RU2652884C1 - Strain of chinese hamster ovary cells cho-epo 4a9 - producer of highly sialylated erythropoethin - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the recombinant production of human proteins, and can be used to produce recombinant human erythropoietin. As a producer of recombinant highly sialylated human erythropoietin, a strain of Chinese hamster ovary cells CHO-EPO 4A9 deposited with number RKKK(P) 767 D is used.

EFFECT: recombinant erythropoietin produced by this producer strain is characterized by a high degree of sialification, which allows to significantly increase the yield of the target product in the production of erythropoietin substance.

1 cl, 1 dwg, 2 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения рекомбинантного эритропоэтина.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a technology for the production of recombinant erythropoietin.

Эритропоэтин - это гормон гликопротеиновой природы, стимулирующий эритропоэз, т.е. пролиферацию клеток-предшественников эритроидного ряда в костном мозге и созревание эритроцитов. (https://ru.wikipedia.org/wiki/Эритропоэтин). Лекарственные препараты на основе рекомбинантного эритропоэтина с успехом применяются для лечения дефицита эритроцитов, прежде всего, у пациентов с анемиями на фоне хронических заболеваний почек, при которых наблюдается дефицит эндогенной продукции эритропоэтина, а также у больных с онкологическими заболеваниями, у которых анемия связана с побочным действием цитостатической терапии.Erythropoietin is a hormone of a glycoprotein nature that stimulates erythropoiesis, i.e. proliferation of erythroid progenitor cells in the bone marrow and the maturation of red blood cells. (https://ru.wikipedia.org/wiki/Erythropoietin). Recombinant erythropoietin-based drugs are successfully used to treat erythrocyte deficiency, especially in patients with anemia due to chronic kidney disease, in which there is a deficiency of endogenous erythropoietin production, as well as in patients with cancer, in which anemia is associated with side effects cytostatic therapy.

В структуре молекулы эритропоэтина присутствует три сайта N-гликозилирования, а также несколько потенциальных сайтов О-гликозилирования. Рекомбинантные эритропоэтины, используемые в качестве лекарственных препаратов, являются обильно гликозилированными и сиалированными белками. Наличие остатков сиаловых кислот в структуре эритропоэтина увеличивает отрицательный заряд молекулы при физиологических значениях рН, что положительно влияет на время циркуляции эритропоэтина in vivo. Наличие соответствующих количеств сиаловых кислот в структуре молекулы эритропоэтина обуславливает определенный диапазон дискретных значений изоэлектрической точки изоформ белка, а определенное соотношение данных изоформ характеризует, в частности, коммерческие препараты эпоэтинов-Рекормон, Эпокрин и других. Указанное соотношение также принципиально важно для определения биоподобия воспроизведенных препаратов рекомбинантного эритропоэтина [Солдатов А.А., и др. Доказательство подобия рекомбинантных эпоэтинов, зарегистрированных на основе принципов "biosimilars" (физико-химические и биологические свойства) // Биопрепараты. 2014. №1 (49). С. 11-22.].There are three N-glycosylation sites in the structure of the erythropoietin molecule, as well as several potential O-glycosylation sites. Recombinant erythropoietins used as drugs are abundantly glycosylated and sialylated proteins. The presence of sialic acid residues in the structure of erythropoietin increases the negative charge of the molecule at physiological pH values, which positively affects the erythropoietin circulation time in vivo. The presence of the corresponding amounts of sialic acids in the structure of the erythropoietin molecule causes a certain range of discrete values of the isoelectric point of the protein isoforms, and a certain ratio of these isoforms characterizes, in particular, commercial preparations of epoetins-Recormon, Epocrin and others. This ratio is also fundamentally important for determining the biosimilarity of reproduced preparations of recombinant erythropoietin [Soldatov A.A. et al. Proof of the similarity of recombinant epoetins registered on the basis of the principles of “biosimilars” (physicochemical and biological properties) // Biological Products. 2014. No1 (49). S. 11-22.].

