RU2650754C1 - Method for producing micro bine of plants of the betulaceae family - Google Patents
Method for producing micro bine of plants of the betulaceae family Download PDFInfo
- Publication number
- RU2650754C1 RU2650754C1 RU2016140800A RU2016140800A RU2650754C1 RU 2650754 C1 RU2650754 C1 RU 2650754C1 RU 2016140800 A RU2016140800 A RU 2016140800A RU 2016140800 A RU2016140800 A RU 2016140800A RU 2650754 C1 RU2650754 C1 RU 2650754C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microprobe
- nutrient medium
- vessel
- micro
- bines
- Prior art date
Links
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims description 15
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 title claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- GHMWZRWCBLXYBX-UHFFFAOYSA-M sodium;4-chlorobenzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 GHMWZRWCBLXYBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 28
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 abstract description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 abstract description 8
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 abstract 5
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 abstract 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 4
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 4
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 4
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 3
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 3
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 3
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219430 Betula pendula Species 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 241000219497 Alnus incana Species 0.000 description 1
- 235000009109 Betula pendula Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241000968653 Freycinetia angustissima Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и воспроизводству лесных древесных растений на искусственных питательных средах в стерильных условиях in vitro и может быть использовано в лесном хозяйстве для массового получения посадочного материала экономически ценных и декоративных форм древесных растений сем. Betulaceae.The invention relates to biotechnology and reproduction of forest woody plants on artificial nutrient media under sterile in vitro conditions and can be used in forestry for mass production of planting material of economically valuable and decorative forms of woody plants of this family. Betulaceae.
Известен способ клонального микроразмножения гибридов карельской березы, по которому в качестве исходных эксплантов используют верхушечные и пазушные почки. Рост каллуса и формирование микропобегов проводят на основной агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей в качестве фитогормонов 80-120 мг/л лизина, 0,05-0,15 мг/л кинетина, 0,6-1,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0,05-0,08 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК). В последующем удлинение побегов осуществляют на агаризованной питательной среде с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей по Мурасиге-Скуга и с добавлением 0,6-1,0 мг/л БАП и 0,3-0,5 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК) (авторское свидетельство СССР №1752284, МПК А01Н 4/00, опубл. 07.08.1992 г.).There is a method of clonal micropropagation of hybrids of Karelian birch, according to which apical and axillary buds are used as initial explants. Callus growth and the formation of microboots are carried out on the main agarized nutrient medium Murashige-Skoog containing 80-120 mg / l lysine, 0.05-0.15 mg / l kinetin, 0.6-1.0 mg / l 6 as phytohormones -benzylaminopurine (BAP) and 0.05-0.08 mg / l of α-naphthylacetic acid (NAA). Subsequently, the elongation of shoots is carried out on an agarized nutrient medium with a halved concentration of macrosalts according to Murashige-Skoog and with the addition of 0.6-1.0 mg / l BAP and 0.3-0.5 mg / l indolylacetic acid (IAA) USSR certificate No. 1752284, IPC A01H 4/00, publ. 08/07/1992).
Однако в указанном способе индукцию микропобегов осуществляют из каллуса, что, с одной стороны, повышает коэффициент размножения, а с другой при прохождении клетками стадии дедифференцировки в условиях in vitro не исключает процесс их полиплоидизации и анеуплоидизации. Все это приводит к сомаклональной изменчивости, в результате чего увеличивается вероятность получения генетически измененного клонового потомства. Для получения каллусной ткани используют дорогостоящие реактивы, например фитогормоны (лизин, НУК, ИУК, БАП, кинетин), при этом само присутствие этапа каллусообразования удлиняет процесс в целом. Использование большого количества стеклянных сосудов малого объема повышает трудозатраты и требует увеличения площади стеллажей. Поэтому полный цикл получения микропобегов является трудоемким, дорогостоящим и продолжительным.However, in this method, the induction of microprobe is carried out from callus, which, on the one hand, increases the reproduction rate, and on the other hand, when the cells undergo the stage of dedifferentiation in vitro, they do not exclude the process of their polyploidization and aneuploidization. All this leads to somaclonal variation, which increases the likelihood of obtaining genetically modified clonal offspring. To obtain callus tissue, expensive reagents are used, for example phytohormones (lysine, IAA, IAA, BAP, kinetin), while the very presence of the callus formation stage lengthens the process as a whole. The use of a large number of glass vessels of small volume increases labor costs and requires an increase in the area of racks. Therefore, the full cycle of obtaining microtuning is time-consuming, expensive and time consuming.
