RU2647570C1 - Genetic design for expression of the functionally-active human stress-protein (hps70) with mutated glycosilation sites for working in eucariotic expression systems - Google Patents
Genetic design for expression of the functionally-active human stress-protein (hps70) with mutated glycosilation sites for working in eucariotic expression systems Download PDFInfo
- Publication number
- RU2647570C1 RU2647570C1 RU2016125944A RU2016125944A RU2647570C1 RU 2647570 C1 RU2647570 C1 RU 2647570C1 RU 2016125944 A RU2016125944 A RU 2016125944A RU 2016125944 A RU2016125944 A RU 2016125944A RU 2647570 C1 RU2647570 C1 RU 2647570C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hsp70
- protein
- milk
- human
- expression
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 title description 10
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 title description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 45
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 45
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 19
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 17
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 abstract description 26
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 abstract description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 15
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 abstract description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 6
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 abstract description 5
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 abstract 4
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 abstract 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 4
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 4
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 4
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 4
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000004447 HSP40 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010042283 HSP40 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100040352 Heat shock 70 kDa protein 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001037759 Homo sapiens Heat shock 70 kDa protein 1A Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 206010058490 Hyperoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 101000839464 Leishmania braziliensis Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000020244 animal milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000001876 chaperonelike Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000222 hyperoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- -1 pH 8.0 25mM Chemical compound 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007111 proteostasis Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
- A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к биотехнологии, биоинженерии, молекулярной биофармакологии и может быть использовано для получения биологически активного белка теплового шока с молекулярной массой 70 килодальтон (БТШ70), который может быть экспрессирован и выделен из различных эукариотических систем, включая и биореакторы (трансгенные животные и др.) для дальнейшего использования в медицине.The invention relates to biotechnology, bioengineering, molecular biopharmacology and can be used to produce biologically active heat shock protein with a molecular weight of 70 kilodaltons (HSP70), which can be expressed and isolated from various eukaryotic systems, including bioreactors (transgenic animals, etc.) for further use in medicine.
БТШ70 играют важнейшую роль в развитии организма млекопитающих и в перспективе могут быть использованы в качестве терапевтического средства для лечения заболеваний человека, связанных с протеинопатией, таких как Болезнь Альцгеймера или Паркинсонизм. В настоящее время человеческий стресс-белок (БТШ70), нарабатываемый в бактериях, проходит доклинические испытания, как лекарство, применяемое для лечения некоторых злокачественных опухолей. С другой стороны, при наработке в бактериях белки человека не проходят свойственных им посттрансляционных модификаций и исследователям приходится тщательно очищать препараты от бактериальных токсинов. Поэтому наработка БТШ70 в эукариотических системах экспрессии в препаративных количествах является важной задачей с точки зрения биофармакологии.HSP70s play an important role in the development of the mammalian organism and, in the future, can be used as a therapeutic agent for treating human diseases associated with proteinopathy, such as Alzheimer's disease or Parkinsonism. Currently, human stress protein (HSP70), produced in bacteria, is undergoing preclinical trials as a medicine used to treat some malignant tumors. On the other hand, when operating in bacteria, human proteins do not pass the post-translational modifications characteristic of them, and researchers have to carefully clean preparations of bacterial toxins. Therefore, the production of HSP70 in eukaryotic expression systems in preparative quantities is an important task from the point of view of biopharmacology.
Белки теплового шока и особенно БТШ70 играют важную роль при нормальном функционировании организма на всех стадиях его развития. Особенно важна роль БТШ70 при различных стрессорных воздействиях, обеспечивая выживание клеток при действии токсинов, радиации, сублетальной температуры, гипоксии или гипероксии, при энергетическом истощении клетки, а также при многих вирусных и микробных инфекциях. Рекомбинантный БТШ70 востребован в таких ситуациях, когда синтез эндогенного БТШ70 снижен или заблокирован, что наблюдается при старении и многих нейродегенеративных заболеваниях.Heat shock proteins and especially HSP70 play an important role in the normal functioning of the body at all stages of its development. The role of HSP70 in various stressful effects is especially important, ensuring cell survival under the action of toxins, radiation, sublethal temperature, hypoxia or hyperoxia, with energy depletion of the cell, as well as with many viral and microbial infections. Recombinant HSP70 is in demand in situations where the synthesis of endogenous HSP70 is reduced or blocked, which is observed with aging and many neurodegenerative diseases.
Уровень техникиState of the art
В результате интенсивных исследований, проводимых во многих лабораториях, за последнее десятилетие подробно изучены основные функции внутриклеточных БТШ70 и его ко-шаперонов, связанные с нормальным функционированием этого комплекса белков, как при нормальном функционировании клетки, так и при различных стрессовых воздействиях. Эти белки осуществляют так называемые «шаперонные» функции и обеспечивают правильную укладку и транспорт вновь синтезированных пептидов в клетке (ссылки). Хотя БТШ70 цитоплазматический белок, в последнее десятилетие оказалось, что он может при определенных условиях выходить из клетки и вести себя как цитокин. Свободный БТШ70 был обнаружен во внеклеточном пространстве в норме и при некоторых патологиях ((Hait1 et al. 2011). Более того БТШ70 был обнаружен на поверхности клеток у ряда линий опухолевых клеток и у вирус-инфицированных лимфоцитов. Продемонстрированы также иммуноадъювантные свойства человеческого БТШ70 и на этой основе ведутся исследования по разработке вакцин для иммунотерапии некоторых злокачественных опухолей ((Srivastava 2002). Интересно, что антитела на БТШ70 обнаружены в крови людей при различных заболеваниях, а также в крови людей, часто подвергающихся действию высокой температуры (например, у рабочих сталелитейной промышленности).As a result of intensive studies conducted in many laboratories, over the past decade, the basic functions of intracellular HSP70 and its co-chaperones associated with the normal functioning of this protein complex, both during normal cell functioning and under various stressful effects, have been studied in detail. These proteins carry out the so-called “chaperone” functions and ensure the correct folding and transport of newly synthesized peptides in the cell (links). Although HSP70 is a cytoplasmic protein, in the last decade it has turned out that under certain conditions it can leave the cell and behave like a cytokine. Free HSP70 was found in the extracellular space under normal conditions and in some pathologies ((Hait1 et al. 2011). Moreover, HSP70 was found on the surface of cells in a number of tumor cell lines and in virus-infected lymphocytes. The immunoadjuvant properties of human HSP70 and on on this basis, studies are underway to develop vaccines for the immunotherapy of certain malignant tumors ((Srivastava 2002). Interestingly, antibodies to HSP70 have been found in the blood of people with various diseases, as well as in the blood of people, often suspected gayuschihsya elevated temperature (for example, steel workers).
Структурно-функциональный анализ молекул БТШ70 разного происхождения показал, что аминоконцевая часть молекулы БТШ70 у всех организмов, включая человека и мышь, содержит консервативный АТФазный домен (44 кДа), в то время как в карбокситерминальной части молекулы находится субстрат-связывающий домен, занимающий обычно около 25 кДа. Этот домен обеспечивает взаимодействие шаперона с различными полипептидами. В отличие от большинства других стрессовых белков БТШ70 функционируют в виде мономеров. У человека имеется целое семейство генов (более 17 членов), отвечающих за синтез различных вариантов БТШ70 с различным уровнем гомологии и выполняющих разные функции в клетке.Structural and functional analysis of HSP70 molecules of different origin showed that the amino-terminal part of the HSP70 molecule in all organisms, including humans and mice, contains a conserved ATPase domain (44 kDa), while in the carboxyterminal part of the molecule there is a substrate-binding domain, which usually occupies about 25 kDa. This domain provides the interaction of the chaperone with various polypeptides. Unlike most other stressful proteins, HSP70s function as monomers. A person has a whole family of genes (more than 17 members) that are responsible for the synthesis of various HSP70 variants with different levels of homology and performing different functions in the cell.
Синтез индуцибельного БТШ70 повышает устойчивость клетки к различным повреждающим факторам, таким как высокая температура, токсины, соли тяжелых металлов и пр. Кроме этого БТШ70 принимают участие в ренатурации и поддержании нормальной структуры клеточных белков. БТШ70 в комплексе с другими шаперонами участвует в норме и особенно после стрессирующих воздействий в выявлении протеолиза белков с нарушенной структурой, а также препятствует необратимой агрегации денатурированных клеточных белков и принимает участие в диссоциации уже образовавшихся агрегатов (Hartl et al., 2011).The synthesis of inducible HSP70 increases the resistance of the cell to various damaging factors, such as high temperature, toxins, salts of heavy metals, etc. In addition, HSP70 is involved in the renaturation and maintenance of the normal structure of cellular proteins. HSP70 in combination with other chaperones participates normally and, especially after stressful influences, in the detection of proteolysis of proteins with impaired structure, and also prevents the irreversible aggregation of denatured cellular proteins and takes part in the dissociation of already formed aggregates (Hartl et al., 2011).
В последние годы полезные, протективные свойства рекомбинантного БТШ70 были продемонстрированы на многих клеточных и животных моделях (Guzhova et al. 2001; Kakimura et al. 2002; Robinson et al. 2005; Kustanova et al. 2006; Rozhkova et al. 2010; Vinokurov et al. 2012) и поэтому необходимость в наработке этого белка в препаративных количествах стоит весьма остро.In recent years, the useful, protective properties of recombinant HSP70 have been demonstrated in many cellular and animal models (Guzhova et al. 2001; Kakimura et al. 2002; Robinson et al. 2005; Kustanova et al. 2006; Rozhkova et al. 2010; Vinokurov et al. 2012) and, therefore, the need for producing this protein in preparative amounts is very acute.
Отметим, что получение препарата белка БТШ70 из органов и тканей человека крайне не эффективно и опасно с точки зрения риска контаминации, в т.ч. вирусами и поэтому не применяется.It should be noted that obtaining the HSP70 protein preparation from human organs and tissues is extremely inefficient and dangerous from the point of view of the risk of contamination, including viruses and therefore not applicable.
Генно-инженерные методы позволяют нарабатывать препаративные количества БТШ70, необходимые для исследования различных функций белка и производства лекарственных препаратов. Рядом исследователей были разработаны продуценты для наработки рекомбинантных аналогов белков теплового шока БТШ70 [пат. США №№6,524,825; 5,919,620; 05.08.1997, 06.07.1999].Genetic engineering methods allow to produce preparative amounts of HSP70 necessary for the study of various protein functions and the production of drugs. A number of researchers have developed producers for the production of recombinant analogues of heat shock proteins HSP70 [US Pat. US No. 6,524,825; 5,919,620; 08/05/1997, 07/06/1999].
