RU2648169C1 - Ферментный биокатализатор с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений - Google Patents
Ферментный биокатализатор с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений Download PDFInfo
- Publication number
- RU2648169C1 RU2648169C1 RU2017101197A RU2017101197A RU2648169C1 RU 2648169 C1 RU2648169 C1 RU 2648169C1 RU 2017101197 A RU2017101197 A RU 2017101197A RU 2017101197 A RU2017101197 A RU 2017101197A RU 2648169 C1 RU2648169 C1 RU 2648169C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- biocatalyst
- antioxidant
- enzymatic
- complex
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 162
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 162
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 title claims abstract description 80
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 60
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims abstract description 60
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 108010053512 phosphorylphosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 16
- 150000002903 organophosphorus compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 6
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-catechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 claims abstract description 5
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 229950001002 cianidanol Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 claims abstract description 5
- AETKQQBRKSELEL-UHFFFAOYSA-N (2E)-1-(2-hydroxyphenyl)-3-phenylprop-2-en-1-one Natural products OC1=CC=CC=C1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 AETKQQBRKSELEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 4
- AETKQQBRKSELEL-ZHACJKMWSA-N 2'-hydroxychalcone Chemical compound OC1=CC=CC=C1C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 AETKQQBRKSELEL-ZHACJKMWSA-N 0.000 claims abstract description 3
- DCYOADKBABEMIQ-OWMUPTOHSA-N myricitrin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O DCYOADKBABEMIQ-OWMUPTOHSA-N 0.000 claims abstract description 3
- DCYOADKBABEMIQ-FLCVNNLFSA-N myricitrin Natural products O([C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)C1=C(c2cc(O)c(O)c(O)c2)Oc2c(c(O)cc(O)c2)C1=O DCYOADKBABEMIQ-FLCVNNLFSA-N 0.000 claims abstract description 3
- UDOOPSJCRMKSGL-ZHACJKMWSA-N (e)-3-(2-hydroxyphenyl)-1-phenylprop-2-en-1-one Chemical compound OC1=CC=CC=C1\C=C\C(=O)C1=CC=CC=C1 UDOOPSJCRMKSGL-ZHACJKMWSA-N 0.000 claims abstract 2
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 150000001789 chalcones Chemical class 0.000 claims abstract 2
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 claims abstract 2
- FHFSSMDJUNVMNY-UHFFFAOYSA-N tectoridin Natural products COc1c(O)c2C(=O)C(=COc2cc1OC3OC(CO)C(O)C(O)C3O)c4cccc(O)c4 FHFSSMDJUNVMNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 8
- TZJALUIVHRYQQB-XFDQAQKOSA-N Icariin Natural products O(C)c1ccc(C2=C(O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O3)C(=O)c3c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)c(C/C=C(\C)/C)c3O2)cc1 TZJALUIVHRYQQB-XFDQAQKOSA-N 0.000 claims description 4
- TZJALUIVHRYQQB-XLRXWWTNSA-N icariin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(O[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O2)O)C(=O)C2=C(O)C=C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C(CC=C(C)C)=C2O1 TZJALUIVHRYQQB-XLRXWWTNSA-N 0.000 claims description 4
- TZJALUIVHRYQQB-UHFFFAOYSA-N icariine Natural products C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(OC2C(C(O)C(O)C(C)O2)O)C(=O)C2=C(O)C=C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CC=C(C)C)=C2O1 TZJALUIVHRYQQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OBBCRPUNCUPUOS-UHFFFAOYSA-N tectorigenin Chemical compound O=C1C2=C(O)C(OC)=C(O)C=C2OC=C1C1=CC=C(O)C=C1 OBBCRPUNCUPUOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- UYLQOGTYNFVQQX-UHFFFAOYSA-N psi-tectorigenin Natural products COC1=C(O)C=C(O)C(C2=O)=C1OC=C2C1=CC=C(O)C=C1 UYLQOGTYNFVQQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OYUJPVCKGSEYDD-UHFFFAOYSA-N tectorigenin Natural products COc1c(O)cc2OCC(C(=O)c2c1O)c1ccc(O)cc1 OYUJPVCKGSEYDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 claims 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 claims 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 claims 1
- CNOURESJATUGPN-UDEBZQQRSA-N tectoridin Chemical compound C1=C2OC=C(C=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)C2=C(O)C(OC)=C1O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O CNOURESJATUGPN-UDEBZQQRSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 abstract description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 abstract description 2
- -1 icarian Chemical compound 0.000 abstract description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 abstract description 2
- XKNZYDKRYPYTHS-UHFFFAOYSA-N irisolidone-7-O-alpha-D-glucoside Natural products COc1ccc(cc1)C2=COc3cc(OC4OC(CO)C(O)C(O)C4O)c(OC)c(O)c3C2=O XKNZYDKRYPYTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 15
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 5
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003987 organophosphate pesticide Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 5
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- UDOOPSJCRMKSGL-UHFFFAOYSA-N 3-(2-hydroxyphenyl)-1-phenylprop-2-en-1-one Chemical compound OC1=CC=CC=C1C=CC(=O)C1=CC=CC=C1 UDOOPSJCRMKSGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000006996 Aryldialkylphosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108010008184 Aryldialkylphosphatase Proteins 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 3
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005944 Chlorpyrifos Substances 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N chlorpyrifos Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=NC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N diazinon Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC(C)=NC(C(C)C)=N1 FHIVAFMUCKRCQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N paraoxon Chemical compound CCOP(=O)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004623 paraoxon Drugs 0.000 description 2