Наиболее близким заявленному является способ получения растительного материала для размножения растений, по которому размножение осуществляют путем высадки стерильных черенков побегов растений в сосуд с агаризованной питательной средой, содержащей в качестве регулятора роста цитокинин или кинетин (таблица 1). После этого сосуд заливают жидкой питательной средой того же состава до полного погружения черенков и культивируют при 16-часовом фотопериоде при освещенности 10000 лк до появления боковых побегов. Твердая питательная среда обеспечивает побегам вертикальное положение (Патент SU 1590029, МПК A3 А01Н 3/00, опубл. 30.08.1990 г.).Closest to the claimed is a method of obtaining plant material for propagation of plants, in which propagation is carried out by planting sterile cuttings of plant shoots in a vessel with an agarized nutrient medium containing cytokinin or kinetin as a growth regulator (table 1). After that, the vessel is poured with a liquid nutrient medium of the same composition until the cuttings are completely immersed and cultivated at a 16-hour photoperiod under illumination of 10,000 lux until lateral shoots appear. A solid nutrient medium provides the shoots with an upright position (Patent SU 1590029, IPC A3 A01H 3/00, publ. 08/30/1990).
Данный способ разработан для травянистых многолетних растений, имеющих высокую скорость роста, которую сложно соотнести с довольно низкой скоростью роста древесных растений. Способ не обеспечивает микропобегам оптимальные условия на этапе побегообразования, поскольку при длительном нахождении в жидкой среде они могут испытывать затяжную гипоксию (недостаток кислорода), вследствие которой возможно угнетение процессов фотосинтеза и формирования боковых пазушных побегов. Кроме того, как указывают сами авторы, у самых сильных побегов, находящихся выше уровня поверхности жидкой среды, т.е. в воздушной среде, листовых почек в пазухах листа образовывалось мало или вовсе не образовывалось. Недостатком способа является использование высокой концентрации агара (10000 мг/л), приводящей к его удорожанию. Применение комбинированной по консистенции питательной среды (агаризованной полутвердой одновременно с жидкой) усложняет сам процесс приготовления, увеличивает его продолжительность и трудозатраты, предусматривает использование дорогостоящих реактивов и снижает уровень асептики культивируемой ткани. Трудозатраты также повышаются из-за повторного культивирования черенков, полученных из средней и нижней частей побегов и использования для разлива питательной среды индивидуальных стеклянных колб небольшого объема (200 мл), для установки которых, кроме того, требуются дополнительные площади. Поэтому полный цикл получения микропобегов является трудоемким, дорогостоящим, длительным и, кроме того, не обеспечивающим необходимого их качества.This method is designed for herbaceous perennials having a high growth rate, which is difficult to correlate with a rather low growth rate of woody plants. The method does not provide the micrunages with optimal conditions at the stage of shoot formation, since if they are in the liquid medium for a long time, they may experience prolonged hypoxia (oxygen deficiency), which may inhibit photosynthesis and formation of lateral axillary shoots. In addition, as the authors themselves indicate, in the strongest shoots located above the surface level of a liquid medium, i.e. in the air, leaf buds in the axils of the leaf formed little or not at all. The disadvantage of this method is the use of a high concentration of agar (10,000 mg / l), leading to its appreciation. The use of a combination of a nutrient medium (agarized semi-solid simultaneously with liquid) complicates the cooking process itself, increases its duration and labor costs, involves the use of expensive reagents and reduces the level of asepsis of cultured tissue. Labor costs are also increased due to the re-cultivation of cuttings obtained from the middle and lower parts of the shoots and the use of small glass flasks (200 ml) for spilling the nutrient medium, for the installation of which, in addition, additional areas are required. Therefore, the full cycle of obtaining microtuning is time-consuming, expensive, lengthy and, in addition, not providing the necessary quality.
