RU2659204C1 - Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения - Google Patents
Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2659204C1 RU2659204C1 RU2017103716A RU2017103716A RU2659204C1 RU 2659204 C1 RU2659204 C1 RU 2659204C1 RU 2017103716 A RU2017103716 A RU 2017103716A RU 2017103716 A RU2017103716 A RU 2017103716A RU 2659204 C1 RU2659204 C1 RU 2659204C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- treatment
- dysplasia
- joints
- cultured
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 3
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 abstract description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 abstract description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010073767 Developmental hip dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000007446 Hip Dislocation Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 208000030175 lameness Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 streptomicin Chemical compound 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D7/00—Devices or methods for introducing solid, liquid, or gaseous remedies or other materials into or onto the bodies of animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой биотрансплантат для лечения дисплазии суставов, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из аутологичного материала, отличающийся тем, что содержит от 5 млн. мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в 1 мл физиологического раствора. Так же группа изобретений включает способ получения данного биотрансплантата для лечения дисплазии суставов, при котором мезенхимальные стволовые клетки (МСК), получают из аутологичного материала, который измельчают, ферментативно дезагрегируют и полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, отличающийся тем, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки получают из жирового биоптата аутологичного материала, при этом ткань гомогенезируют, ферментируют колагеназой, отмывают и культивируют в среде, содержащей глютамин, гентамицин, и с добавлением 5% пуллированной, обогащенной тромбоцитами плазмы крови. Группа изобретений позволяет разработать высокоэффективный способ клеточной терапии дисплазии суставов для применения в ветеринарной медицине. 2 н. и 2 з.п. ф-ды, 1 табл., 1 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и касается получения культуры генетически немодифицированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и способа лечения дисплазии суставов.
В настоящее время в ветеринарной ортопедической практике возрастает число животных с заболеваниями опорно-двигательного аппарата. Так по статистике Ортопедического фонда животных (Orthopedic Foundation for Animals), для 50 наиболее подверженных дисплазиям пород, из 430000 обследованных собак дисплазия тазобедренного сустава присутствует в 21%, а дисплазии локтя в 16% из 180000 обследованных животных. Дегенеративные формы артритов составляют приблизительно одну треть причин, вызывающих хромоту у животных, наиболее часто встречающимися являются остеоартрозы. Вместе с тем, этиология возникновения остеоартроза до сих пор до конца не выяснена. Считают, что они могут быть вызваны травмами, возрастными изменениями, генетическими и другими факторами риска. Потеря способности передвигаться из-за болезни опорно-двигательного аппарата является ключевой причиной эвтаназии у большинства животных. Существующие методы лечения, как консервативные, так и хирургические, не позволяют ветеринарному врачу добиться полного выздоровления или ремиссии на длительный срок [Csaki С, Matis U, et al., 2007; Arends В, Vankelecom H., et al., 2009].
В последнее время во всем мире все большее внимание уделяется использованию стволовых клеток в терапии различных заболеваний. Изначально мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) привлекли к себе внимание в научном мире из-за их способности к дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты и возможной трансдифференцировки в нейроны, глиальные и эндотелиальные клетки. Эта широкая пластичность под влиянием клеточного микроокружения, межклеточных структур и ряда химических факторов позволяет использовать ММСК в качестве ключевого механизма процессов репарации [Горностаева С.Н., 2006; Bronckaers A., Hilkens P., et. al. 2014].
ММСК, являясь клетками тканей взрослого организма, обладают ограниченным потенциалом дифференцировки. Тем не менее, с точки зрения этики, являются более приемлемым для клинического использования материалом. Популяции ММСК базируются в костном мозге, в жировом депо, а также могут присутствовать и во многих других тканях как резидентные клеточные компоненты. Их способность к дальнейшей дифференцировке определяется как клеточным, так и гуморальным микроокружением. Эти клетки формируют своеобразный «резерв», способный в случае необходимости мобилизоваться и перемещаться к зонам повреждения для участия в восстановлении пораженных участков ткани.