Рекомбинантный эритропоэтин человека получают в настоящее время биотехнологическим способом с использованием клеток млекопитающих, поскольку только клетки млекопитающих могут обеспечить необходимый уровень гликозилирования данного белка. При этом, как правило, используются клетки линии СНО (яичники китайского хомячка). При культивировании штаммов-продуцентов эритропоэтина на основе клеток СНО происходит накопление рекомбинантного белка в культуральной жидкости, при этом характерно присутствие в ней большого разнообразия гликоформ, отличающихся степенью гликозилирования и сиалирования. Очистка эритропоэтина из среды культивирования клеток включает обычно несколько хроматографических стадий, в ходе которых, в частности, удаляются недостаточно сиалированные гликоформы с изоэлектрическими точками, не входящими в целевой диапазон. При этом, в зависимости от особенностей штамма-продуцента и использованной технологии ферментации доля гликоформ, подлежащих удалению при очистке, может превышать 50% [Ahn W.S., et al. Effect of Culture Temperature on Erythropoietin Production and Glycosylation in a Perfusion Culture of Recombinant CHO Cells // Biotechnology and Bioengineering, Vol. 101, No. 6, December 15, 2008, 1234-1243].Recombinant human erythropoietin is currently obtained by a biotechnological method using mammalian cells, since only mammalian cells can provide the required level of glycosylation of this protein. In this case, as a rule, cells of the CHO line (Chinese hamster ovaries) are used. During the cultivation of strains producing erythropoietin based on CHO cells, the recombinant protein accumulates in the culture fluid, and it is characterized by the presence of a wide variety of glycoforms that differ in the degree of glycosylation and sialylation. Purification of erythropoietin from a cell culture medium usually involves several chromatographic steps, during which, in particular, insufficiently sialylated glycoforms with isoelectric points outside the target range are removed. Moreover, depending on the characteristics of the producer strain and the fermentation technology used, the proportion of glycoforms to be removed during purification may exceed 50% [Ahn W.S., et al. Effect of Culture Temperature on Erythropoietin Production and Glycosylation in a Perfusion Culture of Recombinant CHO Cells // Biotechnology and Bioengineering, Vol. 101, No. 6, December 15, 2008, 1234-1243].

В связи с этим актуальной проблемой современной биотехнологии является поиск подходов, позволяющих увеличить гликозилирование и сиалирование эритропоэтина. Подобные подходы обычно основаны либо на подборе питательных добавок, улучшающих профиль гликозилирования [Орлова Н.В., и др. Влияние различных добавок на уровень продукции и степень сиалирования рекомбинантного эритропоэтина человека, секретируемого производственной клеточной линией СНО-ЕРО-2 // Биотехнология. - 2013. - №4. - С. 48-55], либо на использовании специально созданных штаммов-продуцентов с повышенной экспрессией ферментов, ответственных за синтез гликанов [Bork K. et al. Enhanced sialylation of EPO by overexpression of UDP-GlcNAc 2-epimerase/ManAc kinase containing a sialuria mutation in CHO cells // FEBS Letters 581 (2007) 4195-4198; Yeon Tae J. et al., Enhanced Sialylation of Recombinant Erythropoietin in CHO Cells by Human Glycosyltransferase Expression // J. Microbiol. Biotechnol. (2008), 18(12), 1945-1952; Son Y.-D., et al. Enhanced sialylation of recombinant human erythropoietin in Chinese hamster ovary cells by combinatorial engineering of selected genes // Glycobiology vol. 21 no. 8 pp. 1019-1028, 2011; Wang Z., et al. Enhancement of recombinant human EPO production and sialylation in Chinese hamster ovary cells through Bombyx mori 30Kcl9 gene expression // Biotechnol Bioeng. 2011 Jul; 108(7):1634-42].In this regard, an urgent problem of modern biotechnology is the search for approaches to increase the glycosylation and sialylation of erythropoietin. Such approaches are usually based either on the selection of nutritional supplements that improve the glycosylation profile [Orlova N.V. et al. Effect of various additives on the production level and degree of sialylation of recombinant human erythropoietin secreted by the CHO-EPO-2 production cell line // Biotechnology. - 2013. - No. 4. - S. 48-55], or using specially designed producer strains with increased expression of enzymes responsible for glycan synthesis [Bork K. et al. Enhanced sialylation of EPO by overexpression of UDP-GlcNAc 2-epimerase / ManAc kinase containing a sialuria mutation in CHO cells // FEBS Letters 581 (2007) 4195-4198; Yeon Tae J. et al., Enhanced Sialylation of Recombinant Erythropoietin in CHO Cells by Human Glycosyltransferase Expression // J. Microbiol. Biotechnol. (2008), 18 (12), 1945-1952; Son Y.-D., et al. Enhanced sialylation of recombinant human erythropoietin in Chinese hamster ovary cells by combinatorial engineering of selected genes // Glycobiology vol. 21 no. 8 pp. 1019-1028, 2011; Wang Z., et al. Enhancement of recombinant human EPO production and sialylation in Chinese hamster ovary cells through Bombyx mori 30Kcl9 gene expression // Biotechnol Bioeng. 2011 Jul; 108 (7): 1634-42].

