RU2653750C1 - Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli - Google Patents
Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli Download PDFInfo
- Publication number
- RU2653750C1 RU2653750C1 RU2017117549A RU2017117549A RU2653750C1 RU 2653750 C1 RU2653750 C1 RU 2653750C1 RU 2017117549 A RU2017117549 A RU 2017117549A RU 2017117549 A RU2017117549 A RU 2017117549A RU 2653750 C1 RU2653750 C1 RU 2653750C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- streptavidin
- plasmid
- antibiotic
- coli
- vector
- Prior art date
Links
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 title claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 44
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 title claims description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 86
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 33
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 30
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 17
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 15
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 claims description 10
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 7
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 claims description 6
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 claims description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 abstract 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 44
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 9
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000942941 Arabidopsis thaliana DNA ligase 6 Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000186983 Streptomyces avidinii Species 0.000 description 3
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001113309 Bacillus subtilis (strain 168) 50S ribosomal protein L30 Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000837455 Thermus aquaticus DNA polymerase I, thermostable Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина. Настоящий способ предусматривает создание двух плазмид, одна из которых кодирует стрептавидин мутантного типа, а другая – стрептавидин дикого типа, трансформацию указанными плазмидами клеток E.coli, индукцию синтеза стрептавидинов, выделение периплазматической фракции клеток и очистку гетеротетрамерного стрептавидина на аффинном сорбенте. Способ отличается тем, что в одном случае его осуществления стрептавидин дикого типа сцеплен с аффинной меткой, а стрептавидин мутантного типа – с PelB-лидерным пептидом, во втором случае – стрептавидин мутантного типа сцеплен с аффинной меткой, а стрептавидин дикого типа – с PelB-лидерным пептидом. Настоящее изобретение позволяет получать гетеротетрамерный рекомбинантный стрептавидин с высокой эффективностью. 1 н. и 9 з.п. ф-лы, 12 ил., 9 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии, и представляет собой способ получения гетеротетрамерного стрептавидина из периплазматического пространства клетки. Предлагаемый способ включает создание двух плазмид, полученных на базе векторов pET22b+ и рЕТ28а+ и кодирующих мономеры мутантного стрептавидина (не способного связывать биотин) и стрептавидина дикого типа соответственно, и создание штамм-продуцента Е. Coli, обеспечивающего экспрессию генов в клетке. Получение периплазматической фракции клеток бактериального штамма и очистку белка на никель-агарозе. Гетеротетрамерный стрептавидин находит применение в различных методах диагностики заболеваний, к примеру, в таких методах как иммуноферментный анализ и иммуногистохимия.
В настоящее время основным источником стрептавидина является продуцент S. avidinii АТСС 27419, обладающий высокой природной устойчивостью к антибиотикам и требующий длительного времени культивирования. Кроме того, при выделении стрептавидина из S. Avidinii, целевой белок часто загрязнен биотином [Proc. Natl. Acad. Sci. 1980. V. 77. P. 4666-4668; Biochem. Biophys. Methods. 1986. V. 13. P. 103-112; J. Immunol. Methods. 1988. V. 113. P. 83-91].
В международной заявке PCT/US 2006/016480, опубликованной 13 августа 2009 г., предлагается способ экспрессии стрептавидина в питательную среду, что усложняет процесс выделения белка из-за больших объемов питательной среды, прогоняемых через никелевую колонку.
Известен способ получения конструкции экспрессионной плазмиды для наработки стрептавидина в периплазматическом пространстве (pSAV27) [RU 2153535, опуб. 27.07.2000]. Получение плазмиды включает: выделение из S. avidinii M170791 нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид стрептавидина и зрелый белок (прострептавидин) с введением сайтов рестрикции; конструирование высококопийной pSAV27 плазмиды с ампицилиновым маркером; трансформация штамма E.coli JM110 полученной конструкцией; выращивание штамма-продуцента на LB-среде; лизирование полученной биомассы для выделения периплазматической фракции; определение биологической активности стрептавидина путем разделения в ПААГ продуктов связывания стрептавидина с синтетическим биотинилированным олигонуклеотидом. По сравнению с вышеприведенным методом выделения белка из телец включения, данный метод обладает значительным преимуществом. Плазмида pSAV27, несущая последовательность лидерного пептида вместе с нуклеотидной последовательностью гомотетрамерного стрептавидина, селективно экспрессирует белок в периплазматическое пространство, где он локализируется в биологически активном состоянии. Недостаток метода получения стрептавидина, приведенного в патенте RU 2153535, заключается в том, что получаемый в данной работе гомотетрамерный стрептавидин способен связывать четыре молекулы биотина, что впоследствии приводит к конгломерации и потере физиологических свойств транспортируемой молекулы.
