RU2658707C1 - Способ восстановления кожного покрова - Google Patents
Способ восстановления кожного покрова Download PDFInfo
- Publication number
- RU2658707C1 RU2658707C1 RU2016152062A RU2016152062A RU2658707C1 RU 2658707 C1 RU2658707 C1 RU 2658707C1 RU 2016152062 A RU2016152062 A RU 2016152062A RU 2016152062 A RU2016152062 A RU 2016152062A RU 2658707 C1 RU2658707 C1 RU 2658707C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- carrier
- skin
- fibroin
- bioresorbable
- cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title abstract description 6
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 6
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 4
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 4
- 230000010388 wound contraction Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 22
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 230000036448 vitalisation Effects 0.000 description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 2
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 239000002745 poly(ortho ester) Substances 0.000 description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 2
- -1 polylactones Polymers 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 2
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000005705 Keratin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010070553 Keratin-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000035617 depilation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002346 layers by function Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000003158 myorelaxant agent Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000218 poly(hydroxyvalerate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 230000009237 prenatal development Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Birds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для восстановления кожного покрова. Для этого в область повреждения кожи последовательно вводят биорезорбируемый носитель с культурой клеток фибробластов и биорезорбируемый носитель с культурой кераноцитов, где носитель представляет собой частицы диаметром 100-500 мкм, обладающие отрицательным зарядом при физиологических значениях рН, полученные измельчением трехмерных матриксов на основе фиброина шелка Bombyx mori. Способ позволяет ускорить процесс заживления раны за счет ускорения контракции раны на ранних этапах восстановления и ускорения реэпителизации. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Более подробно изобретение относится к области применения витализированных биорезорбируемых микроносителей для восстановления кожного покрова.
Уровень техники
Кожный покров играет важную роль в жизнедеятельности организма, обеспечивая целый ряд важных функций, таких как механическая, термическая и химическая защита тканей тела, барьер для микроорганизмов, поддержание гомеостаза, обеспечение механической рецепции. Наличие долго незаживающих ран может стать причиной развития инфекций, привести к инвалидности или смерти пациента.
Кроме того, на месте обширных повреждений вследствие процессов восстановления может образоваться рубцовая ткань, которая отличается по механическим и физиологическим свойствам от нормальной кожи. Это может приводить как к проявлениям дискомфорта и неудобств косметического характера, так и к ограничениям функциональных возможностей работы отдельных частей тела.
Успешное заживление ран зависит от своевременного и оптимального течения самых разнообразных процессов, взаимодействия разных типов клеток, молекулярных медиаторов и структурных элементов. В различных этапах восстановления доминируют различные клетки, и клеточные ансамбли варьируют в зависимости от различных видов травм и степени повреждения тканей. При нормальном заживлении ран закрытие тканевых дефектов развивается через серию скоординированных молекулярных и клеточных событий, в результате чего происходит регенерация или заживление тканей [Y. Zeng, et al. Acta Biomater. 2015. V. 25. P. 291-303, J. Zhou et al. Mater. Sci. Eng. C. Mater. Biol. Appl. 2016. V. 60. Р. 437-445].
При нарушении целостности капилляров в слое дермы происходит образование тромба, что в свою очередь приводит к высвобождению противоспалительных факторов, таких как трансформирующие факторы роста α и β (TGF-α, TGF-β) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF). В области раны начинает расти число нейтрофилов и макрофагов, развивается воспаление. Выделение макрофагами цитокина TGF-β1 индуцирует дифференцировку дермальных фибробластов в миофибробласты, которые синтезируют внеклеточный матрикс, преимущественно состоящий из фибронектина и гиалуроновой кислоты, стимулирующей миграцию фибробластов. Миграция кератиноцитов приводит к восстановлению барьерной функции. После этого происходит апоптоз миофибробластов с последующим их замещением фибробластами из прилегающих участков кожи, создающих коллагеновый внеклеточный матрикс.
Наименее сложным является заживление чистых ран без потери ткани и неинфицированных хирургических разрезов с использованием швов. Это быстрый процесс, и он заметно контрастирует с заживлением открытой раны с обширной потерей тканей. Здесь репаративный процесс более сложен, так как утраченная ткань должна быть заменена новообразованной. Процесс занимает больше времени и требует формирования большого количества грануляционной ткани для заполнения дефекта ткани.