Помимо этого, поскольку рекомбинантный БТШ70 способен образовывать комплексы с белковыми антигенами in vitro, это позволило создавать на их основе противоопухолевые и противовирусные вакцины. Так известны работы в области создания противоопухолевых препаратов на основе гибридных, слитых и других белков с участием рекомбинантного БТШ70. Например, в опубликованной заявке на изобретение РФ №2003101965/14 (опубл. 07.2004 г.) описан способ лечения заболеваний, связанных с вирусом папилломы человека (бородавки, рак шейки матки и прямой кишки и т.д.) с помощью гибридного белка, состоящего из белка теплового шока (БТШ70 65 или БТШ70 из Mycobacterium bovis) и белка вируса папилломы. Лечение может осуществляться либо путем введения субъекту рекомбинантного гибридного белка, либо путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, которая содержится в вирусном векторе.In addition, since the recombinant HSP70 is capable of forming complexes with protein antigens in vitro, this has allowed the development of antitumor and antiviral vaccines based on them. So the work in the field of creating antitumor drugs based on hybrid, fused and other proteins with the participation of recombinant HSP70 is known. For example, in the published application for the invention of the Russian Federation No. 2003101965/14 (publ. 07.2004) describes a method of treating diseases associated with human papillomavirus (warts, cancer of the cervix and rectum, etc.) using a hybrid protein consisting from heat shock protein (HSP70 65 or HSP70 from Mycobacterium bovis) and papilloma virus protein. Treatment can be carried out either by introducing a recombinant fusion protein to a subject, or by introducing a nucleic acid encoding a fusion protein contained in a viral vector.
Препаративное получение целевых белков в различных системах.Preparative preparation of target proteins in various systems.
Так рекомбинантные белки с полезными свойствами для использования в качестве лекарственных препаратов или биодобавок (БАДы) нарабатываются посредством экспрессии: а) в дрожжевых и бактериальных системах, б) в культуре клеток животных, например, в культуре клеток шелкопряда, в) с использованием в качестве биореактора трансгенных животных (млекопитающих). По экономической эффективности и качеству препарата для биофармакологии производство на основе трансгенных животных превосходит другие методы.So recombinant proteins with useful properties for use as drugs or dietary supplements (BAA) are produced by expression: a) in yeast and bacterial systems, b) in animal cell culture, for example, silkworm cell culture, c) using as a bioreactor transgenic animals (mammals). In terms of economic efficiency and the quality of the drug for biopharmacology, production based on transgenic animals is superior to other methods.
В настоящее время многие человеческие рекомбинантные белки нарабатываются в молоке коз или коров. Для этого используют конструкции, в которых экспрессия в молоке обеспечивается промотором генов казеина, лактоферрина или генов других молочных белков. Обычно целевой белок несет на своем С-конце слитый пептид, обеспечивающий его синтез в молоко. Надо сказать, что экскретируемые в молоко или кровь рекомбинантные белки, в принципе, легче очистить, и они обладают и другими преимуществами с точки зрения биотехнологии. Отметим, что экскретируемые белки и в том числе белки, выходящие в молоко, обычно гликозилированы. Это не влияет на свойства секретируемых в норме «молочных» белков, таких как лизоцим или лактоферрин, но может влиять на свойства белков, которые в норме не гликозилируются.Currently, many human recombinant proteins are produced in the milk of goats or cows. To do this, constructs are used in which expression in milk is provided by a promoter of casein, lactoferrin or other milk protein genes. Usually, the target protein carries a fusion peptide at its C-terminus, which ensures its synthesis into milk. I must say that recombinant proteins excreted into milk or blood are, in principle, easier to purify, and they also have other advantages from the point of view of biotechnology. Note that the excreted proteins, including those that enter the milk, are usually glycosylated. This does not affect the properties of normally secreted “milk” proteins, such as lysozyme or lactoferrin, but can affect the properties of proteins that are not normally glycosylated.
Проведенный нами биоинформационный анализ последовательности человеческого рекомбинантного БТШ70 показал, что он имеет потенциальные сайты гликозилирования и его экспрессия в молоке модельных животных может привести к нежелательной посттрансляционной модификации (гликозилированию), которая может нарушить его шаперонные и другие протективные функции.Our bioinformation analysis of the sequence of human recombinant HSP70 showed that it has potential glycosylation sites and its expression in the milk of model animals can lead to undesirable post-translational modification (glycosylation), which can disrupt its chaperone and other protective functions.
Изобретательской задачей изобретения является получение биологически активного модифицированного белка человека БТШ70 в препаративных количествах в различных экспрессионных системах для использования в медицине и биотехнологии.The inventive objective of the invention is to obtain biologically active modified human protein HSP70 in preparative amounts in various expression systems for use in medicine and biotechnology.
Для решения этой задачи была получена генетическая конструкция на базе человеческого индуцибельного гена БТШ70, в котором были мутированы все (пять) потенциальных сайтов гликозилирования.To solve this problem, a genetic construct based on the human inducible HSP70 gene was obtained, in which all (five) potential glycosylation sites were mutated.
На следующем этапе (Пример №1) экспрессировали полученную конструкцию в клетках бактерий (E. coli) и исследовали свойства мутантного БТШ70, а также наработали «дикий» и мутантный БТШ70 в молоке (пример №2), полученных нами для этой цели двух линий трансгенных мышей. Введенные мутации не должны были повлиять на шаперонные свойства белка, но могли предотвратить нехарактерную для внутриклеточных форм БТШ70 посттрансляционную модификацию, возникающую обычно в процессе получения БТШ70 и других рекомбинантных белков в молоке трансгенных животных.At the next stage (Example No. 1), the obtained construct was expressed in bacterial cells (E. coli) and the properties of the mutant HSP70 were studied, as well as the “wild” and mutant HSP70 in milk (example No. 2) obtained by us for this purpose of two transgenic lines were obtained. mice. The introduced mutations were not supposed to affect the chaperone properties of the protein, but could prevent the post-translational modification uncharacteristic for intracellular forms of HSP70, which usually occurs during the production of HSP70 and other recombinant proteins in the milk of transgenic animals.
Технический результатTechnical result
Анализ потенциальных сайтов гликозилирования и проведение in vitro мутагенеза гена БТШ70 человека.Analysis of potential glycosylation sites and in vitro mutagenesis of the human HSP70 gene.
Гликозилирование белков эукариот происходит по следующей схеме: гликозидные остатки присоединяются к азоту амидогруппы боковых цепей аминокислотных остатков Аспарагина или Глицина в специфических последовательностях [Asn OR Gln]X[Ser OR Thr] (где X = любая аминокислота кроме Пролина).Glycosylation of eukaryotic proteins occurs according to the following scheme: glycosidic residues are attached to the nitrogen of the amido group of the side chains of the amino acid residues of Asparagine or Glycine in specific sequences [Asn OR Gln] X [Ser OR Thr] (where X = any amino acid except Proline).
Соответствующие последовательности в белке БТШ70 были выявлены нами при помощи "fuzzpro" EMBOSS программного обеспечения ("The European Molecular Biology Open Software Suite"). Предполагаемые сайты 0-гликозилирования были проанализированы с помощью программы NetOGlyc 4.0 Server (www.expasy.org) и не были обнаружены.The corresponding sequences in the HSP70 protein were identified by us using the "fuzzpro" EMBOSS software ("The European Molecular Biology Open Software Suite"). Estimated 0-glycosylation sites were analyzed using NetOGlyc 4.0 Server (www.expasy.org) and were not detected.
Были выявлены потенциальные сайты гликозилирования БТШ70: DQGnRTTPS, AYFnDSQR, GRDLnKSI, IKRnSTIPT и GILnVTAT. Была проведена оценка влияния гликозилирования по этим сайтам на свойства белка БТШ70. Для этого аналогичные места гликозилирования были выявлены, используя уже установленную 3D структуру гомологичных белков (2QWL.pdb, 1CKR.pdb, 3CQX.pdb) и структуру фрагментов БТШ70 (2E8A.pdb, 2E88.pdb) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Большинство сайтов возможного гликозилирования оказались важными для энзиматической функции БТШ70. Например, гликозилирование DQGnRTTPS может экранировать АТФ-связывающий центр БТШ70.Potential HSP70 glycosylation sites were identified: DQGnRTTPS, AYFnDSQR, GRDLnKSI, IKRnSTIPT and GILnVTAT. The effect of glycosylation at these sites on the properties of the HSP70 protein was evaluated. For this, similar glycosylation sites were identified using the already established 3D structure of homologous proteins (2QWL.pdb, 1CKR.pdb, 3CQX.pdb) and the structure of HSP70 fragments (2E8A.pdb, 2E88.pdb) (http: //www.ncbi. nlm.nih.gov). Most sites of possible glycosylation were important for the enzymatic function of HSP70. For example, glycosylation of DQGnRTTPS can screen the ATP binding site of HSP70.
Основным техническим результатом является получение функционально активного человеческого БТШ70 с мутациями в основных сайтах гликозилирования для наработки в молоке животных.The main technical result is the production of functionally active human HSP70 with mutations in the main glycosylation sites for production in animal milk.
Мутагенез потенциальных сайтов гликозилирования БТШ70Mutagenesis of potential HSP70 glycosylation sites
Общие принципы мутагенеза описаны в статье (Lei Young, Qihan Dong. Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 3 e11). Мы использовали два фланкирующих мутагенных праймера: 5ʹ-CCTCGAGCATATGGCGAAGGCAGCCGCTATCGGCATCGACCT-3ʹ (Р1), вносящих сайт Nde на N-конце, и мутацию гликозилирования. 5ʹ-GAGGGTCTGGTTCTGGTCCTACAATTGAGGAGGT-3ʹ (Р2), вносящих мутацию последовательности без изменения кодируемой ей аминокислоты на С-конце. Для элиминации сайтов гликозилирования были использованы следующие мутагенные праймеры:The general principles of mutagenesis are described in (Lei Young, Qihan Dong. Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 3 e11). We used two flanking mutagenic primers: 5ʹ-CCTCGAGCATATGGCGAAGGCAGCCGCTATCGGCATCGACCT-3ʹ (P1), introducing an Nde site at the N-terminus, and a glycosylation mutation. 5ʹ-GAGGGTCTGGTTCTGGTCCTACAATTGAGGAGGT-3ʹ (P2), introducing a mutation of the sequence without changing the encoded amino acid at the C-terminus. The following mutagenic primers were used to eliminate glycosylation sites:
{5ʹ-ACGACCAGGGTAACCGCGCCACCCCTAGCTACGTGGC-3ʹ M11{5ʹ-ACGACCAGGGTAACCGCGCCACCCCTAGCTACGTGGC-3ʹ M11
5ʹ-ACGACCAGGGTGACCGCACCACCCCTAGCTACGTGGC-3ʹ M125ʹ-ACGACCAGGGTGACCGCACCACCCCTAGCTACGTGGC-3ʹ M12
5ʹ-TCACCGTGCCTGCCTACTTCAACGACGCGCAGCGCCA-3ʹ M25ʹ-TCACCGTGCCTGCCTACTTCAACGACGCGCAGCGCCA-3ʹ M2
5ʹ-CCTGAACAAGGCCATCAATCCGGACGAGGCTGT-3ʹ M35ʹ-CCTGAACAAGGCCATCAATCCGGACGAGGCTGT-3ʹ M3
5ʹ-CTGCCCTGATTAAGAGGAATTCCGCCATCCCCAC-3ʹ M45ʹ-CTGCCCTGATTAAGAGGAATTCCGCCATCCCCAC-3ʹ M4
5ʹ-GATGCCAACGGAATTCTGAACGTCGCGGCCACGGA-3ʹ M5}5ʹ-GATGCCAACGGAATTCTGAACGTCGCGGCCACGGA-3ʹ M5}
Олигонуклеотиды были синтезированы на фирме SYNTOL. 1 nmol олигонуклеотида был фосфорилирован 2 ug Т4 полинуклеотидкиназы при 37о в буфере (12mM MgCl2, 20mM tric-Ac рН8, 1mM АТР). Матрицей для мутагенеза был БТШ человека, клонированный в плазмиду Bluescript. В реакцию мутагенеза брали 1ug/ml денатурированной матрицы, 0.4 uM праймера Р1, 0.4 uM фосфорилированного праймера Р2, 0.1 uM фосфорилированных М-праймеров (только одного праймера для единичной мутации или вместе с М11 (или 12) +М2+М3+М4+М5) в x1 буфере для Pfu (Sibenzyme), 0.1mM NADH, 0.1mM каждого dNTP. В смесь добавляли 10u of Pfu ДНК полимеразы (Sibenzyme) и 1ug Taq ДНК лигазы и проводили РЦР реакцию {94° 20ʹʹ; (93° 10ʹʹ, 65° 20ʹ) х10 циклов}.Oligonucleotides were synthesized by SYNTOL. 1 nmol oligonucleotide was phosphorylated with 2 ug T4 polynucleotide kinases at 37 ° in a buffer (12mM MgCl2, 20mM tric-Ac pH8, 1mM ATP). The mutagenesis matrix was human HSP cloned into the Bluescript plasmid. A 1ug / ml denatured matrix, 0.4 uM P1 primer, 0.4 uM phosphorylated P2 primer, 0.1 uM phosphorylated M primers (only one primer for a single mutation or together with M11 (or 12) + M2 + M3 + M4 + M5 were taken into the mutagenesis reaction ) in x1 buffer for Pfu (Sibenzyme), 0.1mM NADH, 0.1mM each dNTP. 10u of Pfu DNA polymerase (Sibenzyme) and 1ug Taq DNA ligase were added to the mixture, and a PCR reaction {94 ° 20ʹʹ; (93 ° 10ʹʹ, 65 ° 20ʹ) x10 cycles}.
