RU2646446C1 - Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation - Google Patents
Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646446C1 RU2646446C1 RU2016121897A RU2016121897A RU2646446C1 RU 2646446 C1 RU2646446 C1 RU 2646446C1 RU 2016121897 A RU2016121897 A RU 2016121897A RU 2016121897 A RU2016121897 A RU 2016121897A RU 2646446 C1 RU2646446 C1 RU 2646446C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- usa
- medium
- days
- neuronal
- peprotech
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к фармакологии. Изобретение позволяет проводить оценку наличия нейропротекторных свойств у соединений, представляющих фармакологический интерес.The invention relates to pharmacology. The invention allows the assessment of the presence of neuroprotective properties in compounds of pharmacological interest.
Одной из актуальных проблем современной фармакологии и медицины является создание эффективных и безопасных лекарственных препаратов, направленных на лечение тех или иных заболеваний. Для их создания необходимы адекватные, высокопроизводительные и воспроизводимые, а главное относительно дешевые технологии скрининга потенциальных лекарственных соединений. Разработка технологии репрограммирования соматических клеток и получения индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток млекопитающих, включая человека, открыла новые перспективы в трансплантологии и изучении молекулярных и клеточных основ тяжелых болезней человека in vitro [1, 2]. Не случайно, что именно за эти работы («за открытие возможности репрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные») японскому ученому Синья Яманака была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине за 2012 г. Развитие технологии репрограммирования соматических клеток человека в ИПС клетки открывает новые возможности для создания моделей ряда тяжелых патологий человека, в том числе нейродегенеративных, а также тест-систем, позволяющих проводить масштабный скрининг и выяснять свойства лекарственных средств, направленных на лечение конкретных заболеваний in vitro, учитывая при этом индивидуальные особенности пациента [3, 4]. Тот факт, что технология репрограммирования позволяет получать ИПС клетки из индивидуальных дифференцированных соматических клеток больных и здоровых пациентов, дает ей существенные преимущества перед технологией эмбриональных стволовых клеток, что, в свою очередь, открывает большие перспективы в развитии персонализированной медицины [5, 6]. Развитие такой технологии позволит существенным образом сократить эксперименты по тестированию перспективных для фармакологии соединений на клетках животных, проводя их сразу на клетках человека. Возможность дифференцировки ИПС клеток в кардиомиоциты, гепатоциты, фибробласты и нейроны позволит проводить прицельный доклинический скрининг соединений на кардиопротекторную, гепатопротекторную и нейропротекторную активность in vitro [7, 8].One of the urgent problems of modern pharmacology and medicine is the creation of effective and safe drugs aimed at the treatment of certain diseases. Their creation requires adequate, high-performance and reproducible, and most importantly relatively cheap screening technologies for potential drug compounds. The development of technology for the reprogramming of somatic cells and the production of induced pluripotent stem (IPA) mammalian cells, including humans, has opened up new prospects in transplantology and the study of molecular and cellular foundations of serious human diseases in vitro [1, 2]. It is no coincidence that it is precisely for these works (“for opening the possibility of reprogramming differentiated cells into pluripotent cells”) that the Japanese scientist Signa Yamanaka was awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine for 2012. The development of the technology for reprogramming human somatic cells in IPS cells opens up new possibilities for creating models of a number of severe human pathologies, including neurodegenerative ones, as well as test systems that allow for large-scale screening and ascertain the properties of drugs, patients for the treatment of specific diseases in vitro, taking into account the individual characteristics of the patient [3, 4]. The fact that the technology of reprogramming allows one to obtain IPA cells from individual differentiated somatic cells of patients and healthy patients gives it significant advantages over the technology of embryonic stem cells, which, in turn, opens up great prospects in the development of personalized medicine [5, 6]. The development of this technology will significantly reduce the experiments on testing compounds that are promising for pharmacology on animal cells, conducting them immediately on human cells. The possibility of differentiating IPS cells into cardiomyocytes, hepatocytes, fibroblasts and neurons will allow for preclinical targeted screening of compounds for cardioprotective, hepatoprotective and neuroprotective activity in vitro [7, 8].
Известны первичные культуры нервных и глиальных клеток, полученных из мозга крысы, которые используются для скрининга соединений на наличие нейропротекторной активности [9]. При этом результаты, полученные на животных моделях, не всегда воспроизводятся на человеке. С другой стороны, невозможно получать нервные клетки из мозга взрослого человека в достаточных количествах для проведения скрининга фармакологических соединений. И, к тому же, нейроны из мозга взрослого человека не способны к росту в культуре in vitro.Primary cultures of nerve and glial cells derived from rat brain are known that are used to screen compounds for neuroprotective activity [9]. Moreover, the results obtained in animal models are not always reproduced in humans. On the other hand, it is impossible to obtain nerve cells from the brain of an adult in sufficient quantities to screen pharmacological compounds. And, in addition, neurons from the brain of an adult are not capable of growth in vitro.
Известны индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные из фибробластов кожи человека, которые используются для оценки цито- и эмбриотоксических свойств фармакологических соединений [10]. В данной заявке идет речь о недифференцированных ИПС клетках и их производных в виде эмбриоидных тел и производных трех зародышевых листков.Induced pluripotent stem cells derived from human skin fibroblasts are known to be used to evaluate the cyto- and embryotoxic properties of pharmacological compounds [10]. This application is about undifferentiated IPA cells and their derivatives in the form of embryoid bodies and derivatives of three germ layers.
Таким образом, создание адекватной модели для изучения нейродегенеративных заболеваний у человека и оценка нейропротекторных свойств различных соединений с целью создания на их основе эффективных лекарственных средств для лечения этих заболеваний, является в настоящее время чрезвычайно актуальной.Thus, the creation of an adequate model for the study of neurodegenerative diseases in humans and the assessment of the neuroprotective properties of various compounds in order to create effective drugs on their basis for the treatment of these diseases is currently extremely relevant.
