RU2639582C2 - Композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов - Google Patents
Композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639582C2 RU2639582C2 RU2016119116A RU2016119116A RU2639582C2 RU 2639582 C2 RU2639582 C2 RU 2639582C2 RU 2016119116 A RU2016119116 A RU 2016119116A RU 2016119116 A RU2016119116 A RU 2016119116A RU 2639582 C2 RU2639582 C2 RU 2639582C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hgf
- cells
- pck
- seq
- isoforms
- Prior art date
Links
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 title claims abstract description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 12
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title abstract description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 title description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 54
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 53
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 45
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 42
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 13
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 101100230980 Homo sapiens HGF gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 110
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 20
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 102220020162 rs397508045 Human genes 0.000 description 9
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 8
- 102000057308 human HGF Human genes 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108010021188 Superoxide Dismutase-1 Proteins 0.000 description 6
- 102000008221 Superoxide Dismutase-1 Human genes 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- FTALBRSUTCGOEG-UHFFFAOYSA-N Riluzole Chemical compound C1=C(OC(F)(F)F)C=C2SC(N)=NC2=C1 FTALBRSUTCGOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 5
- 101150024147 bax gene Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 229960004181 riluzole Drugs 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 4
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100020873 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical group [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 229920002491 Diethylaminoethyl-dextran Polymers 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 101150022655 HGF gene Proteins 0.000 description 2
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 2
- 101100149812 Homo sapiens SOD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 239000004594 Masterbatch (MB) Substances 0.000 description 2
- 101000693855 Mus musculus Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit Proteins 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- GQMMRLBWXCGBEV-YVMONPNESA-N (nz)-n-[(3-nitrophenyl)methylidene]hydroxylamine Chemical compound O\N=C/C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 GQMMRLBWXCGBEV-YVMONPNESA-N 0.000 description 1
- 101150078635 18 gene Proteins 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CFBVWCHTNQHZLT-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-5-[3-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-(phenylcarbamoyl)tetrazol-3-ium-2-yl]-2-nitrobenzenesulfonate Chemical compound COC1=CC([N+]([O-])=O)=C(S([O-])(=O)=O)C=C1N1[N+](C=2C(=CC(=C(C=2)S(O)(=O)=O)[N+]([O-])=O)OC)=NC(C(=O)NC=2C=CC=CC=2)=N1 CFBVWCHTNQHZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100232919 Homo sapiens IL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000664887 Homo sapiens Superoxide dismutase [Cu-Zn] Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 101150102264 IE gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241001028048 Nicola Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108700013394 SOD1 G93A Proteins 0.000 description 1
- 238000011831 SOD1-G93A transgenic mouse Methods 0.000 description 1
- 241000978776 Senegalia senegal Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100038836 Superoxide dismutase [Cu-Zn] Human genes 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 108700041737 bcl-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003340 calcium silicate Drugs 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000004220 muscle function Effects 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000005709 nerve cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000009163 protein therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 101150062190 sod1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000001032 spinal nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- DQJCHOQLCLEDLL-UHFFFAOYSA-N tricyclazole Chemical compound CC1=CC=CC2=C1N1C=NN=C1S2 DQJCHOQLCLEDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза, содержащая изоформы фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы, и способ предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза, включающий введение млекопитающему указанной композиции. Предложенная группа изобретений обеспечивает предупреждение или лечение бокового амиотрофического склероза. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение испрашивает приоритет по заявке на патент Кореи с регистрационным номером 10-2013-0126216, зарегистрированной Корейским ведомством по интеллектуальной собственности 22 октября 2013 г., и по заявке на патент Кореи с регистрационным номером 10-2014-0143377, зарегистрированной Корейским ведомством по интеллектуальной собственности 22 октября 2014 г., содержание которых полностью включено в материалы настоящей заявки посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста, гепатоцитов или полинуклеотид, кодирующий изоформы, для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза.
Предшествующий уровень техники
Боковой амиотрофический склероз (БАС), являющийся заболеванием двигательных нейронов, был впервые описан в 1869 г. французским врачом Жаном-Мартеном Шарко. Обычные люди узнали о БАС, когда в 1939 г. этот диагноз был поставлен Лу Геригу, знаменитому бейсболисту из США, и с этого времени БАС называют болезнью Лу Герига.
Прогноз в случае БАС основан на клинических признаках, результатах электрофизиологических диагностических тестов и исключении других медицинских состояний, сопровождающихся такими же симптомами. Молекулярно-генетический тест, который можно использовать в клинических тестах, связанных с некоторыми генами, участвующими в развитии БАС, играет важную роль в определении генотипа и генетическом консультировании.
БАС может наследоваться по аутосомно-доминантному типу, аутосомно-рецессивному типу или X-сцепленному типу. Генетическое консультирование и оценка риска зависят от точной диагностики конкретных генов.
Рилузол известен как лекарственный препарат, используемый для замедления прогрессирования БАС. Известно, что рилузол может снижать скорость прогрессирования БАС за счет ингибирования избытка глутаминовой кислоты, которую считают одной из причин деструкции двигательных нейронов. Однако клинические эффекты рилузола не облегчают симптомы БАС, и результаты его использования не выявили заметного увеличения продолжительности жизни без трахеостомы у пациентов с БАС, которым не была выполнена трахеостомия. Как указано выше, истинные клинические эффекты рилузола, который помогает пациентам с БАС, оказались очень ограниченными и неопределенными (Stewart et al., 2001). Тем не менее, нет эффективного профилактического или терапевтического средства для БАС, кроме рилузола, имеющего хотя бы сомнительную клиническую эффективность, и поэтому необходима разработка лекарственных средств, оказывающих эффекты предупреждения или лечения БАС.
Между тем, из предшествующего уровня техники известны векторы экспрессии, используемые в качестве системы доставки генов для генетической терапии. Подробное описание вектора рСК, использованного в примере осуществления настоящего изобретения, приведено в публикации PCT/KR1999/000855. Кроме того, в публикации PCT/KR2003/000548 раскрыта композиция, содержащая рекомбинантный вектор pCK-HGFX7, использованный в настоящем изобретении, предназначенная для лечения или предупреждения ишемических болезней или поражений печени. Содержание PCT/KR1999/000855 и PCT/KR2003/000548 полностью включено в данную заявку посредством ссылки.
В настоящей публикации даны ссылки на многочисленные статьи и патентные документы и приведены цитаты из них. Содержание процитированных статей и патентных документов полностью включено в данную заявку посредством ссылки, а область техники, к которой относится настоящее изобретение, и признаки настоящего изобретения разъяснены более подробно.
Подробное описание изобретения
Техническая проблема
Авторы настоящего изобретения провели исследования и попытались разработать лекарственные препараты, способные предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз (БАС). В результате авторы настоящего изобретения установили, что БАС можно лечить с использованием композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF; от англ.: hepatocyte growth factor) или полинуклеотид, кодирующий изоформы, и таким образом выполнили настоящее изобретение.
Поэтому аспектом настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.
Другим аспектом настоящего изобретения является обеспечение способа предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.
Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания изобретения, формулы изобретения и графических материалов.
Техническое решение
Согласно первому аспекту настоящего изобретения обеспечена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза; эта композиция содержит в качестве активного ингредиента два или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.
Авторы настоящего изобретения провели исследования и попытались разработать лекарственные препараты, способные предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз. В результате авторы настоящего изобретения установили, что БАС можно лечить с использованием композиции, содержащей в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.