Задачей настоящего изобретения является разработка экономичного способа клонального микроразмножения растений семейства Betulaceae, позволяющего получать одновременно большое количество высококачественных микропобегов in vitro, сохраняющих уникальные признаки исходных генотипов, и способствующего ускоренному выращиванию посадочного материала экономически ценных и декоративных трудноразмножаемых древесных растений.The objective of the present invention is to develop an economical method of clonal micropropagation of plants of the Betulaceae family, which allows to simultaneously obtain a large number of high-quality microprobe in vitro, preserving the unique characteristics of the original genotypes, and contributing to the accelerated growing of planting material of economically valuable and decorative hard-to-propagate woody plants.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности способа за счет стимуляции формирования множественного числа боковых пазушных побегов (de novo) при одновременном развитии на каждом из них нескольких микропобегов (от 2 до 10 шт.) in vitro и усиления скорости их роста (длины), увеличения фотосинтетической деятельности формирующихся листьев, а также повышение жизнеспособности микропобегов, удешевление и снижение трудозатрат процесса получения микропобегов в культуре тканей, соответствующих исходному фенотипу.The technical result of the invention is to increase the efficiency of the method by stimulating the formation of a plurality of lateral axillary shoots (de novo) while simultaneously developing on each of them several microboots (from 2 to 10 pcs.) In vitro and increasing their growth rate (length), increasing photosynthetic the activity of forming leaves, as well as increasing the viability of microprobe, cheapening and reducing the labor costs of the process of obtaining microprobe in a tissue culture corresponding to the initial phenotype.
Заявленный технический результат достигается тем, что в способе получения микропобегов растений сем. Betulaceae, включающем индукцию микропобегов на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга in vitro, последующую их элонгацию и мультипликацию, согласно изобретению, индукцию микропобегов осуществляют непосредственно из апикальной недифференцированной ткани вегетативных почек экспланта, а элонгацию и мультипликацию полученных микропобегов проводят путем одновременного в одном сосуде необходимого количества микропобегов на поверхности перфорированной площадки, закрепленной выше уровня жидкой питательной среды, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга, дополнительно включающей 0,25-2,0 мг/л БАП, 20000-30000 мг/л сахарозы, и осуществляют в автоматическом режиме циклическое чередование процессов экспозиции микропобегов в воздушной среде влажностью 80-90% и погружения их в жидкую питательную среду на 1-4 минуты 2-4 раза в сутки путем подъема ее уровня, с дополнительной аэрацией воздуха внутри сосуда по 2-6 минут через равные промежутки времени от 10 до 16 раз в сутки в течение 16-часового фотопериода.The claimed technical result is achieved by the fact that in the method of producing microprobe of plants of this. Betulaceae, including the induction of microprobe on an agarized nutrient medium Murashige-Skoog in vitro, their subsequent elongation and animation, according to the invention, the induction of microprobe is carried out directly from the apical undifferentiated tissue of vegetative kidneys of the explant, and the elongation and multiplication of the obtained microprobe is carried out by the same amount in one microblows on the surface of a perforated platform fixed above the level of a liquid nutrient medium containing mineral the main basis according to Murashige-Skoog, which additionally includes 0.25-2.0 mg / l BAP, 20000-30000 mg / l sucrose, and carry out in an automatic mode a cyclic alternation of microprobe exposure processes in air with a humidity of 80-90% and immersing them into a liquid nutrient medium for 1-4 minutes 2-4 times a day by raising its level, with additional aeration of air inside the vessel for 2-6 minutes at regular intervals from 10 to 16 times a day for a 16-hour photoperiod.
Предлагаемый способ получения микропобегов растений сем. Betulaceae реализуется следующим образом.The proposed method of obtaining microprobe plants of the family. Betulaceae is implemented as follows.