Таким образом, в процессы восстановления и регенерации вовлечено множество клеток разных типов и биологически активных веществ. Использование их в различных сочетаниях с биомедицинскими изделиями может качественно изменить подходы к восстановлению кожных покровов после различных повреждений.
В настоящее время для улучшения посттравматического восстановления кожных покровов активно исследуется возможность применения выделенных из костного мозга или жировой ткани мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). ММСК способны к дифференцировке в различные типы клеток, выделению факторов роста, а также участию в воспалительных процессах, что делает перспективным их применение в клеточной трансплантологии [Tony Kwang-Poh Goh et al. Biores Open Access. 2013. V. 2(2). P. 84-97]. Однако существенным недостатком применения суспензии свободных клеток является их низкая приживаемость в области поражения, что привело к необходимости создания эффективной системы доставки. Одним из таких методов является конструирование биоинженерных микроскаффолдов (микроносителей). Для их создания используются различные материалы, такие как коллаген, гиалуроновая кислота, фиброин, хитозан и желатин [Dal P. Et al. Biomaterials. 2005. V. 26. P. 1987-1999, Lee J. et al. Tissue Eng Part В Rev. 2008b. V. 14. Р. 61-86].
Выбор материала является серьезным этапом создания скаффолда, поскольку он определяет биосовместимость, скорость биодеградации, адгезионные и антибактериалные свойства готового продукта, определяющие в свою очередь скорость и качество восстановления кожного покрова.
Важной характеристикой является не только материал, но также форма и размер скаффолда. Для развития методов клеточной терапии перспективно использование биорезорбируемых микроносителей - небольших частиц от 50 до 500 мкм, поскольку это позволяет использовать иммобилизованные на носителях клетки в инъекционной форме и помогает исключить травматичную для клеток стадию снятия культуры с подложки. Биорезорбируемые микроносители наиболее удобны для иммобилизации клеток и последующего введения в повреждение кожи.
Кроме того, микроносители не только доставляют мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки непосредственно в повреждение, они повышают жизнеспособность клеток, обеспечивают их длительное высвобождение и, имея структуру, напоминающую внеклеточный матрикс, влияют на экспрессию генов и секрецию белков, модулируют клеточный фенотип.
Таким образом, лечение кожных покровов с помощью микроносителей способствует как большей выживаемости вводимых клеток, так и повышает скорость и полноту регенерации кожи.
Прототипом настоящего изобретения является способ обработки повреждений живой кожи, включающий нанесение заменителя живой кожи на области повреждений кожи, отличающийся тем, что он содержит в качестве биосовместимого носителя микросферы из биорезорбируемого in vivo материала, имеющие средний диаметр 50-500 мкм, предпочтительно 80-250 мкм, и культуру клеток кожи в виде покрытия, нанесенного на поверхность этих микросфер, который наносят в виде суспензии покрытых клетками микросфер на область повреждения кожи (документ RU 2104039 С1).
Существенным недостатком данного изобретения является использование в качестве материала микросфер полигидроксибутирата, сополимера полигидроксибутирата и полигидроксивалериата, полимеров лактидогликолидов, полилактонов, полиэфиров, полилактидов, полиглюколидов, полиангидридов, так как в результате биодеградации данных материалов образуются кислые продукты распада, что отрицательно сказывается на биосовместимости носителя. Ранее было показано, что синтетические полимеры, применяемые для создания трехмерных пористых матриц, такие как полигликолиевая кислота (PGA), полимолочная кислота (PLA) и полиортоэфир (РОЕ), при деградации образуют вещества, обладающие токсическим действием. Продукты распада PGA и PLА в водной среде существенно понижают уровень рН среды, а при быстрой деградации уровень образующихся кислот превышает емкость буферного раствора TRIS (рН 7,4) [Sachlos Е. and Czernuszka J.T., 2003; Taylor M.S. et al., 1994]. Изменение уровня рН среды влияет на физиологическое состояние клеток, их экспрессионный профиль и синтез межклеточного матрикса [Kohn D.H. et al., 2002; Wu M.H. et al., 2007]. Еще одним значительным недостатком данного изобретения является сферическая форма носителя, которая не защищает доставляемые клетки от механических воздействий и, как следствие, разрушений, в процессе введения в область повреждения, в результате чего возможно происходит снижение эффективности лечения. Данные факторы будут приводить к увеличению времени восстановления кожного покрова.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка эффективного способа восстановления кожного покрова.