Еще одной очень важной особенностью ММСК является их низкая иммуногенность и, более того, способность подавлять посттрансплантационный иммунный ответ организма, что крайне важно при осуществлении различного рода аллогенных трансплантаций [Рябцева Е.С., Кривенко С.И., и др., 2006; Herrmann R.P., Sturm M.J., 2014].
Одним из приоритетных направлений является лечение заболеваний и травм опорно-двигательного аппарата, дефектов суставного хряща, остеоартрита, которые являются растущей проблемой для человека и домашних животных и которые требуют разработки новой и усовершенствованной терапевтической стратегии.
Благодаря ряду уникальных свойств, в частности, способности дифференцироваться в различные типы клеток соединительной ткани, ММСК привлекают пристальное внимание исследователей. Эти свойства определяют перспективность применения ММСК в биотехнологии и регенеративной медицине.
Dalemans W., Lombardo Е. и Dekker R. представили способ «Mesenchymal stromal cells fortreating rheumatoid arthritis» (WO 2016001845 (A1) - England2016, A61K 35/28; A61P 9/02) для лечения ревматоидного артрита, включающий использование мезенхимальных стромальных клеток. Было обнаружено, что введение мезенхимальных стромальных клеток (МСК), в частности полученных из жировой ткани человека (hASCs), могут быть полезными при лечении ревматоидного артрита. Изобретение относится к композиции, содержащей мезенхимальные стромальные клетки (МСК), которая примененяется в лечении ревматоидного артрита. Изобретение также учитывает применение мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в производстве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита.
Недостатком этого способа является использование фетальной бычьей сыворотки или сывороточного альбумина человека, что приводит к невысокой пролиферативной активности ММСК жировой ткани в культуре. Использование дополнительных питательных и ростовых компонентов может стать решением этого вопроса. В частности замена такого стандартного компонента ростовой среды как эмбриональная телячья сыворотка на пуллированную плазму, обогащенную тромбоцитами, полученную от доноров того же вида. Использование в заявляемом способе пуллированной, обогащенной тромбоцитами плазмы крови позволяет получить культуру клеток ММСК жировой ткани аутологичных пациенту в условиях in vitro, которая будет отличаться высокой пролиферативной активностью, низким апоптотическим индексом, более высоким процентом жизнеспособных клеток и безопасностью в связи с отсутствием ксеногенных компонентов питательной среды.
Наиболее близким по технической сущности заявляемому (или выбранному в качестве прототипа) является способ «Биотрансплантат и способ лечения остеопороза» (патент РФ № RU 2265442 С1, 2004 г., A61K 35/28 (2000.01); A61K 35/48 (2000.01); А61Р 19/10 (2000.01)). Биотрансплантат для лечения остеопороза содержит мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы. Способ лечения остеопороза заключается во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн. в 50-100 мл физиологического раствора.
В связи с тем, что фетальные донорские клетки являются плюрипотентными, они обладают высокой пролиферативной активностью, что наряду с высокой вариабельностью генома зачастую может привести к развитию злокачественных новообразований, в случае применения этих клеток парентеральным путем. При внутривенном капельном введении аутологичного материала, регенераторная эффективность этих клеток крайне мала за счет системного действия, относительно малого количества и неспособности преодолеть васкулярно-эндотелиальный барьер.
Заявляемый способ локального лечения дисплазии суставов является методом внутрисуставного введения клеточного материала в очаг деструкции ткани, что предполагает непосредственное взаимодействие клеточного трансплантата с окружающей тканью с экскрецией в межклеточное пространство всех противовоспалительных и ростовых факторов, а также прямой контакт с клеточным и внеклеточным тканевым микроокружением реципиента.
Задачей заявляемого изобретения является разработка высокоэффективного способа клеточной терапии дисплазий суставов для применения в ветеринарной медицине.
Поставленная задача решается тем, что в изобретении «Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения», при котором в биотрансплантанте содержатся мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из аутологичного материала и согласно изобретению содержится от 5 млн. мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, предназначенных для введения во внутрисуставную сумку, причем биотрансплантан используется для лечения дисплазии суставов у собак. Используемые в изобретении «Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения» мезенхимальные стволовые клетки (МСК), получают из аутологичного материала, который измельчают, ферментативно дезагрегируют и полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, причем согласно изобретению мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, получают из жирового биоптата аутологичного материала и культивируют в среде с добавлением пуллированной, обогащенной тромбоцитами плазмы крови.