Наиболее близким по совокупности существенных признаков к предлагаемому способу является способ получения гетеротетрамерного стрептавидина, описанный в патенте США US 8586708 В2. Авторы предлагают получать моновалетный стрептавидин в несколько этапов: на первом этапе происходит создание двух плазмид, кодирующих мономеры мутантного стрептавидина и стрептавидина дикого типа, затем данными конструкциями трансформируются разные клетки E.coli и трансформаты раздельно культивируются в питательной среде при 37°С. Индукция синтеза белка происходит за счет добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида. На втором этапе происходит раздельное выделение мутантного (не способного связывать биотин) и стрептавидина дикого типа (способного связывать биотин) из телец включения клеток Е. Coli. На третьем этапе производят денатурацию стрептавидинов в 6М Gu-HCl для получения мономеров стрептавидина обоих типов, смесь мутантного и стрептавидина дикого типа предлагают смешивать в соотношении 3:1 соответственно, и на заключительном этапе производят ренатурацию полученного белка в ФБР (фосфатный буферный раствор). Получившийся белок концентрируют осаждением с использованием сульфата аммония и затем подвергают двукратному диализу против ФБР для очистки стрептавидина дикого типа от биотина. Затем гетеротетрамерный стрептавидин выделяют на никель-агарозной колонке. Метод получения гетеротетрамерного белка, приведенный в патенте США US 8586708 В2, обладает рядом недостатков: данный процесс является трудоемким и ресурсозатратным, происходит снижение выхода целевого белка и необратимая потеря биологических свойств белка. Это приводит к повышению себестоимости стрептавидина. Причина данных недостатков заключается в наличии дополнительных стадий выделения, денатурации и ренатурации гомотетрамеров белка для получения гетеротетрамерного стрептавидина.
Технической проблемой, решаемой изобретением, является создание такого способа получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli, который бы позволил снизить себестоимость целевого белка без потери биологических свойств молекул.
Техническим результатом является повышение эффективности процесса получения гетеротетрамерного стрептавидина, состоящего одновременно из мономеров мутантного стрептавидина и стрептавидина дикого типа, за счет исключения дополнительных стадий выделения и денатурации-ренатурации белка.
Предлагается создавать две генетические конструкции, одна из которых кодирует мономер мутантного стрептавидина, а другая мономер стрептавидина дикого типа. Данными конструкциями трансформируют одни и те же клетки E. coli, что позволяет получить целевой гетеротетрамер непосредственно в клетке, минуя дополнительные стадии выделения и денатурации-ренатурации белка in vitro.
Таким образом, технический результат достигается за счет того, что в способе получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E. coli, включающем создание двух плазмид, обеспечивающих экспрессию стрептавидинов, трансформацию полученными плазмидами клеток E. coli, культивирование клеток в культуральной среде, индукцию синтеза стрептавидинов изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом, выделение стрептавидина из периплазматического пространства и очистку гетеротетрамерного стрептавидина на аффинном сорбенте,
предлагается
- в качестве первой плазмиды на базе исходного вектора создавать плазмиду, обеспечивающую экспрессию стрептавидина дикого типа, сцепленного с аффинной меткой и имеющую ген устойчивости к антибиотику группы аминогликозидов,
- в качестве второй плазмиды на базе исходного вектора создавать плазмиду, обеспечивающую экспрессию мутантного стрептавидина, сцепленного с pelB-лидерным
пептидом и не способного к связыванию биотина, имеющую ген устойчивости к антибиотику пенициллинового ряда,
- проводить трансформацию одних и тех же клеток E. coli двумя указанными плазмидами, с последующим культивированием этих трансформированных клеток в культуральной среде, содержащей одновременно антибиотик пенициллинового ряда и антибиотик группы аминогликозидов,
или предлагается
- в качестве первой плазмиды на базе исходного вектора создавать плазмиду, обеспечивающую экспрессию мутантного стрептавидина, сцепленного с аффинной меткой и не способного к связыванию биотина, имеющую ген устойчивости к антибиотику группы аминогликозидов,
- в качестве второй плазмиды на базе исходного вектора создавать плазмиду, обеспечивающую экспрессию стрептавидина дикого типа, сцепленного с pelB-лидерным пептидом, имеющую ген устойчивости к антибиотику пенициллинового ряда,
- проводить трансформацию одних и тех же клеток E. coli двумя указанными плазмидами, с последующим культивированием этих трансформированных клеток в культуральной среде, содержащей одновременно антибиотик пенициллинового ряда и антибиотик группы аминогликозидов.
Дополнительными отличиями предлагаемого способа являются:
- в качестве аффинного сорбента предпочтительно использовать никель-агарозу;
- в качестве антибиотика группы аминогликозидов предпочтительно использовать ампициллин;
- в качестве антибиотика пенициллинового ряда предпочтительно использовать канамицин;
- в качестве вектора для первой плазмиды может быть использован вектор рЕТ28а+;
- в качестве вектора для второй плазмиды может быть использован вектор pET22b+;
- в качестве штамма для трансформации клеток E. coli может быть использован штамм E. coli BL21(DE3);
- мутантный стрептавидин, не способный к связыванию биотина, или стрептавидин дикого типа сцеплен с пептидом слияния;
- в качестве пептида слияния используют ТАТ-пептид;
- в качестве аффинной метки предпочтительно использовать олигогистидиновую последовательность.
Сущность изобретения поясняется следующими фигурами.
На фиг. 1 приведено схематичное изображение процесса синтеза моновалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. На фиг. 2 приведено схематичное изображение процесса синтеза бивалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. На фиг. 3 приведено схематичное изображение процесса синтеза тетравалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. На фиг. 4 приведено схематичное изображение процесса синтеза гомотетрамера стрептавидина дикого типа с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. На фиг. 5 приведено схематичное изображение процесса синтеза гомотетрамеров мутантного стрептавидина в штамме Е. coli. На фиг. 6 схематично показано как эндонуклеазы рестрикции NcoI и XhoI режут вектор pET22b(+) с образованием двух «липких концов». На фиг. 7 схематично показан процесс получения продуктов SAD с использованием олигонуклеотидов f-SA-NCO и r-SA-stop-XHO. Черным цветом на схеме обозначена нуклеотидная последовательность SAD. Справа на схеме обозначен конечный продукт амплификации - SAD. На фиг. 8 схематично показан процесс лигирования конструкции pEP22b(+)/NcoI/XhoI и амплификатов SAD. Черным цветом обозначена нуклеотидная последовательность SAD. На фиг. 9 схематично показан процесс разрезания вектора pET28a(+)эндонуклеазами рестрикции.