Стратегия терапии по настоящему изобретению может быть грубо классифицирована на два типа: белковая терапия и генная терапия. Согласно стратегии белкового терапевтического агента по настоящему изобретению используют два или более типов изоформ белков HGF. В то же время согласно стратегии генного терапевтического агента по настоящему изобретению используют по меньшей мере одну последовательность нуклеотидов, кодирующую два или более типов изоформ HGF. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая две или более изоформ HGF, может быть обеспечена одним полинуклеотидом или раздельными полинуклеотидами. Предпочтительно полинуклеотидная последовательность, кодирующая две или более изоформ HGF, обеспечена одним полинуклеотидом.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «изоформа HGF» относится к полипептиду HGF, содержащему последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична природной последовательности аминокислот HGF у животного, включая все аллельные варианты. Например, термин «изоформа HGF» имеет значение, которое включает нормальную форму или дикий тип HGF и различные варианты HGF (например, сплайсинговые варианты и делегированные варианты).
В варианте осуществления настоящего изобретения две или более изоформ HGF включают полноразмерный HGF (flHGF; от англ.: full-length HGF) и делетированный вариант HGF (dHGF; от англ.: deleted variant HGF). Использование композиции, содержащей полноразмерный HGF и делетированный вариант HGF, может эффективно предотвращать или лечить БАС.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «flHGF» относится к последовательности аминокислот с 1 по 728 белка HGF животного, предпочтительно млекопитающего и более предпочтительно человека.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «dHGF» относится к делетированному варианту белка HGF, полученного посредством альтернативного сплайсинга гена HGF животного, предпочтительно млекопитающего, и более предпочтительно термин относится к HGF человека, содержащему 723 аминокислоты, с делецией пяти аминокислот (F, L, Р, S и S) в первом крингл-домене альфа-цепи последовательности полноразмерного HGF.
В варианте осуществления настоящего изобретения полноразмерный HGF по настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, а делетированный вариант HGF по настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.
В варианте осуществления настоящего изобретения изоформы HGF по настоящему изобретению кодируются отдельными последовательностями нуклеотидов или одной последовательностью нуклеотидов. Соответственно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит два или более полинуклеотидов, если различные типы изоформ HGF кодируются раздельными полинуклеотидами, и содержит по меньшей мере один полинуклеотид, включающий единый полинуклеотид, если различные типы изоформ HGF кодируются одной полинуклеотидной последовательностью. Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть функционально связан с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью (например, с промотором или энхансером), регулирующей экспрессию изоформ HGF.
Если два или более типов изоформ HGF кодируются раздельными полинуклеотидами, то кассета экспрессии может быть сконструирована двумя способами. Согласно первому способу кассету экспрессии конструируют посредством присоединения последовательности, регулирующей экспрессию, к кодирующей последовательности (CDS; от англ.: coding sequence) каждой изоформы. Согласно второму способу кассету экспрессии конструируют с использованием сайта внутренней посадки рибосом (IRES; от англ.: internal ribosomal entry site) и 2А-пептидов, например - «последовательность, регулирующая экспрессию - первая изоформа CDS - IRES - вторая изоформа CDS - последовательность терминации транскрипции». IRES обеспечивает начало трансляции с последовательности IRES, за счет чего экспрессируются два или более генов, представляющих интерес, в одной и той же конструкции.
Если два или более типов изоформ HGF кодируются одним полинуклеотидом, то полинуклеотид, кодирующий два или более типов изоформ, функционально связан с одной регулирующей экспрессию последовательностью.
В настоящем изобретении изоформы HGF могут кодироваться гибридным геном HGF, который одновременно экспрессирует два или более различных типов изоформ HGF, например-flHGF и dHGF.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения гибридный ген HGF содержит кДНК, соответствующую экзонам с 1 по 18 HGF человека, и интрон 4 гена HGF человека или его фрагмент, который инсерцирован между экзоном 4 и экзоном 5 кДНК.
Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения гибридный ген HGF содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 3 по SEQ ID NO: 10.
Гибридный ген HGF, содержащий интрон 4, имеет длину, равную 7113 bp (пар оснований; от англ.: base pairs), и включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. Гибридный ген HGF может избирательно содержать фрагмент интрона 4 между экзоном 4 и экзоном 5 кДНК HGF.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения последовательность, дополнительно инсерцированная между экзоном 4 и экзоном 5, содержит: интрон 4 гена HGF человека, нуклеотиды с 392 по 2247, нуклеотиды с 392 по 727, нуклеотиды с 2229 по 5471, нуклеотиды с 5117 по 5471, нуклеотиды с 3167 по 5471, нуклеотиды с 4167 по 5471, или их комбинацию, из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 3.
Более предпочтительно последовательность, дополнительно инсерцированная между экзоном 4 и экзоном 5 терапевтической последовательности нуклеотидов, используемой в настоящем изобретении, является (i) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 2229 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 5117 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 3167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (iv) нуклеотидами с 392 по 2247 и нуклеотидами с 4167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (v) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 2229 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (vi) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 5117 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; (vii) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 3167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3; или (viii) нуклеотидами с 392 по 727 и нуклеотидами с 4167 по 5471 последовательности SEQ ID NO: 3.
Терапевтическая последовательность нуклеотидов по настоящему изобретению в зависимости от последовательности, дополнительно инсерцированной между экзоном 4 и экзоном 5, в конечном итоге выглядит следующим образом: (i) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 2297 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (ii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 5117 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (iii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 392 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (iv) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 2247 - нуклеотиды с 4167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (v) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 2229 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (vi) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 5117 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); (vii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 3167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18); и (viii) (экзоны с 1 по 4)-(нуклеотиды с 392 по 727 - нуклеотиды с 4167 по 5471 SEQ ID NO: 3)-(экзоны с 5 по 18).
В данной публикации гибридный ген HGF, содержащий фрагмент интрона 4, называют «HGF-Х», и HGF-X включает HGF-X2, HGF-X3, HGF-X4, HGF-X5, HGF-X6, HGF-X7 и HGF-X8, которые содержат нуклеотидные последовательности SEQ ID NOs: с 4 по 10. В настоящем изобретении предпочтительно используют HGF-X7. «Изоформа HGF», «HGF-Х» и «HGF-X7» из настоящего изобретения описаны в публикации PCT/KR2003/000548, содержание которой включено в данную работу посредством ссылки.
Аминокислотные или нуклеотидные последовательности изоформ HGF, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, конструируют так, чтобы они включали аминокислотные или нуклеотидные последовательности, по существу идентичные последовательностям изоформ дикого типа HGF человека. Термин «по существу идентичные» означает, что аминокислотную или нуклеотидную последовательность изоформы дикого типа HGF человека и другую нуклеотидную последовательность выравнивают так, чтобы они как можно больше соответствовали друг другу, и выравненные последовательности анализируют с использованием алгоритма, обычно используемого в данной области техники. Аминокислотная или нуклеотидная последовательность изоформы дикого типа HGF человека демонстрирует по меньшей мере 80%-ную идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную идентичность, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность. Способы выравнивания для сравнения последовательностей хорошо известны в данной области техники. Различные способы и алгоритмы выравнивания раскрыты в публикациях Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Соmр. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992); и Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994). The Пакет программ NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) можно получить через Национальный центр биотехнологической информации США (NCBI), и его можно использовать в Интернете совместно с такими программами для анализа последовательностей, как blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx. В пакет BLAST можно войти по ссылке http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Способ сравнения идентичности последовательностей с использованием этого пакета программ можно подтвердить по ссылке http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.html.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «предотвращение» относится к действиям по подавлению бокового амиотрофического склероза или задержке прогрессирования бокового амиотрофического склероза посредством введения композиции по настоящему изобретению.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «лечение» относится к: (а) подавлению прогресса бокового амиотрофического склероза, (b) облегчению бокового амиотрофического склероза или (с) устранению бокового амиотрофического склероза.