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RLBIQVVOMOPOHC-UHFFFAOYSA-N parathion-methyl Chemical compound COP(=S)(OC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 RLBIQVVOMOPOHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N Sarin Chemical compound CC(C)OP(C)(F)=O DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N Soman Chemical compound CC(C)(C)C(C)OP(C)(F)=O GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- NHWZQIYTQZEOSJ-UHFFFAOYSA-N carbonic acid;phosphoric acid Chemical compound OC(O)=O.OP(O)(O)=O NHWZQIYTQZEOSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004783 oxidative metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- IBIRZFNPWYRWOG-UHFFFAOYSA-N phosphane;phosphoric acid Chemical compound P.OP(O)(O)=O IBIRZFNPWYRWOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
- A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
- A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
- A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
- A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
- A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
- A62D2101/04—Pesticides, e.g. insecticides, herbicides, fungicides or nematocides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
- A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
- A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
- A62D2101/20—Organic substances
- A62D2101/26—Organic substances containing nitrogen or phosphorus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Emergency Management (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментным биокатализаторам для детоксификации фосфорорганических соединений (ФОС) и нейтрализации активных форм кислорода. Ферментный биокатализатор представляет собой лиофилизованный нековалентный комплекс между гексагистидинсодержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы и антиоксидантом, выбранным из флавоноидов: апигенина, икариина, катехина, мирицетрина, текторигенина, текторидина, или халконоидов: 2-гидроксихалкона, 2'-гидроксихалкона. Биокатализатор получают в результате смешивания растворов указанных компонентов так, чтобы мольное соотношение составляло от 1:1 до 100:1 между антиоксидантом и ферментом или фермент-полиэлектролитным комплексом на основе поли-L-глутаминовой кислоты или ее блок-сополимера с полиэтиленгликолем, замораживания полученной смеси при температуре не выше минус 40°С и ее последующей лиофилизации до остаточной влажности 2-4%. Изобретение позволяет получать биокатализатор с двойной активностью: органофосфатгидролазной и антиоксидантной, и осуществлять детоксификацию фосфорорганических соединений и нейтрализовать активные формы кислорода. При этом биокатализатор обладает повышенной стабильностью и увеличенным сроком хранения. 1 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к ферментным биокатализаторам в виде наноразмерных частиц, предназначенных для детоксификации фосфорорганических соединений (ФОС) и нейтрализации активных форм кислорода, представляющих собой лиофилизованный нековалентный комплекс между антиоксидантом и гексагистидинсодержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы (His6-ОРН), получающийся в результате смешивания растворов указанных компонентов так, чтобы мольное соотношение составляло от 1:1 до 100:1 между антиоксидантом и ферментом или его полиэлектролитным комплексом, замораживания полученной смеси при температуре не выше минус 40°С и ее последующей лиофилизации до остаточной влажности 2-4%.
Такой биокатализатор обладает двойной активностью органофосфатгидролазной и антиоксидантной, то есть способен осуществлять детоксификацию фосфорорганических соединений и нейтрализацию активных форм кислорода, а также обладает повышенной стабильностью и длительным сроком хранения. Изобретение может быть использовано для детоксификации ФОС, попадающих в организм человека или животных трансдермально, ингаляторно или перорально с продуктами питания, питьевыми источниками или в результате чрезвычайных ситуаций (утечек ФОС при их производстве, применении, транспортировке, хранении или утилизации, в результате катастроф или террористических актов).
К числу ФОС, являющихся эфирами ортофосфорной и алкилфосфоновой кислот, относятся широко применяемые в сельском, приусадебном и домашнем хозяйстве фосфорорганические пестициды, а также ингибиторы коррозии и антинакипины, применяемые в теплоэнергетике, нефте- и газодобывающей промышленности, пластификаторы и стабилизаторы, используемые в строительной промышленности, в составе моющих и чистящих средств промышленного назначения, а также высокотоксичные боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия: зоман, зарин, Vx, вещества типа Vx и продукты их разложения (метилфосфоновая кислота и ее эфиры) [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2013 год. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России) http://www.mcx.ru/documents/document/v7_show/20198.285.htm; Балабин Ю.В., Костенко Г.И. Антинакипины - органофосфонаты в энергетике. История и современная практика. // Энергоснабжение и водоподготовка, 2013, Т. 82 (№2), с. 2-8; Холстов В.И. Уничтожение запасов химического оружия в России на завершающем этапе. // Теоретическая и прикладная экология, 2014, №4, с. 8-11].
ФОС, обладающие свойствами нейротоксинов, мутагенов и канцерогенов, попадая в организм человека, индуцируют развитие процессов окислительного метаболизма токсинов, которые происходят через их окисление под действием вырабатываемых в организме активных форм кислорода, избыток которых и приводит к оксидативному стрессу, провоцирующему в свою очередь развитие различных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона, атеросклероза, онкогенеза и т.д.). Применение антиоксидантов при попадании ФОС в организм человека и животных направлено на преодоление этих негативных последствий [Nurulain S.M., Szegi P., Tekes K., Naqvi S.N.H (2013) Antioxidants in organophosphorus compounds poisoning. Arh. Hig. Rada Toksikol, 64 p. 169-177].
Комбинирование природных антиоксидантов, снижающих последствия интоксикации ФОС, с биокатализаторами, способными осуществлять их гидролитическую детоксификацию и снижать, таким образом, их концентрацию в организме, является высокоэффективным решением задачи защиты организма человека как от воздействия самих ФОС, так и от последствий этого воздействия, то есть от активных форм кислорода, вырабатываемых в организме в ответ на проникновение в него ФОС. Однако сегодня не известен ни один ферментный биокатализатор, который бы одновременно обладал способностью осуществлять гидролиз ФОС и нейтрализовать действие активных форм кислорода. Известны лишь ферментные биокатализаторы, способные осуществлять только гидролитическую детоксификацию ФОС, и отдельно применяемые антиоксиданты, не способные осуществить детоксификацию ФОС, то есть не избавляющие организм от прямого негативного воздействия ФОС.
