RU2642957C2

RU2642957C2 - Liposome, pharmaceutical composition and drug for treatment of local radiation skin lesions, liposome application and method for local radiation skin lesions treatment

Info

Publication number: RU2642957C2
Application number: RU2016108822A
Authority: RU
Inventors: Александр Васильевич Аклеев; Игорь Вячеславович Дудич; Юрий Игоревич Остроумов; Лидия Николаевна Семенкова; Сергей Владимирович Беневоленский; Галина Александровна Тряпицына; Наталья Игоревна Атаманюк; Надежда Александровна Обвинцева; Евгений Александрович Пряхин
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2018-01-29
Also published as: RU2016108822A

Abstract

FIELD: pharmacology.

SUBSTANCE: pharmaceutical composition comprising the said liposomes is used. In addition, liposomes can contain a human granulocyte colony stimulating factor. A drug for local radiation skin lesions treatment, comprising the pharmaceutical composition, can be administered subcutaneously or transdermally.

EFFECT: provides a method for treatment or prevention of local radiation skin lesions.

12 cl, 12 dwg, 8 tbl, 6 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтике, в частности к липосомам, фармацевтической композиции и лекарственному средству для лечения местных радиационных поражений кожи, а также к способу лечения и/или профилактики местных радиационных поражений кожи. Указанные липосомы могут содержать альфа-фетопротеин человека и, в дополнение к нему, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.The invention relates to biotechnology and pharmaceuticals, in particular to liposomes, pharmaceutical compositions and drugs for the treatment of local radiation injuries of the skin, as well as to a method for the treatment and / or prevention of local radiation injuries of the skin. These liposomes may contain human alpha-fetoprotein and, in addition to it, human granulocyte colony stimulating factor.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Радиационный дерматит является наиболее распространенным побочным эффектом радиационной терапии и обследований, производимых с применением радиоактивных изотопов (Козлова А.В. Возможные последствия повреждений органов и тканей при лучевой терапии злокачественных опухолей, Мед. Радиология, 1977, Вып. 12, с. 71-75), что делает необходимым разработку мероприятий по снижению повреждающего действия ионизирующей радиации на нормальные клетки и ткани. Случаи радиационных поражений кожи вероятны при авариях на атомных энергетических установках, среди персонала, работающего с радиоизотопами и связанного с утилизацией ядерных боеприпасов, а также в результате террористических актов с использованием так называемых "грязных бомб" (Goffman Т.Е. Nuclear terrorism and the problem of burns, Am J Emerg Med, 2011, v. 29(2), p. 224-228; Романович И.К. и др. Авария на АЭС «Фукусима-1»: организация профилактических мероприятий, направленных на сохранение здоровья населения Российской Федерации. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко, СПб.: НИИРГ им. проф. П.В. Рамзаева, 2012, 336 с.; Радиационные поражения человека, Ильин Л.А., Кочетков О.А., Савкин М.Н. и др., М.: ИздАТ, 2002, 607 с.).Radiation dermatitis is the most common side effect of radiation therapy and examinations using radioactive isotopes (Kozlova A.V. Possible consequences of damage to organs and tissues during radiation therapy of malignant tumors, Med. Radiology, 1977, Issue 12, pp. 71-75 ), which makes it necessary to develop measures to reduce the damaging effects of ionizing radiation on normal cells and tissues. Cases of radiation damage to the skin are likely during accidents at nuclear power plants, among personnel working with radioisotopes and associated with the disposal of nuclear weapons, as well as as a result of terrorist attacks using the so-called "dirty bombs" (Goffman T.E. Nuclear terrorism and the problem of burns, Am J Emerg Med, 2011, v. 29 (2), p. 224-228; Romanovich IK et al. Accident at Fukushima-1 NPP: organization of preventive measures aimed at maintaining the health of the Russian population Federation Edited by the Acad. RAMS GG Onishchenko, St. Petersburg: NIIRG im. Prof. P.V. Ramzayev, 2012, 336 pp .; Radiation injuries of a person, Ilyin L.A., Kochetkov O.A., Savkin M.N. et al., Moscow: Publishing House of Publishers, 2002, 607 pp.) .

Выраженность лучевых поражений кожи определяется дозой, мощностью дозы облучения, видом и характеристиками ионизирующего излучения (Wilson C.W. Comparsion of the skin and depilatory reactions produced in the legs of mice by 2000 r of 200 kV and 2 MeV X-rays, Brit. J. Radiol., 1957, v. 115, p. 661-670). При радиационных авариях и инцидентах электромагнитные ионизирующие излучения могут дистанционно оказывать поражающее действие на людей даже на значительном расстоянии от источника облучения. Особенностью действия ионизирующих излучений электромагнитной природы, в отличие от α- и β-излучений, является их высокая проникающая способность и, как следствие, поражающее действие на все слои кожи.The severity of radiation damage to the skin is determined by the dose, dose rate, type and characteristics of ionizing radiation (Wilson CW Comparsion of the skin and depilatory reactions produced in the legs of mice by 2000 r of 200 kV and 2 MeV X-rays, Brit. J. Radiol ., 1957, v. 115, p. 661-670). In radiation accidents and incidents, electromagnetic ionizing radiation can remotely have a damaging effect on people even at a considerable distance from the radiation source. A feature of the action of ionizing radiation of an electromagnetic nature, in contrast to α- and β-radiation, is their high penetrating ability and, as a result, the damaging effect on all layers of the skin.

Кроме того, ионизирующие излучения электромагнитной природы получили широкое применение в онкологической практике. В зависимости от используемого вида излучения различают электронную терапию, бета-терапию, нейтронную, протонную, пи-мезонную терапию, рентгенотерапию и гамма-терапию. Разрабатываются все новые современные установки для точной формы лучевой терапии, такие как Гамма-Нож, Кибер-Нож (CyberKnife). В настоящее время в мире установлено около 250 установок Кибер-Нож. Они используется в стереотаксической радиохирургии (СРХ) для лечения, удаления опухолей и других патологий мозга и позвоночника, лечения метастазов, лечения рака и опухолей паренхиматозных органов (рака предстательной железы (рака простаты), рака легких (не мелкоклеточного), рака печени, рака почек, рака поджелудочной железы. При использовании Гамма-Ножа и Кибер-Ножа применяют разовые дозы 2-4 Гр, а суммарные дозы составляет до 60-80 Гр (Малая медицинская энциклопедия, 1991-96). Повреждающему действию радиации при этом подвергаются все слои кожи. Так при гамма-терапии злокачественных опухолей внутренних органов, в частности, опухолей легких, мочевого пузыря, женских половых органов и других, лучевые повреждения кожи развиваются у 25-30% пациентов (Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи, М.: Медицина, 1975, с. 8-41).In addition, ionizing radiation of an electromagnetic nature have been widely used in cancer practice. Depending on the type of radiation used, electronic therapy, beta therapy, neutron, proton, pi-meson therapy, x-ray therapy and gamma therapy are distinguished. All new modern facilities are being developed for the exact form of radiation therapy, such as Gamma Knife, CyberKnife. Currently, about 250 CyberKnife installations are installed in the world. They are used in stereotactic radiosurgery (CPX) to treat, remove tumors and other pathologies of the brain and spine, treat metastases, treat cancer and tumors of the parenchymatous organs (prostate cancer (prostate cancer), lung cancer (not small cell), liver cancer, kidney cancer pancreatic cancer When using the Gamma Knife and Cyber Knife, single doses of 2-4 Gy are used, and the total doses are up to 60-80 Gy (Small Medical Encyclopedia, 1991-96) .All the layers of the skin are exposed to radiation damage. . T for gamma-therapy of malignant tumors of internal organs, in particular, tumors of the lungs, bladder, female genital organs and others, radiation injuries of the skin develop in 25-30% of patients (Afrikanova L.A. Acute radiation injury to the skin, M .: Medicine 1975, pp. 8-41).

Реакции кожи на облучение подразделяют на ранние и поздние. Поздние местные лучевые повреждения развиваются через 3-6 месяцев и позже после лучевого воздействия. Характеризуются образованием поздней лучевой язвы в зоне лучевого фиброза, которая не имеет четких границ. Морфологическими признаками зоны, где образуется поздняя лучевая язва, являются: хроническое неспецифическое воспаление, склероз и облитерация кровеносных и лимфатических сосудов, периваскулярная инфильтрация, демиелинизация нервных стволов, распространенный фиброз соединительной ткани.Skin reactions to radiation are divided into early and late. Late local radiation injuries develop 3-6 months and later after radiation exposure. They are characterized by the formation of a late radiation ulcer in the area of radiation fibrosis, which does not have clear boundaries. Morphological signs of the zone where the late radiation ulcer is formed are: chronic nonspecific inflammation, sclerosis and obliteration of the blood and lymph vessels, perivascular infiltration, demyelination of nerve trunks, common connective tissue fibrosis.

В генезе поздних радиационных поражений кожи, развивающихся через месяцы-годы после облучения, помимо повреждения стволовых клеток базального слоя эпидермиса, существенную роль играет поражение эндотелия сосудов кожи. На пораженных участках наблюдается прогрессирующая облитерация капилляров, развитие атрофической аваскулярной неэластичной дермы, неспособной питать лежащий поверх нее эпидермис, что в свою очередь приводит к его атрофии, изъязвлению и некрозу.In the genesis of late radiation damage to the skin that develops months to years after irradiation, in addition to damage to the stem cells of the basal layer of the epidermis, a significant role is played by damage to the endothelium of the skin vessels. In the affected areas, there is a progressive obliteration of the capillaries, the development of an atrophic avascular inelastic dermis, unable to nourish the epidermis lying on top of it, which in turn leads to atrophy, ulceration and necrosis.

В процессе развития лучевого поражения кожи выделяют две фазы: фазу деструкции, когда формируется очаг острого радиационного поражения, и фазу репарации, когда в очаге поражения идут процессы, направленные на ликвидацию этого очага.In the process of development of radiation damage to the skin, two phases are distinguished: the destruction phase, when a focus of acute radiation damage is formed, and the repair phase, when processes aimed at eliminating this focus are in the lesion.

Радиочувствительность клеточных элементов уменьшается в следующей последовательности: волосяные луковицы, эпидермис, сальные железы, подкожная соединительная ткань, эндотелий кровеносных сосудов (Devik F. Histological and cytological changes produces by alpha-particles in the skin of mice, Acta Radiol., 1961, v. 35, p. 150-164).The radiosensitivity of cellular elements decreases in the following sequence: hair follicles, epidermis, sebaceous glands, subcutaneous connective tissue, endothelium of blood vessels (Devik F. Histological and cytological changes produces by alpha-particles in the skin of mice, Acta Radiol., 1961, v. 35, p. 150-164).

Таким образом, критическими структурами кожи при облучении являются стволовые клетки базального слоя эпидермиса и эпителия вокруг придатков кожи.Thus, the critical skin structures during irradiation are stem cells of the basal layer of the epidermis and epithelium around the skin appendages.

Особенностью лучевых поражений кожи является глубокое подавление всех регенеративных и репаративных процессов, поэтому лучевые язвы характеризуются торпидным длительным течением, а их лечение представляет трудноразрешимую задачу (Стрелин Г.С. Регенерационные процессы в развитии и ликвидации лучевого повреждения, М.: Медицина, 1978. 207 с.; Сосоновский А.Е. Лучевые дерматиты, Минск: Беларусь, 1974, 143 с.).A feature of radiation skin lesions is the deep suppression of all regenerative and reparative processes, therefore, radiation ulcers are characterized by a torpid prolonged course, and their treatment is an intractable task (Strelin G.S. Regenerative processes in the development and elimination of radiation damage, M .: Medicine, 1978. 207 S.; Sosonovsky A.E. Radiation dermatitis, Minsk: Belarus, 1974, 143 p.).

Деление формирования лучевой язвы на деструктивную и репаративную фазы носит условный характер. И в той, и в другой фазе явления деструкции и репарации неотделимы друг от друга, однако имеет место явное преобладание направленности тех или иных процессов в зависимости от фазы. Репаративная фаза клинически определяется как завершение стадии влажной эксквамации формированием струпа. В это время регистрируется эпителизация ожоговой раны. В процессе эпителизации принимают участие не только пролиферирующий эпидермис, но и эпителий придатков кожи (Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи, М.: Медицина, 1975, с. 8-41).The division of the formation of radiation ulcers into the destructive and reparative phases is conditional. In both phases, the phenomena of destruction and repair are inseparable, but there is a clear predominance of the direction of certain processes depending on the phase. The reparative phase is clinically defined as the completion of the wet excavation stage by the formation of a scab. At this time, epithelization of the burn wound is recorded. In the process of epithelialization, not only the proliferating epidermis is involved, but also the epithelium of the skin appendages (Afrikanova L.A. Acute radiation injury to the skin, M .: Medicine, 1975, p. 8-41).

Имеются данные, что при заживлении ран в восстановлении эпителия участвуют клетки эпидермиса, а для восстановления популяции дермальных фибробластов привлекаются как местные мезенхимальные клетки дермы, так и стволовые клетки костного мозга (Fathke С, Wilson L, Hutter J, Kapoor V, Smith A, Hocking A, Isik F. Contribution of bone marrow-derived cells to skin: collagen deposition and wound repair, Stem Cells, 2004, 22(5):812-22).There is evidence that epidermal cells are involved in wound healing in the restoration of the epithelium, while local desenic mesenchymal cells and bone marrow stem cells (Fathke C, Wilson L, Hutter J, Kapoor V, Smith A, Hocking are involved in the restoration of the dermal fibroblast population) A, Isik F. Contribution of bone marrow-derived cells to skin: collagen deposition and wound repair, Stem Cells, 2004, 22 (5): 812-22).

Пролиферирующий эпидермис проявляет потенцию к росту пластом. Однако прочность связи его с подлежащими тканями и возможность его дальнейшего существования зависят от характера соединительной ткани на дне дефекта кожи. Пролиферирующий эпидермис прочно удерживается на соединительной ткани слоя дермы, на кожной жировой клетчатке и на молодой соединительной ткани, формирующейся за счет преобразования этого слоя. На месте ожоговой раны формируется рубец. Однако молодая соединительная ткань, формирующаяся за счет преобразования рыхлой соединительной ткани на границе с фасциями подлежащих мышц, не может обеспечить жизнеспособность пролиферирующего эпидермиса. В этом случае репарация приобретает неблагоприятное течение с возникновением трофических язв (Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи, М.: Медицина, 1975, с. 8-41).The proliferating epidermis shows potency for growth by the reservoir. However, the strength of its connection with the underlying tissues and the possibility of its further existence depend on the nature of the connective tissue at the bottom of the skin defect. The proliferating epidermis is firmly held on the connective tissue of the dermis layer, on the dermal fatty tissue and on the young connective tissue formed by the transformation of this layer. A scar forms at the site of the burn wound. However, young connective tissue, which is formed due to the transformation of loose connective tissue at the border with the fascia of the underlying muscles, cannot ensure the viability of the proliferating epidermis. In this case, the repair acquires an unfavorable course with the appearance of trophic ulcers (Afrikanova L.A. Acute radiation injury to the skin, M .: Medicine, 1975, p. 8-41).

Поражения кожи, вызванные воздействием ионизирующего излучения, относятся к разряду тяжелых и инвалидизирующих заболеваний и вносят существенный вклад в течение и исход лучевой болезни (Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи, М.: Медицина, 1975, с. 8-41; Ильин Л.А., Кочетков О.А., Савкин М.Н. и др. Радиационные поражения человека, М.: ИздАТ, 2002, 607 с.). Степень выраженности радиационного поражения кожи в зависимости от условий облучения может варьировать от легкой воспалительной реакции (ожог I степени) до полного поражения кожи и нижележащих тканей (ожог IV степени).Skin lesions caused by exposure to ionizing radiation are classified as severe and disabling diseases and make a significant contribution to the course and outcome of radiation sickness (Afrikanova L.A. Acute radiation injury to the skin, M .: Medicine, 1975, p. 8-41; Ilyin L.A., Kochetkov O.A., Savkin M.N. et al. Radiation injuries of a person, Moscow: IzdAT, 2002, 607 pp.). The severity of radiation damage to the skin, depending on the irradiation conditions, can vary from a mild inflammatory reaction (burn I degree) to complete damage to the skin and underlying tissues (burn IV degree).

Как и простые термические повреждения участков кожи, лучевые ожоги по глубине делятся на четыре степени:Like simple thermal damage to skin, radiation burns are divided in depth into four degrees:

I степень характеризуется повреждением самого поверхностного слоя кожи (эпидермиса), состоящего из эпителиальных клеток. При этом появляется покраснение кожи, небольшая припухлость, сопровождающаяся болезненностью. Через два - три дня эти явления самостоятельно проходят, и после ожога не остается никаких следов, исключая незначительный зуд и шелушение кожи;I degree is characterized by damage to the surface layer of the skin (epidermis), consisting of epithelial cells. In this case, redness of the skin appears, a slight swelling, accompanied by soreness. After two to three days, these phenomena pass on their own, and after the burn there are no signs left, except for slight itching and peeling of the skin;

II степень отличается образованием пузырей с желтоватой жидкостью на фоне покраснения кожи. Пузыри могут образовываться сразу после ожога или спустя некоторое время. Если пузыри лопаются, то обнажается ярко-красная эрозия. Заживление при этой степени происходит обычно к 10-12 дню без образования рубцов;II degree is characterized by the formation of bubbles with a yellowish liquid against a background of redness of the skin. Bubbles can form immediately after a burn or after some time. If the bubbles burst, then a bright red erosion is exposed. Healing with this degree usually occurs by 10-12 days without scarring;

III степень ожогов характеризуется большей глубиной поражения с омертвением тканей (некроз) и образованием ожогового струпа. Струп представляет собой сухую корку от светло-коричневого до почти черного цвета; при ошпаривании же струп бывает мягким, влажным, белесовато-серого цвета. Выделяют IIIA степень, при которой сохраняются эпителиальные элементы кожи, являющиеся исходным материалом для самостоятельного заживления раны, и IIIБ степень, при которой все слои кожи полностью погибают и образовавшаяся ожоговая рана заживает посредством рубцевания;Grade III burns are characterized by a greater depth of damage with necrosis of the tissues (necrosis) and the formation of a burn scab. The scab is a dry crust from light brown to almost black; when scalding, the scab is soft, moist, whitish-gray in color. Allocate IIIA degree, in which the epithelial elements of the skin are preserved, which are the starting material for self-healing of the wound, and IIIB degree, in which all layers of the skin completely die and the resulting burn wound heals by scarring;

IV степень ожогов сопровождается обугливанием кожи и поражением глубжележащих тканей - подкожной жировой клетчатки, мышц и костей.The IV degree of burns is accompanied by charring of the skin and damage to the underlying tissues - subcutaneous fat, muscles and bones.

В соответствии с принятой в настоящее время концепцией, специальному лечению подлежат случаи с местными лучевыми поражениями II и выше степени тяжести (Инструкция по диагностике, медицинской сортировке и лечению острых радиационных поражений: Утв. Минздравом СССР 30.09.1977. Под ред. В.И. Пахомова, М.: Воениздат, 1980, 40 с.).In accordance with the currently accepted concept, cases with local radiation injuries of II and higher severity are subject to special treatment (Instructions for the diagnosis, medical sorting and treatment of acute radiation injuries: Approved by the USSR Ministry of Health on 09/30/1977. Edited by V.I. Pakhomova, Moscow: Military Publishing House, 1980, 40 p.).

При лечении лучевых ожогов комплекс терапевтических процедур включает в себя системное введение препаратов для уменьшения воспалительной реакции (глюкокортикоиды), обезболивающих средства, препаратов антипротеолитического действия и антибиотиков. Местное лечение направлено на предотвращение инфицирования пораженных поверхностей. В более поздние сроки при активации регенерационных процессов применяются лекарственные средства, содержащие стимуляторы регенерации и адаптогены.In the treatment of radiation burns, the complex of therapeutic procedures includes the systemic administration of drugs to reduce the inflammatory response (glucocorticoids), painkillers, antiproteolytic drugs and antibiotics. Local treatment is aimed at preventing infection of affected surfaces. Later, when activating regenerative processes, drugs containing regeneration stimulants and adaptogens are used.