Поставленная задача решается способом восстановления кожного покрова, включающим последовательное введение в область повреждения кожи суспензии, содержащей биорезорбируемый носитель с иммобилизованными фибробластами, затем через 2-4 часа суспензии, содержащей биорезорбируемый носитель с иммобилизованными кератиноцитами, где носитель представляет собой частицы диаметром 100-500 мкм, обладающие отрицательным зарядом при физиологических значениях рН, полученные измельчением трехмерных матриксов на основе фиброина шелка Bombyx mori.
Измельчение трехмерных матриксов включает следующие стадии:
a) заморозку в течение 12-24 ч при -80-90°С;
b) криоизмельчение трехмерных матриксов на основе фиброина шелка с применением диспергатора.
При этом трехмерные матриксы на основе фиброина шелка получают путем замораживания-оттаивания водного раствора фиброина и включает в себя следующие стадии:
a) получение водного раствора фиброина с концентрацией 18-30 мг/мл с использованием смеси СаCl2/С2Н5ОН/Н2О в следующем молярном соотношении 1/2/8;
b) заморозку смеси раствора фиброина с ДМСО, при этом содержание ДМСО в растворе составляет 0,5-2 об.%;
c) размораживание и обработку 96% этанолом для формирования β-складчатой структуры.
Введение биорезорбируемого носителя с фибробластами и носителя с кератиноцитами осуществляют посредством инъекции подкожно на расстоянии 0,5-2 мм от места повреждения, при этом каждая суспензия содержит 260-270 тыс. кл/мл, а введение осуществляют посредством трех-пяти инъекций по 20-30 мкл на 1 мм2 повреждения.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является замедление контракции поврежденной области на ранних этапах восстановления и ускорение реэпителизации при введении суспензий, содержащих биорезорбируемый носитель с иммобилизованными фибробластами и биорезорбируемый микроноситель с иммобилизованными кератиноцитами, и, как следствие, ускорение заживления кожного покрова с восстановлением всех структурных и функциональных слоев. Заявляемый способ позволяет сохранить клетки, участвующие в регенерации, при осуществлении инъекций вокруг повреждения. Это достигается за счет того, что предлагаемый биорезорбируемый композитный микроскаффолд представляет собой микрочастицы с поверхностью сложной формы, обеспечивающей защиту клеток от механических воздействий и являющейся оптимальным субстратом для адгезии, пролиферации и миграции клеток. При этом дальнейшая деградация фиброина в организме сопровождается образованием нетоксичных и, в некоторых случаях, даже полезных для регенерации продуктов, и поддается контролю [Wang Y. et al. In vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds. // Biomaterials. Vol. 29, №24-25. P. 3415-3428; Park S.-H. et al. Relationships between degradability of silk scaffolds and osteogenesis. // Biomaterials. 2010. Vol. 31, №24. P. 6162-6172]. Многие фиброиновые продукты прошли тестирование in vivo и показали эффективность для регенерации кожных повреждений [Thurber А.Е., Omenetto F.G., Kaplan D.L. In vivo bioresponses to silk proteins. // Biomaterials. 2015. Vol. 71. P. 145-157], костной ткани, хрящей [Foss С. et al. Silk fibroin/hyaluronic acid 3D matrices for cartilage tissue engineering. // Biomacromolecules. 2013. Vol. 14, №1. P. 38-47], сердца [Chi N.-H. et al. Cardiac repair using chitosan-hyaluronan/silk fibroin patches in a rat heart model with myocardial infarction // Carbohydr. Polym. 2013. Vol. 92, №1. P. 591-597], сосудов [Lovett M. et al. Silk fibroin microtubes for blood vessel engineering // Biomaterials. 2007. Vol. 28, №35. P. 5271-5279], печени [Yang Z. et al. In vitro and in vivo characterization of silk fibroin/gelatin composite scaffolds for liver tissue engineering // J. Dig. Dis. 2012. Vol. 13, №3. P. 168-178], а также в качестве носителей лекарственных соединений с регулируемым высвобождением [Liu Q., Liu Н., Fan Y. Preparation of silk fibroin carriers for controlled release // Microsc. Res. Tech. 2015. P. n/a-n/a].