На фиг. 10 схематично представлен процесс получения ПЦР-продукта SAA с использованием олигонуклеотидов f-SA-XBA и f-SA-ХНО. Черным цветом на схеме обозначена нуклеотидная последовательность SAA. Справа на схеме обозначен конечный продукт амплификации - SAA.
На фиг. 11 схематично представлен процесс лигирования конструкции pEP22a(+)/XbaI/XhoI и амплификатов SAA. Черным цветом обозначена нуклеотидная последовательность SAA.
На фиг. 12 схематично представлен процесс лигирования конструкции pEP28a(+)-SAA/XbaI и амплификатов нуклеотидной последовательности, кодирующих ТАТ-белок. Черным цветом обозначена нуклеотидная последовательность SAA. Серым цветом обозначена нуклеотидная последовательность ТАТ-пептида.
Краткое описание рисунков.
Фиг. 1 Схематичное изображение процесса синтеза моновалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. В начале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина (Позиции 1,2,3), сцепленных с PelB-лидерым пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа (позиция 4), сцепленных с ТАТ-пептидом (белок вируса иммунодифециты человека) и олигогистидиновой последовтаельностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров белка в цитоплазме клетке (позиция 5) и транспортировка данного тетерамера в периплазму клетки, где PelB-лидерный пептид отщепляется протеиназами клетки (позиция 6).
Фиг. 2 Схематичное изображение процесса синтеза бивалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. Вначале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина (Позиции 1, 2), сцепленных с PelB-лидерным пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа (позиция 3, 4), сцепленных с ТАТ-пептидом(белок вируса иммунодифецита человека) и олигогистидиновой последовательностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров белка в цитоплазме клетке (позиция 5) и транспортировка данного тетрамера в периплазму клетки, где PelB-лидерный пептид отщепляется протеиназами клетки (позиция 6).
Фиг. 3 Схематичное изображение процесса синтеза тетравалентного стрептавидина с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. Вначале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина (Позиции 2), сцепленных с PelB-лидерным пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа (позиция 1, 3, 4), сцепленных с ТАТ-пептидом(белок вируса иммунодифецита человека) и олигогистидиновой последовательностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров белка в цитоплазме клетке (позиция 5) и транспортировка данного тетерамера в периплазму клетки, где PelB-лидерный пептид отщепляется протеиназами клетки (позиция 6).
Фиг. 4 Схематичное изображение процесса синтеза гомотетрамера стрептавидина дикого типа с ТАТ-пептидом в штамме Е. coli. Вначале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина(на фиг. не показаны), сцепленных с PelB-лидерным пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа(позиция 1, 2, 3, 4), сцепленных с ТАТ-пептидом(белок вируса иммунодифецита человека) и олигогистидиновой последовательностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров стрептавидина дикого типа в цитоплазме клетке (позиция 5). Данный тетерамер не имеет в своем составе мутантный стрептавидин, несущий на себе PelB-лидерный пептид, в связи с чем транспорт тетрамеров данной конструкции в периплазму осуществляться не будет. Таким образом удается in vivo очистить гетеротетрамеры белка от нецелевого гомотетрамера стрептавидина.
Фиг. 5 Схематичное изображение процесса синтеза гомотетрамеров мутантного стрептавидина в штамме Е. coli. Вначале происходит экспрессия генов сконструированных ДНК плазмид, обеспечивающих синтез мономеров мутантного стрептавидина (Позиция 1, 2, 3, 4), сцепленных с PelB-лидерным пептидом (белок-транспортер в периплазму) и мономеров стрептавидина дикого типа(на фиг. не показаны), сцепленных с ТАТ-пептидом(белок вируса иммунодефицита человека) и олигогистидиновой последовательностью. Затем происходит тетрамеризация мономеров мутантного стрептавидина в цитоплазме клетке (позиция 5) и транспортировка данного тетрамера в периплазму клетки, где PelB-лидерный пептид отщепляется протеиназами клетки (позиция 6). Данный тетрамер не имеет в своем составе стрептавидина дикого типа, несущего на себе олигогистидиновую последовательность, в связи с чем тетрамеры данной конструкции не возможно будет выделить из периплазматической фракции на никель-агарозном сорбенте. Таким образом, удается очистить гетеротетрамеры белка от нецелевого гомомтетрамера стрептавидина.
Предлагаемый способ получения гетеротетрамерного стрептавидина включает в себя несколько стадий:
- создание плазмиды pET22b+-SAD, обеспечивающей экспрессию мутантного стрептавидина, сцепленного с pelB лидером, осуществляющим транспорт гетеротетрамерного белка в периплазму;
- создание плазмиды pET22a+-SAA-TAT, обеспечивающей экспрессию стрептавидина дикого типа, сцепленного с олигогистидиновой последовательностью и ТАТ-белком вируса иммунодефицита человека;
- трансформация штамма E.coli BL21(DE3) конструкциями pET22b+-SAD и pET22b+-SAA-TAT, с последующим культивированием данного штамма в LB-среде;
- выделение гетеротетрамерного стрептавидина из периплазматического пространства на никель-агарозном сорбенте;
- подтверждение наличия белка в пробах с помощью электрофоретического разделения белка в денатурирующих условиях; проверка способности стрептавидина связывать биотин с помощью метода иммуноблоттинга.
