RU2644155C1 - 2-(3-(4-(7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-1h-pyrazol-1-yl)-1-(ethylsulfonyl)azetidin-3-yl)acetonitrile heminaphthyldisulfonate as janus kinase inhibitor - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to a novel compound of formula 1 having properties of Janus kinase (JAK) inhibitors. Compound of formula 1 is 2-(3-(4-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-1H-pyrazol-1-yl)-1-(ethylsulfonyl)azetidin-3-yl)acetonitrile with heminaphthyldisulfonate and corresponds to the structure

.

Method for preparing said compound comprises reaction of 2 molar equivalents of a Baricitinib base with 1,5-naphthyldisulfonic acid in a suitable solvent or solvent mixture.

EFFECT: compounds can be used for treatment of diseases selected from the group consisting of multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, psoriatic arthritis, type I diabetes, lupus, psoriasis, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, myasthenia gravis, immunoglobulin nephropathy, autoimmune thyroid disease.

6 cl, 6 dwg, 4 tbl, 8 ex

Description

Изобретение относится к 2-(3-(4-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил)-1-(этилсульфонил)азетидин-3-ил)ацетонитрила геминафтилдисульфонату, а также его композициям, способам применения и получения. Это соединение и его композиции являются ингибиторами Янус киназ (JAK) и могут использоваться при лечении JAK ассоциированных заболеваний, включая, например, воспалительные и аутоиммунные расстройства, а также рак.The invention relates to 2- (3- (4- (7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl) -1H-pyrazol-1-yl) -1- (ethylsulfonyl) azetidin-3-yl) acetonitrile geminaphthyldisulfonate, as well as its compositions, methods of use and preparation. This compound and its compositions are inhibitors of Janus kinases (JAK) and can be used in the treatment of JAK associated diseases, including, for example, inflammatory and autoimmune disorders, as well as cancer.

Онкогенные протеинкиназы представляют собой одну из самых крупных и наиболее привлекательных групп белковых мишеней для разработки лекарственных средств. JAK играют важную роль в цитокин-зависимой регуляции пролиферации и функции клеток, участвующих в иммунной реакции. В настоящее время известны четыре JAK: JAK1, JAK2, JAK3 (также известная как Янус-киназа лейкоцитов; JAKL; L-JAK) и TYK2 (также известна как тирозинкиназа Т).Oncogenic protein kinases are one of the largest and most attractive groups of protein targets for drug development. JAKs play an important role in the cytokine-dependent regulation of proliferation and function of cells involved in the immune response. Four JAKs are currently known: JAK1, JAK2, JAK3 (also known as white blood cell Janus kinase; JAKL; L-JAK) and TYK2 (also known as tyrosine kinase T).

Блокировка передачи сигнала на уровне JAK перспективна для разработки методов лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, миелопролиферативных и раковых заболеваний человека. Предполагается, что ингибирование JAK имеет терапевтический эффект у пациентов, страдающих иммунными расстройствами кожи, такими как псориаз и сенсибилизация кожи. Эффективные ингибиторы JAK представляют безусловный интерес для разработки новых лекарственных средств. Некоторые JAK ингибиторы, в том числе пирролопиримидины, представлены в WO 2009/114512. В этой серии соединений Барицитиниб (Baricitinib) является самым передовым лекарственным кандидатом. Барицитиниб показал быструю (через 6 месяцев лечения) и устойчивую эффективность при лечении ревматоидного артрита в трех исследованиях III фазы [NCT02340104, NCT02263911, NCT01710358. http://www.medpagetoday.com/MeetingCoverage/EULAR/52084.http://www.fiercepharma.com/press-releases/lilly-and-incyte-announce-positive-top-line-results-phase-3-trial-baricitin].Blocking signal transmission at the JAK level is promising for the development of methods for treating inflammatory diseases, autoimmune diseases, myeloproliferative and human cancers. JAK inhibition is believed to have a therapeutic effect in patients suffering from immune disorders of the skin, such as psoriasis and skin sensitization. Effective JAK inhibitors are of undoubted interest in the development of new drugs. Some JAK inhibitors, including pyrrolopyrimidines, are presented in WO 2009/114512. In this series of compounds, Baricitinib is the most advanced drug candidate. Baricitinib showed fast (after 6 months of treatment) and sustained effectiveness in the treatment of rheumatoid arthritis in three phase III studies [NCT02340104, NCT02263911, NCT01710358. http://www.medpagetoday.com/MeetingCoverage/EULAR/52084.http://www.fiercepharma.com/press-releases/lilly-and-incyte-announce-positive-top-line-results-phase-3- trial-baricitin].

Таким образом, поиск новых улучшенных JAK ингибиторов является одним из основных направлений для разработки новых, более эффективных лекарственных препаратов для лечения ревматоидного артрита, рака и других заболеваний. Соединение и способы, описанные здесь, направлены на удовлетворение этих потребностей.Thus, the search for new improved JAK inhibitors is one of the main directions for the development of new, more effective drugs for the treatment of rheumatoid arthritis, cancer and other diseases. The compound and methods described herein are intended to meet these needs.

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.The following are definitions of terms that are used in the description of this invention.

«Алкил» означает алифатическую углеводородную линейную или разветвленную группу с 1-12 атомами углерода в цепи. Разветвленная означает, что алкильная цепь имеет один или несколько «низших алкильных» (С₁-C₆)алкильных заместителей. Предпочтительными алкильными группами являются (С₁-C₆)алкил, еще более предпочтительными (С₁-C₃)алкил, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, циклопропилметил, циклобутилметил, циклопентилметил, н-пентил, 2-пентил, 3-пентил, нео-пентил, н-гексил, циклогексил. Алкил может иметь заместители."Alkyl" means an aliphatic hydrocarbon linear or branched group with 1-12 carbon atoms in the chain. Branched means that the alkyl chain has one or more "lower alkyl" (C ₁ -C ₆ ) alkyl substituents. Preferred alkyl groups are (C ₁ -C ₆ ) alkyl, even more preferred (C ₁ -C ₃ ) alkyl, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, cyclopropylmethyl , cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, n-pentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, neo-pentyl, n-hexyl, cyclohexyl. Alkyl may have substituents.

«Замещенный алкил» - замещенный алкил может иметь один или несколько одинаковых или различных заместителей, включая галоген, алкенилокси, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, ароил, гетероароил, циано, гидрокси, алкокси, карбокси, алкинилокси, аралкокси, арилокси, арилоксикарбонил, алкилтио, гетероарилтио, аралкилтио, арилсульфонил, алкилсульфонил, гетероаралкилокси или R_k ^aR_k+1 ^aN-, где R_k ^a и R_k+1 ^a независимо друг от друга представляют собой «заместители аминогруппы», значение которых определено в данном разделе, например атом водорода, алкил, арил, аралкил, гетероаралкил, гетероциклил или гетероарил, или R_k ^a и R_k+1 ^a вместе с атомом N, с которым они связаны, образуют через R_k ^a и R_k+1 ^a 4-7-членный гетероциклил или гетероцикленил. Предпочтительными «алкильными заместителями» являются арил, гетероарил, гетероциклил, гидрокси, C₁-C₅ алкокси, С₁-С₅ алкоксикарбонил, аралкокси, арилокси, алкилтио, гетероарилтио, аралкилтио, алкилсульфонил, арилсульфонил, алкоксикарбонил, аралкоксикарбонил, гетероаралкилоксикарбонил или R_k ^aR_k+1 ^aN-, R_k ^aR_k+1 ^aNC(=O)-, аннелированный арилгетероцикленил, аннелированный арилгетероциклил.“Substituted alkyl” - substituted alkyl may have one or more, same or different substituents, including halogen, alkenyloxy, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, aroyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, alkoxy, carboxy, alkynyloxy, aralkoxy, aryloxy, aryloxycarbonyl alkylthio, heteroarylthio, aralkylthio, arylsulfonyl, alkylsulfonyl, heteroaralkyloxy or R _k ^a R _{k + 1} ^a N-, where R _k ^a and R _{k + 1} ^{a are} independently “amino substituents”, the meanings of which are defined in this section e.g. hydrogen atom , Alkyl, aryl, aralkyl, heteroaralkyl, heterocyclyl or heteroaryl, or R _k ^a and R _{k + 1} ^a together with the atom N, which they are linked to, form through R _k ^a and R _{k + 1} ^a 4-7-membered heterocyclyl, or heterocyclenyl. The preferred "alkyl substituents" are aryl, heteroaryl, heterocyclyl, hydroxy, C ₁ -C ₅ alkoxy, C ₁ -C ₅ alkoxycarbonyl, aralkoxy, aryloxy, alkylthio, heteroarylthio, aralkylthio, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, alkoxycarbonyl, aralkoxycarbonyl, or R _k geteroaralkiloksikarbonil ^a R _{k + 1 ^{a N-, R k a R k}} + ₁ ^a NC (= O) -, annelated arylheterocyclenyl, annelated arylheterocyclyl.