Композиция по настоящему изобретению может предотвращать или лечить боковой амиотрофический склероз за счет образования и роста аксонов и роста и антиапоптоза двигательных нейронов.
Композицию по настоящему изобретению можно применять in vivo с использованием различных способов доставки, которые известны специалистам в области генной терапии.
В варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению является депротеинизированной ДНК или содержится в системе доставки гена. Примерами системы доставки гена являются плазмида, вектор и вирусный вектор.
(i) Плазмида (вектор)
Плазмиду (вектор) можно использовать в качестве системы доставки, которая доставляет полинуклеотид по настоящему изобретению. Полинуклеотид, включенный в вектор, предпочтительно находится в соответствующей кассете экспрессии. Предпочтительно полинуклеотид функционально связан с промотором в кассете экспрессии.
При использовании в контексте настоящего изобретения термин «функционально связан» относится к функциональной связи между регулирующей экспрессию последовательностью нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью или последовательностью из фактора регуляции транскрипции) и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, и за счет этой связи регуляторная последовательность регулирует транскрипцию и/или трансляцию другой последовательности нуклеиновой кислоты.
В настоящем изобретении промотор, связанный с полинуклеотидной последовательностью, может регулировать транскрипцию нуклеотидной последовательности в клетках животных, предпочтительно в клетках млекопитающих, и более предпочтительно в клетках человека, и содержит, например, промоторы, полученные из вирусов млекопитающих, и промоторы, полученные из геномов клеток млекопитающих. Примерами могут служить промотор цитомегаловируса (CMV; от англ.: cytomegalovirus), поздний промотор аденовируса, промотор гена белка 7,5 кДа вируса коровьей оспы, промотор вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40; от англ.: simian virus 40), промотор гена тимидинкиназы (tk; от англ.: thymidine kinase) вируса простого герпеса (HSV; от англ.: herpes simplex virus), промотора вируса саркомы Рауса (RSV; от англ: Rouse sarcoma virus), промотора альфа-субъединицы фактора 1 элонгации трансляции (EF1; от англ: elongation factor 1), промотора металлотионеина, промотора бета-актина, промотора гена интерлейкина-2 (IL-2; от англ.: interleukin-2) человека, промотора гена интерферона (IFN; от англ.: interferon) человека, промотора гена IL-4 человека, промотора гена лимфотоксина человека и промотора гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF; от англ.: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), но не ограничиваются ими. Еще более предпочтительно промотор, используемый в настоящем изобретении, является промотором, полученным из немедленного раннего (IE; от англ.: immediately early) гена CMV человека (hCMV; от англ.: human cytomegalovirus), или промотором альфа-субъединицы EF1, и наиболее предпочтительно - 5'-нетранслируемой областью (UTR; от англ.: untranslated region), включающей промотор/энхансер и полную последовательность экзона 1, непосредственно прилегающую к кодону инициации ATG-последовательности экзона 2 IE-гена hCMV.
Кассета экспрессии, используемая в настоящем изобретении, может включать последовательность полиаденилации, например терминатор бычьего гормона роста (Gimmi, Е.R., et al., Nucleic Acids Res. 17: 6983-6998 (1989)), последовательность полиаденилации, полученную из SV40 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12: 5386-5393 (1992)), шпильку polyA ВИЧ-1 (Klasens, В. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), шпильку polyA β-глобина (Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), шпильку polyA HSV TK (Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) или шпильку polyA вируса полиомы (Batt, D.В and G.G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15: 4783-4790 (1995)), но не ограничивается ими.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения векторы рСК, рСР, pVAX1 или pCY могут быть использованы в качестве системы доставки полинуклеотида, и более предпочтительно может быть использован вектор рСК. Вектор рСК подробно описан в публикации WO 2000/040737, содержание которой включено в данную работу посредством ссылки.
(ii) Ретровирус
Ретровирус может внедрять свой ген в геном организма-хозяина для доставки многих экзотических генетических материалов, и спектр инфицируемых им клеток очень широк, так что большинство ретровирусов используют в качестве векторов доставки генов.
Для конструирования ретровирусного вектора полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, но не ретровирусную последовательность, инсерцируют в ретровирусный геном, получая тем самым вирусы с нарушенной репликацией. Для продукции вириона сконструирована пакующая клеточная линия, содержащая gag, pol и env гены, но не содержащая последовательности длинного терминального повтора (LTR; от англ.: long terminal repeat) и ψ-непоследовательности (Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)). Если рекомбинантную плазмиду, содержащую полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, LTR-последовательность и ψ-последовательность внедряют в клеточную линию, ψ-последовательность обеспечивает продукцию РНК-транскриптов рекомбинантной плазмиды, и эти транскрипты упаковываются с вирусами, которые выбрасываются в среду (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). Среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, собирают и концентрируют, а затем используют в качестве системы доставки гена.
Описана доставка гена с использованием ретровирусных векторов второго поколения. Kasahara et al. получили вариант вируса мышиного лейкоза Молони и химерный белок, обладающий новыми характеристиками связывания, посредством инсерцирования последовательности эритропоэтина (ЕРО; от англ.: erythropoietin) в сайт оболочки вируса (Science, 266: 1373-1376 (1994)). Полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению также можно включить в ретровирус согласно стратегии конструирования ретровирусных векторов второго поколения.
(iii) Аденовирус
Аденовирус обычно использовали в качестве вектора для доставки генов из-за средних размеров его генома, легкости генной инженерии, высокого титра, широкого спектра клеток-мишеней и высокой инфекционности. Оба конца генома содержат инвертированные терминальные повторы (ITRs; от англ.: inverted terminal repeats) размером 100-200 bp, которые являются цис-элементами, необходимыми для репликации и упаковки ДНК. Область Е1 (Е1А и Е1В) генома кодирует белки, ответственные за регуляцию транскрипции вирусного генома, и транскрипцию генов клетки-хозяина. Область Е2 (Е2А и Е2В) кодирует белки, участвующие в репликации вирусной ДНК.
Кроме разработанных к настоящему времени аденовирусных векторов обычно используют аденовирус с нарушенной репликацией, в котором делетирована область Е1. Однако делетированная Е3 область в нормальных аденовирусных векторах может обеспечить сайт инсерции для экзотических генов (Thimmappaya, В. et al., Cell, 31: 543-551 (1982); и Riordan, J.R. et al., Science, 245: 1066-1073 (1989)). Поэтому полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению предпочтительно инсерцируют либо в делетированную область Е1 (область Е1А и/или область Е1В), либо в делетированную Е3 область. Кроме того, полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению можно также инсерцировать в делетированную область Е4. В контексте настоящего изобретения термин «делеция», использованный в отношении последовательностей из вирусных геномов, охватывает полную делецию соответствующей последовательности и ее частичную делецию. Кроме того, аденовирус может включать примерно 105% генома дикого типа, обеспечивая емкость для примерно 2 дополнительных kb ДНК (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)). Поэтому указанные экзотические последовательности, инсерцированные в аденовирус, могут быть дополнительно соединены с аденовирусным геномом.
Аденовирус может быть любым из 42 различных серотипов и подгрупп A-F. Из них аденовирус типа 5, относящийся к подгруппе C, является наиболее предпочтительным исходным материалом для получения аденовирусного вектора по настоящему изобретению. Биохимическая и генетическая информация относительно аденовируса типа 5 хорошо известна. Экзотические гены, доставленные аденовирусом, реплицируются так же, как в эписоме, и поэтому обладают низкой генотоксичностью для клеток хозяина. Поэтому генная терапия с использованием аденовирусной системы доставки генов определена как безопасная.