Пример 1. Создание плазмиды pET22b+-SAD
Для создания плазмиды, кодирующий нуклеотидную последовательность мутантного стрептавидина, был использован исходный вектор pET22b(+) [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Edition], содержащий ген устойчивости к ампициллину и нуклеотидную последовательность pe1B-лидерного пептида [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Edition], необходимого для направленного транспорта белка в периплазму. Для наработки исходного вектора pET22b(+) был использован штамм E.coli DH5(α). К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+). Затем инкубировали во льду 15 минут. Для осуществления теплового шока суспензию клеток инкубировали в течение 5 минут при 42°С на водяной бане, с последующей инкубацией во льду 2 минуты. К суспензии добавили 900 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С. Клетки высевали на чашки, содержащие агаризованную LB-среду с ампициллином (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 37°. Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовали для выделения плазмидной ДНК фенол-хлороформным методом. Супернатант сливали, остаток клеток ресуспендировали в 4 мл среды и осаждали центрифугированием, затем супернатант снова сливали. Добавляли по 200 мкл раствора I в каждую пробирку. Раствор I имеет следующий состав: 50 мМ глюкозы, 25 мМ TrisHCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0. Смесь ресуспендировали на вортексе и добавляли по 400 мкл раствора II, следующего состава: 0.2Н NaOH, 1% SDS. Получившуюся суспензию перемешивали быстрым переворачиванием в течение 5 минут и добавляли по 300 мкл раствора III (5М CH3COOK, 11.5% СН3СООН), несколько раз переворачивали и инкубировали во льду в течение 5 минут. Клетки осаждали центрифугированием и отбирали по 600 мкл суспензии и переносили в чистые эппендорфы и затем добавляли по 600 мкл изопропилового спирта (-20°С). Затем суспензию инкубировали при - 20°С в течение 10 минут и осаждали центрифугированием. Спирт сливали и осадок высушивали. Растворяли осадок в 200 мкл воды. Добавляли 250 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1) и перемешивали. Суспензию осаждали центрифугированием, супернатант отбирали и добавляли 250 мкл смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) и перемешивали. Суспензию осаждали центрифугированием. Получившийся супернатант отбирали, добавляли 2.5 объема 96% этилового спирта и инкубировали при -20°С в течение 30 минут. Затем осаждали центрифугированием, спирт сливали и добавляли 1 мл 70% этилового спирта. Затем смесь осаждали центрифугированием, спирт сливали. Высушивали осадок до исчезновения запаха спирта. Осадок растворяли в 200 мкл воды. Полученную плазмидную ДНК разделяли в 0.8% агарозном геле. Состав геля: 0.8% агароза, 0.5х ТВЕ буфер, 1 мкг/мл этидиум бромид. Состав буфер для образцов: 30%-ный глицерин (v/v), 0.025%-ный ксиленцианол (w/v), 0.025%-ный бромфеноловый синий (w/v). Электродный буфер: 0.5х буфер ТВЕ Состав 10х буфера ТВЕ: 890 мМ Tris, 890 мМ борная кислота (рН 8.0), 20М EDTA. Для приготовления геля смесь компонентов прогревали до полного растворения агарозы, после чего охлаждали до 50°С, добавляли бромид этидия до концентрации 0.5 мг/мл и заливали на горизонтальную платформу размером 80×110 мм. Толщина геля составляла 5 мм. Напряженность электрического поля составляла 5 В/см В качестве маркеров использовали коммерческие маркеры 250-10000 п.н. («Медиген»). Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием специального набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США). - удалить все
Для вставки нуклеотидной последовательности мутантного стрептавидина (SAD) в исходную плазмиду использовались «липкие концы», получаемые за счет обработки вектора эндонуклеазми рестрикции NcoI и XhoI (фиг. 6). Под мутантным стрептавидином подразумевается стрептавидин, не способный связывать биотин.
pET22b(+): 22 мкл
NcoI 2,5 мкл, XhoI 2,5 мкл,
10Хбуфер 6 мкл,
Н2О 27 мкл
После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергался электрофоретическом разделению в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием специального набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Для наработки необходимого количества нуклеотидной последовательности SAD проводилась ПЦР с использованием специально подобранных олигонуклеотидов.
В качестве матрицы для наработки нуклеотидной последовательности использовалась плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность мутантного стрептавидина [Biochem Biophys Res Commun. 2015 Aug 7; 463(4): 1059-1063]. Для получения нуклеотидной последовательности нами были подобраны специальные олигонуклеотиды:
f-SA-NCO: 5'-ctgccatggctgaagctggtatcacc - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для NcoI и последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина
r-SA-stop-XHO: 5'-ctgctcgagtcattoggaagcagcggacggtt - с сайтом рестрикции XhoI, стоп кодоном перед олигогистидиновой последовательностью и последовательностью комплементарной последовательности гена стрептавидина.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась в реакционной смеси конечным объемом 30 мкл. Состав реакционной смеси: Олигонуклеотиды (прямой и обратный) по 10 пМоль, Буфер для Taq-полимеразы x1, (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 6 нМоль, MgCl2 50 нМоль, Taq-полимераза 1 единица. ПЦР проводилась в микроцентрифужных пробирках объемом 0.5 мл на аппарате «Терцик» (Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР. Была проведена амплификация нуклеотидных последовательностей методом ПЦР. Температурный профиль ПЦР: 5 минут 95°С, 1 минута 95°С (денатурация), 1 минута 30 циклов, 1 минута 72°С (достройка), 5 минут 72°С.
