RU2663347C1 - Method of delivering biologically active macromolecules into the cells of plants - Google Patents
Method of delivering biologically active macromolecules into the cells of plants Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663347C1 RU2663347C1 RU2017124849A RU2017124849A RU2663347C1 RU 2663347 C1 RU2663347 C1 RU 2663347C1 RU 2017124849 A RU2017124849 A RU 2017124849A RU 2017124849 A RU2017124849 A RU 2017124849A RU 2663347 C1 RU2663347 C1 RU 2663347C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoparticle
- plant
- delivery
- cell
- rna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 title claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 69
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 39
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 29
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 19
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 9
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 8
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 claims 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 71
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 59
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 37
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 37
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 21
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 21
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 10
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 10
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 108010051876 p80-coilin Proteins 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 2
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001149092 Arabidopsis sp. Species 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100031144 Coilin Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 101710180995 Endonuclease 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 1
- 241000283283 Orcinus orca Species 0.000 description 1
- 241000511986 Oryza sp. Species 0.000 description 1
- 244000273256 Phragmites communis Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100025135 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 6 Human genes 0.000 description 1
- 108050000071 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 6 Proteins 0.000 description 1
- 235000003846 Ricinus Nutrition 0.000 description 1
- 241000322381 Ricinus <louse> Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- -1 ZFB) Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010006205 fluorescein isothiocyanate bovine serum albumin Proteins 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003721 gunpowder Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000004476 plant protection product Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область применения изобретенияThe scope of the invention
Изобретение относится к области биотехнологии, физико-химической биологии, молекулярной биологии и направлено на разработку эффективного способа доставки биологически активных макромолекул (белков, нуклеиновых кислот различного размера и нуклеопротеидных комплексов белков с нуклеиновыми кислотами) в клетки растений. В соответствии с настоящим изобретением получены инфильтрируемые в клетки растений наноплатформы на основе частиц хитозана, функционализированные биологически активными макромолекулами, которые могут быть использованы в различных био- нанотехнологиях, например с целью их последующего применения для редактирования генома растений методом, исключающим неконтролируемое внесение чужеродного генетического материала, защиты сельскохозяйственных растений от различных патогенов, включая бактерии, оомицеты, грибы и вирусы, а также для генетической трансформации растений.The invention relates to the field of biotechnology, physico-chemical biology, molecular biology, and is aimed at developing an effective method for the delivery of biologically active macromolecules (proteins, nucleic acids of various sizes and nucleoprotein complexes of proteins with nucleic acids) in plant cells. In accordance with the present invention, nanoplatforms based on chitosan particles infiltrated into plant cells have been obtained, functionalized with biologically active macromolecules, which can be used in various bio-nanotechnologies, for example, for their subsequent use in editing the plant genome by a method that excludes uncontrolled introduction of foreign genetic material, protect agricultural plants from various pathogens, including bacteria, oomycetes, fungi and viruses, as well as for eticheskoy plant transformation.
Описание изобретенияDescription of the invention
Терминология: Все термины и определения, приведенные в тексте, следует понимать в том смысле, в котором они обычно применяются в соответствующих областях науки и техники.Terminology: All terms and definitions given in the text should be understood in the sense in which they are usually applied in the relevant fields of science and technology.
Некоторые определения, оговоренные специально, не являются исключениями и приводятся только в целях облегчения понимания сущности изобретения.Certain definitions, specifically mentioned, are not exceptions and are provided only for the purpose of facilitating understanding of the essence of the invention.
Эффективность доставки биомолекул - процент попадания внутрь растительной клетки целевых биомолекул, определяемый с помощью введения флуоресцирующих/флуоресцентно меченных молекул.Biomolecule Delivery Efficiency — Percentage of target biomolecules entering the plant cell, determined by introducing fluorescent / fluorescently labeled molecules.
Эффективность геномного редактирования - процент локусов в геноме растительных клеток, в которые были внесены направленные мутации.The effectiveness of genomic editing is the percentage of loci in the genome of plant cells into which directed mutations have been introduced.
Биологически активные макромолекулы, биомолекулы или биополимеры - полимеры, встречающихся в природе в естественном виде, входящие в состав живых организмов.Biologically active macromolecules, biomolecules or biopolymers are polymers that occur naturally in nature and are part of living organisms.
Постоянно растущее население мира и сокращающийся фонд сельскохозяйственных пахотных земель стимулируют исследования, направленные на повышение эффективности сельского хозяйства. Стандартные средства повышения урожайности сельскохозяйственных и садовых культур включают в себя селекционные методики, основанные на выявлении растений, характеризующихся желаемыми признаками. Технологии молекулярной биологии, основанные на манипуляции генетическим материалом (нуклеиновых кислот в виде ДНК или РНК) и последующем введении этого генетического материала в растение, позволяют создавать культуры, характеризующиеся различными улучшенными экономическими, агротехническими и садово-техническими признаками.The ever-growing world population and the declining fund of agricultural arable land stimulate research aimed at improving the efficiency of agriculture. Standard means of increasing the yield of agricultural and horticultural crops include breeding techniques based on the identification of plants characterized by the desired traits. Molecular biology technologies based on the manipulation of genetic material (nucleic acids in the form of DNA or RNA) and the subsequent introduction of this genetic material into a plant allow the creation of cultures characterized by various improved economic, agrotechnical and horticultural characteristics.
Задача настоящего изобретения состояла в разработке технически простого универсального метода доставки биологически активных макромолекул в клетки растений, который применим для доставки разнообразных макромолекул, включая короткие РНК, ДНК, белки и комплексы белков с нуклеиновыми кислотами, с эффективностью, позволяющей регулировать различные клеточные процессы, в том числе активность клеточных генов и защитный ответ растений на инфекцию различными патогенами.The objective of the present invention was to develop a technically simple universal method for the delivery of biologically active macromolecules to plant cells, which is applicable for the delivery of a variety of macromolecules, including short RNA, DNA, proteins and protein complexes with nucleic acids, with the efficiency that allows you to regulate various cellular processes, including including the activity of cell genes and the protective response of plants to infection by various pathogens.
В качестве перспективного инструмента для доставки нуклеиновых кислот, белков и нуклеопротеинов в клетку в настоящее время рассматриваются полимерные системы, в том числе наночастицы и нанокапсулы [Марквичева Е.А. Хитозан и его производные в биоинкапсулировании. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М.: Изд-во Наука, 2002. с. 315-326.]. Документы WO/2010/118077, WO/2009/046384, WO/2012/006439, WO/2012/006443, WO 2008/083233, WO 2011US57813A раскрывают применение наночастиц для доставки ДНК и трансформации растений. Известен также опосредованный золотыми наночастицами метод доставки сиквенс-специфических нуклеаз в растительные клетки, раскрытый в документах RU 2612156 C2 и RU 2556376 C2 (ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ, (US)). В отличие от известного метода, в настоящем изобретении в качестве материала для создания наночастиц для применения в доставке макромолекул в растительные клетки предложен хитозан. Хитозан широко применяют в сельском хозяйстве при разработке средств защиты растений, однако к настоящему времени не разработано способов его применения для эффективной доставки макромолекул в растительные клетки. Хитозан, в составе которого преобладают остатки глюкозамина, - природный полимер, обладающий широким спектром биологических свойств, в том числе биосовместимостью и биодеградируемостью. В последнее время хитозан рассматривается как один из перспективных материалов при создании полимерных матриц для доставки в лекарственных препаратов и ДНК в клетки животных.As a promising tool for the delivery of nucleic acids, proteins and nucleoproteins into the cell, polymer systems, including nanoparticles and nanocapsules, are currently considered [Markvicheva EA Chitosan and its derivatives in bioencapsulation. Chitin and chitosan: production, properties and application. M .: Publishing House of Science, 2002.p. 315-326.]. Documents WO / 2010/118077, WO / 2009/046384, WO / 2012/006439, WO / 2012/006443, WO 2008/083233, WO 2011US57813A disclose the use of nanoparticles for DNA delivery and plant transformation. Also known is a mediated method of delivering sequence-specific nucleases to plant cells mediated by gold nanoparticles, disclosed in documents RU 2612156 C2 and RU 2556376 C2 (DAU AGROSAIENISIS, (US)). Unlike the known method, in the present invention, chitosan is proposed as a material for creating nanoparticles for use in the delivery of macromolecules to plant cells. Chitosan is widely used in agriculture in the development of plant protection products, however, to date, no methods have been developed for its use for the efficient delivery of macromolecules to plant cells. Chitosan, in which glucosamine residues predominate, is a natural polymer with a wide range of biological properties, including biocompatibility and biodegradability. Recently, chitosan is considered as one of the promising materials in the creation of polymer matrices for delivery in drugs and DNA to animal cells.