(iv) Вектор AAV
Аденоассоциированные вирусы (AAV; от англ.: adeno-associated viruses) способны инфицировать не делящиеся клетки и обладают способностью инфицировать различные типы клеток; поэтому они пригодны для использования в качестве системы доставки генов по настоящему изобретению. Подробные описания применения и получения AAV-вектора приведены в публикациях US 5,139,941 и US 4,797,368.
Результаты исследования AAV как системы доставки генов приведены в публикациях La Face et al, Virology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp.Hematol. (NY), 21: 928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94: 1440-1448 (1994), и Flotte et al., Gene Therapy, 2: 29-37 (1995). Недавно AAV-вектор был утвержден для клинических исследований Фазы I на человеке с целью лечения муковисцидоза.
В характерном случае AAV-вирус получают посредством котрансфицирования плазмиды, содержащей последовательность целевого гена, фланкированную двумя терминальными повторами AAV (McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963-1973 (1988); и Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)), и экспрессирующей плазмиды, содержащей кодирующую последовательность AAV дикого типа без терминальных повторов (McCarty et al., J. Virol., 65: 2936-2945 (1991)).
(v) Другие вирусные векторы
Другие вирусные векторы можно использовать для доставки полинуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в биологический организм. Векторы, полученные из вирусов, таких как вирус коровьей оспы (Puhlmann М. et al., Human Gene Therapy 10: 649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) и Coupar et al., Gene, 68: 1-10 (1988)), lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104 (11): R55-62 (1999)), или вирус простого герпеса (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 1411-1415 (1995)), также можно использовать в качестве системы доставки, способной доставлять полинуклеотид в клетки,
(vi) Липосомы
Липосомы образуются спонтанно из фосфолипидов, суспензированных в водной среде. Опосредованная липосомами доставка экзотической молекулы ДНК оказалась очень успешной, как описано в публикации Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982) и Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987). Липосомы, содержащие полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, доставляют полинуклеотидную последовательность в клетки за счет взаимодействия с клетками по таким механизмам, как эндоцитоз, адсорбция на поверхностях клеток и слияние с плазматическими мембранами клеток.
В тех случаях, когда полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению включена в депротеинизированную рекомбинантную молекулу ДНК или в плазмиду (вектор), полинуклеотидную последовательность можно ввести в клетки посредством микроинъекции (Capecchi, M.R., Cell, 22: 479 (1980); и Harland & Weintraub, J. Cell Biol. 101: 1094-1099 (1985)), осаждения фосфатом кальция (Graham, F.L. et al., Virology, 52: 456 (1973); и Chen & Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)), электропорации (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982); и Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716-718 (1986)), опосредованной липосомами трансфекции (Wong, Т.К. et al., Gene, 10: 87 (1980); Nicolau & Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982); и Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), обработки диэтиламиноэтил-декстраном (DEAE-dextran; от англ.: diethylaminoethyldextran) (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)) и бомбардировки генами (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)).
Если полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению сконструирована на основе вирусного вектора, полинуклеотидную последовательность можно доставить в клетки различными способами инфицирования вирусами, известными в данной области техники. Инфицирование клеток хозяина с использованием вирусных векторов описано в публикациях, процитированных выше.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектором по настоящему изобретению является плазмида, и наиболее предпочтительно может быть использован вектор рСК. Примером рекомбинантного вектора, содержащего один полинуклеотид, экспрессирующий два или более изоформ HGF, с использованием вектора рСК, может быть pCK-HGFX7, состав которого подробно описан в публикации PCT/KR 1999/000855 и PCT/KR 2003/000548, как указано выше.
Композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель, содержащийся в композиции по настоящему изобретению, обычно используют для приготовления композиции, и примеры носителей могут включать, но не ограничиваются этим, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, крахмал, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать смазывающее вещество, смачивающее средство, подсластитель, вкусовую добавку, эмульгатор, суспензирующее средство, консервант и т.п., помимо указанного выше ингредиента. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и добавки подробно описано в публикации 
Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
Предпочтительно фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно ввести парентерально, и, например, можно использовать внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, подкожное введение, интрадермальное введение, интраспинальное введение, интратекальное введение, интравентрикулярное введение, паренхимальное введение, интракраниальное введение, внутримышечное введение или местное введение. Наиболее предпочтительно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена внутримышечно, интраспинально, интратекально, интравентрикулярно, паренхимально или интракраниально.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена и введена в форме инъекции. Подходящая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению варьируется в зависимости от ряда факторов, таких как способ приготовления, способ введения, возраст, масса тела и пол пациента, степень тяжести заболевания, время введения, путь введения, скорость выведения и чувствительность ответа, и практикующий врач сможет легко определить и назначить дозу, эффективно обеспечивающую желаемое лечение или предотвращение болезни.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения изоформы HGF по настоящему изобретению вводят в дозе, лежащей в диапазоне от 1 мкг до 2,500 мг, а полинуклеотид, кодирующий изоформы, вводят в дозе, лежащей в диапазоне от 1 мкг до 2,500 мг. Если изоформы HGF или полинуклеотид, кодирующий изоформы, вводят повторно один или более раз, то доза при каждом введении может быть одинаковой или разной.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению приготавливают с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя способом, который легко может быть выполнен специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и фармацевтическую композицию можно приготовить в единичной лекарственной форме, или ее можно поместить в многодозовый контейнер. При этом лекарственная форма может быть раствором в масляной или водной среде, суспензией, эмульсией, экстрактом, порошком, гранулами, таблеткой или капсулой, и она может дополнительно содержать диспергатор или стабилизатор.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечен способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза, который включает введение млекопитающему композиции, содержащей в качестве активного ингредиента два или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий изоформы.
В варианте осуществления настоящего изобретения две или более изоформ HGF по настоящему изобретению включают полноразмерный HGF (flHGF) и делетированный вариант HGF (dHGF).
В варианте осуществления настоящего изобретения полноразмерный HGF по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а делетированный вариант HGF по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Поскольку способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза по настоящему изобретению включает стадию введения фармацевтической композиции для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза, которая является аспектом настоящего изобретения, то перекрывающиеся описания были опущены во избежание чрезмерного усложнения публикации из-за повторных описаний.
Полезные эффекты
Признаки и преимущества настоящего изобретения можно обобщитьследующим образом:
(a) Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.
(b) Настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза.
(c) Композицию или способ по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения или лечения бокового амиотрофического склероза за счет образования и роста аксонов в эмбриональных нервных клетках и роста и антиапоптоза двигательных нейронов.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 изображает эффект pCK-HGFX7 на образование аксонов эмбриональных нервных клеток (ENC; от англ.: embryonic neuronal cells) согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 2 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост эмбриональных нервных клеток согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 3 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост клеток NSC-34 согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 4 изображает эффект pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34 согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 5 изображает эффект pCK-HGFX7 на переживание клеток NSC-34 при культивировании в условиях оксидативного стресса согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 6 изображает эффект pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34 при культивировании в условиях оксидативного стресса согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 7 изображает эффект pCK-HGFX7 на рост клеток, в которые была доставлена hSOD1 с мутацией G93A, согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Фиг. 8 изображает эффект pCK-HGFX7 на силу захвата лапы БАС-мышей согласно варианту осуществления настоящего изобретения.
Описание примеров осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на примеры его осуществления. Эти примеры предназначены только для более конкретной иллюстрации настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничен этими примерами.