«Аминогруппа» означает R₁R₂N-группу, замещенную или незамещенную необязательно одинаковыми заместителями R₁ и R₂. Аминогруппа может иметь заместители.“Amino group” means an R ₁ R ₂ N group optionally substituted or unsubstituted with the same substituents R ₁ and R ₂ . An amino group may have substituents.

«Активный компонент» (лекарственное вещество, лекарственная субстанция, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего) происхождения, обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства)."Active component" (drug substance, drug substance, drug-substance) means a physiologically active substance of synthetic or other (biotechnological, plant, animal, microbial and other) origin, having pharmacological activity and is the active principle of the pharmaceutical composition used for the manufacture and manufacture medicinal product (means).

«Галоген» означает фтор, хлор, бром и иод. Предпочтительными являются фтор, хлор и бром.“Halogen” means fluoro, chloro, bromo and iodo. Fluorine, chlorine and bromine are preferred.

«Метин» представляет собой группу из одного атома углерода и одного атома водорода СН."Metin" is a group of one carbon atom and one hydrogen atom CH.

«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции) в виде таблеток, капсул, инъекций, мазей и других готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.“Medicinal product (preparation)” - a substance (or a mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition) in the form of tablets, capsules, injections, ointments and other formulations intended to restore, correct or alter physiological functions in humans and animals, as well as for treatment and disease prevention, diagnosis, anesthesia, contraception, cosmetology and more.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя активный компонент и по крайней мере один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных, распределяющих и воспринимающих средств, средств доставки, таких как консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, антибактериальные агенты, фунгициды, лубриканты, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Примерами суспендирующих агентов являются этоксилированный изостеариловый спирт, полиоксиэтилен, сорбитол и сорбитовый эфир, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также смеси этих веществ. Защита от действия микроорганизмов может быть обеспечена с помощью разнообразных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, таких как парабены, хлорбутанол, сорбиновая кислота и подобные им соединения. Композиция может включать также изотонические агенты, например сахара, хлористый натрий и им подобные. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, альгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, трансдермального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, местного или ректального введения активного начала, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, жевательные резинки и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, такие как мази и кремы, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные или внутриглазные формы введения и ректальные формы введения."Pharmaceutical composition" means a composition comprising an active component and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, solvents, diluents, carriers, excipients, distributing and perceiving means, delivery vehicles, such as preservatives, stabilizers, fillers, grinders, moisturizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, sweeteners, perfumes, flavors, antibacterial and cients, fungicides, lubricants, and prolonged delivery controllers, the choice and suitable proportions of which depend on the nature and way of administration and dosage. Examples of suspending agents are ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene, sorbitol and sorbitol ether, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth, as well as mixtures of these substances. Protection against the action of microorganisms can be achieved using a variety of antibacterial and antifungal agents, for example, such as parabens, chlorobutanol, sorbic acid and the like. The composition may also include isotonic agents, for example, sugars, sodium chloride and the like. The prolonged action of the composition can be achieved using agents that slow down the absorption of the active principle, for example aluminum monostearate and gelatin. Examples of suitable carriers, solvents, diluents and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, and also mixtures thereof, vegetable oils (such as olive oil) and injectable organic esters (such as ethyl oleate). Examples of excipients are lactose, milk sugar, sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate and the like. Examples of grinders and distributors are starch, alginic acid and its salts, silicates. Examples of lubricants are magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, talc, and high molecular weight polyethylene glycol. The pharmaceutical composition for oral, sublingual, transdermal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, local or rectal administration of the active principle, alone or in combination with another active principle, can be administered to animals and humans in a standard administration form in the form of a mixture with traditional pharmaceutical carriers. Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, gelatine capsules, pills, powders, granules, chewing gums and oral solutions or suspensions, sublingual and buccal administration forms, aerosols, implants, topical, transdermal such as ointments and creams, subcutaneous , intramuscular, intravenous, intranasal or intraocular administration forms and rectal administration forms.

«Фармацевтически приемлемая соль» означает относительно нетоксичные органические и неорганические соли кислот и оснований, заявленных в настоящем изобретении. Эти соли могут быть получены in situ в процессе синтеза, выделения или очистки соединений или приготовлены специально. В частности, соли оснований могут быть получены специально, исходя из очищенного свободного основания заявленного соединения и подходящей органической или неорганической кислоты. Примерами полученных таким образом солей являются гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, дихлорацетаты, оксалаты, валериаты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, мезилаты, малонаты, салицилаты, пропионаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, сульфаматы и им подобные. (Подробное описание свойств таких солей можно найти в справочнике фармацевтических солей [Р.Н. Stahl, C.G. Wermuth (Eds.). Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection, and Use. VHCA, Verlag Helvetica Chimica Acta,

, Switzerland, and Wiley-VCH, Weinheim, Germany. 2002].) Соли заявленных кислот также могут быть специально получены реакцией очищенной кислоты с подходящим основанием, при этом могут быть синтезированы соли металлов и аминов. К металлическим относятся соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния, лития и алюминия, наиболее желательными из которых являются соли натрия и калия. Подходящими неорганическими основаниями, из которых могут быть получены соли металлов, являются гидроксид, карбонат, бикарбонат и гидрид натрия, гидроксид и бикарбонат калия, поташ, гидроксид лития, гидроксид кальция, гидроксид магния, гидроксид цинка. В качестве органических оснований, из которых могут быть получены соли заявленных кислот, выбраны амины и аминокислоты, обладающие достаточной основностью, чтобы образовать устойчивую соль, и пригодные для использования в медицинских целях (в частности, они должны обладать низкой токсичностью). К таким аминам относятся аммиак, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, бензиламин, дибензиламин, дициклогексиламин, пиперазин, этилпиперидин, трис(гидроксиметил)аминометан и подобные им. Кроме того, для солеобразования могут быть использованы гидроокиси тетраалкиламмония, например, такие как холин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний и им подобные. В качестве аминокислот могут быть использованы основные аминокислоты - лизин, орнитин и аргинин.“Pharmaceutically acceptable salt” means the relatively non-toxic organic and inorganic salts of the acids and bases of the present invention. These salts can be obtained in situ during the synthesis, isolation or purification of the compounds or prepared specially. In particular, base salts can be prepared on the basis of the purified free base of the claimed compound and a suitable organic or inorganic acid. Examples of salts thus obtained are hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, bisulfates, phosphates, nitrates, acetates, dichloroacetates, oxalates, valeriates, oleates, palmitates, stearates, laurates, borates, benzoates, lactates, tosylates, citrates, maleates, fumarates, c tartrates, mesylates, malonates, salicylates, propionates, ethanesulfonates, benzenesulfonates, sulfamates and the like. (A detailed description of the properties of such salts can be found in the Handbook of Pharmaceutical Salts [R. N. Stahl, CG Wermuth (Eds.). Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection, and Use. VHCA, Verlag Helvetica Chimica Acta,

, Switzerland, and Wiley-VCH, Weinheim, Germany. 2002].) Salts of the claimed acids can also be specially prepared by reacting the purified acid with a suitable base, and metal and amine salts can be synthesized. Metal salts include sodium, potassium, calcium, barium, zinc, magnesium, lithium and aluminum salts, the most desirable of which are sodium and potassium salts. Suitable inorganic bases from which metal salts can be obtained are hydroxide, carbonate, sodium bicarbonate and hydride, potassium hydroxide and bicarbonate, potash, lithium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, zinc hydroxide. As organic bases from which salts of the claimed acids can be obtained, amines and amino acids are selected that are sufficiently basic to form a stable salt and are suitable for medical use (in particular, they should have low toxicity). Such amines include ammonia, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, ethylamine, diethylamine, triethylamine, benzylamine, dibenzylamine, dicyclohexylamine, piperazine, ethylpiperidine, tris (hydroxymethyl) aminomethane and the like. In addition, tetraalkylammonium hydroxides, for example, such as choline, tetramethylammonium, tetraethylammonium and the like, can be used for salt formation. As amino acids, the main amino acids can be used - lysine, ornithine and arginine.