Одним из стратегических направлений лечения ожоговых ран является хирургический. Основными недостатками аутодермопластики являются: дополнительная кожная рана в месте забора лоскута и невозможность применения этой технологии при обширных поражениях (Valencia I.C., Falabella AF, Eaglstein WH. Skin grafting, Dermatol Clin., 2000, 18(3), p. 521-32; Qaryoute S. et al. Usage of autograft and allograft skin in treatment of burns in children, Burns, 2001, 27 (6), p. 599-602). Важное место в этой области исследований отводится использованию клеточных технологий (Котенко К.В., Смирнов С.В. и др. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов, Хирургия, 2003, вып. 12, с. 58-62).One of the strategic areas of treatment for burn wounds is surgical. The main disadvantages of autodermoplasty are: an additional skin wound at the site of flap collection and the inability to use this technology for extensive lesions (Valencia IC, Falabella AF, Eaglstein WH. Skin grafting, Dermatol Clin., 2000, 18 (3), p. 521-32; Qaryoute S. et al. Usage of autograft and allograft skin in treatment of burns in children, Burns, 2001, 27 (6), p. 599-602). An important place in this research area is given to the use of cellular technologies (Kotenko K.V., Smirnov S.V. et al. Modern methods of cell therapy in the treatment of burns, Surgery, 2003, issue 12, pp. 58-62).

Для лечения глубоких ожогов, хронических язв и обширных повреждений постоянно разрабатываются новые покрытия, заменяющие кожу: трансплантаты из культивированных аутокератиноцитов (Teepe R.G, Kreis R.W., Koebrugge E.J. et all. The use of cultured autologous epidermis in the treatment of extensive burn wounds, J Trauma., 1990, v. 30(3), p. 269-275; Terskikh V.V., Vasiliev A.V. Cultivation and transplantation of epidermal keratinocytes, Int Rev Cytol, 1999, v. 188, p. 41-72) и аллогенных кератиноцитов (De Luca M., Albanese E., Bondanza S. et al. Multicentre experience in the treatment of burns with autologous and allogenic cultured epithelium, fresh or preserved in a frozen state, Burns, 1989, v. 15(5), p. 303-309; Oshima H., Inoue H., Matsuzaki K. et all. Permanent restoration of human skin treated with cultured epithelium grafting - wound healing by stem cell based tissue engineering, Hum Cell, 2002, v. 15(3), p. 118-128), эквиваленты кожи (Dvorankova В., Holikova Z., Vacik J. et all. Reconstruction of epidermis by grafting of keratinocytes cultured on polymer support-clinical study, Int J Dermatol., 2003, v. 42(3), p. 219-223; Ehrlich H.P. Understanding experimental biology of skin equivalent: from laboratory to clinical use in patients with bums and chronic wounds, Am J Surg., 2004, v. 187(5A), p. 29-33), которые включают не только культивированные кератиноциты, но и дермальный эквивалент, состоящий из коллагена, гликозамин-гликанов и др.).For the treatment of deep burns, chronic ulcers and extensive injuries, new coatings are constantly being developed to replace the skin: transplants from cultured autokeratinocytes (Teepe RG, Kreis RW, Koebrugge EJ et all. The use of cultured autologous epidermis in the treatment of extensive burn wounds, J Trauma ., 1990, v. 30 (3), p. 269-275; Terskikh VV, Vasiliev AV Cultivation and transplantation of epidermal keratinocytes, Int Rev Cytol, 1999, v. 188, p. 41-72) and allogeneic keratinocytes (De Luca M., Albanese E., Bondanza S. et al. Multicentre experience in the treatment of burns with autologous and allogenic cultured epithelium, fresh or preserved in a frozen state, Burns, 1989, v. 15 (5), p. 303 -309; Oshima H., Inoue H., Matsuzaki K. et all. Permanent restoration of human skin treated with cultur ed epithelium grafting - wound healing by stem cell based tissue engineering, Hum Cell, 2002, v. 15 (3), p. 118-128), skin equivalents (Dvorankova B., Holikova Z., Vacik J. et all. Reconstruction of epidermis by grafting of keratinocytes cultured on polymer support-clinical study, Int J Dermatol., 2003, v. 42 (3), p. 219-223; Ehrlich H.P. Understanding experimental biology of skin equivalent: from laboratory to clinical use in patients with bums and chronic wounds, Am J Surg., 2004, v. 187 (5A), p. 29-33), which include not only cultured keratinocytes, but also the dermal equivalent, consisting of collagen, glycosamine-glycans, etc.).

Применения трансплантатов из культивированных аутокератиноцитов имеет ряд недостатков: использование аутокератиноцитов не дает возможности создать банк клеток; сроки, необходимые для изготовления достаточного по площади трансплантата, велики и составляют 3-4 недели (Navsaria НА, Myers SR, Leigh IM, McKay IA. Culturing skin in vitro for wound therapy, Trends Biotechnol., 1995, Mar; 13(3):91-100; Туманов В.П., Алексеев А.А., Будкевич Л.И. Десятилетний опыт использования культивированных клеток кожи человека для лечения термических ожогов. Архив патологии, 1999, №4. с. 14-21); длительные сроки получения трансплантатов увеличивают риск развития инфекционных осложнений ожоговой болезни и удлиняют время пребывания пациентов в стационаре; аутокератиноциты практически не приживаются при трансплантации на гранулирующие ожоговые раны (De Luca М., Albanese Е., Bondanza S. et al. Multicentre experience in the treatment of burns with autologous and allogenic cultured epithelium, fresh or preserved in a frozen state. Burns, 1989, v. 15(5), p. 303-309; Туманов В.П., Алексеев А.А., Будкевич Л.И. Десятилетний опыт использования культивированных клеток кожи человека для лечения термических ожогов. Архив патологии, 1999, №4. с. 14-21); высока стоимость специальных ростовых сред и биологически активных стимуляторов роста кератиноцитов.The use of grafts from cultured autokeratinocytes has several disadvantages: the use of autokeratinocytes does not make it possible to create a cell bank; the time required to produce a sufficient transplant area is long and is 3-4 weeks (Navsaria HA, Myers SR, Leigh IM, McKay IA. Culturing skin in vitro for wound therapy, Trends Biotechnol., 1995, Mar; 13 (3) : 91-100; Tumanov VP, Alekseev AA, Budkevich LI Ten years of experience in using cultured human skin cells for the treatment of thermal burns. Pathology Archive, 1999, No. 4, pp. 14-21); long periods of receiving transplants increase the risk of developing infectious complications of burn disease and lengthen the patient's hospital stay; autokeratinocytes practically do not survive during transplantation onto granulating burn wounds (De Luca M., Albanese E., Bondanza S. et al. Multicentre experience in the treatment of burns with autologous and allogenic cultured epithelium, fresh or preserved in a frozen state. Burns, 1989, v. 15 (5), p. 303-309; Tumanov VP, Alekseev AA, Budkevich LI Ten years of experience in using cultured human skin cells for the treatment of thermal burns. Pathology Archive, 1999, No. 4.p. 14-21); the high cost of special growth media and biologically active stimulants of keratinocyte growth.

В последние несколько лет начаты исследования по возможностям применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Поскольку такой клеточный материал аутологичен (в отличие от аллофибробластов), легко культивируется и дифференцируется (в отличие от кератиноцитов), то этот метод в будущем может стать хорошей альтернативой прочим клеточным методам лечения кожных поражений (Шумаков В.И., Расулов М.Ф., Крашенинников М.Е. и др. Сравнительная оценка эффективности применения аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для терапии глубоких ожоговых ран. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2002, Вып. 4, с. 7-11; Ai G., Su Y., Yan G. et all. The experimental study of bone marrow mesenchymal stem cells on the repair of skin wound combined with local radiation injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi., 2002, v. 82(23), p. 1632-1636; Badiavas E.V. The potential of bone marrow cells to orchestrate homeostasis and healing in skin. Blood Cells Mol Dis., 2004, v. 32(1), p. 21-23).In the past few years, research has begun on the possibilities of using bone marrow mesenchymal stem cells. Since such cellular material is autologous (unlike allofibroblasts), easily cultivated and differentiated (unlike keratinocytes), this method in the future may become a good alternative to other cellular methods of treating skin lesions (Shumakov V.I., Rasulov M.F. , Krasheninnikov ME and other Comparative evaluation of the effectiveness of the use of allogeneic embryonic fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells for the treatment of deep burn wounds.Vestnik of Transplantology and Artificial Organs, 2002, Issue 4, p. 7-11; Ai G., Su Y., Yan G. et all. The experimental study of bone marrow mesenchymal stem cells on the repair of skin wound combined with local radiation injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi., 2002, v. 82 (23), p. 1632-1636; Badiavas EV The potential of bone marrow cells to orchestrate homeostasis and healing in skin. Blood Cells Mol Dis., 2004, v. 32 (1), p. 21-23).

Определенные успехи достигнуты на пути использования в лечении лучевых поражений цитокинов (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб: Гиппократ, 1992, 256 с.; Рождественский Л.М. Радиобиологические аспекты применения интерлейкина-1 бета как средства скорой помощи при остром радиационном воздействии. Труды Междунар. симпозиума "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии", 1997, Дубна, т. 2, с. 15-22), в частности при использовании колониестимулирующих факторов (КСФ) - гранулоцитарного (Г-КСФ) и гранулоцитарно-макрофагального (ГМ-КСФ) (Легеза В.И., Селезнев А.Б., Загарова Н.И., Кондаков А.Ю. Экспериментальное исследование лечебно-профилактического применения интерлейкина-1β при сочетанных радиационных поражениях. Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях, 2010, №4 (2), с. 41-45; Dainiak N., Waselenko J.K., Armitage J.O. et al. The Hematologist and Radiation Casualties. Hematology, 2003, v. 1). К настоящему времени разработан целый ряд препаратов такого рода, к числу которых относятся, прежде всего, интерлейкины и колониестимулирующие факторы: беталейкин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (нейпоген, филграстим, пегфилграстим, лейкостим), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (молграмостим, сарграмостим, лейкомакс), тромбопоэтин и другие. Именно это направление и, в частности, изучение возможности комплексного применения различных цитокинов с целью стимуляции восстановления костномозгового кроветворения, является наиболее перспективным подходом к существенному повышению эффективности терапии острых радиационных поражений мирного и военного времени.Certain successes have been achieved in the use of cytokines in the treatment of radiation injuries (Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S., Vorobiev A.A. Endogenous immunomodulators. St. Petersburg: Hippocrates, 1992, 256 pp .; Rozhdestvensky L. M. Radiobiological aspects of application interleukin-1 beta as an ambulance for acute radiation exposure. Proceedings of the International Symposium "Problems of Biochemistry, Radiation and Space Biology", 1997, Dubna, t. 2, pp. 15-22), in particular when using colony-stimulating factors (CSF ) - granulocytic (G-CSF) and granulocyte arno-macrophage (GM-CSF) (Legeza V.I., Seleznev AB, Zagarova NI, Kondakov A.Yu. An experimental study of the therapeutic and prophylactic use of interleukin-1β in combined radiation injuries. Biomedical and socio-psychological safety issues in emergency situations, 2010, No. 4 (2), pp. 41-45; Dainiak N., Waselenko JK, Armitage JO et al. The Hematologist and Radiation Casualties. Hematology, 2003, v. one). To date, a number of preparations of this kind have been developed, which include, first of all, interleukins and colony-stimulating factors: betaleukin, granulocyte colony-stimulating factor (neupogen, filgrastim, pegfilgrastim, leukostim), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (milgramostim, lemramostim, sar thrombopoietin and others. It is this area, and, in particular, the study of the possibility of the complex use of various cytokines in order to stimulate the restoration of bone marrow hematopoiesis, is the most promising approach to significantly increase the effectiveness of the treatment of acute radiation injuries in peacetime and wartime.

Перспективными являются исследования, направленные на использование антиоксидантов с целью снижения деструкции после лучевого воздействия за счет инактивации окислительных радикалов, возникающих преимущественно при взаимодействии ионизирующего излучения с водой пораженной ткани (Kouvaris J.R., Kouloulias V.E., Vlahos L.J. Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum radioprotector. Oncologist, 2007, 12:738-747; Montana G.S., Anscher M.S., Mansbach C.M 2nd, Daly N., Delannes M., Carke-Pearson D, Gaydica E.F. Topical application of WR-2721 to prevent radiation-induced proctosigmoiditis. A phase I/II trial. Cancer, 1992; 69: 2826-2830; Kumar S, Juresic E, Barton M, Shafiq J. Management of skin toxicity during radiation therapy: a review of the evidence. J Med Imaging Radiat Oncol., 2010 Jun; 54(3):264-79; Greenberger J.S., Clump D., Kagan V., Bayir H., Lazo J.S., Wipf P., Li S., Gao X., Epperly M.W. Strategies for discovery of small molecule radiation protectors and radiation mitigators. Front Oncol., 2012 Jan., 13; 1:59).Promising are studies aimed at the use of antioxidants to reduce destruction after radiation exposure due to the inactivation of oxidative radicals that occur predominantly when ionizing radiation interacts with water from affected tissue (Kouvaris JR, Kouloulias VE, Vlahos LJ Amifostine: the first selective-target and broad- spectrum radioprotector. Oncologist, 2007, 12: 738-747; Montana GS, Anscher MS, Mansbach CM 2nd, Daly N., Delannes M., Carke-Pearson D, Gaydica EF Topical application of WR-2721 to prevent radiation-induced proctosigmoiditis .A phase I / II trial. Cancer, 1992; 69: 2826-2830; Kumar S, Juresic E, Barton M, Shafiq J. Management of skin toxicity during radiation therapy: a re view of the evidence. J Med Imaging Radiat Oncol., 2010 Jun; 54 (3): 264-79; Greenberger JS, Clump D., Kagan V., Bayir H., Lazo JS, Wipf P., Li S., Gao X., Epperly MW Strategies for discovery of small molecule radiation protectors and radiation mitigators. Front Oncol., 2012 Jan., 13; 1:59).

Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является решение, описанное в Евразийском патенте №010058. В указанном патенте, в частности, описан пептид, соответствующий активному центру альфа-фетопротеина человека. Также указано, что указанный пептид может применяться для снижения цитотоксических эффектов после химио- и лучевой терапии.The closest analogue of the present invention is the solution described in Eurasian patent No. 010058. In said patent, in particular, a peptide corresponding to the active center of human alpha-fetoprotein is described. It is also indicated that this peptide can be used to reduce cytotoxic effects after chemo and radiation therapy.

Несмотря на большой опыт по изучению способов консервативного лечения лучевых поражений, проблема создания средств экстренной профилактики и лечения лучевых ожогов остается крайне актуальной.Despite extensive experience in the study of methods of conservative treatment of radiation injuries, the problem of creating means of emergency prevention and treatment of radiation burns remains extremely urgent.

Краткое описание настоящего изобретенияA brief description of the present invention

Целью настоящего изобретения является разработка нового эффективного средства для экстренной профилактики и лечения местных радиационных поражений кожи.The aim of the present invention is to develop a new effective tool for emergency prevention and treatment of local radiation injuries of the skin.

Указанная цель была достигнута путем установления того факта, что альфа-фетопротеин человека (АФП) увеличивает жизнеспособность облученных клеток и снижает напряженность апоптотических процессов. Далее было показано, что использование липосомального препарата, содержащего рекомбинантный альфа-фетопротеин человека (рчАФП), липосомального препарата, содержащего, в дополнение к рчАФП, рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГКСФ), а также липосомального препарата, состоящего из «пустых» липосом ускоряет процессы репарации и эпителизации ожоговой раны и в целом укорачивает время заживления лучевого ожога.This goal was achieved by establishing the fact that human alpha-fetoprotein (AFP) increases the viability of irradiated cells and reduces the intensity of apoptotic processes. It was further shown that the use of a liposomal preparation containing recombinant human alpha-fetoprotein (rhAFP), a liposomal preparation containing, in addition to rhAFP, a recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhGCF), as well as a liposomal preparation consisting of “empty” liposomal processes of repair and epithelization of a burn wound and generally shortens the healing time of a radiation burn.

Первый аспект настоящего изобретения предоставляет липосомы, содержащие альфа-фетопротеин человека, для лечения местных радиационных поражений кожи.A first aspect of the present invention provides liposomes comprising human alpha-fetoprotein for the treatment of local radiation lesions of the skin.

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанным альфа-фетопротеином человека является рекомбинантный альфа-фетопротеин человека.Another aspect of the present invention provides the aforementioned liposome, wherein said human alpha-fetoprotein is a recombinant human alpha-fetoprotein.

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанная липосома содержит от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл альфа-фетопротеина человека.Another aspect of the present invention provides the aforementioned liposome, wherein said liposome contains from 0.1 mg / ml to 1.0 mg / ml of human alpha-fetoprotein.

Следующий аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанная липосома дополнительно содержит гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.A further aspect of the present invention provides the aforementioned liposome, wherein said liposome further comprises a human granulocyte colony stimulating factor.

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека является рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.Another aspect of the present invention provides the aforementioned liposome, wherein said human granulocyte colony stimulating factor is a recombinant human granulocyte colony stimulating factor.

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанная липосома содержит от 0,004 мг/мл до 0,06 мг/мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.Another aspect of the present invention provides the aforementioned liposome, wherein said liposome contains from 0.004 mg / ml to 0.06 mg / ml of human granulocyte colony stimulating factor.

Следующий аспект настоящего изобретения указывает на возможность применения указанных выше липосом для лечения местных радиационных поражений кожи.Another aspect of the present invention indicates the possibility of using the above liposomes for the treatment of local radiation lesions of the skin.

Еще один аспект настоящего изобретения указывает на возможность применения так называемых «пустых» липосом, то есть липосом, не содержащих каких-либо активных веществ, для лечения местных радиационных поражений кожи.Another aspect of the present invention indicates the possibility of using the so-called "empty" liposomes, that is, liposomes that do not contain any active substances, for the treatment of local radiation lesions of the skin.

Следующий аспект настоящего изобретения предоставляет фармацевтическую композицию для лечения местных радиационных поражений кожи, содержащую эффективное количество указанных выше липосом.A further aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating local radiation injuries of the skin, comprising an effective amount of the above liposomes.

Следующий аспект настоящего изобретения предоставляет лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи, содержащее указанную выше фармацевтическую композицию.A further aspect of the present invention provides a medicament for treating local radiation injuries of the skin, comprising the aforementioned pharmaceutical composition.

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанное выше лекарственное средство, которое является средством трансдермального действия.Another aspect of the present invention provides the aforementioned drug, which is a transdermal agent.

Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанное выше лекарственное средство в виде пластины, пластыря, пленки, крема, раствора, эмульсии, мази или спрея.Another aspect of the present invention provides the above drug in the form of a plate, patch, film, cream, solution, emulsion, ointment or spray.

Следующий аспект настоящего изобретения предоставляет способ лечения и/или профилактики местных радиационных поражений кожи, включающий стадию нанесения указанной выше фармацевтической композиции на пораженный или подвергающийся поражению участок кожи.A further aspect of the present invention provides a method for treating and / or preventing local radiation injuries of the skin, comprising the step of applying the above pharmaceutical composition to an affected or affected area of the skin.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На Фиг. 1 показано влияние рчАФП на жизнеспособность NIH3T3 клеток после облучения. NIH3T3 клетки облучали и инкубировали с добавлением рчАФП. Подсчет клеток осуществляли через 72 часа после фиксации и окрашивания. Для анализа использовали данные, полученные в 3-х независимых полях зрения. График демонстрирует результат одного из трех независимых экспериментов. Данные представлены в виде среднего значения ± среднеквадратичное отклонение.In FIG. Figure 1 shows the effect of rfAPP on the viability of NIH3T3 cells after irradiation. NIH3T3 cells were irradiated and incubated with rhAFP. Cell counting was performed 72 hours after fixation and staining. For analysis, we used data obtained in 3 independent fields of view. The graph shows the result of one of three independent experiments. Data are presented as mean ± standard deviation.