Ферментом, наиболее эффективно осуществляющим биодеструкцию самого широкого спектра ФОС, признана органофосфатгидролаза (ОРН, КФ 3.1.8.1), однако введение в молекулу ОРН полигистидинсодержащей последовательности позволяет получить полипептид с активностью ОРН, который характеризуется существенно улучшенными (по отношению к исходному ферменту) каталитическими характеристиками в реакциях детоксификации различных ФОС [Патент РФ 2255975, МПК7 C12N 1/21, C12N 15/52, C12N 15/70. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы; Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. (2006) Свойства гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы. // Биохимия, Т. 76 (2), с. 216-222]. Наличие именно полигистидиновой последовательности в молекуле полипептида позволяет проводить его быструю очистку и выделение из клеток E.coli с использованием металл-хелатирующей хроматографии [Efremenko Е., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. (2006) Purification of His6-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microb. Biotech., V. 70(5), p. 558-563], и, следовательно, масштабирование процесса его наработки с целью использования при получении заявляемого ферментного биокатализатора легко реализуемо. Именно использование гексагистидинсодержащего полипептида с ОРН-активностью (His6-OPH) для разработки ферментных биокатализаторов, осуществляющих гидролитическую детоксификацию ФОС in vivo, является наиболее рациональным.
Поскольку His6-OPH имеет оптимум действия при pH 10,5 [Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. (2006) Свойства гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы. // Биохимия, Т. 76 (2), с. 216-222], а применение ферментного биокатализатора на его основе в физиологических условиях требует от него проявления максимальной активности при pH 7,3-7,5, то необходима стабилизация фермента в конформации, соответствующей его максимально активному состоянию. Для такой стабилизации и получения ферментного биокатализатора для детоксификации ФОС с высокой активностью наиболее целесообразным является формирование нековалентных комплексов His6-OPH с различными стабилизаторами фермента, то есть образующихся за счет слабых, но множественных химических взаимодействий без применения химических сшивающих агентов.
Сегодня известен ферментный биокатализатор для детоксификации ФОС на основе His6-OPH, получаемый путем смешивания растворов фермента и полимера, являющегося полианионом, с целью формирования между противоположно заряженными функциональными группами, находящимися на поверхности молекулы фермента и в составе выбранного полимера, множественных межмолекулярных ионных связей, стабилизирующих и поддерживающих каталитически активную конформацию фермента [Патент РФ 2525658 (2014), МПК7 C12N 11/02, C12N 11/08, C12N 9/16. Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo]. При этом в качестве полианиона используется блок-сополимер полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, имеющий разную степень полимеризации. Формирующийся при этом наноразмерный ферментный биокатализатор предполагает такое смешивание растворов фермента и полианиона, которое позволяет получить зарядовое соотношение между положительными и отрицательными группами на поверхности фермента и блок-сополимера из диапазона от 2:1 до 1:5 [Lyagin I.V., Andrianova M.S., Efremenko E.N. (2016) Extensive hydrolysis of phosphonates as unexpected behaviour of the known His6-organophosphorus hydrolase. // Appl. Microb. Biotech., V. 100 (13), p. 5829-5838; Efremenko E.N., Lyagin I.V., Klyachko N.L., Bronich Т., Zavialova N.V., Yuhang Jiang, Kabanov A.V. (2017) A simple and highly effective catalytic nanozyme scavenger for organophosphorus neurotoxins. // J. Control. Release, 2017, V. 247, p. 175-181]. Для этого используют 1 г/л раствора His6-OPH в буфере (pH 7,5-10,5) и 20 г/л водного раствора ПЭГ119-ПГК50 (Mw=13 кг/моль) или ПЭГ119-ПГК10 (Mw=6,5 кг/моль). Приготовленную смесь указанных растворов оставляют при температуре +8 ÷ +30°С для экспонирования в течение 20÷40 мин для формирования ферментного биокатализатора в виде нековалентного полиэлектролитного комплекса с размером наночастиц 27±4 ÷ 30±5 нм.
Каталитическая константа действия такого ферментного биокатализатора по фосфорорганическим пестицидам Параоксону, Хлорпирифосу, Паратиону, Диазинону, Метилпаратиону, Кумафосу составляет соответственно 5010±60 с-1, 482±25 с-1, 1040±80 с-1, 85,6±5,1 с-1, 309±15 с-1, 335±15 с-1; константа Михаэлиса - 16,7±0,9 мкМ, 150±10 мкМ, 20,1±1,7 мкМ, 202±13 мкМ, 34,5±1,9 мкМ, 350±20 мкМ; константа эффективности действия - (3,0±0,2)×108 М-1с-1 (3,2±0,4)×106 MV, 5,2±0,8)×107 MV, (4,2±0,5)×105 MV1, (9,0±0,9)×106 MV, (9,6±1,0)×105 М-1с-1. Снижение активности данного биокатализатора, выдержанного при 55°С в течение 15 мин, составляет 2-5%. Полученный ферментный биокатализатор функционирует в диапазоне pH 7,0-12,0 и температур 15-60°С. Расчетный период полуинактивации биокатализатора при 37°С составляет как минимум 500 ч.