Цель настоящего изобретения заключается в создании новых ингибиторов JAK для лечения ревматоидного артрита, рака и других заболеваний.An object of the present invention is to provide novel JAK inhibitors for the treatment of rheumatoid arthritis, cancer and other diseases.

Поставленная цель достигается 2-(3-(4-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-1-ил)-1-(этилсульфонил)азетидин-3-ил)ацетонитрила геминафтилдисульфонатом формулы 1:The goal is achieved 2- (3- (4- (7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl) -1H-pyrazol-1-yl) -1- (ethylsulfonyl) azetidin-3-yl) acetonitrile heminaphthyldisulfonate of the formula 1:

Предметом настоящего изобретения является новый JAK ингибитор общей формулы 1.The subject of the present invention is a new JAK inhibitor of general formula 1.

Соединение 1 по настоящему изобретению может также включать все изотопы атомов, присутствующих в соединении 1. Изотопы включают атомы, имеющие одинаковый атомный номер, но разные массовые числа. Например, изотопы водорода включают тритий и дейтерий.Compound 1 of the present invention may also include all isotopes of atoms present in compound 1. Isotopes include atoms having the same atomic number but different mass numbers. For example, hydrogen isotopes include tritium and deuterium.

Соединение 1 по настоящему изобретению может быть получено с использованием известных методов органического синтеза и может быть синтезировано в соответствии с любым из многочисленных возможных путей синтеза. Реакция для получения соединения по изобретению может быть осуществлена в подходящих растворителях, которые могут быть легко выбраны специалистом в области органического синтеза. Данная реакция может быть осуществлена в одном растворителе или в смеси растворителей. В зависимости от конкретной стадии реакции подходящие растворители для конкретной стадии реакции могут быть выбраны специалистом в данной области.Compound 1 of the present invention can be obtained using known methods of organic synthesis and can be synthesized in accordance with any of the many possible synthetic routes. The reaction for the preparation of a compound of the invention can be carried out in suitable solvents, which can be easily selected by one skilled in the art of organic synthesis. This reaction can be carried out in one solvent or in a mixture of solvents. Depending on the particular reaction step, suitable solvents for the particular reaction step may be selected by one skilled in the art.

Ингибирующая активность и селективность соединения формулы 1 по отношению к JAK сопоставимы с активностью и селективностью Барицитиниба, который в настоящее время проходит фазу III клинических испытаний [NCT02340104; NCT02263911; NCT01710358; J.D. Clark, М.Е. Flanagan, J.-В. Telliez. Discovery and Development of Janus Kinase (JAK) Inhibitors for Inflammatory Diseases. J. Med. Chem. 2014, 57, 5023-5038].The inhibitory activity and selectivity of the compound of formula 1 with respect to JAK is comparable to the activity and selectivity of Baricitinib, which is currently undergoing phase III clinical trials [NCT02340104; NCT02263911; NCT01710358; J.D. Clark, M.E. Flanagan, J.-B. Telliez. Discovery and Development of Janus Kinase (JAK) Inhibitors for Inflammatory Diseases. J. Med. Chem. 2014, 57, 5023-5038].

Преимуществом нового соединения формулы 1 является и несколько более высокая растворимость в водных растворах, чем у Барицитиниба (Таблица 2). Так, например, растворимость ингибитора 1 в воде при рН=7 равна 1 мг/мл, в то время как у Барицитиниба в нейтральной среде растворимость полностью отсутствует.An advantage of the new compound of formula 1 is also a slightly higher solubility in aqueous solutions than that of Baricitinib (Table 2). So, for example, the solubility of inhibitor 1 in water at pH = 7 is 1 mg / ml, while in baricitinib in a neutral medium, solubility is completely absent.

Преимуществом соединения 1 являются двукратно лучшие по сравнению с Барицитинибом показатели АДМЕ теста Р_арр А-В (СаСо-2), которые свидетельствуют о лучшем проникновении через клеточную мембрану в клетку, что, в свою очередь, является предпосылкой для лучшей биодоступности при пероральном применении.The advantage of compound 1 is the twice as good as in comparison with Baricitinib ADM test parameters P _arr A-B (CaCo-2), which indicate better penetration through the cell membrane into the cell, which, in turn, is a prerequisite for better oral bioavailability.

Лучшие значения проникновения в клетку в тесте СаСо-2 могут свидетельствовать о потенциально лучшей биодоступности препарата при пероральном применении.The best values of cell penetration in the CaCO-2 test may indicate a potentially better bioavailability of the drug when administered orally.

Основным преимуществом препарата формулы 1 является более высокая активность in vivo по сравнению с Барицитиниб-основанием, что может быть объяснено лучшей биодоступностью ввиду несколько большей растворимости и заметного ускорения проникновения к клетки СаСо-2. Лучшая in vivo активность препарата формулы 1 продемонстирована на модели ревматоидного артрита, вызванного коллагеном.The main advantage of the preparation of formula 1 is a higher in vivo activity compared to baricitinib base, which can be explained by better bioavailability due to a slightly greater solubility and a noticeable acceleration of CaCo-2 cell penetration. The best in vivo activity of a preparation of formula 1 was demonstrated in a collagen-induced rheumatoid arthritis model.

Динамика развития ревматоидного артрита по всем лапам животных приведена на Фиг. 1. На Фиг. 2 приведены данные показателей по группам в конце исследования. Видно, что наибольшую эффективность показала новая соль Барицитиниба - ZD19-0002 (препарат формулы 1) - снижение признаков ревматоидного артрита на 60%. На Фиг. 3 и 4 приведены данные по развитию ревматоидного артрита на терапевтических лапах (с признаками ревматоидного артрита на момент рандомизации по группам). Эффективность препаратов была ниже, чем при оценке по все лапам, но общая картина сохранилась - ZD19-0002 (препарат формулы 1) наиболее эффективен. На Фиг. 5 и 6 приведены данные по развитию ревматоидного артрита на профилактических лапах (без признаков ревматоидного артрита на момент рандомизации по группам). Сравнимый эффект наблюдается как в группе, получавшей ZD19-0002 (препарат формулы 1) в дозе 20 мг/кг 2 раза в день, так и в группе, получавшей ZD19-0001 (Барицитиниб-основание).The development dynamics of rheumatoid arthritis in all paws of animals is shown in FIG. 1. In FIG. 2 shows the data of indicators for groups at the end of the study. It is seen that the most effective was shown by the new salt of Baricitinib - ZD19-0002 (a preparation of formula 1) - a 60% reduction in the signs of rheumatoid arthritis. In FIG. Figures 3 and 4 show data on the development of rheumatoid arthritis on therapeutic paws (with signs of rheumatoid arthritis at the time of randomization in groups). The effectiveness of the preparations was lower than when assessed for all paws, but the overall picture was preserved - ZD19-0002 (a preparation of formula 1) is most effective. In FIG. Figures 5 and 6 show data on the development of rheumatoid arthritis on prophylactic paws (without signs of rheumatoid arthritis at the time of randomization in groups). A comparable effect is observed both in the group receiving ZD19-0002 (a preparation of formula 1) at a dose of 20 mg / kg 2 times a day, and in the group receiving ZD19-0001 (baricitinib base).

Настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы 1, который заключается в реакции двух молярных эквивалентов соединения формулы 1а (основания Барицитиниба) с одним эквивалентом нафталиндисульфокислоты в подходящем растворителе или смеси растворителей, при этом выход соединения формулы 1 может быть количественный, что выгодно отличает соединение формулы 1 от других солей Барицитиниба и существенно упрощает технологию синтеза.The present invention relates to a method for producing a compound of formula 1, which consists of reacting two molar equivalents of a compound of formula 1a (baricitinib base) with one equivalent of naphthalene disulfonic acid in a suitable solvent or mixture of solvents, while the yield of the compound of formula 1 can be quantitative, which distinguishes the compound of formula 1 from other salts of Baricitinib and greatly simplifies the synthesis technology.

