RU2648144C2 - КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ГЕТЕРОГЕННЫЕ ПОПУЛЯЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Ха - Google Patents
КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ГЕТЕРОГЕННЫЕ ПОПУЛЯЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Ха Download PDFInfo
- Publication number
- RU2648144C2 RU2648144C2 RU2016108608A RU2016108608A RU2648144C2 RU 2648144 C2 RU2648144 C2 RU 2648144C2 RU 2016108608 A RU2016108608 A RU 2016108608A RU 2016108608 A RU2016108608 A RU 2016108608A RU 2648144 C2 RU2648144 C2 RU 2648144C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- fxa
- seq
- variant
- amino acid
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 127
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 329
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 322
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 title abstract description 10
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 title abstract description 10
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 title abstract description 10
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 claims abstract description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 120
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 110
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 20
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 20
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 7
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 claims description 6
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 claims description 6
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims description 6
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 claims description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 abstract description 66
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 abstract description 36
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 abstract description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 228
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 118
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 91
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 90
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 101001030665 Dictyostelium discoideum GDP-L-fucose synthase Proteins 0.000 description 43
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 40
- 241000894007 species Species 0.000 description 38
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 35
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 30
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 24
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 24
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 18
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 14
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 14
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- FSNVAJOPUDVQAR-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-amino-2-[[2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCCC(N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 8
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001437 electrospray ionisation time-of-flight quadrupole detection Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 7
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 6
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 5
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700007498 PF-05230907 Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 5
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- -1 cyclic hemiacetal Chemical class 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FSNVAJOPUDVQAR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 4
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 101001052793 Homo sapiens GDP-L-fucose synthase Proteins 0.000 description 4
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 4
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 4
- 102220501226 Scaffold attachment factor B1_I16L_mutation Human genes 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 102000050085 human TSTA3 Human genes 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000012500 ion exchange media Substances 0.000 description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 3
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 3
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 3
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- 102100021546 60S ribosomal protein L10 Human genes 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 2
- 239000013019 capto adhere Substances 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012433 multimodal chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000020971 positive regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 239000002821 viper venom Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000793340 Achromobacter lyticus Protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000001593 Bernard-Soulier syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 102100029117 Coagulation factor X Human genes 0.000 description 1
- 206010067787 Coagulation factor deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000028702 Congenital thrombocyte disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 229920006010 Fractogel SO3 Polymers 0.000 description 1
- 208000013607 Glanzmann thrombasthenia Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N Menaquinone 1 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M Methanesulfonate Chemical compound CS([O-])(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000000392 Thrombasthenia Diseases 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 101710181748 Venom protease Proteins 0.000 description 1
- 102100038182 Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108091005588 alkylated proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010018823 anti-inhibitor coagulant complex Proteins 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 229940105756 coagulation factor x Drugs 0.000 description 1
- 208000014763 coagulation protein disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940105776 factor viii inhibitor bypassing activity Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 108010013113 glutamyl carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000019175 phylloquinone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 1
- MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N 0.000 description 1
- 229960001898 phytomenadione Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005173 quadrupole mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Toxicology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композициям, содержащим рекомбинантные варианты человеческого фактора свертывания крови Ха, что может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают широкое разнообразие изоформ и посттрансляционных модификаций FXa. Изобретение позволяет осуществлять эффективную терапию гемостаза у нуждающихся в этом субъектов. 4 н. и 33 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 7 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ НА ИЗОБРЕТЕНИЕ
В данной заявке на изобретение заявлено преимущество предварительной заявки на патент США №61/881834, поданной 24 сентября 2013 г., включенной в данное описание путем ссылки.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, поданный одновременно с данной заявкой на изобретение в соответствии с 37 CFR §1.821 в машиночитаемой форме (CRF) через EFS-Web в виде файла с названием PC72049_SEQLIST_ST25.txt, включен в данное описание путем ссылки. Электронная копия перечня последовательностей создана 10 сентября 2014 г., где размер файла составляет 31 килобайт.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Эффективные способы терапии необходимы для того, чтобы контролировать чрезмерные кровотечения в ряде клинических состояний, при которых кровотечение нельзя адекватно контролировать путем медицинского или хирургического вмешательства. Данная неудовлетворенная потребность особенно критична для пациентов, страдающих от гемофилии, в особенности тех, у которых заместительная терапия в отношении фактора свертывания крови оказывается менее эффективной вследствие продукции ингибиторных антител.
Активированный фактор свертывания крови X (FXa) занимает центральную позицию в каскаде свертывания крови на схождении внутренних и внешних путей свертывания крови. Связанный с мембраной FXa в присутствии своего кофактора фактора Va (FVa) превращает протромбин в тромбин, который активирует тромбоциты и превращает фибриноген в фибрин с образованием тромба. В принципе, заместительная терапия путем прямого введения FXa может корректировать кровотечение. Тем не менее, терапевтический потенциал FXa ограничен вследствие его очень короткого периода полувыведения из плазмы крови и возможности вызывать чрезмерное свертывание крови вследствие активации других факторов свертывания крови.
В более ранней работе идентифицировали вариант FXa (вариант I16L), в котором лейцин заменял изолейцин по N-концу тяжелой цепи FXa дикого типа (позиция 16 в схеме нумерации химотрипсина). Эта замена приводила к варианту FXa, обладающему зимогеноподобными свойствами. Toso R. et al., The conformational switch from the factor X zymogen to protease state mediates exosite expression and prothrombinase assembly. J. Biol. Chem. 283, 18627-18635 (2008); Ivanciu L. et al., A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nat. Biotechnol. 29:1028-33 (2011).
Будучи не включенным в протромбиназный комплекс со своим кофактором, а именно фактором Va (FVa), вариант FXa I16L не обладал значимой каталитической активностью и был лучше защищен от инактивации ингибиторами сывороточной протеазы по сравнению FXa дикого типа. В результате этот вариант обладал более длительным периодом полувыведения из сыворотки крови по сравнению с FXa дикого типа. Тем не менее, связывание с FVa в протромбиназе приводило к переходу варианта от зимогеноподобного состояния к активной конформации, таким образом, восстанавливая способность этого варианта катализировать превращение протромбина в тромбин и, таким образом, его прокоагулянтную активность. В мышиных моделях гемофилии А и гемофилии В введение варианта FXa I16L до повреждения уменьшало кровопотерю после отсечения хвоста в зависимости от дозы. Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что вариант FXa I16L может быть полезен для лечения неконтролируемого кровотечения у людей, страдающих от гемофилии.
Тем не менее, вариант FXa I16L, используемый в более ранних исследованиях, получали в небольших количествах из стабильно трансфицируемых клеток НЕК 293 с последующей активацией белка FX с использованием протеазы яда гадюки Рассела RWX. Toso R., Zhu H. & Camire R.M. The conformational switch from the factor X zymogen to protease state mediates exosite expression and prothrombinase assembly. J. Biol. Chem. 283, 18627-18635 (2008). Несмотря на пользу данного подхода для мелкомасштабных исследований, он не подходит для продукции больших количеств очищенного варианта белка FXa, необходимых для клинических исследований и конечной поставки пациентам. Соответственно, в области техники существует потребность в препаратах варианта белка FXa I16L, приготавливаемых в таком количестве и с такой чистотой, что они могут быть тестированы в клинических исследованиях, и после одобрения предложены субъектам, нуждающимся в гемостазе.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Описание настоящего изобретения относится к неудовлетворенной потребности в области техники, описанной выше, путем того, что предложены композиции вариантов белка FXa, получаемые с достаточной чистотой и в достаточном количестве, таким образом, что они могут доставляться субъектам нуждающимся в гемостазе. В различных воплощениях эти композиции содержат разные изоформы и посттрансляционные модификации вариантов белка FXa.
В одном из воплощений композиции содержат бета форму варианта белка FXa, в которой последовательности легкой и тяжелой цепей белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 139 и со 146 по 386, аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 384, аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 386, аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 384, аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 386, аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 384, аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 386, аминокислот с 1 по 143 и со 146 по 384, и аминокислот с 1 по 143 и со 146 по 386, все из которых имеют аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1.
В еще одном воплощении композиции содержат альфа форму варианта белка FXa, в которой последовательности легкой и тяжелой цепей белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 139 и со 146 по 398, аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 398, аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 399, аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 398, аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 399, аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 398, и аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 399, все из которых имеют аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1.
В любом одном или более чем одном из воплощений бета и альфа изоформы вариантов белков FXa, описанных выше, легкие цепи белков могут быть модифицированы таким образом, что включают β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу и 9, 10 или 11 остатков Gla. В некоторых воплощениях присутствует 9 остатков Gla. В других воплощениях присутствует 10 остатков Gla. И в других воплощениях присутствует 11 остатков Gla.
В любом одном или более чем одном воплощении бета изоформы вариантов белка FXa, описанных выше, тяжелые цепи могут быть модифицированы таким образом, что включают один или два О-связанных гликана ядра-1. В некоторых воплощениях только первый, только второй или оба О-связанных гликана ядра-1 могут быть не сиалилированы, моносиалилированы или дисиалилированы. В соответствии с некоторыми воплощениями отсутствуют какие-либо группы сиаловой кислоты. В других воплощениях присутствует одна группа сиаловой кислоты. В других воплощениях присутствует две группы сиаловой кислоты. В дополнительных воплощениях присутствует три группы сиаловой кислоты. И в других дополнительных воплощениях в общей сложности присутствует четыре группы сиаловой кислоты.
В соответствии с некоторыми воплощениями композиции варианта белка FXa включают по меньшей мере один вид варианта белка FXa, представленный в таблице 2 описания изобретения. В других воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55 или по меньшей мере 60 видов варианта белка FXa, перечисленных в таблице 2.
В соответствии с другими воплощениями композиции варианта белка FXa включают по меньшей мере один вариант белка FXa, в котором легкая цепь представляет собой виды, перечисленные в таблице 3 описания изобретения. И в других воплощениях композиции варианта белка FXa включают по меньшей мере один вариант белка FXa, в котором тяжелая цепь представляет собой виды, перечисленные в таблице 4 описания изобретения.
В некоторых воплощениях любой один или более чем один вариант белка FXa в соответствии с описанием изобретения может быть представлен в композиции со средней частотой, которая варьирует относительно других видов, которые могут быть представлены. Например, конкретный вид может быть представлен с основной, минорной или следовой частотой по сравнению с другими представленными видами. Альтернативно, конкретный вид может быть представлен с высокой частотой, средней частотой, низкой частотой или очень низкой частотой по сравнению с другими представленными видами.
В описании настоящего изобретения также предложены нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы получения и очистки вариантов белка FXa.
Например представлены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие вариант белка FX, включающий замену нативной последовательности активационного пептида (АР) на сайт процессинга РАСЕ (фермент, расщепляющий белок в месте спаренных основных аминокислот), таким образом, давая возможность для внутриклеточной активации фактора свертывания крови. В некоторых воплощениях последовательность АР удаляют полностью и заменяют на аминокислотную последовательность Arg-Lys-Arg. В соответствии с некоторыми воплощениями в качестве последовательности кДНК (комплементарная ДНК), кодирующей вариант белка FX, предложена последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4, и в качестве кодируемой ею аминокислотной последовательности предложена аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1. Родственные способы предложены для получения варианта белка FXa путем выращивания клеток-хозяев, коэкспрессирующих РАСЕ (или сходную протеазу) и вариант белка FX, и затем очистки варианта белка FXa, продуцируемого, процессируемого и секретируемого клетками-хозяевами. Также раскрыты варианты белка FXa, продуцируемые в соответствии с этими способами. В некоторых воплощениях этих способов клетки-хозяева представляют собой клетки СНО (яичника китайского хомячка).
Очистка вариантов белка FXa может быть осуществлена путем хроматографии, включающей пропускание раствора, содержащего белки, через колонку для хроматографии в смешанном режиме (ММС) (например, с использованием сред Capto ММС), с последующим промыванием и элюированием, затем пропусканием белков через первую колонку для ионообменной хроматографии (например, с использованием сред Q-Sepharose Fast Flow), с последующим промыванием и элюированием, и затем пропусканием белков через вторую отличающуюся от первой колонку для ионообменной хроматографии (например, с использованием сред Fractogel SO3 -). с последующим промыванием и элюированием. Также возможны другие способы очистки вариантов белка FXa.
Способы очистки могут возможно включать стадию вирусной инактивации, а также стадии ультрафильтрования и диафильтрования. После очистки вариантов белка FXa, и в некоторых случаях их концентрирования, они могут быть разведены в фармацевтически приемлемом разбавителе, возможно содержащем другие ингредиенты, такие как буферы или эксципиенты.