Берут верхушечные и боковые вегетативные почки у растений сем. Betulaceae с ауксибластов (молодые побеги текущего года), достигших длины от 1 до 3 см, стерилизуют с помощью антисептических и дезинфицирующих средств. Использование ауксибластов для получения эксплантов значительно упрощает процесс стерилизации, поскольку они, как правило, менее заражены разными видами микрофлоры. В стерильных условиях из них вычленяют апикальную недифференцированную ткань и размещают в небольших стеклянных сосудах, объемом 125 мл, на агаризованной питательной среде (по 15 мл в один сосуд), содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга, куда дополнительно вносят 0,25-2,0 мг/л БАП, 25000-30000 мг/л сахарозы, 6000 мг/л агара (таблица 1). На этой среде в течение 2-3 недель индуцируют пазушные побеги. Использование минимального набора фитогормонов (только БАП) в питательной среде в процессе побегообразования является не только экономически выгодным, но также препятствует формированию каллуса и способствует сохранению гарантированных признаков исходного генотипа. Затем осуществляют процесс элонгации и мультипликации путем черенкования полученных микропобегов на сегменты с размещением их в стерильном сосуде, объемом 3,5 л, содержащем 0,5 л жидкой питательной среды того же состава, за исключением агара, для последующей индукции на них микропобегов de novo (таблица 1). Микропобеги в сосуде размещают свободно на поверхности перфорированной площадки, которая закреплена выше уровня жидкой питательной среды. Размещение микропобегов без их индивидуальной фиксации в общем сосуде значительно сокращает временные затраты и экономит площади рабочей поверхности, предназначенной для культивирования. Мультипликацию микропобегов повторяют в зависимости от потребностей в их количестве. Исключение агара из среды на побегообразование значительно удешевляет процесс получения микропобегов. Культивирование микропобегов проводят на стеллажах при температуре 23-27°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности общей интенсивности от 3000 до 4500 лк в течение 3-5 недель.The apical and lateral vegetative buds are taken from plants of this family. Betulaceae from auxiblasts (young shoots of the current year), reaching a length of 1 to 3 cm, are sterilized with antiseptic and disinfectants. The use of auxiblasts to obtain explants greatly simplifies the sterilization process, since they are usually less infected with different types of microflora. Under sterile conditions, the apical undifferentiated tissue is isolated from them and placed in small glass vessels, 125 ml in volume, on an agarized nutrient medium (15 ml in one vessel) containing the mineral base according to Murashige-Skoog, where additionally 0.25-2 0 mg / l BAP, 25000-30000 mg / l sucrose, 6000 mg / l agar (table 1). On this medium, axillary shoots are induced for 2–3 weeks. The use of a minimum set of phytohormones (only BAP) in a nutrient medium during the process of shoot formation is not only economically viable, but also prevents the formation of callus and helps to maintain guaranteed characteristics of the original genotype. Then, the process of elongation and animation is carried out by grafting the obtained microprobe into segments with their placement in a sterile vessel of 3.5 L volume containing 0.5 L of a liquid nutrient medium of the same composition, except for agar, for subsequent induction of de novo microprobe ( Table 1). Microboots in the vessel are placed freely on the surface of the perforated platform, which is fixed above the level of the liquid nutrient medium. Placing microprobe without their individual fixation in a common vessel significantly reduces time costs and saves the area of the working surface intended for cultivation. The multiplication of microprobes is repeated depending on the need for their number. The exclusion of agar from the medium for shoot formation significantly reduces the cost of the process of obtaining microprobe. Cultivation of microprobes is carried out on racks at a temperature of 23-27 ° C, a 16-hour photoperiod and illumination of a total intensity of 3000 to 4500 lux for 3-5 weeks.