На Фиг. 2 показано влияние рчАФП на напряженность апоптотического процесса в культуре облученных NIH3T3 клеток. NIH3T3 клетки облучали и инкубировали с добавлением рчАФП. Подсчет клеток осуществляли через 72 часа после фиксации и окрашивания красителем DAPI. Для анализа использовали данные, полученные в 3-х независимых полях зрения. График демонстрирует результат одного из трех независимых экспериментов. Данные представлены в виде среднего значения ± среднеквадратичное отклонение.In FIG. Figure 2 shows the effect of rfAPP on the intensity of the apoptotic process in a culture of irradiated NIH3T3 cells. NIH3T3 cells were irradiated and incubated with rhAFP. Cell counting was performed 72 hours after fixation and staining with DAPI. For analysis, we used data obtained in 3 independent fields of view. The graph shows the result of one of three independent experiments. Data are presented as mean ± standard deviation.

На Фиг. 3 показан способ фиксации кожной складки на спине животного при проведении экспериментов по облучению.In FIG. Figure 3 shows a method for fixing a skin fold on the back of an animal during irradiation experiments.

На Фиг. 4 показана схема эксперимента по оценке эффективности липосомального препарата при подкожном и трансдермальном введении. А2 - сроки введения препарата А2 (липосомальный белковый препарат); A0 - сроки введения препарата A0 (комплекс антиоксидантов).In FIG. 4 shows a design of an experiment to evaluate the effectiveness of a liposome preparation with subcutaneous and transdermal administration. A2 - the timing of the administration of the drug A2 (liposomal protein preparation); A0 - the timing of administration of the drug A0 (a complex of antioxidants).

На Фиг. 5 показана клиническая картина лучевого ожога: А - стадия сухого радиоэпидермита (эритема, отек); Б - стадия влажного радиоэпидермита; В - стадия струпа; Г - стадия после отпадения последней корочки (струпа); Д - в конце периода восстановления эпителия.In FIG. 5 shows the clinical picture of radiation burn: A - stage of dry radioepidermitis (erythema, edema); B - stage of wet radioepidermitis; B - the stage of the scab; G - stage after falling off the last crust (scab); D - at the end of the recovery period of the epithelium.

На Фиг. 6 приведены показатели клинической картины течения радиационного поражения кожи в экспериментах по сравнительной оценке эффективности трансдермального и подкожного способа введения исследуемых препаратов.In FIG. Figure 6 shows the indicators of the clinical picture of the course of radiation damage to the skin in experiments on a comparative assessment of the effectiveness of the transdermal and subcutaneous route of administration of the studied drugs.

На Фиг. 7 приведены схемы эксперимента по оценке эффективности препарата при лечении и профилактике лучевых поражений кожи с использованием мышей в моделях «Профилактика», «Лечение», «Профилактика + Лечение».In FIG. 7 shows the experimental design for evaluating the effectiveness of the drug in the treatment and prevention of radiation skin lesions using mice in the models "Prevention", "Treatment", "Prevention + Treatment".

На Фиг. 8 показаны результаты различных схем применения липосомального белкового препарата (рчАФП, рчГКСФ) на течение лучевого ожога кожи IIIA степени у мышей по клиническим показателям.In FIG. Figure 8 shows the results of various regimens for the use of liposomal protein preparation (rhAFP, rhGKSF) for the course of radiation burn of the skin of the IIIA degree in mice according to clinical indicators.

На Фиг. 9 приведена схема эксперимента по оценке эффективности липосомального препарата с разной концентрацией рчАФП при лечении лучевых поражений кожи.In FIG. Figure 9 shows an experimental design for evaluating the effectiveness of a liposomal preparation with a different concentration of rhAFP in the treatment of radiation injuries of the skin.

На Фиг. 10 показаны результаты оценки влияния концентрации рчАФП в липосомальном препарате на течение лучевого ожога кожи IIIA степени у мышей по клиническим показателям. Примечание: * - достоверные отличия от группы облученного контроля, р≤0,05.In FIG. 10 shows the results of evaluating the effect of rhFAP concentration in a liposome preparation on the course of radiation burn of the IIIA degree skin in mice according to clinical indicators. Note: * - significant differences from the irradiated control group, p≤0.05.

На Фиг. 11 показаны зависимости длительностей различных стадий лучевого ожога кожи IIIA степени у мышей от концентрации рчАФП в липосомальном препарате: А - длительность скрытого периода; Б - длительность стадии сухого эпидермита; В - длительность стадии влажного эпидермита; Г - длительность деструктивного периода.In FIG. Figure 11 shows the dependences of the durations of various stages of radiation burn of the skin of the IIIA degree in mice on the concentration of rhAFP in the liposome preparation: A - duration of the latent period; B - the duration of the stage of dry epidermitis; In - the duration of the stage of wet epidermitis; G - the duration of the destructive period.

На Фиг. 12 показаны данные по длительности периодов течения лучевого поражения кожи после использования исследуемого липосомального препарата с активными веществами и «пустых» липосом.In FIG. 12 shows data on the duration of the periods of the course of radiation damage to the skin after using the studied liposome preparation with active substances and empty liposomes.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Авторы настоящего изобретения установили, что альфа-фетопротеин человека АФП увеличивает жизнеспособность облученных клеток и снижает напряженность апоптотических процессов в клетках. Затем авторы настоящего изобретения в ходе длительных и тщательных исследований установили, что использование липосомального препарата, содержащего рекомбинантный альфа-фетопротеин человека (рчАФП), липосомального препарата, содержащего, в дополнение к рчАФП рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГКСФ), а также липосомального препарата, состоящего из «пустых» липосом, ускоряет процесс заживления лучевого ожога, репарации и эпителизации ожоговой раны. Таким образом, было выполнено настоящее изобретение.The authors of the present invention found that human AFP alpha-fetoprotein increases the viability of irradiated cells and reduces the intensity of apoptotic processes in cells. Then, the authors of the present invention, during lengthy and thorough studies, found that the use of a liposomal preparation containing recombinant human alpha-fetoprotein (rhAFP), a liposomal preparation containing, in addition to rhAPP, a recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhGKSF), as well as a liposomal preparation consisting of "empty" liposomes, accelerates the healing process of a radiation burn, repair and epithelization of a burn wound. Thus, the present invention has been completed.

В настоящем изобретении термин "липосома" означает сферическую везикулу, имеющую один или несколько липидных бислоев. Липосомы образуются в смесях фосфолипидов с водой. Внутри липосом может содержаться вода или раствор, в котором проводилось их получение. Также внутри липосом могут находиться активные вещества, в частности различные биологически активные белки.In the present invention, the term "liposome" means a spherical vesicle having one or more lipid bilayers. Liposomes are formed in mixtures of phospholipids with water. The liposomes may contain water or the solution in which they were prepared. Also, active substances, in particular various biologically active proteins, can be located inside liposomes.

В настоящее время разработан целый ряд способов приготовления различных типов липосом и протеолипосом, а также их стандартизации по размерам, структуре, гомогенности, стабильности и другим характеристикам. Однослойные липосомы можно получать различными методами, например из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Диаметр однослойных липосом, полученных этим методом, составляет 25-30 нм. Разработаны и другие методы получения однослойных липосом, в том числе диаметром до 400 нм и более.Currently, a number of methods have been developed for the preparation of various types of liposomes and proteoliposomes, as well as their standardization in size, structure, homogeneity, stability and other characteristics. Single-layer liposomes can be obtained by various methods, for example, from a suspension of multilayer liposomes, if treated with ultrasound. The diameter of single-layer liposomes obtained by this method is 25-30 nm. Other methods have been developed for the production of single-layer liposomes, including those with a diameter of up to 400 nm or more.

Липосомы, искусственные фосфолипидные везикулы, являются универсальным контейнером для доставки лекарственных препаратов непосредственно в клетку. Они защищают включенное соединение от разрушающего действия ферментов плазмы, снижают токсичность инкапсулируемых веществ и пролонгируют их действие в организме. Методы получения существенным образом влияют на свойства липосом. От технологии приготовления зависит размер везикул, степень окисления липидов (ПОЛ), входящих в состав оболочки (липосомы с высоким соединением продуктов ПОЛ могут быть токсичными для организма), их внутренний объем, стабильность при хранении и др. свойства.Liposomes, artificial phospholipid vesicles, are a universal container for delivering drugs directly to the cell. They protect the incorporated compound from the destructive effect of plasma enzymes, reduce the toxicity of encapsulated substances and prolong their action in the body. Production methods significantly affect the properties of liposomes. The size of the vesicles, the degree of oxidation of the lipids (lipid peroxidation) that make up the membrane (liposomes with a high connection of lipid peroxidation products may be toxic to the body), their internal volume, storage stability, and other properties depend on the preparation technology.

Существуют разные способы получения липосом и выбор метода, как правило, зависит от задач, поставленных при разработке той или иной липосомальной формы. Наиболее просто получаются мультиламеллярные липосомы, так как липиды, используемые для получения липосом, самопроизвольно образуют при гидратировании подобные бислойные структуры (V.P. Torchilin and V. Weissig, Liposomes A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press, 2003).There are different ways to obtain liposomes and the choice of method, as a rule, depends on the tasks set in the development of a particular liposome form. The most simple are multilamellar liposomes, since the lipids used to produce liposomes spontaneously form similar bilayer structures when hydrated (V.P. Torchilin and V. Weissig, Liposomes A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press, 2003).

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов целевых белков в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем белок. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор целевого белка.The method of immobilization close to encapsulation can be considered as the inclusion of aqueous solutions of target proteins in liposomes, which are spherical or lamellar systems of double lipid bilayers. This method was first used to immobilize enzymes by J. Weissman and J. Sess in 1970. An organic solvent was evaporated to obtain liposomes from lipid solutions (most often lecithin). The remaining thin film of lipids is dispersed in an aqueous solution containing protein. In the process of dispersion, self-assembly of bilayer lipid structures of the liposome containing the included solution of the target protein occurs.

Липосомальные препараты согласно настоящему изобретению готовили на специализированной установке ЛЭМП (электромагнитный смеситель-диспергатор) из раствора рчАФП, раствора рчГ-КСФ и раствора фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле с добавлением, в случае необходимости, консервантов.Liposomal preparations according to the present invention were prepared on a specialized LEMP installation (electromagnetic mixer-dispersant) from a solution of rhAFP, a solution of rhG-CSF and a solution of phospholipids Lipoid S80 in propylene glycol with the addition of, if necessary, preservatives.

Данная установка позволяет получать липосомальные системы с заданными показателями размеров дисперсной фазы (медианный размер от 5 мкм до 50 нм) и высокой однородностью получаемой эмульсии. Препараты, полученные для профилактики и лечения радиационных ожогов кожи, характеризовались содержанием липидной фазы 1,0-1,4%, рН 7,3-7,5. Медианный размер препаратов составлял для различных партий от 130 до 100 нм.This setup allows you to get liposomal systems with specified indicators of the size of the dispersed phase (median size from 5 μm to 50 nm) and high uniformity of the resulting emulsion. Preparations obtained for the prevention and treatment of radiation burns of the skin were characterized by a lipid phase content of 1.0-1.4%, pH 7.3-7.5. The median size of the preparations was for various batches from 130 to 100 nm.

В настоящем изобретении термин "альфа-фетопротеин человека" (чАФП) означает гликопротеин с молекулярным весом 69000 Да, состоящий из одной полипептидной цепи, включающей ~600 аминокислот и содержащей около 4% углеводов (Tomasi ТВ. Structure and function of alpha-fetoprotein. Annual review of medicine, 1977, v. 28, p. 453-65.), который образуется при развитии эмбриона и плода. По структуре и физико-химическим свойствам АФП очень близок главному белку сыворотки крови взрослых - сывороточному альбумину (СА). Функция СА - транспортная, перенос низкомолекулярных веществ в ткани. АФП как бы заменяет СА у эмбриона, его часто называют эмбриональным СА, и его функция, скорее всего, тоже транспортная. АФП обладает исключительно высоким сродством к полиненасыщенным жирным кислотам (ПНЖК), веществам, необходимым для построения клеточных мембран и особого класса биологически активных веществ - простагландинов. Наиболее вероятная функция АФП - избирательное связывание ПНЖК в плаценте и перенос их из крови матери в кровь и клетки эмбриона.In the present invention, the term "human alpha-fetoprotein" (hAPP) means a glycoprotein with a molecular weight of 69,000 Da, consisting of one polypeptide chain comprising ~ 600 amino acids and containing about 4% carbohydrates (Tomasi TB. Structure and function of alpha-fetoprotein. Annual review of medicine, 1977, v. 28, p. 453-65.), which is formed during the development of the embryo and fetus. In terms of structure and physicochemical properties, AFP is very close to the main serum protein of adults - serum albumin (CA). The function of CA is transport, the transfer of low molecular weight substances into tissues. AFP, as it were, replaces the CA in the embryo, it is often called embryonic CA, and its function is most likely also transport. AFP has an extremely high affinity for polyunsaturated fatty acids (PUFAs), substances necessary for the construction of cell membranes and a special class of biologically active substances - prostaglandins. The most likely function of AFP is the selective binding of PUFAs in the placenta and their transfer from the mother’s blood to the blood and cells of the embryo.

АФП человека согласно настоящему изобретению может быть натуральным сывороточным эмбриональным АФП, получаемым из абортивного материала или пуповинной сыворотки (RU 2170586, RU 2100031, RU 2010113136). АФП человека согласно настоящему изобретению предпочтительно является рекомбинантным чАФП (рчАФП) (US 2011/0077208, ЕА 011606 В1).The human AFP according to the present invention can be a natural serum fetal AFP obtained from abortive material or umbilical cord serum (RU 2170586, RU 2100031, RU 2010113136). The human AFP according to the present invention is preferably recombinant hAPP (rhAPP) (US 2011/0077208, EA 011606 B1).

Последовательность аминокислот АФП человека, последовательность нуклеотидов гена, кодирующего АПФ человека, а также свойства указанного белка описаны, например, в базе данных Uniprot: http://www.uniprot.org/uniprot/P02771.The amino acid sequence of a human AFP, the nucleotide sequence of a gene encoding a human ACE, as well as the properties of this protein are described, for example, in the Uniprot database: http://www.uniprot.org/uniprot/P02771.

В настоящем изобретении термин "гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека" (ГКСФ), также известный как колониестимулирующий фактор 3 (КСФ 3), это колониестимулирующий фактор, стимулирующий в культуре клеток формирование колоний гранулоцитов (Metcalf, D. Hematopoietic regulators: Redundancy or subtlety? Blood, 1993, v. 82, p. 3515-23). Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является главным гемопоэтическим фактором роста, регулирующим гранулоцитопоэз. ГКСФ стимулирует пролиферацию и дифференцировку поздних клеток-предшественников в нейтрофилы. Под действием цитокинов Г-КСФ и колониестимулирующий фактор макрофагов (М-КСФ) происходит образование нейтрофилов и моноцитов, соответственно, из колониеобразующих единиц гранулоцитов-макрофагов (КОЕ-ГМ). Оба эти фактора в дальнейшем, как и другие цитокины, стимулируют дифференцировку моноцитов в макрофаги.In the present invention, the term “human granulocyte colony stimulating factor” (GCSF), also known as colony stimulating factor 3 (CSF 3), is a colony stimulating factor that stimulates the formation of granulocyte colonies in cell culture (Metcalf, D. Hematopoietic regulators: Redundancy or subtlety? Blood, 1993, v. 82, p. 3515-23). Granulocyte colony-stimulating factor is the main hematopoietic growth factor that regulates granulocytopoiesis. GCSF stimulates the proliferation and differentiation of late progenitor cells into neutrophils. Under the action of cytokines G-CSF and colony-stimulating macrophage factor (M-CSF), the formation of neutrophils and monocytes, respectively, from colony-forming units of granulocyte macrophages (CFU-GM). Both of these factors in the future, like other cytokines, stimulate the differentiation of monocytes into macrophages.

ГКСФ человека согласно настоящему изобретению предпочтительно является рекомбинантным чГКСФ (рчГКСФ) (RU 2326169, RU 2278870, RU 2207373, RU 2201962, RU 2157846, US 2010/0227818).The human G-CSF according to the present invention is preferably recombinant h-G-CSF (rh-G-CSF) (RU 2326169, RU 2278870, RU 2207373, RU 2201962, RU 2157846, US 2010/0227818).

Последовательность аминокислот ГКСФ человека, последовательность нуклеотидов гена, кодирующего ГКСФ человека, а также свойства указанного белка описаны, например, в базе данных Uniprot: http://www.uniprot.org/uniprot/P09919.The amino acid sequence of a human G-CSF, the nucleotide sequence of a gene encoding a human G-CSF, and the properties of this protein are described, for example, in the Uniprot database: http://www.uniprot.org/uniprot/P09919.

Рекомбинантные белки, обладающие активностью зрелого АФП человека или зрелого ГКСФ человека, представляют собой белки с аминокислотной последовательностью, соответствующей природным белкам, или с модифицированной аминокислотной последовательностью, имеющей делеции, добавления, вставки или замены одного или нескольких аминокислотных остатков, что приводит к образованию соответствующих модифицированных белков, последовательность которых по крайней мере на 80% соответствует аминокислотным последовательностям зрелых природных белков, с сохранением у указанных продуктов с модифицированной структурой функциональной биологической активности зрелого АФП человека или зрелого ГКСФ человека, соответственно.Recombinant proteins having activity of a mature human AFP or mature human G-CSF are proteins with an amino acid sequence corresponding to natural proteins, or with a modified amino acid sequence having deletions, additions, additions, or substitutions of one or more amino acid residues, resulting in the formation of corresponding modified proteins whose sequence is at least 80% consistent with the amino acid sequences of mature natural proteins , While maintaining said products in a modified structure of the functional biological activity of a mature human AFP or mature human G-CSF, respectively.

Способы получения рекомбинантных белков, в частности рчАФП и рчГКСФ согласно настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области техники. Указанные способы включают, например, экспрессию рекомбинантных плазмид, содержащих гены, кодирующие целевые белки, в подходящих клетках-продуцентах указанных целевых белков. В указанных способах клетки-продуценты целевых белков выращивают в питательной среде и выделяют полученные целевые белки из, например, культуральной жидкости или телец включения.Methods for producing recombinant proteins, in particular rhAFP and rhGKSF according to the present invention, are well known to specialists in this field of technology. These methods include, for example, expression of recombinant plasmids containing genes encoding the target proteins in suitable producer cells of these target proteins. In these methods, target protein producing cells are grown in culture medium and the resulting target proteins are isolated from, for example, culture fluid or inclusion bodies.

Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Methods for obtaining plasmid DNA, DNA cleavage and ligation, transformation, selection of oligonucleotides as primers and similar methods can be standard methods well known to those skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Липосомы согласно настоящему изобретению содержат от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл альфа-фетопротеина человека (АФП). Указанный альфа-фетопротеин человека предпочтительно является рекомбинантным альфа-фетопротеином человека (рчАФП).Liposomes according to the present invention contain from 0.1 mg / ml to 1.0 mg / ml of human alpha-fetoprotein (AFP). Said human alpha-fetoprotein is preferably recombinant human alpha-fetoprotein (rhFAP).

Также липосомы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать от 0,004 мг/мл до 0,06 мг/мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека. Указанный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека является рекомбинантным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека (рчГКСФ).Also, the liposomes of the present invention may additionally contain from 0.004 mg / ml to 0.06 mg / ml of human granulocyte colony stimulating factor. The specified human granulocyte colony stimulating factor is a recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhGCSF).