Схема получения продукта SAD представлена на фиг. 7.
Встраивание нуклеотидной последовательности SAD в плазмиду pET22b(+) производилось следующим способом. Полученные продукты амплификации нуклеотидной последовательности SAD обрабатывались эндонуклеазами рестрикции XhoI и NcoI. Состав реакционной смеси для NcoI и XhoI (V=60 мкл, , 1 час):
нуклеотидная последовательность SAD: 35 мкл
NcoI 2,5 мкл, XhoI 2,5 мкл,
10Хбуфер 6 мкл,
Н2О 16 мкл
Таким образом, нами была подготовлена плазмида pET22b(+)/NcoI/XhoI и продукты амплификации нуклеотидной последовательности SAD, имеющие идентичные липкие концы. Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности SAD смешивались с подготовленным вектором и затем литеровались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/20. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10 мкл.): нуклеотидная последовательность SAD 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Литерование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция названная нами pEP22b(+)-SAD, кодирующая белок SAD с PelB-лидерным пептидом. Схема создания данных конструкций представлена на фиг. 8.
Отбор колоний, содержащих плазмиды со вставкой нуклеотидной последовательности SAD, производился следующим образом. Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SAD и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик ампициллин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к ампициллину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET22b(+)-SAD, выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием при 4000 об/мин на центрифуге К23 при 4°С в течение 30 минут и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции дополнительно проверялась с помощью секвенирования по Сэнгеру [J.Mol.Biol. 1975. V. 94. Р. 441-446].
Пример 2. Создание плазмиды pET28a+-SAA-TAT
Для создания плазмиды, кодирующий нуклеотидную последовательность стрептавидина дикого типа, был использован исходный вектор рЕТ28а(+) [Novagen, рЕТ System Manual, 11th Edition], содержащий ген устойчивости к канамицину и олигогистидиновой последовательностью, необходимую для последующей очистки целевого белка на никель-агарозном сорбенте. Для наработки исходного вектора рЕТ28а(+) был использован штамм E.coli DH5(α). К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК рЕТ28а(+) и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Клетки E.coli DH5(α), трансформированные рЕТ28а(+), выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте. Полученную плазмидную ДНК разделяли в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Для вставки фрагментов нуклеотидной последовательности стрептавидина дикого типа (SAA) в исходную плазмиду, использовались «липкие концы», получаемые за счет обработки вектора эндонуклеазмами рестрикции XbaI и XhoI (Фиг. 9).
Реакционная смесь рестрикции имела следующий состав: состав реакционной смеси для XbaI и XhoI (V=60 мкл, t0=370С, 1 час):
рЕТ28а(+): 22 мкл
XbaI 2,5 мкл,
XhoI 2,5 мкл,
10Хбуфер 6 мкл,
Н2О 27 мкл
После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергался электрофоретическом разделению в 0.8% агарозном геле с использованием протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США).
Для наработки необходимого количества нуклеотидной последовательности SAA проводилась ПЦР с использованием специально подобранных олигонуклеотидов.
В качестве матрицы для наработки нуклеотидной последовательности использовалась плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность стрептавидина дикого типа [J Chromatogr А. 1994 Aug 5; 676(2): 337-45]. Для получения нуклеотидной последовательности SAA нами были подобраны специальные олигонуклеотиды:
f-SA-XBA: 5'-ctgtctagactgaagctggtatcacc - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для XbaI и последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина
r-SA-XHO: 5'-ctgctcgagggaagcagcggacggtt - олигонуклеотид с сайтом рестрикции для XhoI, последовательностью, комплементарной последовательности гена стрептавидина
Схема получения продукта SAA представлена на фиг. 10.
Встраивание нуклеотидной последовательности SAA в плазмиду рЕТ28а(+) проводилось следующим способом. Полученные продукты амплификации SAA предварительно обрабатывались эндонуклеазмами рестрикции XhoI и XbaI. Состав реакционной смеси для XbaI и XhoI (V=60 мкл, , 1 час):
нуклеотидная последовательность SAA: 35 мкл
XbaI 2,5 мкл, XhoI 2,5 мкл,
10Хбуфер 6 мкл,
Н2О 16 мкл
Таким образом, нами были подготовлены плазмида pET28a(+)/XbaI/XhoI и продукты амплификации нуклеотидной последовательности SAA, имеющие идентичные липкие концы. Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности SAA смешивались с подготовленным вектором и затем лигировались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/20. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10 мкл.): нуклеотидная последовательность SAA 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Лигирование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция условно названная нами pEP28a(+)-SAA, экспрессирующая ген SAA, сцепленный с олигогистидиновой последовательностью. Схема создания данных конструкций представлена на фиг. 11.