Способ получения соединения формулы 1 включает взаимодействие соединения формулы 1а с 1,5-нафталин дисульфокислотой путем обработки раствора свободного основания формулы 1а в органическом растворителе, таком как этанол (EtOH), раствором кислоты в органическом растворителе, таком как этанол, при комнатной температуре или при повышенной температуре (например, от 60°С до 70°С). Полученная соль в случае необходимости может быть дополнительно очищена перекристаллизацией или другими общеизвестными методами, например переосаждением или промывкой.A process for preparing a compound of formula 1 involves reacting a compound of formula 1a with 1,5-naphthalene disulfonic acid by treating a solution of the free base of formula 1a in an organic solvent such as ethanol (EtOH), an acid solution in an organic solvent such as ethanol at room temperature or at elevated temperature (for example, from 60 ° C to 70 ° C). The salt obtained, if necessary, can be further purified by recrystallization or other well-known methods, for example, reprecipitation or washing.

Соединение формулы 1 может быть получено в соответствии с синтетическими протоколами, описанными ниже в разделе примеров.The compound of formula 1 can be obtained in accordance with the synthetic protocols described below in the examples section.

Соединение формулы 1 по настоящему изобретению может модулировать активность одной или более JAK. Термин «модулировать» означает способность увеличивать или уменьшать активность одного или нескольких членов семьи JAK. Соответственно, соединение формулы 1 по изобретению может быть использовано в способах модуляции активности JAK.The compound of formula 1 of the present invention can modulate the activity of one or more JAKs. The term “modulate” means the ability to increase or decrease the activity of one or more members of the JAK family. Accordingly, the compound of formula 1 according to the invention can be used in methods for modulating JAK activity.

В соответствии с настоящим изобретением соединение формулы 1 может действовать в качестве ингибитора одной или нескольких JAK.In accordance with the present invention, a compound of formula 1 may act as an inhibitor of one or more JAKs.

В соответствии с настоящим изобретением соединение формулы 1 может быть использовано для модуляции активности JAK у пациента, который нуждается в такой модуляции рецептора, путем введения модулирующего количества соединения формулы 1.In accordance with the present invention, a compound of formula 1 can be used to modulate JAK activity in a patient who needs such modulation of the receptor by introducing a modulating amount of a compound of formula 1.

Предметом настоящего изобретения является способ лечения заболеваний или расстройств у пациентов, связанных с JAK, путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения формулы 1 по настоящему изобретению или его фармацевтической композиции.An object of the present invention is a method of treating diseases or disorders in patients associated with JAK by administering to a patient in need of such treatment a therapeutically effective amount of a compound of formula 1 of the present invention or a pharmaceutical composition thereof.

JAK-связанное заболевание может включать в себя любое заболевание, расстройство или состояние, непосредственно или косвенно связанное с экспрессией или активностью в JAK, в том числе гиперэкспрессией и/или аномальным уровнем активности. JAK-сопутствующее заболевание может также включать любое заболевание, расстройство или состояние, которое может быть предотвращено, облегчено или вылечено путем модуляции JAK активности.A JAK-related disease can include any disease, disorder or condition directly or indirectly associated with expression or activity in a JAK, including overexpression and / or an abnormal level of activity. A JAK concomitant disease may also include any disease, disorder or condition that can be prevented, ameliorated or cured by modulating JAK activity.

Предметом настоящего изобретения является способ лечения JAK-ассоциированных аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, ювенильный артрит, псориатический артрит, диабет типа I, волчанка, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, миастения, нефропатия иммуноглобулинов, аутоиммунные заболевания щитовидной железы и тому подобное.The subject of the present invention is a method for treating JAK-associated autoimmune diseases such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, psoriatic arthritis, type I diabetes, lupus, psoriasis, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn’s disease, myasthenia gravis, immunoglobulin nephropathy, and immunoglobulins, thyroid disease and the like.

В соответствии с настоящим изобретением соединение формулы 1 может быть введено пациенту в виде фармацевтических композиций. Эти композиции могут быть получены способом, хорошо известным в фармацевтической области, и могут быть введены различными способами в зависимости от того, требуется местное или системное лечение и на площади, подлежащей обработке. Композиции могут быть в форме таблеток, пилюль, порошков, лепешек, облаток, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (как твердое вещество или в жидкой среде), мазей, содержащих, например, до 10% по весу активного соединения, мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных инъекционных растворов и стерильно упакованных порошков. Композиции могут быть приготовлены в виде единичной дозы, причем каждая доза содержит примерно от 5 мг до 1000 мг, обычно предпочтительно от 100 мг до 500 мг активного ингредиента. Термин «единичные дозы» относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для человека и других млекопитающих, причем каждая единица содержит заданное количество активного материала, рассчитанное на получение желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с подходящим фармацевтическим наполнителем.In accordance with the present invention, a compound of formula 1 can be administered to a patient in the form of pharmaceutical compositions. These compositions can be obtained by a method well known in the pharmaceutical field, and can be administered in various ways depending on whether local or systemic treatment is required and on the area to be treated. The compositions may be in the form of tablets, pills, powders, lozenges, wafers, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, syrups, aerosols (as a solid or in a liquid medium), ointments containing, for example, up to 10% by weight of the active compound, soft and hard gelatin capsules, suppositories, sterile injectable solutions and sterile packaged powders. The compositions may be prepared in unit dosage form, each dose containing from about 5 mg to 1000 mg, usually preferably from 100 mg to 500 mg of the active ingredient. The term "unit dose" refers to physically discrete units suitable as unit doses for humans and other mammals, each unit containing a predetermined amount of active material, calculated to produce the desired therapeutic effect, in combination with a suitable pharmaceutical excipient.

Активное соединение может быть эффективным в широком диапазоне доз и обычно вводится в фармацевтически эффективном количестве. Следует понимать, однако, что количество фактически принимаемого соединения обычно будет определяться лечащим врачом в соответствии с состоянием пациента, подлежащего лечению.The active compound can be effective over a wide range of doses and is usually administered in a pharmaceutically effective amount. It should be understood, however, that the amount of actually taken compound will usually be determined by the attending physician in accordance with the condition of the patient to be treated.

Данное изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.

Фиг. 1. Динамика развития ревматоидного артрита по всем лапам животных в модели ревматоидного артрита, вызванного коллагеном, у мышей при лечении ZD19-0002 (препарат формулы 1) и ZD19-0001(Барицитиниб-основание).FIG. 1. The dynamics of the development of rheumatoid arthritis in all paws of animals in a model of collagen-induced rheumatoid arthritis in mice in the treatment of ZD19-0002 (preparation of formula 1) and ZD19-0001 (baricitinib base).

Фиг. 2. Усредненные значения клинических показателей по всем лапам животных в модели ревматоидного артрита, вызванного коллагеном, у мышей при лечении ZD19-0002 (препарат формулы 1) и ZD19-0001 (Барицитиниб-основание).FIG. 2. The average values of clinical indicators for all paws of animals in the model of rheumatoid arthritis caused by collagen in mice in the treatment of ZD19-0002 (preparation of formula 1) and ZD19-0001 (baricitinib base).

Фиг. 3. Динамика развития ревматоидного артрита по терапевтическим лапам животных в модели ревматоидного артрита, вызванного коллагеном, у мышей при лечении ZD19-0002 (препарат формулы 1) и ZD19-0001 (Барицитиниб-основание).FIG. 3. The dynamics of the development of rheumatoid arthritis by the therapeutic paws of animals in a model of collagen-induced rheumatoid arthritis in mice in the treatment of ZD19-0002 (preparation of formula 1) and ZD19-0001 (baricitinib base).

Фиг. 4. Усредненные значения клинических показателей по терапевтическим лапам животных в модели ревматоидного артрита, вызванного коллагеном, у мышей при лечении ZD19-0002 и ZD19-0001.FIG. 4. The average values of clinical indicators for therapeutic paws of animals in the model of rheumatoid arthritis caused by collagen in mice in the treatment of ZD19-0002 and ZD19-0001.

Фиг. 5. Динамика развития ревматоидного артрита по профилактическим лапам животных в модели ревматоидного артрита, вызванного коллагеном, у мышей при лечении ZD19-0002 (препарат формулы 1) и ZD19-0001 (Барицитиниб-основание).FIG. 5. The dynamics of the development of rheumatoid arthritis by the prophylactic paws of animals in a model of collagen-induced rheumatoid arthritis in mice in the treatment of ZD19-0002 (preparation of formula 1) and ZD19-0001 (Baricitinib base).