Пример 1
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на созревание эмбриональных нервных клеток (ENC)
Из эмбриона мыши взяли только участок коры головного мозга для разделения на отдельные клетки, после чего к культуральной среде добавили 10 мкМ Ara-С 10 для культивирования только нервных клеток. Для подтверждения эффекта pCK-HGFX7 на созревание ENC высеяли 2×104 клеток и на следующий день клетки обработали 1,25 нг/мл белка, полученного из клеток 293F (Life Technologies, США), трансфицированных pCK-HGFX7, для проверки уровня отрастания аксонов, обнаруживаемого в ходе созревания клеток. Уровень отрастания аксонов подтвердили с использованием иммуноцитохимии по экспрессии TUJ-1 - тубулинового белка, специфически экспрессируемого нервными клетками.
Результаты подтвердили, что, как показано на Фиг. 1, длина аксонов была значимо большей в группе, обработанной pCK-HGFX7, чем в группе, обработанной рСК с целью контроля.
Пример 2
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток после созревания ENC
Проверили эффект pCK-HGFX7 на рост клеток после созревания ENC. Для этого высеяли 5×104 ENC, после чего они созревали в течение 6 дней. Через 6 дней клетки обработали 1,25 нг/мл белка, полученного из клеток 293F, трансфицированных pCK-HGFX7, для проверки эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток. После 3 дней обработки pCK-HGFX7 был выполнен анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ) для измерения роста клеток.
Результаты подтвердили, что, как показано на Фиг. 2, рост клеток значимо увеличивался примерно на 40% в группе, обработанной pCK-HGFX7, по сравнению с группой, обработанной рСК с целью контроля.
Пример 3
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток и апоптоз двигательных нервных клеток (NSC-34)
3-1. Клеточная линия и культура клеток
Клетки NSC-34 (Cellution Biosystem, Ванкувер, Канада), использованные в этом тесте, были двигательными нервными клетками мыши. Клетки NSC-34 соответствуют клеточной линии, в которой двигательные нервные клетки, полученные из спинномозгового нерва эмбрионов мышей, смешаны с клетками нейробластомы, и широко используются в исследованиях, связанных с двигательными нервами. Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Sigma), с добавлением 10% фетальной сыворотки коров и антибиотического материала (Gibco BRL, США) при 37°C и 5% CO2. Среду, реагент и сыворотку для культуры клеток закупили в компаниях Gibco и Sigma Aldrich.
3-2. Получение и количественная оценка супернатанта, экспрессирующего белок HGF
Трансфекцию ДНК использовали для получения супернатанта, экспрессирующего белок HGF. Трансфекцию провели с использованием системы трансфекции FuGene HD (Promega, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки 293Т высеяли в количестве 1×106 клеток, и на следующий день клетки трансфицировали 3 мкг рСК, pCK-HGF728 (pCK-cHGF в публикации PCT/KR03/000548), pCK-HGF723 (pCK-dHGF в публикации PCT/KR03/000548) и рСК-HGFX7 ДНК. После культивирования в течение 48 часов соответствующие супернатанты собрали и профильтровали через фильтр с ячейками 0,22 мкм. Уровень экспрессии белка HGF, содержавшегося в каждом супернатанте, измерили с использованием иммуноанализа на HGF человека. Каждый супернатант снова разбавили до концентрации, равной 1 мкг/мл, перед проведением анализов. Рекомбинантный белок HGF человека, использованный в иммуноанализе на HGF человека, закупили в компании R&D (R&D Systems, Inc., MSP, США).
3-3. Эффект pCK-HGFX7 человека на клеточный рост в клетках NSC-34
Для подтверждения эффекта pCK-HGFX7 на рост двигательных нервных клеток клетки NSC-34 обработали pCK-HGFX7 и затем оценили уровень пролиферации клеток. Клетки культивировали в культуральной среде с добавлением 10% фетальной сыворотки коров, а затем перед использованием для анализов культуру суспензировали с использованием среды Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Sigma), с добавлением 1% фетальной сыворотки коров. Клетки засеяли в 6-луночный планшет так, что в 2 мл среды, содержавшей 1% сыворотки, находилось 3×104 клеток. Через 2 часа после посева соответствующие супернатанты, полученные от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, добавили в 6-луночный планшет в количестве, равном 100 мкл/ячейку, так что концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл. Супернатант, полученный посредством трансфицирования клеток 293Т вектором рСК, был использован в качестве контроля. После культивирования в течение 48 часов среду в 6-луночном планшете заменили. После добавления в каждую лунку 2 мл среды, содержавшей 1% фетальной сыворотки коров, в каждую лунку добавили супернатанты, полученные от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, так что концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл, после чего культивировали в течение 48 часов. Супернатант, полученный посредством трансфицирования клеток 293Т вектором рСК, был использован в качестве контроля. Культивированные клетки собрали и подсчитали. Вектор рСК использовали в качестве контроля.
В результате культивирования в течение 5 дней после засева клеток, когда группы, обработанные соответствующими супернатантами, полученными от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, сравнили с группой, обработанной рСК, пролиферация клеток была индуцирована примерно на 20% в группах, обработанных pCK-HGF728 или pCK-HGF723, а рост клеток увеличился примерно на 48% в группе, обработанной pCK-HGFX7. Благодаря этим результатам удалось подтвердить, что pCK-HGFX7 может значимо увеличивать клеточный рост двигательных нервных клеток по сравнению с pCK-HGF728 или pCK-HGF723.
3-4. Эффект pCK-HGFX7 на апоптоз в клетках NSC-34
Клетки NSC-34 суспензировали в количестве, равном 3×104, в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 1% фетальной сыворотки коров и затем засеяли в 6-луночный планшет. После посева клетки стабилизировали в течение 2 часов, после чего добавили супернатанты, полученные от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, так, чтобы концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл. Супернатант, полученный посредством трансфицирования клеток 293Т вектором рСК, был использован в качестве контроля. Клетки культивировали в течение 5 дней, причем среду и каждый из супернатантов заменяли с интервалами, равными от 2 до 3 дней.
РНК экстрагировали из клеток, которые культивировали в течение 5 дней, с использованием реагента Тризол (Life Technologies, США), и экстрагированную РНК использовали для синтеза кДНК с использованием набора First Strand cDNA (Roche, США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени провели с использованием синтезированной кДНК в качестве матрицы и полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 для гена Вах или полинуклеотидов SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 для гена Bcl-12 в качестве праймеров. ПЦР в реальном времени провели посредством смешивания 1 мкл матрицы кДНК, 1 мкл 10 пмоль/мкл каждого из праймеров, 12,5 мкл маточной смеси для ПЦР SYBR green (Life Technologies, США) и 9,5 мкл стерилизованной трижды дистиллированной воды с получением в общей сложности 25 мкл жидкой смеси, после чего провели реакцию в течение 2 мин при 50°C и в течение 10 мин при 95°C, а затем выполнили 40 циклов по 15 с при 95°C и 1 мин при 60°C. Для коррекции каждого значения, полученного в реакции, ПЦР в реальном времени выполнили с использованием в качестве праймеров нуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 для GAPDH как конститутивного гена. Как показали результаты, экспрессия гена Вах, связанного с апоптозом, снижалась в каждой из групп, обработанной супернатантом с HGF, в большей мере, чем в группе, обработанной рСК, и, в частности, экспрессия Bcl-2, связанного с антиапоптозом, была в 1,3 раза выше в группе, обработанной pCK-HGFX7, чем в группе, обработанной рСК (см. Фиг. 4а). Благодаря этому тесту было подтверждено, что в среде, содержавшей 1% фетальной сыворотки коров, pCK-HGFX7 ингибировал апоптоз примерно на 40%, по сравнению с группой, обработанной рСК, которую использовали в качестве контроля (см. Фиг. 4b).