В описании также предложены способы лечения субъектов, нуждающихся в гемостазе, путем введения гемостатически эффективного количества композиции, содержащей один или более чем один вариант белка FXa в соответствии с описанием изобретения. В других воплощениях субъектам вводят гемостатически эффективное количество композиции, содержащей один или более чем один вариант белка FXa в соответствии с описанием изобретения, до возникновения кровотечения для профилактического предупреждения неконтролируемого кровотечения у восприимчивого субъекта. В некоторых воплощениях субъекта лечат от гемофилии А. В других воплощениях субъекта лечат от гемофилии В. И в других воплощениях субъекта лечат от травмы или других типов неконтролируемого кровотечения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1А представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) зрелого варианта белка FX, в котором изолейциновый остаток дикого типа в положении 146 заменен на лейцин, показанный жирным шрифтом. Положение 146 соответствует положению 16 в системе нумерации химотрипсина. Потенциальные остатки γ-карбоксиглутаминовой кислоты (Gla) подчеркнуты и выделены курсивом. Предсказанные внутрицепочечные и межцепочечные дисульфидные связи проиллюстрированы при помощи линий, проведенных между связанными цистеинами. Предсказанный сайт β-гидроксилирования заключен в рамку из сплошных линий. Сайт распознавания и расщепления РАСЕ, сконструированный для замены активационного пептида, заключен в рамку из пунктирных линий. Лизин, составляющий С-концевую аминокислоту бета формы тяжелой цепи (Lys386) заключен в овал из сплошной линии. На Фиг. 1В представлена предсказанная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) легкой цепи зрелого варианта белка FX. На Фиг. 1С представлена предсказанная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) тяжелой цепи варианта белка FXa. На Фиг. 1D представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 4) кДНК, кодирующей вариант белка FX, включающий сигнальную последовательность и пропептид.
На Фиг. 2 представлен масс-спектр пептидов, полученных в результате восстановления, алкилирования и протеолитического расщепления при помощи Lys-C очищенного препарата интактного варианта белка FXa. Обозначение пиков, основанное на масс-спектре после анализа пептидов при помощи RP-HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография на обращенной фазе)/ESI-QТОF MS (времяпролетная квадрупольная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением), использовали для подтверждения аминокислотной последовательности белка и для идентификации некоторых посттрансляционных модификаций, описанных в таблице 1 и в настоящем описании. Маркировка пиков является следующей. "L" с последующим номером относится к конкретному пептиду, происходящему из легкой цепи. "Н" с последующим номером относится к конкретному пептиду, происходящему из тяжелой цепи. "Н201": С-концевая альфа-форма H цепи, оканчивающаяся Lys399, содержащая два дисиалилированых О-гликана ядра-1. "Н202": С-концевая альфа-форма H цепи, оканчивающаяся Lys399, содержащая один дисиалилированый О-гликан ядра-1. "Н203": С-концевая альфа-форма H цепи, оканичивающаяся Leu398, содержащая один дисиалилированый О-гликан ядра-1. “L41Gla”: пептид L цепи #4, содержащий 1 остаток γ-карбоксиглутаминовой кислоты. "L10glc": пептид L цепи #10, содержащий потенциально О-связанную глюкозу (гексозу). "L1Gla": пептид L цепи #1 с 2 остатками γ-карбоксиглутаминовой кислоты. "L36-8Gla": пептид L цепи #3 с 6, 7 или 8 остатками γ-карбоксиглутаминовой кислоты. "L8b-OH": пептид L цепи #8, содержащий β-гидрокси Asp. "d": деамидирование. "R": пик реагента, т.е. продукты буфера, соответствующие реагентному контролю. "*": сверхалкилирование.
На Фиг. 3 представлена хроматограмма HPLC очищенного препарата интактного варианта белка FXa и продемонстрировано присутствие в препарате различных изоформ варианта белка FXa.
На Фиг. 4 представлена хроматограмма HPLC очищенного препарата интактного варианта белка FXa и продемонстрировано присутствие в препарате различных изоформ варианта белка FXa. Препарат также анализировали при помощи масс-спектрометрии.
На Фиг. 5 представлен масс-спектр интактного варианта белка FXa из очищенного препарата. Масс-спектр подтверждает присутствие двух основных изоформ альфа и бета, а также обширную гетерогенность по массам, присущую вариабельному расщеплению по сайту расщепления РАСЕ, и присутствие различных типов посттрансляционной модификации. Основные пики идентифицированы на фигуре по их обнаруженной массе в дальтонах. Обозначение пиков, основанное на масс-спектре после анализа RP-HPLC/ESI-QTOF MS, использовали для подтверждения аминокислотной последовательности белковых изоформ и для идентификации некоторых посттрансляционных модификаций, описанных в таблице 2 и описании изобретения. Пики, обозначенные "*", указывают на присутствие 11 остатков Gla в домене Gla легкой цепи.
На Фиг. 6 представлена хроматограмма HPLC очищенного препарата варианта белка FXa после восстановления и алкилирования для разделения легкой и тяжелой цепей путем устранения межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидных связей. Хроматограмма демонстрирует присутствие различных изоформ варианта белка FXa. Препарат также анализировали при помощи масс-спектрометрии.
На Фиг. 7А представлен масс-спектр легкой цепи варианта белка FXa после восстановления и алкилирования очищенного препарата белка. Масс-спектр демонстрирует обширную гетерогеннность по массам, присущую вариабельному расщеплению по сайту расщепления РАСЕ, и присутствие различных типов посттрансляционных модификаций. Основные пики идентифицированы на фигуре по их обнаруженной массе в дальтонах. Обозначение пиков, основанное на масс-спектре после анализа RP-HPLC/ESI-QTOF MS, использовали для подтверждения аминокислотной последовательности белковых изоформ и для идентификации некоторых посттрансляционных модификаций, описанных в таблице 3 и описании изобретения.
На Фиг. 7В представлен масс-спектр тяжелой цепи варианта белка FXa после восстановления и алкилирования очищенного препарата белка. Масс-спектр демонстрирует обширную гетерогеннность по массам, присущую присутствию различных типов посттрансляционных модификаций. Основные пики идентифицированы на фигуре по их обнаруженной массе в дальтонах. Обозначение пиков, основанное на масс-спектре после анализа RP-HPLC/ESI-QTOF MS, использовали для подтверждения аминокислотной последовательности белковых изоформ и для идентификации некоторых посттрансляционных модификаций, описанных в таблице 4 и в описании изобретения. Пики, обозначенные "*", указывают на сверхалкилирование тяжелой цепи.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Здесь описаны композиции, содержащие вариант белка FXa, полученный с достаточной чистотой и в достаточном количестве, тестируемые в клинических исследованиях, и предложенные для субъектов, нуждающихся в гемостазе. Также описаны способы получения и очистки варианта белка FXa.
В некоторых воплощениях фраза "вариант белка FX", "вариант белка FXa" и похожие термины относятся (если из контекста не ясно иное) к человеческому фактору X (FX) или активированному фактору X (FXa), соответственно, в котором изолейцин (IIе или I) непосредственно за последовательностью активационного пептида в тяжелой цепи заменен на лейцин (Leu или L). На основе выравнивания последовательностей тяжелой цепи FXa и каталитического домена химотрипсина эту замену также называют мутацией путем замены I16L с использованием схемы нумерации химотрипсина. Эта позиция соответствует аминокислоте 146 в SEQ ID NO: 1 и аминокислоте 1 в SEQ ID NO: 3. Как обсуждалось выше, FXa, включающий эту мутацию, обладает зимогенными свойствами, которые дают ему возможность циркулировать в крови в течение более длительных периодов времени по сравнению с FXa дикого типа, а также способен расщеплять протромбин с высокой скоростью при включении в протромбиназный комплекс.
В соответствии с другими воплощениями вариант белка FX и вариант белка FXa относятся к FX или FXa, соответственно, в котором аминокислота, соответствующая положению 146 в SEQ ID NO: 1 (положение 16 в схеме нумерации химотрипсина) заменена на Phe (F), Asp (D) или Gly (G). В соответствии с другими воплощениями вариант белка FX и вариант белка FXa относятся к человеческому FX или FXa, соответственно, в котором валин (Val или V), соответствующий положению 147 в SEQ ID NO: 1 (положение 17 в схеме нумерации химотрипсина), заменен на Leu (L), Ala (А) или Gly (G). В других воплощениях вариант белка FX и вариант белка FXa относятся к человеческому FX или FXa, соответственно, в котором аминокислота, соответствующая положению 329 в SEQ ID NO: 1 (положение 194 в схеме нумерации химотрипсина), заменена на Asn (Ν) или Glu (Ε).
Фактор X дикого типа обычно циркулирует в крови в виде неактивных двух цепей зимогена, удерживаемых вместе при помощи дисульфидной связи. Двухцепочечный зимоген образуется из зрелого FX (т.е. лишенного сигнального пептида и пропептида) после протеолитического удаления пептида Arg-Lys-Arg, представленного в зрелом белке аминокислотами 140-142. Тем не менее, для активации требуется удаление активационного пептида (АР) фактором IXa или фактором VIIa до образования сгустка, или при помощи других протеаз, таких как RWX. АР соответствует аминокислотам 143-194 в зрелом одноцепочечном FX. В двухцепочечном зимогене он представлен по N-концу тяжелой цепи. М. Hertzberg, Biochemistry of factor X, Blood Rev. 8(1):56-62 (1994).
В примере воплощения последовательность варианта белка фактора X модифицирована путем удаления активационного пептида и его замены на аминокислотную последовательность Arg-Lys-Arg (RKR в однобуквенном коде) для создания сайта распознавания и расщепления для фермента, расщепляющего спаренные основные аминокислоты (РАСЕ; также называемого фурин). Вместо того, чтобы активировать FXa на отдельной стадии, замена АР дает возможность для внутриклеточной активации варианта белка FX, когда РАСЕ коэкспрессируется в клетках-хозяевах. Это позволяет избежать потребности в исходной очистке варианта FX, продуцируемого клетками, отдельной активации белка с использованием протеазы (такой как RWX) и затем очистки варианта FXa. Путем того, что избегают этих дополнительных стадий, вариант FXa может быть получен в более чистой форме и в больших количествах.
Аминокислотная последовательность зрелого варианта фактора X изображена на Фиг. 1А (SEQ ID NO: 1), в которой лейциновая замена I16L располагается по аминокислотному положению 146 (показана жирным шрифтом), последовательность RKR, заменяющая активационный пептид, располагается в положениях 143-145 и сайт процессинга РАСЕ располагается в положениях 140-145 (показан рамкой с пунктирной линией). На Фиг. 1В и Фиг. 1С изображена предсказанная аминокислотная последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 2) и тяжелой цепи (SEQ ID NO: 3) варианта FXa, соответственно, после расщепления по сайту РАСЕ.
Анализ множества препаратов варианта белка FXa, продуцируемых в соответствии со способами в соответствии с описанием изобретения, продемонстрировал неожиданную степень гетерогенности в отношении белковой последовательности и посттрансляционной модификации по сравнению с предсказанной структурой. Тем не менее, такие композиции, содержащие структурно гетерогенные популяции вариантов белка FXa способны действовать в качестве сильных прокоагулянтов в анализе in vitro. Как дополнительно описано ниже, гетерогенность присуща вариациям в аминокислотной последовательности легкой цепи и тяжелой цепи и посттрансляционным модификациям, представленным в одной, другой или обеих цепях.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией действия, полагают, что один источник структурной гетерогенности присущ вариабельному расщеплению по сайту распознавания и расщепления протеазой РАСЕ/фурин, сконструированному для замены активационного пептида. В не ограничивающем объем изобретения воплощении аминокислотная последовательность сайта РАСЕ представляет собой RKRRKR (в однобуквенном коде) (SEQ ID NO: 5), сконструированную в варианте белка FX путем замены нативной аминокислотной последовательности АР на остатки RKR, которые вместе с последними тремя остатками легкой цепи, образуют сайт протеолитического распознавания RKRRKR (SEQ ID NO: 5). Также могут быть использованы другие сайты распознавания РАСЕ (например, только RKR), а также сайты распознавания и расщепления протеазами, отличающимися от РАСЕ/фурина.