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является штамм CHO-gmt4 (JW152) [Goh J.S.Y., et al. Highly sialylated recombinant human erythropoietin production in large-scale perfusion bioreactor utilizing CHO-gmt4 (JW152) with restored GnT I function // Biotechnol. J. 2014, 9, 100-109], позволяющий получать высокосиалированный эритропоэтин. Однако использование данного штамма характеризуется достаточно низкими уровнями выхода целевого белка, что делает его малопригодным для создания промышленной технологии.The closest in technical essence to the claimed invention is a strain of CHO-gmt4 (JW152) [Goh J.S.Y., et al. Highly sialylated recombinant human erythropoietin production in large-scale perfusion bioreactor utilizing CHO-gmt4 (JW152) with restored GnT I function // Biotechnol. J. 2014, 9, 100-109], allowing to obtain highly sialylated erythropoietin. However, the use of this strain is characterized by rather low levels of the yield of the target protein, which makes it unsuitable for creating industrial technology.

Технической задачей, решаемой авторами, было создание штамма-продуцента рекомбинантного эритропоэтина человека, который способен производить высокосиалированный эритропоэтин при культивировании в бессывороточной среде с химически определенным составом с более высоким выходом.The technical problem solved by the authors was the creation of a producer strain of recombinant human erythropoietin, which is capable of producing highly sialylated erythropoietin when cultured in serum-free medium with a chemically defined composition with a higher yield.

Технический результат был достигнут получением штамма клеток яичников китайского хомячка СНО-ЕРО 4А9 - продуцента высокосиалированного эритропоэтина человека, обеспечивающего за 13 суток культивирования в бессывороточной среде накопление в культуральной среде до 240 мг/л рекомбинантного эритропоэтина со средним содержанием сиаловых килот не менее 10 моль на моль белка.The technical result was achieved by obtaining a strain of Chinese hamster ovary cells CHO-EPO 4A9, a producer of highly salted human erythropoietin, which ensures accumulation in the culture medium of up to 240 mg / l of recombinant erythropoietin with an average sialot content of at least 10 mol per mol in 13 days of cultivation in serum free medium squirrel.

Данный штамм клеток яичников китайского хомячка СНО-ЕРО 4А9 -продуцент эритропоэтина человека был депонирован в Специализированную коллекцию культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур 11.06.2015 под РККК(П) 767 Д.This strain of Chinese hamster ovary cells CHO-EPO 4A9, a producer of human erythropoietin, was deposited in the Specialized Collection of Vertebrate Cell Cultures of the Russian Cell Culture Collection on 06/11/2015 under RKKK (P) 767 D.

Родословная штамма: Родительская клеточная линия CHO-S. Трансфекция плазмидами pBVneo/hER и pBVdhfr/hER, отбор стабильного высокопродуктивного клона на среде без гипоксантина/тимидина с 500 мкг/мл G-418 и постепенным увеличением концентрации метотрексата.Pedigree strain: Parent cell line CHO-S. Transfection with plasmids pBVneo / hER and pBVdhfr / hER, selection of a stable highly productive clone on a medium without hypoxanthine / thymidine with 500 μg / ml G-418 and a gradual increase in the concentration of methotrexate.

