоцитов, тщательно перемешивают. В камере Горяева подсчитывают количество клеток в 100 больших квадратах, полученное число умножают на 5*104 и получают количество клеток в 1 мл. Если количество клеток в 1 мл окажется менее 100*106. животное исключают из опыта и заменяют другим. Полученную суспензию клеток разбавляют средой 199 до концентрации 20*106 клеток/мл. Одновременно готовят концентрацию суспензии 2*106 клеток/мл (норма).
В сухую центрифужную пробирку вносят в соотношении 6:1 суспензию тимоцитов в концентрации 20*106 клеток/мл и 0,5% раствор трипсина в среде 199, приготовленный непосредственно перед использованием. После прибавления раствора трипсина образовавшийся сгусток удаляют отсасыванием пипеткой. Суспензию клеток центрифугируют при 1500 об/мин (400 g) в течение 10 мин. Надосадочную жидкость аккуратно сливают, прибавляют 3 мл среды 199, тщательно ресуспендируют. Затем отмывают тимоциты от трипсина в этом же режиме. К осадку прибавляют 1 мл среды, тщательно ресуспендируют. Затем готовят рабочую суспензию с концентрацией 2*106 клеток/мл (контроль), как указано ранее. Определение биологической активности субстанции экстракта вилочковой железы с использованием тимоцитов от одной морской свинки проводят следующим образом. В первую центрифужную пробирку вносят 0,1 мл контрольной суспензии тимоцитов в концентрации 2*106 клеток/мл (норма). Во вторую (контроль) и третью (опыт) центрифужные пробирки вносят по 0,1 мл рабочей суспензии тимоцитов, обработанных трипсином, в той же концентрации. В третью пробирку прибавляют 0,02 мл испытуемого раствора. Затем во все пробирки прибавляют по 0,1 мл % суспензии свежих отмытых раствором натрия хлорида изотонического 0,9% эритроцитов кролика, разведенных в среде 199. Взвесь клеток перемешивают и центрифугируют в течение 5 минут при 800-1000 об/мин (200g). Клетки ресуспендируют и в камере Горячева подсчитывают процентное содержание РОК в каждой из трех пробирок. За РОК принимают тимоцит, присоединивший 3 и более эритроцитов. В случае определения числа РОК в субстанции в норме (без обработки трипсином) менее 40% или процентного содержания РОК в опыте менее чем в контроле, животное исключают из опыта и заменяют другим. Определяют средние арифметические показатели процентного содержания РОК у 5 животных. Субстанцию считают биологически активной, если при снижении среднеарифметического числа РОК при воздействии трипсина по сравнению с нормой, она восстанавливает количество РОК не менее чем на 40% по сравнению с контролем.
Выявлено, что продукт полученный заявленным способом обладает выраженной биологической активностью - процент восстановления РОК (розеткообразующих клеток) достоверно превышали 40% относительно контрольных значений (таблица 2).
Проведенные испытания представлены в таблице 3.
Представленные в таблице 3 данные демонстрируют, что полученный заявленным способом целевой продукт имеет аналогичные качественные и количественные характеристики, а по некоторым параметрам заявленный продукт превосходит известный.
Таким образом, целевой продукт, полученный предлагаемым способом, соответствует всем параметрам фармацевтического продукта - субстанции.