В некоторых воплощениях сайт РАСЕ протеолитически отщеплен для полного его удаления из легкой цепи, не оставляя остатки позади (ANS…TLER139/RKRRKR/) (SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 5, соответственно, легкая цепь и пептидный фрагмент). В предшествующем и следующих воплощениях, описанных в этом абзаце, косая черта ("I") указывает на возможные сайты расщепления между соседними аминокислотами, и надстрочный номер указывает на позицию С-концевой аминокислоты легкой цепи после расщепления (на основе Фиг. 1А; SEQ ID NO: 1). В других воплощениях сайт РАСЕ протеолитически расщеплен, оставляя свой первый остаток по С-концу легкой цепи (ANS…TLERR140/KRRKR/) (SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно, легкая цепь и пептидный фрагмент). В других воплощениях сайт РАСЕ протеолитически расщеплен, оставляя свои первые два остатка по С-концу легкой цепи (ANS…TLERRK141/RRKR/) (SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно, легкая цепь и пептидный фрагмент). В других воплощениях сайт РАСЕ протеолитически расщеплен, оставляя свои первые три остатка по С-концу легкой цепи (ANS…TLERRKR142/RKR/) (SEQ ID NO: 11). В других воплощениях сайт РАСЕ протеолитически расщеплен, оставляя свои первые четыре остатка по С-концу легкой цепи (ANS…TLERRKRR143/KR/) (SEQ ID NO: 12). В других воплощениях сайт РАСЕ протеолитически расщеплен, оставляя свои первые пять остатков по С-концу легкой цепи (ANS…TLERRKRRK144/R/) (SEQ ID NO: 13). И в других воплощениях сайт РАСЕ протеолитически расщеплен, оставляя всю свою последовательность по С-концу легкой цепи (ANS…TLERRKRRKR145/) (SEQ ID NO: 2).
В других воплощениях структурная гетерогенность в легкой цепи может также включать присутствие варьирующего количества остатков Gla в домене Gla, присущего вариациям степени γ-карбоксилирования некоторых остатков глутаминовой кислоты. В некоторых воплощениях количество остатков Gla составляет 9, 10 или 11. Потенциальные сайты γ-карбоксилирования глутаминовой кислоты в домене Gla идентифицированы на Фиг. 1А. В соответствии с другими воплощениями дополнительные потенциальные источники структурной гетерогенности легкой цепи включают присутствие или отсутствие β-гидроксилированного остатка аспарагиновой кислоты по Asp63 (Фиг. 1А; SEQ ID NO: 1) и присутствие или отсутствие О-связанной гексозы. В некоторых воплощениях О-связанная гексоза представляет собой глюкозу, но в других воплощениях она может представлять собой другую альдогексозу, или циклический полуацеталь, кетогексозу или другую О-связанную гексозу.
Тяжелая цепь также может демонстрировать структурную гетерогенность. В соответствии с некоторыми воплощениями вариация может возникать по длине тяжелой цепи. Например некоторые тяжелые цепи представляют собой более длинную альфа изоформу, оканчивающуюся по К399 (SEQ ID NO: 3) (надстрочный индекс указывает на положение С-концевой аминокислоты тяжелой цепи на основе Фиг. 1А; SEQ ID NO: 1), а в других случаях концевой лизин отсутствует, таким образом, что белок оканчивается по L398 (SEQ ID NO: 14). В других воплощениях тяжелая цепь представляет собой более короткую бета форму, оканчивающуюся по К386 или К384 (SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 45, соответственно).
Еще один источник гетерогенности в тяжелых цепях представляет собой степень О-связанного гликозилирования. Таким образом, в некоторых воплощениях тяжелые цепи не гликозилированы. В других воплощениях тяжелые цепи включают один или два О-гликана ядра-1. О-гликан ядра-1 представляет собой О-гликан, где N-ацетилгалактозамин (GalNAc) присоединен по серину или треонину, и галактоза (Gal) присоединена по GalNAc. В некоторых воплощениях изобретения представлен сахар GalNAc, но отсутствует сахар Gal. В соответствии с другими воплощениями каждый из двух О-связанных гликанов ядра-1 по отдельности может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, таким образом, что тяжелые цепи могут нести в общей сложности 0-4 группы сиаловой кислоты. Когда группы сиаловой кислоты присутствуют, тогда они могут быть присоединены по GalNAc или по Gal, или по обоим сахарам.
В соответствии с другими воплощениями возможны различные варианты образования пар легких цепей и тяжелых цепей, таким образом, давая возможность для получения большого комбинаторного набора двухцепочечных зимогенов с различными длинами цепи и посттрансляционными модификациями.
В других воплощениях различные виды вариантов белка FXa могут варьировать по своей относительной частоте. В одном из воплощений частота различных видов может быть определена путем сравнения высот пиков в масс-спектрах интактных вариантов белка FXa. Альтернативно, частота легкой и тяжелой цепей могут быть по отдельности проанализированы при помощи масс-спектрометрии после восстановления интактного белка и его алкилирования для устранения межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидных связей. Как описано в приведенных ниже примерах, частота различных видов вариантов FXa может быть оценена как основная, минорная или следовая путем сравнения с самым высоким пиком в масс-спектрах.
Тем не менее, сравнение высоты пиков масс-спектров представляет собой не единственный способ измерения частоты. Другие способы измерения абсолютной или относительной частоты структурных видов находятся в пределах знаний специалистов в данной области техники. В не ограничивающем объем изобретения примере другого способа классификации относительной частоты виды рассматривают как имеющие высокую частоту в том случае, если высота их пиков в масс-спектре составляет по меньшей мере приблизительно 50% от наиболее частых видов (т.е. самый высокий пик в масс-спектре). Вид имеет среднюю частоту в том случае, если его пик составляет приблизительно 10-50% от наиболее частых видов. Виды обладают низкой частотой в том случае, если их пик составляет приблизительно 2-10% от наиболее частых видов, и обладают очень низкой частотой в том случае, если их пик составляет меньше чем приблизительно 2% от наиболее частых видов. Также возможны другие соглашения для сравнения относительной частоты видов.
Специфические не ограничивающие объем изобретения воплощения структурной гетерогенности в легких цепях, тяжелых цепях варианта белка FXa, и их комбинаций описаны ниже.
Воплощения изобретения включают варианты белка FXa, в которых С-концы легкой цепи оканчиваются по различным аминокислотам вследствие вариабельного расщепления по сайту РАСЕ. Родственные воплощения включают присутствие варьирующего числа остатков Gla и посттрансляционные модификации, такие как β-гидроксилирование остатка аспарагиновой кислоты и О-связанную гексозу. Некоторые из этих воплощений описаны ниже.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 139 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми из других вариантов белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 141 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 143 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
Воплощения в соответствии с описанием изобретения включают варианты белка FXa, в котором С-конец тяжелой цепи оканчивается по различным аминокислотам. Родственные воплощения включают варьирующие количества О-связанных гликанов, включающие варьирующие степени сиалилирования. Некоторые из этих воплощений описаны ниже.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут дополнительно содержать любой из других вариантов белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут дополнительно содержать любой из других вариантов белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
Воплощения в соответствии с описанием изобретения включают варианты белка FXa, в которых С-конец легкой цепи оканчивается по различным аминокислотам вследствие вариабельного расщепления по сайту РАСЕ и в которых С-конец тяжелой цепи также оканчивается по различным аминокислотам. Родственные воплощения включают варьирующие количества остатков Gla и посттрансляционные модификации, такие как β-гидроксилирование остатка аспарагиновой кислоты и О-связанную гексозу в легких цепях, и варьирующие количества О-связанных гликанов, включающие варьирующие степени сиалилирования в тяжелых цепях. Некоторые из этих воплощений описаны ниже.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 139 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 139 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 139 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 139 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра 1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 141 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 141 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 141 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 141 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 143 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 143 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 143 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения содержат вариант белка FXa, в котором легкая цепь состоит из аминокислот с 1 по 143 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и1 тяжелая цепь состоит из аминокислот с 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В родственных воплощениях легкая цепь дополнительно содержит 9 остатков Gla, 10 остатков Gla или 11 остатков Gla. В каждом из этих воплощений легкая цепь может дополнительно содержать β-гидрокси Asp63, О-связанную гексозу или обе эти посттрансляционные модификации. В других родственных воплощениях тяжелая цепь дополнительно содержит один гликан ядра-1, который может быть не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован, или два гликана ядра-1, каждый из которых может быть независимо не сиалилирован, моносиалилирован или дисиалилирован. В других родственных воплощениях каждая возможная пермутация посттрансляционных модификаций легкой цепи комбинирована с каждой возможной пермутацией посттрансляционных модификаций тяжелой цепи. Композиции в соответствии с описанием изобретения могут содержать любые варианты белка FXa, описанные в этом абзаце, сами по себе или в комбинации с другими описанными, а также с любыми другими вариантами белка FXa в соответствии с описанием изобретения.
В описании настоящего изобретения дополнительно предложены выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют вариант белка FX. В соответствии с примером не ограничивающего объем изобретения воплощения последовательность комплементарной ДНК (кДНК), кодирующая вариант белка FX, здесь раскрыта как SEQ ID NO: 4. Как будет понятно специалистам в данной области техники, множество других последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих вариант белка FX, возможно в свете вырожденности генетического кода.
В некоторых воплощениях может быть предложена нуклеиновая кислота, кодирующая вариант белка FX, имеющая последовательность, кодирующую сигнальный пептид и/или пропептид (т.е. лидерные последовательности), располагающийся по N-концу белка FX, который, среди других потенциальных функций, направляет вновь синтезированный белок в секреторный компартмент. Посттрансляционный процессинг затем удаляет лидерную последовательность до секреции зрелого белка из клетки. В некоторых воплощениях эти последовательности происходят из нативного человеческого FX. Могут быть использованы ненативные лидерные последовательности, такие как последовательности из человеческого протромбина. Также могут быть использованы лидерные последовательности из других белков (включая белки не человеческого происхождения). В воплощении последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 4 N-концевая лидерная последовательность происходит из человеческого протромбина.
В соответствии с другими воплощениями нуклеиновая кислота, кодирующая вариант белка FX, может быть модифицирована таким образом, чтобы дать возможность для внутриклеточной активации фактора свертывания крови с получением вариантов белка FXa.
В соответствии с указанным выше, FX обычно циркулирует в виде двухцепочечного зимогена, в котором активационный пептид из 52 аминокислот расположен по N-концу тяжелой цепи FX. Для активации с образованием FXa, способного функционировать в качестве прокоагулянта в протромбиназном комплексе, требуется протеолитическое удаление АР протеазами из внутренней или внешней системы свертывания крови, такой как активированный FIX или активированный FVII. В предшествующих исследованиях использовали аналогичные способы активации. В частности, вариант белка FX экспрессировали в клетках и затем активировали на отдельной стадии путем обработки ядом гадюки Расселла (RWX), после чего вариант белка FXa очищали для последующего анализа.
Хотя активированный вариант белка FX в принципе может быть продуцирован в промышленном масштабе с использованием похожих способов, это может быть весьма неэффективным и дорогостоящим. Например может потребоваться тщательная очистка для устранения какого-либо остаточного RWX. Для того, чтобы избежать этих недостатков, нативный АР может быть удален и заменен на сайты распознавания и расщепления протеаз, способных экспрессироваться и функционировать внутриклеточно. Таким образом, возможно, чтобы вариант белка FX активировался внутриклеточно без необходимости в дополнительных стадиях процессинга. Активируемые варианты белка FX, секретируемые клетками-хозяевами в питательную среду, затем могут быть очищены.
Не ограничивающий объем изобретения пример последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант FX, в котором последовательность АР заменена на сайт распознавания и расщепления РАСЕ, приведен в SEQ ID NO: 4. Белковая последовательность зрелого варианта белка FX, кодируемого этим примером последовательности кДНК, приведена в SEQ ID NO: 1. В этих воплощениях аминокислоты, составляющие АР (аминокислоты с 143 по 194 последовательности белка FX дикого типа), заменены на последовательность Arg-Lys-Arg (RKR в однобуквенном коде). Эта последовательность, комбинированная с последними тремя остатками последовательности легкой цепи (также RKR; аминокислоты 140-142 в SEQ ID NO: 1), формирует сайт распознавания и расщепления (т.е. RKRRKR) (SEQ ID NO: 5) для фермента, расщепляющего спаренные основные аминокислоты (РАСЕ). Таким образом, растворимый фермент РАСЕ, коэкспрессируемый в тех же самых клетках-хозяевах, экспрессирующих модифицированный вариант белка FX, может внутриклеточно активировать фактор свертывания крови.
В некоторых воплощениях, когда клетки-хозяева исходно экпрессируют фермент с сайтом распознавания, сходным с таковым у РАСЕ, может отсутствовать необходимость в коэкспрессии экзогенной протеазы. Наоборот, нативная протеаза может быть достаточна для активации варианта белка FX, экспрессируемого в клетках, таким образом, продуцируя и секретируя активированный вариант белка FX.
В других воплощениях сайты распознавания и расщепления для протеаз, отличающихся от РАСЕ, но также способных функционировать внутриклеточно, могут быть использованы для замены аминокислотной последовательности АР. Такие ферменты могут быть коэкспрессироваться в одних и тех же клетках-хозяевах вместе с вариантом белка FX для активации модифицированного фактора свертывания крови. Если нативные ферменты, способные расщеплять сконструированный сайт, продуцируются на достаточных уровнях в клетках-хозяевах, тогда коэкспрессия экзогенных протеаз может не потребоваться.