Созданные на его основе системы доставки в клетки животных с внедренными в них ДНК-векторами имеют ряд преимуществ: на их поверхности можно ковалентно присоединить лиганды, которые обеспечивают высокоспецифическое взаимодействие с клеточными рецепторами; можно ввести в клетку не одну, а несколько ДНК-плазмид в одной наночастице или нанокапсуле; можно защитить нуклеиновую кислоту от расщепления ферментами; ДНК-плазмиды приобретают компактный вид, что предотвращает их механический разрыв и облегчает проникновение через мембраны клеток; такие наночастицы можно лиофильно высушить и длительно хранить в такой форме без потери активности [Gene Ther. 2004; v. 11:19:1441-1452.]. Методы введения генетического материала, ДНК, РНК, протеинов и нуклеопротеидных комплексов в растительные клетки значительно отличаются от тех, что используются для клеток животных. Основным препятствием на пути макромолекул является клеточная стенка. Ее химический состав и особенности расположения составляющих ее компонентов способствуют связыванию нуклеиновых кислот и белков различной структуры, ограничивая тем самым доступ их к мембране клетки. При использовании не вирусных векторов, например, несущей целевой ген бактериальной плазмидной ДНК, эффективность прямой трансформации оказывается очень низкой. Проводимые в 1970-1980-е годы эксперименты по введению суспензий молекул ДНК в завязи цветков или молодые цветочные побеги с помощью шприца (макроинъекции), замачиванию сухих семян растений или пыльцы в подобных растворах, применению электрофореза для усиления проникновения ДНК в ткани проростков показали, что частота образования трансформантов крайне низка (менее 2%). Альтернативными являются методы введения ДНК в протопластированные (лишенные клеточной стенки) растительные клетки, где для удаления клеточной стенки растительных клеток применяют комплекс ферментов грибного или бактериального происхождения, состоящий из пектинлиаз и целлюлаз.The systems of delivery to animal cells with DNA vectors embedded in them have been developed on its basis and have several advantages: ligands that provide highly specific interaction with cellular receptors can be covalently attached to their surface; you can enter into the cell not one but several DNA plasmids in one nanoparticle or nanocapsule; nucleic acid can be protected from enzyme digestion; DNA plasmids acquire a compact form, which prevents their mechanical rupture and facilitates penetration through cell membranes; such nanoparticles can be freeze-dried and stored for a long time in this form without loss of activity [Gene Ther. 2004; v. 11: 19: 1441-1452.]. The methods for introducing genetic material, DNA, RNA, proteins, and nucleoprotein complexes into plant cells are significantly different from those used for animal cells. The main obstacle to macromolecules is the cell wall. Its chemical composition and features of the arrangement of its constituent components contribute to the binding of nucleic acids and proteins of various structures, thereby limiting their access to the cell membrane. When using non-viral vectors, for example, carrying the target gene of bacterial plasmid DNA, the efficiency of direct transformation is very low. The experiments conducted in the 1970s and 1980s on introducing suspensions of DNA molecules into the ovary of flowers or young flower shoots using a syringe (macroinjection), soaking dry plant seeds or pollen in such solutions, and the use of electrophoresis to enhance the penetration of DNA into seedling tissues showed that the frequency of formation of transformants is extremely low (less than 2%). Alternative are methods for introducing DNA into protoplastic (devoid of a cell wall) plant cells, where a complex of enzymes of fungal or bacterial origin, consisting of pectinliases and cellulases, is used to remove the cell wall of plant cells.
В настоящее время часто используют физический способ доставки ДНК в клетку - бомбардировку ее микрочастицами (биобаллистика или сокращенно биолистика). ДНК на частицах диаметром от 0,4 до 1,2 мкм закрепляют путем обработки растворами нуклеиновой кислоты и СаСl2, или спермидина, или полиэтиленгликоля. Покрытые ДНК частицы с помощью специальных приборов разгоняют до скорости 300-600 м/с и направляют поток на изолированные клетки, фрагменты или целое растение. Для создания потока летящих частиц используют газы, образующиеся при сгорании пороха, сжатый воздух или гелий. Частицы пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. Доставленная в клетки ДНК частично переходит в свободное состояние и взаимодействует с молекулами ДНК в ядре, митохондриях или пластидах.Currently, they often use the physical method of delivering DNA to a cell - bombarding it with microparticles (bio-ballistics or abbreviated biolistics). DNA on particles with a diameter of 0.4 to 1.2 μm is fixed by treatment with solutions of nucleic acid and CaCl 2 , or spermidine, or polyethylene glycol. Particles coated with DNA are accelerated to a speed of 300-600 m / s using special instruments and the flow is directed to isolated cells, fragments, or the whole plant. To create a flow of flying particles, gases generated by the combustion of gunpowder, compressed air or helium are used. Particles pierce the cell wall and membranes of the plant cell. The DNA delivered to the cells partially goes into a free state and interacts with the DNA molecules in the nucleus, mitochondria, or plastids.
Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения практически любых видов. Но при этом известно, что происходит она с невысокой частотой, а интеграция и экспрессия чужеродных генов может зависеть от вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК. Кроме того, при бомбардировке микрочастицами высокомолекулярные плазмиды (более 10 т.п.н.) могут фрагментироваться, поэтому уровень экспрессии чужеродных генов окажется ниже, чем в случае плазмид меньшего размера.The microparticle bombardment method allows you to transform plants of almost any species. But it’s known that it occurs at a low frequency, and the integration and expression of foreign genes may depend on the vector used for their introduction. For example, the frequency of transformation is increased if linear rather than circular DNA is used. In addition, when microparticle bombardment, high molecular weight plasmids (more than 10 kb) can fragment, so the level of expression of foreign genes will be lower than in the case of smaller plasmids.
В качестве микрочастиц для бомбардировки растительных тканей используют сферические частицы благородных металлов - золота или вольфрама, поскольку они обладают необходимой массой и твердостью и при этом не являются токсичными.As microparticles for the bombardment of plant tissues, use spherical particles of noble metals - gold or tungsten, since they have the necessary mass and hardness and are not toxic.
В настоящем изобретении в качестве материала для создания частиц-носителей макромолекул используется хитозан, который, благодаря своей поликатионной природе, способен образовывать полиэлектролитные комплексы с отрицательно заряженными полимерами, такими как нуклеиновые кислоты, белки, нуклеопротеиды (Прикладная Биохимия и Микробиология 2005; т. 41:1:9-16. Biomacromolecules 2004; v. 5:928-936.). Авторы изобретения разработали оригинальную методику, позволяющую использовать хитозан для конструирования наночастиц-носителей макромолекул (ДНК, нуклеопротеидных комплексов и белков) и доставки их в растительную клетку.In the present invention, chitosan is used as a material for creating carrier particles of macromolecules, which, due to its polycationic nature, is able to form polyelectrolyte complexes with negatively charged polymers, such as nucleic acids, proteins, nucleoproteins (Applied Biochemistry and Microbiology 2005; v. 41: 1: 9-16. Biomacromolecules 2004; v. 5: 928-936.). The inventors have developed an original technique that allows the use of chitosan for the construction of nanoparticles-carriers of macromolecules (DNA, nucleoprotein complexes and proteins) and their delivery to the plant cell.
В частности, с помощью раскрытого в настоящем изобретении способа доставки макромолекул авторы изобретения предлагают редактировать геном высших растений, для чего могут быть использованы элементы системы CRISPR-Cas9. Способность частиц хитозана с высокой эффективностью связываться с макромолекулами различного состава и размера крайне важна в данном случае: для работы системы CRISPR необходима особым образом процессированная CRISPR-PHК (crPHК). CRISPR - методы редактирования генома основаны на использовании ДНК-интерференции, направляющей (гидовой) РНК и нацеленности против специфических последовательностей ДНК. Ряд важных открытий, касающихся устройства систем CRISPR типа II (в частности, выяснение необходимости для ее работы белка Cas9 и дополнительной - помимо crРНК - малой РНК, названной tracrPHК), позволил в 2012 году экспериментально опробовать первую искусственно разработанную систему CRISPR типа II. Искусственные системы CRISPR-Cas могут работать не только в клетках бактерий и in vitro, но и в клетках эукариот.In particular, using the method of delivery of macromolecules disclosed in the present invention, the inventors propose editing the genome of higher plants, for which CRISPR-Cas9 system elements can be used. The ability of chitosan particles to bind macromolecules of various compositions and sizes with high efficiency is extremely important in this case: for the CRISPR system to work, a specially processed CRISPR-PHK (crPHK) is necessary. CRISPR - genome editing methods are based on the use of DNA interference, directing (guiding) RNA and targeting specific DNA sequences. A number of important discoveries regarding the design of type II CRISPR systems (in particular, the clarification of the need for Cas9 protein and additional, in addition to crRNA, small RNA called tracrPHK), made it possible to experimentally test the first artificially developed type II CRISPR system in 2012. Artificial CRISPR-Cas systems can work not only in bacterial and in vitro cells, but also in eukaryotic cells.