Способ осуществляется следующим образом.
Биоптат жировой ткани объемом 4-6 см3 промывается раствором D-PBS, в пропорции 1:2, для удаления примеси клеточных компонентов крови, далее биоптат гомогенезируется. Полученная гомогенная смесь из жировой ткани инкубируется в присутствии смеси ферментов в шейкере инкубаторе при 37°С и 200 об/мин в течение часа. После окончания инкубации непереваренный остаток жировой ткани тщательно пипетируется, отбирается водная фаза содержащая суспензию клеток от жировой фазы, и промывается средой, содержащей сыворотку в соотношении 1:1, центрифугированием в 50 мл пробирках при 800 g и +4°С в течение 10 мин. После первой промывки супернатант сливается, клеточный осадок ресуспендируется в 40 мл раствора Хэнкса и центрифугируется при 400 g и +4°С в течение 5 мин. После центрифугирования надосадок сливается и добавляется 1 мл полной питательной среды (DMEM : F12 (1:1), 5% пуллированной обогащенной тромбоцитами плазмы, penicillin, streptomicin, L-glutamine) и ресуспендируется. Количество ядросодержащих клеток (ЯСК) и их жизнеспособность определяется путем подсчета в камере Горяева с использованием Trypan blue 0,4%. Полученная суспензия клеток ММСК жировой ткани для дальнейшего культивирования засевается в культуральные флаконы площадью 25 см2, с плотностью посева 10-50×103 ЯСК/см2 в соответствующем объеме полной (ростовой) питательной среды при 37°С и 5% CO2. Через 24-48 часов неприкрепившиеся клетки удаляют и заменяют ростовую среду. В дальнейшем замену среды производят через каждые 2 дня.
Условия культивирования позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных ММСК.
Условия культивирования позволяют сохранить мультипотентность культуры клеток.
Условия культивирования позволяют получить большое количество ММСК, необходимое для инъекции и формирования клеточного банка пациента, что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.
Способ лечения базируется на экспериментально доказанном факте противовоспалительных и регенеративных свойствах мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках.
Динамика роста клеточной культуры ММСК из жировой ткани животного показана в таблице, где:
Т - общее количество клеток в культуре;
L - количество живых клеток в культуре;
D - количество мертвых клеток в культуре;
V - жизнеспособность.
На Фиг. 1. показаны культуры ММСК 1 и 2-го пассажей:
а) Пассаж 1, конфлуентная культура ММСК; отсутствуют морфологические признаки старения, отмечен упорядоченный рост культуры; фазовый контраст, увеличение ×100.
b) Пассаж 2, субконфлуентная культура ММСК; отсутствуют морфологические признаки старения, отмечен упорядоченный рост культуры; фазовый контраст, увеличение ×100.
По достижении культурой 75-85% конфлюэнтности, монослой трипсинизируют и пересевают в новые культуральные флаконы. После получения нужной концентрации клеток, необходимых для инъекции, с высоким пролиферативным потенциалом и жизнеспособностью не менее 95% клетки в количестве 5 млн. ресуспендируют в 1 мл физиологического раствора. К концу культивирования клетки имеют фибробластоподобный фенотип, морфологические признаки старения культуры отсутствуют (фиг. 1.). Трансплантацию осуществляют в условиях хирургического отделения ветеринарной клиники. Суспензия мезенхимальных стволовых клеток под контролем ультразвукого аппарата (УЗИ) вводится во внутрисуставную сумку.
Таким образом, в заявляемом способе лечения дисплазии суставов с использованием биотрансплантата, биотрансплантат содержит мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), полученные из жирового биоптата аутологичного происхождения, при этом ткань гомогенезируют, ферментируют колагеназой, полученную клеточную суспензию отмывают и культивируют в питательной среде, содержащей глютамин, гентамицин и 5% пулированной плазмы, обогащенной тромбоцитами, полученную от доноров того же вида. Способ лечения дисплазии суставов заключается во внутрисуставном введении 5 млн. ММСК в 1 мл физиологического раствора. Изобретение обеспечивает восстановление хрящевой ткани сустава, приводит к снижению воспалительных процессов, позволяющих улучшить двигательную активность пациента.