С целью устранения указанных выше недостатков предлагается:In order to eliminate the above disadvantages, it is proposed:
1. Способ оценки нейропротекторных свойств веществ in vitro, с использованием тест-системы, содержащей дифференцированные в нейрональном направлении индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПС) человека, включающий этап репрограммирования фибробластов кожи человека в ИПС клеток, после чего ИПС клетки неоднократно помещают в культуральную среду, обеспечивающую их дифференцировку в нейрональном направлении и формирование на них дофаминергических нейронов, полученную тест-систему подвергают повреждающему воздействию в присутствии исследуемых веществ и по результатам выживаемости клеток оценивают их протекторное действие.1. A method for assessing the neuroprotective properties of substances in vitro, using a test system containing differentiated neuronally induced human pluripotent stem cells (IPA), comprising the step of reprogramming human skin fibroblasts in IPA cells, after which IPA cells are repeatedly placed in the culture medium, providing their differentiation in the neuronal direction and the formation of dopaminergic neurons on them, the resulting test system is subjected to damaging effects in the presence of and the test substances and the results of cell survival rate their protective effect.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ИПС клетки помещают в среду DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% N2 («Life Technologies», США), 10 мкМ SB431542 («Stemgent», США), 80 нг Noggin («Peprotech», США).2. The method according to p. 1, characterized in that the IPA cells are placed in DMEM / F12 medium, 2% serum substitute ("Gibco", USA), 1 mM non-essential amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% N2 (Life Technologies, USA), 10 μM SB431542 (Stemgent, USA), 80 ng Noggin (Peprotech, USA).
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что смену среды осуществляют ежедневно в течение 7-10 дней, сформированные нейрональные розетки и гребни механически отделяют и переносят в 24-луночный плашет с предельно низкой адгезией («Costar», США), где впоследствии формировались нейросферы, которые еще 5-7 дней культивируют в планшете, нейросферы собирают в центрифужные пробирки, диссоциируют до моноклеточной суспензии с помощью трипсина (0.25%) и высевают на чашки Петри, покрытые матригелем, и получают культуру нейрональных предшественников.3. The method according to p. 2, characterized in that the medium is changed daily for 7-10 days, the formed neuronal rosettes and combs are mechanically separated and transferred to a 24-well plate with extremely low adhesion (Costar, USA), where subsequently, neurospheres were formed, which were cultivated for another 5-7 days in a plate, neurospheres were collected in centrifuge tubes, dissociated to a monocellular suspension using trypsin (0.25%) and plated on Matriel coated Petri dishes to obtain a culture of neuronal precursors.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что далее полученную культуру нейрональных предшественников культивируют до плотного монослоя и рассевают 1:4 или 1:5 на новые чашки Петри 35 мм, покрытые матригелем.4. The method according to p. 3, characterized in that then the resulting culture of neuronal precursors is cultivated to a dense monolayer and sown 1: 4 or 1: 5 on new 35 mm Petri dishes coated with matrigel.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что полученные нейрональные предшественники культивируют 10 дней в среде для нейрональных предшественников: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh (PeproTech), 20 нг/мл FGF8 (PeproTech) и 2 мкМ пуроморфамин (Stemgent), далее еще 14 дней в среде для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF (PeproTech), 20 нг/мл GDNF (PeproTech), 200 мкМ аскорбиновая кислота, 5 мкМ форсколин (Stemgent).5. The method according to p. 4, characterized in that the obtained neuronal precursors are cultured for 10 days in a medium for neuronal precursors: DMEM / F12, 2% serum substitute ("Gibco", USA), 1 mM non-essential amino acids ("PanEco", RF ), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA), 100 ng / ml Shh (PeproTech), 20 ng / ml FGF8 (PeproTech) and 2 μM puromorphamine (Stemgent), then another 14 days in a maturing medium: DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 IU / ml; 50 mk / Ml), 1% supplement B27 ( «Life Technologies», USA), 20 ng / ml BDNF (PeproTech), 20 ng / ml of GDNF (PeproTech), 200 uM ascorbic acid, 5 .mu.M forskolin (Stemgent).
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что смену среды осуществляют каждые 48 часов впервые дни культивирования и далее каждые 24 часа, дифференцировку проводят в течение 24-32 дней.6. The method according to p. 5, characterized in that the medium is changed every 48 hours for the first days of cultivation and then every 24 hours, differentiation is carried out within 24-32 days.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемое соединение добавляют однократно в объеме 100 мкл за сутки до повреждающего воздействия в виде окислительного стресса.7. The method according to p. 1, characterized in that the test compound is added once in a volume of 100 μl a day before the damaging effect in the form of oxidative stress.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемое соединение добавляют однократно в объеме 100 мкл за 40 мин до повреждающего воздействия в виде добавления перекиси водорода.8. The method according to p. 1, characterized in that the test compound is added once in a volume of 100
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оценку выживаемости нейронов проводят через 24 часа после повреждающего воздействия в виде добавления перекиси водорода.9. The method according to p. 1, characterized in that the assessment of the survival of neurons is carried out 24 hours after the damaging effect in the form of adding hydrogen peroxide.
10. Способ по пп. 1-9, отличающийся тем, что культивирование всех используемых в работе клеток проводят в СО2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха.10. The method according to PP. 1-9, characterized in that the cultivation of all cells used in the work is carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and 95% air.
11. Способ по пп. 1-10, отличающийся тем, что для оценки нейропротекторных свойств веществ in vitro индуцированные плюрипотентные стволовые клетки неоднократно помещают в культуральную среду, обеспечивающую их дифференцировку в нейрональном направлении и формирование дофаминергических нейронов.11. The method according to PP. 1-10, characterized in that to assess the neuroprotective properties of substances in vitro induced pluripotent stem cells are repeatedly placed in a culture medium that ensures their differentiation in the neuronal direction and the formation of dopaminergic neurons.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки помещают в среду DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement N2 («Life Technologies», США), 10 мкМ SB431542 («Stemgent», США), 80 нг Noggin («Peprotech», США).12. The method according to p. 11, characterized in that the induced pluripotent stem cells are placed in DMEM / F12 medium, 2% serum substitute ("Gibco", USA), 1 mm replaceable amino acids ("PanEco", RF), 2 mm L -glutamine, penicillin-streptomycin (50 IU / ml; 50 μg / ml), 1% supplement N2 (Life Technologies, USA), 10 μM SB431542 (Stemgent, USA), 80 ng Noggin (Peprotech, USA).