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: 15The number of passages at the time of certification and deposit: 15

Стандартные условия выращивания: Среда CD СНО (Invitrogen) без гипоксантина/тимидина с 8 мМ глутамина, 500 мкг/мл G-418, 25 нМ метотрексата, 37°С, 8% CO₂.Standard growing conditions: CD SNO medium (Invitrogen) without hypoxanthine / thymidine with 8 mM glutamine, 500 μg / ml G-418, 25 nM methotrexate, 37 ° C, 8% CO ₂ .

Культуральные свойства: Суспензионное культивирование в пробирках, колбах или 6-луночных платах на орбитальном шейкере. Посевная доза 0,3-0,4×10⁶/мл, пересев каждые 3-4 суток. Время удвоения 24-26 часов.Cultural properties: Suspension culture in test tubes, flasks or 6-well plates on an orbital shaker. The sowing dose of 0.3-0.4 × 10 ⁶ / ml, reseeding every 3-4 days. The doubling time is 24-26 hours.

Данные по видовой принадлежности: Cricetulus griseus (ПЦР-анализ с видоспецифичными праймерами).Species data: Cricetulus griseus (PCR analysis with species-specific primers).

Продуцирует рекомбинантный эритропоэтин человека (оценка с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, вестерн-блота, биологического теста).Produces recombinant human erythropoietin (evaluation using enzyme-linked immunosorbent assay, Western blot, biological test).

Способ криоконсервирования: 45% свежей среды CD СНО, 45% кондиционной среды, 10% DMSO, заморозка до -70°С со скоростью 1°С/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта 90% (с трипановым синим).Cryopreservation method: 45% fresh CDO CHO medium, 45% conditioned medium, 10% DMSO, freezing to -70 ° C at a rate of 1 ° C / min, then placing in liquid nitrogen, the viability after thawing and washing from the cryopreservative is 90% (s trypan blue).

Штамм обеспечивает секретирование рекомбинантного эритропоэтина человека в культуральную среду в концентрации не менее 15 пг на клетку в сутки. Стабильность культивирования не менее 25 пассажей.The strain provides for the secretion of recombinant human erythropoietin into the culture medium at a concentration of at least 15 pg per cell per day. Cultivation stability of at least 25 passages.

Изобретение иллюстрируется рисунком на фиг. 1, где показана электрофореграмма рекомбинантного эритропоэтина, выделенного из супернатанта штамма-продуцента 4А9 (капиллярный зонный электрофорез). Изобретение поясняется следующими примерами:The invention is illustrated in the drawing in FIG. 1, which shows the electrophoregram of recombinant erythropoietin isolated from the supernatant of producer strain 4A9 (capillary zone electrophoresis). The invention is illustrated by the following examples:

Пример 1. Получение штамма-продуцента высокосиалированного эритропоэтинаExample 1. Obtaining a producer strain of highly salted erythropoietin

Дизайн гена, кодирующего человеческий эритропоэтин, был проведен с учетом встречаемости кодонов в геноме Cr.griseus. Нуклеотидная последовательность гена была получена синтетическим путем и рестрикционно клонирована по фланкирующим сайтам в два экспрессионных вектора - pBVneo (содержит ген устойчивости к геницитину) и pBVdhfr (содержит ген дигидрофолатредуктазы). Правильность синтеза гена и сборки полученных плазмид pBVneo/hER и pBVdhfr/hER подтверждали сиквенированием.The design of the gene encoding human erythropoietin was carried out taking into account the occurrence of codons in the genome of Cr.griseus. The nucleotide sequence of the gene was synthesized and cloned restrictively at flanking sites into two expression vectors — pBVneo (contains the genicitin resistance gene) and pBVdhfr (contains the dihydrofolate reductase gene). The correct synthesis of the gene and assembly of the obtained plasmids pBVneo / hER and pBVdhfr / hER was confirmed by sequencing.