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие варианты белка FX в соответствии с описанием настоящего изобретения могут быть включены в векторы с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.
В некоторых воплощениях векторы включают плазмиды, как правило бактериальные плазмиды, эукариотические эписомы, дрожжевые искусственные хромосомы и вирусные геномы. Не ограничивающие объем изобретения примеры вирусов включают ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы (AAV) и вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты и вирус табачной мозаики. Возможны другие типы векторов. В некоторых воплощениях векторы способны к автономной репликации в подходящих хозяевах. В других воплощениях векторы поддерживаются в хозяевах экстрахромосомно или могут интегрироваться в геном хозяина, давая возможность для репликации вектора с геномом хозяина. Векторы, содержащие ген и контрольные последовательности, достаточные для поддержания транскрипции и трансляции гена, названы экспрессирующимися векторами. Векторы в соответствии с описанием настоящего изобретения могут быть выбраны или сконструированы в соответствии со знаниями специалиста в данной области техники таким образом, чтобы функционировать в любом типе клеток, способном поддерживать экспрессию варианта белка FX, включающем бактериальные клетки, другие прокариотические клетки, дрожжевые клетки, другие клетки грибов, клетки растений, клетки животных, клетки насекомых, клетки млекопитающих, клетки СНО и человеческие клетки или другие.
Векторы могут возможно содержать одну или более чем одну контрольную последовательность. Некоторые контрольные последовательности дают возможность для репликации, такие как ориджины репликации. Другие контрольные последовательности контролируют или модулируют транскрипцию, такие как промоторы, энхансеры и сайты терминации транскрипции. Не ограничивающие объем изобретения примеры промотора или энхансеров представляют собой промоторы и энхансеры, происходящие из ретровирусных LTR (длинных концевых повторов), цитомегалловируса (CMV), вируса обезьян 40 (SV40), аденовируса (например основанного на аденовирусе позднего промотора (AdMLP)) или вируса полиомы. Дополнительные примеры включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, конститутивно действующие промоторы и энхансеры и индуцируемые промоторы и энхансеры. Также возможны другие промоторы и энхансеры. Другие контрольные последовательности контролируют или модулируют просттранскрипционный процесссинг РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования, или сигналы, которые увеличивают или уменьшают стабильность мРНК. Другие контрольные последовательности контролируют или модулируют трансляцию белка, такие как последовательности инициации трансляции (например консенсусная последовательность Козака), посттрансляционный процессинг или стабильность белка.
Векторы могут также включать селективные маркерные гены, дающие возможность для отбора клеток-хозяев, в которые встроены векторы. Не ограничивающие объем изобретения примеры включают селективные маркерные гены, которые придают резистентный к лекарственному средству фенотип, такие как ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в DHFR- клетках-хозяевах, дающий возможность для отбора с использованием метотрексата), ген neo (дающий возможность для отбора при помощи G418 или похожих лекарственных средств), ген hph (дающий возможность для отбора при помощи гигромицина В) и ген глутаматсинтетазы (дающий возможность для отбора при помощи метионинсульфоксимина).
Векторы, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих варианты белка FX в соответствии с описанием изобретения, могут быть введены в один или более чем один тип клеток-хозяев, способный поддерживать экспрессию варианта белка FX. Способы введения векторов в подходящие клетки-хозяева хорошо известны специалистам в данной области техники. Не ограничивающие объем изобретения примеры включают временную и стабильную трансфекцию, трансформацию, трансдукцию и инфицирование целевых клеток-хозяев вирусами. Другие примеры включают опосредованную декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Способы трансформации клеток растений, бактериальных и дрожжевых клеток также хорошо известны в области техники.
FX или варианты белка FXa могут быть экспрессированы с другими белками для оптимизации экспрессии или посттрансляционной обработки FX или вариантов белка FXa. В не ограничивающем объем изобретения примере вектор, включающий ген, кодирующий γ-глутамилкарбоксилазу, может быть трансфицирован одновременно с вектором, кодирующим вариант белка FX, в клетки-хозяева для увеличения карбоксилирования глутаминовых кислот в домене Gla легкой цепи. Благодаря этому степень карбоксилирования и образования остатков Gla в домене Gla может быть увеличена, таким образом улучшая выход активного фактора свертывания крови, продуцируемого клетками. В еще одном описанном выше воплощении вариант белка FX, модифицированный таким образом, что нативная аминокислотная последовательность АР заменена на сайт расщепления РАСЕ, может быть экспрессирован вместе с растворимым ферментом РАСЕ в тех же самых клетках-хозяевах. Коэкспрессируемый РАСЕ может затем внутриклеточно расщеплять вариант белка FX с образованием активированного варианта белка FX, который затем секретируется из клетки. Как указано выше, этот подход позволяет избежать необходимости активировать вариант белка FX на отдельной стадии, что, в противном случае, может быть весьма неэффективным и дорогостоящим.
Клетки, способные экспрессировать варианты белка FX и другие белки, полезные для оптимизации экспрессии варианта белка FX в активной форме, включают клетки млекопитающих. Линии клеток млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии белка, известные в области техники, включают линии клеток, происходящие из людей, крыс, мышей и других млекопитающих. Не ограничивающие объем изобретения примеры включают некоторые иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской коллекции типовых культур (АТСС) или других источников, включающие клетки яичников китайского хомячка (СНО), клетки NS0, клетки SP2, клетки НЕК-293Т, клетки NIH-3T3, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), клетки почки африканской зеленой мартышки (например, клетки COS, CV-1 или Vero), клетки человеческой гепатоклеточной карциномы (например, HepG2), клетки А549, клетки А431, клетки HeLa, клетки L, клетки ВНК21, клетки HL-60, клетки U937, клетки НаК, клетки Юркат и другие. Применение других клеток млекопитающих в качестве клеток-хозяев для экспрессии белка возможно в соответствии со знаниями специалистов в данной области техники.
В других воплощениях могут быть использованы клеточные линии из насекомых, растений, бактерий или грибов. Не ограничивающие объем изобретения примеры клеток насекомых включают клетки Sf9 или Sf21, которые часто используют в сочетании с системой экспрессии на основе бакуловирусного вектора. Не ограничивающие объем изобретения примеры клеток растений включают клетки видов табака, арабидопсиса, ряски, кукурузы, пшеницы и картофеля. Не ограничивающие объем изобретения примеры бактерий включают Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и штаммы Streptomyces. He ограничивающие объем изобретения примеры грибов включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, дрожжевые штаммы Kluyveromyces и дрожжевые штаммы Candida. Применение клеток других насекомых, растений, бактерий и грибов в качестве клеток-хозяев для белковой экспрессии возможно в соответствии со знаниями специалиста в данной области техники.
Способы, реагенты и условия для выращивания клеток-хозяев для продукции активированного варианта белка FX находятся в пределах знаний специалистов в данной области техники, и не предполагаются в качестве ограничивающих объем изобретения. В не ограничивающем объем изобретения примере варианты белка FXa могут быть продуцированы в 500 литрах культур бессывороточной среды, дополненной витамином К. В еще одном не ограничивающем объем изобретения примере варианты белка FXa в соответствии с описанием изобретения могут быть продуцированы в промышленном масштабе, например в ферментационных чанах объемом 2500 литров, или даже более крупных объемов, в условиях, разработанных для оптимизации экспрессии и выделения.
После выращивания клеток-хозяев в условиях выращивания, поддерживающих экспрессию и внутриклеточную активацию вариантов белка FX среда для выращивания клеток может быть обработана для выделения и очистки вариантов белка FXa, секретируемых во время клеточного роста. В других воплощениях, в частности, когда используют клетки-хозяева, отличающиеся от млекопитающих, вариант белка FXa, оставшийся в клетках, может быть высвобожден, например путем механического, ферментативного разрушения клеток, или разрушения детергентами.
Культуральная среда с клетками может быть центрифугирована и/или профильтрована для удаления клеток и дебриса, например путем глубинного фильтрования самого по себе или с последующим мембранным фильтрованием, например через мембранный фильтр со средним размером пор 0,45 мкм, 0,2 мкм или другим размером пор. После удаления клеточных остатков путем центрифугирования и/или фильтрования среда может быть обработана для дополнительной очистки вариантов белка FXa. В зависимости от последующих стадий очистки, может быть желательно разбавление и/или замена буфера в осветленном супернатанте или фильтрате.
Способы очистки белка хорошо известны из уровня техники. Примеры не ограничивающих объем изобретения способов очистки белка включают осаждение солью, гель-фильтрационную хроматографию, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию. Например, антитела, специфическим образом распознающие вариант белка FXa, могут быть иммобилизированы на колонках для очистки для обратимого захвата белка из окружающей среды или буфера. После промывания аффинной колонки для удаления примесей связанный вариант белка FXa может быть затем элюирован.
Частично очищенный вариант белка FXa может быть подвергнут стадиям обработки в соответствии с надлежащей производственной практикой или другими регулирующими требованиями, включающими, например удаление или инактивацию вирусов. Вирусы могут быть удалены путем ультрафильтрования или инактивированы путем обработки образца спиртом и/или детергентом в соответствии со знаниями специалиста в данной области техники. Например могут быть использованы вирусные фильтры марки Virosart®, доступные от Sartorius Stedim Biotech, а также фильтры других производителей. Возможны другие способы удаления или инактивации вирусов.
В некоторых воплощениях хроматография в смешанном режиме (ММС) может быть использована для очистки варианта белка FXa самого по себе или в комбинации с другими стадиями очистки. ММС, также названная мультимодальной хроматографией, относится к применению хроматографических сред, которые обеспечивают более чем один тип взаимодействия между лигандом и компонентами образца. Примеры типов взаимодействий включают электростатическое (анионо- или катионообменник), гидрофобное, взаимодействие пи-пи, образование водородных связей и тиофильное взаимодействие. Эти взаимодействия могут работать кооперативно или работать независимо. Специфические не ограничивающие объем изобретения примеры сред ММС включают Capto adhere, Capto adhere ImpRes, Capto ММС, Capto ММС ImpRes, Capto Core 700, все из которых дополнительно описаны в Multimodal Chromatography Handbook, опубликованной GE Healthcare Life Sciences (2013). Capto ММС, например, обеспечивает тиофильное, гидрофобное связывание, образование водородных связей, а также электростатические свойства катионообменника. Также возможно применение сред ММС из других источников.
В некоторых воплощениях ионообменная хроматография может быть использована для очистки варианта белка FXa самого по себе или в комбинации с другими стадиями очистки. Ионообменная хроматография относится к применению хроматографических сред, обеспечивающих разделение молекул на основе различий в их общем поверхностном заряде, который может варьировать в зависимости от рН, соли и других условий. При величине рН, превосходящей изоэлектрическую точку белка, последний будет связываться с положительно заряженной средой (анионообменник), тогда как при рН ниже изоэлектрической точки белка, последний будет связываться с отрицательно заряженной средой (катионообменник). Ионообменные среды и буферные условия (например, концентрация соли, рН и т.п.) могут быть выбраны таким образом, чтобы со средами предпочтительно связывался очищаемый белок (например, вариант белка FXa), давая возможность для отмывания от примесей, которые в тех же самых условиях связываются менее прочно, после чего интересующий белок может быть элюирован с хроматографической колонки. Дополнительная информация об ионообменной хроматографии описана в Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing Principles and Methods Handbook, опубликованной GE Healthcare (2010).
Ионообменники могут быть классифицированы на сильные или слабые, что указывает на степень, с которой они остаются заряженными при изменениях рН. Сильные обменники остаются заряженными в широком диапазоне рН, тогда как слабые обменники не остаются. Примеры функциональных групп анионообменника включают четвертичный аммоний (Q), который является сильным, и диэтиламиноэтил (DEAE) и диэтиламинопропил (ANX), которые рассматривают как слабые. Примеры функциональных групп катионообменника включают сульфопропил (SP) и метилсульфонат (S), оба из которых рассматривают как сильные, и карбоксиметил (СМ), который является слабым.
В одном из воплощений вариант белка FXa может быть очищен с использованием только стадии анионообменной хроматографии или с последующей стадией катионообменной хроматографии. В еще одном воплощении вариант белка FXa может быть очищен с использованием только стадии катионообменной хроматографии или с последующей стадией анионообменной хроматографии.