Описанный ферментный биокатализатор обладает рядом недостатков, а именно:
- биокатализатор представляет собой водный раствор ферментного комплекса с полимером, длительное хранение которого, а также транспортировка составляют большую проблему из-за того, что данный раствор занимает определенный объем, который не может быть уменьшен, кроме того, хранение и транспортировка ферментного биокатализатора требуют строгого соблюдения определенных условий (допустимая температура +4÷30°С), из-за чего биокатализатор длительно не хранится и используется в свежеприготовленном виде;
- ферментный биокатализатор приготовлен в виде раствора со строго определенной концентрацией комплекса фермента с полианионом, которая может быть изменена (увеличена) только за счет увеличения объема вводимого раствора и, соответственно, увеличения времени введения нужной дозы для детоксификации ФОС, что может иметь негативные последствия для организма;
- ферментный биокатализатор предполагает использование для его получения строго определенного полианиона, представляющего собой дорогостоящий блок-сополимер полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты со строго определенной молекулярной массой и соотношением мономерных звеньев, производство которого ограничено;
- приготовление ферментного биокатализатора предполагает получение комплекса между ферментом и блок-сополимером при четком соблюдении соотношения между зарядами на поверхности молекулы белка и в составе полимера в диапазоне от 2:1 до 1:5, однако любое изменение pH растворов, используемых для приготовления такого комплекса, ведет к изменению числа и соотношения между зарядами, что сильно усложняет процесс приготовления такого биокатализатора с требуемыми характеристиками;
- отсутствие среди свойств этого ферментного биокатализатора возможности его использования для нейтрализации активных форм кислорода, синтезируемых в организме при метаболически запрограммированной окислительной детоксификации ФОС.
Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по своему назначению и способу получения, а именно по получению ферментного биокатализатора для детоксификации ФОС в виде наноразмерных частиц с органофосфатгидролазной активностью, представляющего собой нековалентный комплекс His6-OPH со стабилизатором, принято за прототип.
Задачей данного изобретения является разработка ферментного биокатализатора для детоксификации ФОС в виде наноразмерных частиц на основе His6-OPH, который, в отличие от прототипа, представляет собой лиофилизованный нековалентный комплекс фермента с антиоксидантом, обеспечивающим биокатализатор одновременно высокой органофосфатгидролазной и антиоксидантной активностью с повышенной стабильностью и длительным сроком хранения.
Поставленная задача решается тем, что ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений с ферментативной и антиоксидантной активностью в виде наноразмерных частиц лиофилизованного нековалентного комплекса фермента, представляющего собой His6-OPH, или его полиэлектролитного комплекса, со стабилизатором, в качестве которого используют антиоксидант, получают в результате смешивания растворов указанных компонентов так, чтобы мольное соотношение составляло от 1:1 до 100:1 между антиоксидантом и ферментом или его полиэлектролитным комплексом, замораживания полученной смеси при температуре не выше минус 40°С и ее последующей лиофилизации до остаточной влажности 2-4%.
Применение антиоксиданта для получения нековалентного комплекса с ферментом His6-OPH позволяет:
- заменить, в сравнении с прототипом, сложно производимый и потому дорогостоящий блок-сополимер в нековалетном комплексе с ферментом на относительно низкомолекулярное соединение, которое может быть выделено из разных растительных источников, что существенно упрощает получение целевого ферментного биокатализатора и делает его применение значительно более экономически привлекательным;
- использовать при формировании ферментного биокатализатора легко рассчитываемых мольных соотношений между ферментом и антиоксидантом вместо зарядовых соотношений, установленных в прототипе между ферментом и блок-сополимером, что существенно упрощает сам процесс получения биокатализатора, так как молекулярная масса и мольные концентрации веществ, взятых для получения комплекса, не изменяются, в отличие от зарядов, при варьировании pH среды;
- использовать различные вещества, обладающих антиоксидантной активностью, например катехин, икариин, текторидин, текторигенин, 2-гидроксихалкон, 2'-гидроксихалкон, апигенин, мирицетрин при формировании ферментного биокатализатора в виде нековалентного комплекса между антиоксидантом и ферментом, при этом не исчерпывая список антиоксидантов указанными примерами;
- широко варьировать мольное соотношение между компонентами в составе ферментного биокатализатора, увеличивая или уменьшая по необходимости его ферментативную или антиоксидантную активность, что позволяет потенциально расширить возможный спектр применения такого ферментного биокатализатора для профилактических (с большей антиоксидативной активностью) и антидотных (с большей органофосфатгидролазной активностью) целей;
- получить возможность перехода к лиофилизованным формам ферментного биокатализатора с длительным сроком хранения, так как применение низкомолекулярных стабилизаторов для фермента в виде антиоксидантов не приводит, в отличие от полимерного стабилизатора в виде блок-сополимера, используемого в прототипе, к получению нерастворимых форм после высушивания нековалентных комплексов;
- получить возможность формирования нековалентных комплексов не только с нативным ферментом, но и с его полиэлектролитными комплексами, дополнительно стабилизируя фермент и придавая получаемому ферментному биокатализатору добавочную антиоксидантную активность;
- значительно стабилизировать и увеличивать срок хранения ферментного биокатализатора благодаря нековалентной стабилизации активной конформации фермента антиоксидантом за счет возникающих между ними межмолекулярных взаимодействий, но и обеспечить антиоксидантную защиту самого фермента от воздействия активных форм кислорода при его хранении и функционировании в зоне детоксификации ФОС;
- удерживать антиоксидант за счет формируемого нековалентного комплекса с ферментом в месте локализации проводимых процессов детоксификации ФОС с использованием ферментного биокатализатора.
Простое смешивание растворов фермента и антиоксиданта позволяет первоначально получить нековалентное межмолекулярное взаимодействие между этими веществами, а потом за счет глубокого снижения температуры полученной биокаталитической системы до температуры не выше минус 40°С дополнительно зафиксировать активную конформацию молекулы фермента без применения каких-либо сшивающих химических агентов, формирующих ковалентные связи между функциональными группами.