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что смену среды осуществляют ежедневно в течение 7-10 дней, сформированные нейрональные розетки и гребни механически отделяют и переносят в 24-луночный плашет с предельно низкой адгезией («Costar», США), где впоследствии формировались нейросферы, которые еще 5-7 дней культивируют в планшете, нейросферы собирают в центрифужные пробирки, диссоциируют до моноклеточной суспензии с помощью трипсина (0.25%) и высевают на чашки Петри, покрытые матригелем.13. The method according to p. 12, characterized in that the medium is changed daily for 7-10 days, the formed neuronal rosettes and combs are mechanically separated and transferred to a 24-well plate with extremely low adhesion (Costar, USA), where subsequently, neurospheres were formed, which were cultured in the plate for another 5-7 days, neurospheres were collected in centrifuge tubes, dissociated to a monocellular suspension using trypsin (0.25%) and plated on Petri dishes coated with matrigel.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что далее полученную культуру нейрональных предшественников культивируют до плотного монослоя и рассевают 1:4 или 1:5 на новые чашки Петри 35 мм, покрытые матригелем.14. The method according to p. 13, characterized in that further the resulting culture of neuronal precursors is cultured to a dense monolayer and sown 1: 4 or 1: 5 into new 35 mm Petri dishes coated with matrigel.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что полученные нейрональные предшественники культивируют 10 дней в среде для нейрональных предшественников: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco)), США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh (PeproTech), 20 нг/мл FGF8 (PeproTech) и 2 мкМ пуроморфамин (Stemgent), далее еще 14 дней в среде для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF (PeproTech), 20 нг/мл GDNF, до полной зрелости полученных нейронов.15. The method according to p. 14, characterized in that the obtained neuronal precursors are cultured for 10 days in a medium for neuronal precursors: DMEM / F12, 2% serum substitute ("Gibco)", USA), 1 mm interchangeable amino acids ("PanEco", RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA), 100 ng / ml Shh (PeproTech), 20 ng / ml FGF8 (PeproTech) and 2 μM puromorphamine (Stemgent), then another 14 days in a maturing medium: DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 m g / ml), 1% supplement B27 ( «Life Technologies», USA), 20 ng / ml BDNF (PeproTech), 20 ng / ml GDNF, to full maturity derived neurons.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что смену среды осуществляют каждые 48 часов в первые дни культивирования и далее каждые 24 часа, дифференцировку проводят в течение 24-32 дней.16. The method according to p. 15, characterized in that the medium is changed every 48 hours in the first days of cultivation and then every 24 hours, differentiation is carried out within 24-32 days.
17. Способ по пп. 11-16, отличающийся тем, что культивирование всех используемых в работе клеток проводят в СО2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха.17. The method according to PP. 11-16, characterized in that the cultivation of all cells used in the work is carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and 95% air.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является поиск и ускорение тестирования соединений, представляющих фармакологический интерес, на наличие нейропротекторной активности или соответственно нейротоксической активности, а также получение более точной информации относительно степени активности тестируемых соединений. Указанный технический результат достигается за счет использования дифференцированных в нейрональном направлении ИПС клеток, полученных репрограммированием фибробластов кожи человека в ИПС клетки, после чего ИПС клетки помещают в культуральную среду, обеспечивающую дифференцировку ИПС клеток в нейрональном направлении с формированием нейронов определенной ергичности, в частности дофаминергических нейронов, что особенно важно в случае болезни Паркинсона, для которой доказана избирательная гибель именно нейронов этого типа в определенных отделах мозга.The technical result achieved by the implementation of the present invention is the search and acceleration of testing of compounds of pharmacological interest for the presence of neuroprotective activity or, respectively, neurotoxic activity, as well as obtaining more accurate information regarding the degree of activity of the tested compounds. The specified technical result is achieved through the use of differentiated in the neuronal direction IPA cells obtained by reprogramming human skin fibroblasts into IPA cells, after which IPA cells are placed in a culture medium that differentiates IPA cells in the neuronal direction with the formation of neurons of a certain ergidity, in particular dopaminergic neurons, which is especially important in the case of Parkinson's disease, for which the selective death of precisely this type of neurons has been proved venous parts of the brain.
Определение терминовDefinition of Terms
Под культурой ИПС клеток понимается клеточная культура, полученная репрограммированием фибробластов кожи взрослого человека по описанной ранее методике [1, 2, 11].Under the culture of IPS cells is understood a cell culture obtained by reprogramming fibroblasts of adult skin using the previously described method [1, 2, 11].
Под культурой дифференцированных в нейрональном направлении ИПС клеток понимается клеточная культура, содержащая до 90% нейронов, которые детектируются иммуноцитохимически.Under the culture of IPS cells differentiated in the neuronal direction, we mean a cell culture containing up to 90% of neurons that are detected immunocytochemically.
Под нейропротекцией понимается способность тестируемого соединения замедлять или предотвращать гибель нервных клеток по сравнению с контролем (без добавления тестируемого соединения).Neuroprotection refers to the ability of a test compound to slow down or prevent nerve cell death compared to a control (without adding a test compound).
Под нейротоксичностью понимается способность тестируемого соединения вызывать или ускорять гибель нервных клеток по сравнению с контролем (без добавления тестируемого соединения)Neurotoxicity refers to the ability of a test compound to cause or accelerate the death of nerve cells compared to a control (without adding a test compound)
Примеры собственных экспериментовExamples of own experiments
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.The following are examples illustrating the invention.
Пример 1. Получение репрограммированных клеток, а именно ИПС клеток из фибробластов кожи взрослого донора.Example 1. Obtaining reprogrammed cells, namely IPA cells from fibroblasts of the skin of an adult donor.