Специфические не ограничивающие объем изобретения примеры ионообменных сред включают Capto DEAE, Capto Q ImpRes, Capto SP ImpRes, Capto S, Capto Q, SOURCE 15Q, SOURCE 15S, SOURCE 30Q, SOURCE 30S, MacroCap SP, MacroCap Q, Mini Q PC, Mini S PC, Mini Q PE, Mini S PE, HR Mono Q, HR Mono S, PC Mono Q, PC Mono S, Mono Q GL, Mono S GL, DEAE Sephacel, CM Sephadex C-25, CM Sephadex C-50, DEAE Sephadex A-25, DEAE Sephadex A-50, QAE Sephadex A-25, QAE Sephadex A-50, SP Sephadex C-25, SP Sephadex C-50, ANX Sepharose 4 Fast Flow (High Sub), ANX Sepharose 4 Fast Flow (Low Sub), CM Sepharose Fast Flow, CM Sepharose High Performance, DEAE Sepharose CL-6B, DEAE Sepharose Fast Flow, Q Sepharose Big Beads, Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Q Sepharose XL, SP Sepharose Big Beads, SP Sepharose Big Beads Food Grade, SP Sepharose High Performance, SP Sepharose Fast Flow и SP Sepharose XL, имеющиеся в продаже от GE Healthcare. Другие ионообменные среды могут быть получены из Merck Millipore, включающие, например среды серий Fractogel® или серий Eshmuno®. Примеры в сериях Fractogel® включают смолу ТМАЕ, смолу ТМАЕ Hicap, смолу ТМАЕ Medcap, смолу DEAE, смолу DMAE, смолу SO3-, смолу SE Hicap и смолу СОО-. Примеры в сериях Eshmuno® включают смолы СРХ, S, Q и НСХ. Также могут быть использованы ионообменные среды из других источников.
После достаточной очистки варианта белка FXa очищенный белок может быть концентрирован с использованием ультрафильтрования и диафильтрования при приготовлении для упаковки или дополнительной обработки.
В некоторых воплощениях очищенные и концентрированные варианты белка FXa могут быть разведены в водных растворах, содержащих буферы и другие ингредиенты, подходящие для введения субъектам, и затем упакованы для длительного хранения до доставки. Могут быть использованы дополнительные стадии обработки. Например композиции, содержащие варианты белка FXa, эксципиенты, буферы и другие фармацевтически приемлемые ингредиенты, могут быть лиофилизированы для длительного хранения.
Варианты белка FXa в соответствии с описанием изобретения, продуцируемые в соответствии со способами, описанными в нижеприведенных примерах, или при помощи других способов, могут быть проанализированы для определения присутствия и степени структурной гетерогенности с использованием способов, знакомых специалистам в данной области техники.
Например, в некоторых воплощениях интактный белок или приготовленные из него протеолитические фрагменты могут быть проанализированы при помощи непосредственного белкового секвенирования, например с использованием деградации по Эдману. Белок или пептиды также могут быть проанализированы при помощи жидкостной хроматографии (LC), включающей обращенно-фазовую LC (RP-LC), а также масс-спектрометрии, включающей квадрупольную времяпролетную масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI-QTOF MS) для обнаружения вариации по аминокислотной последовательности и присутствия конкретных посттрансляционных модификаций. Дополнительно, присутствие заряженных групп, например γ-карбоксилированных остатков глутаминовой кислоты (Gla), может быть обнаружено с использованием анионообменной жидкостной хроматографии (AEX-HPLC).
Когда предполагают присутствие углеводных группировок, тогда их существование может быть подтверждено путем их удаления специфическими гликозидазами. После этого обработанный белок, который должен быть лишен углевода, удаляемого гликозидазой, может быть повторно проанализирован, например при помощи масс-спектрометрии, для подтверждения идентичности предполагаемого и присутствующего углевода.
Другие аналитические методики, с которыми знакомы специалисты в данной области техники, могут быть использованы для выявления степени и идентичности структурной гетерогенности в вариантах белка FXa.
Композиции, содержащие варианты белка FXa в соответствии с описанием изобретения, могут быть протестированы в отношении прокоагулянтной активности. В не ограничивающем объем изобретения примере коагулирующую активность измеряют при помощи одностадийного анализа коагулирующей активности крови с использованием в качестве субстрата плазмы крови людей с дефицитом фактора VIII. Один из таких анализов известен как анализ активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ), но другие анализы могут быть использованы в соответствии со знанием специалиста в данной области техники. Анализ АРТТ более подробно описан в Kamal, A.F., et al., How to interpret and pursue an abnormal prothrombin time, activated partial thromboplastin time, and bleeding time in adults, Mayo Clin Proc. 82(7):864-873 (2007).
В некоторых воплощениях композиции в соответствии с описанием изобретения включают "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" вариантов белка FXa. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата, например гемостаза неконтролируемого кровотечения. Терапевтически эффективное количество варианта FXa может варьировать в зависимости от факторов, таких как болезненное состояние, возраст, пол и масса индивида, и способность варианта FXa вызывать желаемый ответ у индивида. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или вредные действия варианта FXa перевешиваются терапевтически благоприятными действиями. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата, например предупреждения неконтролируемого кровотечения у восприимчивого субъекта. Например, доза может быть введена до планируемого хирургического вмешательства. Примеры восприимчивых субъектов включают субъектов, страдающих от гемофилии А или В, включая субъектов, у которых продуцируются ингибирующие антитела против продуктов, заменяющих фактор.
Композиции в соответствии с описанием изобретения могут быть введены субъекту, включающему пациента-человека, нуждающемуся в0 лечении или предупреждении любого состояния, отличающегося недостаточным свертыванием крови или избыточным кровотечением. Не ограничивающие объем изобретения примеры таких состояний включают гемофилию А, гемофилию В, гемофилию А или В, ассоциирующуюся с ингибирующими антителами, дефицит фактора свертывания крови, дефицит эпоксидредуктазы витамина К С1, дефицит гамма-карбоксилазы, кровотечение, ассоциированное с травмой, повреждения, тромбоз, тромбоцитопению, инсульт, коагулопатию, диссеминированное внутрисосудистое свертывание (DIC), расстройства, связанные с избыточной антикоагуляционной терапией, синдром Бернара-Сулье, тромбастению Гланцмана и дефицит пула тромбоцитов. Также возможно лечение или предупреждение других расстройств, отличающихся недостаточным свертыванием крови или избыточным кровотечением.
Схемы введения доз могут быть скорректированы для обеспечения оптимальной желаемой реакции (например, терапевтической или профилактической реакции). Например может быть введен единичный болюс, несколько дробных доз могут быть введены с течением времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с необходимостью терапевтической ситуации. В соответствии с некоторыми воплощениями композиции для парентерального введения готовят в стандартной лекарственной форме для легкого введения и однородности дозы. Стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, служащим в качестве однократных доз для субъектов, которых лечат, где каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное таким образом, чтобы обеспечивать желаемое терапевтическое действие в ассоциации с подходящим фармацевтическим носителем.
В некоторых воплощениях терапевтически или профилактически эффективное количество вариантов белка FXa составляет от приблизительно 0,0001 до 50 мг/кг, от приблизительно 0,001 до 50 мг/кг, от приблизительно 0,001 до 5 мг/кг, от приблизительно 0,001 до 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,001 до 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,01 до 5 мг/кг или от приблизительно 0,01 до 0,5 мг/кг. В соответствии с родственными воплощениями терапевтически или профилактически эффективная концентрация в сыворотке крови вариантов белка FXa составляет от приблизительно 0,0003 до 300 нМ, от приблизительно 0,003 до 300 нМ, от приблизительно 0,03 до 300 нМ, от приблизительно 0,003 до 30 нМ, от приблизительно 0,03 до 30 нМ или от приблизительно 0,3 до 3 нМ. Концентрация в сыворотке крови варианта FXa может быть измерена при помощи любого способа, известного из уровня техники.
Стандартные дозы композиций в соответствии с описанием изобретения могут быть приготовлены для того, чтобы обеспечить удобное введение субъектам терапевтически или профилактически эффективных количеств вариантов белка FXa или для достижения желаемой концентрации в сыворотке крови таких белков у таких субъектов.
Для любого конкретного субъекта специфические схемы введения доз или диапазоны могут быть скорректированы по времени в соответствии с потребностями субъекта, которого лечат, и профессиональным суждением индивида, ответственного за введение, или контролирующего введение композиций. Соответственно, приведенные здесь схемы введения доз и диапазоны приведены только для примера, и не предполагается, что они ограничивают объем или практическое применение композиций в соответствии с описанием изобретения.
Дополнительно предложены наборы, включающие, например одну или более чем одну стандартную дозу композиции в соответствии с описанием изобретения. Такие стандартные дозы могут быть представлены в жидкой форме или в виде лиофилизата. Если композиция упакована в лиофлизированной форме, тогда наборы могут дополнительно включать контейнер, заполненный разбавителем, таким как стерильная вода или физиологический раствор, для ресуспендирования высушенного осадка. Наборы также могут включать изделия, используемые для введения, включающие, например, шприцы для подкожных инъекций, или трубки игольные или иглы-бабочки и т.п. Наборы могут дополнительно включать указания по применению, спиртовые салфетки для стерилизации кожи или другие компоненты.
Композиции, содержащие вариант белка FXa, могут быть введены однократно или множество раз до остановки кровотечения или достижения достаточного свертывания крови в соответствии со знанием специалиста в данной области техники. Когда используют множество введений, тогда они могут быть ежечасными, ежесуточными, еженедельными или производиться с другими интервалами. Введения могут осуществляться по схеме, такой как каждые 10 минут, каждые 15 минут, каждые 20 минут, каждые 30 минут, каждый час, каждые два часа, каждые три часа, каждые четыре часа, три раза в сутки, два раза в сутки, один раз в сутки, один раз каждые двое суток, один раз каждые трое суток и один раз в неделю. Вариант FXa также может быть введен непрерывно, например при помощи микронасоса. Вариант FXa может быть введен парентеральным путем (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или внутримышечно). Вариант FXa может быть введен однократно, дважды или более чем дважды, или в течение по меньшей мере периода времени, требующегося для достижения эффективного свертывания крови.
В еще одном воплощении композиции, содержащие вариант белка FXa, могут быть введены вместе с еще одним прокоагулянтом, включающим отличающийся вариант FXa (например, вариант, имеющий замену по аминокислоте номер 146, отличающуюся от лейцина), Фактор IX, Фактор XIa, Фактор ХIIа, Фактор VIII, Фактор VIIa, FEIBA (шунтирующая активность при наличии ингибиторов к фактору VIII) или концентрат протромбинового комплекса (РСС).
Композиции, содержащие варианты белка FXa, могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, который может представлять собой растворители, диспергирующие среды, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и подобные физиологически совместимые агенты. Некоторые примеры фармацевтически приемлемых носителей, приведенные исключительно для иллюстрации, представляют собой воду, физиологический раствор, физиологический раствор, забуференный фосфатом, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. В композицию также могут быть включены изотонические агенты, например соли (например, хлорид натрия), сахара (например, сахароза) или полиспирты (например, маннит или сорбит). Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых веществ представляют собой увлажнители, эмульгаторы, консерванты или буферы, которые усиливают стабильность или другие свойства данных композиций.
Композиции для применения в соответствии с описанием изобретения могут находиться в любой подходящей форме для введения субъекту, например в виде жидкости для инъекции или для инфузии. Форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.
Терапевтические композиции обычно являются стерильными и стабильными в условиях приготовления и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарства. Стерильные инъецируемые растворы могут быть приготовлены путем включения вариантов белка FXa в соответствии с описанием изобретения в требуемое количество подходящего растворителя с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, описанных выше, с последующей стерилизацией путем фильтрования. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов способы приготовления включают вакуумную сушку или сушку замораживанием (лиофлизацию), которые дают возможность получать порошок активного ингредиента с любым дополнительным желательным ингредиентом из его раствора, предварительно подвергнутого стерильной фильтрации.
Следующие примеры приведены только для иллюстративных задач, и их не следует рассматривать как ограничивающие каким-либо образом объем формулы изобретения или других раскрытых здесь изобретений.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Экспрессия и очистка рекомбинантного варианта белка FXa
С использованием стандартных для молекулярной биологии способов и реагентов получали кДНК, кодирующую вариант белка FX, включающий мутацию I16L, в котором нативная аминокислотная последовательность активационного пептида фактора X заменена на аминокислотную последовательность RKR (однобуквенный код), которая вместе с последовательностью RKR на С-конце легкой цепи образовывала сайт протеолитического расщепления РАСЕ, имеющий аминокислотную последовательность RKRRKR (SEQ ID NO: 5). Последовательность кДНК и кодируемого ею зрелого белка описаны на Фиг. 1D (SEQ ID NO: 4) и Фиг. 1А (SEQ ID NO: 1), соответственно. Таким образом, предшественник FX варианта FXa может быть активирован путем внутриклеточного протеолитического расщепления ферментами РАСЕ, экспрессируемыми вместе с фактором свертывания крови. Дополнительно, нативная сигнальная последовательность и пропептид человеческого FX заменены на сигнальную последовательность и пропептид человеческого протромбина.
кДНК, кодирующая вариант FX, субклонировали в вектор экспрессии под контролем конститутивного промотора. Вектор также экспрессировал ген устойчивости к неомицину, обеспечивающий возможность для антибиотического отбора стабильных трансфектантов. Был создан второй вектор для экспрессии растворимой формы фермента РАСЕ.