Температура замораживания образующегося нековалентного комплекса (не выше минус 40°С) крайне важна для последующего получения ферментного биокатализатора в результате лиофилизации, поскольку сублимационная сушка, которая при этом происходит, приводит к нагреву высушиваемого образца на 60-70°С от его исходной температуры. Таким образом, конечная температура получаемого ферментного биокатализатора при его лиофилизации не должна превышать 30°С, чтобы максимально сохранить его органофосфатгидролазную и антиоксидантную активности.
В результате замораживания полученной смеси водных растворов фермента и антиоксиданта при их строгом мольном соотношении происходит увеличение концентрации антиоксиданта в приповерхностном слое молекулы фермента за счет того, что растворитель (вода) превращается в лед (вымораживается), число дополнительных образующихся межмолекулярных связей увеличивается, система значительно стабилизируется, что выражается в увеличении стабильности сформированного нековалентного комплекса при использовании (на примере сред с таким наиболее токсичным для фермента органическим растворителем как изопропанол) и хранении.
Мольное соотношение, которое используют при получении ферментного биокатализатора, варьируется в диапазоне от 1:1 до 100:1 между антиоксидантом и ферментом или его полиэлектролитным комплексом и определяется тем, что уменьшение соотношения 1:1 приводит к снижению доли антиоксиданта в смеси и к тому, что часть фермента остается в нативном состоянии, то есть в состоянии, не стабилизированном антиоксидантом, что приводит к потере таким ферментом или его полиэлектролитным комплексом активности при его последующем последовательном замораживании и лиофилизации. Максимальное соотношение 100:1 между антиоксидантом и ферментом или его полиэлектролитным комплексом определяется, с одной стороны, водорастворимостью антиоксиданта, которую необходимо учитывать при приготовлении его раствора для приготовления ферментного биокатализатора, а с другой стороны, использование сверхизбыточного количества антиоксиданта по отношению к ферменту приводит к тому, что часть антиоксиданта остается не вступившей в образование комплекса с ферментом, и снижается удельная активность ферментного биокатализатора.
Лиофилизация нековалентного фермент-оксидантного комплекса до остаточной влажности 2-4% обусловлена тем, что сублимационная сушка до меньшей остаточной влажности приводит к частичной денатурации белка в составе получаемого ферментного биокатализатора и к потере им как ферментативной, так и антиоксидантной активности, а сохранение большего процента остаточной влаги нецелесообразно из-за сокращения срока хранения ферментного биокатализатора вследствие его постепенной инактивации.
Лиофилизация нековалентного фермент-оксидантного комплекса с целью получения конечного ферментного биокатализатора позволяет:
- получить и сохранить в течение длительного времени сформированный комплекс антиоксиданта с ферментом или его полиэлектролитным комплексом в сухом, стабильном и активном состоянии при комнатной температуре;
- получить возможность последующей регидратации сухой формы ферментного биокатализатора с потенциалом приготовления растворов с разной концентрацией, а, следовательно, и с разной активностью (ферментативной и антиоксидантной) для проведения детоксификации ФОС. При этом становится возможным варьирование вводимых доз ферментного биокатализатора без изменения, в отличие от прототипа, общего объема вводимого в организм раствора и без увеличения времени его введения.
В отличие от прототипа при использовании в качестве стабилизатора очищенного фермента такого низкомолекулярного, в сравнении с блок-сополимером, вещества как антиоксидант, происходит формирование ферментного биокатализатора в виде нековалентного комплекса с существенно меньшим размером наночастиц - от 10±2 до 20±4 нм, тогда как в прототипе 27±4 ÷ 30±5 нм, что должно способствовать повышению проникающей способности заявляемого ферментного биокатализатора in vivo и делать его мишени более доступными при детоксификации ФОС и взаимодействии с активными формами кислорода. При этом сохраняется возможность получения нековалентного комплекса антиоксиданта с ферментом, когда фермент уже включен в состав полиэлектролитного комплекса, приготовленного на основе His6-OPH и полианиона, согласно различным известным методам [Лягин И.В., Ефременко Е.Н., Кабанов А.В. (2014) Каталитические характеристки фермент-полиэлектролитных комплексов на основе гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы // Вестник Моск. ун-та Серия 2: Химия, Т. 55 (3), с. 167-173; Maslova O.V., Stepanov N.A., Grigoryeva A.I., Bruyako M.G., Efremenko E.N. (2016) New effective enzymatic biopreparations based on application of mineral carriers treated by low-temperature plasma for destruction of organophosphates in soil // Int. J. Pharm. Technol., 2016, Vol. 8 (4), p. 22679-22694; Efremenko E.N., Lyagin I.V., Klyachko N.L., Bronich Т., Zavialova N.V., Yuhang Jiang, Kabanov A.V. (2017) A simple and highly effective catalytic nanozyme scavenger for organophosphorous neurotoxins. // J. Control. Release, V. 247, p. 175-181].
Такое сочетание основных компонентов ферментного биокатализатора с антиоксидантными свойствами для детоксификации ФОС, которое указано в заявляемом техническом решении, при заявляемых соотношениях антиоксиданта и фермента или его полиэлектролитного комплекса, эффективное взаимодействие между которыми в результате смешивания их водных растворов, приводящее к формированию нековалентных наноразмерных частиц с их последующим замораживанием и лиофилизацией, ранее известно не было и позволяет характеризовать предлагаемое техническое решение как новое.
Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.