Фармацевтическая композиция для лечения местных радиационных поражений кожи согласно настоящему изобретению содержит эффективное количество липосом согласно настоящему изобретению, описанных выше. Термин "эффективное количество" означает количество, способное уменьшить тяжесть и/или сократить время восстановления пораженного участка кожи. Указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые добавки, наполнители и носители, известные специалисту в данной области техники.A pharmaceutical composition for treating local radiation injuries of the skin of the present invention comprises an effective amount of the liposomes of the present invention described above. The term "effective amount" means an amount that can reduce the severity and / or shorten the recovery time of the affected area of the skin. Said pharmaceutical composition may further comprise pharmaceutically acceptable additives, excipients and carriers known to a person skilled in the art.

Лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи, согласно настоящему изобретению, содержит фармацевтическую композицию, описанную выше. Указанное лекарственное средство может предназначено для трансдермального или подкожного введения. Трансдермальное введение является предпочтительным, поскольку трансдермальное введение препарата является не инвазивным способом введения, по сравнению с подкожным. Трансдермальное введения снижает вероятность инфекционных осложнений и исключает дополнительную травматизацию вблизи ожоговой раны.A medicament for the treatment of local radiation injuries of the skin according to the present invention contains the pharmaceutical composition described above. The specified drug may be intended for transdermal or subcutaneous administration. Transdermal administration is preferred since transdermal administration of the drug is a non-invasive route of administration compared to subcutaneous. Transdermal administration reduces the likelihood of infectious complications and eliminates additional trauma near a burn wound.

Для преодоления барьерных свойств кожи и усиления трансдермальной доставки лекарственных средств дополнительно могут применяться различные приемы, заключающиеся например, в использовании в составе лекарственного средства дополнительных химических веществ, усилителей транспорта, и увеличения его проницаемости для лекарственных средств. В качестве таких химических «усилителей» используется широкий спектр веществ, включающий многоатомные спирты, жирные кислоты и их эфиры, поверхностно-активные вещества, терпены (патент США №6444234). Трансдермальная доставка лекарственных средств в инкапсулированном виде, в частности внутри липосом, как это сделано в настоящем изобретении, является одним из таких приемов.To overcome the barrier properties of the skin and enhance the transdermal delivery of drugs, various techniques can be additionally applied, which include, for example, using additional chemicals, transport enhancers, and increasing its permeability to drugs as part of the drug. As such chemical "enhancers", a wide range of substances is used, including polyhydric alcohols, fatty acids and their esters, surfactants, terpenes (US patent No. 6444234). Transdermal drug delivery in an encapsulated form, in particular inside liposomes, as is done in the present invention, is one such technique.

Лекарственные средства согласно настоящему изобретению могут быть в форме пластины, пластыря, пленки, крема, пасты, раствора, эмульсии, мази или спрея. Предпочтительным является использование лекарственных средств согласно настоящему изобретению в виде крема, пасты, раствора, эмульсии, мази или спрея.Medicines according to the present invention may be in the form of a plate, patch, film, cream, paste, solution, emulsion, ointment or spray. It is preferable to use the medicines according to the present invention in the form of a cream, paste, solution, emulsion, ointment or spray.

Способ лечения и/или профилактики местных радиационных поражений кожи согласно настоящему изобретению включает стадию нанесения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению на пораженный или подвергающийся поражению участок кожи. В случае лечения пораженного участка в соответствии с указанным способом кожи фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению наносят на пораженный участок кожи ежедневно один или несколько раз в зависимости от тяжести поражения. Схема лечения подбирается соответствующим практикующим врачом в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в данной области. В случае профилактики подвергающегося возможному поражению участка кожи в соответствии с указанным способом согласно настоящему изобретению фармацевтическую композицию наносят на участок кожи ежедневно один или несколько раз в зависимости от возможного уровня облучения и предполагаемой тяжести поражения. Схема профилактической обработки также подбирается соответствующим практикующим врачом в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в данной области.A method of treating and / or preventing local radiation injuries of the skin according to the present invention includes the step of applying the pharmaceutical composition of the present invention to an affected or affected area of the skin. In the case of treatment of the affected area in accordance with the specified method of the skin, the pharmaceutical composition according to the present invention is applied to the affected area of the skin daily one or more times depending on the severity of the lesion. The treatment regimen is selected by the appropriate practitioner in accordance with methods well known to specialists in this field. In the case of prophylaxis of a skin area subject to possible damage in accordance with said method according to the present invention, the pharmaceutical composition is applied to the skin area once or several times daily depending on the possible level of exposure and the expected severity of the lesion. The prophylactic treatment regimen is also selected by the appropriate practitioner in accordance with methods well known to those skilled in the art.

ПримерыExamples

Последующие примеры приведены исключительно в иллюстративных целях для разъяснения сущности настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают рамки настоящего изобретения.The following examples are provided for illustrative purposes only to clarify the essence of the present invention and in no way limit the scope of the present invention.

Пример 1. Усиление устойчивости фибробластов к действию ионизирующего облучения в присутствии рчАФПExample 1. Enhancing the resistance of fibroblasts to the action of ionizing radiation in the presence of rhFAP

Влияние рчАФП на восстановление фибробластов после сублетального гамма-облучения анализировали на культуре клеток NIH3T3. NIH3T3 - клеточная культура фибробластов мыши, полученная из American Type Culture Collection, культивировалась в полной среде ДМЕМ (с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной сыворотки теленка (ЭСТ)), при 37°C и 5% CO₂ в 25 см² матрасах. В день эксперимента клетки снимали с матраса с помощью раствора трипсин - версен, отмывали и переносили в пробирки со свежей полной средой ДМЕМ. Клетки NIH3T3 (10⁵/мл) облучались при помощи Со⁶⁰ гамма - терапевтического аппарата "Агат-Р" (Россия) с начальной мощностью 1,9×10¹⁴ Бк, поглощенная доза соответствовала 30 Гр. Облучение проводили на холоду. В качестве контроля использовали клетки без облучения, которые инкубировали (клетки находились в суспензии на холоду) аналогично экспериментальным клеткам. Затем облученные (эксперимент) и контрольные клетки вносили в лунки 4-камерной системы для клеточной культуры (Chamber Slides) по 4×10⁴ кл/лунку в 400 мкл среды ДМЕМ, через 30 минут к клеткам добавляли рчАФП. Препарат рчАФП был получен, как описано в Евразийском патенте №011606. Контрольные клетки инкубировали в присутствии растворителя рчАФП - забуференного физиологического раствора (ЗФР). Через 72 часа среду удаляли, лунки промывали 1 раза ЗФР (400 мкл), ЗФР удаляли и вносили в лунки 96% этанол (400 мкл) и инкубировали при -20°C в течение 10 минут. После инкубации содержимое лунок удаляли и лунки просушивали при комнатной температуре. Слайд-камеры с зафиксированными клетками хранили при +4-8°C. Для подсчета клеток слайды обрабатывали красителем Гимза. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Imager D1 (Германия). Подсчет клеток после окраски проводили в 3-х независимых полях зрения. Согласно проведенным экспериментам в присутствии рчАФП наблюдалось достоверное увеличение числа облученных клеток, в среднем на 30-50% (Фиг. 1).The effect of rfAPP on the restoration of fibroblasts after sublethal gamma irradiation was analyzed on a NIH3T3 cell culture. NIH3T3, a mouse fibroblast cell culture obtained from the American Type Culture Collection, was cultured in complete DMEM (supplemented with 2 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum (ECT)), at 37 ° C and 5% CO ₂ in 25 cm ² mattresses. On the day of the experiment, cells were removed from the mattress using trypsin - versene solution, washed and transferred to test tubes with fresh complete DMEM medium. NIH3T3 cells (10 ⁵ / ml) were irradiated with a Co ⁶⁰ gamma - therapeutic apparatus "Agat-R" (Russia) with an initial power of 1.9 × 10 ¹⁴ Bq, the absorbed dose corresponded to 30 Gy. Irradiation was carried out in the cold. As a control, we used cells without irradiation, which were incubated (the cells were in suspension in the cold) similarly to experimental cells. Then, the irradiated (experiment) and control cells were introduced into the wells of the 4-chamber system for cell culture (Chamber Slides) at 4 × 10 ⁴ cells / well in 400 μl of DMEM medium, after 30 minutes rhAFP was added to the cells. The rhAPP preparation was prepared as described in Eurasian Patent No. 011606. Control cells were incubated in the presence of an rhAFP solvent, buffered saline (PBS). After 72 hours, the medium was removed, the wells were washed once with PBS (400 μl), PBS was removed and 96% ethanol (400 μl) was added to the wells and incubated at -20 ° C for 10 minutes. After incubation, the contents of the wells were removed and the wells were dried at room temperature. Fixed cell slide chambers were stored at + 4-8 ° C. To count cells, slides were treated with Giemsa stain. The preparations were analyzed using a Zeiss Imager D1 fluorescence microscope (Germany). Counting cells after staining was performed in 3 independent fields of view. According to the experiments in the presence of rhAFP, a significant increase in the number of irradiated cells was observed, on average, by 30-50% (Fig. 1).

Известно, что при воздействии ионизирующей радиации наблюдается апоптотическая гибель клеток (Ryan, J.L. Ionizing radiation: the good, the bad, and the ugly / Ryan J.L. // The Journal of Investigative Dermatology. - 2012. - Vol. 132, №3, part 2. - P. 985-993). Поэтому мы проводили анализ выраженности апоптотических процессов в культуре клеток, подвергнутых ионизирующему излучению, и оценивали защитные свойства рчАФП по степени угнетения апоптоза в культуре облученных клеток. Для анализа апоптотических процессов слайд-камеры с зафиксированными клетками обрабатывали красителем DAPI (Sigma, США) с последующим подсчетом количества ядер и анализом морфологии ядер клеток. Слайд-камеры инкубировали с 200 мкл 0,1 мкМ раствора DAPI, в течение 1 минуты при комнатной температуре. После интенсивной отмывки красителя избытком дистиллированной воды препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Imager D1 (Германия) и фотографировали с помощью камеры CoolSNAP (США). Для анализа исследовались снимки 3-4 независимых полей зрения, индекс выраженности апоптотических процессов оценивали по формуле А/В×100%, где А - число ядер с характерными апоптотическими признаками, В - общее число ядер в поле зрения.It is known that when exposed to ionizing radiation, apoptotic cell death is observed (Ryan, JL Ionizing radiation: the good, the bad, and the ugly / Ryan JL // The Journal of Investigative Dermatology. - 2012. - Vol. 132, No. 3, part 2. - P. 985-993). Therefore, we analyzed the severity of apoptotic processes in the culture of cells subjected to ionizing radiation, and evaluated the protective properties of rhAPP by the degree of inhibition of apoptosis in the culture of irradiated cells. For the analysis of apoptotic processes, the slide chambers with fixed cells were treated with DAPI dye (Sigma, USA), followed by counting the number of nuclei and analyzing the morphology of cell nuclei. Slide chambers were incubated with 200 μl of 0.1 μM DAPI solution for 1 minute at room temperature. After intensive washing of the dye with excess distilled water, the preparations were analyzed using a Zeiss Imager D1 fluorescence microscope (Germany) and photographed using a CoolSNAP camera (USA). For analysis, we studied images of 3-4 independent fields of view, the severity index of apoptotic processes was estimated using the formula A / B × 100%, where A is the number of nuclei with characteristic apoptotic features, B is the total number of nuclei in the field of view.

Эксперименты показали, что необлученные NIH3T3 клетки демонстрируют нормальную морфологию ядер, для которой характерна четкая овальная или округлая форма, относительная гомогенность по размерам и отсутствие деформации ядер. Воздействие ионизирующего излучения на клетку приводит к запуску апоптотического процесса, который характеризуется: деформацией ядер, присутствием многочисленных апоптотических телец и гиперконденсацией хроматина (Techbiques in apoptosis. A user guide. Edited by T.G. Cotter and S.J. Martin. 1996 Portland Press Ltd, London). Как видно из Фиг. 2, в отсутствие ионизирующего облучения в культуре клеток NIH3T3 почти не наблюдается апоптотических процессов, под действием ионизирующей радиации количество клеток с апоптотическими ядрами, наблюдаемых в поле зрения, достигает 80-90%. Обработка облученных клеток препаратом рчАФП приводит к снижению травматического действия ионизирующей радиации, к снижению интенсивности апоптотических процессов, что выражается в снижение доли клеток с аномальной формой ядер и клеток с апоптотическими тельцами. Наиболее достоверно снижение доли клеток с признаками апоптоза наблюдается при добавлении в культуру NIH3T3 клеток рчАФП в концентрации 300 мкг/мл.Experiments have shown that unirradiated NIH3T3 cells exhibit normal nuclear morphology, which is characterized by a clear oval or round shape, relative size homogeneity and the absence of nuclear deformation. The action of ionizing radiation on the cell triggers an apoptotic process, which is characterized by: nuclear deformation, the presence of numerous apoptotic bodies and chromatin hypercondensation (Techbiques in apoptosis. A user guide. Edited by T.G. Cotter and S.J. Martin. 1996 Portland Press Ltd, London). As can be seen from FIG. 2, in the absence of ionizing radiation in the NIH3T3 cell culture, almost no apoptotic processes are observed; under the influence of ionizing radiation, the number of cells with apoptotic nuclei observed in the field of view reaches 80-90%. The treatment of irradiated cells with rhAFP leads to a decrease in the traumatic effect of ionizing radiation, to a decrease in the intensity of apoptotic processes, which is expressed in a decrease in the proportion of cells with an abnormal shape of nuclei and cells with apoptotic bodies. The most significant decrease in the proportion of cells with signs of apoptosis is observed when rhAFP cells are added to the NIH3T3 culture at a concentration of 300 μg / ml.

Таким образом, показано, что рчАФП, являющийся действующим компонентом липосомального препарата согласно настоящему изобретению, увеличивает жизнеспособность облученных клеток и снижает напряженность апоптотических процессов.Thus, it was shown that rhAPP, which is an active component of the liposomal preparation according to the present invention, increases the viability of irradiated cells and reduces the intensity of apoptotic processes.

Пример 2. Получение липосом, содержащих рчАФП и рчГКСФ, и «пустых» липосомExample 2. Obtaining liposomes containing rhAFP and rhGKSF, and "empty" liposomes

Липосомальные препараты готовили на специализированной установке ЛЭМП из раствора рчАФП, раствора рчГ-КСФ и раствора фосфолипидов Lipoid S80 в пропил енгликоле с добавлением консервантов. Раствор рчАФП готовили путем растворения навески лиофилизированного рчАФП. Для инкапсулирования в липосомы рчГ-КСФ использовали готовый стерильный раствор рчГ-КСФ, для чего отбирали расчетный объем субстанции рчГ-КСФ, содержащий белок. Липосомальные препараты изготавливали путем смешивания раствора фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле и водных растворов рчАФП и рчГ-КСФ в пропорциях, определенных в рецептуре. Пропорция определяется условием устойчивости липосом и характеристиками готового препарата. В случае получения «пустых» липосом использовали раствор фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле без добавления растворов белков.Liposomal preparations were prepared on a specialized LEMP setup from rhAFP solution, rhG-CSF solution and Lipoid S80 phospholipid solution in propyl glycol with the addition of preservatives. An rhAFP solution was prepared by dissolving a sample of lyophilized rhAFP. For encapsulation in the rhG-CSF liposomes, a ready-to-use sterile solution of rhG-CSF was used, for which a calculated volume of the substance of rhG-CSF containing protein was selected. Liposomal preparations were prepared by mixing a solution of Lipoid S80 phospholipids in propylene glycol and aqueous solutions of rhAPP and rhG-CSF in the proportions determined in the formulation. The proportion is determined by the condition for the stability of liposomes and the characteristics of the finished product. In the case of “empty” liposomes, a solution of Lipoid S80 phospholipids in propylene glycol was used without the addition of protein solutions.

Подготовка рабочего места.Workplace preparation.

- Батист стерилизовать в контейнере для стерилизации в стерилизационном шкафу при 100°C.- Sterilize the cambric in a sterilization container in a sterilization cabinet at 100 ° C.

- Положить батист на воронку, вставленную предварительно в промежуточные стерильные флаконы емкостью 500 мл.- Place the cambric on a funnel inserted previously in intermediate sterile 500 ml vials.

- Предварительно простерилизованный фильтрующий блок соединить с подготовленной стерильной приемной емкостью.- Connect the pre-sterilized filter unit to the prepared sterile collection container.

- Входной шланг насоса для органической фазы подсоединить к емкости со стерильным раствором фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле.- Connect the pump inlet hose for the organic phase to a container with a sterile solution of Lipoid S80 phospholipids in propylene glycol.

- Входной шланг насоса для водной фазы подсоединить к емкости со стерильными растворами белков.- Connect the inlet hose of the pump for the aqueous phase to a container with sterile protein solutions.

- Выходной шланг ЛЭМП подсоединить к фильтрующему выходному устройству.- Connect the output hose of the LEMP to the filtering output device.

- Включить установку в соответствии с Инструкцией по эксплуатации и установить подачу экстракта и растворов белков в соответствии с расчетными соотношениями в конечной рецептуре.- Turn on the unit in accordance with the Operating Instructions and set the supply of the extract and protein solutions in accordance with the calculated ratios in the final formulation.

- По окончанию процесса приготовления провести техническое обслуживание установки в соответствии с Регламентом.- At the end of the cooking process, carry out maintenance of the installation in accordance with the Regulations.

- В полученный липосомальный препарат при необходимости ввести расчетное количество стерильного раствора консерванта.- If necessary, introduce the calculated amount of a sterile preservative solution into the obtained liposomal preparation.

Пример 3. Выбор и обоснование наиболее эффективного способа введения препаратаExample 3. The choice and justification of the most effective method of drug administration

В экспериментах проводили сравнительных анализ эффективности трансдермального (путем разбрызгивания препарата на кожу с помощью дозатора) и подкожного способа введения препарата.In experiments, a comparative analysis of the effectiveness of the transdermal (by spraying the drug onto the skin using a dispenser) and the subcutaneous route of administration of the drug was performed.

Оценивали эффективность препарата по клиническим критериям течения раневого процесса и по данным гистологических исследований после локального облучения кожи мышей. Для облучения кожи мышей использовали систему ускорителя Elekta Synergy (Elekta Limited, Великобритания), ГБУЗ "Челябинский областной клинический онкологический диспансер".Evaluated the effectiveness of the drug according to the clinical criteria for the course of the wound process and according to histological studies after local exposure to the skin of mice. To irradiate the skin of mice, we used the Elekta Synergy accelerator system (Elekta Limited, UK), the Chelyabinsk Regional Clinical Oncology Dispensary.

1. Объект исследований1. Object of research

В экспериментах были использованы самцы мышей стока CD1 в возрасте 3-4 мес, массой 24-26 г, полученные из питомника НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН (ветеринарное свидетельство 250 №0543060). Животных содержали в оптимальных для данного вида условиях: температура воздуха в помещении +22°C; влажность воздуха - 50-60%; регулируемая длина светового дня - 12 ч; подстилочный материал - гранулят из стержней початков кукурузы (ООО «Реттенмайер Рус», Германия). Животные содержались на стандартном рационе (гранулированный комбикорм для лабораторных животных «Чара», г. Сергиев Посад, Московская обл.) с неограниченной подачей питьевой воды. В эксперименте использовали здоровых животных, не подвергавшихся ранее другим экспериментальным процедурам. Группы формировали методом сплошной выборки.In the experiments, male CD1 runoff mice aged 3-4 months, weighing 24-26 g, obtained from the nursery of the Scientific Production Enterprise Nursery of Laboratory Animals of the FIBKh RAS (veterinary certificate 250 No. 05543060) were used. The animals were kept in optimal conditions for this species: indoor air temperature + 22 ° C; air humidity - 50-60%; adjustable daylight hours - 12 hours; bedding material - granules from corn cobs (Rettenmeyer Rus LLC, Germany). The animals were kept on a standard diet (granulated compound feed for laboratory animals “Chara”, Sergiev Posad, Moscow Region) with unlimited supply of drinking water. The experiment used healthy animals that had not previously been subjected to other experimental procedures. Groups were formed by the continuous sampling method.