Клетки-хозяева СНО К1 адаптировали для выращивания в бессывороточной суспензии и котрансфицировали путем липофекции линеаризованными векторами для экспрессии варианта FXa и растворимого РАСЕ. Трансфицированные клетки отбирали путем роста в средах, дополненных антибиотиком G418 и витамином К1. Резистентные клоны отбирали в отношении экспрессии и активности рекомбинантного варианта белка FXa. Клоны, демонстрирующие относительно высокую экспрессию и активность рекомбинантного варианта белка FXa, адаптировали для роста в бессывороточной суспензионной культуре. Один клон отбирали и использовали для создания предварительного банка клеток и затем основного банка клеток с использованием химически определенной среды, не содержащей компоненты животного или человеческого происхождения.
Для продукции лекарственного вещества для дополнительного исследования клетки, экспрессирующие вариант FXa, выращивали в масштабе 500 литров (л) или 2500 л с использованием химически определенных сред. Для запуска флаконы с клетками из клеточного банка размораживали, выращивали и постепенно увеличивали по массе путем выращивания в сосудах увеличивающегося объема с использованием химически определенной среды, не содержащей животные компоненты. После завершения увеличения массы культуры поддерживали в небольших биореакторах с перемешиванием содержимого резервуара. Для продукции выращивание продолжали в биореакторах объема 500 л или 2500 л до сбора материала. Для сбора клеточную культуральную среду центрифугировали для удаления клеток и дебриса. Среду дополнительно осветляли путем глубинного фильтрования и фильтрования через фильтр 0,2 мкм.
Профильтрованную среду затем разбавляли буфером и наносили на колонку для хроматографии в смешанном режиме (ММС) Capto (GE Healthcare Life Sciences). После промывания продукт элюировали с колонки. Частично очищенный продукт затем разводили в растворе детергента для инактивации вирусов. После инактивации вирусов продукт наносили на колонку для хроматографии с использованием Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences), промывали и элюировали с колонки. Элюированный продукт затем разбавляли буфером и наносили на хроматографическую колонку Fractogel SO3" (Merck Millipore), промывали и элюировали с колонки. Элюированный продукт затем фильтровали с использованием фильтров Virosart® CPV (Sartorius Stedim Biotech) для удаления любого остаточного вируса, который может присутствовать. После фильтрования вируса очищенный продукт концентрировали с использованием ультрафильтрования и диафильтрования. Очищенное лекарственное вещество затем тестировали для того, чтобы охарактеризовать вариант белка FXa, продуцируемый клетками СНО.
ПРИМЕР 2: Концевая аминокислотная последовательность
N-концевое секвенирование варианта FXa путем деградации по Эдману использовали для подтверждения первых десяти остатков N-конца легкой цепи и N-конца тяжелой цепи. Анализ осуществляли путем автоматизированной деградации по Эдману после разделения варианта FXa при помощи SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях и подвергали электроблоттингу на поливинилидендифторидной (PVDF) мембране.
N-концевая последовательность легкой цепи представляла собой ANSFL(X)(X)MKK (однобуквенный код) (SEQ ID NO: 15). Никакая сигнальная последовательность не появляется по остаткам 6 и 7 (представленным как X), что согласуется с присутствием отстатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (Gla) в этих позициях. N-концевая последовательность тяжелой цепи представляла собой LVGGQE(Z)KDG (SEQ ID NO: 16). Никакая сигнальная последовательность не обнаружена по остатку 7 (представленному как Z), что согласуется с присутствием цистеина в этой позиции. Эти результаты подтверждали ожидаемые N-концевые последовательности легкой цепи и тяжелой цепи по сравнению с теоретической последовательностью.
ПРИМЕР 3: Картирование пептида для подтверждения первичной структуры и идентичности посттрансляционных модификаций
Для подтверждения первичной аминокислотной последовательности и для обнаружения посттрансляционных модификаций вариант белка FXa, продуцируемый как описано в примере 1, анализировали путем пептидного картирования. В частности, белок восстанавливали, алкилировали и расщепляли лизилэндопептидазой Lys-C (протеаза 1 Achromobacter lyticus), после чего фрагменты анализировали путем обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии/квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (RP-HPLC/ESI-QTOF MS).
Пример получающегося в результате профиля пептидной карты представлен на Фиг. 2, в котором пептиды отмечены в соответствии с их предполагаемыми относительными позициями относительно теоретической последовательности легкой цепи, представленный на Фиг. 1В, и тяжелой цепи, представленной на Фиг. 1С. Пики, отмеченные буквой "L", указывают на пептид легкой цепи и пики, отмеченные буквой "Н", указывают на пептид тяжелой цепи. Минорные пики, представляющие продукты буфера, отмечены "R". Несколько пиков следового уровня, представляющих деамидированные (d) или сверхалкилированные пептиды, отмечены "d" и "*", соответственно.
Пептиды, обнаруженные путем пептидного картирования, их теоретические и обнаруженные массы и аминокислотные последовательности представлены в таблице 1 ниже. Нумерация аминокислот основана на Фиг. 1А (SEQ ID NO: 1).
Теоретические массы рассчитывали при помощи PAWS (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI). Наблюдаемые массы рассчитывали по наиболее частому несущему множественный заряд иону в масс-спектре. Все наблюдаемые массы согласовывались с теоретическими массами в пределах 10 млн-1. Покрытие последовательности среди пептидов для легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (НС) составляло приблизительно 94 и 98%, соответственно. Три пептида из цепи L (L2, L5, L7) и два пептида из тяжелой цепи (Н14, Н19) не были обнаружены. Рассчитанные различия между теоретической и наблюдаемой массой пептида дали возможность сделать заключение о присутствии некоторых посттрансляционных модификаций. Эти остатки, как обнаружено, представляющие собой объект для модификации, подчеркнуты в столбце 5 таблицы 1.
N-концевой домен Gla в легкой цепи в общем содержал от 9 до 11 остатков гамма-карбоксилированной глутаминовой кислоты (Gla). Основные виды легкой цепи содержали 10 остатков Gla. Хотя пептид L1 был всегда карбоксилирован, гетерогенность обнаруживали в пептидах L3 и L4. В частности, пептид L3 обнаружен с 6, 7 или 8 остатками Gla, а пептид L4 обнаружен без остатков или с одним остатком Gla. См. таблицу 1.
Гетерогенность в отношении гамма-карбоксилирования подтверждена с использованием анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (AEX-HPLC) для измерения гетерогенности по заряду. Разделение при помощи AEX-HPLC варианта белка FXa позволило разделить изоформы, содержащие 9, 10 и 11 остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (Gla). Относительная частота количества остатков Gla в легкой цепи варианта FXa согласовывалась среди семи протестированных препаратов очищенного варианта белка FXa. В частности, на основе относительного распределения пиков частота появления 9 остатков Gla находилась в диапазоне от 10% до 17% (среднее значение равно 12,1%, SD (стандартное отклонение) равно 2,5%), частота появления 10 остатков Gla находилась в диапазоне от 41% до 46% (среднее значение равно 43,0%, SD равно 1,8%) и частота появления 11 остатков Gla находилась в диапазоне от 36% до 46% (среднее значение равно 42,1%, SD равно 3,3%).
Показано, что очищенные изоформы 10 и 11 Gla в равной степени активны в основанном на АРТТ анализе коагулирующей активности крови, тогда как изоформа 9 Gla обладала уменьшенной активностью (приблизительно 20% активности изоформ 10 и 11 Gla при нормализации по массе).
Также обнаружили другие посттрансляционные модификации легкой цепи. В частности, обнаружили, что масса пептида L8 согласуется с присутствием остатка бета-гидроксилированной аспарагиновой кислоты в положении 63 (Asp63) (SEQ ID NO: 1). Дополнительно, пептид L10 обнаружен с разностью масс, указывающей на добавление О-связанной гексозы.
Тяжелая цепь также подвергается О-связанному гликозилированию. На пептидной карте обнаружено, что основная форма С-конца альфа изоформы тяжелой цепи оканчивается по аминокислоте L398, и обнаружено, что минорная форма С-конца оканчивается по аминокислоте К399. Обнаружено, что оба этих пептида содержат один или два дисиалилированных О-гликана ядра-1, тогда как преобладающие виды обоих пептидов содержат один дисиалилированный О-гликан ядра-1. В профиле пептидной карты пик, помеченный как "Н203", соответствует пептиду Н20, оканчивающемуся по L398, а пик, помеченный как "Н202", соответствует пептиду Н20, оканчивающемуся по К399, каждый из которых содержит один О-связанный гликан. Пик, помеченный как "Н201", соответствует пептиду Н20, оканчивающемуся по К399 и содержащему два О-связанных гликана. Пептид Н20, оканчивающийся по L398, имеющий два О-связанных гликана, обнаруживали на следовых уровнях, и он не помечен на Фиг. 2. Местоположение О-гликанов в Н20 с Thr394 по Ser395 было определено путем бета-элиминирования с последующей фрагментацией путем MS (масс-спектрометрия).
ПРИМЕР 4: Структурная гетерогенность, определенная при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии
Обращеннофазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (RP-HPLC) использовали для измерения структурной гетерогенности в одном из препаратов интактного очищенного варианта белка FXa. Очищенный белок инжектировали на обращенно-фазовую колонку и элюировали градиентом подкисленного ацетонитрила. В соответствии с обнаруженным в результате анализа путем пептидного картирования вариант FXa содержал структурную гетерогенность по С-концу тяжелой цепи, приводя в результате к двум основным структурным изоформам, альфа (оканчивающейся по Lys399) и бета (оканчивающейся по Lys386). Обнаружена дополнительная минорная изоформа, названная гамма, вследствие обрезания тяжелой цепи после Lys281 или Arg283. Хроматограмма HPLC, полученная в этих экспериментах, представлена на Фиг. 3.
Относительная частота основных структурных изоформ согласовывалась среди семи протестированных препаратов очищенного варианта белка FXa. В частности, на основе относительного распределения пиков частота появления альфа изоформы находилась в диапазоне от 54% до 74% (среднее значение равно 66,9%, SD равно 7,0%), частота появления изоформы бета находилась в диапазоне от 24% до 42% (среднее значение равно 31,4%, SD равно 6,5%), и частота появления изоформы гамма находилась в диапазоне от 1% до 3% (среднее значение равно 2,0%, SD равно 0,8%).
Альфа и бета изоформы очищали с использованием гель-фильтрационной HPLC и тестировали в отношении активности в стандартном основанном на АРТТ анализе коагулирующей активности крови. Изоформа бета демонстрировала слегка меньшую активность (79%) по сравнению с альфа изоформой (нормализованной как 100%). Активность минорных видов гамма не тестировали.
ПРИМЕР 5: Структурная гетерогенность интактного белка, определенная при помощи масс-спектроскопии
Молекулярную массу (Мr) интактного варианта FXa из одного препарата очищенного белка анализировали при помощи RP-HPLC с последующей масс-спектрометрией с использованием гибридного квадрупольного времяпролетного масс-анализатора высокого разрешения (ESI-QTOF MS). Значения Мг определяли по масс-спектрам для нулевого заряда после обращенной свертки данных для множественного заряда при помощи программного обеспечения Waters MaxEnt-1. Все относительные ошибки между теоретическими и наблюдаемыми основными и минорными значениями масс находились в пределах ±60 млн-1, согласуясь с функциональными характеристиками масс-спектрометра Waters Q-ToF. Хроматограмма HPLC представлена на Фиг. 4. Масс-спектр интактного варианта белка FXa представлен на Фиг. 5, и обозначение пиков, основанное на масс-спектре, перечислено в таблице 2 ниже. Нумерация аминокислот основана на Фиг. 1А (SEQ ID NO: 1). 1ANS…LER139 соответствует SEQ ID NO: 6; 1ANS…ERR140 соответствует SEQ ID NO: 7; 1ANS…RRK141 соответствует SEQ ID NO: 9; 1ANS…RKR142 соответствует SEQ ID NO: 11; 1ANS…KRR143 соответствует SEQ ID NO: 12; 146LVG…LPK384 соответствует SEQ ID NO: 45; 146LVG…KAK386 соответствует SEQ ID NO: 46; 146LVG…SPL398 соответствует SEQ ID NO: 14; и 146LVG…PLK399 соответствует SEQ ID NO: 3.
HPLC вновь продемонстрировала структурную гетерогенность варианта белка FXa (Фиг. 4). Пики, меченные А, соответствуют видам гамма. Пик, меченный В, соответствует альфа форме белка, включающей два О-гликана. Пик, меченный С, соответствует альфа форме белка, включающей один О-гликан. Пик, меченный D, соответствует бета форме белка, в котором тяжелая цепь оканчивается по К386. Пик, меченный Е, соответствует бета форме белка, в котором тяжелая цепь оканчивается по К384.