Фиг. 6. Усредненные значения клинических показателей по профилактическим лапам животных в модели ревматоидного артрита, вызванного коллагеном, у мышей при лечении ZD19-0002 (препарат формулы 1) и ZD19-0001 (Барицитиниб-основание).FIG. 6. The average values of clinical indicators for the preventive paws of animals in the model of rheumatoid arthritis caused by collagen in mice in the treatment of ZD19-0002 (preparation of formula 1) and ZD19-0001 (baricitinib base).

Ниже изобретение будет описано более подробно с помощью конкретных примеров, которые представлены с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом. Специалисты в данной области техники легко поймут различие некритических параметров, которые могут быть изменены или модифицированы, чтобы получить те же результаты.Below the invention will be described in more detail using specific examples, which are presented for purposes of illustration and are not intended to limit the invention in any way. Specialists in the art will easily understand the difference in non-critical parameters that can be changed or modified to obtain the same results.

Пример 1. Метод синтеза 2-(3-(4-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил)-1-(этилсульфонил)азетидин-3-ил)ацетонитрила геминафтилдисульфоната (1)Example 1. Method for the synthesis of 2- (3- (4- (7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl) -1H-pyrazol-1-yl) -1- (ethylsulfonyl) azetidin-3-yl ) acetonitrile heminaphthyldisulfonate (1)

2-(3-(4-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил)-1-(этилсульфонил)азетидин-3-ил)ацетонитрила геминафтилдисульфонат (1) получали в соответствии со схемой 1:2- (3- (4- (7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl) -1H-pyrazol-1-yl) -1- (ethylsulfonyl) azetidin-3-yl) acetonitrile geminaphthyldisulfonate (1 ) were obtained in accordance with scheme 1:

К нагретому до 60°С раствору {1-(этилсульфонил)-3-[4-(7Н-пирроло[2,3-d]пиpимидин-4-ил)-1H-пиpaзoл-1-ил]азетидин-3-ил}ацетонитрила (300 мг, 0.808 ммоль, 1 экв.) в ацетонитриле (40 мл) был прибавлен раствор тетрагидрата нафтил-1,5-дисульфокислоты (145.6 мг, 0.404 ммоль, 0.5 экв) в ацетонитриле (V=2 мл). Реакционная масса перемешивалась при 60°С 2 часа, затем выдержана при кипении 10 мин. Реакционная масса охлаждена до комнатной температуры, осадок отфильтрован и высушен. Выход 2-(3-(4-(7Н-пирроло[2,3-d]пиримидин-4-ил)-1Н-пиразол-1-ил)-1-(этилсульфонил)азетидин-3-ил)ацетонитрила геминафтилдисульфоната 379 мг, 91%. При охлаждении реакционной массы до -10°С в течение 16 часов выход продукта повышается до 408 мг, 98%.To a solution of {1- (ethylsulfonyl) -3- [4- (7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl) -1H-pyrazol-1-yl] azetidin-3-yl heated to 60 ° C } acetonitrile (300 mg, 0.808 mmol, 1 equiv.) in acetonitrile (40 ml) was added a solution of naphthyl-1,5-disulfonic acid tetrahydrate (145.6 mg, 0.404 mmol, 0.5 equiv) in acetonitrile (V = 2 ml). The reaction mass was stirred at 60 ° C for 2 hours, then kept at boiling for 10 minutes. The reaction mass is cooled to room temperature, the precipitate is filtered and dried. Yield of 2- (3- (4- (7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-4-yl) -1H-pyrazol-1-yl) -1- (ethylsulfonyl) azetidin-3-yl) acetonitrile heminaphthyl disulfonate 379 mg, 91%. When the reaction mixture was cooled to -10 ° C for 16 hours, the product yield increased to 408 mg, 98%.

Пример 2. Определение ингибирующей активности соединений по отношению к JAKExample 2. Determination of the inhibitory activity of compounds against JAK

Соединения тестировали в соответствии со стандартным протоколом Z'-Lyte скрининга компании Life Technologies). Тест соединения проверяются в 1% ДМСО (окончательный) в скважине. 100 нл 100х тестируемых соединений в 100% ДМСО добавляют в 2,4 мкл киназного буфера (50 мМ HEPES, рН6.5, 0,01% BRIJ-35, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ EGTA, 0,02% NaN₃) в условиях низкой объемной NBS, черный 384 -Ну пластины (Corning Кат. # 4514). После этого добавляют к 5 мкл 2Х пептида / киназы смесь (Туr06 / JAK1, окончательные концентрации 21.2 - 91.5 нг JAK1 и 2 мкМ Тир 06) и 2,5 мкл 4хАТР (конечная концентрация 75 мкМ) добавляют в киназный буфер. Через 30 сек инкубации на шейкере реакцию киназы инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. После этого добавляют 5 мкл 1:128 разбавленного реагента А и инкубируют в течение еще 60 мин при комнатной температуре. Флуоресценция была измерена при возбуждении длиной волны 400 нм и эмиссии при 445 и 520 нм. Степень фосфорилирования FRET-пептида может быть рассчитана из соотношения выбросов. Коэффициент выбросов будет оставаться низким, если лада-пептид фосфорилируется (т.е. нет ингибирования киназы) и будет высоким, если лада-пептид не фосфорилирован (т.е. киназа ингибирована)Compounds were tested in accordance with Life Technologies standard Z'-Lyte screening protocol). Test compounds are tested in 1% DMSO (final) in the well. 100 nl 100x test compounds in 100% DMSO are added to 2.4 μl kinase buffer (50 mM HEPES, pH6.5, 0.01% BRIJ-35, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM EGTA, 0.02% NaN ₃ ) under conditions of low volume NBS, black 384-well plate (Corning Cat. # 4514). After this, a mixture (Tyr06 / JAK1, final concentrations 21.2 - 91.5 ng JAK1 and 2 μM Tyr 06) is added to 5 μl of 2X peptide / kinase and 2.5 μl of 4xATP (final concentration of 75 μM) is added to the kinase buffer. After 30 seconds of incubation on a shaker, the kinase reaction was incubated for 60 min at room temperature. Then add 5 μl of 1: 128 diluted reagent A and incubate for another 60 min at room temperature. Fluorescence was measured with excitation at a wavelength of 400 nm and emission at 445 and 520 nm. The degree of phosphorylation of the FRET peptide can be calculated from the emission ratio. The emission factor will remain low if the Lada peptide is phosphorylated (i.e. there is no kinase inhibition) and will be high if the Lada peptide is not phosphorylated (i.e. the kinase is inhibited)

% фосфорилирования рассчитывается как% phosphorylation calculated as

,

,

% ингибирования рассчитывается как% inhibition is calculated as

,

,

где С_100%=средний сигнал эмиссии кумарина контроль 100% фосфорилирования;where C _100% = average coumarin emission signal control 100% phosphorylation;

С_0%=средний сигнал эмиссии кумарина контроль 0% фосфорилирования;C _0% = average coumarin emission signal; control 0% phosphorylation;

F_100%=средний сигнал эмиссии флуоресцеина контроль 100% фосфорилирования;F _100% = average fluorescein emission signal control 100% phosphorylation;

F_0%=средний сигнал эмиссии флуоресцеина контроль 0% фосфорилирования.F _0% = average fluorescein emission signal control 0% phosphorylation.

Концентрационная кривая зависимости активности киназы от концентрации тестируемых веществ построена с использованием сигмоидной модели.The concentration curve of the kinase activity versus the concentration of the tested substances was constructed using the sigmoid model.

Данные активности соединения формулы 1 и Барицитиниба по отношению к JAK1 представлены в таблице 1.The activity data of the compounds of formula 1 and Baricitinib in relation to JAK1 are presented in table 1.