Так для переклонирования последовательности дикого типа без замены аминокислоты использовали только праймеры Р1 и Р2; для создания мутации М5 были использованы праймеры P1, Р2 и М5. Для создания варианта M125 были использованы праймеры Р1+Р2+М12+М2+М3+М4+М5.So for cloning the wild-type sequence without amino acid substitution, only primers P1 and P2 were used; primers P1, P2, and M5 were used to create the M5 mutation. To create the M125 variant, primers P1 + P2 + M12 + M2 + M3 + M4 + M5 were used.
Смесь для мутагенеза разводили в пропорции 1:100 смесью для ПЦР: {x1 Pfu буфер, 5u/100ul Pfu (Sibenzyme), 0.25mM каждого dNTP+1ug/100ul фермента KlenTaq. ПЦР реакцию вели при: {94° 20ʹʹ; (93° 10ʹʹ, 72° 5ʹ) х15 циклов} с праймерами РА1 5ʹ-CCTCGAGCATATGGCGAAGGCAGCCGCTA-3 и РА2 5ʹ-GGGGATCCTATTAATCTACCTCCTCAATAGTAGGAC-3ʹThe mutagenesis mixture was diluted 1: 100 with a PCR mixture: {x1 Pfu buffer, 5u / 100ul Pfu (Sibenzyme), 0.25mM of each dNTP + 1ug / 100ul KlenTaq enzyme. PCR reaction was carried out at: {94 ° 20ʹʹ; (93 ° 10ʹʹ, 72 ° 5ʹ) x15 cycles} with primers PA1 5ʹ-CCTCGAGCATATGGCGAAGGCAGCCGCTA-3 and PA2 5ʹ-GGGGATCCTATTAATCTACCTCCTCAATAGTAGGAC-3ʹ
Праймеры P1, Р2, РА1 и РА2 были подобраны так, что РА1,2 амплифицировали только последовательности, мутированные праймерами Р1, Р2. Смесь Pfu и Taq позволяла провести удлинение цепи до следующего праймера. При температуре 65°С Pfu имеет очень низкую активность по замене цепи. Преимуществом данного метода мутагенеза является одновременное включение в матрицу всех мутаций с выходом около 80%.Primers P1, P2, PA1 and PA2 were selected so that PA1,2 amplified only sequences mutated by primers P1, P2. A mixture of Pfu and Taq allowed chain extension to the next primer. At a temperature of 65 ° C, Pfu has a very low chain replacement activity. The advantage of this method of mutagenesis is the simultaneous inclusion of all mutations in the matrix with a yield of about 80%.
Продукты ПЦР реакции были проанализированы в агарозном геле, реакционная смесь была разведена в 100 раз смесью для ПЦР реакции {x1 Pfu буфер, 5u/100ul Pfu (Sibenzyme), 0.25mM каждого dNTP+1ug/100ul фермента KlenTaq}. ПЦР реакцию вели при: (94° 20ʹʹ; 93° 10ʹʹ, 72° 5ʹ) x25 циклов} с праймерами РА1 5ʹ-CCTCGAGCATATGGCGAAGGCAGCCGCTA-3 и PS2 5ʹ-CCTTGTCGACCTCGACCTAATCTACCTCCTCAATGGTGGGGCCTGACCCAGACC-3ʹ.PCR reaction products were analyzed on an agarose gel, the reaction mixture was diluted 100 times with PCR reaction mixture {x1 Pfu buffer, 5u / 100ul Pfu (Sibenzyme), 0.25mM of each dNTP + 1ug / 100ul KlenTaq enzyme}. The PCR reaction was carried out at: (94 ° 20ʹʹ; 93 ° 10ʹʹ, 72 ° 5ʹ) x25 cycles} with primers PA1 5ʹ-CCTCGAGCATATGGCGAAGGCAGCCGCTA-3 and PS2 5ʹ-CCTTGTCGACCTCGACCTAATCTACCTCCTCAATGGTGGGCGGCG-3CG.
Продукты ПЦР реакции были проанализированы в агарозе, экстрагированы фенолом, осаждены и промыты этанолом. Далее была проведена рестрикция по сайтам Nde+Sal, клонирование мутированного фрагмента и его секвенирование.PCR reaction products were analyzed in agarose, extracted with phenol, precipitated and washed with ethanol. Next, restriction was performed at the Nde + Sal sites, cloning of the mutated fragment and its sequencing.
На Фиг. 1 представлена последовательность аминокислот человеческого БТШ70 и указаны сайты гликозилирования, которые были мутированы.In FIG. 1 shows the amino acid sequence of human HSP70 and indicates glycosylation sites that have been mutated.
Изобретение поясняется двумя примерами:The invention is illustrated by two examples:
Пример 1. Экспрессия в бактериях (E. coli) и характеристика протективных свойств «дикого» и мутантного человеческого БТШ70Example 1. Expression in bacteria (E. coli) and characterization of the protective properties of the "wild" and mutant human HSP70
Формы рекомбинантных человеческих БТШ70, включая модифицированные варианты, при экспрессии в бактериях содержат полигистидиновый «хвост» (6xHis), что позволяет выделять эти белки из биомассы с использованием никелевых колонок, как описано (Hoffmann, Roeder 1991). Специальные исследования показали, что 6xHis не влияет на функциональные свойства форм БТШ70. БТШ70 «дикого» типа, не содержащий 6xHis, выделяли на DEAE-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences, Cleveland, OH, USA) с последующей очисткой на АТФ-агарозе (Sigma, St Louis, MO, USA) (Welch and Feramisco, 1985).Forms of recombinant human HSP70, including modified variants, when expressed in bacteria, contain a polyhistidine tail (6xHis), which allows the isolation of these proteins from biomass using nickel columns as described (Hoffmann, Roeder 1991). Special studies have shown that 6xHis does not affect the functional properties of HSP70 forms. Wild-type HSP70 containing 6xHis was isolated on DEAE-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences, Cleveland, OH, USA) followed by purification on ATP agarose (Sigma, St Louis, MO, USA) (Welch and Feramisco, 1985 )
Электрофорез выделенных БТШ70 проводили согласно общепринятым методикам (Magi and Liberatori, 2004). Для визуализации БТШ70 использовали коммерческие моноклональные антитела SPA822 (EnzoLab) или поликлональные антитела, получены из ФГБУН «Институт биологии гена» Российской академии наук (ИБГ РАН).Electrophoresis of isolated HSP70 was performed according to generally accepted methods (Magi and Liberatori, 2004). For visualization of HSP70, commercial monoclonal antibodies SPA822 (EnzoLab) or polyclonal antibodies obtained from the Institute of Gene Biology of the Russian Academy of Sciences (IBG RAS) were used.
Различные in vitro тесты, использованные для характеристики рекомбинантных форм БТШ70, наработанных в бактериях.Various in vitro tests used to characterize the recombinant forms of HSP70 developed in bacteria.
Все эксперименты по анализу протективных свойств рекомбинантных форм БТШ70 проводили с препаратами высокой степени очистки (97-98%), выделенными из бактерий. В некоторых случаях в качестве контроля использовали человеческий БТШ70, экспрессированный в эукариотической экспрессионной системе (культура клеток Spodoptera), характеризующийся полным отсутствием бактериальных эндотоксинов.All experiments on the analysis of the protective properties of recombinant forms of HSP70 were performed with highly purified preparations (97-98%) isolated from bacteria. In some cases, human HSP70 expressed in a eukaryotic expression system (Spodoptera cell culture), characterized by a complete absence of bacterial endotoxins, was used as a control.