Отбор колоний, содержащих плазмиды со вставкой нуклеотидной последовательности SAA, производился следующим способом. Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SAA и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик канамицин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к канамицину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET28a(+)-SAA, выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием при 4000 об/мин на центрифуге К23 при 4°С в течение 30 минут и использовали для выделения плазмидной ДНК методом подробно изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции дополнительно проверялась с помощью секвенирования по Сэнгеру [J.Mol.Biol. 1975. V. 94. Р. 441-446].
Встраивание нуклеотидной последовательности, кодирующей ТАТ-пептид в плазмиду pEP28a(+)-SAA производилось следующим способом. Полученный ранее вектор подготавливали к вставке нуклеотидной последовательности ТАТ-пептида. Для этого вектор подвергался рестрикции по сайту XbaI. Состав реакционной смеси для XbaI (V=60 мкл,
t0=370C, 1 час):
pET28a(+)-SAA: 22 мкл
XbaI 4 мкл,
10Хбуфер 6 мкл,
H2O 28 мкл
После процедуры гидролиза, получившийся линейный вектор подвергался электрофоретическом разделению в 0.8% агарозном геле с использование протокола, указанного выше в тексте. Очистка плазмиды из агарозного геля проводилась с использованием набора фирмы Promega (WizardSV Gel and PCR Clean-Up System, США)..
Необходимое для вставки в плазмиду количество нуклеотидной последовательности ТАТ-пептида, было получено с помощью метода, подробно изложенного в статье [J Drug Target. 2012 Sep; 20(8): 678-690]. Продукты амплификации нуклеотидной последовательности ТАТ-пептида предварительно обрабатывались эндонуклеазой рестрикции Xbal.
Реакционная смесь для XbaI_(V=60 мкл, t0=370C, 1 час): нуклеотидная последовательность ТАТ: 35 мкл
XbaI 4 мкл,
10Хбуфер 6 мкл,
Н2О 15 мкл
Продукты рестрикции нуклеотидной последовательности ТАТ-пептида смешивались с подготовленным вектором и затем лигировались. Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/100. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Состав реакционной смеси (объем пробы составлял 10 мкл.): нуклеотидная последовательность ТАТ-пептида 65 нг (4 мкл), Лигаза 1 мкл, Лигазный буфер 1 мкл, Плазмида 40 нг (4 мкл). Лигирование проводили в течение 16 часов при температуре +4°С. В результате была получена генетическая конструкция условно названная нами pEP28a(+)-SAA-TAT, экспрессирующая нуклеотидную последовательность SAA, сцепленную с нуклеотидной последовательностью ТАТ-пептида. Схема создания данных конструкций представлена на фиг. 12.
Полученной лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма DH5(α) E.coli. К 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5(α) добавили от 100 до 300 нг плазмидной ДНК pET22b(+)-SAA-TAT и далее проводили трансформацию с помощью аналогичного метода, изложенного выше. Трансформанты были высеяны на чашку Петри с агаризованной LB средой, в состав которой входил антибиотик канамицин. Таким образом, на селективной среде выросли клетки, резистентные к канамицину, содержащие плазмиды - продукты лигирования.
Клетки E.coli DH5(α), трансформированные pET28a(+)-SAA-TAT, выращивались при 37°С в условиях аэрации, осаждались центрифугированием и использовались для выделения плазмидной ДНК, изложенным выше в тексте.
Для проверки вставки с помощью ПЦР было выбрано несколько колоний. Нуклеотидная последовательность целевой генетической конструкции проверялась с помощью секвенирования по Сэнгеру [J.Mol.Biol. 1975. V. 94. Р. 441-446].
Пример 3. Трансформация штамма E.coli BL21(DE3) конструкциями pET22b+-SAD и pET22b+-SAA-TAT
Полученные конструкции pET22b(+) -SAA-TAT и pET22b+-SAD были использованы для трансформации клеткок E.coli BL21(DE3). К 100 мкл компетентных клеток E.coli BL21(DE3) добавили от 100 нг плазмидной ДНК pET22b(+) -SAA-TAT и pET22b(+)-SAD. Затем инкубировали во льду 15 минут. Для осуществления теплового шока суспензию клеток инкубировали в течение 5 минут при 42°С на водяной бане, с последующей инкубацией во льду 2 минуты. Добавляли 900 мкл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С. Клетки высевали на чашки, содержащие агаризованную LB-среду с ампицилином (100 мкг/мл) и канамицином (50 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 37°.
Пример 4. Культивирование штамма E.coli BL21(DE3)/pET28a(+) -SAA-ТАТ/ pET22b+-SAD.
Полученные трансформаты E.coli BL27(DE3)/рЕТ28а(+) -SAA-ТАТ/ pET22b+-SAD засевали в 10 мл LB-среды с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и канамицина (50 мкг/мл) растили в течение ночи при 37°С при постоянном покачивании. Утром инокулят переливали в 500 мл LB-среды. Для селекции трансформированных обеими плазмидами клеток производилось добавление антибиотика ампицилина и канамицина (в расчете 100 мкг и 50 мкг соответственно на 1 мл среды). Клетки выращивали при 37°С в условиях аэрации до плотности А600=0.6-1. Синтез белка индуцировали добавлением IPTG (0,5 ммоль/л), культивирование продолжали в течение ночи при 26°С.
Пример 5. Выделение белка из периплазматической фракции E.coli BL21(DE3).