Фибробласты кожи взрослого донора были разморожены и в СО2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха, посеяны на лунки 12-луночного планшета с плотностью 30% монослоя в среде: DMEM («ПанЭко», РФ), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 2 мМ L-глутамин, 10% эмбриональная телячья сыворотка («HyClone», США), 2 нг/мкл bFGF («Peprotech», США). Через 2 дня после рассева клетки достигли плотности 60% монослоя и в этот момент они были инфицированы четырьмя вирусами в следующем количестве LeGO-hOct4 - MOI 5, LeGO-hSox2 - MOI 5, LeGO-hc-Myc - MOI 2.5, LeGO-hKlf4-MOI 5. Через 4 дня клетки были пересеяны на новые чашки Петри 1:22,5 в среде DMEM («ПанЭко», РФ), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 2 мМ L-глутамин, 10% эмбриональная телячья сыворотка («HyClone», США). На следующий день среда была заменена на среду mTeSR1. Затем клетки культивировали в этой среде в течение 8-10 дней, среду меняли раз в 2 дня. К этому моменту на чашках образовалось множество клонов с различной морфологией. Эти клоны были механически пересеяны 1:1 на матригель в среде mTeSR1 («STEM CELL Technologies», США). Через несколько дней некоторые из колоний стали расти и морфологически становиться более похожими на эмбриональные стволовые клетки, другие же дифференцировались и перестали расти.Fibroblasts of the skin of an adult donor were thawed and in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO2 and 95% air, seeded in the wells of a 12-well plate with a density of 30% monolayer in the medium: DMEM (PanEco, RF ), penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 2 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum (HyClone, USA), 2 ng / μl bFGF (Peprotech, USA). 2 days after sieving, the cells reached a density of 60% of the monolayer and at that moment they were infected with four viruses in the following quantities LeGO-hOct4 - MOI 5, LeGO-hSox2 - MOI 5, LeGO-hc-Myc - MOI 2.5, LeGO-hKlf4- MOI 5. After 4 days, the cells were seeded into new Petri dishes 1: 22.5 in DMEM (PanEco, RF), penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 2 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum ("HyClone", USA). The next day, the medium was replaced with mTeSR1. Then the cells were cultured in this medium for 8-10 days, the medium was changed every 2 days. At this point, many clones with different morphologies formed on the plates. These clones were mechanically seeded 1: 1 on matrigel in mTeSR1 medium (STEM CELL Technologies, USA). After a few days, some of the colonies began to grow and morphologically become more like embryonic stem cells, while others differentiated and stopped growing.
Через неделю был произведен отбор клонов на 24-луночный планшет, покрытый матригелем («BD Biosciences», США), в среде mTeSR1 было посеяно 15 различных клонов, после чего их культивировали раздельно. В итоге 6 клонов показали способность к стабильному росту на подложке матригель в среде mTeSR1. Два клона были использованы для дальнейшей работы, оставшиеся заморожены в жидком азоте. Все полученные клоны ИПС клеток методом иммуноцитохимического анализа были исследованы на маркеры плюрипотентности, на способность формировать эмбриоидные тела и давать начало трем зародышевым листкам (эктодерме, мезодерме, энтодерме).A week later, clones were selected for a 24-well Matrigel coated plate (BD Biosciences, USA), 15 different clones were seeded in mTeSR1 medium, and then they were cultured separately. As a result, 6 clones showed the ability to stably grow on a matrigel substrate in mTeSR1 medium. Two clones were used for further work; the remaining ones were frozen in liquid nitrogen. All obtained clones of IPA cells by immunocytochemical analysis were tested for pluripotency markers, for the ability to form embryoid bodies and give rise to three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm).
Пример 2. Получение нейрональных предшественников из ИПС клеток.Example 2. Obtaining neuronal precursors from IPA cells.
После достижения ИПС клетками 50-60% монослоя делали смену среды на нейрональную DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement N2 («Life Technologies», США), 10 мкМ SB431542 («Stemgent», США), 80 нг Noggin («Peprotech», США). Инкубацию проводили в СО2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха. Смена среды осуществлялась ежедневно в течение 7-10 дней. За это время происходило образование нейрональных розеток и гребней (рис. 1).After IPA reached 50-60% of the monolayer, the medium was changed to neuronal DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement N2 (Life Technologies, USA), 10 μM SB431542 (Stemgent, USA), 80 ng Noggin (Peprotech, USA). Incubation was carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and 95% air. The change of environment was carried out daily for 7-10 days. During this time, the formation of neuronal rosettes and ridges occurred (Fig. 1).
Сформированные нейрональные розетки и гребни механически отделяли и переносили в 24-луночный плашет с предельно низкой адгезией («Costar», США), где впоследствии формировались нейросферы, которые еще 5-7 дней культивировали в планшете.The formed neuronal rosettes and ridges were mechanically separated and transferred to a 24-well plate with extremely low adhesion (Costar, USA), where neurospheres were subsequently formed, which were cultivated for another 5-7 days in a plate.