Для трансфекции использовали смесь плазмид в соотношении 2 части pBVneo/hER и 1 часть pBVdhfr/hER. В качестве штамма-реципиента использовали клеточную линию CHO-S, дефицитную по дигидрофолатредуктазе, и адаптированную к суспензионному росту в бессывороточной среде. Клетки культивировали в среде CD-CHO Medium (Invitrogen) с добавлением 8 мМ L-глутамина (Gibco) и HT-media supplement (Gibco). Трансфекцию проводили с помощью реагента Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Селекцию проводили в среде CD-CHO Medium с глутамином, без гипоксантина/тимидина и с 500 мкг/мл антибиотика G-418 (Gibco).For transfection, a mixture of plasmids in a ratio of 2 parts pBVneo / hER and 1 part pBVdhfr / hER was used. As the recipient strain, the dihydrofolate reductase deficient CHO-S cell line was used and adapted to suspension growth in serum-free medium. Cells were cultured in CD-CHO Medium (Invitrogen) supplemented with 8 mM L-glutamine (Gibco) and HT-media supplement (Gibco). Transfection was performed using Lipofectamine 2000 reagent (Life Technologies). Selection was performed in CD-CHO Medium medium with glutamine, without hypoxanthine / thymidine and with 500 μg / ml of the antibiotic G-418 (Gibco).

Через 48 часов после трансфекции клетки переводили на селективную среду, в которой культивировали в течение 22 суток, а затем клонировали методом лимитирующих разведений в 96-луночных платах. Было проанализировано 185 индивидуальных клонов, демонстрировавших стабильный рост в селективной среде. Супернатанты из 96-луночной платы отбирали для первичного скрининга с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора Human Erythropoietin Platinum ELISA. Всего после первичного скрининга было отобрано для дальнейшей работы 48 клонов, в супернатантах которых уровень эритропоэтина превысил 3 мкг/мл,48 hours after transfection, the cells were transferred to a selective medium in which they were cultured for 22 days, and then cloned by limiting dilution in 96-well plates. 185 individual clones were analyzed that showed stable growth in a selective medium. Supernatants from a 96-well plate were selected for initial screening by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human Erythropoietin Platinum ELISA kit. In total, after the initial screening, 48 clones were selected for further work, in the supernatants of which the erythropoietin level exceeded 3 μg / ml,

Клетки отобранных 48 клонов с максимальной продукцией по результатам первичного скрининга наращивали и высевали по 300 тысяч в 1 мл культуральной среды CD-CHO Medium с 20% питательной добавки СНО CD EfficientFeed С (Life Technologies) в лунке 24-луночной платы и культивировали 10 суток. После определяли концентрацию рЭПО в супернатантах с помощью ИФА, а затем - содержание сиаловых кислот в белках супернатанта с помощью метода, основанного на отщеплении сиаловых кислот от белка сиалидазой с последующей их дериватизацией малононитрилом [10].According to the results of the initial screening, the cells of the selected 48 clones with the maximum production were grown and sown 300 thousand in 1 ml of CD-CHO Medium culture medium with 20% nutritional supplement ССО CD EfficientFeed С (Life Technologies) in the well of a 24-well plate and cultured for 10 days. After that, the concentration of rEPO in the supernatants was determined using ELISA, and then the sialic acid content in the supernatant proteins was determined using a method based on the removal of sialic acids from a protein by sialidase followed by their derivatization with malononitrile [10].

В ходе второго скрининга среди десяти клонов с максимальным содержанием эритропоэтина в супернатанте был обнаружен клон 4А9, в супернатанте которого содержался белок со средним содержанием сиаловых кислот более 11 моль в расчете на 1 моль рекомбинантного эритропоэтина (таблица 1). В супернатантах прочих клонов содержание сиаловых кислот не превышало 7 моль на 1 моль эритропоэтина.During the second screening, clone 4A9 was detected among ten clones with the maximum erythropoietin content in the supernatant, the supernatant of which contained a protein with an average sialic acid content of more than 11 mol per 1 mol of recombinant erythropoietin (table 1). In the supernatants of other clones, the content of sialic acids did not exceed 7 mol per 1 mol of erythropoietin.

Клон 4А9 с высоким уровнем содержания сиаловых кислот в секретируемом белке был подвергнут раунду амплификации при 25 нМ метотрексата для повышения продуктивности. Затем культура штамма-продуцента клона 4А9 была реклонирована и криоконсервирована.Clone 4A9 with a high level of sialic acid in the secreted protein was amplified at 25 nM methotrexate to increase productivity. Then the culture of the producer strain of clone 4A9 was reclone and cryopreserved.