После отделения бактериальных клеток путем центрифугирования в течение 15 минут при 10000 g, периплазматическую фракцию получали методом «осмотического шока» [Current Protocols in Molecular Biology. 1989. John Wiley & Sons, New York]. Гетеротетрамеры стрептавидина были аффинно очищены на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте (Sigma). Для этого к полученному содержимому периплазмы бактерий добавляли фенилметилсульфонилфторид и имидазол (конечная концентрация 1 mM и 10 тМ соответственно). Раствор фильтровали через металл-хелатный сорбент. Балластные белки отмывали 0,5 м раствором NaCl на 0,1 М К-фосфатном буфере, рН=8,0, содержащем 20 мМ имидазола. Далее белок элюировали 0,15 М NaCl, рН=7,4, содержащем 200 мМ имидазола.
Пример 6. Электрофоретическое разделение белка в SDS-электрофорезе.
Содержащие белок фракции анализировали при помощи электрофоретического разделения. Электрофоретическое разделение белков осуществляли в 12% полиакриламидном геле 9*9 см при градиенте напряжения 20 В/см в разделяющем геле следующего состава: 12% акриламид/метиленбисакриламид 29:1, 37 мМ Tris-HCl, рН=9,2, 0,01% персульфат аммония, 0,001% тетраметилэтилендиамин с использованием электродного буфера, содержащего 0,125 М Tris-HCl, рН=6,8.
Образцы смешивались в соотношении 4:1 с буфером, состоящим из 0.3 М TrisHCl, рН 6.8, 30% глицерина и 0.025%) бромфенолового синего. Для проведения электрофоретического анализа белков в ПААГ в денатурирующих условиях в состав гелей, электродного буфера и буфера для образцов добавлялся ДСД до конечной концентрации 0.1%. В буфер для образцов добавляли 5% меркаптоэтанол и прогревали смесь с белками в течение 10 минут при 100°С.
Для проведения электрофоретического разделения белков использовалась Электрофоретическая установка с блоком питания фирмы Эльф-4.
Наличие белка в пробах подтверждалось с помощью следующего эксперимента. В соседние лунки на геле наносили пробы с предварительным кипячением при 100°С и с добавлением меркаптоэтанола и пробы без предварительного кипячения. Тетрамер белка стрептавинида имеет молярную массу примерно 60 кДа и дает бенд на геле в соответствующем для этой молекулярной массе месте. При кипячении тетрамерная структура данного белка разрушается, и он распадается на мономеры, дающие бенды на геле в области молекулярных масс равных 15 кДа. Наличие бендов в указанных областях молекулярных масс одновременно, а именно в области 60 кДа в случае нанесения проб без кипячения и в области 15 кДа в случае нанесения проб с кипячением, говорит о присутствии белка стрептавидина в пробе. Таким образом, с помощью данного эксперимента удалось подтвердить наличие белка стрептавидина в пробах, выделенных из периплазматической фракции.
Пример 9. Проверка активности белка методом иммуноблоттинга.
Для проверки полученного гетеротетрамерного стрептавидина на способность связывать биотин был использован метод иммуноблоттинга. На нитроцеллюлозный фильтр 1×1 см или 2×2,5 см наносили по 1 мкл гетеротетромеров стрептавидина. «Окраску» нитроцеллюлозного фильтра осуществляли с использованием следующих растворов:
Раствор I: 3% обезжиренное молоко («Sigma», США) на
ФБР (профильтрованное).
Раствор II: Разведенный в 3 раза раствор I.
Раствор III: 6 мг 4-хлор-1-нафтола, 2 мл 96% этанола, до 12 мл ФБР, 6 мкл 3033% перекиси водорода.
Инкубировали нитроцеллюлозный фильтр в растворе I в течение 30 минут при постоянном покачивании при комнатной температуре. Затем инкубировали с биотинилированной пероксидазой в растворе I в течение 1 часа при покачивании при комнатной температуре и отмывали 3 раза по 5 минут раствором II.
Далее инкубировали в течение 1 часа при покачивании при комнатной температуре со вторыми антителами, стрептавидином конъюгированным с пероксидазой хрена («ICN», США). Необходимое количество вторых антител рассчитывали исходя из протокола фирмы-производителя. Нитроцеллюлозный фильтр отмывали трижды по 5 минут ФБР и окрашивали раствором III.
С помощью данного эксперимента удалось подтвердить наличие активного стрептавидина в пробах.