Условия содержания и процедура эксперимента соответствовали общим правилам работ с использованием экспериментальных животных (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Страсбург, 1986. - European Community Directive 86/606/ЕС). При проведении исследований соблюдались правила гуманного обращения с экспериментальными животными в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом Минздрава СССР (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г №775) и стандартами этического комитета УНПЦ РМ (Протокол №7 от 04.07.2014 г. Этического комитета ФГБУН УНПЦ РМ; Протокол №7 от 04.07.2014 г. Этического комитета ФГБУН УНПЦ РМ и Протокол №1 от 18.03.2015 г.The conditions and experimental procedure were in accordance with the general rules for the use of experimental animals (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experiments or for Other Scientific Purposes. Strasbourg, 1986. - European Community Directive 86/606 / EC). During the research, the rules for the humane treatment of experimental animals were observed in accordance with the "Rules for the Use of Experimental Animals" approved by the order of the USSR Ministry of Health (Appendix to the Order of the USSR Ministry of Health dated 08/12/1977 No. 775) and the standards of the ethics committee of the Ukrainian Scientific and Practical Center (Protocol No. 7 dated July 4, 2014 of the Ethics Committee of the Federal State Budget Scientific Institution of the Scientific and Practical Center of the Republic of Moldova; Protocol No. 7 dated July 4, 2014 the Ethical Committee of the Federal State Budgetary Institutions of the Scientific and Practical Center of the Republic of Moldova and Protocol No. 1 dated March 18, 2015

2. Фиксация животных и формирование кожной складки для локального облучения кожи2. Fixation of animals and the formation of skin folds for local skin irradiation

За день до облучения у животных выщипывали шерсть пинцетом с браншами, покрытыми резиновыми или латексными трубками, небольшими пучками на участке кожи в центре спины размером 3×3 см, не допуская травмирования кожи. В каждой группе животным присваивали индивидуальный номер и метили стандартными способами.The day before irradiation, animals were plucked with tweezers with branches, covered with rubber or latex tubes, small bundles on the skin in the center of the back measuring 3 × 3 cm, avoiding skin injury. In each group, animals were assigned an individual number and labeled by standard methods.

Перед облучением животное размещали в положении спиной кверху на планшете путем фиксирования задних конечностей с использованием марлевых повязок (самозатягивающаяся петля) и головы (фиксация петлей из лески за верхние резцы). Размер планшета - 170×25 мм. Отверстия диаметром 5 мм для фиксации задних конечностей расположены на расстоянии 10 мм от одного края планшета; стержень с резьбой для фиксации головы мыши расположен на расстоянии 15 мм от противоположенного края планшета. Прототипом способа фиксации является способ обездвиживания крыс на операционном столе (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Страсбург, 1986. - European Community Directive 86/606/ЕС).Before irradiation, the animal was placed in a position with its back up on the tablet by fixing the hind limbs using gauze bandages (a self-tightening loop) and the head (fixing with a loop from the fishing line for the upper incisors). The size of the tablet is 170 × 25 mm. Holes with a diameter of 5 mm for fixing the hind limbs are located at a distance of 10 mm from one edge of the tablet; a threaded rod for fixing the mouse head is located at a distance of 15 mm from the opposite edge of the tablet. The prototype of the fixation method is the method of immobilization of rats on the operating table (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experiments or other scientific purposes. Strasbourg, 1986. - European Community Directive 86/606 / EC).

Планшет с зафиксированной мышью помещали на подставку из оргстекла так, чтобы животное располагалось горизонтально (Фиг. 3). На вертикальной стенке подставки имеется металлический зажим с латексным покрытием. На спине животного формируют складку кожи и закрепляют ее между стенкой подставки и металлическим зажимом. С обеих сторон вертикальной стенки и на металлическом зажиме нанесена разметка для позиционирования складки кожи по отношению к пучку ионизирующего излучения. Такой способ фиксации кожи не нарушает кровообращение и не вызывает гипоксии кожи.A tablet with a fixed mouse was placed on a plexiglass stand so that the animal was placed horizontally (Fig. 3). On the vertical wall of the stand there is a metal clip with a latex coating. A fold of skin is formed on the back of the animal and it is fixed between the wall of the stand and a metal clip. On both sides of the vertical wall and on the metal clip, markings are applied to position the skin folds in relation to the ionizing radiation beam. This method of skin fixation does not disturb blood circulation and does not cause skin hypoxia.

Поскольку введение мышам химических веществ, в том числе и наркотизирующих, может модифицировать радиобиологические эффекты, были выполнены эксперименты по оценке влияния данного вида фиксации на физиологическое состояние мышей. Исследования показали, что иммобилизация мышей указанным способом в течение 20 мин не приводит к значимым изменениям самочувствия животных, не приводит к непереносимым болевым ощущениям и не вызывает стойких изменений в кровообращении конечностей и кожной складки. Длительность всех процедур, связанных с облучением кожи в дозе 60 Гр составляет не более 15 мин. В связи с этим фиксация животных на время облучения проводилась без наркотизации.Since the introduction of chemicals into mice, including narcotics, can modify the radiobiological effects, experiments were performed to evaluate the effect of this type of fixation on the physiological state of mice. Studies have shown that immobilization of mice in this way for 20 minutes does not lead to significant changes in the well-being of animals, does not lead to intolerable pain and does not cause persistent changes in the blood circulation of the limbs and skin fold. The duration of all procedures associated with irradiation of the skin at a dose of 60 Gy is no more than 15 minutes. In this regard, the fixation of animals at the time of exposure was carried out without anesthesia.

3. Условия облучения3. Irradiation conditions

Оптимальной моделью для экспериментальной оценки радиационного поражения кожи является лучевой ожог IIIA степени, так как при этом происходит повреждение эпидермиса и собственно кожи, но сохраняются эпителиальные элементы кожи, являющиеся исходным материалом для самостоятельного заживления раны, и в то же время клинические проявления ожога выглядят достаточно ярко.The optimal model for the experimental assessment of radiation damage to the skin is a IIIA degree burn, since this causes damage to the epidermis and the skin itself, but the epithelial elements of the skin are preserved, which are the starting material for self-healing of the wound, and at the same time, the clinical manifestations of the burn look quite bright .

Облучение кожи спины площадью 1,5 см² на установке Elekta Synergy проводили рентгеновским лучами с мощностью дозы 5,5 Гр/мин и номинальной энергией фотонов 6 МэВ. Мышь, зафиксированную на подставке из оргстекла (Фиг. 3), помещали на стол установки комплекса Elekta Synergy и проводили локальное облучение кожи.Irradiation of the skin of the back with an area of 1.5 cm ² at the Elekta Synergy installation was carried out by X-rays with a dose rate of 5.5 Gy / min and a nominal photon energy of 6 MeV. A mouse mounted on a plexiglass stand (Fig. 3) was placed on the installation table of the Elekta Synergy complex and local skin irradiation was performed.

4. Характеристики ускорителя Elekta Synergy4. Characteristics of the Elekta Synergy Accelerator

Ускоритель включает в себя многолепестковый коллиматор MLCi2, систему портальной визуализации iViewGT, высокоэнергетичный линейный ускоритель с широким диапазоном энергий как для пучков фотонов (6 МэВ, 10 МэВ, 15 МэВ), так и для электронов (6-22 МэВ). Фотонное излучение используют для проведения лучевой терапии глубоко расположенных опухолей, тогда как электроны имеют меньшую проникающую способность и применяются для лечения опухолей, непосредственно прилежащих к коже.The accelerator includes a multi-leaf MLCi2 collimator, iViewGT portal imaging system, a high-energy linear accelerator with a wide energy range for both photon beams (6 MeV, 10 MeV, 15 MeV) and electrons (6-22 MeV). Photon radiation is used for radiation therapy of deeply located tumors, while electrons have less penetrating power and are used to treat tumors directly adjacent to the skin.

5. Характеристика исследуемых препаратов5. Characterization of the studied drugs

В серии экспериментов для проведения сравнительного анализа способа введения препаратов испытывали комплекс антиоксидантов (препарат A0) и липосомальный белковый препарат (препарат А2):In a series of experiments, to conduct a comparative analysis of the method of drug administration, a complex of antioxidants (drug A0) and a liposomal protein preparation (drug A2) were tested:

- препарат A0 - микроэмульсия комплекса антиоксидантов (1% бутилированного гидрокситолуола (БГТ) + 1% гидроксикверцетина (ДГК) + 0,17% астаксантин + 4,5% эмульгатор гидрогенизированный лецитин + 0,3% консерванты + 30% масло растительное + вода дистиллированная до 100 мл).- drug A0 - microemulsion of the antioxidant complex (1% bottled hydroxytoluene (BHT) + 1% hydroxyquercetin (DHA) + 0.17% astaxanthin + 4.5% emulsifier hydrogenated lecithin + 0.3% preservatives + 30% vegetable oil + distilled water up to 100 ml).

Препарат А2 - липосомы, содержащие 0,5 мг/мл рчАФП, 0,02 мг/мл рекомбинантный дрожжевой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГКСФ), 10 мг/мл фосфолипидов.The preparation A2 - liposomes containing 0.5 mg / ml rhAFP, 0.02 mg / ml recombinant human yeast granulocyte colony stimulating factor (rhGKSF), 10 mg / ml phospholipids.

6. Схема эксперимента6. Experiment design

Препарат А2 применяли на 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 18 и 25-е сутки после облучения (Фиг. 4). Микроэмульсию антиоксидантов (препарат A0) применяли в течение первых 3-х суток после облучения.The drug A2 was used on 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 18, and 25 days after irradiation (Fig. 4). A microemulsion of antioxidants (drug A0) was used during the first 3 days after irradiation.

В соответствии со схемой эксперимента были сформированы группы мышей по оценке эффективности испытуемых препаратов для экстренной профилактики и лечения лучевых поражений кожи. Всего сформировано 2 группы мышей численностью по 20 животных в каждой:In accordance with the experimental design, groups of mice were formed to evaluate the effectiveness of the tested drugs for emergency prevention and treatment of radiation injuries of the skin. In total, 2 groups of mice were formed with a population of 20 animals each:

1 группа - локальное облучение кожи + эмульсия антиоксидантов + липосомы с белками, трансдермальное введение;Group 1 - local skin irradiation + emulsion of antioxidants + liposomes with proteins, transdermal administration;

2 группа - локальное облучение кожи + эмульсия антиоксидантов (трансдермально) + липосомы с белками, подкожное введение.Group 2 - local skin irradiation + emulsion of antioxidants (transdermal) + liposomes with proteins, subcutaneous administration.

Трансдермальное нанесение 180-200 мкл липосомальных препаратов А2 (доза соответствует единичной терапевтической дозе рчАФП и рчГКСФ препарата) проводили с использованием дозатора-распрыскивателя с расстояния 1 см от поверхности кожи. Подкожное введение препарата А2 проводили, отступая на 0,2-0,3 см от места ожоговой раны с помощью инсулинового шприца в объеме 200 мкл.Transdermal application of 180-200 μl of liposome preparations A2 (the dose corresponds to a single therapeutic dose of rhAFP and rhGKSF preparation) was carried out using a dispenser from a distance of 1 cm from the skin surface. Subcutaneous administration of the preparation A2 was carried out, retreating 0.2-0.3 cm from the site of the burn wound using an insulin syringe in a volume of 200 μl.

При одновременном использовании липосом с белками (препарат А2) и микроэмульсии антиоксидантов (препарат A0) сначала на кожу наносили липосомы с белками, а затем через 30 минут наносили 1 каплю микроэмульсии с антиоксидантами с помощью дозатора-капельницы. Вес одной капли препарата A3, получаемой с помощью данного дозатора при температуре 20-22°C, соответствует 35-40 мг.With the simultaneous use of liposomes with proteins (preparation A2) and microemulsions of antioxidants (preparation A0), liposomes with proteins were first applied to the skin, and then after 30 minutes, 1 drop of a microemulsion with antioxidants was applied using a dropper. The weight of one drop of the drug A3, obtained using this dispenser at a temperature of 20-22 ° C, corresponds to 35-40 mg.

У животных всех групп проводили в динамике ежедневные клинические наблюдения за ожоговой раной в течение 60 суток после облучения, гистологические исследования кожи проводили на 7, 21 и 35 сутки после облучения в соответствии со схемой эксперимента (Фиг. 4). Для гистологических исследований случайным образом отбирали по 4 животных из каждой экспериментальной группы.In animals of all groups, daily clinical observations of a burn wound were performed in dynamics 60 days after irradiation, histological studies of the skin were performed on 7, 21 and 35 days after irradiation in accordance with the experimental design (Fig. 4). For histological studies, 4 animals were randomly selected from each experimental group.

7. Клиническое обследование экспериментальных животных7. Clinical examination of experimental animals

Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно после облучения в течение 60 суток. Выполняли тщательный осмотр животного, оценивали и регистрировали в журнале визуальные признаки локального радиационного поражения кожи. Проводили ежедневное фотографирование ожоговой раны в течение 60 суток. Фотографирование мышей после облучения производилось каждый день с целью выявления клинических проявлений.A clinical examination of each animal was performed daily after irradiation for 60 days. A thorough examination of the animal was performed, visual signs of local radiation damage to the skin were evaluated and recorded in the journal. Spent daily photographing of a burn wound for 60 days. Photographing mice after irradiation was performed every day in order to identify clinical manifestations.

Для каждого животного по визуальным наблюдениям и фотоматериалам отмечали время появления следующих изменений:For each animal, according to visual observations and photographic materials, the time of occurrence of the following changes was noted:

1. Время появления эритемы и отека. Эритема - покраснение кожи на месте облучения. Кожа становится уплотненной, сухой, красного, розового, розово-коричневого или желто-коричневого цвета, увеличивается толщина эпидермиса, нарушается нормальный тонус кожи (кожа дряблая) (Фиг. 5А). Период со дня появления эритемы до дня формирования влажного экссудата - период сухого эпидермита;1. Time of occurrence of erythema and edema. Erythema - redness of the skin at the site of irradiation. The skin becomes thickened, dry, red, pink, pink-brown or tan, the thickness of the epidermis increases, the normal tone of the skin is disturbed (sagging skin) (Fig. 5A). The period from the appearance of erythema to the day of the formation of moist exudate is the period of dry epidermitis;

2. Время появления влажного экссудата. Кожа начинает шелушиться, образуются мелкие поверхностные пузырьки, наполненные прозрачной желтоватой жидкостью серозно-геморрагического отделяемого, ссыхающиеся в тонкие корочки. Через некоторое время отдельные корочки сливаются в одну, розовато-коричневого цвета, блестящую, влажную корочку, под которой формируется крупный, наполненный жидкостью пузырь (Фиг. 5Б). Период со дня появления влажного экссудата до дня формирования струпа - период влажного эпидермита;2. The time of the appearance of wet exudate. The skin begins to peel off, small superficial vesicles are formed, filled with a transparent yellowish liquid of serous-hemorrhagic discharge, shrinking into thin crusts. After some time, the individual crusts merge into one pinkish-brown, shiny, moist crust, under which a large, fluid-filled bubble forms (Fig. 5B). The period from the day the moist exudate appears to the day the scab forms - the period of wet epidermitis;

3. Время появления струпа - сухой, плотной, твердой, матовой корки темно-красного, коричневого или светло-коричневого цвета и значительной толщины (Фиг. 5В);3. The time of appearance of the scab - dry, dense, hard, matte crust of dark red, brown or light brown color and significant thickness (Fig. 5B);

4. Время отслоения струпа. Края струпа достаточно быстро (через день-два после формирования) начинают шелушиться и отслаиваться, вся корка может отслаиваться и образовываться вновь несколько раз, при этом с каждой сменой корочки зона краевой эпителизации увеличивается. Период с первого дня формирования струпа до дня последнего отслоения струпа - период струпа. Регистрируется день отслоения последней корочки, когда вместо нее остается блестящая, розовая, очень гладкая кожа (характерный рисунок эпидермиса отсутствует), пронизанная большим количеством сосудов (Фиг. 5Г). Площадь поврежденной кожи меньше, чем площадь первоначальной ожоговой раны, и со временем размер повреждений еще больше уменьшается и восстанавливается;4. The time of exfoliation of the scab. The edges of the scab quickly enough (a day or two after formation) begin to peel off and exfoliate, the entire crust can exfoliate and form again several times, and with each change in the crust, the zone of edge epithelization increases. The period from the first day of formation of the scab to the day of the last detachment of the scab is the period of the scab. The day of exfoliation of the last crust is recorded, when shiny, pink, very smooth skin (a characteristic epidermal pattern is absent), penetrated by a large number of vessels, remains in its place (Fig. 5G). The area of damaged skin is smaller than the area of the initial burn wound, and over time, the size of the lesions decreases and is restored even more;

5. Время полного исчезновения дефекта кожи - окончание процесса эпителизации, формируется эпителий, сходный по структуре и рисунку с эпителием непораженного участка кожи. Кожа в месте ожога приобретает обычный цвет и структуру, либо длительное время после облучения сохраняет мелкие пятна нежной тонкой кожи с гиперпигментацией или более низким уровнем пигментации кожи, телеангиоэктазиями (Фиг. 5Д). Период со дня отпадения последней корочки до появления эпителия, сходного по структуре и рисунку с эпителием непораженного участка кожи - период восстановления эпителия.5. The time of complete disappearance of the skin defect is the end of the epithelialization process, an epithelium is formed that is similar in structure and pattern to the epithelium of the unaffected area of the skin. The skin at the burn site acquires the usual color and structure, or for a long time after irradiation retains small spots of delicate thin skin with hyperpigmentation or lower skin pigmentation, telangiectasias (Fig. 5D). The period from the date of falling off of the last crust until the appearance of the epithelium, similar in structure and pattern to the epithelium of the unaffected area of the skin - the period of restoration of the epithelium.

Для каждого животного рассчитывали длительность периодов деструктивной и репаративной фаз.For each animal, the duration of the periods of the destructive and reparative phases was calculated.

Деструктивная фаза включает:The destructive phase includes:

латентный период - со дня облучения до дня появления эритемы и отека (день обнаружения эритемы не учитывается, не входит в расчет длительности латентного периода). Рассчитывается как разница между днем появления эритемы и отека за вычетом 1 суток;latent period - from the day of exposure to the day of the appearance of erythema and edema (the day of detection of erythema is not taken into account, is not included in the calculation of the duration of the latent period). It is calculated as the difference between the day of the appearance of erythema and edema minus 1 day;

период сухого эпидермита - с первого дня обнаружения эритемы включительно до дня появления влажной блестящей корочки (влажного экссудата), день появления экссудата не входит в расчет длительности периода сухого эпидермита. Рассчитывается как разница между днем появления влажной блестящей корочки и днем появления эритемы и отека;dry epidermitis period - from the first day of erythema detection, up to the day of the appearance of a wet shiny crust (wet exudate), the day of the appearance of exudate is not included in the calculation of the duration of the period of dry epidermitis. It is calculated as the difference between the day of the appearance of a wet shiny crust and the day of the appearance of erythema and edema;

период влажного эпидермита - с первого дня обнаружения экссудата (влажной корочки) до формирования твердой сухой корочки (струпа), день появления струпа не входит в расчет длительности периода. Рассчитывается как разница между днем появления струпа и днем появления влажной блестящей корочки.the period of wet epidermitis - from the first day that exudate (wet crust) is detected until the formation of a hard dry crust (scab), the day the scab appears is not included in the calculation of the length of the period. It is calculated as the difference between the day the scab appears and the day the wet shiny crust appears.

Деструктивная фаза заканчивается формированием струпа.The destructive phase ends with the formation of a scab.