а. Способность связываться с субстратомbut. The ability to bind to the substrate
Шаперонную активность рекомбинантных форм БТШ70 анализировали модифицированным иммуноэнзиматическим методом (Cheetham et al 1994; Lazarev 2011). Суть метода заключается в том, что необратимо денатурированный белок (лактальбумин) наносится в 96-луночную плашку. После отмывки не связавшегося белка препараты БТШ70 в разных концентрациях наносятся в лунки, а после этого наносятся поликлональные антитела к БТШ70 (RSIII, Институт Цитологии (Lazarev et al., 2016). Антитела RSIII узнают БТШ70, связавшийся с денатурированным белком, и это позволяет количественно измерять уровень связывания (то есть шаперонные свойства БТШ70). В качестве вторых антител для визуализации комплексов использовали антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой (Jackson Immunochemicals, USA). Проведенные эксперименты показали, что по данному показателю модифицированная форма БТШ70, названная нами «вариант 128», не уступает «дикому типу» («вариант 135»). См. Фиг. 2 (А).The chaperone activity of the recombinant forms of HSP70 was analyzed by the modified immunoenzymatic method (Cheetham et al 1994; Lazarev 2011). The essence of the method is that irreversibly denatured protein (lactalbumin) is applied in a 96-well plate. After washing the unbound protein, HSP70 preparations at different concentrations are applied to the wells, and then polyclonal antibodies to HSP70 are applied (RSIII, Institute of Cytology (Lazarev et al., 2016). RSIII antibodies recognize HSP70 bound to the denatured protein, and this allows quantitative measure the level of binding (that is, the chaperone properties of HSP70) Antioxidant antibodies conjugated with peroxidase (Jackson Immunochemicals, USA) were used as the second antibodies to visualize the complexes. Yeh-lii modified form of Hsp70, named by us "
б. Способность восстанавливать укладку (рефолдинг) поврежденных белковb. The ability to restore folding (refolding) of damaged proteins
Для оценки способности препаратов БТШ70 восстанавливать нормальную укладку белков использовали методику, описанную Касселом с некоторыми модификациям (Cassel et al., 2012). Согласно этому протоколу люциферазу светлячка (Sigma-Aldrich, USA), инактивированную с помощью 8М мочевины, смешивали с экстрактом прогретых клеток эритробластомы K-562. После 100-кратного разведения в раствор добавляли БТШ70, креатин фосфат, креатин фосфокиназу, а также Glo-Bright раствор, представляющий собой субстрат для люциферазы (Promega, USA), и измеряли интенсивность люминесценции с помощью Charity multifunctional reader (Probanauchpribor, Russia). Проведенные опыты показали, что мутантный белок БТШ70 (вариант 128) по способности восстанавливать укладку не уступает белку «дикого типа». См. Фиг. 2 (Б).To assess the ability of HSP70 drugs to restore normal protein folding, the technique described by Kassel with some modifications was used (Cassel et al., 2012). According to this protocol, firefly luciferase (Sigma-Aldrich, USA) inactivated with 8M urea was mixed with K-562 erythroblastoma warm cell extract. After 100-fold dilution, HSP70, creatine phosphate, creatine phosphokinase, and Glo-Bright solution, which is a substrate for luciferase (Promega, USA), were added to the solution, and the luminescence intensity was measured using a Charity multifunctional reader (Probanauchpribor, Russia). The experiments showed that the HSP70 mutant protein (option 128) is not inferior to the “wild-type” protein in its ability to restore folding. See FIG. 2 (B).
в. Способность вытеснять эндогенный БТШ70 из клеткиat. The ability to displace endogenous HSP70 from the cell
В ряде лабораторий было показано, что при введении рекомбинантного БТШ70 в клетки, происходит вытеснение эндогенного БТШ70 на поверхность клетки (Mikhaylova et al., 2016). Для проверки способности полученных препаратов БТШ70 вытеснять эндогенный БТШ70 клетки крысиной глиобластомы инкубировали с препаратами БТШ70 в 96-луночной плашке и после инкубации добавляли антитела cmHsp70.1, которые селективно узнают TKD-пептид во внутриклеточном БТШ70, который вытесняется на поверхность клетки (Stangl et al., 2011; Shevtsov et al., 2014b). Интенсивность окраски (абсорбция), измеряемая с помощью ридера, пропорциональна количеству вытесненного эндогенного БТШ70. Опыты показали, что модифицированный БТШ70 не уступает исходному препарату БТШ70 по этому параметру (Фиг. 3А).In a number of laboratories, it was shown that, when recombinant HSP70 is introduced into cells, endogenous HSP70 is displaced onto the cell surface (Mikhaylova et al., 2016). To test the ability of the obtained HSP70 preparations to displace endogenous HSP70, rat glioblastoma cells were incubated with HSP70 preparations in a 96-well plate and, after incubation, cmHsp70.1 antibodies were added, which selectively recognize the TKD peptide in intracellular HSP70, which is displaced onto the cell surface (Stangl et al. , 2011; Shevtsov et al., 2014b). The color intensity (absorption), measured with a reader, is proportional to the amount of extruded endogenous HSP70. The experiments showed that the modified HSP70 is not inferior to the original HSP70 preparation in this parameter (Fig. 3A).
Способность экзогенного БТШ70 вытеснять из клеток эндогенный аналог изучали также с использованием конфокального микроскопа. Для этого рекомбинантный БТШ70 метили флуорохромом Alexa Fluor 555 (красный, Invitrogen, USA) и добавляли к клеткам человеческой эритробластомы K-562 cells (50μg/мл). Через 18 часов инкубации локализация меченого и суммарного БТШ70 была выявлена с помощью поликлональных антител RSIII, с использованием конфокальной микроскопии согласно известной методике (Shevtsov et al., 2014b). Эндогенный окрашенный БТШ70 виден на клеточной поверхности в виде зеленых точек (Фиг. 3Б). Опыты показали, что модифицированный рекомбинантный БТШ70 не уступает исходному препарату БТШ70 по этому параметру и эффективно вытесняет эндогенный аналог из клеток. См. Фиг. 3Б.The ability of exogenous HSP70 to displace the endogenous analogue from cells was also studied using a confocal microscope. For this, recombinant HSP70 was labeled with Alexa Fluor 555 fluorochrome (red, Invitrogen, USA) and K-562 cells (50 μg / ml) were added to human erythroblastoma cells. After 18 hours of incubation, the localization of labeled and total HSP70 was detected using RSIII polyclonal antibodies using confocal microscopy according to a known technique (Shevtsov et al., 2014b). Endogenous stained HSP70 is visible on the cell surface as green dots (Fig. 3B). The experiments showed that the modified recombinant HSP70 is not inferior to the original HSP70 preparation in this parameter and effectively displaces the endogenous analog from the cells. See FIG. 3B.
г. Способность понижать уровень АФК, индуцированный эндотоксинами бактерий.d. Ability to lower the level of ROS induced by bacterial endotoxins.
Ранее мы показали, что добавление рекомбинантного БТШ70 до введения бактериальных токсинов (ЛПС) достоверно снижает уровень активных форм кислорода (АФК) в клетках (Kustanova et al., 2006; Rozhkova et al., 2010). Мы провели сравнительный анализ действия различных препаратов рекомбинантного БТШ70, включая модифицированный БТШ70 с мутированными сайтами гликозилирования, на уровень АФК в клетках, индуцированный добавлением эндотоксина на модели человеческих нейтрофилов по описанной ранее методике (Rozhkova et al., 2010). Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что модифицированный БТШ70 («128») превосходит все остальные протестированные препараты БТШ70 по этому важнейшему параметру (Фиг. 4).We previously showed that the addition of recombinant HSP70 before the introduction of bacterial toxins (LPS) significantly reduces the level of reactive oxygen species (ROS) in cells (Kustanova et al., 2006; Rozhkova et al., 2010). We performed a comparative analysis of the effects of various recombinant HSP70 drugs, including modified HSP70 with mutated glycosylation sites, on the ROS level in cells induced by the addition of endotoxin in a model of human neutrophils using the previously described method (Rozhkova et al., 2010). The results obtained indicate that the modified HSP70 (“128”) is superior to all other tested HSP70 drugs in this most important parameter (Fig. 4).
Пример 2. Получение и анализ нативного и мутантного белка БТШ70 при экспрессии в молочной железе трансгенных мышейExample 2. Obtaining and analysis of the native and mutant HSP70 protein when expressed in the mammary gland of transgenic mice
Клонирование гена БТШ70 в плазмидный вектор для инъекций в животных.Cloning of the HSP70 gene into an animal plasmid vector for injection.
Плазмида БТШ70 была создана на основе коммерческого вектора pBC1 (Invitrogen) и геномной последовательности гена БТШ70 человека, причем в работе использовали, как БТШ70 «дикого типа», так и модифицированный вариант с мутированными сайтами гликозилирования (Фиг. 5). Клонирование гена мутантного БТШ70 в плазмидный вектор для инъекций в животных осуществлялось как и для интактного БТШ70, за исключением того, что в позициях 55, 172, 380, 437 и 507 были изменены аминокислотные остатки на аланин для мутирования соответствующих сайтов гликозилирования (Фиг. 1). Измерение наличия трансгена в животных проводили методом ПЦР.The HSP70 plasmid was created on the basis of the commercial vector pBC1 (Invitrogen) and the genomic sequence of the human HSP70 gene, and both wild-type HSP70 and a modified variant with mutated glycosylation sites were used in the work (Fig. 5). Cloning of the mutant HSP70 gene into a plasmid vector for injection in animals was carried out as for intact HSP70, except that amino acid residues were changed to alanine at positions 55, 172, 380, 437 and 507 to mutate the corresponding glycosylation sites (Fig. 1) . The transgene in animals was measured by PCR.
Молекулярно-биологические свойства используемой в работе плазмиды, содержащей ген человеческого БТШ70 - размер конструкции: 16912 п.н., размер векторной части - 5877 п.н., маркерный признак - устойчивость к ампициллину. Структурные элементы: тандемный повтор инсуляторов из бета-глобинового гена кур, бета-казеиновый промотор из генома коз, 5ʹ-нетранслируемая область содержит два первых экзона бета-казеинового гена, кодирующая область содержит геномную последовательность сигнального пептида лактоферрина и кодирующую область гена БТШ70 человека («дикий тип» или мутант), ген устойчивости к ампициллину, bla-промотор, ориджин репликации из плазмиды pBR322; сайт клонирования: NotI-SalI; размер кодируемого белка: 659 а.о. Устойчивость рекомбинантной плазмиды. Стандартные условия выращивания in vitro, условия культивирования - линия Е. coli XL-2, среда 2xYT, ампициллин 50 мкг/мл, 37°С, 18-20 часов. Хранение в течение 2 лет (срок наблюдения) в виде плазмидной ДНК при температуре минус 20°С.Molecular biological properties of the plasmid used in the work containing the human HSP70 gene - construction size: 16912 bp, vector part size - 5877 bp, marker sign - resistance to ampicillin. Structural elements: tandem repeat of insulators from the beta-globin gene of chickens, beta-casein promoter from the genome of goats, the 5ʹ-untranslated region contains the first two exons of the beta-casein gene, the coding region contains the genomic sequence of the lactoferrin signal peptide and the coding region of the human HSP70 gene (" wild type "or mutant), ampicillin resistance gene, bla promoter, origin of replication from plasmid pBR322; cloning site: NotI-SalI; encoded protein size: 659 a.o. The stability of the recombinant plasmid. Standard in vitro growth conditions, cultivation conditions — E. coli XL-2 line, 2xYT medium,
Аликвоту плазмидной ДНК извлекают из холодильника (температура хранения - минус 20,0±2,0°С) и проводят трансформацию культуры Е. coli методом электропорации. Проводят культивирование трансформированной культуры на среде 2xYT с добавлением 50 мкг/мл ампициллина. Продолжительность культивирования составляет от 18 до 20 часов при температуре +37,0±0,5°С.An aliquot of plasmid DNA is removed from the refrigerator (storage temperature minus 20.0 ± 2.0 ° C) and the E. coli culture is transformed by electroporation. The transformed culture is cultured on 2xYT medium with the addition of 50 μg / ml ampicillin. The cultivation duration is from 18 to 20 hours at a temperature of + 37.0 ± 0.5 ° C.
Плазмидная ДНК выделяется методом щелочного лизиса.Plasmid DNA is isolated by alkaline lysis.