Claims (18)
1. Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E. coli, включающий создание двух плазмид, обеспечивающих экспрессию стрептавидинов, трансформацию полученными плазмидами клеток E.coli, культивирование клеток в культуральной среде, индукцию синтеза стрептавидинов изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом, выделение стрептавидина из периплазматического пространства и очистку гетеротетрамерного стрептавидина на аффинном сорбенте,
отличающийся тем, что
в качестве первой плазмиды на базе исходного вектора создают плазмиду, обеспечивающую экспрессию стрептавидина дикого типа, сцепленного с аффинной меткой, и имеющую ген устойчивости к антибиотику группы аминогликозидов,
в качестве второй плазмиды на базе исходного вектора создают плазмиду, обеспечивающую экспрессию мутантного стрептавидина, сцепленного с pelB-лидерным пептидом и не способного к связыванию биотина, имеющую ген устойчивости к антибиотику пенициллинового ряда,
проводят трансформацию одних и тех же клеток E. coli двумя указанными плазмидами с последующим культивированием этих трансформированных клеток в культуральной среде, содержащей одновременно антибиотик пенициллинового ряда и антибиотик группы аминогликозидов,
или отличающийся тем, что
в качестве первой плазмиды на базе исходного вектора создают плазмиду, обеспечивающую экспрессию мутантного стрептавидина, сцепленного с аффинной меткой и не способного к связыванию биотина, имеющую ген устойчивости к антибиотику группы аминогликозидов,
в качестве второй плазмиды на базе исходного вектора создают плазмиду, обеспечивающую экспрессию стрептавидина дикого типа, сцепленного с pelB-лидерным пептидом, имеющую ген устойчивости к антибиотику пенициллинового ряда,
проводят трансформацию одних и тех же клеток E. coli двумя указанными плазмидами с последующим культивированием этих трансформированных клеток в культуральной среде, содержащей одновременно антибиотик пенициллинового ряда и антибиотик группы аминогликозидов.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аффинного сорбента используют никельагарозу.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве антибиотика группы аминогликозидов используют ампициллин.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве антибиотика пенициллинового ряда используют канамицин.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве вектора для первой плазмиды может быть использован вектор рЕТ28а+.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве вектора для второй плазмиды может быть использован вектор pET22b+.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве штамма для трансформации клеток E.coli используют штамм E. coli BL21(DE3).
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мутантный стрептавидин, не способный к связыванию биотина, или стрептавидин дикого типа сцеплен с пептидом слияния.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что в качестве пептида слияния используют ТАТ-пептид.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве аффинной метки используют олигогистидиновую последовательность.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017117549A RU2653750C1 (ru) | 2017-05-19 | 2017-05-19 | Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017117549A RU2653750C1 (ru) | 2017-05-19 | 2017-05-19 | Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2653750C1 true RU2653750C1 (ru) | 2018-05-14 |
Family
ID=62152980
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017117549A RU2653750C1 (ru) | 2017-05-19 | 2017-05-19 | Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2653750C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2728652C1 (ru) * | 2019-08-05 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" (ФИЦ КНЦ СО РАН, КНЦ СО РАН) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-SAV, обеспечивающая синтез полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент растворимого полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2153535C1 (ru) * | 1999-05-14 | 2000-07-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii |
US20070099248A1 (en) * | 2005-10-28 | 2007-05-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Monovalent streptavidin compositions |
-
2017
- 2017-05-19 RU RU2017117549A patent/RU2653750C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2153535C1 (ru) * | 1999-05-14 | 2000-07-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii |
US20070099248A1 (en) * | 2005-10-28 | 2007-05-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Monovalent streptavidin compositions |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SANO T. et al. Molecular engineering of streptavidin. Annals of the New York Academy of Sciences, 1996. YUMURA K. et al. Mutations for decreasing the immunogenicity and maintaining the function of core streptavidin. Protein Science, 2013. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2728652C1 (ru) * | 2019-08-05 | 2020-07-30 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" (ФИЦ КНЦ СО РАН, КНЦ СО РАН) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-SAV, обеспечивающая синтез полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент растворимого полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Mierendorf et al. | Expression and purification of recombinant proteins using the pET system | |
KR100270195B1 (ko) | 겔로닌 폴리펩타이드를 암호화하는 dna 서열 | |
CN113728098A (zh) | 具有ruvc结构域的酶 | |
WO2021179860A1 (zh) | 利用枯草芽孢杆菌和核酸内切酶制备人碱性成纤维细胞生长因子 | |
Baty et al. | Extracellular release of colicin A is non‐specific. | |
JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
HU193504B (en) | Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens | |
US5089406A (en) | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences | |
CN113136374B (zh) | 一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用 | |
US8008016B2 (en) | Vectors and methods for high throughput co-expressions | |
RU2653750C1 (ru) | Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli | |
KR910000461B1 (ko) | L-페닐알라닌 암모니아리아제의 아미노산배열, l-페닐알라닌 암모니아리아제의 구조유전자, 이것을 함유하는 신규의 dna배열, 이것을 함유하는 신규의 조환형 dna 플라스미드, 이것에 의해 형성되는 형질전환체 및, 이것을 사용한 l-페닐알라닌의 제조방법 | |
KR910001810B1 (ko) | L-페닐알라닌 암모니아-리아제의 발현용 조환형 플라스미드 및 이를 함유하는 형질전환주 | |
CN118176302A (zh) | 一种纯化单链dna的方法 | |
EP1981978B1 (en) | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins | |
WO1988005082A1 (en) | Microbial production of peptide oligomers | |
KR102152142B1 (ko) | Cas10/Csm4를 이용한 사이클릭 올리고아데닐레이트 제조방법 | |
CN114736309A (zh) | 一种基于离心法的寡肽合成及纯化方法 | |
EP0109428B1 (en) | Cloning vector with indicator genes which have been inactivated by frameshift | |
CN113832127A (zh) | 一种限制性内切酶BamHⅠ的突变体及其应用 | |
RU2593172C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TA1 GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА α1 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА | |
KR910001811B1 (ko) | 배지의 당분농도제어에 의한 외래유전자 발현제어방법 및 그에 따른 외래유전자 산물의 생산방법 | |
JPS62502656A (ja) | Dna配列体 | |
CN115873811B (zh) | 一种pbcv-1连接酶突变体、表达纯化方法及应用 | |
JPH0928380A (ja) | ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190520 |