Claims (1)
- Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью, из вилочковой железы крупного рогатого скота, включающий операции измельчения и гомогенизации ткани, экстракции гомогената раствором 3% кислоты уксусной, содержащей цинк хлористый при массовом соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:5, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивания осадка, экстракции пептидов из высушенного порошка водой для инъекций, отличающийся тем, что на стадии экстракции гомогената ткани вилочковой железы используется концентрация цинка хлористого 1,2 г/л, на стадии экстракции пептидов из высушенного порошка добавляют фермент - сериновую эндопротеазу до конечной концентрации 0,3%, выдерживают при температуре +65°С при постоянном перемешивании в течение 3 часов, инактивируют фермент при температуре +90°С в течение 30 минут, охлаждают до комнатной температуры, сепарируют или фильтруют и лиофилизируют.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128861A RU2669691C1 (ru) | 2017-08-14 | 2017-08-14 | Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128861A RU2669691C1 (ru) | 2017-08-14 | 2017-08-14 | Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2669691C1 true RU2669691C1 (ru) | 2018-10-15 |
Family
ID=63862365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017128861A RU2669691C1 (ru) | 2017-08-14 | 2017-08-14 | Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2669691C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2049472C1 (ru) * | 1992-12-21 | 1995-12-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Способ получения гидролизата мозговой ткани "церебролизат" |
| SU1112606A1 (ru) * | 1982-04-27 | 1996-08-20 | Ленинградское производственное объединение мясной промышленности им. С.М.Кирова | Способ получения иммуностимулятора из тимуса |
| RU2090194C1 (ru) * | 1994-09-30 | 1997-09-20 | Игорь Арнольдович Скворцов | Способ получения препарата для лечения координаторных нарушений из мозжечково-стволового отдела головного мозга |
-
2017
- 2017-08-14 RU RU2017128861A patent/RU2669691C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1112606A1 (ru) * | 1982-04-27 | 1996-08-20 | Ленинградское производственное объединение мясной промышленности им. С.М.Кирова | Способ получения иммуностимулятора из тимуса |
| RU2049472C1 (ru) * | 1992-12-21 | 1995-12-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Способ получения гидролизата мозговой ткани "церебролизат" |
| RU2090194C1 (ru) * | 1994-09-30 | 1997-09-20 | Игорь Арнольдович Скворцов | Способ получения препарата для лечения координаторных нарушений из мозжечково-стволового отдела головного мозга |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Выделение регуляторных пептидов из тимусамина - нуклеопротеинового комплекса тимуса/А.Ю. Соловьев, Д.В. Жилинский, И.А. Чернова, Б.Я. Басин, Л.К. Шатаева, В.Х. Хавинсон // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Т.11. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR910009342B1 (ko) | 생물학적 활성 추출물의 제조방법 | |
| CN102933595A (zh) | 去端肽胶原及其分离方法、改性去端肽胶原及其制备方法、胶原型基质 | |
| JPH08501688A (ja) | ベータ・カゼイン強化製品の製造方法 | |
| WO2012002837A1 (ru) | Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс | |
| RU2409291C1 (ru) | Способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород | |
| RU2669691C1 (ru) | Способ получения комплекса биологически активных пептидов, обладающих иммуностимулирующей активностью | |
| RU2669693C1 (ru) | Способ получения комплекса биологически активных пептидов, восстанавливающих функцию предстательной железы | |
| RU2669692C1 (ru) | Способ получения комплекса биологически активных пептидов обладающих нейротропной активностью | |
| RU2287959C2 (ru) | Способ производства натуральных структурообразователей из рыбных отходов | |
| RU2560845C1 (ru) | Способ приготовления низкомолекулярного комплекса активированного эмбрионального (ника-эм) | |
| RU2563816C1 (ru) | Способ получения иммуностимулятора | |
| RU2488634C1 (ru) | Способ получения днк из молок лососевых рыб | |
| RU2481113C2 (ru) | Способ получения веществ, влияющих на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека а431 | |
| RU2671537C2 (ru) | Препарат гиалуронидазы и способ его получения | |
| RU2625497C1 (ru) | Способ производства пищевой добавки из дикорастущего растения люпина | |
| RU2128511C1 (ru) | Способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы | |
| RU2338375C2 (ru) | Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов | |
| RU1417244C (ru) | Способ получения вещества, восстанавливающего функцию предстательной железы | |
| RU2782347C1 (ru) | Способ переработки фабрициевой бурсы птиц | |
| RU2736645C1 (ru) | Способ получения бактериологически чистого протеинового продукта с повышенным содержанием минорных белков | |
| RU2332423C2 (ru) | Способ получения тимических пептидов | |
| RU2553334C2 (ru) | Способ выделения белков из клеток костного мозга | |
| RU2738745C1 (ru) | Бактериологически чистый протеиновый продукт с повышенным содержанием минорных белков | |
| RU2483565C2 (ru) | Способ получения модифицированного белкового изолята из подсолнечного жмыха | |
| JP2010018575A (ja) | 細胞接着阻害活性を有するクラゲ抽出画分 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200815 |