Пример 4
Подтверждение эффекта PCK-HGFX7 на переживание клеток NSC-34 в культуре в условиях оксидативного стресса
4-1. Выбор концентрации раствора пероксида водорода, вызывающей апоптоз клеток NSC-34 за счет оксидативного стресса
Перед проверкой эффекта pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34, вызванный раствором пероксида водорода, были выбраны концентрация клеток для посева, подходящая для оценки апоптоза клеток NSC-34, и концентрация раствора пероксида водорода, вызывающая апоптоз.
Клетки, культивировавшиеся в культуральной среде с добавлением фетальной сыворотки коров, собрали и затем суспензировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 1% плодной сыворотки коров, после чего подсчитали клетки. Подсчитанные клетки засеяли в 96-луночный планшет в концентрации 1×104 и на следующий день обработали растворами пероксида водорода, равными 10, 20, 30, 50 и 10 мкМ. В лунку, не обработанную раствором пероксида водорода, добавили фосфатный буферный раствор, и эту лунку использовали в качестве контроля. Через 24 часа измерили уровень апоптоза с использованием способа количественного анализа клеток с применением реагента ХТТ (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолиум-5-карбоксанилида) (Roche, США). Было обнаружено, что в исследованных группах, обработанных растворами пероксида водорода с различными концентрациями, был индуцирован апоптоз, превысивший контрольный уровень на 0%, 10%, 30%, 70% и 85%. На основании этих результатов была выбрана подходящая для индуцирования апоптоза клеток NSC-34 концентрация раствора пероксида водорода, равная 30 мкМ.
Кроме того, для проведения анализа на апоптоз в 6-луночном планшете клетки засеяли в 6-луночный планшет так, что в 2 мл среды, содержавшей 1% фетальной сыворотки коров, содержалось 1,5×105, 3×105 и 1×106 клеток. На следующий день клетки NSC-34 обработали раствором пероксида водорода с концентрацией, равной 30 мкМ, и подсчитали число клеток в дни 1, 4 и 7. В результате определения числа клеток в день 7 оказалось, что все клетки в лунке, куда было засеяно 1,5×105 клеток, погибли, и поэтому эту лунку нельзя было выбрать для анализа, а в лунке, куда было засеяно 1×106 клеток, не был индуцирован апоптоз. Исходя из этих результатов анализа, для испытаний на индукцию апоптоза были выбраны число клеток и концентрация раствора пероксида водорода, равные 3×105 и 30 мкМ соответственно.
4-2. Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на переживание клеток NSC-34 в культуре, находящейся в условиях оксидативного стресса
Клетки NSC-34 культивировали в культуральной среде с добавлением 10% фетальной сыворотки коров, и для использования в испытании на ингибирование апоптоза культуру суспензировали с использованием среды Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 1% фетальной сыворотки коров. Клетки засеяли в 6-луночный планшет так, что в 2 мл среды, содержавшей 1% сыворотки, содержалось 3×105 клеток. На следующий день соответствующие лунки обработали раствором пероксида водорода с концентрацией, равной 30 мкМ, выбранной из предварительного испытания, и затем обработали соответствующими супернатантами, полученными от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, так, чтобы концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл. Культуральную среду, полученную при трансфицировании клеток вектором рСК, использовали в качестве контроля. После культивирования клеток в течение 7 дней определили уровень апоптоза. Через 7 дней после посева клеток клетки собрали и подсчитали. В результате подсчета клеток было установлено, что лишь примерно от 60 до 70% клеток от первоначально засеянного количества выжило в исследованных группах, обработанных рСК, pCK-HGF728 и pCK-HGF723, тогда как клетки NSC-34, обработанные pCK-HGFX7, продемонстрировали примерно 92%-ное выживание, что свидетельствует о превосходном ингибировании апоптоза, по сравнению с группами, обработанными другими испытанными материалами. Эти результаты подтвердили, что белок HGFX7 эффективно ингибировал апоптоз двигательных нейронов, индуцированный оксидативным стрессом, вызванным раствором пероксида водорода (см. Фиг. 2).
4-3. Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на апоптоз клеток NSC-34 в культурах, находящихся в условиях оксидативного стресса
Клетки NSC-34 суспензировали в количестве, равном 3×105, в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 1% фетальной сыворотки коров и затем засеяли в 6-луночный планшет. На следующий день соответствующие лунки обработали раствором пероксида водорода с концентрацией, равной 30 мкМ, после чего обработали соответствующими супернатантами, полученными от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728, pCK-HGF723 и pCK-HGFX7, так, чтобы концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл, и затем культивировали в течение 7 дней. Супернатант, полученный от клеток, трансфицированных вектором рСК, использовали в качестве контроля.
РНК экстрагировали из клеток, которые культивировали в течение 7 дней, с использованием реагента Trizol и использовали экстрагированную РНК для синтеза кДНК с использованием набора First Strand cDNA. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) провели с использованием синтезированной кДНК в качестве матрицы и полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 для гена Вах или полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 для гена Bcl в качестве праймеров. ПЦР в реальном времени провели посредством смешивания 1 мкл матрицы кДНК, 1 мкл 10 пмоль/мкл каждого из праймеров, 12,5 мкл маточной смеси для ПЦР SYBR green (Life Technologies, США) и 9,5 мкл стерилизованной трижды дистиллированной воды с получением в общей сложности 25 мкл жидкой смеси, после чего провели реакцию в течение 2 мин при 50°C и в течение 10 мин при 95°C, а затем выполнили 40 циклов по 15 с при 95°C и 1 мин при 60°C. Для коррекции каждого значения, полученного в реакции, ПЦР в реальном времени выполнили с использованием в качестве праймеров полинуклеотидов с последовательностями SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 для GAPDH как конститутивного гена. Результаты испытания подтвердили, что экспрессия гена Вах, связанного с апоптозом, снижалась, а экспрессия гена Bcl-2, связанного с антиапоптозом, увеличивалась в каждой из групп, обработанной супернатантом с HGF, в большей мере, чем в группе, обработанной рСК. В частности, экспрессия гена Вах снизилась примерно на 70% (см. Фиг. 6а), а отношение Bax/Bcl-2 снизилось примерно на 75%, что свидетельствует о превосходном антиапоптотическом эффекте (см. Фиг. 6b) в группе, обработанной pCK-HGFX7, по сравнению с группой, обработанной рСК.
Пример 5
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на рост клеток, в которые была доставлена hSOD1 с мутацией G93A
Анализ in vitro с использованием мутантной формы G93A супероксиддисмутазы 1 (SOD1; от англ.: superoxide dismutase 1), которая является одной из причин БАС, был разработан многими исследователями. В частности, сообщалось, что доставка мутантной G93A формы HSOD1 в клетки NSC-34, которые широко используют в исследованиях двигательных нейронов, может вызвать апоптоз (Cheema et al., 2005). Поэтому в данном испытании pCK-hSOD1 дикого типа и pCK-hSOD1-G93A были получены посредством инсерции человеческого гена SOD1 дикого типа (WT; от англ.: wild type) (NM_000454) и человеческого гена SOD1, в которой 93-й остаток аминокислоты был изменен с глицина на аланин, в сайт BamHI вектора рСК, соответственно. Описанное ниже испытание было проведено с целью исследования эффекта pCK-HGFX7 на клетки NSC-34, в которые hSOD1-G93A была доставлена с использованием полученной плазмиды.