На масс-спектре обнаружены три области (Фиг. 5). Первая на низкомолекулярном конце масс-спектра (слева) соответствует интактному варианту белка FXa, содержащему бета изоформу тяжелой цепи. Эта область также содержит так называемые основные виды, которые появляются с большей частотой по сравнению с другими, на основе относительной интенсивности пиков. Основные виды включают виды, содержащие бета форму тяжелой цепи, оканчивающуюся по К386, в которой С-концевой остаток легкой цепи представлял собой R139, R140 или К141, по-видимому вследствие вариабельного расщепления по сайту расщепления РАСЕ. Виды, в которых легкая цепь оканчивается по R142, также, по-видимому, возникающие вследствие вариабельного расщепления, также представлены в виде минорных видов. Среди эти основных и минорных видов, легкая цепь включала β-гидрокси Asp63 и О-связанную гексозу, а также 10 или 11 остатков Gla.
В масс-спектре также появились две области с большей массой, обе из которых соответствуют минорным видам интактного варианта белка FXa, содержащим альфа изоформу тяжелой цепи (оканчивающуюся по L398 или К399). Одна из групп таких видов дополнительно включает единичную О-гликановую, а вторая группа дополнительно включает две О-гликановые посттрансляционные модификации (центр и правая часть на Фиг. 5, соответственно).
Обозначения, специально приведенные на Фиг. 5, соответствуют видам интактного варианта белка FXa, в которых легкая цепь содержит 10 остатков Gla, β-гидрокси Asp63 и О-связанную глюкозу. Соседние пики в спектре, помеченные "*", представляют виды, содержащие 11 остатков Gla, которые увеличивают массу на 44,0 Да.
В таблице 2 представлены основные и минорные виды, идентифицированные на описанном выше масс-спектре, а также многочисленные другие минорные и следовые виды, идентифицированные по данным масс-спектра. В таблице 2 виды, имеющее то же самое значение обнаруженной Мr, которое нельзя отличить от похожей изобарической изоформы в таблице, обозначены "*". Обозначение кажущейся частоты различных видов как основное, минорное и следовое основано на относительных интенсивностях пиков по данным масс-спектра. В столбце, озаглавленном "О-гликан", приведено состояние гликозилирования тяжелой цепи различных видов вариантов белка FXa, идентифицированных в таблице. В соответствии с обсуждаемым здесь легкая цепь содержит О-связанную гексозу. В таблице "0" обозначает отсутствие О-связанных гликанов в тяжелой цепи; "1+1NeuAc" указывает на присутствие одного моносиалилированного О-гликана в ядре-1; "1+1NeuAc - Gal" указывает на присутствие одного моносиалилированного О-гликана в ядре-1, в котором концевая галактоза (Gal) отсутствует; "1+2NeuAc" указывает на присутствие одного дисиалилированного О-гликана в ядре-1; "2+2NeuAc" указывает на присутствие двух О-гликанов в ядре-1, один из которых дисиалилирован или оба из которых моносиалилированы; "2+3NeuAc" указывает на присутствие двух О-гликанов в ядре-1, один из которых моносиалилирован, а другой из которых дисиалилирован; и "2+4NeuAc" указывает на присутствие двух О-гликанов в ядре-1, каждый из которых дисиалилирован.
ПРИМЕР 6: Структурная гетерогенность восстановленного и алкилированного белка, определенная при помощи масс-спектроскопии
Для подтверждения описанного выше анализа очищенный интактный вариант белка FXa восстанавливали и алкилировали для устранения межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидных связей. Разделенные легкие и тяжелые цепи затем анализировали при помощи RP-HPLC/ESI-QTOF MS для определения их аминокислотной структуры и посттрансляционной модификации.
Хроматограмма HPLC представлена на Фиг. 6, в которой легкие и тяжелые цепи помечены. Альфа и бета изоформы тяжелой цепи элюируются в виде множественных хроматографических пиков. Следовые уровни видов гамма (тяжелая цепь бета, усеченная после аминокислоты К281 или R283) обнаружены при элюировании непосредственно перед тяжелой цепью на хроматограмме приблизительно на 48-50 минуте.
Масс-спектр легкой цепи для нулевого заряда представлен на Фиг. 7А, и виды, идентифицированные из спектра, включая их относительные частоты как основные, минорные или следовые, перечислены в таблице 3 ниже. Нумерация аминокислот основана на Фиг. 1А (SEQ ID NO: 1). 1ANS…LER139 соответствует SEQ ID NO: 6; 1ANS…ERR140 соответствует SEQ ID NO: 7; 1ANS…RRK141 соответствует SEQ ID NO: 9; 1ANS…RKR142 соответствует SEQ ID NO: 11; и 1ANS…KRR143 соответствует SEQ ID NO: 12.
Как видно для интактного варианта белка FXa, обнаружено, что все виды легкой цепи включают β-гидроксилирование Asp63 и О-связанную гексозу. Карбоксилирование глутаминовой кислоты в домене Gla и расщепление РАСЕ, тем не менее, варьировали, приводя к образованию видов легкой цепи с 9, 10 или 11 остатками Gla и С-концевой гетерогенностью, возникающей в результате неаккуратного расщепления по сайту РАСЕ.
Масс-спектр тяжелой цепи для нулевого заряда представлен на Фиг. 7 В, и различные виды, идентифицированные из спектра, включая их относительные частоты как основные, минорные или следовые, перечислены в таблице 4 ниже. Нумерация аминокислот основана на Фиг. 1А (SEQ ID NO: 1). 146LVG…LPK384 соответствует SEQ ID NO: 45; 146LVG…KAK386 соответствует SEQ ID NO: 46; 146LVG…SPL398 соответствует SEQ ID NO: 14; и 146LVG…PLK399 соответствует SEQ ID NO: 3.
В масс-спектре тяжелая цепь обнаружена в виде трех преобладающих областей, соответствующих изоформам бета и альфа. Наблюдаемая Мг наиболее частой изоформы тяжелой цепи (27683,9 Да) хорошо сравнима с теоретической массой бета изоформы тяжелой цепи (27684,3 Да; 146LVG…KAK386) с алкилированием всех девяти цистеиновых остатков. Дополнительная гетерогеннность по массам возникает вследствие вариации по С-концевому остатку и О-гликозилирования альфа изоформ. В частности, некоторые пики соответствовали альфа изоформам, оканчивающимся по L398 или К399, тогда как другие пики соответствовали тяжелым цепям, несущим один или два О-гликана ядра-1, которые произвольно были не сиалилированы, моносиалилированы или дисиалилированы. На Фиг. 7В присутствие "*" указывает на сверхалкилирование тяжелой цепи, согласующееся с пиками, обнаруженными путем пептидного картирования варианта белка FXa (см. Пример 3).
Структурная гетерогенность, обнаруженная в легкой и тяжелой цепях после восстановления и алкилирования, согласуется с результатами, обнаруженными с использованием интактного варианта белка FXa.
Теоретические массы рассчитывали при помощи программного обеспечения PAWS (2000.06.08, Genomic Solutions, Ann Arbor, Ml). Обнаруженные массы определяли по масс-спектрам для нулевого заряда после обращенной свертки данных для множественного заряда при помощи программного обеспечения Waters MaxEnt-1. Все относительные ошибки между теоретическими и наблюдаемыми основными и минорными значениями масс составляли меньше 60 млн-1, согласуясь с функциональными характеристиками масс-спектрометра Waters Q-ToF для анализа интактного гликопротеина. Разделение видов на основные, минорные и следовые основано на соответствующих интенсивностях пиков, что коррелирует с частотой изоформы.
ПРИМЕР 7: Анализ in vitro коагулирующей активности крови
Коагулирующую активность для семи различных препаратов варианта белка FXa определяли с использованием одностадийного анализа коагулирующей активности крови с использованием в качестве субстрата человеческой плазмы, дефицитной по фактору VIII (анализ АРТТ). Специфическую активность определяли путем деления коагулирующей активности (мг/мл) на концентрацию белка (мг/мл). Средняя коагулирующая активность среди препаратов составляла 1,52 мг/мл при стандартном отклонении 0,09. Средняя специфическая активность составляла 101,3% при стандартном отклонении 5,9.
Описание настоящего изобретения не ограничивается объемом конкретных описанных здесь воплощений. Действительно, различные модификации описания изобретения дополнительно к описанным здесь понятны специалисту в данной области техники из предшествующего описания и сопутствующих графических материалов. Предполагается, что такие модификации оказываются в пределах объема формулы изобретения.
Здесь цитируются различные ссылки, включающие заявки на патенты, патенты и технические публикации. Описание каждого такого источника во всей его полноте включено в данное описание путем ссылки.
Claims (74)
1. Композиция для эффективной терапии субъекта, нуждающегося в гемостазе, содержащая в эффективном количестве два или более рекомбинантных вариантов белка FXa, выбранных из группы, состоящей из:
(а) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 139 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(б) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(в) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(г) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(д) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 143 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(е) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(ж) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(з) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и
(и) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 143 и со 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
где легкие цепи указанных вариантов белка FXa возможно содержат модификацию, выбранную из группы, состоящей из β-гидроксилирования Asp63, включения О-связанной гексозы и включения 9, 10 или 11 остатков Gla.
2. Композиция для эффективной терапии субъекта, нуждающегося в гемостазе, содержащая в эффективном количестве два или более рекомбинантных варианта белка FXa, выбранных из группы, состоящей из:
(а) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 139 и со 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(б) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(в) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(г) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(д) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(е) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и
(ж) рекомбинантного варианта белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
где легкие цепи указанных вариантов белка FXa возможно содержат модификацию, выбранную из группы, состоящей из β-гидроксилирования Asp63, включения О-связанной гексозы и включения 9, 10 или 11 остатков Gla, и
где тяжелые цепи указанных вариантов белка FXa возможно содержат модификацию, представляющую собой включение одного или двух О-связанных гликанов ядра-1.
3. Композиция по п. 1 или 2, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa включают β-гидрокси Asp63 и О-связанную гексозу.
4. Композиция по п. 1 или 2, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa включают 9, 10 или 11 остатков Gla.
5. Композиция по п. 3, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa дополнительно включают 9, 10 или 11 остатков Gla.
6. Композиция по п. 5, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa включают 9 остатков Gla.
7. Композиция по п. 5, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa включают 10 остатков Gla.
8. Композиция по п. 5, где легкие цепи указанных вариантов белка включают 11 остатков Gla.
9. Композиция по п. 2, где тяжелые цепи указанных вариантов белка FXa включают один или два О-связанных гликана ядра-1.
10. Композиция по п. 9, где один О-связанный гликан ядра-1 моносиалилирован или дисиалилирован.
11. Композиция по п. 10, где один О-связанный гликан ядра-1 моносиалилирован.
12. Композиция по п. 10, где один О-связанный гликан ядра-1 дисиалилирован.
13. Композиция по п. 9, где каждый из двух О-связанных гликанов ядра-1, если присутствуют, моносиалилирован.
14. Композиция по п. 9, где каждый из двух О-связанных гликанов ядра-1, если присутствуют, дисиалилирован.
15. Композиция по п. 9, где один из двух О-связанных гликанов ядра-1, если присутствуют, моносиалилирован, а другой дисиалилирован.
16. Композиция по п. 1, содержащая 3, 4, 5, 6, 7, 8 или все 9 рекомбинантных вариантов белка FXa, выбранных из указанной группы.
17. Композиция по п. 2, содержащая 3, 4, 5, 6 или все 7 рекомбинантных вариантов белка FXa, выбранных из указанной группы.
18. Композиция по п. 1, где относительная частота вариантов белка FXa (а), (б), (в) и (г), каждый из которых содержит 10 остатков Gla, составляет (б) больше (в), (в) больше (а), (а) больше (г), как определено с использованием масс-спектрометрии.
19. Композиция по п. 2, где относительная частота вариантов белка FXa (а), (б), (в) и (е), каждый из которых содержит 10 остатков Gla и один О-связанный гликан ядра-1, составляет (б) больше (в), (в) больше (е), (е) больше (а), как определено с использованием масс-спектрометрии.
20. Композиция рекомбинантных вариантов белка FXa для эффективной терапии субъекта, нуждающегося в гемостазе, содержащая в эффективном количестве:
(а) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 139 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(б) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(в) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(г) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(д) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 143 и со 146 по 386 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(е) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(ж) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(з) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(и) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 143 и со 146 по 384 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(к) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 139 и со 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(л) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(м) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(н) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 398 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(о) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 140 и со 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
(п) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 141 и со 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и
(р) вариант белка FXa, где последовательности легкой цепи и тяжелой цепи белка соответственно состоят из аминокислот с 1 по 142 и со 146 по 399 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1,
где легкие цепи указанных вариантов белка FXa возможно содержат модификацию, выбранную из группы, состоящей из β-гидроксилирования Asp63, включения О-связанной гексозы и включения 9, 10 или 11 остатков Gla, и
где тяжелые цепи указанных вариантов белка FXa возможно содержат модификацию, представляющую собой включение одного или двух О-связанных гликанов ядра-1.