Центрифугируют при ЦФ 4°С в течение 10-15ʹ, сливают среду; далее центрифугируют 4krpm в течение 1ʹ, удаляют остатки жидкости. Ресуспензируют в 10(5)ml раствора "I" (Глюкоза 50mM, Tris-HCl, рН 8.0 25mM, EDTA 10mM); + 1ml свежеприготовленного раствора лизоцима (10mg/ml в р-ре "I"). Далее выдерживают при нормальной температуре в течение 15ʹ, добавляют 20ml раствора "II" (NaOH 0.2N, SDS 1%), резко выливают, смешивают при 0°С в течение 5ʹ; добавляют 10ml холодного 10М AcONH4 (добавляют 5 ml пипеткой по каплям), смешивают. Выдерживают при 0°С в течение 5ʹ.Centrifuged at 4 ° С CF for 10-15ʹ, the medium is drained; then centrifuged 4krpm for 1ʹ, remove the remaining liquid. Resuspend in 10 (5) ml of “I” solution (Glucose 50mM, Tris-HCl, pH 8.0 25mM, EDTA 10mM); + 1ml freshly prepared lysozyme solution (10mg / ml in the "I" solution). Then they are kept at normal temperature for 15ʹ, add 20ml of “II” solution (NaOH 0.2N,
Центрифугируют 5krpm, при 4°С в течение 10ʹ; супернатант снимают, делят на 2 пробирки, добавляют к каждой по 12.5 мл изопропанола. Делают это на весах, чтобы пробирки имели равный вес; выдерживают при комнатной температуре в течение 10ʹ, далее центрифугируют 5krpm при 4°С в течение 10ʹ, сбросить супернатант. Центрифугируют при комнатной температуре в течение 3ʹ, отсасывают остатки жидкости.Centrifuge 5krpm, at 4 ° C for 10ʹ; the supernatant is removed, divided into 2 tubes, 12.5 ml of isopropanol are added to each. Do this on a scale so that the tubes have equal weight; kept at room temperature for 10 течение, then centrifuged 5krpm at 4 ° С for 10 С, discard the supernatant. It is centrifuged at room temperature for 3ʹ, the remaining liquid is sucked off.
Суспендируют осадок в 800μl 2 М AcONH4, объединяют в одной 2ml пробирке; выдерживают при комнатной температуре в течение 5ʹ и центрифугируют при комнатной температуре в течение 10ʹ. Супернатант переносят в пробирку с 800μl изопропанола; выдерживают при комнатной температуре в течение 5ʹ; центрифугируют при комнатной температуре в течение 5ʹ; далее споласкивают 70% EtOH; растворяют в 0.2-1ml Н2O.Suspend the pellet in 800μl 2 M AcONH 4 , combine in one 2ml tube; incubated at room temperature for 5ʹ and centrifuged at room temperature for 10ʹ. The supernatant is transferred to a test tube with 800 μl of isopropanol; incubated at room temperature for 5ʹ; centrifuged at room temperature for 5ʹ; rinse with 70% EtOH; dissolved in 0.2-1ml H 2 O.
Выделенные и очищенные препараты плазмидной ДНК оценивают электрофоретически в 0,8% агарозном геле. Концентрацию измеряли на спектрофотометре и флуорометре. Проводили рестриктное картирование отдельно по EcoRI, HindIII, NotI-SalI. Рестриктные фрагменты разделяют электрофоретически на 0,8% агарозном геле и сравнивают с эталонными картами, представленными на фиг. 2-4.Isolated and purified plasmid DNA preparations are evaluated electrophoretically on a 0.8% agarose gel. The concentration was measured on a spectrophotometer and fluorometer. Conducted restriction mapping separately for EcoRI, HindIII, NotI-SalI. Restriction fragments are separated electrophoretically on a 0.8% agarose gel and compared with the reference cards shown in FIG. 2-4.
Полученный препарат представляет собой очищенный препарат ДНК рекомбинантной плазмиды для экспрессии природного БТШ70, который может быть использован для подготовки фрагмента для микроинъекций.The resulting preparation is a purified DNA preparation of a recombinant plasmid for the expression of natural HSP70, which can be used to prepare a fragment for microinjection.
Создание и анализ трансгенных мышей.Creation and analysis of transgenic mice.
Создание трансгенных животных, получение потомства и анализ наличия трансгена проводили согласно ранее описанной методике (Goldman at al., 2008). Первичные трансгены были получены методом микроинъекций раствора ДНК в ТЕ-буфере (концентрация ДНК 5 нг/мкл) в мужской пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток мышей гибридной линии (CBAxC57BL/6)F1 с последующей пересадкой выживших микроинъецированных зигот псевдобеременным реципиентам.Creation of transgenic animals, procreation, and analysis of the presence of a transgene were performed according to the previously described method (Goldman at al., 2008). Primary transgenes were obtained by microinjection of a DNA solution in TE buffer (DNA concentration of 5 ng / μl) into the male pronucleus of fertilized egg cells of hybrid mice (CBAxC57BL / 6) F1, followed by transplantation of surviving microinjected zygotes to pseudopregnant recipients.
Яйцеклетки получали после индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам (CBAxC57BL/6) F1 весом 12-13 г вводили внутрибрюшинно 8 ед. ГСЖК (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, фирма "МОСАГРОГЕН"), а затем, через 46 ч, внутрибрюшинно вводили 8 ед. Хгч (хорионический гонадотропин человека. Московский эндокринный завод). После такой обработки самок подсаживали к самцам-производителям гибридной линии (CBAxC57BL/6)F1. Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки. Схема получения суперовуляции: 13.00 ч - ГСЖК, через 46 ч в 11.00 ч - Хгч. В 17.00 ч этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9.30 ч. Виварий освещали с 7.00 до 19.00 ч.Eggs were obtained after induction of superovulation. For this, immature females (CBAxC57BL / 6) F1 weighing 12-13 g were injected intraperitoneally 8 units. HFA (gonadotropin of serum of mares, company MOSAGROGEN), and then, after 46 hours, 8 units were intraperitoneally administered. HCG (human chorionic gonadotropin. Moscow endocrine plant). After this treatment, the females were planted with the male producers of the hybrid line (CBAxC57BL / 6) F1. The fact of mating was ascertained the next morning by the presence of a copulative plug. The scheme for obtaining superovulation: 13.00 h - HFA, after 46 h at 11.00 h - HCG. At 17.00 o'clock on the same day - replanting to male producers. The selection of donors was carried out the next day at 9.30 a.m. The Vivarium was lit from 7 a.m. to 7 p.m.
Самок с копулятивными пробками умерщвляли путем цервикальной дислокации и извлекали яйцеводы. Яйцеклетки вымывали из яйцеводов средой HEPES_KSOM с добавлением гиалуронидазы ("Sigma") под бинокуляром "Zeiss Stemi DV4" при увеличении 32х. Для вымывания использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром около 100 мкм, изготовленные на пуллере "Narishige РС-10" и микрокузнице "Narishige MF-900". Яйцеклетки культивировали в течение 2 ч (37°С, 5% CO2) в капле среды HEPES-KSOM или KSOM под минеральным маслом, затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом "Zeiss Axiovert 200M" при увеличении 400х-600х, используя микроманипуляторы "Narishige". Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер "Sutter instrument Со Р-97". После окончания микроинъекций выжившие клетки переносили в каплю среды KSOM или HEPES-KSOM под минеральное масло и культивировали в течение 1 ч для выявления жизнеспособных клеток. Реципиентов получали следующим образом. Половозрелых самок (CBAxC57BL/6) F1 весом не менее 24 г подсаживали к вазэктомированным самцам той же линии. Псевдобеременных реципиентов отбирали на следующее утро по наличию копулятивных пробок.Females with copulative plugs were killed by cervical dislocation and oviducts were removed. Eggs were washed from the oviducts with HEPES_KSOM medium supplemented with hyaluronidase (Sigma) under a Zeiss Stemi DV4 binocular at a magnification of 32x. For washing, we used glass capillaries with an inner diameter of about 100 μm, made on a Narishige PC-10 puller and a Narishige MF-900 micro forge. The eggs were cultured for 2 h (37 ° C, 5% CO 2 ) in a drop of HEPES-KSOM or KSOM medium under mineral oil, then placed in a microinjection chamber. Microinjections were performed in HEPES-KSOM medium under a Zeiss Axiovert 200M microscope at 400x-600x magnification using Narishige micromanipulators. For the manufacture of microinjection needles, the Sutter instrument Co P-97 puller was used. After the end of microinjections, the surviving cells were transferred into a drop of KSOM or HEPES-KSOM medium under mineral oil and cultured for 1 h to identify viable cells. Recipients were prepared as follows. Mature females (CBAxC57BL / 6) F1 weighing at least 24 g were planted with vasectomized males of the same line. Pseudopregnant recipients were selected the next morning by the presence of copulative plugs.
Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в левый яйцевод псевдобеременной самки. В зависимости от числа клеток, выживших после микроинъекции, одной псевдобеременной самке пересаживали от 10 до 20 зигот. Для обездвиживания животных во время операции использовали авертин, который представляет собой 2.5% раствор в воде раствора 1 г 2,2,2 трибромэтанола в 1 мл 2_метил_2_бутанола. Авертин вводили внутрибрюшинно из расчета 15 мкл на 1 г веса животного.Zygotes that survived after microinjection were transplanted into the left oviduct of a pseudopregnant female. Depending on the number of cells surviving after microinjection, 10 to 20 zygotes were transplanted to one pseudopregnant female. To immobilize animals during the operation, avertin was used, which is a 2.5% solution in water of a solution of 1 g of 2.2.2 tribromoethanol in 1 ml of 2_methyl_2_butanol. Avertin was administered intraperitoneally at the rate of 15 μl per 1 g of animal weight.
Получение потомства и анализ наличия трансгенаProgeny generation and transgene analysis
При отсутствии естественных родов на 21-й день после пересадки микроинъецированных яйцеклеток реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 14-21 сут после рождения у мышат, рожденных после микроинъекций, отрезали кусочек хвоста, выделяли из них ДНК и анализировали наличие трансгена методом ПЦР.In the absence of natural birth, on the 21st day after transplantation of microinjected ovules, the recipient was killed by cervical dislocation and a cesarean section was performed, after which the surviving cubs were placed on a pre-prepared nurse. 14-21 days after birth, a piece of tail was cut off in mice born after microinjections, DNA was extracted from them, and the presence of a transgene was analyzed by PCR.
ДНК выделяли по стандартному протоколу ("Molecular Cloning", USA). Фрагменты ДНК амплифицировали с помощью Taq-полимеразы ("GIBCO/BRL", USA) в буфере (с 2.5 мМ MgCl2), прилагаемом фирмой-производителем, в присутствии 0.2 мМ dNTP и 0.3 мкМ каждого праймера.DNA was isolated according to a standard protocol (Molecular Cloning, USA). DNA fragments were amplified using Taq polymerase (GIBCO / BRL, USA) in a buffer (with 2.5 mM MgCl2) supplied by the manufacturer in the presence of 0.2 mM dNTP and 0.3 μM of each primer.