Побегообразование осуществляют при циклическом чередовании процессов экспозиции микропобегов в воздушной среде, влажностью 80%, и погружения их в жидкую питательную среду на 1-4 минуты. Процесс повторяют 2-4 раза в сутки автоматически в соответствии с заданным интервалом времени. Погружение микропобегов обеспечивается путем подъема жидкой питательной среды до уровня, обеспечивающего их покрытие. При этом дополнительно проводят аэрацию воздуха внутри сосуда по 2-6 мину в автоматическом режиме через равные промежутки времени от 10 до 16 раз в сутки в течение 16-часового фотопериода. Заявляемый режим создает оптимальные условия для побегообразования, обеспечивающие индукцию пазушных побегов de novo и развитие листовой массы. Кроме того, наблюдается замедление процесса старения листьев, благодаря чему усиливается их аттрагирующая способность, направленная на поглощение необходимых веществ из питательной среды, а также общая способность клеток к синтетической деятельности. Экспериментальным путем выявлено, что поднятие уровня жидкой питательной среды на 1-4 минуты 2-4 раза в сутки с погружением в нее микропобегов достаточно, поскольку в этом случае поглощение необходимого количества питательных веществ ими активно осуществляется всей поверхностью. При этом тургор тканей не снижается, а гипоксия практически исключается. Многократная аэрация внутри сосуда оптимизирует условия газообмена и способствует обновлению воздушной среды, препятствуя накоплению в ней этилена и других газов, которые оказывают в основном тормозящее влияние на процессы роста.The shoot formation is carried out in a cyclic alternation of the processes of exposure of microboots in air, with a humidity of 80%, and immersing them in a liquid nutrient medium for 1-4 minutes. The process is repeated 2-4 times a day automatically in accordance with a predetermined time interval. Microprobe immersion is ensured by raising the liquid nutrient medium to the level that provides their coverage. In this case, air is also aerated inside the vessel for 2-6 minutes automatically at regular intervals from 10 to 16 times a day for a 16-hour photoperiod. The inventive mode creates optimal conditions for shoot formation, ensuring the induction of axillary shoots de novo and the development of leaf mass. In addition, there is a slowdown in the aging process of leaves, due to which their attracting ability is enhanced, aimed at absorbing the necessary substances from the nutrient medium, as well as the general ability of cells to synthesize. It was experimentally found that raising the level of liquid nutrient medium by 1-4 minutes 2-4 times a day with immersion of microprobe in it is enough, since in this case the necessary amount of nutrients are absorbed by them all over the surface. At the same time, tissue turgor does not decrease, and hypoxia is practically eliminated. Repeated aeration inside the vessel optimizes the conditions of gas exchange and promotes the renewal of the air environment, preventing the accumulation of ethylene and other gases in it, which have a mainly inhibitory effect on growth processes.
Применение предлагаемого способа получения микропобегов растений позволяет существенно сократить использование дорогостоящих реактивов, например агара, что значительно удешевляет культивирование растений in vitro. Создание оптимальных условий формирования микропобегов за счет особого режима кратковременного погружения эксплантов в жидкую питательную среду и последующего длительного их экспонирования в воздушной среде с высокой влажностью обеспечивают ускоренное формирование новых микропобегов (de novo). Стимулирование побегообразования дает возможность ускорить процесс формирования пазушных побегов, увеличить биомассу микропобегов, а также усилить процесс фотосинтеза и замедлить старение (хлороз) листьев, что способствует повышению жизнеспособности микропобегов в целом.The use of the proposed method for producing microprobe of plants can significantly reduce the use of expensive reagents, such as agar, which significantly reduces the cost of cultivation of plants in vitro. The creation of optimal conditions for the formation of microturns due to the special regime of short-term immersion of explants in a liquid nutrient medium and their subsequent prolonged exposure in high-humidity air provide accelerated formation of new microtubules (de novo). Stimulation of shoot formation makes it possible to accelerate the process of formation of axillary shoots, increase the biomass of microprobe, as well as strengthen the photosynthesis process and slow down leaf aging (chlorosis), which contributes to the increased viability of microprobe as a whole.