Ожидаемым техническим результатом настоящего изобретения являлась разработка унифицированной процедуры доставки макромолекул в растительные клетки, расширение методического арсенала способов и средств доставки в растительную клетку макромолекул, в частности нуклеиновых кислот, белков и нуклеопротеидных комплексов, с возможностью последующего перепрограммирования растительных клеток и/или редактирования их генома.The expected technical result of the present invention was the development of a unified procedure for the delivery of macromolecules to plant cells, the expansion of the methodological arsenal of methods and means of delivery of macromolecules, in particular nucleic acids, proteins and nucleoprotein complexes, to the plant cell, with the possibility of subsequent reprogramming of plant cells and / or editing of their genome.
Описание чертежейDescription of drawings
Фиг. 1. Фазово-контрастное изображение частиц хитозана, полученное с помощью флуоресцентного микроскопа (А), флуоресцентная микроскопия частиц хитозана, функционализированных бычьим сывороточным альбумином, меченным флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) (Б) и флуоресцентная микроскопия частиц хитозана, функционализированных препаратом тРНК, меченным флуоресцентной меткой Су-3 (В). Видно эффективное связывание частицами хитозана флуоресцентно-меченных молекул белка и РНК.FIG. 1. Phase-contrast image of chitosan particles obtained using a fluorescence microscope (A), fluorescence microscopy of chitosan particles functionalized with bovine serum albumin labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) (B) and fluorescence microscopy of chitosan particles functionalized with fluorescence drug Su-3 (B). Effective binding of chitosan particles to fluorescently-labeled protein and RNA molecules is seen.
Фиг. 2. Инфильтрация растений Nicotiana benthamiana ФИТЦ-БСА, иммобилизованного на частицах хитозана или золотых частицах (в присутствии частиц хитозана).FIG. 2. Infiltration of plants Nicotiana benthamiana FITZ-BSA immobilized on chitosan particles or gold particles (in the presence of chitosan particles).
Фиг. 3. Инфильтрация тРНК, меченной флуоресцентным красителем Су3 и иммобилизованной на частицах хитозана, в клетки растений Nicotiana benthamiana. Ярко окрашены клетки проводящего пучка.FIG. 3. Infiltration of tRNA labeled with Cu3 fluorescent dye and immobilized on chitosan particles into Nicotiana benthamiana plant cells. The cells of the conducting beam are brightly colored.
Фиг. 4. Оценка эффективности метода доставки плазмидной ДНК, кодирующей ЗФБ, в клетки растений с помощью инфильтрации частицами хитозана.FIG. 4. Evaluation of the effectiveness of the method for the delivery of plasmid DNA encoding ZFB into plant cells by infiltration with chitosan particles.
Фиг. 5. Электрофореграмма библиотеки до и после очистки.FIG. 5. Electrophoregram library before and after cleaning.
М - маркер молекулярного веса ДНК.M is a molecular weight marker for DNA.
1 bАu - биолистический бомбардмент золотыми наночастицами, покрытыми комплексами Cas9-sgRNA1 bАu - biolistic bombardment with gold nanoparticles coated with Cas9-sgRNA complexes
2 bН2O - биолистический бомбардмент комплексами Cas9-sgRNA без наночастиц (- контроль)2 bН2O - biolistic bombardment with Cas9-sgRNA complexes without nanoparticles (- control)
3 iChit - вакуумная инфильтрация комплексами Cas9-sgRNA на хитозановых наночастицах3 iChit - vacuum infiltration with Cas9-sgRNA complexes on chitosan nanoparticles
4 iH2O - вакуумная инфильтрация комплексами Cas9-sgRNA без наночастиц (-контроль)4 iH2O - vacuum infiltration with Cas9-sgRNA complexes without nanoparticles (-control)
Фиг. 6. Картирование ридов для выявления редактирования гена коилина картофеля.FIG. 6. Mapping of reeds to identify editing of the potato coilin gene.
Фиг. 7. Морфогенные каллусы картофеля, сорт Чикаго, отделяемые от стеблевого экспланта для инфильтрации частицами.FIG. 7. Morphogenic callus of potato, a variety of Chicago, separated from the stem explant for particle infiltration.
Фиг. 8. Регенерация побегов из морфогенных каллусов картофеля, сорт Чикаго, после инфильтрации суспензии содержащей частицы хитозана (0.25%), Cas9 и gRNA PDS.FIG. 8. Regeneration of shoots from morphogenic callus of potato, cultivar Chicago, after infiltration of a suspension containing particles of chitosan (0.25%), Cas9 and gRNA PDS.
Фиг. 9. Т7Е1 тест на ДНК морфогенного каллуса картофеля, подвергшегося редактированию гена фитоендесатуразы с помощью инфильтрации хитозановыми наночастицами, с иммобилизованным на их поверхности комплексом Cas9-sgRNA. ПЦР - амплифицированный фрагмент гена фитоендесатуразы морфогенного каллуса картофеля, подвергшегося редактированию. Т7Е1 - он же обработанный Т7 эндонуклеазой 1. Наличие разрезания целевой ДНК указывает на наличие геномного редактирования в нужном локусе.FIG. 9. T7E1 DNA test of morphogenic callus of potato, which underwent editing of the phytoendesaturase gene by infiltration with chitosan nanoparticles, with the Cas9-sgRNA complex immobilized on their surface. PCR is an amplified fragment of the phytoendesaturase gene of morphogenic callus of potato that has been edited. T7E1 - it is also treated with
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Технический результат достигается за счет оптимальной комбинации приемов и средств, применяемых при осуществлении процедуры доставки: в частности, получения частиц хитозана оптимальной величины, их связывания с макромолекулами различной природы (нуклеиновыми кислотами, нуклеопротеидными комплексами и белками в оптимальных условиях, определяемых структурой и свойствами доставляемой макромолекулы, и введения нагруженных таким образом наночастиц в растительные клетки.The technical result is achieved due to the optimal combination of techniques and means used in the delivery procedure: in particular, to obtain optimal chitosan particles, their binding to macromolecules of various nature (nucleic acids, nucleoprotein complexes and proteins under optimal conditions, determined by the structure and properties of the delivered macromolecule , and introducing thus loaded nanoparticles into plant cells.
Получение частиц хитозана и их функционализация.Obtaining particles of chitosan and their functionalization.
Хитозан (Sigma, CAS Number 9012-76-4) в концентрации 1,75 мг/мл растворяли в 30 мМ Na-ацетатном буфере рН 4,5 (буфер готовили, подводя рН раствора 30 мМ СН3СОONa до 4,5 10% раствором СН3СООН) при постоянном встряхивании до полного растворения хитозана. Затем к раствору добавляли водный раствор триполифосфата натрия (ТПФ, Галреахим) в концентрации 1 мг/мл в соотношении хитозан : ТПФ, равном 5:2. Данные условия приводили к формированию гомогенного препарата частиц хитозана с диаметром 600-800 нм (фазово-контрастное изображение, полученное с помощью моторизованного инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия), рис. 1a. Для некоторых методик (указаны ниже) исходный раствор частиц хитозана с рН 4,5 нейтрализовали добавлением 10% раствора NaOH до рН 6,5. К полученному раствору частиц хитозана добавляли растворы белка, РНК или ДНК (концентрации указаны в соответствующих примерах), перемешивали и озвучивали (обрабатывали ультразвуком с частотой 50/60 Hz) при температуре 25°С в течение 10 минут с использованием ультразвуковой мойки Elmasonic s300h (Германия).Chitosan (Sigma, CAS Number 9012-76-4) at a concentration of 1.75 mg / ml was dissolved in 30 mM Na-acetate buffer pH 4.5 (the buffer was prepared by adjusting the pH of a solution of 30 mM CH 3 COONa to 4.5 10% solution of CH 3 COOH) with constant shaking until complete dissolution of chitosan. Then, an aqueous solution of sodium tripolyphosphate (TPF, Galreakhim) was added to the solution at a concentration of 1 mg / ml in a ratio of chitosan: TPF equal to 5: 2. These conditions led to the formation of a homogeneous preparation of chitosan particles with a diameter of 600-800 nm (phase-contrast image obtained using an Axiovert 200M motorized inverted fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany), Fig. 1a. For some methods (indicated below), the initial solution particles of chitosan with a pH of 4.5 was neutralized by adding 10% NaOH solution to a pH of 6.5. To the resulting solution of chitosan particles were added solutions of protein, RNA or DNA (concentrations are indicated in the corresponding examples), mixed and voiced (processed ultrasonically with a frequency of 50/60 Hz) at 25 ° C for 10 minutes using an ultrasonic washing Elmasonic s300h (Germany).