Пример 3. Определение термодинамической растворимости соединения формулы 1 и прототипа БарицитинибаExample 3. Determination of the thermodynamic solubility of the compounds of formula 1 and the prototype Baricitinib

Смешивали 5 мг исследуемого соединения с 1 мл универсального буфера (pION) с рН=2,0; 4,0 или 7,0 в течение 15 мин при 25°С. Дополнительные количества веществ добавляли до тех пор, пока раствор не становился мутным. Виалы с раствором инкубировали при перемешивании в течение 24 ч при 25°С для достижения равновесия между раствором и осадком при насыщении. После уравновешивания 200 мкл раствора (в 2-х повторах) фильтровали через 96-луночный фильтровальный планшет (Millipore) для отделения осадка. Концентрацию соединений в фильтрате определяли спектрофотометрически с помощью стандартной калибровочной кривой. Проводили измерение спектра оптического поглощения вещества и построение калибровочной кривой при выбранной длине волны (обычно, соответствующей максимуму поглощения вещества λmax). Концентрацию вещества в фильтрате (т.е. растворимость) рассчитывали по нижеприведенной формуле:5 mg of the test compound was mixed with 1 ml of universal buffer (pION) with pH = 2.0; 4.0 or 7.0 for 15 minutes at 25 ° C. Additional amounts of substances were added until the solution became cloudy. Vials with solution were incubated with stirring for 24 hours at 25 ° C to achieve equilibrium between solution and precipitate at saturation. After equilibration, 200 μl of the solution (in 2 repetitions) was filtered through a 96-well filter plate (Millipore) to separate the precipitate. The concentration of compounds in the filtrate was determined spectrophotometrically using a standard calibration curve. The optical absorption spectrum of the substance was measured and a calibration curve was constructed at the selected wavelength (usually corresponding to the maximum absorption of the substance λmax). The concentration of the substance in the filtrate (i.e. solubility) was calculated by the formula below:

Solubility=(OD_λmax filtrate - OD_λmax blank)/Slope × 1,67 × Filtrate dilution,Solubility = (OD _λmax filtrate - OD _λmax blank) / Slope × 1.67 × Filtrate dilution,

где OD_λmax filtrate - оптическая плотность фильтрата;where OD _λmax filtrate is the optical density of the filtrate;

OD_λmax blank - оптическая плотность холостого раствора без вещества;OD _λmax blank is the optical density of a blank solution without a substance;

Slope - наклон калибровочной кривой;Slope - slope of the calibration curve;

1,67 - фактор разведения фильтрата ацетонитрилом;1.67 - dilution factor of the filtrate with acetonitrile;

Filtrate dilution - фактор разведения фильтрата буфером.Filtrate dilution - factor dilution of the filtrate with a buffer.

Полученные результаты представлены в Таблице 2.The results obtained are presented in Table 2.

Пример 4. Проницаемость в модели клеток кишечника линии Сасо-2Example 4. Permeability in a model of intestinal cell line Caco-2

Культивирование Сасо-2 клетокCultivation of Saso-2 cells

Линия клеток Сасо-2 была получена из АТСС (cat. # НТВ-37) и культивировалась согласно рекомендациям АТСС и Millipore [1] в 75 см² флаконах при 37°С и 5% СO₂. Клетки пересевали 2 раза в неделю в отношении 1:6.The Caco-2 cell line was obtained from ATCC (cat. # NTV-37) and cultivated according to the recommendations of ATCC and Millipore [1] in 75 cm ² bottles at 37 ° C and 5% CO ₂ . Cells were subcultured 2 times a week in a ratio of 1: 6.

Среда для Сасо-2 клеток: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 0.584 г/л L-глутамина, 10% бычьей сыворотки, 100 U/мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина, 2% незаменимые аминокислоты.Saso-2 Cell Medium: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 0.584 g / L L-Glutamine, 10% bovine serum, 100 U / ml penicillin and 0.1 mg / ml streptomycin, 2% essential amino acids.

Посадка клеток в плашкуPlating cells in the plate

Для проведения эксперимента Сасо-2 клетки 10-50 пассажа в состоянии 80-90% покрытия флакона рассаживают в планшеты с двухкомпонентными ячейками Millicell 96 в количестве 10000 на 0.11 см² лунку (90 909 клеток/см²). Дно внутренней части ячейки состоит из полупроницаемого фильтра, на котором образуется монослой клеток. Процедура посадки клеток в плашку:For the Saso-2 experiment, cells of passage 10-50 in a state of 80-90% of the coating of the vial are plated in tablets with two-component Millicell 96 cells in an amount of 10,000 per 0.11 cm ² well (90 909 cells / cm ² ). The bottom of the inner part of the cell consists of a semipermeable filter on which a monolayer of cells forms. The procedure for planting cells in the plate:

- снять клетки с помощью трипсина-ЭДТА;- remove cells using trypsin-EDTA;

- посчитать количество живых клеток в суспензии с помощью автоматического счетчика клеток и приготовить 10 мл суспензии с концентрацией 1.33×10⁵ клеток/мл;- calculate the number of living cells in suspension using an automatic cell counter and prepare 10 ml of a suspension with a concentration of 1.33 × 10 ⁵ cells / ml;

- добавить по 250 мкл среды в нижние лунки планшета;- add 250 μl of medium to the lower wells of the tablet;

- добавить по 75 мкл суспензии клеток в верхние лунки планшета Millicell 96.- Add 75 μl of cell suspension to the upper wells of a Millicell 96 plate.

Сасо-2 клетки инкубируют в планшете Millicell 96 в течение 21 дня со сменой среды 2 раза в неделю в первые 2 недели и 3 раза в последнюю (по 75 мкл среды добавляют в верхние и по 250 мкл в нижние лунки).Caco-2 cells are incubated in a Millicell 96 plate for 21 days with a change of medium 2 times a week in the first 2 weeks and 3 times in the last (75 μl of medium are added to the upper and 250 μl to the lower wells).

Целостность монослоя проверяют путем измерения электрического сопротивления (TEER) с помощью прибора Millicell-ERS. Приемлемым является значение TEER не менее 3 кОм/лунку.The integrity of the monolayer is checked by measuring the electrical resistance (TEER) using a Millicell-ERS instrument. An acceptable TEER of at least 3 kOhm / well is acceptable.

Протокол экспериментаExperiment Log

Рабочие растворыWorking solutions

1) 500 мл Буфера I (HBSS, 10 мМ HEPES, рН=7.4).1) 500 ml of Buffer I (HBSS, 10 mM HEPES, pH = 7.4).

2) 50 мл Буфера II (HBSS, 10 мМ HEPES, рН=7.4, 1% ДМСО).2) 50 ml of Buffer II (HBSS, 10 mM HEPES, pH = 7.4, 1% DMSO).

3) 50 мкл 100х стоков тестируемых веществ и контролей - 0.1 мМ в ДМСО.3) 50 μl of 100x stocks of the tested substances and controls - 0.1 mm in DMSO.

4) 50 мкл 200х стока родамина 123 - 2 мМ в ДМСО.4) 50 μl of 200x stock of rhodamine 123 - 2 mm in DMSO.

5) 50 мкл 2 мМ стока циклоспорина А в ДМСО.5) 50 μl of 2 mM runoff of cyclosporin A in DMSO.

6) Приготовить 10 мл Буфера III (HBSS. 10 мМ HEPES, рН=7.4, 10 мкМ циклоспорин А из 2 мМ ДМСО стока).6) Prepare 10 ml of Buffer III (HBSS. 10 mm HEPES, pH = 7.4, 10 μM cyclosporin A from 2 mm DMSO stock).

7) Приготовить из 100х ДМСО стоков 1.6 мл исходных растворов тестируемых веществ в буфере I:7) Prepare from 100x DMSO stocks 1.6 ml of stock solutions of test substances in buffer I:

16 мкл (0.1 мМ ДМСО стока)+1584 мкл буфера I. Финальная концентрация веществ - 1 мкМ.16 μl (0.1 mM DMSO runoff) +1584 μl of buffer I. The final concentration of substances is 1 μM.

8) Приготовить из 100х ДМСО стоков 0.8 мл исходных растворов контролен в буфере I:8) Prepare from 100x DMSO effluents 0.8 ml of stock solutions of control in buffer I:

8 мкл (0.1 мМ ДМСО стока)+792 мкл буфера I.8 μl (0.1 mM DMSO stock) +792 μl of buffer I.

9) Приготовить из 200х ДМСО стока 1600 мкл 10 мкМ исходных раствора родамина 123 с и без циклоспорина А в буфере I:9) Prepare from 200 × DMSO stock 1600 μl of 10 μM stock solution of rhodamine 123 with and without cyclosporin A in buffer I:

8 мкл (2 мМ ДМСО стока)+8 мкл (2 мМ ДМСО стока циклоспорина А или ДМСО)+1584 мкл буфера I.8 μl (2 mM DMSO drain) + 8 μl (2 mm DMSO cyclosporin A or DMSO drain) + 1584 μl of buffer I.