Пример 1. Ферментный биокатализатор, с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений, полученный при мольном соотношении 1:1 между антиоксидантом апигенином и ферментом His6-OPH
В водный раствор 5 мг/л апигенина (Mw=270,2 г/моль) вносят аликвоту 1 г/л раствора очищенного фермента His6-OPH [Efremenko Е., Lyagin I., Votchitseva Y., Sirotkina M., Varfolomeyev S. Polyhistidine-containing organophosphorus hydrolase with outstanding properties. // Biocat. Biotransform., 2007, V. 25 (1), p. 103-108] (Mw=36 кДа), приготовленного на основе 100 мМ карбонатного буфера (pH 10,5), так, чтобы мольное соотношение между антиоксидантом и ферментом составило 1:1. Приготовленную смесь перемешивают, помещают в сублиматор лиофильной установки и проводят замораживание препарата при температуре -40°С, а далее проводят лиофилизацию образца при остаточном давлении в камере сублиматора, не превышающем 10 Па, до остаточной влажности 2%.
Полученный образец при его регидратации до его исходного объема, который был перед лиофилизацией, представляет собой гомогенный раствор, содержащий частицы комплекса фермента с антиоксидантом, которые имеют размер 10±2 нм. Полученный ферментный биокатализатор проявляет органофосфатгидролазную активность в диапазоне температур 10-65°С при pH 6,5-12,5.
При гидролизе такого фосфорорганического пестицида как Параоксон полученный ферментный биокатализатор имеет каталитическую константу 5120±30 с-1; константу Михаэлиса - 16,5±0,6 мкМ и константу эффективности действия - (3,1±0,3)×108 М-1с-1. Антиоксидантная активность полученного ферментного биокатализатора при ее определении с применением стабильных радикалов + (АБТС) по стандартной методике [Seyoum A., Asres K., El-Fiky F.K. (2006) Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids. // Phytochemistry, V. 67, p. 2058-2070] составляет IC50=1,21±0,10 мкг/мл, что превышает эффективность действия контрольного антиоксиданта витамина С, испытанного в аналогичных условиях (IC50=7,48±0,52 мкг/мл), в 6,2 раза.
Полученный ферментный биокатализатор сохраняет 50% ферментативной активности после его экспонирования в течение 20 мин в среде с 5 об. % изопропанола, тогда как нативный фермент His6-OPH в аналогичных условиях теряет полностью свою активность через 3 мин.
Полученный лиофилизованный образец ферментного биокатализатора при его хранении в герметичных условиях при комнатной температуре сохраняет свои каталитические и антиоксидантные свойства на 95% в течение 300 сут.
Пример 2. Ферментный биокатализатор, с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений, полученный при мольном соотношении 10:1 между антиоксидантом катехином и ферментом His6-OPH
В водный раствор 0,05 г/л катехина (Mw=290 г/моль) вносят аликвоту 1 г/л раствора очищенного фермента His6-OPH, приготовленного на основе 50 мМ карбонатного буфера (pH 10,0), так, чтобы мольное соотношение между антиоксидантом и ферментом составило 10:1. Приготовленную смесь перемешивают, помещают в сублиматор лиофильной установки и проводят замораживание препарата при температуре -70°С, а далее проводят лиофилизацию образца при остаточном давлении в камере сублиматора, не превышающем 10 Па, до остаточной влажности 4%.
Полученный образец при его регидратации до его исходного объема, который был перед лиофилизацией, представляет собой гомогенный раствор, содержащий частицы комплекса фермента с антиоксидантом, которые имеют размер 12±3 нм. Полученный ферментный биокатализатор проявляет органофосфатгидролазную активность в диапазоне температур 10-65°С при pH 6,5-12,5. В реакции гидролиза такого фосфорорганического пестицида как Паратион полученный ферментный биокатализатор имеет каталитическую константу - 1150±50 с-1; константу Михаэлиса - 20,1±1,1 мкМ и константу эффективности действия - (5,7±0,5)×107 М-1с-1. Антиоксидантная активность полученного ферментного биокатализатора при ее определении с применением стабильных радикалов (АБТС) по стандартной методике составляет IC50=1,44±0,04 мкг/мл, что превышает эффективность действия контрольного антиоксиданта витамина С, испытанного в аналогичных условиях, в 5,2 раза. Полученный ферментный биокатализатор сохраняет 55% ферментативной активности после его экспонирования в течение 20 мин в среде с 5 об. % изопропанола.
Полученный лиофилизованный образец ферментного биокатализатора при его хранении в герметичных условиях при комнатной температуре сохраняет свои каталитические и антиоксидантные свойства на 95% в течение 320 сут.
Пример 3. Ферментный биокатализатор, с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений, полученный при мольном соотношении 100:1 между антиоксидантом икариином и ферментом His6-OPH
В водный раствор 0,1 г/л икариина (Mw=676 г/моль) вносят аликвоту 1 г/л раствора очищенного фермента His6-OPH, приготовленного на основе 100 мМ карбонатно-фосфатного буфера (pH 8,5), так, чтобы мольное соотношение между антиоксидантом и ферментом составило 100:1. Приготовленную смесь перемешивают, помещают в сублиматор лиофильной установки и проводят замораживание препарата при температуре -50°С, а далее проводят лиофилизацию образца при остаточном давлении в камере сублиматора, не превышающем 10 Па, до остаточной влажности 4%.
Полученный образец при его регидратации до его исходного объема представляет собой гомогенный раствор, содержащий частицы комплекса фермента с антиоксидантом, которые имеют размер 20±4 нм.
В реакции гидролиза фосфорорганического пестицида Диазинон полученный ферментный биокатализатор имеет каталитическую константу - 98,0±3,5 с-1; константу Михаэлиса - 210±7 мкМ и константу эффективности действия - (4,7±0,5)×105 M-1с-1. Антиоксидантная активность полученного ферментного биокатализатора при ее определении с применением стабильных радикалов (АБТС) по стандартной методике составляет IC50=6,71±0,01 мкг/мл, что превышает эффективность действия контрольного антиоксиданта витамина С, испытанного в аналогичных условиях в 1,2 раза.