Эффективность загрузки наноплатформ оценивалась методом флуоресцентной микроскопии, основываясь на количестве флуоресцирующих частиц по отношению к общему количеству частиц, видимых в световом поле (Фиг. 1). Сигналы флуоресцентных красителей (ФИТЦ и Су-3), которыми с использованием стандартных методик были мечены соответственно белки и РНК, регистрировали с помощью моторизованного инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия), управляемого программным комплексом Axiovision 4.5 (Carl Zeiss Microimaging, Германия) и оборудованного объективами Plan-Neofluar с увеличениями 10х и 20х. Сигналы детектировали в зеленом и красном каналах. Параллельно регистрировали фазово-контрастное изображение каждого поля зрения. Для регистрации изображения использовали цифровую камеру ORCA II ERG-2 (Hamamatsu Photonics, Япония). Дополнительно флуоресцентно-меченные белки и РНК в клетках растений детектировались при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа, модель Leica TCS SP5 (Leica Mycrosystems, Heidelberg, Germany). В клетках проводилась детекция зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Для возбуждения свечения использовался аргоновый лазер с длиной волн 488 нм.The loading efficiency of nanoplatforms was evaluated by fluorescence microscopy, based on the number of fluorescent particles relative to the total number of particles visible in the light field (Fig. 1). The signals of fluorescent dyes (FITC and Su-3), which were used to label proteins and RNA, respectively, using standard techniques, were recorded using an Axiovert 200M motorized inverted fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany) controlled by the Axiovision 4.5 software package (Carl Zeiss Microimaging, Germany ) and equipped with Plan-Neofluar lenses with magnifications of 10x and 20x. Signals were detected in the green and red channels. In parallel, a phase-contrast image of each field of view was recorded. For image registration, an ORCA II ERG-2 digital camera (Hamamatsu Photonics, Japan) was used. Additionally, fluorescently-labeled proteins and RNA in plant cells were detected using a confocal laser scanning microscope, model Leica TCS SP5 (Leica Mycrosystems, Heidelberg, Germany). The cells were detected green fluorescent protein (GFP). To excite the glow, an argon laser with a wavelength of 488 nm was used.
Оценка показала, что частицы хитозана в условиях эксперимента эффективно связывают флуоресцентно меченные белок/РНК. Меченные флуоресцентными красителями белки и РНК, связанные с частицами хитозана, показаны на фиг. 1б, в. Полученные наноплатформы сохраняли стабильность и функциональность в растворе в течение 24-48 час.The evaluation showed that chitosan particles effectively bind fluorescently labeled protein / RNA under experimental conditions. Fluorescent dye-labeled proteins and RNA bound to chitosan particles are shown in FIG. 1b, c. The resulting nanoplatforms remained stable and functional in solution for 24-48 hours.
Для осуществления способа не является принципиальным, каким именно способом осуществлена функционализация частиц хитозана - например, она может быть обеспечена электростатической адсорбцией, конъюгацией с лигандом на поверхности наночастицы, покрытием наночастицы малым кофактором, который доставляемая макромолекула РНК, ДНК, белка или нуклеопротеина может распознать и связать, и непосредственной конъюгацией макромолекулы с наночастицей.To implement the method, it is not fundamental how the chitosan particles are functionalized — for example, it can be provided by electrostatic adsorption, conjugation with a ligand on the surface of the nanoparticle, coating the nanoparticle with a small cofactor, which the delivered RNA, DNA, protein or nucleoprotein macromolecule can recognize and bind , and direct conjugation of a macromolecule with a nanoparticle.
Получение экспериментальных растений. В экспериментах использовали растения Nicotiana benthamiana и картофеля Solanum tuberosum. Растения выращивали из семян/миниклубней и содержали в условиях теплицы при 16 часовом дне, с минимальной дневной температурой 28°С и минимальной температурой ночью 22°С.Obtaining experimental plants. In the experiments, plants of Nicotiana benthamiana and potato Solanum tuberosum were used. Plants were grown from seeds / minicubers and kept in a greenhouse at 16 hours a day, with a minimum daily temperature of 28 ° C and a minimum temperature of 22 ° C at night.
Инфильтрация функционализированных частиц хитозана в клетки растений.Infiltration of functionalized chitosan particles into plant cells.
Инфильтрацию проводили частицами хитозана, функционализированными белком/РНК/ДНК/РНП или частицами хитозана (0,5% раствор) с добавлением раствора золотых частиц ((BioRad, Microcarrier Gold размером 0,6 мкм), функционализированными белком/РНК/ДНК/РНП. Полученные суспензии/растворы частиц предварительно озвучивали при температуре 25°С в течение 10 мин. с частотой 50/60 Hz с использованием ультразвуковой мойки Elmasonic s300h (Германия). Для инфильтрации тканей растений использовали методы механической и вакуумной инфильтрации. Механическую инфильтрацию проводили макроинъекцией с использованием инъекционного стерильного шприца. Инфильтрация вакуумированием может проводиться путем помещения ткани в эксикатор и создания в нем вакуума, после чего, при разгерметизации и резком повышении давления, происходит забрасывание нанесенной суспензии внутрь ткани. Препарат частиц хитозана, функционализированных белком/РНК/ДНК или комплексом белок-РНК, белок-ДНК, инфильтрировали в нижнюю поверхность листа через небольшое повреждение наружного эпидермиса. Площадь инфильтрации составляла не менее 1 см в диаметре. Вакуумную инфильтрацию проводили с использованием PDS-1000/Не пушки (BioRad). Для растительных образцов использовано давление 28-30 дюймов рт.ст., в соответствии с инструкцией производителя. Образцы (высечки листовой пластинки размером 5×5 мм, апикальные меристемы (около 10 меристем) или пазушные почки) помещали в камеру PDS-1000 /Не пушки, на образец наносили до 100 мкл приготовленного препарата, поднимали давление в камере до рекомендованного уровня, выдерживали в течение 60 сек, а затем снижали давление до нормального уровня. Инфильтрированные функционализированными частицами хитозана клетки/ткани растения выдерживали в климатической камере или при комнатной температуре. Оценку результатов проводили на 2-3 день после инфильтрации методами флуоресцентной микроскопии и лазерной конфокальной микроскопии.Infiltration was carried out with chitosan particles functionalized with protein / RNA / DNA / RNP or chitosan particles (0.5% solution) with the addition of a solution of gold particles ((BioRad, Microcarrier Gold 0.6 μm in size) functionalized with protein / RNA / DNA / RNP. The resulting suspensions / particle solutions were pre-voiced at 25 ° C for 10 minutes at a frequency of 50/60 Hz using an Elmasonic s300h ultrasonic cleaner (Germany). Mechanical and vacuum methods were used to infiltrate plant tissues. acroinjection using an injectable sterile syringe. Vacuum infiltration can be carried out by placing the tissue in the desiccator and creating a vacuum in it, after which, when depressurization and a sharp increase in pressure, the applied suspension is thrown into the tissue. The preparation of chitosan particles functionalized with protein / RNA / DNA or a protein-RNA complex, protein-DNA, was infiltrated into the lower surface of the sheet through slight damage to the external epidermis. The infiltration area was at least 1 cm in diameter. Vacuum infiltration was performed using a PDS-1000 / Not gun (BioRad). For plant samples, a pressure of 28-30 inches of mercury was used, in accordance with the manufacturer's instructions. Samples (5 × 5 mm leaf plate die cuts, apical meristems (about 10 meristems) or axillary kidneys) were placed in a PDS-1000 / He gun chamber, up to 100 μl of the prepared preparation was applied to the sample, the pressure in the chamber was raised to the recommended level, maintained for 60 seconds, and then reduced the pressure to normal levels. The plant cells / tissues infiltrated with functionalized chitosan particles were kept in a climatic chamber or at room temperature. Evaluation of the results was carried out 2-3 days after infiltration by fluorescence microscopy and laser confocal microscopy.
В качестве материала для доставки наночастиц, дополнительно к вышеназванным, могут быть использованы и другие растительные ткани, например, меристемы, морфогенный каллус, пазушные почки, экспланты, зародыш, каллус, пыльца, листья, пыльники, корни, корневые кончики, цветки, семена, стручки и стебли. Для улучшения эффективности доставки дополнительно можно применять предварительную обработку растительного материала (например, частичную мацерацию клеточных стенок, инкубацию растительного материала с растворами повышенными осмотическими свойствами, к примеру раствором маннита).In addition to the above, other plant tissues can be used as a material for the delivery of nanoparticles, for example, meristems, morphogenic callus, axillary buds, explants, germ, callus, pollen, leaves, anthers, roots, root tips, flowers, seeds, pods and stems. In order to improve delivery efficiency, pretreatment of plant material can be additionally applied (for example, partial maceration of cell walls, incubation of plant material with solutions with enhanced osmotic properties, for example, mannitol solution).
Для покрытия частиц хитозана могут быть использованы макромолекулы, обеспечивающие направленную доставку в определенный субклеточный компартмент: цитозоль, ядро, тонопласты, пластиды, этиопласты, хромопласты, лейкопласты, элайопласты, протеинопласты, амилопласты, хлоропласты и полости двухслойной мембраны.For the coating of chitosan particles, macromolecules can be used that provide targeted delivery to a specific subcellular compartment: cytosol, nucleus, tonoplasts, plastids, etioplasts, chromoplasts, leukoplasts, elioplasts, protein plastics, amyloplasts, chloroplasts and cavities of a two-layer membrane.