Пример 2. Анализ содержания изоформ в рекомбинантном эритропоэтине, секретируемом штаммом-продуцентом 4А9Example 2. Analysis of the content of isoforms in recombinant erythropoietin secreted by the producer strain 4A9

Для проведения анализа состава изоформ в рекомбинантном эритропоэтине, секретируемом штаммом-продуцентом 4А9, клетки данного клона культивировали в колбе Эрленмейера в течение 13 суток в среде CD-CHO Medium с 8 мМ глутамина и 25% питательной добавки СНО CD EfficientFeed С, которую добавляли по 5% объема на 3, 5, 7, 9 и 11 сутки. На 13 сутки культивирования концентрация рекомбинантного эритропоэтина в супернатанте составила 240 мг/л, а содержание сиаловых кислот, измеренное, как описано в примере 1-10,9 моль на моль эритропоэтина.To analyze the composition of isoforms in recombinant erythropoietin secreted by the producer strain 4A9, the cells of this clone were cultured in an Erlenmeyer flask for 13 days in CD-CHO Medium medium with 8 mM glutamine and 25% CHO CD supplement EfficientFeed C supplemented with 5 % of the volume on 3, 5, 7, 9 and 11 days. On the 13th day of cultivation, the concentration of recombinant erythropoietin in the supernatant was 240 mg / L, and the sialic acid content, measured as described in Example 1-10.9 mol per mole of erythropoietin.

Супернатант осветляли двухступенчатым центрифугированием при 500g и 10000g с последующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Очистка рекомбинантного эритропоэтина проводилась с помощью иммуно-аффинной хроматографии (использовали колонку с иммуносорбентом 6-4A3-сефароза объемом 15 мл). Полученный белок анализировали с помощью капиллярного зонного электрофореза с использованием фонового электролита по Ph. Eur. 1316, непокрытого капилляра общей длиной 50 см с эффективной длиной 40 см диаметром 50 мкм с использованием системы «Капель-105М». Пример электрофореграммы показан на Фиг. 1. При анализе серии электрофореграмм данного образца установлено, что состав изоформ в белке, полученном после единственного этапа хроматографической очистки культуральной жидкости штамма-продуцента 4А9, соответствует требованиям Европейской фармакопеи (таблица 2).The supernatant was clarified by two-stage centrifugation at 500g and 10000g, followed by filtration through a filter with a pore diameter of 0.22 μm. Purification of recombinant erythropoietin was carried out using immuno-affinity chromatography (used column with immunosorbent 6-4A3-Sepharose volume of 15 ml). The resulting protein was analyzed using capillary zone electrophoresis using a background electrolyte according to Ph. Eur. 1316, an uncovered capillary with a total length of 50 cm and an effective length of 40 cm with a diameter of 50 μm using the Kapel-105M system. An example of an electrophoregram is shown in FIG. 1. When analyzing a series of electrophoregrams of this sample, it was found that the composition of the isoforms in the protein obtained after a single step of chromatographic purification of the culture fluid of producer strain 4A9 meets the requirements of the European Pharmacopoeia (table 2).

Таким образом, рекомбинантный эритропоэтин, секретируемый штаммом-продуцентом 4А9, выделенный из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии имеет состав изоформ, соответствующий требованиям Европейской фармакопеи к препаратам эритропоэтина, что подтверждает высокую степень гликозилирования и сиалирования белка.Thus, the recombinant erythropoietin secreted by the producer strain 4A9 isolated from the culture fluid using affinity chromatography has an isoform composition that meets the requirements of the European Pharmacopoeia for erythropoietin preparations, which confirms the high degree of protein glycosylation and sialylation.