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 представлены макрофотографии состояния полнослойных повреждений кожного покрова мыши, демонстрирующие влияние последовательного внесения экспериментальных образцов биорезорбируемых микроносителей для доставки клеток (БМНДК), витализированных мышиными эмбриональными фибробластами (МЭФ) и кератиноцитами (КЦ) и невитализированных БМНДК (контроль), на скорость затягивания полнослойной раны кожи и образование рубца в течение 14 дней после нанесения раны.
На фиг. 2 представлена гистограмма, демонстрирующая влияние последовательного внесения экспериментальных образцов БМНДК, витализированных МЭФ КЦ и невитализированных БМНДК (контроль), на скорость затягивания полнослойной раны кожи. На гистограмме отражены % площади раны относительно площади раны в нулевой точке в экспериментальной и контрольной группах.
Осуществление изобретения
Получение водного раствора фиброина шелка осуществляли с использованием нитей хирургических нестерильных 100% натуральный шелк, произведенных по ГОСТ 396-84 (соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 396-84, наличие сертификата соответствия №0302120, гарантии производителя, срок годности, условия хранения по ГОСТ 396-84, сертификат соответствия), растворяя навеску в смеси dH2O, кальция хлористого (х.ч., о.с.ч., ГОСТ 450-77; соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 3885-73, наличие гарантии производителя, срок годности, внешний вид) и спирта этилового ректификованного 96% (ГОСТ 5962-67). Формирование макроносителей для дальнейшего криоизмельчения с целью получения микроносителей проводили путем заморозки водного раствора фиброина с добавлением 1% ДМСО (х.ч., ТУ 2635-114-44493179-08). Криоизмельчение сформированных макроносителей выполняли с помощью диспергатора).
Перечисленные выше процедуры осуществлялись с использованием следующего оборудования: система очистки воды Еliх 70, «Millipore» (Франция, система включает: картридж предварительной очистки Progard TL, картридж обратного осмоса, модуль Elix; производительность 70 л/час при температуре 7-30°С, рабочее давление 0,7-1,0 МПа, 220 В, 50 Гц, габариты (ШГВ): 662×441×733 мм, 56 кг); резервуар для сбора очищенной воды SDS 200, «Millipore» (Франция, объем 200 л), весы электронные RV 1502, «OHAUS» (США, (1500,00±0,01) г, 220 В, 50 Гц); шкаф вытяжной 1200 ШВМкв (Россия, ООО «ЛаМО» макс, мощность подключаемых приборов 3,5 кВт, 220 В, габариты (ШГВ): 1280×750×2400 мм); холодильник бытовой Атлант МХМ 1707-02 (Минск, Белоруссия, емкость камеры холодильника 175 л, температура от 0°С до 10°С, емкость мороз, камеры 115 л, температура минус 18 до минус 24°С, 220 В, 50 Гц); диспергатор Bosch MSM 66150 ERGOMIXX (Словения, мощность 600 Вт, 220 В, погружной, турборежим, габариты (ВГШ):210×620×550, вес: 1.15 кг); центрифуга MiniSpin, «Eppindorf», (Германия, скорость вращения 13400 об/мин, ротор F-45-12-11, 12×1,5/2 мл, 220 В, 70 Вт, габариты (ВГШ): 122×240×226 мм, 4,3 кг); баня водяная BWT-U/20, Biosan (Латвия, ванна из н/ж стали объем 20 л. Диапазон регулирования температуры от 30°С до 100°С, точность поддержания температуры ±0,1°С, внутренняя циркуляция, внутр. размеры ванны: 300×320×140 мм, габариты: 345×550×290 мм, 11 кг, 220 В, 50 Гц, 1 кВт).