Полученный ферментный биокатализатор сохраняет 59% ферментативной активности после его экспонирования в течение 20 мин в среде с 5 об. % изопропанола. Полученный лиофилизованный образец ферментного биокатализатора при его хранении в герметичных условиях при комнатной температуре сохраняет свои каталитические и антиоксидантные свойства на 95% в течение 350 сут.
Пример 4. Ферментный биокатализатор, с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений, полученный при мольном соотношении 10:1 между антиоксидантом 2-гидроксихалконом и ферментом His6-OPH, находящемся в составе полиэлектролитного комплекса
В водный раствор 0,05 г/л 2-гидроксихалкона (Mw=224 г/моль) вносят аликвоту 2 г/л раствора нековалентного комплекса фермента His6-OPH и блок-сополимера ПЭГ119-ПГК50 (Mw=13 кг/моль), полученного как описано в примере 1 прототипа при зарядовом соотношении фермента и блок-сополимера 2:1 [Патент РФ 2525658 (2014), МПК7 C12N 11/02, C12N 11/08, C12N 9/16. Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo], приготовленного на основе 100 мМ карбонатного буфера (pH 10,5), так, чтобы мольное соотношение между антиоксидантом и ферментом составило 1:1. Приготовленную смесь перемешивают, помещают в сублиматор лиофильной установки и проводят замораживание препарата при температуре -70°С, а далее проводят лиофилизацию образца до остаточной влажности 3%.
Полученный образец при его регидратации до его исходного объема, который был перед лиофилизацией, представляет собой гомогенный раствор, содержащий частицы комплекса фермента с антиоксидантом, которые имеют размер 29±2 нм.
Полученный ферментный биокатализатор проявляет органофосфатгидролазную активность в диапазоне температур 15-65°С при pH 7,0-12,5. При гидролизе такого фосфорорганического пестицида как Хлорпирифос полученный ферментный биокатализатор имеет каталитическую константу 510±20 с-1; константу Михаэлиса 145±12 мкМ и константу эффективности действия - (3,5±0,2)×106 М-1с-1. Антиоксидантная активность полученного ферментного биокатализатора при ее определении с применением стабильных радикалов (АБТС) по стандартной методике составляет IC50=5,28±0,32 мкг/мл, что превышает эффективность действия контрольного антиоксиданта витамина С, испытанного в аналогичных условиях в 1,4 раза.
Полученный ферментный биокатализатор сохраняет 35% ферментативной активности после его экспонирования в течение 20 мин в среде с 5 об. % изопропанола.
Полученный лиофилизованный образец ферментного биокатализатора при его хранении в герметичных условиях при комнатной температуре сохраняет свои каталитические и антиоксидантные свойства на 90% в течение 420 сут.
Пример 5. Ферментный биокатализатор, с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений, полученный при мольном соотношении 50:1 между антиоксидантом 2'-гидроксихалконом и ферментом His6-OPH, находящемся в составе полиэлектролитного комплекса
В водный раствор 0,1 г/л 2'-гидроксихалкона (Mw=224 г/моль) вносят аликвоту 5 г/л раствора нековалентного комплекса фермента His6-OPH и поли-L-глутаминовой кислоты (Mw=7,5 кг/моль), полученного по известному способу [Maslova O.V., Stepanov N.A., Grigoryeva A.I., Bruyako M.G., Efremenko E.N. (2016) New effective enzymatic biopreparations based on application of mineral carriers treated by low-temperature plasma for destruction of organophosphates in soil // Int. J. Pharm. Technol., 2016, Vol. 8 (4), p. 22679-22694] при зарядовом соотношении фермента и полимера 1:5, так, чтобы мольное соотношение между антиоксидантом и ферментом составило 1:1. Приготовленную смесь перемешивают, помещают в сублиматор лиофильной установки и проводят замораживание препарата при температуре -40°С, а далее проводят лиофилизацию образца до остаточной влажности 4%.
Полученный образец при его регидратации до его исходного объема, который был перед лиофилизацией, представляет собой гомогенный раствор, содержащий частицы комплекса фермента с антиоксидантом, которые имеют размер 36±6 нм.
Полученный ферментный биокатализатор при гидролизе такого фосфорорганического пестицида как Метилпаратион имеет каталитическую константу 360±24 с-1; константу Михаэлиса - 36±6 мкМ и константу эффективности действия - (10,0±0,4)×106 М-1с-1. Антиоксидантная активность полученного ферментного биокатализатора при ее определении с применением стабильных радикалов (АБТС) по стандартной методике составляет IC50=4,10±0,34 мкг/мл, что превышает эффективность действия контрольного антиоксиданта витамина С, испытанного в аналогичных условиях, в 1,8 раза.
Полученный ферментный биокатализатор сохраняет 40% ферментативной активности после его экспонирования в течение 20 мин в среде с 5 об. % изопропанола.
Полученный лиофилизованный образец ферментного биокатализатора при его хранении в герметичных условиях при комнатной температуре сохраняет свои каталитические и антиоксидантные свойства на 90% в течение 380 сут.
Далее для более полного раскрытия сути изобретения в таблице 1 приводятся дополнительные примеры ферментного биокатализатора, полученного в тех же условиях и при том же мольном соотношении антиоксиданта и фермента, как описано в примере 1, только вместо апигинина используют другие антиоксиданты.