10) Приготовить 500 мл раствора MeCN:H₂O=1:1 с 50 нг/мл внутреннего стандарта толбутамида.10) Prepare 500 ml of a solution of MeCN: H ₂ O = 1: 1 with 50 ng / ml of the internal standard of tolbutamide.

ПрединкубацияPreincubation

1) Переместить Millicell 96 Сасо-2 систему из инкубатора и измерить TEER.1) Move Millicell 96 Caco-2 system from the incubator and measure TEER.

2) Удалить среду из всех 96 лунок с фильтром плашки Millicell 96 Сасо-2 и нижней части планшета.2) Remove the medium from all 96 wells with a Millicell 96 Caco-2 plate filter and the bottom of the plate.

3) Промыть клеточный монослой, добавляя по 100 мкл Буфера I в верхние и по 300 мкл в нижние лунки Millicell 96 Сасо-2 плашки. Удалить Буфер I сначала из верхних, затем из нижних лунок Millicell 96 Сасо-2 плашки. Повторить процесс промывки еще 2 раза. Оставить преинкубировать плашку с Буфером I в течение 30 минут при 37°С.3) Rinse the cell monolayer by adding 100 μl of Buffer I to the upper and 300 μl to the lower wells of Millicell 96 Caco-2 plates. Remove Buffer I first from the top, then from the bottom wells of a Millicell 96 Caco-2 plate. Repeat the flushing process 2 more times. Leave to pre-incubate the buffer I buffer for 30 minutes at 37 ° C.

Изучение транспортаStudy of transport

Изучали транспорт соединений в двух направлениях с целью выяснить вклад мембранных транспортеров. Контроли с высокой (пропранолол) и низкой (ранитидин) проницаемостью тестировали в направлении А-В, контролем транспорта с участием Pgp служит родамин 123, его транспорт проводили в обоих направлениях с и без добавления ингибитора Pgp циклоспорина А.We studied the transport of compounds in two directions in order to find out the contribution of membrane transporters. Controls with high (propranolol) and low (ranitidine) permeability were tested in the direction AB, transport control with Pgp was rhodamine 123, its transport was carried out in both directions with and without the addition of the cyclosporin A Pgp inhibitor.

4) Для определения скорости транспорта из апикальной (А) в базолатеральную (В) область [А-В] нужно: добавить по 90 мкл 1х тестируемого вещества в буфере с/без циклоспорина А в 3 лунки с фильтрами и по 250 мкл Буфера II или III в лунки нижней транспортной плашки.4) To determine the transport speed from the apical (A) to the basolateral (B) region [A-B], add: 90 μl of 1x test substance in buffer with / without cyclosporin A to 3 wells with filters and 250 μl of Buffer II or III to the wells of the lower transport plate.

5) Для определения скорости транспорта из базолатеральной (В) области в апикальную (А) [В-А] нужно: добавить по 90 мкл Буфера II или III в 3 лунки с фильтрами и по 250 мкл тестируемого вещества в буфере с/без циклоспорина А в нижние лунки плашки.5) To determine the speed of transport from the basolateral (B) region to the apical (A) [B-A], add: 90 μl of Buffer II or III to 3 wells with filters and 250 μl of the test substance in the buffer with / without cyclosporin A to the bottom wells of the plate.

6) Инкубировать собранную Millicell 96 Сасо-2 систему в течение 2 ч при 37°С на шейкере с перемешиванием при 300 об/мин.6) Incubate the assembled Millicell 96 Caco-2 system for 2 hours at 37 ° C on a shaker with stirring at 300 rpm.

7) Разъединить верхнюю и нижнюю части плашки.7) Separate the upper and lower parts of the die.

Работа с исходными растворамиWorking with stock solutions

8) Исходные растворы тестируемых веществ и контролей содержать в темном месте до конца инкубации (в течение 2 ч).8) Keep the stock solutions of the tested substances and controls in a dark place until the end of incubation (within 2 hours).

9) Перенести по 70 мкл исходных растворов тестируемых и контрольных веществ в подписанные пробирки на 1.1 мл, добавить по 210 мкл холодного 50% MeCN, содержащего 50 нг/мл толбутамида (внутренний стандарт). Перемешать и хранить при -80°С до анализа.9) Transfer 70 μl of the stock solutions of the tested and control substances to the signed 1.1 ml tubes, add 210 μl of cold 50% MeCN containing 50 ng / ml tolbutamide (internal standard). Stir and store at -80 ° C until analysis.

Измерение флуоресценции Родамина123Rhodamine Fluorescence Measurement123

Для оценки проницаемости родамина 123 с и без циклоспорина А проводят измерения флуоресценции (Ех.485/Еm.535 нм) предварительно разведенных образцов:To assess the permeability of rhodamine 123 with and without cyclosporine A, fluorescence measurements (Ex.485 / Em.535 nm) of pre-diluted samples are carried out:

1) 2 мкл (исходного раствора)+58 мкл (буфер II или III для проб с/без циклоспорина).1) 2 μl (stock solution) +58 μl (buffer II or III for samples with / without cyclosporine).

2) 2 мкл (донорный апикальный (DA) и базолатеральный (DB) образцы)+58 мкл (буфер II или III для проб с/без циклоспорина).2) 2 μl (donor apical (DA) and basolateral (DB) samples) +58 μl (buffer II or III for samples with / without cyclosporine).

3) 60 мкл - акцепторный апикальный (А) и базолатеральный (В) образцы.3) 60 μl - acceptor apical (A) and basolateral (B) samples.

Подготовка образцов к анализуSample preparation for analysis

По 70 мкл растворов отбираются из верхней и нижней плашек в отдельные пробирки в штативе, затем к ним добавляется по 210 мкл холодного 50% MeCN, содержащего 50 нг/мл толбутамида (внутренний стандарт). Манипуляции выполняются с помощью автоматизированной станции Biomek FX.70 μl of solutions are taken from the upper and lower dies into separate tubes in a rack, then 210 μl of cold 50% MeCN containing 50 ng / ml tolbutamide (internal standard) is added to them. Manipulations are performed using the Biomek FX automated station.

Образцы хранят при -80°С до ВЭЖХ-МС/МС анализа.Samples were stored at -80 ° C until HPLC-MS / MS analysis.

Обработка данных, расчетыData processing, calculations

Для количественного определения использовали ВЭЖХ-МС/МС систему QTRAP 5500 (Applied Biosystems) с хроматографом Agilent Infinity 1290 (Agilent Technologies). Параметры хроматографии и детекции подбирались для достижения максимальной чувствительности при приемлемом времени анализа.For quantification, an HPLC-MS / MS QTRAP 5500 system (Applied Biosystems) with an Agilent Infinity 1290 chromatograph (Agilent Technologies) was used. The parameters of chromatography and detection were selected to achieve maximum sensitivity at an acceptable analysis time.

Площади под хроматографическими пиками аналита, нормированные на сигнал внутреннего стандарта (AUC/IS), считали в программе Analyst 1.5.2 и использовали для расчетов.The areas under the chromatographic peaks of the analyte normalized to the internal standard signal (AUC / IS) were calculated in Analyst 1.5.2 and used for calculations.

Проницаемость (Рарр, см/с) через монослой Сасо-2 клеток оценивается по формуле:Permeability (Rarr, cm / s) through a monolayer of Caco-2 cells is estimated by the formula:

,

,

где V_A - объем (мл) в акцепторной лунке, который равен 0.25 для транспорта [А-В] и 0.09 для транспорта [В-А];where V _A is the volume (ml) in the acceptor well, which is 0.25 for transport [A-B] and 0.09 for transport [B-A];

Area - площадь поверхности (см²), составляет 0,11 см² для 96-луночной MultiScreen Сасо-2 плашки;Area - surface area (cm ² ), is 0.11 cm ² for 96-well MultiScreen Saso-2 dies;

Time - время транспорта (7200 с);Time - transport time (7200 s);

С_А(t) - AUC/IS вещества в акцепторной лунке после эксперимента;C _A (t) - AUC / IS of the substance in the acceptor well after the experiment;

C_D(0) - AUC/IS исходного раствора вещества в донорной лунке.C _D (0) - AUC / IS of the initial solution of the substance in the donor well.

Для родамина 123 отношение

определяется по флуоресценции.For rhodamine 123 ratio

determined by fluorescence.