Клетки NSC-34 засеяли в 96-луночный планшет так, что клетки были суспензированы в количестве, равном 1×104, в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 10% плодной сыворотки коров. На следующий день клетки трансфицировали рСК, pCK-hSOD1-WT (дикого типа) и pCK-hSOD1-G93A (мутантная форма, G93A) с использованием реагента липофектамина LTX (Life Technologies, США). Сразу же после трансфекции клетки, трансфицированные G93A, обработали супернатантами, полученными от клеток 293Т, трансфицированных pCK-HGF728 и pCK-HGFX7, так, что концентрация белка HGF была равна 50 нг/мл. Супернатант, полученный посредством трансфицирования клеток вектором рСК, использовали в качестве контроля.
После культивирования в течение 3 дней оценили клеточный рост посредством обработки реагентом ХТТ. Результаты показали, что клетки, в которые была доставлена hSOD1 дикого типа, и клетки, в которые был доставлен вектор рСК, продемонстрировали одинаковый клеточный рост. Однако клетки, в которые была доставлена мутантная G93A форма hSOD1, показали клеточный рост, составивший примерно 85% от роста клеток с доставленным вектором рСК, что свидетельствует о нарушении клеточного роста по сравнению с клетками, куда была доставлена hSOD1 дикого типа. Однако группа, обработанная pCK-HGFX7, показала клеточный рост, составивший примерно 92,9%, что свидетельствует об эффекте ингибирования нарушения клеточного роста, вызванного доставкой мутантной G93A формы hSOD1 (см. Фиг. 7).
[Последовательности генов]
SEQ ID NO: 11: GGC AGA CAG TGA CCA TCT TT
SEQ ID NO: 12: AGT GGA CCT GAG GTT TAT TG
SEQ ID NO: 13: CCA TCA АТС AAA GCC AAG CA
SEQ ID NO: 14: AGС CTT CAC GCA AGT TCA GG
SEQ ID NO: 15: CCA TCA CTG CCA CTC AGA AGA С
SEQ ID NO: 16: TCA TAC TTG GCA GGT TTC TCC
Пример 6
Подтверждение эффекта pCK-HGFX7 на силу захвата лапы трансгенных мышей с мутантной человеческой SOD1-G93A (далее - БАС-мышей)
Поскольку обнаружено, что мутация супероксиддисмутазы 1 (SOD1) является одной из причин БАС, то разработана модель БАС на мышах с использованием этого гена, и к настоящему времени исследователи БАС во всем мире провели разнообразные исследования с использованием этой модели на животных. Из этих моделей была выбрана широко использовавшаяся модель B65JL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J (002726) и использована для испытаний. Получение модели БАС на мышах было заказано в компании Woo Jung BSC (Корея), и модель на мышах была использована для данного испытания, после того как было проверено, экспрессируется ли ген SOD1 мутантного типа, посредством генотипирования.
Мышей с БАС в возрасте 10 недель разделили на группы по 4 мыши, которым ввели Tg-pCK, Tg-pCK-HGF728 (pCK-cHGF в публикации PCT/KR03/00548) и Tg-pCK-HGFX7. Шесть мышей без трансгена выбрали и использовали в качестве отрицательного контроля (далее - non-Tg). Через две недели мышам из трех испытательных групп, кроме отрицательного контроля, ввели соответствующую плазмиду посредством внутримышечной инъекции. При этом 50 мкл соответствующей плазмиды ввели в концентрации 2 мкг/мл в трехглавую мышцу передней лапы, большеберцовую мышцу, прямую мышцу бедра и икроножную мышцу слева и справа соответственно. После двухнедельного введения (в возрасте 14 недель) силу захвата лап каждой мыши исследовали в поведенческом испытании. Для поведенческого испытания выполнили тест с силой захвата сетки. Испытание с силой захвата сетки было использовано для оценки силы захвата, при этом мышь помещали на проволочную сетку, которая содержала устройства, которые через предварительно заданные интервалы переворачивали проволочную сетку, после чего измеряли время, в течение которого мышь удерживалась на проволочной сетке. Это один из репрезентативных способов оценки мышечной силы мыши (Crawley J.N., 2008).
В результате теста было обнаружено, что non-Tg мыши в среднем удерживались на сетке в течение примерно 9 минут, однако среди Tg-мышей мыши, которые получали рСК, удерживались на сетке в среднем примерно через 30 с. Мыши, получившие плазмиду pCK-HGF728, продемонстрировали немного большее среднее время по сравнению с мышами, получавшими только рСК, и это время в среднем было равно 49 с. При этом мыши, получившие pCK-HGFX7, удерживались на сетке в течение более длительного времени по сравнению с мышами, получавшими рСК или pCK-HGF728, и среднее время было равно 3 минутам (см. Фиг. 8). Это показывает, что pCK-HGFX7 значимо улучшает функцию мышц, включая силу захвата у мышей с БАС по сравнению с рСК или pCK-HGF728.
Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные признаки, специалистам в данной области техники будет очевидно, что это описание относится только к предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Соответственно существенный объем настоящего изобретения определен формулой изобретения и ее эквивалентами.
Claims (12)
1. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза, содержащая в качестве активного ингредиента две или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий указанные изоформы, где указанные две или более изоформ HGF включают полноразмерный HGF (flHGF), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и делетированный вариант HGF (dHGF), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что две или более изоформ HGF закодированы раздельными последовательностями нуклеотидов.
3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что две или более изоформ HGF закодированы одной последовательностью нуклеотидов.
4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что полинуклеотид является депротеинизированной ДНК или содержится в системе доставки генов.
5. Композиция по п. 4, отличающаяся тем, что системой доставки генов является вектор.
6. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что вектор является плазмидой.
7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что вектор является рСК.
8. Композиция по п. 1, где указанный полинуклеотид включает последовательность, соответствующую экзонам с 1 по 18 гена HGF человека, и последовательность интрона 4 гена HGF человека или его фрагмента, который дополнительно инсерцирован между экзоном 4 и экзоном 5.
9. Композиция по п. 8, где указанный полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей с SEQ ID NO: 3 по SEQ ID NO: 10.
10. Композиция по п. 9, где указанный полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9.
11. Композиция по п. 1, где указанный полинуклеотид присутствует в количестве от 1 мкг до 2500 мг.