Нейросферы собирали в центрифужные пробирки, диссоциировали до моноклеточной суспензии с помощью трипсина (0.25%) и высевали на чашки Петри, покрытые матригелем, в нейрональную среду DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement N2 («Life Technologies)), США), 10 мкМ SB431542(«Stemgent», США), 80 нг Noggin («Peprotech», США). Далее полученную культуру нейрональных предшественников культивировали до плотного монослоя (рис. 2) и рассевали 1:4 или 1:5 на новые чашки Петри 35 мм, покрытые матригелем. Пассирование нейрональных предшественников осуществляли каждые 3-5 дней, в зависимости от плотности посева. Нейрональные предшественники имеют высокую пролиферативную активность, за 2-3 пассирования наращивается большое количество клеток, которые успешно подвергаются криоконсервации и хранению в жидком азоте, с высоким процентом (от 50 до 70%) выхода живых клеток из заморозки. При дальнейшей направленной дифференцировке нейрональных предшественников после 8 пассажа пролиферативная активность клеток существенно снижалась и начиналось формирование сети нейритов (рис. 3).Neurospheres were collected in centrifuge tubes, dissociated to a single cell suspension using trypsin (0.25%) and plated on Matrigel coated Petri dishes in DMEM / F12 neuronal medium, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids ( “PanEco”, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement N2 (“Life Technologies)”, USA), 10 μM SB431542 (“Stemgent”, USA), 80 ng Noggin (Peprotech, USA). Next, the resulting culture of neuronal precursors was cultured to a dense monolayer (Fig. 2) and scattered 1: 4 or 1: 5 into new 35 mm Matriel Petri dishes. Passivation of neuronal precursors was carried out every 3-5 days, depending on the density of seeding. Neuronal precursors have high proliferative activity, a large number of cells that successfully undergo cryopreservation and storage in liquid nitrogen, with a high percentage (from 50 to 70%) of the release of living cells from freezing, grow in 2-3 passages. With further directed differentiation of neuronal precursors after passage 8, the proliferative activity of cells decreased significantly and the formation of a network of neurites began (Fig. 3).
Пример 3. Дифференцировка нейрональных предшественников в культуры зрелых нейронов, обогащенных дофаминергическими нейронами.Example 3. Differentiation of neuronal precursors in the culture of mature neurons enriched in dopaminergic neurons.
Полученные нейрональные предшественники культивировали в CO2-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 95% воздуха в среде DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США). Для получения терминально дифференцированных дофаминергических нейронов клетки рассевали в количестве 200 тыс./см2 на чашки Петри, покрытые матригелем. На следующий день делали смену среды на среду для нейрональных предшественников: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh («PeproTech», США), 20 нг/мл FGF8 («PeproTech», США) и 2 мкМ пуроморфамин («Stemgent», США). Клетки культивировали в течение 10 дней, смену среды осуществляли каждые 48 часов. На 11 сутки культивирования нейрональную среду заменяли на среду для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF («PeproTech», США), 20 нг/мл GDNF («PeproTech», США), 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 5 мкМ форсколина («Stemgent», США). Клетки культивировали еще 14 дней до полной зрелости нейронов. Смену среды осуществляли каждые 48 часов в первые дни культивирования и далее каждые 24 часа.The resulting neuronal precursors were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 and 95% air in DMEM / F12 medium, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM non-essential amino acids (PanEco ”, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin (50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA). To obtain terminally differentiated dopaminergic neurons, the cells were scattered in an amount of 200 thousand / cm 2 on Petri dishes coated with matrigel. The next day, we changed the medium to the medium for neuronal precursors: DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin ( 50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA), 100 ng / ml Shh (PeproTech, USA), 20 ng / ml FGF8 (PeproTech, USA) and 2 μM puromorphamine (Stemgent, USA). Cells were cultured for 10 days, medium change was carried out every 48 hours. On the 11th day of cultivation, the neuronal medium was replaced with a maturation medium: DMEM / F12, 2% serum substitute (Gibco, USA), 1 mM amino acids (PanEco, RF), 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin ( 50 U / ml; 50 μg / ml), 1% supplement B27 (Life Technologies, USA), 20 ng / ml BDNF (PeproTech, USA), 20 ng / ml GDNF (PeproTech, USA), 200 μM ascorbic acid, 5 μM forskolin (Stemgent, USA). Cells were cultured another 14 days until the neurons were fully matured. A change of medium was carried out every 48 hours in the first days of cultivation and then every 24 hours.
В результате разработанной методики была получена морфологически гомогенная популяция нейрональных клеток, в которой не менее 90% клеток окрашивались антителами к нейрон-специфическому белку бета-III-тубулину (рис. 4). Более того, согласно разработанной модели были получены нейрональные культуры, обогащенные дофаминергическими нейронами (рис. 5), что особенно важно в случае болезни Паркинсона, для которой доказана избирательная гибель именно нейронов этого типа в определенных отделах мозга. В качестве маркера дофаминергических нейронов использовались антитела к ферменту синтеза катехоламинов-тирозингидроксилазе.As a result of the developed technique, a morphologically homogeneous population of neuronal cells was obtained in which at least 90% of the cells were stained with antibodies to the neuron-specific beta-III-tubulin protein (Fig. 4). Moreover, according to the developed model, neuronal cultures enriched with dopaminergic neurons were obtained (Fig. 5), which is especially important in the case of Parkinson’s disease, for which the selective death of precisely this type of neurons in certain parts of the brain was proved. Antibodies to the enzyme for the synthesis of catecholamines tyrosine hydroxylase were used as a marker of dopaminergic neurons.
Пример 4. Оценка нейропротекторных эффектов исследуемых соединений в культурах дифференцированных в нейрональном направлении ИПС клеток.Example 4. Evaluation of the neuroprotective effects of the studied compounds in cultures of differentiated in the neuronal direction IPA cells.
Модель цитотоксического повреждения нейронов с применением перекиси водорода. Для создания модели цитотоксического повреждения нейронов, полученных при дифференцировке ИПС клеток, был использован подход с применением перекиси водорода. Подбор концентраций перекиси водорода, оказывающих токсическое действие на клетки, проводили на нейронах, полученных от здорового донора. В этом случае нейрональные предшественники культивировали в присутствии соответствующих факторов дифференцировки в течение 24 суток. Перекись водорода в широком диапазоне концентраций (50-500 мкМ) вносили одновременно со сменой среды и клетки инкубировали 24 ч. Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали специфическими антителами против бета-III-тубулина. Было показано, что перекись водорода в концентрации 50 мкм существенно снижает количество тубулин положительных клеток, в концентрации 200 мкм гибель клеток составила более 50%, при 500 мкм все клетки погибали (рис. 6).A model of cytotoxic damage to neurons using hydrogen peroxide. To create a model of cytotoxic damage to neurons obtained by differentiation of IPA cells, an approach using hydrogen peroxide was used. The selection of the concentrations of hydrogen peroxide, which have a toxic effect on the cells, was carried out on neurons obtained from a healthy donor. In this case, neuronal precursors were cultured in the presence of appropriate differentiation factors for 24 days. Hydrogen peroxide in a wide range of concentrations (50-500 μM) was introduced simultaneously with the change of medium and the cells were incubated for 24 hours. Then the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with specific antibodies against beta-III-tubulin. It was shown that hydrogen peroxide at a concentration of 50 μm significantly reduces the number of tubulin-positive cells, at a concentration of 200 μm, cell death was more than 50%, at 500 μm all cells died (Fig. 6).