Выделение и культивирование первичных культур фибробластов и кератиноцитов для последующей витализации полученных микроносителей выполняли с использованием стандартных сред и добавок по известным протоколам (Мойсенович М.М. и др. Фундаментальные основы использования биорезорбируемых микроносителей на основе фиброина шелка в терапевтической практике на примере регенерации кожи // Терапевтический архив, 2015, 87 (12), с. 66-72). Витализацию микроносителей проводили по оригинальной методике, включающей следующие стадии:
1. Подготовка микроносителей
Стерильную навеску микроносителя переносят в среду культивирования ДМЕМ в центрифужную пробирку из расчета 5 мг на 1 мл, ресуспендируют и центрифугируют 3 минуты при 1500 об/мин. Заменяют супернатант на 1 мл полной среды культивирования и инкубируют при 37°С 1 час. Полученную суспензию используют на стадии 3.
2. Подготовка суспензии фибробластов МЭФ/кератиноцитов
Культивируемые клетки снимают раствором трипсин-Версена, трипсин инактивируют ЭТС и переносят в центрифужные пробирки в полную среду культивирования, осаждают клетки, центрифугируя при 1500 об/мин в течение 7 минут. Супернатант удаляют и ресуспендируют осадок в среде культивирования. Проводят подсчет клеток в камере Горяева и готовят суспензию, содержащую 400 тыс.клеток в 1 мл полной среды культивирования. Полученную суспензию используют на стадии 3.
3. Иммобилизация клеток на микроносителе
Суспензию микрочастиц, полученную на стадии 1, вносят в лунки 96-луночной круглодонной плашки по 50 мкл на 1 лунку и добавляют по 100 мкл суспензии клеток, полученной на стадии 2. Помещают плашку в СО2-инкубатор и инкубируют 6 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2. Суспензию микроносителей с иммобилизованными клетками переносят в лунки 24-луночной плашки, содержащие 1,5 мл полной культуральной среды. Планшет помещают в СО2-инкубатор на 37°С с 5% СО2 в атмосфере.
Для восстановления кожного покрова осуществляли последовательное введение на расстоянии 0,5-2 мм от места повреждения суспензии, содержащей биорезорбируемый носитель с иммобилизованными фибробластами, затем с интервалом в 2-4 часа суспензии, содержащей биорезорбируемый носитель с иммобилизованными кератиноцитами.
Настоящее изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение биорезорбируемых микроносителей для доставки клеток в область восстановления и регенерации ран
1. Подготовка рабочих растворов:
1.1. Подготовка раствора 1. Готовят раствор хлорида кальция в смеси этанола и воды. Молярное соотношение компонентов CaCl2:C2H5OH:H2O составляет 1:2:8.
1.2. Подготовка раствора 2. Готовят навеску шелка из расчета 150 мг на 1 мл раствора 1 и переносят в емкость с раствором 1. Инкубируют в течение 5 часов на водяной бане при 70°С. Полученный раствор центрифугируют 15 минут при 15500 g и супернатант диализуют против дистиллированной воды, проводя 4 смены диализа. Полученный раствор центрифугируют 15 минут при 15500 g и определяют концентрацию фиброина по оптической плотности при 280 нм. Доводят раствор до концентрации фиброина 20 мг/мл, вносят 1% ДМСО и используют на стадии 2.
2. Формирование матриксов
Раствор 2 вносят в форму и замораживают в морозильной камере при -20°С в течение 7 дней. Обрабатывают 96% этанолом полученные заготовки матриксов 3 раза по 45 минут. Полученные матриксы переносят в дистиллированную воду и используют на стадии 3.
3. Получение микрочастиц из матриксов
Матриксы, полученные на стадии 2, погружают в дистиллированную воду и помещают на ночь в морозильную камеру при -20°С. Переносят замороженные в воде матриксы в морозильную камеру на 4 часа при -90°С. За это время охлаждают 96% этанол. Замороженные в воде матриксы переносят в диспергатор и размельчают в течение 45 секунд. Полученную взвесь переносят в 50 мл центрифужные пробирки и используют на стадии 4.
4. Сортинг и стерилизация микрочастиц из матриксов
Полученные микрочастицы последовательно пропускают через сита с диаметром отверстий 500, 250 и 100 мкм. Собирают фракции частиц 500-250 мкм, 100-250 мкм в центрифужные пробирки типа Falcon и центрифугируют 10 минут при 150 g. Супернатант отбирают, вносят дистиллированную воду, замораживают и лиофильно высушивают. Хранят при +4°С в герметично закрытой таре, защищающей от влаги.