Для амплификации гена использовали следующие праймеры:For amplification of the gene used the following primers:
1 - 5ʹcgcaactccaccatccccaccaag1 - 5ʹcgcaactccaccatccccaccaag
2 - 5ʹgccctctcgccctcgtacacctg2 - 5ʹgccctctcgccctcgtacacctg
С помощью ПЦР в режиме реального времени было оценено наличие трансгенов в молочной железе трансгенных мышей. Таким образом, нами были получены две линии трансгенных мышей, которые экспрессировали в молочной железе нативный (линия 1) и модифицированный (линия 2) человеческий БТШ70.Using real-time PCR, the presence of transgenes in the mammary gland of transgenic mice was evaluated. Thus, we obtained two lines of transgenic mice that expressed native (line 1) and modified (line 2) human HSP70 in the mammary gland.
Очистка препарата БТШ 70 из молока трансгенных мышейPurification of HSP 70 from transgenic mouse milk
Пробы молока у трансгенных мышей получали на 2-20 день после родов не чаще 2 раз за лактацию. Взятие молока проводится у наркотизированной внутрибрюшинной инъекцией раствора Avertin (0,25%) мыши из расчета 10 мкл/г, для увеличения молокоотдачи мыши внутрибрюшинно вводится окситоцин (10 ед./мл) из расчета 10 мкл/г. Молоко отбирается с помощью доильного аппарата, представляющего собой перистальтический насос, создающий разреженную атмосферу в пробирке для образцов.Milk samples from transgenic mice were obtained 2-20 days after birth no more than 2 times per lactation. Milk is taken from an anesthetized intraperitoneal injection of Avertin solution (0.25%) of the mouse at a rate of 10 μl / g, to increase the milk yield of the mouse, oxytocin (10 units / ml) is administered at a rate of 10 μl / g. Milk is collected using a milking machine, which is a peristaltic pump, creating a rarefied atmosphere in a test tube for samples.
Анализ свойств нативного и модифицированного БТШ70, полученного в молочной железе трансгенных мышей.Analysis of the properties of native and modified HSP70 obtained in the mammary gland of transgenic mice.
Далее было измерено примерное содержание БТШ70 (г/л) в молоке трансгенных мышей.). Молоко разбавляли 5 раз буфером состава 20 мМ NaH2PO4/300 мМ NaCl рН 8.0, после чего разделяли методом диск-электрофореза в 10% полиакриламидном геле. После разделения белки переносили на мембрану Hybond ECL и обрабатывали моноклональными антителами к БТШ70 человека. Белок узнавался антителами, но его электрофоретическая подвижность была меньше, чем у контрольного образца, что говорит о его посттрансляционной модификации (Фиг. 6).Next, the approximate content of HSP70 (g / l) in the milk of transgenic mice was measured.). Milk is diluted 5 times with buffer comprising 20 mM NaH 2 PO 4/300 mM NaCl pH 8.0, and then separated by disc electrophoresis in 10% polyacrylamide gel. After separation, the proteins were transferred onto a Hybond ECL membrane and treated with monoclonal antibodies to human HSP70. The protein was recognized by antibodies, but its electrophoretic mobility was less than that of the control sample, which indicates its post-translational modification (Fig. 6).
Несмотря на высокий уровень продукции и иммунологическую идентичность полученного препарата природному аналогу, биологических функций он не выполнял (не связывался с АТФ-колонкой, что, вероятно, объясняется его гликозилированием). Для проверки этого предположения мы выделили молоко из обеих линий мышей и исследовали его с помощью иммуноблотинга. На Фиг. 6 видно, что в молоке обеих линий мышей присутствует человеческий БТШ70, но в линии, где экспрессируется в молоке БТШ70 «дикого типа», молекулярная масса этого белка достоверно выше, чем в линии, экспрессирующей модифицированный БТШ70.Despite the high level of production and the immunological identity of the resulting preparation with a natural analogue, it did not perform biological functions (did not bind to the ATP column, which is probably due to its glycosylation). To verify this assumption, we isolated milk from both lines of mice and examined it using immunoblotting. In FIG. Figure 6 shows that human HSP70 is present in the milk of both mouse strains, but in the line where wild-type HSP70 is expressed, the molecular weight of this protein is significantly higher than in the line expressing the modified HSP70.
Более того, было показано, что модифицированный БТШ70 успешно выделяется на АТФ-агарозе, в отличие от БТШ70 «дикого типа». В этих опытах молоко разбавляли высокосолевым буфером Tris-HCl pH8.0/300mM NaCl в соотношении 1:10 (10 частей буфера на 1 часть молока), после чего центрифугировали 10 мин при ускорении не меньше 8000 g и отбрасывали жировую фракцию. К обезжиренному молоку добавляли АТФ-агарозу производства Sigma (соотношение молоко/смола зависит от теоретической емкости смолы) и инкубировали при температуре 4°С в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Затем молоко вместе со смолой наносили на 2-мл колонку производства Bio-Rad, пропускали жидкую фракцию, а оставшуюся на колонке смолу трижды промывали буфером Tris-HCl pH8.0/300mM NaCl (объем каждой промывки не менее трех объемов смолы). После промывки белок элюировали со смолы раствором 10 mM АТФ/10 mM MgCl2, приготовленном на буфере Tris-HCl pH8.0/300mM NaCl. Далее для очистки белка от АТФ к элюату добавляли ЭДТА до концентрации 20 mM и диализовали сначала против PBS/10 mM ЭДТА, затем дважды против PBS. В результате БТШ70 связывается с АТФ, иммобилизованным на колонке, после чего выделяется с чистотой не менее 90% (Фиг. 7).Moreover, it was shown that the modified HSP70 was successfully isolated on ATP agarose, in contrast to the wild-type HSP70. In these experiments, milk was diluted with Tris-HCl pH8.0 / 300mM NaCl high-salt buffer in a ratio of 1:10 (10 parts of the buffer per 1 part of milk), after which it was centrifuged for 10 min with an acceleration of at least 8000 g and the fat fraction was discarded. Sigma ATP agarose was added to skim milk (the milk / resin ratio depends on the theoretical capacity of the resin) and incubated at 4 ° C for 1 h with constant stirring. Then the milk together with the resin was applied to a 2 ml Bio-Rad column, the liquid fraction was passed, and the resin remaining on the column was washed three times with Tris-HCl buffer pH8.0 / 300mM NaCl (the volume of each washing was no less than three volumes of resin). After washing, the protein was eluted from the resin with a solution of 10 mM ATP / 10 mM MgCl 2 prepared in Tris-HCl buffer pH8.0 / 300mM NaCl. Then, to purify the protein from ATP, EDTA was added to the eluate to a concentration of 20 mM and dialyzed first against PBS / 10 mM EDTA, then twice against PBS. As a result, HSP70 binds to ATP immobilized on a column, after which it is released with a purity of at least 90% (Fig. 7).
Анализ биологической активности препарата БТШ70, выделенного из молока трансгенных мышейAnalysis of the biological activity of the HSP70 preparation isolated from the milk of transgenic mice
Для оценки шаперонных свойств модифицированного БТШ70, нарабатываемого в молоке трансгенных мышей, белок выделяли по описанной выше методике (АТФ-колонки) и исследовали по тем же in vitro тестам, что и препараты БТШ70, выделяемые из бактерий (см. Пример 1). Так мы изучали субстрат-связывание с помощью шаперонного теста, который представляет собой систему, с помощью которой определяется способность активной части молекул шаперона, в данном случае БТШ70, узнавать и связывать субстрат, денатурированный белок. Тест подробно описан в работе Лазарев и др., 2011. При сравнении с эталонным белком БТШ70 (r-Hu-Hsp70, HSPA1A, выделенным из биомассы Е. coli), хорошо видно, что аналог, выделенный из молока, не уступает эталонному белку по этому показателю (Фиг. 8А).To assess the chaperone properties of the modified HSP70 produced in the milk of transgenic mice, the protein was isolated according to the method described above (ATP columns) and tested using the same in vitro tests as HSP70 preparations isolated from bacteria (see Example 1). So we studied substrate binding using the chaperone test, which is a system that determines the ability of the active part of the chaperone molecules, in this case HSP70, to recognize and bind the substrate, a denatured protein. The test is described in detail in the work of Lazarev et al., 2011. When comparing with the HSP70 reference protein (r-Hu-Hsp70, HSPA1A isolated from E. coli biomass), it is clearly seen that the analog isolated from milk is not inferior to the reference protein in this indicator (Fig. 8A).
Другим информативным тестом для оценки протективных свойств рекомбинантного модифицированного БТШ70, нарабатываемого в молоке, был ЦТЛ тест. ЦТЛ (CTL) классический тест цитотоксических лимфоцитов, в котором последние должны узнавать и убивать опухолевые клетки. Тест является одним из ключевых в иммунологии при определении активности клеток врожденного и приобретенного иммунитета. В нашем случае в качестве ЦТЛ служили неактивированные спленоциты, выделенные из мышей С3Н в соответствии со стандартным протоколом; по данным проточной цитометрии 2-7% от результирующей популяции составляют натуральные киллеры. Мишенью для них служат клетки эритробластомы человека К-562, обработанные в течение 18 час Hsp70 (50 мкг/мл). После совместной инкубации в соотношении эффекторы : опухолевые клетки 50:1 и 100:1 клетки помещаются в лунки 96-луночной платы, где после введения необходимых составляющих определяется активность ЛДГ, вышедшего в среду из погибающих клеток с помощью тест-системы CytoTox-96 (Promega). Тест подробно описан в работах Shevtsov et al., 2014, Oncotarget, Int J Cancer. Анализ результатов данного теста показал, что БТШ70, нарабатываемый в молоке, не только не уступает по данному показателю аналогичному белку, экспрессированному и выделенному из бактерий, но даже превосходит его (Фиг. 8Б).Another informative test to evaluate the protective properties of the recombinant modified HSP70 produced in milk was the CTL test. CTL (CTL) is a classic cytotoxic lymphocyte test in which the latter must recognize and kill tumor cells. The test is one of the key in immunology in determining the activity of cells of innate and acquired immunity. In our case, inactivated splenocytes isolated from C3H mice in accordance with the standard protocol served as CTLs; according to flow cytometry, 2–7% of the resulting population are natural killers. The target for them are human erythroblastoma cells K-562, treated for 18 hours with Hsp70 (50 μg / ml). After joint incubation in the ratio of effectors: tumor cells 50: 1 and 100: 1, the cells are placed in the wells of the 96-well plate, where after the introduction of the necessary components, the activity of LDH released into the environment from the dying cells using the CytoTox-96 test system (Promega ) The test is described in detail in Shevtsov et al., 2014, Oncotarget, Int J Cancer. Analysis of the results of this test showed that HSP70, produced in milk, not only is not inferior in this indicator to a similar protein expressed and isolated from bacteria, but even surpasses it (Fig. 8B).