В аналогичных экспериментах исследование гибели дофаминергических нейронов (ТГП нейроны) в дифференцированных культурах ИПС клеток выявило более существенную чувствительность этих клеток к действию перекиси. Так, было показано, что перекись водорода в концентрации 50 мкМ убивает около 60% клеток, а при 200 мкМ живыми оставались менее 5% клеток (рис. 7).In similar experiments, the study of the death of dopaminergic neurons (TGP neurons) in differentiated cultures of IPA cells revealed a more significant sensitivity of these cells to the action of peroxide. Thus, it was shown that hydrogen peroxide at a concentration of 50 μM kills about 60% of the cells, while at 200 μM less than 5% of the cells remained alive (Fig. 7).
Таким образом, установлен важный факт разной чувствительности дифференцированных в нейральном направлении ИПС клеток к такому цитотоксическому соединению, как перекись водорода. В дальнейшем, разработанная модель позволяет проводить скрининг соединений на наличие нейропротекторной активности как для общей нейрональной популяции, так и для нейронов определенной ергичности.Thus, an important fact has been established that the sensitivity of differentiated in the neural direction of IPA cells to such a cytotoxic compound as hydrogen peroxide is different. In the future, the developed model allows screening of compounds for the presence of neuroprotective activity both for the general neuronal population and for neurons of a certain ergotity.
Оценка нейропротекторных эффектов исследуемых соединений на модели цитотоксического повреждения нейронов с применением перекиси водорода. Добавление тестируемых соединений в объеме 100 мкл за 24 ч до внесения перекиси водорода.Evaluation of the neuroprotective effects of the studied compounds on the model of cytotoxic damage to neurons using hydrogen peroxide. The addition of test compounds in a volume of 100
Для этого нейрональные предшественники, прошедшие 1 этап дифференцировки (культивирование в течение 10 дней, в присутствии 100 нг/мл Shh, 20 нг/мл FGF8 и 2 мкМ пуроморфамин) высевали по 20 тыс. клеток в 100 мкл нейрональной среды (DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh (PeproTech), 20 нг/мл FGF8 («PeproTech», США) и 2 мкМ пуроморфамин («Stemgent», США) на лунку 96-луночной плашки, покрытой матригелем. Через 24 часа среду заменяли на среду для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF («PeproTech», США), 20 нг/мл GDNF («PeproTech», США), 200 мкМ аскорбиновая кислота, 5 мкМ форсколина («Stemgent», США). Клетки культивировали еще 7-14 дней. За 24 ч до внесения перекиси водорода делали смену среды в объеме 100 мкл с соответствующими пептидами (тестируемыми соединениями) до конечных концентраций 10-7 М и 10-9 М. Через 24 часа делали смену среды с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 250 мкМ. Клетки инкубировали 3 часа, после чего делали полную смену среды на ростовую (DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки, 1 мМ заменимые аминокислоты, 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27, 20 нг/мл BDNF, 20 нг/мл GDNF, 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 5 мкМ форсколина). Через 24 часа определяли количество жизнеспособных клеток. Оптическую плотность измеряли на приборе Metertech ∑960. Полученные результаты представлены на рис. 8.For this, neuronal precursors that underwent
АКТГ (6-9), Семакс и альфа-МСГ увеличивали число выживших клеток при воздействии перекиси водорода, то есть обладали нейропротекторным эффектом.ACTH (6-9), Semax and alpha-MSH increased the number of surviving cells when exposed to hydrogen peroxide, that is, they had a neuroprotective effect.
Оценка нейропротекторных эффектов исследуемых соединений на модели цитотоксического повреждения нейронов с применением перекиси водорода. Добавление тестируемых соединений в объеме 100 мкл за 40 мин до внесения перекиси водорода.Evaluation of the neuroprotective effects of the studied compounds on the model of cytotoxic damage to neurons using hydrogen peroxide. The addition of test compounds in a volume of 100
Для этого нейрональные предшественники, прошедшие 1 этап дифференцировки (культивирование в течение 10 дней, в присутствии 100 нг/мл Shh, 20 нг/мл FGF8 и 2 мкМ пуроморфамин) высевали по 20 тыс. клеток в 100 мкл нейрональной среды (DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 100 нг/мл Shh («PeproTech», США), 20 нг/мл FGF8 («PeproTech»», США) и 2 мкМ пуроморфамин («Stemgent», США) на лунку 96-луночной плашки, покрытой матригелем. Через 24 часа среду заменяли на среду для созревания: DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки («Gibco», США), 1 мМ заменимые аминокислоты («ПанЭко», РФ), 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27 («Life Technologies», США), 20 нг/мл BDNF («PeproTech», США), 20 нг/мл GDNF («PeproTech», США), 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 5 мкМ форсколина («Stemgent», США). Клетки культивировали еще 7-14 дней. За 40 минут до внесения перекиси водорода делали смену среды (100 мкл) с соответствующими пептидами до конечных концентраций 10-7 М и 10-9 М. Через 40 мин вносили еще 100 мкл среды с перекисью водорода до конечной ее концентрации 250 мкМ. Клетки инкубировали 3 часа, после чего делали полную смену среды на ростовую (DMEM/F12, 2% заменитель сыворотки, 1 мМ заменимые аминокислоты, 2 мМ L-глутамин, пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл), 1% supplement В27, 20 нг/мл BDNF, 20 нг/мл GDNF, 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 5 мкМ форсколина). Через 24 часа определяли количество жизнеспособных клеток. Оптическую плотность измеряли на приборе Metertech ∑960.For this, neuronal precursors that underwent
Полученные результаты представлены на рис. 9. Было показано, что АКТГ (6-9), Семакс и альфа-МСГ увеличивали число выживших клеток при воздействии перекиси водорода, то есть обладали нейропротекторным эффектом.The results are presented in Fig. 9. It was shown that ACTH (6–9), Semax, and alpha-MSH increased the number of surviving cells when exposed to hydrogen peroxide, that is, they had a neuroprotective effect.