Для сравнения уровня содержания целевых изоформ в составе рекомбинантного эритропоэтина, секретируемого клоном 4А9, полученный образец белка был подвергнут дополнительной очистке с помощью ионообменной хроматографии, которая используется при производстве фармацевтической субстанции эритропоэтина с целью удаления примесей, таких как белки штамма-продуцента, а также щелочных изоформ рекомбинантного эритропоэтина. Для этого препарат эритропоэтина после аффинной хроматографии наносили на анионообменную матрицу Sepharose Q FF(GE Healthcare) уравновешанную с 10 мМ фосфатным буфером рН 7,3. После сорбции колонку отмывали двумя объемами того же буфера. Для удаления щелочных изоформ сорбент отмывали двумя объемами 20 мМ ацетатного буфера рН4.0. Затем через сорбент вновь пропускали два объема уравновешивающего буфера, после чего очищенный эритропоэтин элюировали 20 мМ фосфатным буфером рН 7,4 содержащим 0,2 М NaCl.To compare the level of target isoforms in the recombinant erythropoietin secreted by clone 4A9, the obtained protein sample was subjected to additional purification using ion exchange chromatography, which is used in the manufacture of the pharmaceutical substance of erythropoietin to remove impurities, such as proteins of the producer strain, as well as alkaline isoforms recombinant erythropoietin. For this, an erythropoietin preparation after affinity chromatography was applied to a Sepharose Q FF anion exchange matrix (GE Healthcare) balanced with 10 mM phosphate buffer pH 7.3. After sorption, the column was washed with two volumes of the same buffer. To remove alkaline isoforms, the sorbent was washed with two volumes of 20 mM acetate buffer pH 4.0. Then two volumes of equilibration buffer were again passed through the sorbent, after which the purified erythropoietin was eluted with 20 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 0.2 M NaCl.

Выход рекомбинантного эритропоэтина определялся как доля белка, полученного после ионообменной хроматографии, от исходного содержания белка (концентрация белка определялась с помощью спектрофотометрии в ультрафиолетовой области). В качестве препарата сравнения использовался эритропоэтин, секретируемый промышленным штаммом-продуцентом СНО-ЭПО/SPM (RU 2125093, 1999). Культуральная жидкость штамма-продуцента СНО-ЭПО/SPM подвергалась такой же процедуре очистки (аффинная хроматография и ионообменная хроматография).The yield of recombinant erythropoietin was determined as the fraction of protein obtained after ion exchange chromatography from the initial protein content (protein concentration was determined using spectrophotometry in the ultraviolet region). As a comparison drug, erythropoietin was used, secreted by the industrial strain producing CHO-EPO / SPM (RU 2125093, 1999). The culture fluid of the producer strain CHO-EPO / SPM was subjected to the same purification procedure (affinity chromatography and ion exchange chromatography).

Анализ потерь целевого белка при ионообменной хроматографии показал, что при очистке рекомбинантного белка, синтезированного штаммом-продуцентом 4А9, потери при второй стадии очистки в описанных условиях составляют не более 8%. Аналогичная очистка рекомбинантного эритропоэтина из культуральной жидкости штамма СНО-ЭПО/SPM приводила к потере 26% белка, представленного щелочными изоформами.Analysis of the loss of the target protein during ion exchange chromatography showed that when purifying the recombinant protein synthesized by the producer strain 4A9, the losses during the second stage of purification under the described conditions are no more than 8%. A similar purification of recombinant erythropoietin from the culture fluid of the CHO-EPO / SPM strain resulted in the loss of 26% of the protein represented by alkaline isoforms.

Таким образом, штамм-продуцент 4А9 секретирует рекомбинантный эритропоэтин, при выделении которого потери белка, не соответствующего фармакопейным требованиям, являются минимальными, что в совокупности с высокой волюметрической продуктивностью штамма (240 мг/л) демонстрирует его высокую пригодность для промышленного производства рекомбинантного эритропоэтина.Thus, the producer strain 4A9 secrets recombinant erythropoietin, during the isolation of which protein losses that do not meet pharmacopoeial requirements are minimal, which, together with the high volumetric productivity of the strain (240 mg / L), demonstrates its high suitability for the industrial production of recombinant erythropoietin.

Claims (1)

Штамм клеток яичников китайского хомячка СНО-ЕРО 4А9, депонированный в Российской коллекции клеточных культур под номером РККК(П) 767 Д, - продуцент рекомбинантного высокосиалированного эритропоэтина человека.The strain of ovarian cells of the Chinese hamster CHO-EPO 4A9, deposited in the Russian collection of cell cultures under the number RKKK (P) 767 D, is a producer of recombinant highly sialylated human erythropoietin.

Images