Подписи под чертежамиCaptions for drawings
Фиг. 1FIG. one
Сравнение последовательностей БТШ70-135 (последовательность дикого типа с добавлением полигистидиновой метки), БТШ70-128 (с 5-ю заменами в составе сайтов гликозилирования) и БТШ70, экспрессируемого в молоке (с 5-ю заменами в составе сайтов гликозилирования и добавлением лидерной последовательности, обеспечивающей секрецию белка).Comparison of the HSP70-135 sequences (wild-type sequence with the addition of a polyhistidine tag), HSP70-128 (with 5 substitutions in the glycosylation sites) and HSP70 expressed in milk (with 5 substitutions in the glycosylation sites and the addition of a leader sequence, providing protein secretion).
Фиг. 2FIG. 2
Шаперонная активность различных препаратов БТШ70. А - субстрат-связывающая активность БТШ70 в различных концентрациях. В - способность восстанавливать нативную конформацию фермента люциферазы. "Wt": рекомбинантный БТШ70 дикого типа (не содержащий модификаций аминокислотной последовательности); "135": БТШ70, меченный шестью остатками гистидина; "128": БТШ70 с модифицированной аминокислотной последовательностью (мутированными сайтами гликозилирования).Chaperone activity of various HSP70 drugs. A - substrate-binding activity of HSP70 in various concentrations. B is the ability to restore the native conformation of the luciferase enzyme. "Wt": recombinant wild-type HSP70 (not containing amino acid sequence modifications); "135": HSP70 labeled with six histidine residues; "128": HSP70 with a modified amino acid sequence (mutated glycosylation sites).
Фиг. 3FIG. 3
Вытеснение эндогенного БТШ70. А - результаты по инкубации клеток глиобластомы с различными пробами БТШ70 и антителами, узнающими внутриклеточный БТШ70, вытесняемый на поверхность клеток. Использовались две концентрации проб экзогенного БТШ70 (50 и 125 мкг/мл). В - результаты конфокальной микроскопии клеток эритробластомы, инкубированных с пробами БТШ70, конъюгированного с Alexa-555 и поликлональными антителами, узнающими БТШ70 (зеленое окрашивание) (Shevtsov et al. 2014).Extrusion of endogenous HSP70. A - incubation results of glioblastoma cells with various HSP70 samples and antibodies recognizing intracellular HSP70 displaced onto the cell surface. Two concentrations of exogenous HSP70 samples (50 and 125 μg / ml) were used. C - results of confocal microscopy of erythroblastoma cells incubated with HSP70 samples conjugated to Alexa-555 and polyclonal antibodies recognizing HSP70 (green staining) (Shevtsov et al. 2014).
Все пробы БТШ70 (но не БСА) вытесняют внутриклеточный БТШ70 на поверхность клеток (зеленое окрашивание). Wt - БТШ70 дикого типа; 128 - модифицированный БТШ70 с мутированными сайтами гликозилирования; 135 - БТШ70 дикого типа, меченый шестью остатками гистидина.All HSP70 samples (but not BSA) displace intracellular HSP70 onto the cell surface (green staining). Wt — HSP70 wild-type; 128 - modified HSP70 with mutated glycosylation sites; 135 - Wild-type HSP70 labeled with six histidine residues.
Фиг. 4FIG. four
Влияние препаратов БТШ70 на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами под действием ЛПС. К - контроль (без добавления БТШ70); 128 - модифицированный БТШ70; 135 - БТШ70, меченный гистидином; BTШ70S - белок, свободный от ЛПС, выделенный из клеток Spodoptera.The effect of HSP70 drugs on the production of reactive oxygen species by neutrophils under the influence of LPS. K - control (without adding HSP70); 128 - modified HSP70; 135 - HSP70 tagged with histidine; BTSh70S is an LPS-free protein isolated from Spodoptera cells.
Фиг. 5FIG. 5
Карта экспрессионной конструкции для получения БТШ70 в молоке. Карта конструкции (рБТШ70), содержащей ген нативного БТШ70 (Hsp70), для инъекции в животных. Структурные элементы конструкции: бета-казеиновый промотор из генома козы, сигнальная последовательность лактоферрина, тандемный повтор инсуляторов из бета-глобинового гена кур, ТАТА-бокс, ген устойчивости к ампициллину, ориджин репликации из плазмиды pBR322, кДНК копия человеческого гена БТШ70 (получена от Проф. Моримото GenBank Accession No M11717), аминокислотная последовательность соответствующего белка SwissProt Р08107.Map of the expression construct for obtaining HSP70 in milk. Design map (rBSH70) containing the native HSP70 gene (Hsp70) for injection into animals. Structural structural elements: beta-casein promoter from the goat genome, lactoferrin signal sequence, tandem repeat of insulators from the beta-globin chicken gene, TATA box, ampicillin resistance gene, replication origin from plasmid pBR322, cDNA copy of the human HSP70 gene (obtained from Prof. HSP70 Morimoto GenBank Accession No. M11717), the amino acid sequence of the corresponding SwissProt P08107 protein.
Фиг. 6FIG. 6
БТШ70, выделенный из молока трансгенных мышей. 1 - БТШ70 дикого типа, экспрессируемый в клетках Е. coli; 2, 3 - БТШ70 дикого типа, выделенный из молока трансгенных мышей; 4 - молоко нетрансгенной мыши (отрицательный контроль); 5, 6 - модифицированный БТШ70 (128), экспрессируемый в молоке мышей.HSP70 isolated from the milk of transgenic mice. 1 - wild-type HSP70 expressed in E. coli cells; 2, 3 - wild-type HSP70 isolated from the milk of transgenic mice; 4 - milk of a non-transgenic mouse (negative control); 5, 6 — modified HSP70 (128) expressed in mouse milk.
Фиг. 7FIG. 7
Очистка мутантного БТШ70 из молока с помощью АТФ-колонки. А. 1 - молоко; 2 - фракция «проскока»; 3 - смола после элюции БТШ70; 4 - элюированный БТШ70 (1-4 - молоко трансгенных мышей). 5 - молоко; 6 - фракция «проскока»; 7 - смола после элюции БТШ70; 8 - элюат (5-8 - молоко нетрансгенных мышей) В. Вестерн-гибридизация геля, представленного на рис. А, с антителами к БТШ70.Purification of the mutant HSP70 from milk using an ATP column. A. 1 - milk; 2 - fraction "slip"; 3 - resin after elution HSP70; 4 - eluted HSP70 (1-4 - milk of transgenic mice). 5 - milk; 6 - fraction "slip"; 7 - resin after elution HSP70; 8 - eluate (5-8 - milk of non-transgenic mice) B. Western hybridization of the gel shown in Fig. A, with antibodies to HSP70.
Фиг. 8FIG. 8
Активность проб БТШ70, выделенного из клеток Е. coli в сравнении с БТШ70, выделенным из молока трансгенных мышей. А - субстрат-связывающая активность; В - цитотоксичность.The activity of HSP70 samples isolated from E. coli cells compared to HSP70 samples isolated from milk of transgenic mice. A is a substrate binding activity; B - cytotoxicity.
Список литературыBibliography
1. Hartl FU, Bracher A, Hayer-Hartl M. 2011. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475: 324 – 32.1. Hartl FU, Bracher A, Hayer-Hartl M. 2011. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475: 324 - 32.
2. Srivastava P. 2002. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses. Annu Rev Immunol. 20: 395-425.2. Srivastava P. 2002. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses. Annu Rev Immunol. 20: 395-425.
3. Guzhova I, Kislyakova K, Moskaliova O, Fridlanskaya I, Tytell M, Cheetham M, Margulis B. 2001. In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stresstolerance. Brain Res. 914: 66-73.3. Guzhova I, Kislyakova K, Moskaliova O, Fridlanskaya I, Tytell M, Cheetham M, Margulis B. 2001. In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stresstolerance. Brain Res. 914: 66-73.
4. Kakimura J, Kitamura Y, Takata K, Umeki M, Suzuki S, Shibagaki K, Taniguchi T, Nomura Y, Gebicke-Haerter PJ, Smith MA, Perry G, Shimohama S. 2002. Microglial activation and amyloid-beta clearance induced by exogenous heat-shock proteins. FASEB J. 16: 601 – 3.4. Kakimura J, Kitamura Y, Takata K, Umeki M, Suzuki S, Shibagaki K, Taniguchi T, Nomura Y, Gebicke-Haerter PJ, Smith MA, Perry G, Shimohama S. 2002. Microglial activation and amyloid-beta clearance by exogenous heat-shock proteins. FASEB J. 16: 601-3.
5. Robinson MB, Tidwell JL, Gould T, Taylor AR, Newbern JM, Graves J, Tytell M, Milligan CE. 2005. Extracellular heat shock protein 70: critical component for motoneuron survival. J. Neurosci. 25: 9735-45.5. Robinson MB, Tidwell JL, Gould T, Taylor AR, Newbern JM, Graves J, Tytell M, Milligan CE. 2005. Extracellular heat shock protein 70: critical component for motoneuron survival. J. Neurosci. 25: 9735-45.
6. Kustanova G, Murashev A, Karpov V, Margulis B, Guzhova IV, Prokhorenko IR, Grachev SV, 
7. Rozhkova E., M. Yurinskaya, O. Zatsepina, D. Garbuz, Arkady Murashev, Vladimir Ostrov, Boris Margulis, M. Evgenev, M. Vinokurov. 2010. Exogenous mammalian extracellular HSP70 reduces endotoxin manifestations at the cellular and organism levels. Annals of the New-York Academy of Sciences. 1197: 94 – 107.7. Rozhkova E., M. Yurinskaya, O. Zatsepina, D. Garbuz, Arkady Murashev, Vladimir Ostrov, Boris Margulis, M. Evgenev, M. Vinokurov. 2010. Exogenous mammalian extracellular HSP70 reduces endotoxin manifestations at the cellular and organism levels. Annals of the New-York Academy of Sciences. 1197: 94 - 107.
8. Vinokurov M, Ostrov V, Yurinskaya M, Garbuz D, Murashev A, Antonova O,
9. Welch WJ, Feramisco JR. 1985. Rapid purification of mammalian 70,000-dalton stress proteins: affinity of the proteins for nucleotides. Mol. Cell. Biol. 5:1229 – 37.9. Welch WJ, Feramisco JR. 1985. Rapid purification of mammalian 70,000-dalton stress proteins: affinity of the proteins for nucleotides. Mol. Cell. Biol. 5: 1229 - 37.
10. Hoffmann A, Roeder RG. Purification of his-tagged proteins in non-denaturing conditions suggests a convenient method for protein interaction studies. Nucleic Acids Res. 1991 Nov 25;19(22):6337-8.10. Hoffmann A, Roeder RG. Purification of his-tagged proteins in non-denational conditions suggests a convenient method for protein interaction studies. Nucleic Acids Res. 1991
11. Lazarev VF, Nikotina AD, Mikhaylova ER, Nudler E, Polonik SG, Guzhova IV, Margulis BA. Hsp70 chaperone rescues C6 rat glioblastoma cells from oxidative stress by sequestration of aggregating GAPDH. Biochem Biophys Res Commun. 2016 Feb 12;470(3):766-71.11. Lazarev VF, Nikotina AD, Mikhaylova ER, Nudler E, Polonik SG, Guzhova IV, Margulis BA. Hsp70 chaperone rescues C6 rat glioblastoma cells from oxidative stress by sequestration of aggregating GAPDH. Biochem Biophys Res Commun. 2016 Feb 12; 470 (3): 766-71.