Оценка нейропротекторных эффектов исследуемых соединений на модели цитотоксического повреждения нейронов при кратковременном действии (30 мин) перекиси водорода. Добавление тестируемых соединений в объеме 100 мкл в течение 7 дней до внесения перекиси водорода.Evaluation of the neuroprotective effects of the studied compounds on the model of cytotoxic damage to neurons under the short-term action (30 min) of hydrogen peroxide. The addition of test compounds in a volume of 100 μl for 7 days before the introduction of hydrogen peroxide.
На данном этапе работы исследовали действие ряда пептидных соединений на жизнеспособность нейронов при кратковременном воздействии перекиси водорода. Для этого нейрональные предшественники, прошедшие 1-й этап дифференцировки в течение 10 дней в присутствии таких факторов, как FGF8, Shh, Puromorfamin, были рассеяны на 96-луночный планшеты по 40 тыс./лунку в 100 мкл среды. Клетки культивировали еще 7 дней с пептидами и факторами второго этапа дифференцировки - BDNF, GDNF, аскорбиновая кислота, форсколин. На 8 сутки культивирования осуществляли полную смену среды, добавляли перекись водорода (15 мМ), инкубировали 30 минут, затем опять полностью заменяли среду и проводили МТТ тест для определения количества живых клеток. Данные этих экспериментов представлены на рис. 10. АКТГ 6-9, Семакс увеличивали число выживших клеток при кратковременном действии высоких концентраций перекиси водорода на 15-30%, то есть обладали нейропротекторным эффектом.At this stage of the study, the effect of a number of peptide compounds on the viability of neurons under short-term exposure to hydrogen peroxide was investigated. For this, neuronal precursors that underwent the 1st stage of differentiation for 10 days in the presence of factors such as FGF8, Shh, Puromorfamin were scattered on 96-well plates at 40 thousand / well in 100 μl of medium. Cells were cultured for another 7 days with peptides and factors of the second stage of differentiation - BDNF, GDNF, ascorbic acid, forskolin. On the 8th day of cultivation, a complete change of the medium was carried out, hydrogen peroxide (15 mM) was added, incubated for 30 minutes, then the medium was completely replaced again and an MTT test was performed to determine the number of living cells. The data of these experiments are presented in Fig. 10. ACTH 6-9, Semax increased the number of surviving cells under the short-term effect of high concentrations of hydrogen peroxide by 15-30%, that is, they had a neuroprotective effect.
ЛитератураLiterature
1. Takahashi, K., Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126, 663-676.1. Takahashi, K., Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell, 126, 663-676.
2. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, Т., Tomoda, K., Yamanaka, S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131, 861-872.2. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131, 861-872.
3. Лебедева O.C., Лагарькова M.A., Гривенников И.А. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: получение и перспективы применения. В Сборнике «Стволовые клетки и регенеративная медицина» 2011, 304-318. МАКС Пресс, ISBN 978-5-317-03583-9.3. Lebedeva O.C., Lagarkova M.A., Grivennikov I.A. Induced pluripotent stem cells: preparation and application prospects. In the collection "Stem Cells and Regenerative Medicine" 2011, 304-318. MAX Press, ISBN 978-5-317-03583-9.
4. Е.В. Новосадова, И.А. Гривенников. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: от получения до применения в биохимических и биомедицинских исследованиях. Успехи биологической химии. (2014), 54, 3-38.4. E.V. Novosadova, I.A. Grivennikov. Induced pluripotent stem cells: from receipt to use in biochemical and biomedical research. Advances in biological chemistry. (2014), 54, 3-38.
5. Grskovic, М., Javaherian, A., Strulovici, В., Daley, G.Q. (2011) Induced pluripotent stem cells-opportunities for disease modeling and drug discovery, Nature Reviews Drug Discovery, 10, 915-929.5. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G.Q. (2011) Induced pluripotent stem cells-opportunities for disease modeling and drug discovery, Nature Reviews Drug Discovery, 10, 915-929.
6. Mackay-Sim, A. (2013) Patient-derived stem cells: pathways to drug discovery for brain diseases, Frontiers in Cellular Neuroscience, 7, Article 29, 1-10.6. Mackay-Sim, A. (2013) Patient-derived stem cells: pathways to drug discovery for brain diseases, Frontiers in Cellular Neuroscience, 7, Article 29, 1-10.
7. Maury, Y., Gauthier, M., Peschanski, M., Martinat, C. (2012) Human pluripotent stem cells for disease modelling and drug screening, Bioessays, 34, 61-71.7. Maury, Y., Gauthier, M., Peschanski, M., Martinat, C. (2012) Human pluripotent stem cells for disease modeling and drug screening, Bioessays, 34, 61-71.
8. Гривенников И.А. (2008) Эмбриональные стволовые клетки и проблема направленной дифференцировки, Успехи биологической химии, 48, 181-220.8. Grivennikov I.A. (2008) Embryonic stem cells and the problem of directed differentiation, Advances in Biological Chemistry, 48, 181-220.
9. Гривенников И.А., О.В. Долотов, Н.Ф. Мясоедов. «Способ скрининга фармакологических соединений на нейропротекторную активность». Патент РФ №2383615. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 10.03.2010 г. Приоритет от 12 марта 2009 г.9. Grivennikov I.A., O.V. Dolotov, N.F. Meat eaters. "A method for screening pharmacological compounds for neuroprotective activity." RF patent No. 2383615. Registered in the State Register of Inventions of the Russian Federation on March 10, 2010. Priority dated March 12, 2009.