Репаративная фаза включает:The reparative phase includes:

период струпа - с первого дня обнаружения сухой плотной корочки (струпа) до полного его отслоения (если струп отслаивается несколько раз - до последнего отслоения, когда после отпадения корочки уже не образуется новых влажных отделений). Первый день, когда струп полностью отпадает, не входит в длительность этого периода. Рассчитывается как разница между днем отпадения последней корочки и днем появления струпа;the period of the scab - from the first day a dry, dense crust (scab) is detected until it is completely peeled off (if the scab is peeled off several times - until the last peeling, when new wet compartments no longer form after the peeling off). The first day when the scab completely disappears, is not included in the duration of this period. It is calculated as the difference between the day the last crust falls off and the day the scab appears;

период восстановления - со дня отслоения струпа до восстановления эпителия сходного по внешнему виду с неповрежденным эпителием. Этот период заканчивается, когда вся кожа в месте ожога имеет обычный цвет, рисунок и структуру и не отличается от окружающей кожи или же сохраняет длительное время небольшие пятна более темного или светлого цвета. Рассчитывается как разница между днем регистрации эпителия сходного по внешнему виду с неповрежденным эпителием и днем отслоения струпа.recovery period - from the day the scab exfoliates to the restoration of an epithelium similar in appearance to an intact epithelium. This period ends when all the skin at the burn site has the usual color, pattern and structure and does not differ from the surrounding skin or for a long time retains small spots of a darker or lighter color. It is calculated as the difference between the day of registration of an epithelium similar in appearance to an intact epithelium and the day of scab detachment.

Затем в каждой группе проводили расчет средней арифметической величины длительности каждого периода и ошибки средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием t-критерия Стьюдента (р≤0,05).Then, in each group, the arithmetic mean value of the duration of each period and the arithmetic mean error were calculated. The significance of differences in the parameters in the experimental groups was determined using t-student criterion (p≤0.05).

Критерием эффективности испытываемых химических веществ служит сокращение длительности периодов лучевого поражения кожи (например, более быстрое восстановление), или снижение тяжести повреждения, например, формирование более легкой степени ожога, более длинный латентный период, отсутствие периодов влажного эпидермита, струпа в группах облученных мышей, получающих испытываемое вещество.The criterion for the effectiveness of the tested chemicals is a reduction in the duration of radiation exposure of the skin (for example, faster recovery), or a decrease in the severity of damage, for example, the formation of a milder degree of burn, a longer latent period, the absence of periods of wet epidermitis, scab in groups of irradiated mice receiving test substance.

8. Гистологические исследования8. Histological studies

Для сопоставления и интерпретации результатов гистологических исследований кроме указанных выше экспериментальных групп формировали дополнительную группу животных, которые не подвергались никакому воздействию (биологический контроль). В этом случае результаты гистологических исследований характеризовали состояние нормальной интактной кожи.To compare and interpret the results of histological studies, in addition to the above experimental groups, an additional group of animals was formed that were not exposed to any effect (biological control). In this case, the results of histological studies characterized the condition of normal intact skin.

Гистологические исследования кожи проводили на 7-е (деструктивная фаза местных лучевых поражений кожи), 21-е (репаративная фаза местных лучевых поражений кожи) и 35-е (период эптелизации) сутки после облучения животных.Histological studies of the skin were carried out on the 7th (destructive phase of local radiation injuries of the skin), 21st (reparative phase of local radiation injuries of the skin) and 35th (period of eptelization) days after irradiation of animals.

Мышь взвешивали, затем умерщвляли методом дислокации шейных позвонков, иссекали участок облученной кожи. Исследовались фрагменты кожи мышей, взятые из зоны облученной кожи и граничащие с ней участки. Материал фиксировался в 10% растворе забуференного формалина (рН=7,2) и заливались в специальную среду «Гистомикс». С каждого блока-кассеты были изготовлены серийные плоскопараллельные срезы толщиной 4-5 мкм. Серийные гистологические срезы депарафинировали, окрашивали по общепринятым рутинным и специальным методикам, изложенным в ряде известных руководств, далее проводили и заключали препараты по методу Гвинн-Воона и Барнса. Анализ линейных значений и площадей исследуемых структур оценивали при помощи программно-аппаратного комплекса для анализа и обработки изображений в микроскопии - «ВидеоТест - Морфология 5.0». При помощи программно-аппаратного комплекса для анализа и обработки изображений в микроскопии - «ВидеоТест - Морфология 5.0» проводили измерение толщины эпидермиса, подсчет слоев эпидермиса, количества придатков кожи (волосяных фолликулов) в зоне ожоговой раны, определяли площадь срезов.The mouse was weighed, then it was sacrificed by the method of cervical vertebra dislocation, and a section of irradiated skin was excised. We studied fragments of the skin of mice taken from the zone of irradiated skin and bordering on it. The material was fixed in a 10% buffered formalin solution (pH = 7.2) and poured into a special “Histomix” medium. Serial plane-parallel sections 4-5 microns thick were made from each block-cassette. Serial histological sections were deparaffined, stained according to generally accepted routine and special techniques described in a number of well-known manuals, and then preparations were made and concluded according to the Gwynn-Vaughn and Barnes method. Analysis of linear values and areas of the studied structures was evaluated using a hardware-software complex for analysis and processing of images in microscopy - “VideoTest - Morphology 5.0”. Using the software-hardware complex for analyzing and processing images in microscopy - VideoTest - Morphology 5.0, we measured the thickness of the epidermis, counted the layers of the epidermis, the number of skin appendages (hair follicles) in the area of the burn wound, and determined the area of the sections.

Для проведения обзорной микроскопии все срезы окрашивались гематоксилином-эозином. Для выявления тучных клеток серийные парафиновые срезы окрашивались по Романовскому-Гимзе. Подсчет исследуемых критериев проводился в 10 полях зрения при увеличении 400*.To conduct an overview microscopy, all sections were stained with hematoxylin-eosin. To detect mast cells, serial paraffin sections were stained according to Romanovsky-Giemsa. The study criteria were calculated in 10 fields of view with an increase of 400 *.

9. Результаты клинических наблюдений9. Results of clinical observations

В экспериментах по определению наиболее эффективного способа введения липосомального белкового препарата, включающего рчАФП + рчГКСФ, для получения у мышей ожога IIIA степени проводили локальное облучение кожи спины в дозе 60 Гр. Результаты наблюдений клинической картины лучевого ожога представлены на Фиг. 6.In experiments to determine the most effective method of administering a liposomal protein preparation, including rhAFP + rhGKSF, a local irradiation of the back skin at a dose of 60 Gy was carried out to obtain IIIA degree burns. The results of observations of the clinical picture of radiation burn are presented in FIG. 6.

Применение микроэмульсии антиоксидантов и липосомального препарата А2, содержащего рчАФП и рчГКСФ не привело к достоверным изменениям длительности различных этапов течения ожога при трансдермальном введении препарата, по сравнению с подкожным введением (группы 1 и 2 соответственно). Следует отметить, что при трансдермальном способе введения препарата длительность репаративной фазы (длительность периода струпа и периода восстановления) были несколько короче, по сравнению с эффектом подкожного введения препарата, но достоверно не отличались в группах.The use of a microemulsion of antioxidants and a liposomal preparation A2 containing rhAFP and rhGCSF did not lead to significant changes in the duration of various stages of the burn during transdermal administration of the drug, compared with subcutaneous administration (groups 1 and 2, respectively). It should be noted that with the transdermal route of administration of the drug, the duration of the reparative phase (the length of the scab period and recovery period) was somewhat shorter compared with the effect of subcutaneous administration of the drug, but did not significantly differ in the groups.

Таким образом, по клиническим признакам трансдермальный способ введения препарата не уступает эффекту подкожного введения.Thus, according to clinical signs, the transdermal route of administration of the drug is not inferior to the effect of subcutaneous administration.

10. Результаты гистологических исследований10. Results of histological studies

При анализе гистологических изменений в зоне ожога (Таблицы 1-3) не было выявлено достоверных различий при использовании трансдермального и подкожного способов введения липосомального препарата, за исключением количества волосяных фолликулов на 35-е сутки после облучения. В этот период количество придатков кожи приблизительно в группе с трансдермальным введением препарата в 2 раза превышало показатель в группе с подкожным введением (Таблица 3).When analyzing the histological changes in the burn area (Tables 1-3), no significant differences were found when using the transdermal and subcutaneous methods of administering a liposomal preparation, with the exception of the number of hair follicles on the 35th day after irradiation. During this period, the number of skin appendages approximately in the group with transdermal administration of the drug was 2 times higher than in the group with subcutaneous administration (Table 3).

Таким образом, по гистологическим показателям можно заключить, что трансдермальный способ введения липосомального препарата не уступает подкожному введению.Thus, according to histological indicators, we can conclude that the transdermal route of administration of a liposomal preparation is not inferior to subcutaneous administration.

ЗаключениеConclusion

Данные клинических наблюдений и гистологические исследования показывают, что трансдермальный способ введения липосомального препарата по эффективности не уступает подкожному способу введения. Одновременно с этим трансдермальное введение препарата является не инвазивным способом, по сравнению с подкожным, что снижает вероятность инфекционных осложнений и исключает дополнительную травматизацию вблизи ожоговой раны. Все это позволяет определить трансдермальный способ введения как более преимущественный по сравнению с подкожным введением липосомального белкового препарата.Clinical observations and histological studies show that the transdermal route of administration of a liposome preparation is not inferior in effectiveness to the subcutaneous route of administration. At the same time, transdermal administration of the drug is a non-invasive method, compared with subcutaneous, which reduces the likelihood of infectious complications and eliminates additional trauma near the burn wound. All this makes it possible to determine the transdermal route of administration as more advantageous compared with subcutaneous administration of a liposomal protein preparation.

Пример 4. Выбор и обоснование наиболее эффективной схемы применения липосомального препаратаExample 4. The selection and justification of the most effective regimen for the use of liposome preparation

В экспериментах была проведена оценка эффективности препаратов для профилактики и лечения радиационных поражений кожи в зависимости от времени нанесения препарата на пораженный участок кожи относительно облучения.In the experiments, the effectiveness of the preparations for the prevention and treatment of radiation damage to the skin was evaluated depending on the time of application of the drug to the affected area of the skin relative to radiation.

В экспериментах были использованы самцы мышей стока CD1 в возрасте 3-4 мес на начало эксперимента, массой 24-26 г, полученные из питомника НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН (ветеринарное свидетельство 250 №0543060). (см. Пример 3, раздел 1).In the experiments, male CD1 stock mice aged 3-4 months were used at the beginning of the experiment, weighing 24-26 g, obtained from the nursery NPP Nursery for laboratory animals of the FIBCH RAS (veterinary certificate 250 No. 0543060). (see Example 3, section 1).

Для облучения мышей использовали систему ускорителя Elekta Synergy (Elekta Limited, Великобритания), ГБУЗ "Челябинский областной клинический онкологический диспансер". Условия облучения подробно описаны в разделе 3, Пример 3.For irradiation of mice, the Elekta Synergy accelerator system (Elekta Limited, Great Britain) and the Chelyabinsk Regional Clinical Oncology Dispensary were used. Irradiation conditions are described in detail in Section 3, Example 3.

Оценивали эффективность препарата по клиническим критериям течения раневого процесса после локального облучения кожи мышей в дозе 60 Гр (ожог IIIA степени) (см. Пример 3, раздел 7). У животных всех групп проводили в динамике ежедневные клинические наблюдения за ожоговой раной в течение 60 суток после облучения (Фиг. 7).Evaluated the effectiveness of the drug according to the clinical criteria for the course of the wound process after local irradiation of the skin of mice at a dose of 60 Gy (IIIA degree burn) (see Example 3, section 7). In animals of all groups, daily clinical observations of a burn wound were performed in dynamics 60 days after irradiation (Fig. 7).

Для каждого животного рассчитывали длительность периодов деструктивной и репаративной фаз, а также отдельных стадий: латентной стадии, стадии сухого и влажного эпидермита, стадии струпа, стадии эпителизации. Для исследуемых показателей проводили расчет средней арифметической величины и ошибки показателей средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием t-критерия Стьюдента (р≤0,05).For each animal, the duration of the periods of the destructive and reparative phases, as well as the individual stages: the latent stage, the stage of dry and wet epidermitis, the scab stage, and the epithelialization stage were calculated. For the studied indicators, the calculation of the arithmetic mean value and the errors of the arithmetic mean values were performed. The significance of differences in the parameters in the experimental groups was determined using t-student criterion (p≤0.05).

1. Характеристика препарата и способа применения1. Characterization of the drug and method of use

Тестировали препарат - липосомы, содержащие 0,5 мг/мл рчАФП, 0,02 мг/мл рчГКСФ, 10 мг/мл фосфолипидов.We tested the drug - liposomes containing 0.5 mg / ml rhAFP, 0.02 mg / ml rh-GCSF, 10 mg / ml phospholipids.

Трансдермальное нанесение 180-200 мкл липосомального препарата (доза соответствует единичной терапевтической дозе рчАФП и рчГКСФ препарата) проводили с использованием дозатора-распрыскивателя с расстояния 1 см от поверхности кожи.Transdermal application of 180-200 μl of a liposome preparation (the dose corresponds to a single therapeutic dose of rhAFP and rhGKSF preparation) was carried out using a dispenser from a distance of 1 cm from the skin surface.

Разовые дозы и дозы рчАФП на курс представлены на Фиг. 7.Single doses and doses of rhAFP per course are presented in FIG. 7.

2. Схема эксперимента2. Experiment design

В эксперименте тестировали 3 схемы трансдермального (с помощью дозатора-распрыскивателя) нанесения препарата на кожу мышей (Фиг. 7).In the experiment, 3 schemes of transdermal (using a dispenser-sprayer) application of the drug to the skin of mice were tested (Fig. 7).

1) Схема «Профилактика» - препарат ежедневно наносили на эпилированный участок кожи спины мышей в течение 5 суток до облучения.1) Scheme "Prevention" - the drug was applied daily to the epilated area of the skin of the back of mice for 5 days before irradiation.

2) Схема «Лечение» - препарат наносили на эпилированный участок локально облученной кожи спины мышей на 1-5 сутки, а затем на 6-10 сутки и на 13, 18, 25 сутки после облучения кожи. Нанесение препарата непосредственно после облучения и до появления симптомов лучевого дерматита является экстренной профилактикой, поэтому схема «Лечение» включает в себя применение препарата в качестве экстренной профилактики и лечения.2) "Treatment" scheme - the drug was applied to the epilated area of locally irradiated skin of the back of mice on days 1-5, and then on days 6-10 and 13, 18, 25 days after skin irradiation. The application of the drug immediately after irradiation and before the onset of symptoms of radiation dermatitis is an emergency prevention, so the "Treatment" scheme includes the use of the drug as an emergency prevention and treatment.

3) Схема «Профилактика + Лечение» - ежедневно наносили препарат на эпилированный участок кожи спины мышей в течение 5 суток до облучения, а затем на 1-5 суток, на 6-10 сутки и на 13, 18, 25 сутки после облучения.3) Scheme "Prevention + Treatment" - daily applied the drug to the epilated area of the skin of the back of mice for 5 days before irradiation, and then for 1-5 days, for 6-10 days and 13, 18, 25 days after irradiation.

В соответствии со схемой эксперимента были сформированы 4 группы мышей численностью по 20 животных в каждой (Табл. 4).In accordance with the experimental design, 4 groups of mice of 20 animals each were formed (Table 4).

3. Результаты клинических наблюдений3. The results of clinical observations

Результаты наблюдений за клинической картиной патогенеза ожога кожи у мышей представлены на Фиг. 8. Общее время с момента облучения и до восстановления эпителия у мышей, у которых было проведено локальное облучение кожи в дозе 60 Гр без лечения (группа 1), составило 48,2±3,7 суток. Длительность латентного периода формирования лучевого ожога составила 5±0,3 суток. Длительность стадии сухого и влажного эпидермита до формирования струпа составила 11,3±0,3 суток. Репаративный период (период струпа и эпителизации) составил 31,8 суток.The results of observation of the clinical picture of the pathogenesis of skin burns in mice are presented in FIG. 8. The total time from the moment of irradiation to the restoration of the epithelium in mice that underwent local skin irradiation at a dose of 60 Gy without treatment (group 1) was 48.2 ± 3.7 days. The duration of the latent period of radiation burn formation was 5 ± 0.3 days. The duration of the stage of dry and wet epidermitis before the formation of the scab was 11.3 ± 0.3 days. The reparative period (the period of the scab and epithelization) was 31.8 days.

При оценке влияния липосом, содержащих 0,5 мг рчАФП + 0,02 мг рчГКСФ на патогенез лучевого ожога кожи IIIА степени были получены следующие результаты. При использовании всех трех схем «Профилактика», «Лечение» и «Профилактика + Лечение» (группы 2, 3, 4 соответственно) регистрировалось достоверное сокращение времени восстановления эпителия на месте лучевого ожога, и этот показатель составил соответственно 33,8+2,5; 30,0+1,7; 28,8+1,5 суток при 48,2+3,7 суток у облученных нелеченых мышей. Длительность деструктивного периода составила соответственно 12,6+0,9; 14,4+0,2; 13,8+0,5 суток при 16,3+0,4 суток в группе облученных нелеченых мышей; длительность репаративного периода - соответственно 21,2+2,2; 15,6+1,8; 15,0+2,0 суток при 31,8+3,9 суток в группе облученных нелеченых мышей.When assessing the effect of liposomes containing 0.5 mg rhAFP + 0.02 mg rhGCSF on the pathogenesis of radiation burn of the skin of the IIIA degree, the following results were obtained. When using all three schemes “Prevention”, “Treatment” and “Prevention + Treatment” (groups 2, 3, 4, respectively), a significant reduction in the time of restoration of the epithelium at the site of a radiation burn was recorded, and this indicator was 33.8 + 2.5, respectively ; 30.0 + 1.7; 28.8 + 1.5 days at 48.2 + 3.7 days in irradiated untreated mice. The duration of the destructive period was 12.6 + 0.9, respectively; 14.4 + 0.2; 13.8 + 0.5 days at 16.3 + 0.4 days in the group of irradiated untreated mice; the duration of the reparative period is 21.2 + 2.2, respectively; 15.6 + 1.8; 15.0 + 2.0 days at 31.8 + 3.9 days in the group of irradiated untreated mice.

Кроме того, в группе мышей, где липосомальный препарат с белками применяли по схемам «Лечение» и «Лечение + Профилактика», регистрировалось достоверное увеличение скрытого периода и достоверное сокращение длительности периода эпидермита, что является положительным эффектом в лечении лучевых ожогов. Поскольку эти эффекты не наблюдались при использовании схемы «Профилактика», то можно предположить, что они в большей мере обусловлены нанесением препарата по схеме «Лечение».In addition, in the group of mice where the liposome preparation with proteins was used according to the “Treatment” and “Treatment + Prevention” schemes, a significant increase in the latent period and a significant reduction in the duration of the epidermitis period were recorded, which is a positive effect in the treatment of radiation burns. Since these effects were not observed when using the "Prevention" scheme, it can be assumed that they are largely due to the application of the drug according to the "Treatment" scheme.

ЗаключениеConclusion

Таким образом, анализ результатов исследования показал следующее:Thus, the analysis of the results of the study showed the following:

- трансдермальное применение липосомального препарата, содержащего 0,5 мг рчАФП + 0,02 мг рчГКСФ, оказывают благоприятное действие на течение лучевого ожога: сокращение общего времени заживления лучевого ожога при использовании схемы «Профилактика» относительно облученных нелеченых животных составило 28%; при использовании схем «Лечение» и «Профилактика + Лечение» составило соответственно 38% и 40%. При нанесении препарата по схеме «Лечение» регистрируется достоверное увеличение длительности латентного периода, уменьшение длительности стадии эпидермита и репаративного периода;- transdermal use of a liposomal preparation containing 0.5 mg rhAFP + 0.02 mg rh-GCSF has a beneficial effect on the course of a radiation burn: the reduction in the total healing time of a radiation burn when using the “Prevention” scheme relative to irradiated untreated animals was 28%; when using the schemes "Treatment" and "Prevention + Treatment" was 38% and 40%, respectively. When applying the drug according to the "Treatment" scheme, a significant increase in the duration of the latent period, a decrease in the duration of the stage of epidermitis and the reparative period are recorded;

- наиболее оптимальным, как с точки зрения биологического эффекта, так и с точки зрения практического проведения процедуры нанесения препарата на место радиационного поражения кожи, является применение липосомальных препаратов по схеме «Лечение».- the most optimal, both from the point of view of the biological effect, and from the point of view of the practical implementation of the procedure for applying the drug to the site of radiation damage to the skin, is the use of liposome preparations according to the "Treatment" scheme.