Пример 2. Выделение клеток
Выделение мышиных фибробластов проводили из GFP+ эмбрионов на 13 день внутриутробного развития. Датированную беременность получали, подсаживая двух самок C57BL/6N к GFP+ самцу на ночь, утром проверяли наличие копулятивной пробки у самок. Момент обнаружения копулятивной пробки считали 1-м днем беременности. На 13 день беременности мышь эвтаназировали и извлекали матку. Наличие экспрессии GFP проверяли на УФ-трансиллюминаторе. Удаляли голову и внутренние органы у эмбрионов, а оставшиеся ткани измельчали глазными ножницами в стерильных условиях, диссоциировали в 0.05%-ном растворе трипсин-ЭДТА и осаждали 5 минут при 200 g. Полученную клеточную суспензию переносили во флакон в среде ДМЕМ с 10% ЭТС Из расчета 1,2×106 клеток в 10 мл и помещали в СО2- инкубатор на 37°С с содержанием СО2 в атмосфере 5%.
Первичную культуру мышиных кератиноцитов получали из новорожденных мышей C57BL/6N на 0-3 день развития. Фрагмент кожи обеззараживали антибиотиком/антимикотиком (Gibco) следующего состава: 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина в ФСБ в течение 5 минут. Далее в течение ночи при +4°С обрабатывали дерму 0.025%-ным раствором трипсин/ЭДТА. Затем дерму удаляли, а эпидермис измельчали и центрифугировали при 200 g в среде FAD следующего состава: ДМЕМ/Ham’s F12 (Lonza, Швейцария) в соотношении 3.5:1.1 с добавлением 10% ЭТС, 0.18 мМ аденина, 0.5 мкг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл инсулина, 0.1 нМ холерного токсина, 10 нг/мл EGF, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата, с последующим ресуспендированием. Переносили суспензию клеток в чашки Петри диаметром 60 мм из расчета 0,2-0,8×106 клеток на чашку. В течение 14 дней проводили ежедневную замену среды на свежую. Характеристику полученной из суспензии первичной культуры кератиноцитов проводили путем выявления цитокератинов 5 и 14 на поверхности клеток посредством непрямой иммунофлуоресценции с использованием мышиных моноклональных антител к цитокератину 5 с поликлональными козьими антителами против иммуноглобулина G мыши, меченных CF™ 555 и кроличьих моноклональных антител к цитокератину 14 с поликлональными козьими антителами против иммуноглобулина G кролика, меченных CF™ 633. Использовали антитела производства Sigma-Aldrich, США.
Пример 3. Витализация экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клеток
1. Подготовка микроносителей
Стерильную навеску микроносителя (100-250 мкм) переносят в среду культивирования ДМЕМ в центрифужную пробирку из расчета 5 мг на 1 мл, ресуспендируют и центрифугируют 3 минуты при 1500 об/мин. Заменяют супернатант заменяют на 1 мл полной культуральной среды с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и инкубируют при 37°С 1 час. Полученную суспензию используют на стадии 2.
2. Иммобилизация клеток на микроносителе
Суспензию микрочастиц, полученную на стадии 1, переносят в конические пробирки типа Falcon объемом 50 мл и добавляют супензию клеток (400 тыс./мл) МЭФ или первичный эпидермальных кератиноцитов, полученных в примере 2, из расчета 1 мл супензии микроносителей и 2 мл суспензии клеток, полученных в примере 2. Помещают плашку в CO2-инкубатор и инкубируют 6 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2.
Пример 4. Исследование влияния витализации микроносителей на скорость восстановления и регенерации кожных покровов in vivo
Эксперимент проводили на 6 мышах линии C57BL/6N категории SPF (specific pathogen free), полученных из лабораторного питомника Пущино. Перед имплантацией со спины удаляли шерсть депилляционным кремом и обеззараживали поверхность 70% этанолом. Операцию проводили под общей анестезией. Внутрибрюшинно вводили 100 мкл смеси препаратов: наркотизирующего Золетил 100 (Virbac Sante Animale, Каррос, Франция) и миорелаксанта Rometar (Bioveta, a. s., Чешская республика). Полнослойную асептическую рану кожи формировали с помощью стерильного одноразового стилета для биопсии диаметром 4 мм (EPITHEASY, Medax, Италия). Экспериментальные образцы БМНДК с клетками МЭФ и образцы с иммобилизованными кератиноцитами (КЦ), последовательно вводили интрадермально посредством 3 инъекций по 60 мкл суспензии (16 тыс. клеток, иммобилизованных на экспериментальных образцах БМНДК) по краям раны, с интервалом 2 часа, контрольной группе вводили суспензию невитализированных микроносителей. Экспериментальная и контрольная группы содержали каждая по три мыши с двумя полнослойными ранами. Анализ динамики затягивания раны проводили по макрофотографиям. Макрофотографии ран получали в день операции (0 день), через 1, 3, 7, 10 и 14 дней. Полученные данные представлены на фиг. 1. На макрофотографиях представлены изображения области раны на 0, 1, 3, 7, 10 и 14 дни после нанесения раны.