Литература
1. Csaki С., Matis U., Mobasheri A., Ye Н., Shakibaei М. Chondrogenesis, osteogenesis and adipogenesis of canine mesenchymal stem cells: a biochemical, morphological and ultrastructural study. Histochem Cell Biol. 2007; 128(6): 507-20.
2. Arends В., Vankelecom H., Vander Borght S., Roskams Т., Penning L.C., Rothuizen J., Spee B. The dog liver contains a "side population" of cells with hepatic progenitorlike characteristics. Stem Cells Dev. 2009; 18(2): 343-50.
3. Горностаева C.H., Миогенная дифференцировка ультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека in vitro и in vivo. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2006 г.
4. Bronckaers A., Hilkens P., Martens W., Gervois P., Ratajczak J., Struys Т., Lambrichts I. Mesenchymal stem/stromal cells as a pharmacological and therapeutic approach to accelerate angiogenesis. Pharmacol Ther. 2014; 143(2): 181-96.
5. Рябцева E.C., Кривенко С.И., Левин В.И., Луц Л.С., Белевцев М.В., Усс А.Л., Змачинский В.А. Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани: характеристика и аспекты использования при трансплантации гемопоэтических клеток. Известия НАН Беларуси. 2006, 1: 81-87.
6. Herrmann R.P., Sturm M.J. Adult human mesenchymal stromal cells and the treatment of graft versus host disease. Stem Cells Cloning. 2014; 7:45-52.
Claims (4)
1. Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из жирового биоптата аутологичного материала, отличающийся тем, что содержит от 5 млн. мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в 1 мл физиологического раствора.
2. Биотрансплантат по п. 1 предназначен для введения во внутрисуставную сумку.
3 Биотрансплантат по п. 1 предназначен для собак.
4. Способ получения биотрансплантата по п. 1 для лечения дисплазии суставов, при котором мезенхимальные стволовые клетки (МСК) получают из аутологичного материала, который измельчают, ферментативно дезагрегируют и полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, отличающийся тем, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки получают из жирового биоптата аутологичного материала, при этом ткань гомогенезируют, ферментируют колагеназой, отмывают и культивируют в среде, содержащей глютамин, гентамицин, и с добавлением 5% пуллированной, обогащенной тромбоцитами плазмы крови.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103716A RU2659204C1 (ru) | 2017-02-03 | 2017-02-03 | Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103716A RU2659204C1 (ru) | 2017-02-03 | 2017-02-03 | Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2659204C1 true RU2659204C1 (ru) | 2018-06-28 |
Family
ID=62815327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017103716A RU2659204C1 (ru) | 2017-02-03 | 2017-02-03 | Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2659204C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732150C1 (ru) * | 2020-03-04 | 2020-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий" | Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины |
| CN114525245A (zh) * | 2022-02-15 | 2022-05-24 | 江苏银丰生物工程有限公司 | 一种cmm培养基及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051317A1 (en) * | 1997-05-13 | 1998-11-19 | Osiris Therapeutics, Inc. | Osteoarthritis cartilage regeneration using human mesenchymal stem cells |
| RU2265442C1 (ru) * | 2004-05-14 | 2005-12-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Биотрансплантат и способ лечения остеопороза |
| RU2298410C1 (ru) * | 2005-09-12 | 2007-05-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Биотрансплантат и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний |
| RU2309756C1 (ru) * | 2006-07-03 | 2007-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Транс-Технологии" | Способ лечения ложных суставов путем трансплантации аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, биотрансплантат для его применения |
| WO2010111278A1 (en) * | 2009-03-23 | 2010-09-30 | The Texas A&M University System | Compositions of mesenchymal stem cells to regenerate bone |
| WO2016001845A1 (en) * | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Tigenix S.A.U. | Mesenchymal stromal cells for treating rheumatoid arthritis |