Пример 5. Выбор и обоснование наиболее эффективной концентрации рчАФП в липосомальном препаратеExample 5. The choice and justification of the most effective concentration of rhFAP in a liposome preparation

В исследовании выполнена оценка влияния концентрации рчАФП в липосомальном препарате при трансдермальном нанесении (с помощью дозатора-распрыскивателя) по схеме «Лечение» на течение лучевого ожога кожи IIIA степени.The study evaluated the effect of the concentration of rhAFP in the liposome preparation during transdermal application (using a dispenser) according to the “Treatment” scheme for the course of radiation burn of the skin of the IIIA degree.

В экспериментах были использованы самцы мышей стока CD1 в возрасте 3-4 мес на начало эксперимента, массой 24-26 г полученные из питомника НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН (ветеринарное свидетельство 250 №0543060) (см. Пример 3, раздел 1).In the experiments, male CD1 runoff mice aged 3-4 months were used at the beginning of the experiment, weighing 24-26 g obtained from the nursery NPP Nursery for laboratory animals of the FIBCH RAS (veterinary certificate 250 No. 0543060) (see Example 3, section 1).

Для облучения кожи мышей использовали систему ускорителя Elekta Synergy (Elekta Limited, Великобритания), ГБУЗ "Челябинский областной клинический онкологический диспансер". Условия облучения подробно описаны в разделе 3, Пример 3.To irradiate the skin of mice, we used the Elekta Synergy accelerator system (Elekta Limited, UK), the Chelyabinsk Regional Clinical Oncology Dispensary. Irradiation conditions are described in detail in Section 3, Example 3.

Оценивали эффективность препарата по клиническим критериям течения раневого процесса и данным гистологических исследований после локального облучения кожи мышей в дозе 60 Гр (ожог IIIA степени) (см. Пример 3, раздел 7, 8). У животных всех групп проводили в динамике ежедневные клинические наблюдения за ожоговой раной в течение 60 суток после облучения, гистологические исследования кожи (см. Пример 3, раздел 8) на 7, 21 и 35 сутки после облучения в соответствии со схемой эксперимента (Фиг. 9).Evaluated the effectiveness of the drug according to the clinical criteria for the course of the wound process and histological studies after local irradiation of the skin of mice at a dose of 60 Gy (IIIA degree burn) (see Example 3, section 7, 8). In animals of all groups, daily clinical observations of a burn wound within 60 days after irradiation, histological examination of the skin (see Example 3, section 8) on days 7, 21 and 35 after irradiation in accordance with the experimental design (Fig. 9) were performed in dynamics. )

Для каждого животного рассчитывали длительность периодов деструктивной и репаративной фаз, а также отдельных стадий: латентной стадии, стадии сухого и влажного эпидермита, стадии струпа, стадии эпителизации (см. Пример 3, раздел 7).For each animal, the duration of the periods of the destructive and reparative phases, as well as of the individual stages: the latent stage, the stage of dry and wet epidermitis, the scab stage, and the epithelialization stage were calculated (see Example 3, section 7).

Для исследуемых показателей проводили расчет средней арифметической величины и ошибки показателей средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием t-критерия Стьюдента (р≤0,05). Для оценки зависимости анализируемых показателей от концентрации рчАФП в липосомальном препарате проводили регрессионный анализ.For the studied indicators, the calculation of the arithmetic mean value and the errors of the arithmetic mean values were performed. The significance of differences in the parameters in the experimental groups was determined using t-student criterion (p≤0.05). To assess the dependence of the analyzed parameters on the concentration of rhAFP in the liposome preparation, a regression analysis was performed.

1. Характеристика препаратов и способа применения1. Characterization of drugs and method of use

Тестировали липосомальные препараты, имеющие следующий состав:Tested liposome preparations having the following composition:

1) 0,1 мг/мл рчАФП + 0,02 мг/мл рчГКСФ;1) 0.1 mg / ml rhAFP + 0.02 mg / ml rhGKSF;

2) 0,5 мг/мл рчАФП + 0,02 мг/мл рчГКСФ;2) 0.5 mg / ml rhAFP + 0.02 mg / ml rhGKSF;

3) 1 мг/мл рчАФП + 0,02 мг/мл рчГКСФ.3) 1 mg / ml rhAFP + 0.02 mg / ml rhGKSF.

Трансдермальное нанесение 180-200 мкл липосомальных препаратов проводили с использованием дозатора-распрыскивателя с расстояния 1 см от поверхности кожи.Transdermal application of 180-200 μl of liposome preparations was carried out using a dispenser from a distance of 1 cm from the skin surface.

Сроки нанесения препаратов, разовые дозы и дозы на курс представлены на Фиг. 9.The timing of the application of drugs, single doses and doses per course are presented in FIG. 9.

2. Схема эксперимента2. Experiment design

Тестирование проводили по схеме «Лечение» - препарат наносили на эпилированный участок локально облученной кожи спины мышей на 1-5 сутки, а затем на 6-10 сутки и на 13, 18, 25 сутки после облучения кожи (Фиг. 9). Нанесение препарата непосредственно после облучения и до появления симптомов лучевого дерматита является экстренной профилактикой, поэтому схема «Лечение» включает в себя применение препарата в качестве экстренной профилактики и лечения.Testing was carried out according to the "Treatment" scheme - the drug was applied to the epilated area of locally irradiated skin of the back of mice on days 1-5, and then on days 6-10 and 13, 18, 25 days after skin irradiation (Fig. 9). The application of the drug immediately after irradiation and before the onset of symptoms of radiation dermatitis is an emergency prevention, so the "Treatment" scheme includes the use of the drug as an emergency prevention and treatment.

В соответствии со схемой эксперимента были сформированы 5 групп мышей численностью по 20 животных в каждой (табл. 1).In accordance with the experimental design, 5 groups of mice of 20 animals each were formed (Table 1).

Общее время с момента облучения и до восстановления эпителия у облученных нелеченых мышей (Фиг. 10, группа 2) составило 47,8±1,4 суток; длительность периода деструкции составила 14,2±0,2 суток, а периода репарации и эпителизации - 33,6±1,2 суток.The total time from the moment of irradiation to the restoration of the epithelium in irradiated untreated mice (Fig. 10, group 2) was 47.8 ± 1.4 days; the duration of the destruction period was 14.2 ± 0.2 days, and the period of repair and epithelization was 33.6 ± 1.2 days.

Применение для лечения радиационного ожога кожи липосомального препарата, содержащего белки рчАФП + рчГКСФ, привело к достоверному сокращению длительности восстановления эпителия после облучения кожи в дозе 60 Гр практически в 1,5 раза по отношению к облученному нелеченому контролю во всех трех дозовых группах по рчАФП.The use of a liposomal preparation containing rhAFP + rhGCSF proteins for the treatment of radiation burns of the skin led to a significant reduction in the duration of epithelial recovery after irradiation of the skin at a dose of 60 Gy by almost 1.5 times in relation to the irradiated untreated control in all three dose groups for rhAFP.

Однако динамика формирования и заживления ожоговой раны имела свои особенности в зависимости от содержания в липосомальном препарате рчАФП. При трансдермальном нанесении липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрациях 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл не выявлено изменения длительности скрытого периода и стадий сухого и влажного эпидермита, но регистрировалось укорочение длительности репарации и эпителизации ожоговой раны. В период воспаления важным является перевод влажного некроза в сухой струп, что уменьшает вероятность микробной обсемененности ожоговой раны. В нашем исследовании наиболее выраженное сокращение экссудативной стадии регистрируется при нанесении на лучевой ожог кожи липосомального препарата, содержащего 1 мг/мл рчАФП. В этом случае наблюдается увеличение скрытого периода на 20% (недостоверно) и достоверное уменьшение длительности экссудативной стадии (сухой и влажный эпидермит) на 35% по сравнению с показателями у облученных нелеченых мышей.However, the dynamics of the formation and healing of a burn wound had its own characteristics depending on the content of rhAPP in the liposomal preparation. During transdermal application of a liposomal preparation containing rfAFP in concentrations of 0.1 mg / ml and 0.5 mg / ml, no changes in the duration of the latent period and stages of dry and wet epidermitis were detected, but a shortening of the duration of repair and epithelization of the burn wound was recorded. During the period of inflammation, it is important to transfer wet necrosis to a dry scab, which reduces the likelihood of microbial contamination of a burn wound. In our study, the most pronounced reduction in the exudative stage is recorded when a liposome preparation containing 1 mg / ml rhAFP is applied to the skin burn. In this case, there is an increase in the latent period by 20% (unreliable) and a significant decrease in the duration of the exudative stage (dry and wet epidermitis) by 35% compared with indices in irradiated untreated mice.

На Фиг. 11 приведены графики зависимости длительности стадий течения лучевого ожога от концентрации рчАФП в липосомальном препарате. С увеличением содержания рчАФП в липосомальном препарате, наблюдалось дозозависимое удлинение скрытого периода и укорочение стадий сухого и влажного эпидермита, а также в целом деструктивного периода. Наиболее выраженный эффект наблюдался в группе, где применяли препарат, содержащий 1 мг/мл рчАФП.In FIG. 11 shows graphs of the dependence of the duration of the stages of the course of a radiation burn on the concentration of rhAFP in a liposome preparation. With an increase in the rhAFP content in the liposomal preparation, a dose-dependent lengthening of the latent period and shortening of the stages of dry and wet epidermitis, as well as the overall destructive period, were observed. The most pronounced effect was observed in the group where a preparation containing 1 mg / ml rhAPP was used.

Регрессионный анализ показал, что увеличение концентрации рчАФП в липосомальном препарате приводит к снижению длительности скрытого периода (р=0,05; F=4,1), стадии сухого эпидермита (р<0,0001; F=16,2), влажного эпидермита (р<0,024; F=5,7), в целом деструктивного периода (р<0,0001; F=24,4) и не влияло на длительность стадии струпа (р=0,77; F=0,390).Regression analysis showed that an increase in the concentration of rhFAP in the liposome preparation leads to a decrease in the duration of the latent period (p = 0.05; F = 4.1), the stage of dry epidermitis (p <0.0001; F = 16.2), and wet epidermitis (p <0.024; F = 5.7), in the whole of the destructive period (p <0.0001; F = 24.4) and did not affect the duration of the scab stage (p = 0.77; F = 0.390).

4. Гистологические исследования4. Histological studies

Гистологические исследования позволили получить дополнительную информацию, подтверждающую выявленные клинические эффекты исследуемого липосомального препарата. Четкие и достоверные результаты были получены при изучении состояния эпидермиса в зоне лучевого ожога у мышей во все сроки гистологического обследования. На 7-е сутки после облучения толщина и количество слоев эпидермиса в зоне ожога увеличивались с повышением концентрации рчАФП в липосомальном препарате (Табл. 6, 3). Толщина эпидермиса на 7-е сутки после локального облучения кожи в группе, где животные получали липосомальный препарат с концентрацией рчАФП 1 мг/мл была достоверно на 50% больше, а количество слоев эпидермиса на 70% достоверно превышало значение показателя в гамма-контроле. Проведение регрессионного анализа показало высокодостоверное влияние фактора "концентрация рчАФП в липосомальном препарате" на толщину эпидермиса (R²=0,09; t_cт=12,01; р=0,00073) и количество слоев эпидермиса (R²=0,08; t_cт=10,12; р=0,0019) в зоне лучевого ожога.Histological studies allowed to obtain additional information confirming the revealed clinical effects of the studied liposome preparation. Clear and reliable results were obtained by studying the state of the epidermis in the zone of radiation burn in mice at all stages of histological examination. On the 7th day after irradiation, the thickness and number of epidermal layers in the burn zone increased with increasing concentration of rhAFP in the liposome preparation (Table 6, 3). The thickness of the epidermis on the 7th day after local skin irradiation in the group where the animals received a liposomal preparation with a rhFAP concentration of 1 mg / ml was significantly 50% greater, and the number of epidermal layers was 70% significantly higher than the value in the gamma control. Regression analysis showed a highly reliable influence of the factor “rhAFP concentration in the liposome preparation” on the epidermis thickness (R ² = 0.09; t _ct = 12.01; p = 0.00073) and the number of epidermal layers (R ² = 0.08; t _ct = 10.12; p = 0.0019) in the zone of radiation burn.

На 21-е сутки после локального облучения кожи в группе гамма-контроля регистрировалось существенное увеличение толщины и количества слоев эпидермиса по сравнению с биологическим контролем и значением показателя на 7-е сутки после облучения, что еще раз подтверждает, что увеличение толщины и количества слоев эпидермиса является признаком и определенным этапом восстановления повреждения кожи в зоне ожога. На 35-е сутки после локального облучения кожи в группе гамма-контроля наблюдалось восстановление архитектоники эпидермиса кожи, что проявлялось в снижении, приблизительно, в 2 раза толщины и количества слоев эпидермиса по отношению к значению показателя на 21-е сутки после облучения. Одновременно с этим на 35-е сутки эксперимента толщина и количество слоев эпидермиса в ожоговой ране было все еще, приблизительно, 4 раза больше, чем в интактной коже и в 2-3 раза больше, чем на 7-е сутки обследования.On the 21st day after local skin irradiation, a significant increase in the thickness and number of epidermal layers was recorded in the gamma control group compared to the biological control and the value of the indicator on the 7th day after irradiation, which once again confirms that an increase in the thickness and number of epidermal layers is a sign and a certain stage in the restoration of skin damage in the burn zone. On the 35th day after local skin irradiation in the gamma control group, the restoration of the epidermal architectonics of the skin was observed, which was manifested in a decrease of approximately 2 times the thickness and number of layers of the epidermis with respect to the value on the 21st day after irradiation. At the same time, on the 35th day of the experiment, the thickness and number of layers of the epidermis in the burn wound was still approximately 4 times greater than in intact skin and 2-3 times greater than on the 7th day of the examination.

Анализ динамики этого показателя в группах, где использовали липосомальный препарат с различной концентрацией рчАФП, позволяет четко определить направленность биологического действия липосомального препарата. В целом, эффект препарата можно охарактеризовать как более быстрое включение и более быстрое течение процессов восстановления эпидермиса в лучевой ране. Так, на примере состояния эпидермиса в зоне лучевого ожога после применения липосомального препарата с концентрацией рчАФП 1 мг/мл видно, что после быстрого включения процессов восстановления эпидермиса на 7-е сутки после локального облучения кожи, вскоре наступает и более быстрое восстановление эпидермиса: на 21-е сутки регистрируется достоверное, практически двукратное снижение толщины и количества слоев эпидермиса в зоне поражения, по сравнению с гамма-контролем. По этим показателям состояние ожоговой раны на 21-е сутки при применении липосомального препарата (1 мг/мл рчАФП) фактически соответствует состоянию раны в группе гамма-контроля на 35 сутки. И далее, на 35 сутки состояние эпидермиса в группах с липосомальными препаратами существенно ближе к значению в группе биологического контроля: в это время уже толщина (t_ст=1,76; р=0,12) и количество слоев эпидермиса (t_ст=1,97; р=0,08) уже достоверно не отличаются от значения показателей в группе биологического контроля. Крайне важно отметить, что и на 21-е, и на 35-е сутки была выявлена высоко достоверная зависимость показателей состояния эпидермиса в зоне повреждения от концентрации рчАФП в липосомальном препарате: на 21-е сутки (R²=0,18; t_ст=31,73; р=8,7Е-08) и на 35 сутки (R²=0,10; t_ст=13,37; р=0,00038) было зарегистрировано достоверное влияние концентрации рчАФП на толщину эпидермиса и на количество его слоев в зоне поражения - (R²=0,19; t_ст=34,04; р=3,3Е-08), (R²=0,13; t_ст=18,00; р=4,4Е-5) на 21-е и 35-е сутки, соответственно.An analysis of the dynamics of this indicator in groups where a liposomal preparation with a different concentration of rhAPP was used allows one to clearly determine the direction of the biological effect of the liposomal preparation. In general, the effect of the drug can be characterized as a more rapid inclusion and faster course of epidermal restoration processes in a radiation wound. So, using the example of the state of the epidermis in the area of a radiation burn after applying a liposomal preparation with a rhAFP concentration of 1 mg / ml, it is seen that after the rapid activation of epidermal recovery processes on the 7th day after local skin irradiation, a faster epidermis recovery soon occurs: by 21 on the 24th day, a reliable, almost twofold decrease in the thickness and number of epidermal layers in the affected area is recorded, compared with gamma control. According to these indicators, the state of the burn wound on the 21st day with the use of a liposomal preparation (1 mg / ml rhAFP) actually corresponds to the state of the wound in the gamma control group on the 35th day. And further, on the 35th day, the state of the epidermis in groups with liposomal preparations is significantly closer to the value in the biological control group: at this time, the thickness (t _article = 1.76; p = 0.12) and the number of layers of the epidermis (t _article = 1 , 97; p = 0.08) already do not significantly differ from the values of the indicators in the biological control group. It is extremely important to note that on the 21st and on the 35th day a highly reliable dependence of the indicators of the state of the epidermis in the damage zone on the concentration of rhAFP in the liposome preparation was revealed: on the 21st day (R ² = 0.18; t _st = 31.73; p = 8.7E-08) and on the 35th day (R ² = 0.10; t _article = 13.37; p = 0.00038), a significant effect of rhAPP concentration on the epidermis thickness and on the amount was recorded its layers in the affected area - (R ² = 0.19; t _article = 34.04; p = 3.3E-08), (R ² = 0.13; t _article = 18.00; p = 4.4E -5) on the 21st and 35th days, respectively.

Сочетание нескольких факторов (достоверные отличия по показателям состояния эпидермиса в зоне поражения в экспериментальных группах, где применяли липосомальный препарат; четкая достоверное влияние концентрации рчАФП в липосомальном препарате на показатели состояния эпидермиса во все сроки обследования), а также сопоставление показателей в группе гамма-контроля и группы, где животные получали липосомальный препарат с концентрацией 1 мг/мл рчАФП, позволяет уверенно заключить, что липосомальный препарат обладает выраженным эффектом, проявляющимся в более быстром восстановлении эпидермиса в зоне локального лучевого ожога кожи. При этом результатов гистологических исследований следует, что при применении липосомального препарата с концентрацией рчАФП 1 мг/мл восстановление эпидермиса происходит на 2 недели быстрее, по сравнению с динамикой восстановления эпидермиса в группе гамма-контроля.A combination of several factors (significant differences in the indicators of the state of the epidermis in the affected area in the experimental groups where the liposome preparation was used; a clear significant effect of the concentration of rhAFP in the liposome preparation on the indicators of the state of the epidermis at all stages of the examination), as well as a comparison of the indicators in the gamma control group and groups where animals received a liposomal preparation with a concentration of 1 mg / ml rhAPP, allows us to confidently conclude that the liposomal preparation has a pronounced effect, We proceed with a more rapid recovery of the epidermis in the area of local radiation skin burn. Moreover, the results of histological studies suggest that when applying a liposomal preparation with a rhAFP concentration of 1 mg / ml, epidermis recovery occurs 2 weeks faster compared to the dynamics of epidermal recovery in the gamma control group.