Предложенный способ обеспечивает повышение эффективности клонального микроразмножения также за счет ускоренного массового формирования побегов путем применения одного сосуда вместо нескольких небольшого объема. Используется упрощенный состав среды (без добавления агара) и фотопериод: 16-часовой при освещенности 4500 лк (в прототипе в примерах указан постоянный фотопериод при освещенности 8000 лк), которые позволяют удешевить технологию за счет экономии средств на приобретение дорогостоящих реактивов и электроэнергии. Ускоренное развитие микропобегов происходит за счет дополнительной аэрации воздуха внутри сосуда и усиления процесса фотосинтеза. В прототипе данные по фотосинтезу не представлены.The proposed method provides an increase in the efficiency of clonal micropropagation also due to the accelerated mass formation of shoots by using one vessel instead of several small volumes. A simplified composition of the medium is used (without adding agar) and a photoperiod: 16-hour at an illumination of 4,500 lux (the prototype in the examples shows a constant photoperiod at an illumination of 8,000 lux), which make it possible to reduce the cost of the technology by saving money on the purchase of expensive reagents and electricity. The accelerated development of microtuning occurs due to additional aeration of the air inside the vessel and enhancing the photosynthesis process. In the prototype, data on photosynthesis are not presented.
Апробация способа проводилась в течение 4-х лет (2012-2015 гг.) на следующих видах сем. Betulaceae: карельская береза Betula pendula Roth var. carelica (Merclin) 
Контролем служил вариант опыта, где процесс мультипликации осуществляли на полутвердой агаризованной питательной среде. Режимы способа получения микропобегов представлены в таблице 2. По окончании эксперимента визуально определяли наличие или отсутствия хлороза, количество вновь образованных пазушных побегов в расчете на один исходный микропобег, их длину за 4 недели культивирования, на основании которых делали заключение об их жизнеспособности. Полученные данные представлены в таблице 3. В прототипе аналогичные морфофизиологические показатели не приводятся.The control was a variant of the experiment, where the multiplication process was carried out on a semi-solid agarized nutrient medium. The modes of the method for producing microprobe are presented in Table 2. At the end of the experiment, the presence or absence of chlorosis, the number of newly formed axillary shoots per one initial microprobe, and their length for 4 weeks of cultivation were visually determined, based on which a conclusion was made about their viability. The data obtained are presented in table 3. In the prototype, similar morphophysiological indicators are not given.
Анализ данных таблицы 1 показал, что заявляемый способ позволяет повысить количество микропобегов в одном сосуде более чем в 60 раз в течение 3-4 недель и в 5 раз увеличить общее их количество за год по сравнению с прототипом. Из таблицы 3 следует, что предлагаемый способ позволяет снизить в 7 раз проявление хлороза, увеличить в 2,2 раза число боковых пазушных побегов (de novo), при одновременном развитии на каждом из них нескольких микропобегов, усилить в 1,8 раза скорость роста (длину) микропобегов за 4 недели культивирования и получить до 90% жизнеспособных микропобегов, что в 1,2 раза выше по сравнению с контролем.Analysis of the data of table 1 showed that the inventive method allows to increase the number of microprobe in one vessel by more than 60 times for 3-4 weeks and 5 times increase their total number per year compared with the prototype. From table 3 it follows that the proposed method allows to reduce the manifestation of chlorosis by 7 times, increase by 2.2 times the number of lateral axillary shoots (de novo), while developing at the same time several microprobe on each of them, and increase the growth rate by 1.8 times ( the length) of microprobe for 4 weeks of cultivation and to obtain up to 90% of viable microprobe, which is 1.2 times higher compared to the control.