-
2017
- 2017-02-03 RU RU2017103716A patent/RU2659204C1/ru active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051317A1 (en) * | 1997-05-13 | 1998-11-19 | Osiris Therapeutics, Inc. | Osteoarthritis cartilage regeneration using human mesenchymal stem cells |
| RU2265442C1 (ru) * | 2004-05-14 | 2005-12-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Биотрансплантат и способ лечения остеопороза |
| RU2298410C1 (ru) * | 2005-09-12 | 2007-05-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Биотрансплантат и способ лечения ревматических и аутоиммунных заболеваний |
| RU2309756C1 (ru) * | 2006-07-03 | 2007-11-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Транс-Технологии" | Способ лечения ложных суставов путем трансплантации аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, биотрансплантат для его применения |
| WO2010111278A1 (en) * | 2009-03-23 | 2010-09-30 | The Texas A&M University System | Compositions of mesenchymal stem cells to regenerate bone |
| WO2016001845A1 (en) * | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Tigenix S.A.U. | Mesenchymal stromal cells for treating rheumatoid arthritis |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732150C1 (ru) * | 2020-03-04 | 2020-09-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий" | Способ получения аутологичного лизата тромбоцитов в качестве основы для клеточных биомедицинских препаратов ветеринарной медицины |
| CN114525245A (zh) * | 2022-02-15 | 2022-05-24 | 江苏银丰生物工程有限公司 | 一种cmm培养基及其应用 |
| CN114525245B (zh) * | 2022-02-15 | 2023-12-12 | 江苏银丰生物工程有限公司 | 一种cmm培养基及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kolaparthy et al. | Adipose tissue-adequate, accessible regenerative material | |
| Brennan et al. | Pre-clinical studies of bone regeneration with human bone marrow stromal cells and biphasic calcium phosphate | |
| Parker et al. | Adipose-derived stem cells for the regeneration of damaged tissues | |
| JP6545690B2 (ja) | 栄養膜基底層から由来した幹細胞及びそれを含む細胞治療剤 | |
| JP6193214B2 (ja) | 歯髄由来の多能性幹細胞の製造方法 | |
| WO2015004609A2 (en) | Adherent cells from placenta and use thereof in treatment of injured tendons | |
| CN109706115B (zh) | 一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法 | |
| de Paula et al. | Human serum is a suitable supplement for the osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells seeded on poly-3-hydroxibutyrate-co-3-hydroxyvalerate scaffolds | |
| AU2013206755B2 (en) | Activating adipose-derived stem cells for transplantation | |
| CN103223194A (zh) | 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法 | |
| CN107376025B (zh) | 一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法及应用 | |
| Linon et al. | Engraftment of autologous bone marrow cells into the injured cranial cruciate ligament in dogs | |
| RU2659204C1 (ru) | Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения | |
| US9434923B2 (en) | Preparation of parental cell bank from foetal tissue | |
| Maiti et al. | Isolation, Proliferation and Morphological Characteristics of Bone-Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells (BM-MSC) from Different Animal Species. | |
| WO2014203268A2 (en) | Method for isolation, purification and industrial scale expansion of equine adipose tissue derived mensenchymal stem cells | |
| CN114480261B (zh) | 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法 | |
| CN112300986B (zh) | 无血清培养基制备脂肪间充质干细胞的方法 | |
| Ninu et al. | Isolation, proliferation, characterization and in vivo osteogenic potential of bone-marrow derived mesenchymal stem cells (rBMSC) in rabbit model | |
| KR101649375B1 (ko) | 세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법 | |
| WO2023063417A1 (ja) | 撹拌を伴う接着性細胞の浮遊培養方法 | |
| Voga et al. | ISOLATION OF LIVE CELLS FROM DIFFERENT MICE TISSUES UP TO NINE DAYS AFTER DEATH | |
| Graide et al. | Enhancing autologous Equine Therapy: Innovative 3D Culture Method for Muscle-derived Progenitor Cells (mdP-Cells) | |
| RU2404242C1 (ru) | Способ ускоренного формирования костной мозоли у млекопитающих | |
| CN115537380A (zh) | 一种非转基因诱导脂肪干细胞生成人ips细胞的方法 |