Разработанный в данной заявке способ может быть использован для доставки в клетки и ткани растений белков (бычий сывороточный альбумин, БСА; зеленый флуоресцентный белок, ЗФБ), малых РНК (тРНК, направляющей (гидовой) РНК; sgRNA и любых других), ДНК (плазмида, кодирующая ЗФБ) и рибонуклеиновых комплексов системы CRISPR-Cas (нуклеаза Cas9 совместно с гидовой РНК); для создания растений с повышенной урожайностью путем доставки в растение нуклеиновых кислот, кодирующих специфические полипептиды, для переноса в растение гена интерферона-альфа или -бета человека для получения растений, устойчивых к вирусной инфекции. Полученные результаты показывают, что разработанный способ доставки биологических макромолекул в клетки растений, основанный на инфильтрации (механической или вакуумной) препарата частиц хитозана или совместно частиц хитозана и золота с иммобилизованными на их поверхности макромолекулами, обеспечивает эффективную доставку полученных наноплатформ, что подтверждается по выявлению меченных флуоресцентными метками белков и нуклеиновых кислот в клетках растений (фиг. 1), а также результатами прямого секвенирования следующего поколения в случае доставки специфичных CRISPR/Cas9 рибонуклеопротеидных комплексов (см. примеры).The method developed in this application can be used to deliver proteins (bovine serum albumin, BSA; green fluorescent protein, ZFB), small RNAs (tRNAs, guiding (guiding) RNAs, sgRNAs and any others), DNA (plasmid) to cells and tissues of plants encoding SPS) and ribonuclein complexes of the CRISPR-Cas system (Cas9 nuclease together with guiding RNA); for creating plants with increased productivity by delivering nucleic acids encoding specific polypeptides to the plant, for transferring the human interferon alpha or beta gene to the plant to obtain plants resistant to viral infection. The results show that the developed method for the delivery of biological macromolecules to plant cells, based on the infiltration (mechanical or vacuum) of a preparation of chitosan particles or together particles of chitosan and gold with macromolecules immobilized on their surface, ensures efficient delivery of the obtained nanoplatforms, which is confirmed by the identification of labeled fluorescent labels of proteins and nucleic acids in plant cells (Fig. 1), as well as the results of direct sequencing of the next generation in the case of the delivery of specific CRISPR / Cas9 ribonucleoprotein complexes (see examples).
Оценка числа отредактированных клеток следующего поколения в экспериментах по редактированию генома после доставки в ткани растений Nicotiana benthamiana или Solanum tuberosum рибонуклеопротеидного комплекса системы CRISPR/Cas показала, что эффективность редактирования при обработке образцов комплексами Cas9-sgRNA на хитозановых наночастицах неожиданно высока, не менее чем 3-5 раз, а в некоторых случаях в 10 раз, превышая таковую при аналогичной обработке тканей комплексами Cas9-sgRNA в отсутствие наночастиц, что является важным новым техническим результатом.Estimation of the number of edited cells of the next generation in experiments on editing the genome after delivery of the ribonucleoprotein complex of the CRISPR / Cas system to the tissue of plants Nicotiana benthamiana or Solanum tuberosum showed that the editing efficiency when processing samples with Cas9-sgRNA complexes on chitosan nanoparticles is unexpectedly high, not less than 3 5 times, and in some cases 10 times, exceeding that with a similar tissue treatment with Cas9-sgRNA complexes in the absence of nanoparticles, which is an important new technical result.
Эксперименты по оценке количества доставляемого наночастицами хитозана материала показали, что при использовании макроинъекций или вакуумной инфильтрации для различных видов белков оно составляет от 1 до 5 мг/мл, для РНК около 15мМ и для ДНК около 1 мг/мл, до 5 мг\мл для нуклеопротеидных комплексов. При осуществлении функционализации молекулы хитозана не существует каких-либо ограничений для структуры доставляемой макромолекулы, т.е. нагрузка наночастицы может быть осуществлена любым известным в настоящее время белком животного, растительного или искусственного происхождения, любым комплексом белок\ДНК или белок\РНК, ДНК или РНК любой длины и любой степени очистки.Experiments to estimate the amount of material delivered by chitosan nanoparticles showed that when using macroinjections or vacuum infiltration for various types of proteins, it is from 1 to 5 mg / ml, for RNA about 15 mm and for DNA about 1 mg / ml, up to 5 mg / ml for nucleoprotein complexes. During the functionalization of the chitosan molecule, there are no restrictions on the structure of the delivered macromolecule, i.e. loading of the nanoparticle can be carried out by any protein of animal, plant or artificial origin currently known, any protein \ DNA or protein \ RNA, DNA or RNA complex of any length and any degree of purification.
Предложенный в настоящем изобретении способ доставки макромолекул в ткани растений является универсальным и может быть применен для любых известных сельскохозяйственных культур (в этом списке можно назвать, например, зерновые, зернобобовые, кормовые, масличные, эфиромасличные, технические, овощные, лекарственные, цветочные, плодовые, ягодные растения, картофель, томаты, сахарная свекла, виноград, табака, морковь, кукуруза, канола, рапс, хлопчатник, пальма, арахис, соя, Oryza sp., Arabidopsis sp., Ricinus sp. сахарный тростник) и декоративных растений.The method for delivering macromolecules into plant tissues proposed in the present invention is universal and can be applied to any known agricultural crops (in this list, for example, cereals, legumes, fodder, oilseeds, essential oil, technical, vegetable, medicinal, floral, fruit, berry plants, potatoes, tomatoes, sugar beets, grapes, tobacco, carrots, corn, canola, canola, cotton, palm, peanuts, soybeans, Oryza sp., Arabidopsis sp., Ricinus sp. sugarcane) and ornamental plants.
Дальнейшее повышение эффективности доставки макромолекул, ДНК, РНК и белков достигается при инкубации растительного материала в осмотических растворах. Для этого спустя 4-20 часов после проведения инфильтрации обработанный растительный материал инкубируется на высокоосмотической среде, содержащей до 500 mOsm/кг сахарозы. Подобная обработка способна еще в 4-5 раз увеличить эффективность доставки макромолекул.A further increase in the delivery efficiency of macromolecules, DNA, RNA and proteins is achieved by incubation of plant material in osmotic solutions. For this, 4-20 hours after the infiltration, the treated plant material is incubated in a highly osmotic medium containing up to 500 mOsm / kg of sucrose. Such processing is able to increase the delivery efficiency of macromolecules by another 4-5 times.
ПримерыExamples
Пример 1. Доставка зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ) в клетки растений Nicotiana benthamiana.Example 1. Delivery of green fluorescent protein (PBS) into plant cells of Nicotiana benthamiana.
Пробу для инфильтрации получали, смешивая 1,75 мг/мл раствора хитозана в 30 мМ Na-ацетатном буфере (рН 4,5), водный раствор ТПФ (1 мг/мл) в объеме 50 и 20 мкл, соответственно для формирования частиц хитозана. затем к пробе добавляли 15 мкл раствора ЗФБ (TurboGFP, Евроген) с концентрацией 1 мг/мл и инкубировали в течение 15 мин. при температуре 25°С при постоянном перемешивании для иммобилизации белка на частицах хитозана. Доставку наноплатформ в клетки растений осуществляли путем механической или вакуумной инфильтрации.A sample for infiltration was obtained by mixing 1.75 mg / ml of a solution of chitosan in 30 mM Na-acetate buffer (pH 4.5), an aqueous solution of TPF (1 mg / ml) in a volume of 50 and 20 μl, respectively, to form particles of chitosan. then, 15 μl of a 1 mg / ml ZBF solution (TurboGFP, Eurogen) was added to the sample and incubated for 15 min. at a temperature of 25 ° C with constant stirring to immobilize the protein on chitosan particles. The delivery of nanoplatforms to plant cells was carried out by mechanical or vacuum infiltration.
В ряде опытов в пробу для инфильтрации дополнительно вносили частицы золота (BioRad, Microcarrier Gold размером 0,6 мкм). Использовали раствор частиц золота с концентрацией 30 мкг/мл. Предварительно проводили озвучивание золотых частиц при температуре 25°С в течение 10 минут ультразвуком с частотой 50/60 Hz с использованием ультразвуковой мойки Elmasonic s300h (Германия). Пробу для инфильтрации получали, смешивая раствор золотых частиц с концентрацией 30 мкг/мл, 0,5% раствор частиц хитозана, приготовленных по вышеописанной методике, и раствор ЗФБ (TurboGFP, Евроген с концентрацией 1 мкг/мл) в соотношении 40, 140 и 30 мкл, соответственно. Пробу инкубировали в течение 15 мин. при температуре 25°С при постоянном перемешивании. Доставку наноплатформ в клетки растений осуществляли путем механической или вакуумной инфильтрации. Видимой разницы в эффективности доставки, осуществляемой при помощи частиц хитозана, при добавлении золотых наночастиц и без них не обнаружено, что свидетельствует о примерно одинаковой эффективности способов. Фазово-контрастное изображение частиц хитозана при различной обработке, полученное с помощью флуоресцентного микроскопа, показано на Фиг. 1.In a number of experiments, gold particles (BioRad, Microcarrier Gold 0.6 μm in size) were additionally added to the sample for infiltration. A solution of gold particles with a concentration of 30 μg / ml was used. Sounding of gold particles was preliminarily performed at a temperature of 25 ° С for 10 minutes with ultrasound at a frequency of 50/60 Hz using an Elmasonic s300h ultrasonic cleaner (Germany). A sample for infiltration was obtained by mixing a solution of gold particles with a concentration of 30 μg / ml, a 0.5% solution of chitosan particles prepared according to the above method, and a solution of ZBF (TurboGFP, Eurogen with a concentration of 1 μg / ml) in a ratio of 40, 140 and 30 μl, respectively. The sample was incubated for 15 minutes. at a temperature of 25 ° C with constant stirring. The delivery of nanoplatforms to plant cells was carried out by mechanical or vacuum infiltration. No visible difference in the delivery efficiency by using chitosan particles was found with or without adding gold nanoparticles, which indicates approximately the same efficiency of the methods. A phase-contrast image of chitosan particles during various processing, obtained using a fluorescence microscope, is shown in FIG. one.