Далее по полученным макрофотографиям проводили анализ изменения площади раны. Оценку выполняли с использованием приложения ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) следующим образом: область раны выделяли и вычисляли пиксельную площадь. Площадь раны оценивали в процентах относительно нулевой точки для каждого из трех животных во всех группах. Результаты выполненного анализа представлены на фиг. 2.
Площадь раны животных, инъецированных образцами БМНДК, витализированными фибробластами и кератиноцитами посредством последовательных введений клеток на БМНДК, через 1 день после нанесения травмы была меньше, чем у животных, которым вводили невитализированные частицы. При этом площадь раны составляла не менее 40%, а к третьему дню площади ран выравнивались. На седьмой день после нанесения раны струп наблюдался только в группе животных, которым вводили невитализированные БМНДК.
Таким образом, приведенные примеры показывают, что применение последовательного введения БМНДК, витализированных МЭФ и кератиноцитами, способствовало ускорению контракции раны на ранних этапах восстановления и ускорению реэпителизации и, как следствие, заживлению раны.
Claims (11)
1. Способ восстановления кожного покрова, включающий последовательное введение в область повреждения кожи суспензии, содержащей биорезорбируемый носитель с иммобилизованными фибробластами, затем с интервалом в 2-4 ч суспензии, содержащей биорезорбируемый носитель с иммобилизованными кератиноцитами, где носитель представляет собой частицы диаметром 100-500 мкм, обладающие отрицательным зарядом при физиологических значениях рН, полученные измельчением трехмерных матриксов на основе фиброина шелка Bombyx mori.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что измельчение трехмерных матриксов включает следующие стадии:
a) заморозку в течение 12-24 ч при (-80)-(-90)°С;
b) криоизмельчение трехмерных матриксов на основе фиброина шелка с применением диспергатора.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что трехмерные матриксы на основе фиброина шелка получены путем замораживания-оттаивания водного раствора фиброина, и включает в себя следующие стадии:
a) получение водного раствора фиброина с концентрацией 18-30 мг/мл с использованием смеси CaCl2/С2Н5ОН/Н2О в следующем молярном соотношении: 1/2/8;
b) заморозку смеси раствора фиброина с ДМСО, при этом содержание ДМСО в растворе составляет 0,5-2 об.%;
c) размораживание и обработку 96% этанолом для формирования β-складчатой структуры.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что введение биорезорбируемого носителя с фибробластами и носителя с кератиноцитами осуществляют посредством инъекции подкожно на расстоянии 0,5-2 мм от места повреждения.
5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что каждая инъецируемая суспензия носителя с фибробластами и носителя с кератиноцитами содержит 260-270 тыс. кл/мл.