Кроме состояния эпидермиса, количество придатков кожи в ожоговой ране является важным показателем, отражающим выраженность радиационного поражения кожи. Анализ количества волосяных фолликулов в зонге поражения в группах, где применяли липосомальный препарат с разной концентрацией рчАФП показал, что при концентрации рчАФП 1 мг/мл регистрируется достоверное увеличение количества этого вида придатков кожи на 7-е и 35-е сутки, по сравнению с группой гамма-контроля. Кроме этого, еще было выявлено достоверно более высокое количество волосяных фолликулов в зоне лучевого поражения на 35-е сутки при применении липосомального препарата с концентрацией рчАФП 0,1 мг/мл. Для этого показателя не было выявлено четкой зависимости от концентрации рчАФП в липосомальном препарате.In addition to the state of the epidermis, the number of skin appendages in a burn wound is an important indicator reflecting the severity of radiation damage to the skin. An analysis of the number of hair follicles in the lesion pond in groups where a liposome preparation with different rhAFP concentrations was used showed that at a rhAFP concentration of 1 mg / ml, a significant increase in the number of this type of skin appendages was recorded on the 7th and 35th days, compared with the group gamma control. In addition, a significantly higher number of hair follicles in the area of radiation damage was revealed on the 35th day when using a liposome preparation with a rhAFP concentration of 0.1 mg / ml. For this indicator, there was no clear dependence on the concentration of rhAFP in the liposome preparation.

Выводыfindings

1. Трансдермальное нанесение липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрациях 1,0; 0,5 и 0,1 мг/мл, по схеме «Лечение» ускоряют процесс заживления лучевого ожога кожи IIIA степени по сравнению с показателями у облученных нелеченых животных.1. Transdermal application of a liposomal preparation containing rhAFP in concentrations of 1.0; 0.5 and 0.1 mg / ml, according to the "Treatment" scheme, accelerate the healing process of radiation burns of the skin of the IIIA degree compared with indicators in irradiated untreated animals.

2. Трансдермальное нанесение липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрации 0,1 мг/мл, по схеме «Лечение» не влияет на длительность скрытого периода и стадий сухого и влажного эпидермита, ускоряет процесс репарации и эпителизации ожоговой раны.2. Transdermal application of a liposome preparation containing rhAFP in a concentration of 0.1 mg / ml according to the “Treatment” scheme does not affect the duration of the latent period and the stages of dry and wet epidermitis, accelerates the repair and epithelization of a burn wound.

3. При трансдермальном нанесении по схеме «Лечение» липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрации 0,5 мг/мл, не выявлено достоверного изменения показателей длительности скрытого и экссудативного периодов, регистрируется достоверное ускорение процесса репарации и эпителизации ожоговой раны.3. During transdermal application according to the “Treatment” scheme of a liposomal preparation containing rhAFP at a concentration of 0.5 mg / ml, there was no significant change in the duration of the latent and exudative periods, a significant acceleration of the repair and epithelization of the burn wound was recorded.

4. При трансдермальном нанесении по схеме «Лечение» липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрации 1,0 мг/мл, выявлено достоверное снижение длительности деструктивного периода, периода репарации и эпителизации.4. During transdermal application according to the “Treatment” scheme, a liposomal preparation containing rhAFP at a concentration of 1.0 mg / ml revealed a significant decrease in the duration of the destructive period, the period of repair and epithelization.

5. При проведении регрессионного анализа показано, что увеличение концентрации рчАФП в липосомальном препарате приводит к дозозависимому увеличению длительности скрытого периода, снижению длительности деструктивного периода.5. When conducting a regression analysis, it was shown that an increase in the concentration of rhAFP in the liposome preparation leads to a dose-dependent increase in the duration of the latent period and a decrease in the duration of the destructive period.

6. Сопоставляя результаты гистологических исследований и данных клинических наблюдений, можно заключить, что в период альтерации защитное действие липосомального препарата зависит от концентрации в нем рчАФП и проявляется в увеличении слоев эпидермиса в зоне лучевого поражения кожи. При этом, наиболее выраженные благоприятные изменения были зарегистрированы при применении липосомального препарата с концентрацией рчАФП 1 мг/мл как по критериям клинических наблюдений, так и по данным гистологических исследований.6. Comparing the results of histological studies and clinical observation data, it can be concluded that during the alteration period, the protective effect of the liposomal preparation depends on the concentration of rhFAP in it and is manifested in an increase in the layers of the epidermis in the area of radiation exposure to the skin. At the same time, the most pronounced favorable changes were recorded with the use of a liposomal preparation with an rhFAP concentration of 1 mg / ml both according to the criteria of clinical observations and according to histological studies.

Пример 6. Оценка влияния фосфолипидов («пустые» липосомы) на патогенез местных радиационных поражений кожиExample 6. Evaluation of the effect of phospholipids ("empty" liposomes) on the pathogenesis of local radiation lesions of the skin

В экспериментах была проведена сравнительная оценка эффективности «пустых» липосом и липосом, содержащих рекомбинантные белки человека рчАФП и рчГКСФ, при использовании их для экстренной профилактики и лечения местных радиационных поражений кожи.In the experiments, a comparative assessment of the effectiveness of empty liposomes and liposomes containing recombinant human proteins rhAPP and rhGKSF was carried out, when used for emergency prevention and treatment of local radiation lesions of the skin.

В экспериментах были использованы самцы мышей стока CD1 в возрасте 3-4 мес. на начало эксперимента, массой 24-26 г., полученные из питомника НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН (ветеринарное свидетельство 250 №0543060). (см. Пример 3, раздел 1).In experiments, male CD1 runoff mice aged 3-4 months were used. at the beginning of the experiment, weighing 24-26 g., obtained from the nursery NPP Nursery for laboratory animals FIBH RAS (veterinary certificate 250 No. 0543060). (see Example 3, section 1).

Оценивали эффективность препаратов по клиническим критериям течения раневого процесса после локального облучения кожи мышей в дозе 60 Гр (ожог ША степени) (см. Пример 3, раздел 7). У животных всех групп проводили в динамике ежедневные клинические наблюдения за ожоговой раной в течение 60 суток после облучения.The efficacy of the preparations was evaluated according to the clinical criteria for the course of the wound process after local irradiation of the skin of mice at a dose of 60 Gy (burn with an STA degree) (see Example 3, section 7). In animals of all groups, daily clinical observations of a burn wound were performed in dynamics for 60 days after irradiation.

Для каждого животного рассчитывали длительность периодов деструктивной и репаративной фаз, а также отдельных стадий: латентной стадии, стадии сухого и влажного эпидермита, стадии струпа, стадии эпителизации. Для исследуемых показателей проводили расчет средней арифметической величины и ошибки показателей средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием t-критерия Стьюдента (р<0,05).For each animal, the duration of the periods of the destructive and reparative phases, as well as the individual stages: the latent stage, the stage of dry and wet epidermitis, the scab stage, and the epithelialization stage were calculated. For the studied indicators, the calculation of the arithmetic mean value and the errors of the arithmetic mean values were performed. The significance of differences in the indices in the experimental groups was determined using Student's t-test (p <0.05).

В эксперименте тестировали липосомальные препараты. Препараты представляли собой стерильную липосомальную суспензию на основе фосфолипидов и рекомбинантных белков, нетоксичную, с рН 7,4. В состав препаратов входили в различных комбинациях рекомбинантный дрожжевой альфа-фетопротеин человека (рчАФП), рекомбинантный дрожжевой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГ-КСФ), консервант парабены (концентрация 0,4%), фосфолипид Lipoid S80 (концентрация 1%).In the experiment, liposome preparations were tested. The preparations were a sterile liposomal suspension based on phospholipids and recombinant proteins, non-toxic, with a pH of 7.4. The composition of the preparations included recombinant human yeast alpha-fetoprotein (rhAPP), recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF), paraben preservative (0.4% concentration), Lipoid S80 phospholipid (concentration 1%) in various combinations.

Препарат №1 - липосомы, содержащие 1 мг/мл рчАФП; 10 мг/мл фосфолипидов.Drug No. 1 - liposomes containing 1 mg / ml rhAPP; 10 mg / ml phospholipids.

Препарат №2 - липосомы, содержащие 0,2 мг/мл рчАФП; 0,015 мг/мл Г-КСФ; 10 мг/мл фосфолипидов.Drug No. 2 - liposomes containing 0.2 mg / ml rhAPP; 0.015 mg / ml G-CSF; 10 mg / ml phospholipids.

Препарат №3 - «пустые» липосомы, содержащие 10 мг/мл фосфолипидов.Preparation No. 3 - “empty” liposomes containing 10 mg / ml phospholipids.

Ведение проводили с помощью инсулинового шприца подкожно в объеме 0,1 мл, отступая на 0,5 см от края ожоговой раны.Management was carried out using an insulin syringe subcutaneously in a volume of 0.1 ml, retreating 0.5 cm from the edge of the burn wound.

2. Схема эксперимента2. Experiment design

Было сформировано 3 группы мышей стока CD1 по 14 самцов каждая:3 groups of CD1 runoff mice of 14 males each were formed:

группа 1 - гамма-контроль (облучение кожи в дозе 60 Гр);group 1 - gamma control (irradiation of the skin at a dose of 60 Gy);

группа 2 - облучение кожи в дозе 60 Гр + «пустые» липосомы по схеме «Лечение»;group 2 — irradiation of the skin at a dose of 60 Gy + “empty” liposomes according to the “Treatment” scheme;

группа 3 - облучение кожи в дозе 60 Гр + липосомальный препарат рчАФП и рчГКСФ, по схеме «Лечение».group 3 - skin irradiation in a dose of 60 Gy + liposomal preparation rhAFP and rhGKSF, according to the “Treatment” scheme.

Мыши 1 группы (гамма-контроль) после облучения кожи спины не получали лечения.Group 1 mice (gamma control) did not receive treatment after irradiation of the back skin.

Животным 2 группы вводили препарат №3 («пустые» липосомы») по схеме «Лечение»: препарат вводили в тот же день после облучения, затем на 2, 5, 7, 9, 11, 13, 18, 25-е сутки после облучения. Схема «Лечение» включает в себя экстренную профилактику (введение препарата сразу после облучения до появления клинических симптомов ожога) и лечение (введение препарата после появления симптомов ожога).The animals of group 2 were injected with drug No. 3 (“empty” liposomes) according to the “Treatment” scheme: the drug was administered the same day after irradiation, then on the 2nd, 5th, 7th, 9th, 11th, 13th, 18th, 25th day after exposure. The “Treatment” scheme includes emergency prophylaxis (administration of the drug immediately after irradiation before the onset of clinical burn symptoms) and treatment (administration of the drug after the appearance of burn symptoms).

Животным 3 группы по схеме «Лечение» в первые 3 срока (0, 2, 5 сутки после облучения) вводили препарат №1 (липосомы, содержащие 1 мг/мл рчАФП), затем на 7, 9, 11, 13, 18, 25-е сутки вводили препарат №2 (липосомы, содержащие 0,2 мг/мл рчАФП + 0,015 мг/мл ГКСФ).Animals of group 3 according to the “Treatment” scheme in the first 3 periods (0, 2, 5 days after irradiation) were injected with drug No. 1 (liposomes containing 1 mg / ml rhFAP), then at 7, 9, 11, 13, 18, 25 the second day, drug No. 2 was administered (liposomes containing 0.2 mg / ml rhAFP + 0.015 mg / ml GCSF).

В эксперименте общее время с момента облучения и до восстановления эпителия у животных, у которых было проведено локальное облучение кожи в дозе 60 Гр без лечения (группа 1), составило 63,5±1,5 суток (Фиг. 12). При этом фаза деструкции (латентный период + стадии сухого и влажного эпидермита) составила 14,54±0,19 суток, а репаративная фаза (стадии струпа и восстановления эпителия) - 48,9±0,5 суток.In the experiment, the total time from the moment of irradiation to the restoration of the epithelium in animals in which the skin was irradiated locally at a dose of 60 Gy without treatment (group 1) was 63.5 ± 1.5 days (Fig. 12). In this case, the destruction phase (latent period + dry and wet epidermitis stages) was 14.54 ± 0.19 days, and the reparative phase (stages of the scab and restoration of the epithelium) was 48.9 ± 0.5 days.

При анализе длительности восстановительного периода выявлены отличия в течение заживления ожоговой раны в группе, где животные не получали лечения (группа 1), и в группе 3, где животным вводили липосомальные препараты, содержащие рчАПФ и рчГ-КСФ (Фиг. 12). При введении препаратов, содержащих рчАПФ и рчГ-КСФ по схеме «Лечение», регистрировалось достоверное снижение длительности репаративной фазы до 32,1±3,5 суток (против 48,9±0,5 суток в группе гамма-контроля). Это реализовалось в достоверном ускорении заживления ожоговой раны на 35% по отношению к гамма-контролю - от момента облучения до полного заживления раны потребовалось соответственно 47,4±5,0 суток при показателе в группе гамма-контроля 63,5±1,5 суток. Длительность деструктивной фазы у животных этой группы не отличалась от показателя в группе гамма-контроля.When analyzing the duration of the recovery period, differences were revealed during the healing of the burn wound in the group where the animals did not receive treatment (group 1) and in group 3, where the animals were injected with liposome preparations containing rhAPF and rhG-CSF (Fig. 12). With the introduction of drugs containing rhAPF and rhG-CSF according to the “Treatment” scheme, a significant decrease in the duration of the reparative phase was recorded to 32.1 ± 3.5 days (versus 48.9 ± 0.5 days in the gamma control group). This was realized in a reliable acceleration of healing of a burn wound by 35% in relation to gamma control - from the moment of irradiation to complete healing of the wound, it was required 47.4 ± 5.0 days, respectively, with an indicator in the gamma control group of 63.5 ± 1.5 days . The duration of the destructive phase in animals of this group did not differ from that in the gamma control group.

При введении «пустых» липосом (группа 2) по схеме «Лечение» также наблюдался благоприятный эффект, хотя и менее выраженный, чем при введении липосомальных препаратов, содержащих рчАФП и рчГКСФ (группа 3). Общее время заживления раны в группе 2 составило 57,3±1,0 суток, длительность репаративного периода 41,3±1,5 суток. При этом выявлено достоверное снижение стадии восстановления эпителия по сравнению с группой гамма-контроля на 25%. Длительность деструктивной фазы у животных этой группы не отличалась от показателя в группе гамма-контроля.With the introduction of "empty" liposomes (group 2) according to the "Treatment" scheme, a favorable effect was also observed, although less pronounced than with the introduction of liposome preparations containing rhAFP and rhGKSF (group 3). The total wound healing time in group 2 was 57.3 ± 1.0 days, the duration of the reparative period 41.3 ± 1.5 days. In this case, a significant decrease in the stage of restoration of the epithelium was revealed in comparison with the gamma control group by 25%. The duration of the destructive phase in animals of this group did not differ from that in the gamma control group.

То есть применение «пустых» липосом для экстренной профилактики и лечения радиационных поражений кожи не влияет на длительность деструктивного периода, но приводит к более быстрому заживлению ожоговой раны за счет укорочения репаративной фазы.That is, the use of "empty" liposomes for emergency prevention and treatment of radiation damage to the skin does not affect the duration of the destructive period, but leads to faster healing of the burn wound due to the shortening of the reparative phase.

Выявленные эффекты могут быть обусловлены как снижением уровня поражения кожи в деструктивный период, так и ускорением регенеративных процессов в репаративной фазе.The revealed effects can be due to both a decrease in the level of skin lesions in the destructive period, and acceleration of regenerative processes in the reparative phase.

Таким образом, результаты клинических наблюдений показали следующее:Thus, the results of clinical observations showed the following:

1. Подкожное введение липосом, содержащих белки рчАПФ и рчГ-КСФ, животным с лучевыми ожогами кожи ША степени по схеме «Лечение» привело к сокращению общего времени заживления ожоговой раны на 35% относительно облученных нелеченых животных; сокращению репаративной фазы на 35%.1. Subcutaneous administration of liposomes containing rhAPF and rhG-CSF proteins to animals with radiation injuries of the skin of the ShA degree according to the “Treatment” scheme reduced the total healing time of the burn wound by 35% relative to the irradiated untreated animals; reduction of the reparative phase by 35%.

2. Подкожное введение «пустых» липосом животным с лучевыми ожогами кожи ША степени по схеме «Лечение» привело к сокращению общего времени заживления ожоговой раны на 11% относительно облученных нелеченых животных; сокращению репаративной фазы - на 25%.2. Subcutaneous administration of “empty” liposomes to animals with radiation burns of the skin of the ShA degree according to the “Treatment” regimen reduced the total healing time of the burn wound by 11% relative to irradiated untreated animals; reduction of the reparative phase - by 25%.

3. «Пустые» липосомы могут быть использованы для экстренной профилактики и лечения радиационных поражений кожи.3. "Empty" liposomes can be used for emergency prevention and treatment of radiation lesions of the skin.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквивалентные средства, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные здесь документы полностью включены в описание настоящей заявки посредством ссылки.Although the present invention has been described in detail with reference to preferred embodiments thereof, it will be apparent to one skilled in the art that various substitutions can be made and equivalent means applied that are not outside the scope of the present invention. All documents cited here are fully incorporated into the description of this application by reference.

Claims

1. Липосома для лечения местных радиационных поражений кожи, содержащая альфа-фетопротеин человека.1. Liposome for the treatment of local radiation lesions of the skin, containing human alpha-fetoprotein.

2. Липосома по п. 1, отличающаяся тем, что указанным альфа-фетопротеином человека является рекомбинантный альфа-фетопротеин человека.2. The liposome according to claim 1, characterized in that said human alpha-fetoprotein is a recombinant human alpha-fetoprotein.

3. Липосома по п. 1, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл альфа-фетопротеина человека.3. The liposome according to claim 1, characterized in that said liposome contains from 0.1 mg / ml to 1.0 mg / ml of human alpha-fetoprotein.

4. Липосома по п. 1, отличающаяся тем, что указанная липосома дополнительно содержит гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.4. The liposome according to claim 1, characterized in that said liposome further comprises a human granulocyte colony stimulating factor.

5. Липосома по п. 4, отличающаяся тем, что указанным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека является рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.5. The liposome according to claim 4, characterized in that said human granulocyte colony-stimulating factor is a recombinant human granulocyte colony-stimulating factor.

6. Липосома по п. 4, отличающаяся тем, что указанная липосома содержит от 0,004 мг/мл до 0,06 мг/мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.6. The liposome according to claim 4, characterized in that said liposome contains from 0.004 mg / ml to 0.06 mg / ml of granulocyte colony stimulating human factor.

7. Применение липосом по любому из пп. 1-6 для лечения местных радиационных поражений кожи.7. The use of liposomes according to any one of paragraphs. 1-6 for the treatment of local radiation lesions of the skin.

8. Фармацевтическая композиция для лечения местных радиационных поражений кожи, содержащая эффективное количество липосом по любому из пп. 1-6.8. A pharmaceutical composition for treating local radiation injuries of the skin, comprising an effective amount of liposomes according to any one of claims. 1-6.

9. Лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи, содержащее фармацевтическую композицию по п. 8.9. A drug for the treatment of local radiation lesions of the skin, containing the pharmaceutical composition according to p. 8.

10. Лекарственное средство по п. 9, отличающееся тем, что указанное средство является средством трансдермального действия.10. The drug according to p. 9, characterized in that the tool is a means of transdermal action.

11. Лекарственное средство по п. 9 в виде пластины, пластыря, пленки, крема, мази или спрея.11. The drug according to claim 9 in the form of a plate, patch, film, cream, ointment or spray.

12. Способ лечения и/или профилактики местных радиационных поражений кожи, включающий стадию нанесения фармацевтической композиции по п. 8 или лекарственного средства по п. 9 на пораженный или подвергающийся поражению участок кожи.12. A method of treating and / or preventing local radiation injuries of the skin, comprising the step of applying a pharmaceutical composition according to claim 8 or a medicine according to claim 9 on an affected or affected area of the skin.