10. Е.В. Новосадова, Л.А. Андреева, Е.Л. Арсеньева, И.А. Гривенников, С.Н. Иллариошкин, О.С. Лебедева, И.В. Макарова, Е.С. Мануйлова, Н.Ф. Мясоедов, В.З. Тарантул. «Применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для оценки цито- и эмбриотоксических свойств фармакологических соединений». Заявка на патент от 10.09.2015 г. рег. №2015138572.10. E.V. Novosadova, L.A. Andreeva, E.L. Arsenyev, I.A. Grivennikov, S.N. Illarioshkin, O.S. Lebedeva, I.V. Makarova, E.S. Manuylova, N.F. Myasoedov, V.Z. Tarantula. "The use of induced human pluripotent stem cells to evaluate the cyto- and embryotoxic properties of pharmacological compounds." Application for a patent dated September 10, 2015 reg. No. 2015138572.
11. Гривенников И.А., О.С. Лебедева, Е.В. Новосадова, С.Л. Киселев, М.А. Лагарькова, С.Н. Иллариошкин, С.А. Клюшников. «Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов пациентов с болезнью Гентингтона». Патент №2458983. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20 августа 2012 г. Приоритет от 18 июля 2011 г.11. Grivennikov I.A., O.S. Lebedeva, E.V. Novosadova, S.L. Kiselev, M.A. Lagarkova, S.N. Illarioshkin, S.A. Klyushnikov. "A method for producing induced pluripotent stem cells from fibroblasts of patients with Huntington's disease." Patent No. 2458983. Registered in the State Register of Inventions of the Russian Federation on August 20, 2012. Priority dated July 18, 2011.
Claims (17)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016121897A RU2646446C1 (en) | 2016-06-02 | 2016-06-02 | Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016121897A RU2646446C1 (en) | 2016-06-02 | 2016-06-02 | Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2646446C1 true RU2646446C1 (en) | 2018-03-05 |
Family
ID=61568604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016121897A RU2646446C1 (en) | 2016-06-02 | 2016-06-02 | Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646446C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114441413A (en) * | 2022-01-24 | 2022-05-06 | 南京医科大学 | Analysis method for single vesicle storage in dopaminergic neuron induced and differentiated by iPSC technology |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2383615C1 (en) * | 2009-03-12 | 2010-03-10 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН) | Method of screening pharmacological compounds according to neuroprotective activity |
| RU2458983C1 (en) * | 2011-07-18 | 2012-08-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Method of producing induced pluripotent stem cells from fibroblasts of patients with huntington's disease |
| WO2015049677A1 (en) * | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Kadimastem Ltd. | Directed differentiation of astrocytes from human pluripotent stem cells for use in drug screening and the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
-
2016
- 2016-06-02 RU RU2016121897A patent/RU2646446C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2383615C1 (en) * | 2009-03-12 | 2010-03-10 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН) | Method of screening pharmacological compounds according to neuroprotective activity |
| RU2458983C1 (en) * | 2011-07-18 | 2012-08-20 | Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Образования И Науки Российской Федерации | Method of producing induced pluripotent stem cells from fibroblasts of patients with huntington's disease |
| WO2015049677A1 (en) * | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Kadimastem Ltd. | Directed differentiation of astrocytes from human pluripotent stem cells for use in drug screening and the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MAURY Y. et al. Human pluripotent stem cells for disease modelling and drug screening // Bioessays,2012, 34, 61-71. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114441413A (en) * | 2022-01-24 | 2022-05-06 | 南京医科大学 | Analysis method for single vesicle storage in dopaminergic neuron induced and differentiated by iPSC technology |
| CN114441413B (en) * | 2022-01-24 | 2024-05-14 | 南京医科大学 | Analysis method for single vesicle storage in dopaminergic neurons induced to differentiate by iPSC technology |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tucker et al. | Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation | |
| EP2496688B1 (en) | A method for differentiation induction in cultured stem cells | |
| KR20220088800A (en) | Methods for differentiating pluripotent cells | |
| CN105940101A (en) | Specification of functional cranial placode derivatives from human pluripotent stem cells | |
| KR102210180B1 (en) | Method for producing ciliary marginal zone-like structure | |
| CN109136185B (en) | Preparation method and application of brain-like organ device | |
| CN103740757B (en) | A kind of method utilizing reprogrammed to prepare pig neural stem cell | |
| JP2014509192A (en) | Methods and compositions for generating patient-specific pluripotent neuronal stem cells | |
| Bucchia et al. | Limitations and challenges in modeling diseases involving spinal motor neuron degeneration in vitro | |
| KR20170051497A (en) | Method for producing cerebellar progenitor tissue | |
| CA2909637A1 (en) | Media compositions for neuronal cell culture | |
| CN105392881A (en) | Small molecule based conversion of somatic cells into neural crest cells | |
| JP2019517257A (en) | In vitro method of differentiating stem cells into neurons, and neurons generated using this method | |
| EP3656846A1 (en) | Method for preserving neural tissue | |
| CN106350521A (en) | Preparation method of ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) patient specific motor neuron | |
| Khan et al. | Neurosphere development from hippocampal and cortical embryonic mixed primary neuron culture: a potential platform for screening neurochemical modulator | |
| Dierickx et al. | Embryonic template-based generation and purification of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for heart repair | |
| Major et al. | Derivation of telencephalic oligodendrocyte progenitors from human pluripotent stem cells | |
| CN101124319B (en) | Neural stem cells | |
| RU2690846C1 (en) | Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directed differentiation of induced human pluripotent stem cells | |
| Su et al. | Transplanted motoneurons derived from human induced pluripotent stem cells form functional connections with target muscle | |
| RU2646446C1 (en) | Method for assessing neuroprotective properties of vitro substances and the test system for its implementation | |
| RU2690498C1 (en) | Method for preparing a nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directional differentiation of induced human pluripotent stem cells | |
| KR102650805B1 (en) | Differentiation method of securing large amount of cells by chopping oligodendrocytes enriched 3D organoids prepared from human pluripotent stem cells | |
| US20220389378A1 (en) | Spin-aggregated neural microspheres and the application thereof |