Таким образом, данное техническое решение позволяет, в сравнении с прототипом, получить возможность формирования наноразмерных нековалентных комплексов не только с нативным ферментом, но и с его полиэлектролитными комплексами, дополнительно при этом существенно стабилизируя фермент, значительно увеличивая срок его хранения и придавая получаемому ферментному биокатализатору добавочную антиоксидантную активность, что позволяет использовать такой биокатализатор одновременно для детоксификации фосфорорганических соединений и нейтрализации активных форм кислорода.
Claims (1)
- Ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений в виде наноразмерных частиц нековалентного комплекса фермента, представляющего собой гексагистидин-содержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, со стабилизатором, отличающийся тем, что представляет собой лиофилизованный нековалентный комплекс между гексагистидин-содержащим полипептидом со свойствами органофосфатгидролазы и антиоксидантом, выбранным из флавоноидов: апигенина, икариина, катехина, мирицетрина, текторигенина, текторидина, или халконоидов: 2-гидроксихалкона, 2'-гидроксихалкона, проявляющий одновременно ферментативную и антиоксидантную активность и получающийся в результате смешивания растворов указанных компонентов так, чтобы мольное соотношение составляло от 1:1 до 100:1 между антиоксидантом и ферментом или фермент-полиэлектролитным комплексом на основе поли-L-глутаминовой кислоты или ее блок-сополимера с полиэтиленгликолем, замораживания полученной смеси при температуре не выше минус 40°С и ее последующей лиофилизации до остаточной влажности 2-4%.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017101197A RU2648169C1 (ru) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | Ферментный биокатализатор с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017101197A RU2648169C1 (ru) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | Ферментный биокатализатор с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2648169C1 true RU2648169C1 (ru) | 2018-03-22 |
Family
ID=61707981
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017101197A RU2648169C1 (ru) | 2017-01-16 | 2017-01-16 | Ферментный биокатализатор с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2648169C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2743197C1 (ru) * | 2020-03-10 | 2021-02-16 | Елена Николаевна Ефременко | Полифункциональный композитный ферментный препарат для деградации фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и молекул-регуляторов кворума бактериальных патогенов |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2525658C2 (ru) * | 2012-09-13 | 2014-08-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
RU2575627C1 (ru) * | 2014-12-18 | 2016-02-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
-
2017
- 2017-01-16 RU RU2017101197A patent/RU2648169C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2525658C2 (ru) * | 2012-09-13 | 2014-08-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
RU2575627C1 (ru) * | 2014-12-18 | 2016-02-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo |
Non-Patent Citations (4)
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2743197C1 (ru) * | 2020-03-10 | 2021-02-16 | Елена Николаевна Ефременко | Полифункциональный композитный ферментный препарат для деградации фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и молекул-регуляторов кворума бактериальных патогенов |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bigley et al. | The evolution of phosphotriesterase for decontamination and detoxification of organophosphorus chemical warfare agents | |
KR0149997B1 (ko) | 입상 살균제 제품 및 그 제조방법 | |
ES2791485T3 (es) | Método y material para complejación en el sitio activo de moléculas biológicas | |
Pan-utai et al. | Physical extraction and extrusion entrapment of C-phycocyanin from Arthrospira platensis | |
BRPI0509148B1 (pt) | composições farmacêuticas orais de produtos contendo lipase, em particular de pancreatina contendo tensoativos, seus usos e respectivos processos de fabricação | |
MX2007006074A (es) | Composicion de desbridamiento a partir de bromelaina y metodos de produccion de la misma. | |
RU2648169C1 (ru) | Ферментный биокатализатор с антиоксидантной активностью для детоксификации фосфорорганических соединений | |
Chin et al. | Effect of drying on crude ganoderic acids and water soluble polysaccharides content in Ganoderma lucidum | |
KR101649450B1 (ko) | 피부 상처 치료조성물 | |
Maslova et al. | The influence of enzymatic removal of chlorpyrifos from feed grain mixes on biochemical parameters of rat blood | |
Farid et al. | Eobania vermiculata whole-body muscle extract-loaded chitosan nanoparticles enhanced skin regeneration and decreased pro-inflammatory cytokines in vivo | |
JPS62262998A (ja) | 実質的に残存酵素活性を有さないリゾリン脂質含有物の製造法 | |
Song et al. | An integrated quorum quenching biocatalytic nanoplatform for synergistic chemo-photothermal eradication of P. aeruginosa biofilm infections | |
WO2015004305A1 (es) | Péptido con actividad inhibidora de quorum sensing, polinucleótido que codifica dicho péptido y sus aplicaciones | |
ES2796835T3 (es) | Sustancias bioactivas estables y métodos de fabricación | |
Thakur et al. | Packaging of diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) in bacterial outer membrane vesicles protects its activity at extreme temperature | |
RU2615176C1 (ru) | Криосформированный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений | |
Turki et al. | A highly stable Yarrowia lipolytica lipase formulation for the treatment of pancreatic exocrine insufficiency | |
RU2525658C2 (ru) | НАНОРАЗМЕРНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ДЕТОКСИФИКАЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ in vivo | |
Gorshkova et al. | Influence of the structure of alginate-chitosan materials on the kinetics of usnic acid release | |
RU2634914C2 (ru) | Способ биообезвреживания микотоксинов | |
RU2743197C1 (ru) | Полифункциональный композитный ферментный препарат для деградации фосфорорганических пестицидов, микотоксинов и молекул-регуляторов кворума бактериальных патогенов | |
Allahyari et al. | Diisopropyl-fluorophosphatase as a Catalytic Bioscavenger | |
CA2696979A1 (en) | Materials and methods for treating or preventing organophosphate exposure associated damage | |
RU2296164C1 (ru) | Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических боевых отравляющих веществ |