Важным преимуществом предлагаемого способа по сравнению с известными является возможность получать одновременно массовое количество высококачественных микропобегов при размножении и выращивании хозяйственно ценных и декоративных представителей семейства Betulaceae при экономии средств и снижении трудозатрат, что позволяет широко использовать его в практике лесного хозяйства для массового выращивания посадочного материала, а также в научных целях.An important advantage of the proposed method compared to the known ones is the ability to simultaneously obtain a massive amount of high-quality microprobe when propagating and growing economically valuable and decorative representatives of the Betulaceae family while saving money and reducing labor costs, which allows it to be widely used in forestry practice for mass cultivation of planting material, and also for scientific purposes.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016140800A RU2650754C1 (en) | 2016-10-17 | 2016-10-17 | Method for producing micro bine of plants of the betulaceae family |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016140800A RU2650754C1 (en) | 2016-10-17 | 2016-10-17 | Method for producing micro bine of plants of the betulaceae family |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2650754C1 true RU2650754C1 (en) | 2018-04-17 |
Family
ID=61976557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016140800A RU2650754C1 (en) | 2016-10-17 | 2016-10-17 | Method for producing micro bine of plants of the betulaceae family |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2650754C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1590029A3 (en) * | 1982-06-28 | 1990-08-30 | Навотрейд (Инопредприятие) | Method of producing plant material for plant reproduction |
-
2016
- 2016-10-17 RU RU2016140800A patent/RU2650754C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1590029A3 (en) * | 1982-06-28 | 1990-08-30 | Навотрейд (Инопредприятие) | Method of producing plant material for plant reproduction |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ВЕТЧИННИКОВА Л.В., и др.,Влияние кадмия на морфо-и органогенез березы in vitro, Труды Карельского научного центра Российской Академии наук, N 5, 2014, с.174-181. * |
| ВЕТЧИННИКОВА Л.В., и др.,Клональное размножение Карельской березы в Карелии, Resources and technology, N5, 2005, с.17-22. * |
| ВЕТЧИННИКОВА Л.В., и др.,Клональное размножение Карельской березы в Карелии, Resources and technology, N5, 2005, с.17-22. ВЕТЧИННИКОВА Л.В., и др.,Влияние кадмия на морфо-и органогенез березы in vitro, Труды Карельского научного центра Российской Академии наук, N 5, 2014, с.174-181. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Murthy et al. | Bioreactor systems for micropropagation of plants: present scenario and future prospects | |
| Nasircilar et al. | In vitro propagation of endemic and endangered Muscari mirum from different explant types | |
| Jo et al. | Micropropagation of Alocasia amazonica using semisolid and liquid cultures | |
| Cristea et al. | Effect of AgNO3 on androgenesis of Brassica oleracea L. anthers cultivated in vitro | |
| Nas et al. | Improved rooting and acclimatization of micropropagated hazelnut shoots | |
| CN104304034B (en) | Induction culture method and special induction culture medium for somatic embryo calluses of picea schrenkiana | |
| Shukla et al. | Micropropagation of African violet (saintpaulia ionantha Wendl.) | |
| RU2650754C1 (en) | Method for producing micro bine of plants of the betulaceae family | |
| Mir et al. | In vitro development and regeneration of microcorms in saffron (Crocus sativus L) | |
| Nomura et al. | Somatic Embryogenesis in Cultured Carrot Cells: (somatic embryogenesis/plant cell culture/totipotency/carrot) | |
| Lucchesini et al. | Plant tissue culture—an opportunity for the production of nutraceuticals | |
| RU2627194C1 (en) | Method for clonal micro-reproduction of betulaceae family plants | |
| Maurya et al. | IN VITRO PLANT REGENERATION OF ROSE (Rosa hybrida L.) CV.„BENJAMIN PAUL‟ THROUGH VARIOUS EXPLANTS | |
| Nunes et al. | Morphogenesis and regeneration of adventitious shoots in'Jatropha curcas' L. | |
| Ptak | Leucojum aestivum L. in vitro bulbs induction and acclimatization | |
| Chen et al. | Efficient regeneration of Eucommia ulmoides from hypocotyl explant | |
| Camargo et al. | Temporary immersion biorreators: efficient technique for the propagation of the ‘Pircinque’strawberry | |
| Arnold | Importance of genotype on the potential for in vitro adventitious bud production of Picea abies | |
| KR101636726B1 (en) | Method for mass production of tulip bulblet through liquid culture of tulip embryogenic callus in bioreactor and regeneration on solid media | |
| Van Minh | Micropropagation of Mokara orchid by temporary immersion system technique | |
| Lian et al. | Mass production of lilium bulblets in bioreactors | |
| Huong et al. | Optimisation of an in vitro propagation protocol for a valuable lily (Lilium spp.) | |
| Sharan et al. | Diversity in callus organization in Eclipta alba Hassak | |
| RU2798519C1 (en) | Method for accelerated production of healthy virus-free plants of berry crops in vitro | |
| Karadag et al. | The comparison of plant regeneration between Jerusalem artichoke and purple potato cultured on MS media with different concentrations and combinations of plant growth regulators |