6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что введение осуществляют посредством трех-пяти инъекций по 20-30 мкл на 1 мм2 повреждения.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016152062A RU2658707C1 (ru) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Способ восстановления кожного покрова |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016152062A RU2658707C1 (ru) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Способ восстановления кожного покрова |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2658707C1 true RU2658707C1 (ru) | 2018-06-22 |
Family
ID=62712685
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016152062A RU2658707C1 (ru) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Способ восстановления кожного покрова |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2658707C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2731313C1 (ru) * | 2019-12-24 | 2020-09-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) | Способ восстановления кожного покрова |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2104039C1 (ru) * | 1992-05-18 | 1998-02-10 | Нэшнл Ресеч Консил оф Канада | Заменитель живой кожи, способ его получения и способ обработки повреждений живой кожи |
RU2148970C1 (ru) * | 1999-02-26 | 2000-05-20 | Парамонов Борис Алексеевич | Способ восстановления кожного покрова |
CA2499014A1 (en) * | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Agennix Incorporated | Lactoferrin compositions and methods of wound treatment |
-
2016
- 2016-12-28 RU RU2016152062A patent/RU2658707C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2104039C1 (ru) * | 1992-05-18 | 1998-02-10 | Нэшнл Ресеч Консил оф Канада | Заменитель живой кожи, способ его получения и способ обработки повреждений живой кожи |
RU2148970C1 (ru) * | 1999-02-26 | 2000-05-20 | Парамонов Борис Алексеевич | Способ восстановления кожного покрова |
CA2499014A1 (en) * | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Agennix Incorporated | Lactoferrin compositions and methods of wound treatment |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MOISENOVICH M.M. et al.Fundamental bases for the use of silk fibroin-based bioresorbable microvehicles as an example of skin regeneration in therapeutic practice//Ter Arkh. 2015;87(12):66-72. * |
ГОСТИЩЕВ В.К. Общая хирургия. Учебник для студентов мед.ВУЗов// М., "Медицина", 1997, с.353. * |
ГОСТИЩЕВ В.К. Общая хирургия. Учебник для студентов мед.ВУЗов// М., "Медицина", 1997, с.353. MOISENOVICH M.M. et al.Fundamental bases for the use of silk fibroin-based bioresorbable microvehicles as an example of skin regeneration in therapeutic practice//Ter Arkh. 2015;87(12):66-72. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2731313C1 (ru) * | 2019-12-24 | 2020-09-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) | Способ восстановления кожного покрова |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210128792A1 (en) | Electrospun matrix and method | |
BR112015017174B1 (pt) | Enxerto de nervo de tecido manipulado para reparo de defeito de nervo periférico e método de preparação do mesmo | |
CN107224617B (zh) | 一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法 | |
Yao et al. | Biomimetic injectable HUVEC‐adipocytes/collagen/alginate microsphere co‐cultures for adipose tissue engineering | |
WO2010003104A2 (en) | Compositions and methods for tissue filling and regeneration | |
US11596714B2 (en) | Methods for development and use of minimally polarized function cell micro-aggregate units in tissue applications using LGR4, LGR5 and LGR6 expressing epithelial stem cells | |
CN111407921A (zh) | 一种医用水凝胶敷料、其制备方法及应用 | |
WO2016140716A1 (en) | Injectable microtissue systems, devices, and methods | |
RU2483756C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА ШЕЛКА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | |
Wei et al. | Biodegradable silk fibroin scaffold doped with mineralized collagen induces bone regeneration in rat cranial defects | |
RU2658707C1 (ru) | Способ восстановления кожного покрова | |
KR20130109850A (ko) | 재조합 인간 골형성 단백질을 활성성분으로 함유하는 피부조직 재생용 키트 | |
RU2644633C1 (ru) | Способ восстановления кожного покрова | |
CN114832156B (zh) | 一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸凝胶 | |
Nashchekina et al. | Distribution of bone-marrow stromal cells in a 3D scaffold depending on the seeding method and the scaffold inside a surface modification | |
RU2616866C1 (ru) | Биорезорбируемый микроноситель для доставки клеток в область заживления и регенерации ран | |
CN110893248A (zh) | 一种表面微突图案化材料及其在体表创伤愈合和伤疤修复中的应用 | |
US20230174932A1 (en) | Novel hydrogel for 3d tissue engineering | |
CN114832149A (zh) | 一种基于干细胞微包埋复合水凝胶的创面敷料及制备方法 | |
Chong | Improving 3D Scaffolds for Skin Tissue Engineering using Advanced Biotechnology | |
JP2010253299A (ja) | 細胞培養用コラーゲン | |
Nojehdehyan et al. | Differentiation of Mouse Stem Cells into Neural Cells on PLGAMicrospheres Scaffold: Differentiation of stem cells | |
NOUZHEH et al. | Differentiation of Mouse Stem Cells into Neural Cells on PLGA Microspheres Scaffold | |
Siriwardane | The extraction of type 1 collagen and the fabrication of multi-filament embedded hydrogels for guided nerve regeneration |