12. Lazarev VF, Onokhin KV, Antimonova OI, Polonik SG, Guzhova IV, Margulis BA. Kinetics of chaperone activity of proteins Hsp70 and Hdj1 in human leukemia u-937 cells after preconditioning with thermal shock or compound u-133. Biochemistry (Mosc). 2011 May; 76(5):590-5.12. Lazarev VF, Onokhin KV, Antimonova OI, Polonik SG, Guzhova IV, Margulis BA. Kinetics of chaperone activity of proteins Hsp70 and Hdj1 in human leukemia u-937 cells after preconditioning with thermal shock or compound u-133. Biochemistry (Mosc). 2011 May; 76 (5): 590-5.
13. Cheetham ME, Jackson AP, Anderton ВН. Regulation of 70-kDa heat-shock-protein ATPase activity and substrate binding by human DnaJ-like proteins, HSJ1a and HSJ1b. Eur J Biochem. 1994 Nov 15; 226(1):99-107.13. Cheetham ME, Jackson AP, Anderton BH. Regulation of 70-kDa heat-shock-protein ATPase activity and substrate binding by human DnaJ-like proteins, HSJ1a and HSJ1b. Eur J Biochem. 1994
14. Mikhaylova ER, Lazarev VF, Nikotina AD, Margulis BA, Guzhova IV. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase augments the intercellular transmission and toxicity of polyglutamine aggregates in a cell model of Huntington disease. J Neurochem. 2016 Mar; 136(5): 1052-63.14. Mikhaylova ER, Lazarev VF, Nikotina AD, Margulis BA, Guzhova IV. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase augments the intercellular transmission and toxicity of polyglutamine aggregates in a cell model of Huntington disease. J Neurochem. 2016 Mar; 136 (5): 1052-63.
15. Stangl S, Gehrmann M, Riegger J, Kuhs K, Riederer I, Sievert W, Hube K, Mocikat R, Dressel R, Kremmer E, Pockley AG, Friedrich L, Vigh L, Skerra A, Multhoff G. Targeting membrane heat-shock protein 70 (Hsp70) on tumors by cmHsp70. 1 antibody. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108:733-738.15. Stangl S, Gehrmann M, Riegger J, Kuhs K, Riederer I, Sievert W, Hube K, Mocikat R, Dressel R, Kremmer E, Pockley AG, Friedrich L, Vigh L, Skerra A, Multhoff G. Targeting membrane heat -shock protein 70 (Hsp70) on tumors by cmHsp70. 1 antibody. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108: 733-738.
16. Shevtsov MA, Pozdnyakov AV, Mikhrina AL, Yakovleva LY, Nikolaev BP, Dobrodumov AV, Komarova EY, Meshalkina DA, Ischenko AM, Pitkin E, Guzhova IV, Margulis BA. 2014 (b) Exogenously delivered heat shock protein 70 displaces its endogenous analogue and sensitizes cancer cells to lymphocytes-mediated cytotoxicity. Int J Cancer. Nov 1; 135(9):2118-28. doi: 10.1002/ijc.28858.16. Shevtsov MA, Pozdnyakov AV, Mikhrina AL, Yakovleva LY, Nikolaev BP, Dobrodumov AV, Komarova EY, Meshalkina DA, Ischenko AM, Pitkin E, Guzhova IV, Margulis BA. 2014 (b) Exogenously delivered heat shock protein 70 displaces its endogenous analogue and sensitizes cancer cells to lymphocytes-mediated cytotoxicity. Int J Cancer.
17. Cassel JA, Ilyin S, McDonnell ME, Reitz AB. Novel inhibitors of heat shock protein Hsp70-mediated luciferase refolding that bind to DnaJ. Bioorg Med Chem. 2012 Jun 1; 20(11):3609-14. doi: 10.1016/j.bmc.2012.03.067.17. Cassel JA, Ilyin S, McDonnell ME, Reitz AB. Novel inhibitors of heat shock protein Hsp70-mediated luciferase refolding that bind to DnaJ. Bioorg Med Chem. 2012
Генетическая конструкция для экспрессии функционально активного человеческого стресс-белка (БТШ70) с мутированными сайтами гликозилирования для наработки в эукариотических экспрессионных системахGenetic construct for the expression of a functionally active human stress protein (HSP70) with mutated glycosylation sites for production in eukaryotic expression systems
Перечень последовательностейSequence listing
Последовательность мутированного БТШ70, синтезируемого в молоке трансгенных мышей (сайты мутации выделены)The sequence of mutated HSP70 synthesized in the milk of transgenic mice (mutation sites are highlighted)
MKLVFLVLLFLGALGLCLA MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQG D RTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDAKRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPVTNAVITVPAYFND A QRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGRDLNK A INPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNS A IPTKQTQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNV A ATDKSTGKANKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKKVLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEVD MKLVFLVLLFLGALGLCLA MAKAAAIGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQG D RTTPSYVAFTDTERLIGDAAKNQVALNPQNTVFDAKRLIGRKFGDPVVQSDMKHWPFQVINDGDKPKVQVSYKGETKAFYPEEISSMVLTKMKEIAEAYLGYPVTNAVITVPAYFND A QRQATKDAGVIAGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDRTGKGERNVLIFDLGGGTFDVSILTIDDGIFEVKATAGDTHLGGEDFDNRLVNHFVEEFKRKHKKDISQNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQASLEIDSLFEGIDFYTSITRARFEELCSDLFRSTLEPVEKALRDAKLDKAQIHDLVLVGGSTRIPKVQKLLQDFFNGRDLNK A INPDEAVAYGAAVQAAILMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLGLETAGGVMTALIKRNS A IPTKQTQIFTTYSDNQPGVLIQVYEGERAMTKDNNLLGRFELSGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNV A ATDKSTGKANKITITNDKGRLSKEEIERMVQEAEKYKAEDEVQRERVSAKNALESYAFNMKSAVEDEGLKGKISEADKKKVLDKCQEVISWLDANTLAEKDEFEHKRKELEQVCNPIISGLYQGAGGPGPGGFGAQGPKGGSGSGPTIEEVD
SEQ ID:1SEQ ID: 1
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016125944A RU2647570C1 (en) | 2016-06-29 | 2016-06-29 | Genetic design for expression of the functionally-active human stress-protein (hps70) with mutated glycosilation sites for working in eucariotic expression systems |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016125944A RU2647570C1 (en) | 2016-06-29 | 2016-06-29 | Genetic design for expression of the functionally-active human stress-protein (hps70) with mutated glycosilation sites for working in eucariotic expression systems |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2647570C1 true RU2647570C1 (en) | 2018-03-16 |
Family
ID=61629547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016125944A RU2647570C1 (en) | 2016-06-29 | 2016-06-29 | Genetic design for expression of the functionally-active human stress-protein (hps70) with mutated glycosilation sites for working in eucariotic expression systems |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2647570C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050260746A1 (en) * | 2002-05-06 | 2005-11-24 | Animal Technology Institute | Transgenic pig containing heat shock protein 70 transgene |
| EA010200B1 (en) * | 2002-07-01 | 2008-06-30 | Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк. | Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs |
| RU2564120C2 (en) * | 2013-07-10 | 2015-09-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | STRAIN OF Escherichia coli BACTERIA - PRODUCENT OF HEAT SHOCK PROTEIN 70 AND METHOD FOR OBTAINING PREPARATION OF HUMAN HEAT SHOCK PROTEIN |
-
2016
- 2016-06-29 RU RU2016125944A patent/RU2647570C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050260746A1 (en) * | 2002-05-06 | 2005-11-24 | Animal Technology Institute | Transgenic pig containing heat shock protein 70 transgene |
| EA010200B1 (en) * | 2002-07-01 | 2008-06-30 | Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк. | Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs |
| RU2564120C2 (en) * | 2013-07-10 | 2015-09-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | STRAIN OF Escherichia coli BACTERIA - PRODUCENT OF HEAT SHOCK PROTEIN 70 AND METHOD FOR OBTAINING PREPARATION OF HUMAN HEAT SHOCK PROTEIN |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "pBC1 Milk Expression Vector Kit For the Expression of Recombinant Proteins in the Milk of Transgenic Mice", Catalog no. K270-01, Version E, Invitrogen, 08.09.2010, найдено [03.03.2017] в сети Интернет по адресу: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pbc1_man.pdf. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Van Kaert et al. | Altered peptidase and viral-specific T cell response in LMP2 mutant mice | |
| WO2018227755A1 (en) | Base editing system and method for specifically repairing hbb gene mutations of humans, reagent kit, and applications thereof | |
| WO2017101221A1 (en) | Method for producing recombinant human fibroblast growth factor-17 | |
| Gurskiy et al. | The development of modified human Hsp70 (HSPA1A) and its production in the milk of transgenic mice | |
| US20090239219A1 (en) | Telomerase expression repressor proteins and methods of using the same | |
| KR20150091499A (en) | Method for recombinant production of horseshoe crab Factor C protein in protozoa | |
| WO2022247873A1 (en) | Engineered cas12i nuclease, effector protein and use thereof | |
| US7795416B2 (en) | Telomerase expression repressor proteins and methods of using the same | |
| Min et al. | Generation of antiviral transgenic chicken using spermatogonial stem cell transfected in vivo | |
| WO2016168763A1 (en) | Mitochondrial genome editing | |
| RU2647570C1 (en) | Genetic design for expression of the functionally-active human stress-protein (hps70) with mutated glycosilation sites for working in eucariotic expression systems | |
| CN110250108B (en) | RPRM gene knockout mouse model and construction method and application thereof | |
| US20090156467A1 (en) | Thymic stromal lymphpoietin promoter and use therefor | |
| Miao et al. | Production of transgenic mice carrying the Thanatin gene by intratesticular injection | |
| Wen et al. | The GT1-TPS structural domain protein from haemonchus contortus could be suppressive antigen of goat PBMCs | |
| WO2008110356A2 (en) | Protein pi 16 secreted from the heart and uses thereof | |
| RU2644663C2 (en) | Genetic structure rbct70 for expression of the main human stress protein in milk of transgenic animals | |
| JP7222075B2 (en) | Complement factor H gene knockout rats as a model of C3 glomerulopathy | |
| CN113501885B (en) | Chimeric disease-resistant gene and related biological material and application thereof | |
| CZ309487B6 (en) | Method of preparing barley plants producing antimicrobial peptides | |
| WO2023138617A1 (en) | Engineered casx nuclease, effector protein and use thereof | |
| Yang et al. | Identification and characterization of apoptosis-associated speck-like protein gene of Micropterus salmoides | |
| Sainova et al. | Production of cells with activated immunogenic properties from hematopoietic and non-hematopoietic progenitors by activation specific protective pathways | |
| WO2021129766A1 (en) | Il-15 humanized mouse model and use thereof | |
| JP2019532620A (en) | Methods and compositions related to improved human erythrocyte survival in genetically modified immunodeficient non-human animals |