Пример 2. Доставка бычьего сывороточного альбумина, меченного ФИТЦ, в клетки растений Nicotiana benthamiana и Solanum tuberosum.Example 2. Delivery of bovine serum albumin labeled with FITC into plant cells of Nicotiana benthamiana and Solanum tuberosum.
Предварительно проводили мечение бычьего сывороточного альбумина (БСА) ФИТЦ. Для этого непосредственно перед мечением готовили раствор БСА в концентрации 5 мг/мл в 0,1 М карбонатном буфере с рН 9,0 и на каждый 1 мл белка вносили 50 мкл исходного раствора ФИТЦ (Sigma), затем к раствору добавляли хлорид аммония (до конечной концентрации 50 мМ) и оставляли на ночь при 4°С в темноте. Меченный ФИТЦ БСА отделяли от свободного ФИТЦ с помощью гельфильтрации на Сефадексе G-50 (Pharmacea). Эффективность мечения БСА ФИТЦ была рассчитана по соответствующей формуле, определенное молярное соотношение ФИТЦ/БСА составило 1,5. Пробу для инфильтрации получали, смешивая раствор частиц хитозана, полученный согласно вышеприведенной методике (1,75 мг/мл раствора хитозана в 30 мМ ацетатном буфере (рН 4,5), раствор ТПФ (1 мг/мл) в соотношении 100 к 40 мкл) и 100 мкл раствора БСА/ФИТЦ (концентрация 3 мг/мл). Пробу инкубировали в течение 15 мин. при температуре 25°С при постоянном перемешивании. Доставку наноплатформ в клетки растений осуществляли путем механической (макроинъекция шприцом) или вакуумной инфильтрации.Labeling of bovine serum albumin (BSA) FITC was preliminarily carried out. For this, just before labeling, a BSA solution was prepared at a concentration of 5 mg / ml in 0.1 M carbonate buffer with a pH of 9.0, and 50 μl of the initial FITC solution (Sigma) was added for each 1 ml of protein, then ammonium chloride was added to the solution (up to final concentration of 50 mM) and left overnight at 4 ° C in the dark. Labeled FITC BSA was separated from free FITC by gel filtration on Sephadex G-50 (Pharmacea). The labeling efficiency of BSA FITC was calculated using the appropriate formula, the determined molar ratio of FITC / BSA was 1.5. An infiltration sample was prepared by mixing a solution of chitosan particles obtained according to the above procedure (1.75 mg / ml of a solution of chitosan in 30 mM acetate buffer (pH 4.5), a solution of TPF (1 mg / ml) in a ratio of 100 to 40 μl) and 100 μl of a BSA / FITZ solution (concentration of 3 mg / ml). The sample was incubated for 15 minutes. at a temperature of 25 ° C with constant stirring. Nanoplatforms were delivered to plant cells by mechanical (macroinjection with a syringe) or vacuum infiltration.
В ряде опытов в пробу для инфильтрации дополнительно вносили частицы золота (BioRad, Microcarrier Gold размером 0,6 мкм). Использовали раствор частиц золота с концентрацией 30 мкг/мл. Предварительно проводили озвучивание золотых частиц при температуре 25°С в течение 10 минут ультразвуком с частотой 50/60 Hz с использованием ультразвуковой мойки Elmasonic s300h (Германия). Пробу для инфильтрации получали, смешивая 40 мкл раствора золотых частиц с концентрацией 30 мкг/мл, 140 мкл 0,5% раствор частиц хитозана, приготовленных по вышеописанной методике, и 100 мкл раствора ФИТЦ-БСА с концентрацией 3 мг/мл. Пробу инкубировали в течение 15 мин. при температуре 25°С при постоянном перемешивании. Доставку наноплатформ в клетки растений осуществляли путем механической или вакуумной инфильтрации. Видимой разницы в эффективности доставки, осуществляемой при помощи частиц хитозана, при добавлении золотых наночастиц и без них не обнаружено, что свидетельствует о примерно одинаковой эффективности способов (Фиг. 2).In a number of experiments, gold particles (BioRad, Microcarrier Gold 0.6 μm in size) were additionally added to the sample for infiltration. A solution of gold particles with a concentration of 30 μg / ml was used. Sounding of gold particles was preliminarily performed at a temperature of 25 ° С for 10 minutes with ultrasound at a frequency of 50/60 Hz using an Elmasonic s300h ultrasonic cleaner (Germany). An infiltration sample was prepared by mixing 40 μl of a solution of gold particles with a concentration of 30 μg / ml, 140 μl of a 0.5% solution of chitosan particles prepared according to the above procedure, and 100 μl of a solution of FITZ-BSA with a concentration of 3 mg / ml. The sample was incubated for 15 minutes. at a temperature of 25 ° C with constant stirring. The delivery of nanoplatforms to plant cells was carried out by mechanical or vacuum infiltration. No visible difference in the delivery efficiency by using chitosan particles with and without the addition of gold nanoparticles was found, which indicates approximately the same efficiency of the methods (Fig. 2).
Пример 3. Доставка малых РНК, меченных флуоресцентной меткой Су-3, в клетки растений Nicotiana benthamiana.Example 3. Delivery of small RNA labeled with a fluorescent label Su-3, in plant cells Nicotiana benthamiana.
В экспериментах использовали препараты тРНК или синтезированной in vitro (как описано ниже, гидовой РНК) Предварительно проводили мечение малых РНК флуоресцентным красителем Су3 (Jena Bioscience) с использованием стандартной методики. Пробу для инфильтрации получали, смешивая раствор частиц хитозана, полученный согласно вышеприведенной методике (1,75 мг/мл раствора хитозана в 30 мМ ацетатном буфере (рН 4,5), раствор ТПФ (1 мг/мл) в соотношении 100 к 40 мкл) и 30 мкл раствора гидовой РНК (концентрация 15 мМ) или препарата тРНК (концентрация 1 мг/мл). Пробу инкубировали в течение 5 мин. при температуре 4°С при постоянном перемешивании. Доставку наноплатформ в клетки растений осуществляли путем механической или вакуумной инфильтрации. Проникновение тРНК в растительную клетку показано на Фиг. 3.In the experiments, preparations of tRNA or synthesized in vitro (as described below, hydraulic RNA) were used. Small RNAs were preliminarily labeled with fluorescent dye Cu3 (Jena Bioscience) using a standard technique. An infiltration sample was prepared by mixing a solution of chitosan particles obtained according to the above procedure (1.75 mg / ml of a solution of chitosan in 30 mM acetate buffer (pH 4.5), a solution of TPF (1 mg / ml) in a ratio of 100 to 40 μl) and 30 μl of a solution of hydraulic RNA (concentration of 15 mM) or tRNA preparation (concentration of 1 mg / ml). The sample was incubated for 5 minutes. at a temperature of 4 ° C with constant stirring. The delivery of nanoplatforms to plant cells was carried out by mechanical or vacuum infiltration. The penetration of tRNA into a plant cell is shown in FIG. 3.
Пример 4. Доставка плазмиды (ДНК), кодирующей зеленый флуоресцентный белок, в клетки растений Nicotiana benthamiana.Example 4. Delivery of a plasmid (DNA) encoding a green fluorescent protein into Nicotiana benthamiana plant cells.