21. Композиция по п. 20, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa включают β-гидрокси Asp63 и О-связанную гексозу.
22. Композиция по п. 20, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa включают 9, 10 или 11 остатков Gla.
23. Композиция по п. 21, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa дополнительно включают 9, 10 или 11 остатков Gla.
24. Композиция по п. 23, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa включают 9 остатков Gla.
25. Композиция по п. 23, где легкие цепи указанных вариантов белка FXa включают 10 остатков Gla.
26. Композиция по п. 23, где легкие цепи указанных вариантов белка включают 11 остатков Gla.
27. Композиция по п. 20, где тяжелые цепи указанных вариантов белка FXa, имеющих тяжелую цепь альфа формы, включают один или два О-связанных гликана ядра-1.
28. Композиция по п. 27, где один О-связанный гликан ядра-1 моносиалилирован или дисиалилирован.
29. Композиция по п. 28, где один О-связанный гликан ядра-1 моносиалилирован.
30. Композиция по п. 28, где один О-связанный гликан ядра-1 дисиалилирован.
31. Композиция по п. 27, где каждый из двух О-связанных гликанов ядра-1, если присутствуют, моносиалилирован.
32. Композиция по п. 27, где каждый из двух О-связанных гликанов ядра-1, если присутствуют, дисиалилирован.
33. Композиция по п. 27, где один из двух О-связанных гликанов ядра-1, если присутствуют, моносиалилирован, а другой дисиалилирован.
34. Способ лечения субъекта, нуждающегося в гемостазе, включающий стадию введения указанному субъекту количества композиции по любому из пп. 1-33, эффективного для того, чтобы вызывать гемостаз у указанного субъекта.
35. Способ по п. 34, где указанный субъект страдает от гемофилии А.
36. Способ по п. 34, где указанный субъект страдает от гемофилии В.
37. Способ по п. 34, где указанный субъект страдает от травмы.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361881834P | 2013-09-24 | 2013-09-24 | |
US61/881,834 | 2013-09-24 | ||
PCT/IB2014/064564 WO2015044836A1 (en) | 2013-09-24 | 2014-09-16 | Compositions comprising heterogeneous populations of recombinant human clotting factor xa proteins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016108608A RU2016108608A (ru) | 2017-10-26 |
RU2648144C2 true RU2648144C2 (ru) | 2018-03-22 |
Family
ID=51844797
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016108608A RU2648144C2 (ru) | 2013-09-24 | 2014-09-16 | КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ГЕТЕРОГЕННЫЕ ПОПУЛЯЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Ха |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9757434B2 (ru) |
EP (1) | EP3049434A1 (ru) |
JP (1) | JP6429885B2 (ru) |
KR (1) | KR101988705B1 (ru) |
CN (2) | CN112195169A (ru) |
AR (1) | AR097732A1 (ru) |
AU (1) | AU2014326257B2 (ru) |
BR (1) | BR112016005899A8 (ru) |
CA (1) | CA2924981C (ru) |
HK (1) | HK1218760A1 (ru) |
IL (2) | IL244258A0 (ru) |
MX (1) | MX2016003871A (ru) |
MY (1) | MY173548A (ru) |
PE (1) | PE20160877A1 (ru) |
RU (1) | RU2648144C2 (ru) |
SA (1) | SA516370751B1 (ru) |
SG (1) | SG11201601221XA (ru) |
TW (1) | TWI631134B (ru) |
WO (1) | WO2015044836A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX2015008813A (es) | 2013-01-31 | 2016-03-31 | Pfizer | Composiciones y metodos para contrarrestar la inhibicion del factor xa. |
MX2016003871A (es) | 2013-09-24 | 2016-08-04 | Pfizer | Composiciones que comprenden poblaciones heterogeneas de proteinas recombinantes humanas de factor xa de coagulacion. |
HUE054597T2 (hu) | 2016-06-17 | 2021-09-28 | Alexion Pharma Inc | Az XA faktor származékainak elõkészítése |
EP3722418A1 (en) * | 2019-04-08 | 2020-10-14 | AB Enzymes Oy | Solution stable enzyme composition |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090175931A1 (en) * | 2005-11-15 | 2009-07-09 | Camire Rodney M | Compositions and methods for modulating hemostasis |
RU2396347C2 (ru) * | 2004-08-17 | 2010-08-10 | Ксл Бехринг Гмбх | Модифицированные витамин к-зависимые полипептиды |
WO2013049804A1 (en) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating hemostasis |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5597799A (en) | 1990-09-04 | 1997-01-28 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant agents affecting thrombosis |
AT405517B (de) | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon |
AT405516B (de) | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
AT410216B (de) | 1999-08-10 | 2003-03-25 | Baxter Ag | Faktor x-analogon mit verbesserter aktivierbarkeit |
US20040102388A1 (en) | 2000-03-22 | 2004-05-27 | High Katherine A. | Modified blood clotting factors and methods of use |
FR2831170B1 (fr) | 2001-10-19 | 2004-03-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Proteines c modifiees activables directement par la thrombine |
FR2841904B1 (fr) | 2002-07-03 | 2004-08-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Analogues de facteurs x clivables par la thrombine |
EP1728798A1 (en) | 2005-06-01 | 2006-12-06 | ZLB Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
EP1820508A1 (en) | 2006-02-21 | 2007-08-22 | CSL Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
CN101802188B (zh) * | 2007-09-28 | 2013-08-21 | 普托拉制药有限公司 | 用于因子Xa抑制剂的解毒剂和其使用方法 |
DK2300497T3 (da) | 2008-06-24 | 2012-10-29 | Octapharma Ag | Fremgangsmåde til oprensning af koagulationsfaktor VIII |
EP2364165B1 (en) | 2008-11-14 | 2018-01-03 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same in combination with blood coagulating agents |
WO2010070137A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-06-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Serine protease derivatives and uses in the prevention or the treatment of blood coagulation disorders |
WO2011008885A1 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
KR20140002601A (ko) * | 2010-07-09 | 2014-01-08 | 바이오겐 이데크 헤모필리아 인코포레이티드 | 키메라 응고 인자 |
FR2972114B1 (fr) | 2011-03-01 | 2013-03-15 | Univ Grenoble 1 | Un nouveau leurre moleculaire procoagulant pour le traitement des hemophiles a ou b avec ou sans inhibiteur |
US9145552B2 (en) | 2012-07-25 | 2015-09-29 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified factor X polypeptides and uses thereof |
MX2015008813A (es) | 2013-01-31 | 2016-03-31 | Pfizer | Composiciones y metodos para contrarrestar la inhibicion del factor xa. |
MX2016003871A (es) | 2013-09-24 | 2016-08-04 | Pfizer | Composiciones que comprenden poblaciones heterogeneas de proteinas recombinantes humanas de factor xa de coagulacion. |
EP3063170A4 (en) | 2013-11-01 | 2017-06-28 | The Children's Hospital of Philadelphia | Compositions and methods for increasing the half-life of factor xa |
KR20160093731A (ko) | 2014-01-24 | 2016-08-08 | 화이자 인코포레이티드 | 뇌내 출혈을 치료하기 위한 조성물 및 방법 |
-
2014
- 2014-09-16 MX MX2016003871A patent/MX2016003871A/es active IP Right Grant
- 2014-09-16 SG SG11201601221XA patent/SG11201601221XA/en unknown
- 2014-09-16 RU RU2016108608A patent/RU2648144C2/ru active
- 2014-09-16 KR KR1020167007373A patent/KR101988705B1/ko active IP Right Grant
- 2014-09-16 PE PE2016000398A patent/PE20160877A1/es unknown
- 2014-09-16 CN CN202011112690.1A patent/CN112195169A/zh active Pending
- 2014-09-16 AU AU2014326257A patent/AU2014326257B2/en not_active Ceased
- 2014-09-16 EP EP14792595.2A patent/EP3049434A1/en not_active Withdrawn
- 2014-09-16 JP JP2016543477A patent/JP6429885B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-09-16 BR BR112016005899A patent/BR112016005899A8/pt not_active IP Right Cessation
- 2014-09-16 CA CA2924981A patent/CA2924981C/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-09-16 WO PCT/IB2014/064564 patent/WO2015044836A1/en active Application Filing
- 2014-09-16 CN CN201480052212.2A patent/CN105579468A/zh active Pending
- 2014-09-16 MY MYPI2016700985A patent/MY173548A/en unknown
- 2014-09-23 AR ARP140103512A patent/AR097732A1/es unknown
- 2014-09-23 TW TW103132803A patent/TWI631134B/zh not_active IP Right Cessation
- 2014-09-24 US US14/495,478 patent/US9757434B2/en active Active
-
2016
- 2016-02-23 IL IL244258A patent/IL244258A0/en unknown
- 2016-03-17 SA SA516370751A patent/SA516370751B1/ar unknown
- 2016-06-10 HK HK16106674.2A patent/HK1218760A1/zh unknown
-
2017
- 2017-08-04 US US15/669,340 patent/US10660946B2/en active Active
-
2020
- 2020-05-25 US US16/882,598 patent/US20210106658A1/en not_active Abandoned
- 2020-12-13 IL IL279396A patent/IL279396A/en unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2396347C2 (ru) * | 2004-08-17 | 2010-08-10 | Ксл Бехринг Гмбх | Модифицированные витамин к-зависимые полипептиды |
US20090175931A1 (en) * | 2005-11-15 | 2009-07-09 | Camire Rodney M | Compositions and methods for modulating hemostasis |
WO2013049804A1 (en) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating hemostasis |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
LACRAMIOARA I. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia, Nature Biotechnology, 2011, v.29, n.11, p.1028-1035. * |
MIN-NING H., Characterization of the Human Blood Coagulation Factor X Promoter, The J. of Biol. Chem., 1992, v.267, n.22, p.15440-15446. * |
YAN-MEI S. Vitamin K epoxide reductase significantly improves carboxylation in a cell line overexpressing factor X, Blood, 2005, v.106, numb. 12, p.3811-3815. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2014326257A1 (en) | 2016-03-10 |
JP2016535071A (ja) | 2016-11-10 |
IL279396A (en) | 2021-01-31 |
WO2015044836A1 (en) | 2015-04-02 |
CN105579468A (zh) | 2016-05-11 |
KR101988705B1 (ko) | 2019-06-12 |
TW201524996A (zh) | 2015-07-01 |
EP3049434A1 (en) | 2016-08-03 |
US10660946B2 (en) | 2020-05-26 |
AU2014326257B2 (en) | 2017-08-10 |
US20210106658A1 (en) | 2021-04-15 |
CA2924981C (en) | 2020-03-31 |
PE20160877A1 (es) | 2016-09-11 |
RU2016108608A (ru) | 2017-10-26 |
JP6429885B2 (ja) | 2018-11-28 |
IL244258A0 (en) | 2016-04-21 |
HK1218760A1 (zh) | 2017-03-10 |
US20170333535A1 (en) | 2017-11-23 |
US9757434B2 (en) | 2017-09-12 |
CN112195169A (zh) | 2021-01-08 |
CA2924981A1 (en) | 2015-04-02 |
TWI631134B (zh) | 2018-08-01 |
KR20160044034A (ko) | 2016-04-22 |
BR112016005899A8 (pt) | 2018-02-06 |
AR097732A1 (es) | 2016-04-13 |
SA516370751B1 (ar) | 2018-04-05 |
MX2016003871A (es) | 2016-08-04 |
SG11201601221XA (en) | 2016-04-28 |
US20150182604A1 (en) | 2015-07-02 |
BR112016005899A2 (pt) | 2017-09-26 |
MY173548A (en) | 2020-02-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210106658A1 (en) | Compositions comprising heterogeneous populations of recombinant human clotting factor xa proteins | |
EP1863920B1 (en) | Method for improved isolation of recombinantly produced proteins | |
CA2683423C (en) | Recombinant vitamin k dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same | |
EP2108046B1 (en) | Fviii-independent fix-mutant proteins for hemophilia a treatment | |
US11708570B2 (en) | Compositions and methods for modulating Factor IX function | |
US20230250412A1 (en) | Compositions and Methods for Modulating Factor IX Function | |
WO2023198171A1 (zh) | 一种凝血因子x激活酶及其应用 | |
CA2744174C (en) | Snake factor v and methods of use as a procoagulant | |
US20110162094A1 (en) | Modified human factor vii/viia and pharmaceutical composition containing the same | |
WO2017025566A1 (en) | Improved recombinant factor vii |