Считают проницаемость (Р_арр) вещества.Consider the permeability (P _arr ) of the substance.

Пример 5. Исследование эффективности в модели ревматоидного артрита, вызванного коллагеномExample 5. The study of effectiveness in the model of rheumatoid arthritis caused by collagen

В дни 0 и 21 животных анестезировали Изофлураном и вводили подкожно в основание хвоста 100 мкл коллагена 2го типа в полном адъюванте Фрейнда. В период с 18 по 35 дни проявляются признаки ревматоидного артрита. Животных рандомизировали по группам после опухания хотя бы одной лапы (клинический показатель 1). Старались, чтобы средний показатель в группах на момент рандомизации был на уровне 0.25. Всего будет использовано как минимум 8 животных в группе.On days 0 and 21, the animals were anesthetized with Isoflurane and injected subcutaneously at the base of the tail with 100 μl of type 2 collagen in Freund's complete adjuvant. In the period from 18 to 35 days, signs of rheumatoid arthritis are manifested. Animals were randomized in groups after swelling of at least one paw (clinical indicator 1). They tried to ensure that the average indicator in groups at the time of randomization was at the level of 0.25. In total, at least 8 animals in the group will be used.

После рандомизации (день 1 ревматоидного артрита) начинают лечение животных согласно таблице ниже. Ежедневно оценивали показатель лап животных. Эффективность исследуемых веществ оценивали на основе AUC, построенных на основе показателей лап, и по данным гистологии передних и задних лап. Оценивали как потенциальную терапевтическую эффективность (по индивидуальным лапам со значениями показателя >0 в момент рандомизации), так и потенциальную профилактическую эффективность (по индивидуальным лапам со значениями показателя =0 в момент рандомизации).After randomization (day 1 of rheumatoid arthritis), animals are treated according to the table below. Daily estimated rate of paws of animals. The effectiveness of the studied substances was evaluated on the basis of AUC, built on the basis of the parameters of the paws, and according to the histology of the fore and hind legs. We evaluated both potential therapeutic efficacy (for individual paws with indicator values> 0 at the time of randomization) and potential preventive efficacy (for individual paws with indicator values = 0 at the time of randomization).

BID - введение 2 раза в сутки с интервалом 10-12 часов.BID - administration 2 times a day with an interval of 10-12 hours.

Также в ходе исследования определяли вес животных и оценивали признаки токсичности исследуемых веществ. В день 11 ревматоидного артрита животных анестезировали Изофлураном и подвергали некропсии.Also, during the study, the weight of the animals was determined and signs of toxicity of the test substances were evaluated. On day 11 of the rheumatoid arthritis, the animals were anesthetized with Isoflurane and subjected to necropsy.

Индукция ревматоидного артритаRheumatoid Arthritis Induction

Коллаген готовили в виде раствора с концентрацией 4 мг/мл в 0.01N уксусной кислоте. Равные объемы раствора коллагена (4 мг/мл) и полного адъюванта Фрейнда (5 мг/мл) с добавлением Micro-tuberculosis bacterium (МТВ) были смешаны для получения эмульсии в течение 5 мин.Collagen was prepared in the form of a solution with a concentration of 4 mg / ml in 0.01N acetic acid. Equal volumes of a collagen solution (4 mg / ml) and Freund's complete adjuvant (5 mg / ml) supplemented with Micro-tuberculosis bacterium (MTB) were mixed to form an emulsion for 5 minutes.

Критерии клинических показателейClinical Performance Criteria

0 = норма;0 = normal;

1 = сустав одной передней или задней лапы нарушен или отмечена минимальная диффузная эритема или отек;1 = the joint of one front or hind leg is broken or minimal diffuse erythema or edema is noted;

2 = сустав двух передних или задних лап нарушен или отмечена умеренная диффузная эритема или отек;2 = the joint of two front or hind legs is broken or moderate diffuse erythema or edema is noted;

3 = сустав трех передних или задних лап нарушен или отмечена средняя диффузная эритема или отек;3 = the joint of the three front or hind legs is broken or average diffuse erythema or edema is noted;

4 = выраженная диффузная эритема или отек, или 4 сустава нарушены;4 = severe diffuse erythema or edema, or 4 joints are impaired;

5 = резкая диффузная эритема или резкий отек полной лапы, невозможность двигать пальцами.5 = sharp diffuse erythema or sharp swelling of a full paw, inability to move fingers.

Пример 6. Получение лекарственного средства в виде таблетокExample 6. Obtaining a drug in the form of tablets

Спресовывали смесь 1600 мг крахмала, 1600 мг измельченной лактозы, 400 мг талька и 1000 мг ингибитора формулы 1. Полученный брусок измельчали в гранулы и просеивали через сито, собирая гранулы размером 14-16 меш. Полученные гранулы таблетировали в таблетки пригодных форм, весом 500 мг каждая.A mixture of 1600 mg of starch, 1600 mg of crushed lactose, 400 mg of talc and 1000 mg of the inhibitor of formula 1 was pressed. The resulting bar was crushed into granules and sieved through a sieve, collecting granules with a size of 14-16 mesh. The granules obtained were tabletted into tablets of suitable forms, weighing 500 mg each.

Пример 7. Получение лекарственного средства в форме капсулExample 7. Obtaining a drug in the form of capsules

Ингибитор формулы 1 тщательно смешивали с лактозой в соотношении 2:1. Полученную порошкообразную смесь упаковывали по 600 мг в желатиновые капсулы подходящего размера.An inhibitor of formula 1 was thoroughly mixed with lactose in a ratio of 2: 1. The resulting powdery mixture was packaged in 600 mg in a suitable size gelatin capsule.

Пример 8. Получение лекарственного средства в форме композиций для внутримышечных, внутрибрюшинных или подкожных инъекцийExample 8. Obtaining a medicinal product in the form of compositions for intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection

Смешали 500 мг ингибитора формулы 1, 300 мг хлорбутанола, 2 мл пропиленгликоля и 100 мл воды для инъекций. Раствор фильтровали и помещали в 1 мл ампулы, которые укупоривали.500 mg of an inhibitor of formula 1, 300 mg of chlorobutanol, 2 ml of propylene glycol and 100 ml of water for injection were mixed. The solution was filtered and placed in 1 ml ampoules, which were sealed.

Из приведенного выше описания специалистам в данной области техники очевидны различные модификации изобретения в дополнение к описанным здесь.From the above description, various modifications of the invention are apparent to those skilled in the art in addition to those described herein.

Claims (8)

1. Соединение общей формулы 1:1. The compound of General formula 1:

2. Фармацевтическая композиция, обладающая свойствами ингибитора Янус киназы (JAK), содержащая в качестве активного компонента соединение формулы 1 по п. 1 в терапевтически эффективном количестве.2. A pharmaceutical composition having the properties of a Janus kinase inhibitor (JAK), comprising, as an active component, a compound of formula 1 according to claim 1 in a therapeutically effective amount. 3. Фармацевтическая композиция по п. 2 для использования в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку.3. The pharmaceutical composition according to claim 2 for use in the form of tablets, capsules or injections, placed in a pharmaceutically acceptable package. 4. Способ лечения JAK-связанных заболеваний или расстройств, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 2 или 3.4. A method of treating JAK-related diseases or disorders, comprising administering to a specified patient a therapeutically effective amount of a compound according to claim 1 or a pharmaceutical composition according to claim 2 or 3. 5. Способ лечения по п. 4, где JAK-связанные заболевания выбраны из таких заболеваний, как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, ювенильный артрит, псориатический артрит, диабет типа I, волчанка, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, миастения, нефропатия иммуноглобулинов, аутоиммунные заболевания щитовидной железы.5. The treatment method of claim 4, wherein the JAK-related diseases are selected from diseases such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, psoriatic arthritis, type I diabetes, lupus, psoriasis, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn’s disease, myasthenia gravis, nephropathy of immunoglobulins, autoimmune diseases of the thyroid gland. 6. Способ получения соединения формулы 1 по п. 1, включающий реакцию 2-х молярных эквивалентов основания Барицитиниба с 1,5-нафтилдисульфокислотой в подходящем растворителе или смеси растворителей:6. A method for producing a compound of formula 1 according to claim 1, comprising reacting 2 molar equivalents of baricitinib base with 1,5-naphthyldisulfonic acid in a suitable solvent or mixture of solvents:

Images