Плазмидную ДНК из клеток E.coli штамма XL-blue выделяли стандартным методом с помощью набора Plasmid Miniprep (Евроген) в концентрации не менее 1мкг/мкл. Пробу для инфильтрации получали, смешивая раствор частиц хитозана, полученный согласно вышеприведенной методике (1,75 мг/мл раствора хитозана в 30 мМ ацетатном буфере (рН 4,5), раствор ТПФ (1 мг/мл) в соотношении 100 к 40 мкл) и 20 мкл раствора ДНК. Пробу инкубировали в течение 15 мин. при температуре 25°С при постоянном перемешивании. Доставку наноплатформ в клетки растений осуществляли путем механической или вакуумной инфильтрации. На Фиг. 4 наблюдается эффективная флуоресценция (экспрессия гена ЗФБ) в клетках растения после инфильтрации плазмидой, содержащей ген ЗФБ, по сравнению с контрольной плазмидой (без гена ЗФБ).Plasmid DNA from cells of E. coli strain XL-blue was isolated by the standard method using a Plasmid Miniprep kit (Eurogen) at a concentration of not less than 1 μg / μl. An infiltration sample was prepared by mixing a solution of chitosan particles obtained according to the above procedure (1.75 mg / ml of a solution of chitosan in 30 mM acetate buffer (pH 4.5), a solution of TPF (1 mg / ml) in a ratio of 100 to 40 μl) and 20 μl of DNA solution. The sample was incubated for 15 minutes. at a temperature of 25 ° C with constant stirring. The delivery of nanoplatforms to plant cells was carried out by mechanical or vacuum infiltration. In FIG. 4, effective fluorescence (expression of the ZFB gene) is observed in plant cells after infiltration with a plasmid containing the ZFB gene, compared with the control plasmid (without the ZFB gene).
Пример 5. Редактирование гена коилина для получения растений с повышенной устойчивостью к Y вирусу картофеля.Example 5. Editing the coilin gene to produce plants with increased resistance to the Y potato virus.
Редактирование осуществлялось путем доставки рибонуклеопротеидного комплекса системы CRISPR/Cas, включающего направляющую (гидовую) РНК и нуклеазу Cas9 S. pyogenes в клетки растений Nicotiana benthamiana или Solanum tuberosum.Editing was carried out by delivery of the CRISPR / Cas system ribonucleoprotein complex, including the guide (hydrofluoric) RNA and S. pyogenes nuclease Cas9 into Nicotiana benthamiana or Solanum tuberosum plant cells.
Для получения рибонуклеопротеидного комплекса использовали препарат EnGen® Cas9 NLS, S. pyogenes производства England Biolabs и гидовые РНК, синтезированные при помощи MEGAscript® Т7 Transcription Kit производства Invitrogen™. РНП получали, смешивая 1 мкл нуклеазы Cas9 с исходной концентрацией 20мкМ, 2 мкл гидовой РНК (концентрация 15 мкМ), 3 мкл 10-кратного буфера для Cas9 (10Х Cas9 Nuclease Reaction Buffer) и 14 мкл стерильной, свободной от нуклеаз Н2О. Пробу инкубировали 10 мин. при комнатной температуре и смешивали с 80 мкл предварительно озвученного раствора частиц золота или с раствором частиц хитозана, полученным как описано выше. В качестве контроля в пробу вносили 80 мкл Н2О. Доставку наноплатформ в клетки растений осуществляли путем механической или вакуумной инфильтрации.To obtain the ribonucleoprotein complex, EnGen® Cas9 NLS, S. pyogenes, manufactured by England Biolabs, and hydrotoxic RNAs synthesized using the Invitrogen ™ MEGAscript® T7 Transcription Kit were used. RNPs were prepared by mixing 1 μl of Cas9 nuclease with an initial concentration of 20 μM, 2 μl of guiding RNA (15 μM concentration), 3 μl of 10-fold Cas9 buffer (10X Cas9 Nuclease Reaction Buffer), and 14 μl of sterile H 2 O nuclease free. The sample was incubated for 10 minutes. at room temperature and mixed with 80 μl of a pre-voiced solution of gold particles or with a solution of chitosan particles obtained as described above. As a control, 80 μl of H 2 O was added to the sample. The delivery of nanoplatforms to plant cells was carried out by mechanical or vacuum infiltration.
Редактирование гена коилина оценивали методом высокопроизводительного секвенирования следующего поколения: в составе гена коилина Solanum tuberosum выявлена делеция размером около 70 нуклеотидов в районе предполагаемого сайта разрезания.The editing of the coilin gene was evaluated by the next generation high-performance sequencing method: a deletion of about 70 nucleotides in size of the proposed cutting site was detected in the Solanum tuberosum coilin gene.
Пример 6: Секвенирование отредактированного гена коилина картофеляExample 6: Sequencing of an Edited Potato Coilin Gene
Таргетная амплификация:Targeted Amplification:
Амплификацию области геномного редактирования апикальных меристем, подвергшихся редактированию гена коилина, проводили с использованием праймеров F 5'-TGATGTTCCCTTCTGCTGTAGGTTGGGAA-3' и R 5'-GCGTGGTTTTGTATTGAGAAGAGTCАТА-3'. Данные праймеры были разработаны с возможностью идентификации не только точечных мутаций, но и крупных делеций. Амплификацию проводили в 50 мкл смеси используя DreamTaq PCR Master Mix 2х (Thermo Scientific, США) со следующими параметрами: первичная денатурация при 94°С в течение 2 минут; 40 циклов: 94°С, 65°С и 72°С каждый цикл по 40 секунд. Продукты амплификации были очищены с помощью Agencourt AMPure beads (Beckman Coulter, США)Amplification of the genomic editing region of apical meristems subjected to coilin gene editing was carried out using primers F 5'-TGATGTTCCCTTCTGCTGTAGGTTGGGAA-3 'and R 5'-GCGTGGTTTTGTATTGAGAAGAGTCATA-3'. These primers were designed with the ability to identify not only point mutations, but also large deletions. Amplification was carried out in 50 μl of the mixture using DreamTaq PCR Master Mix 2x (Thermo Scientific, USA) with the following parameters: primary denaturation at 94 ° C for 2 minutes; 40 cycles: 94 ° C, 65 ° C and 72 ° C each cycle for 40 seconds. Amplification products were purified using Agencourt AMPure beads (Beckman Coulter, USA)
Приготовление библиотеки и секвенирование:Library Preparation and Sequencing:
Подготовка библиотеки для секвенирования и секвенирование были произведены в соответствие с инструкциями от производителя оборудования (Thermo Scientific, США). Определение концентрации библиотеки для секвенирования было выполнено с помощью набора Ion Library TaqMan™ Quantitation Kit (Thermo Scientific, США). Дополнительным контролем качества служило постановка электрофореза. В результате были выявлены 2 фрагмента длиной ≈360 и 300 пар нуклеотидов (Фиг. 5).Preparation of the library for sequencing and sequencing were performed in accordance with the instructions from the equipment manufacturer (Thermo Scientific, USA). The concentration of the library for sequencing was determined using the Ion Library TaqMan ™ Quantitation Kit (Thermo Scientific, USA). An additional quality control was electrophoresis. As a result, 2 fragments of ≈360 and 300 nucleotide pairs were identified (Fig. 5).
Подготовка матрицы и загрузка на чип было осуществлено с Ion Chef (Thermo Scientific, США) используя реактивы Ion 520™ & Ion 530™ Kit-Chef (Thermo Scientific, США) и Ion 520™ Chip Kit (Thermo Scientific, США). Секвенирование было произведено на приборе Ion S5 (Thermo Scientific, США).The matrix was prepared and loaded onto the chip with Ion Chef (Thermo Scientific, USA) using the reagents Ion 520 ™ & Ion 530 ™ Kit-Chef (Thermo Scientific, USA) and Ion 520 ™ Chip Kit (Thermo Scientific, USA). Sequencing was performed on an Ion S5 instrument (Thermo Scientific, USA).
Обработка данных последовательностей:Processing sequence data:
Полученные риды были подвержены вторичной обработке, данные секвенирования были отфильтрованы по качеству QV≥20 и были удалены риды длиной менее 200 нуклеотидов. Картирование было произведено на последовательность дикого типа (WT) используя стандартный протокол. Выравнивания представлены на Фиг. 6.The resulting reads were subjected to secondary processing, sequencing data was filtered by QV≥20 quality and reads less than 200 nucleotides in length were removed. Mapping was performed on the wild-type sequence (WT) using a standard protocol. Alignments are shown in FIG. 6.
Пример 7: Количественная оценка эффективности редактирования генома растений.Example 7: Quantification of the effectiveness of editing the genome of plants.
Эффективность редактирования оценивали в эксперименте по редактированию гена коилина после доставки в ткани растений рибонуклеопротеидного комплекса системы CRISPR/Cas, включающего гидовую РНК и нуклеазу Cas9 S. pyogenes в клетки растений Nicotiana benthamiana или Solanum tuberosum. Эффективность оценивалась в процентах как отношение числа отредактированных последовательностей (локусов) (с отредактированным геном коилина) к неотредактированным (имеющим исходную последовательность гена). Для этого из тканей обработанных наночастицами клеток/апикальных меристем/пазушных почек/целых растений выделяется ДНК, после чего проводится, как описано в примере 6, таргетное секвенирование целевого участка ДНК, подвергнутого редактированию. После чего сравнивается число прочтений (нуклеотидных последовательностей), содержащих направленные мутации, с прочтениями, нуклеотидные последовательности которых не содержат подобных мутаций. Отношение числа прочтений, содержащих акты редактирования к общему числу прочтений и дает эффективность геномного редактирования.Editing efficiency was evaluated in the experiment on editing the coilin gene after delivery of the ribonucleoprotein complex of the CRISPR / Cas system to the plant tissue, including the guiding RNA and S. pyogenes nuclease Cas9 into Nicotiana benthamiana or Solanum tuberosum plant cells. Efficiency was estimated as a percentage as the ratio of the number of edited sequences (loci) (with the edited coilin gene) to unedited (having the original gene sequence). To do this, DNA is extracted from the tissues of nanoparticle-treated cells / apical meristems / axillary buds / whole plants, and then, as described in Example 6, targeted sequencing of the target DNA section subjected to editing is carried out. After that, the number of readings (nucleotide sequences) containing directed mutations is compared with readings whose nucleotide sequences do not contain such mutations. The ratio of the number of reads containing editing acts to the total number of reads gives the effectiveness of genomic editing.
При обработке золотыми наночастицами, покрытыми комплексами Cas9-sgRNA, и при вакуумной либо механической инфильтрации комплексами Cas9-sgRNA на хитозановых наночастицах эффективность трансформации находилась в пределах 10-20%. Обработка вакуумной или механической инфильтрацией комплексами Cas9-sgRNA без наночастиц (- контроль) показал эффективность доставки в пределах 0-5%.When processing gold nanoparticles coated with Cas9-sgRNA complexes, and during vacuum or mechanical infiltration with Cas9-sgRNA complexes on chitosan nanoparticles, the transformation efficiency was in the range of 10-20%. Processing by vacuum or mechanical infiltration with Cas9-sgRNA complexes without nanoparticles (- control) showed delivery efficiency in the range of 0-5%.
Пример 8. Геномное редактирование морфогенных каллусов картофеля с помощью инфильтрации хитозановыми наночастицами.Example 8. Genomic editing of morphogenic potato calli using chitosan nanoparticle infiltration.
Для получения морфогенных каллусов и растений-регенерантов стеблевые сегменты (0.5-1.0 см) срезали с растений in vitro картофеля и культивировали в чашках петри 21 день на среде Мурасиге и Скуга, содержащую набор витаминов по Мурасиге и Скуга (2 мг/л glycine, 0.5 мг/л nicotinic acid, 0.5 мг/л pyridoxine НСl, 0.4 мг/л thiamine НСl), 100 мг/л инозитола, 30 г/л сахарозы, 7 г/л агара, рН 5.8, а также фитогормоны Zeatin 3 мг/л, NAA 2 мг/л, GA3 1 мг/л. Экспланты культивировали в условиях освещения (16 часов 40 μmol m-2s1) при 22-25°С. Образовавшиеся морфогенные каллусы отделяли от стеблевых эксплантов (показано на Фиг. 7) и погружали в суспензию частиц. Проводили инфильтрацию хитозановыми наночастицами, с иммобилизованным на их поверхности комплексом Cas9-sgRNA к гену фитоендесатуразы, путем вакуумирования при ~0.9 bar, после чего каллусы переносили на среду для регенерации побегов указанную выше. Через 21 день после инфильтрации каллусы, формирующие побеги (Фиг. 8, А), переносили на свежую среду Мурасиге и Скуга не содержащую фитогормонов (Фиг. 8, Б) для дальнейшего развития и роста побегов и проведения их анализа. Геномное редактирование подтверждалось с помощью Т7Е1-эндонуклеазного теста, который проводился по стандартной методике, описанной на сайте производителя эндонуклеазы (https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i). Результаты теста детектировались с помощью электрофореза в агарозном геле. В среднем, один из 10 морфогенных каллусов демонстрировал наличие геномного редактирования в нужном локусе (Фиг. 8).To obtain morphogenic calluses and regenerated plants, stem segments (0.5-1.0 cm) were cut from potato plants in vitro and cultivated in petri dishes for 21 days on Murashige and Skoog medium containing a set of vitamins according to Murashige and Skoog (2 mg / l glycine, 0.5 mg / l nicotinic acid, 0.5 mg / l pyridoxine НСl, 0.4 mg / l thiamine НСl), 100 mg / l inositol, 30 g / l sucrose, 7 g / l agar, pH 5.8, and
Claims (21)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017124849A RU2663347C1 (en) | 2017-07-12 | 2017-07-12 | Method of delivering biologically active macromolecules into the cells of plants |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017124849A RU2663347C1 (en) | 2017-07-12 | 2017-07-12 | Method of delivering biologically active macromolecules into the cells of plants |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2663347C1 true RU2663347C1 (en) | 2018-08-03 |
Family
ID=63142553
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017124849A RU2663347C1 (en) | 2017-07-12 | 2017-07-12 | Method of delivering biologically active macromolecules into the cells of plants |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2663347C1 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220298518A1 (en) * | 2019-09-10 | 2022-09-22 | Kaneka Corporation | Plant modification method using axillary bud meristem |
CN116348098A (en) * | 2020-05-20 | 2023-06-27 | 斯菲拉封装有限责任公司 | Particles encapsulating hydrophilic or amphiphilic biological compounds |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016094159A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Syngenta Participations Ag | Compositions and methods for controlling plant pests |
RU2612156C2 (en) * | 2009-04-07 | 2017-03-02 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Nanoparticles mediated delivery of sequence-specific nucleases |
-
2017
- 2017-07-12 RU RU2017124849A patent/RU2663347C1/en active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2612156C2 (en) * | 2009-04-07 | 2017-03-02 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Nanoparticles mediated delivery of sequence-specific nucleases |
WO2016094159A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Syngenta Participations Ag | Compositions and methods for controlling plant pests |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ABDEL-RAZIK A.B. et al., Transformation of Thionin Genes Using Chitosan Nanoparticle into Potato Plant to Be Resistant to Fungal Infection, IOSR Journal of Biotechnology and Biochemistry (IOSR-JBB), May. - June. 2017, Vol. 3, Issue 3, PP 01-13. * |
ABDEL-RAZIK A.B. et al., Transformation of Thionin Genes Using Chitosan Nanoparticle into Potato Plant to Be Resistant to Fungal Infection, IOSR Journal of Biotechnology and Biochemistry (IOSR-JBB), May. - June. 2017, Vol. 3, Issue 3, PP 01-13. QIONG WANG et al., Establishment of a suspension cell system for transformation of Jatropha curcas using nanoparticles, Advanced Materials Research, 2012, Vol. 608-609, pp. 314-319. * |
QIONG WANG et al., Establishment of a suspension cell system for transformation of Jatropha curcas using nanoparticles, Advanced Materials Research, 2012, Vol. 608-609, pp. 314-319. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220298518A1 (en) * | 2019-09-10 | 2022-09-22 | Kaneka Corporation | Plant modification method using axillary bud meristem |
CN116348098A (en) * | 2020-05-20 | 2023-06-27 | 斯菲拉封装有限责任公司 | Particles encapsulating hydrophilic or amphiphilic biological compounds |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11624071B2 (en) | Method of creating a plurality of targeted insertions in a plant cell | |
AU2017355507B2 (en) | Novel plant cells, plants, and seeds | |
RU2485180C2 (en) | Method of transfection and transduction of plant cells | |
US7132289B2 (en) | Method for introducing foreign matters into living cells | |
CN109153988B (en) | Method for editing genome of plant | |
JP2019517261A (en) | Hybrid nucleic acid sequences for genome manipulation | |
AU2016239037A1 (en) | Method of applying non-genetic substance to perform site-directed reform of plant genome | |
WO2019144124A1 (en) | Plant gene editing systems, methods, and compositions | |
EP3392339A1 (en) | Improved genome editing in plant cells | |
Mahmoud et al. | A cationic lipid mediated CRISPR/Cas9 technique for the production of stable genome edited citrus plants | |
KR20210049137A (en) | Methods and compositions for transformation of plants | |
EP3563673A1 (en) | Method for introducing substance into plant | |
RU2663347C1 (en) | Method of delivering biologically active macromolecules into the cells of plants | |
CN112384063A (en) | Methods for regeneration and transformation of cannabis | |
JP2018504133A (en) | Plastid transformation method | |
US20200392525A1 (en) | Compositions and methods for delivery of nucleic acid to plant cells | |
Kikkert et al. | Genetic engineering of grapevine (Vitis sp.) for enhancement of disease resistance | |
Khanna et al. | Nanotechnology and CRISPR/Cas9 system for sustainable agriculture | |
WO2017165724A1 (en) | Introducing dna into organisms for transient expression | |
WO2021054407A1 (en) | Introduction device, method for cellular introduction of macromolecule, dna nanoparticle crystal, and method for producing dna nanoparticle crystal inclusion body | |
WO2022120142A1 (en) | Pest and pathogen resistant soybean plants | |
US11499158B2 (en) | Method for modifying plant | |
CN116368230A (en) | Method for producing genome-edited plants | |
JP3780333B2 (en) | A novel method for introducing foreign genetic material or physiologically active substance into cells | |
Miyamoto et al. | Advancing Biomolecule Delivery in Plants: Harnessing Synthetic Nanocarriers to Overcome Multiscale Barriers for Cutting-Edge Plant Bioengineering |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20181004 |
|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190304 Effective date: 20190304 |