12. Способ предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза, включающий введение млекопитающему композиции, содержащей в качестве активного ингредиента два или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF) или полинуклеотид, кодирующий указанные изоформы, где указанные две или более изоформ HGF включают полноразмерный HGF (flHGF), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и делетированный вариант HGF (dHGF), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130126216 | 2013-10-22 | ||
| KR10-2013-0126216 | 2013-10-22 | ||
| KR10-2014-0143377 | 2014-10-22 | ||
| PCT/KR2014/009971 WO2015060650A2 (ko) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR1020140143377A KR101779775B1 (ko) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016119116A RU2016119116A (ru) | 2017-11-28 |
| RU2639582C2 true RU2639582C2 (ru) | 2017-12-21 |
Family
ID=53386224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016119116A RU2639582C2 (ru) | 2013-10-22 | 2014-10-22 | Композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10639351B2 (ru) |
| EP (1) | EP3061457B1 (ru) |
| JP (1) | JP6240337B2 (ru) |
| KR (2) | KR101779775B1 (ru) |
| CN (1) | CN105682676B (ru) |
| AU (1) | AU2014337870B2 (ru) |
| BR (1) | BR112016008267A2 (ru) |
| CA (1) | CA2926607C (ru) |
| ES (1) | ES2773305T3 (ru) |
| HK (1) | HK1219873A1 (ru) |
| MX (1) | MX2016005006A (ru) |
| RU (1) | RU2639582C2 (ru) |
| SG (1) | SG11201602452SA (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3046202B1 (fr) * | 2015-12-24 | 2017-12-29 | Snecma | Turboreacteur avec un moyen de reprise de poussee sur le carter inter-compresseurs |
| CA3086046C (en) * | 2017-12-29 | 2023-02-21 | Helixmith Co., Ltd. | Adeno-associated virus (aav) vector having hybrid hgf gene introduced thereto |
| JP7380670B2 (ja) * | 2018-07-17 | 2023-11-15 | ヘリックスミス カンパニー， リミテッド | Ｉｇｆ－１－暗号化ｄｎａ作製物及びｈｇｆ－暗号化ｄｎａ作製物を用いた神経病症治療 |
| CN110577954A (zh) * | 2019-10-12 | 2019-12-17 | 北京万福来生物技术有限责任公司 | 突变的肝细胞生长因子基因及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2413524C1 (ru) * | 2009-07-31 | 2011-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "КриоЦентр" | Способ лечения психических и неврологических расстройств |
Family Cites Families (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0255320A3 (en) | 1986-07-28 | 1989-09-06 | Genzyme Corporation | Production of proteins in myeloma cells |
| GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
| NZ232813A (en) | 1989-03-10 | 1992-08-26 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Human fibroblast glycoprotein, cell differentiation, blood vessel endothelial cell growth factor, cellular immunology inforcing factor of 78 or 74 thousand daltons plus or minus two thousand daltons |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US6673776B1 (en) | 1989-03-21 | 2004-01-06 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human |
| US5693622A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-02 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal |
| CA2022752C (en) | 1989-08-11 | 1998-07-07 | Naomi Kitamura | Hepatic parenchymal cell growth factor, gene encoding the same, process for producing the factor, and transformants producing the factor |
| US6706694B1 (en) | 1990-03-21 | 2004-03-16 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate |
| EP0539590B1 (en) | 1990-07-13 | 1999-03-31 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Plasmid containing dna which codes for the amino acid sequence of tcf-ii, transformed cell, and production of physiologically active substance by using the same |
| US5661133B1 (en) | 1991-11-12 | 1999-06-01 | Univ Michigan | Collateral blood vessel formation in cardiac muscle by injecting a dna sequence encoding an angiogenic protein |
| US7323297B1 (en) | 1992-04-03 | 2008-01-29 | The Regents Of The University Of California | Stabilized polynucleotide complexes and methods |
| JP3680114B2 (ja) | 1993-09-17 | 2005-08-10 | 敏一 中村 | 脳神経障害治療剤 |
| US5837676A (en) | 1993-10-18 | 1998-11-17 | Long Island Jewish Medical Center | Use of scatter factor to enhance angiogenesis |
| US6498144B1 (en) | 1993-10-18 | 2002-12-24 | North Shore - Long Island Jewish Research Institute | Use of scatter factor to enhance angiogenesis |
| US5652225A (en) | 1994-10-04 | 1997-07-29 | St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. | Methods and products for nucleic acid delivery |
| US6143714A (en) | 1994-10-24 | 2000-11-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using hepatocyte growth factor to promote survival, growth and differentiation of motor neurons |
| US20030148968A1 (en) | 1995-02-28 | 2003-08-07 | Hammond H. Kirk | Techniques and compositions for treating cardiovascular disease by in vivo gene delivery |
| JP3927248B2 (ja) | 1995-07-11 | 2007-06-06 | 第一製薬株式会社 | Ｈｇｆ凍結乾燥製剤 |
| WO1997007824A1 (fr) | 1995-08-29 | 1997-03-06 | Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. | Medicament comprenant le gene hgf |
| US5830879A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-03 | St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. | Treatment of vascular injury using vascular endothelial growth factor |
| US6121246A (en) | 1995-10-20 | 2000-09-19 | St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. | Method for treating ischemic tissue |
| EA005157B1 (ru) | 1997-05-06 | 2004-12-30 | Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния | Методы и составы для лечения сердечной недостаточности и вентрикулярной коррекции путем доставки in vivo ангиогенных трансгенов |
| WO1999036103A1 (en) | 1998-01-16 | 1999-07-22 | Mcgill University | Prevention and treatment of neuropathy by hepatocyte growth factor |
| JPH11246433A (ja) | 1998-03-03 | 1999-09-14 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 心筋梗塞治療剤 |
| WO1999045775A1 (en) | 1998-03-09 | 1999-09-16 | St. Elizabeth's Medical Center | Compositions and methods for modulating vascularization |
| US20040228834A1 (en) | 1998-03-09 | 2004-11-18 | Jeffrey Isner | Compositions and methods for modulating vascularization |
| EP1555033A3 (en) | 1998-03-13 | 2005-08-17 | Wyeth | Polynucleotide composition, method of preparation, and use thereof |
| DE69925113T2 (de) | 1998-03-13 | 2006-01-19 | Wyeth | Polynukleotidzusammensetzung, verfahren zu deren herstellung und verwendung |
| US7276359B1 (en) | 1998-03-13 | 2007-10-02 | Wyeth | Polynucleotide composition, method of preparation, and use thereof |
| WO2000007615A1 (fr) | 1998-08-05 | 2000-02-17 | Sumitomo Pharmacueticals Co., Ltd. | Preparations destinees a l'administration d'un facteur de croissance des hepatocytes |
| KR20000046969A (ko) | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 이선경 | 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 |
| CA2356701C (en) | 1999-10-29 | 2011-02-15 | Ryuichi Morishita | Gene therapy for diabetic ischemic disease |
| JP2003513942A (ja) | 1999-11-05 | 2003-04-15 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | インビボ遺伝子送達による心血管疾患を処理するための技術および組成物 |
| ATE530197T1 (de) | 2000-06-27 | 2011-11-15 | Anges Mg Inc | Medizinische zusammensetzungen zur angiogenese- therapie |
| AU2001286221B2 (en) | 2000-09-13 | 2006-09-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedies for ischemic diseases |
| JP5442173B2 (ja) | 2000-09-14 | 2014-03-12 | 敏一 中村 | 筋萎縮性側索硬化症治療剤 |
| US20030176347A1 (en) | 2003-05-14 | 2003-09-18 | Toshikazu Nakamura | Remedies for amyotrophic lateral sclerosis |
| CN1150035C (zh) | 2000-12-21 | 2004-05-19 | 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 | 一种重组质粒及其在疾病防治中的应用 |
| CA2433936A1 (en) | 2001-01-23 | 2002-08-22 | Boston Scientific Corporation | Localized myocardial injection method for treating ischemic myocardium |
| KR100562824B1 (ko) | 2002-03-20 | 2006-03-23 | 주식회사 바이로메드 | 유전자 발현효율이 높으며 간세포 성장인자의 두 가지이형체를 동시에 발현하는 하이브리드 간세포 성장인자유전자 |
| WO2004060059A2 (en) | 2002-12-23 | 2004-07-22 | Vical Incorporated | Method for freeze-drying nucleic acid/block copolymer/cationic surfactant complexes |
| US20050164208A1 (en) | 2004-01-22 | 2005-07-28 | Paul Poulin | Storage of genetic information |
| KR100833612B1 (ko) | 2004-12-29 | 2008-05-30 | 에프씨비파미셀 주식회사 | 간엽 간세포로부터 분화된 신경세포를 유효성분으로함유하는 신경계 질환 치료용 약학 조성물 |
| AU2006244639A1 (en) | 2005-03-31 | 2006-11-16 | Mytogen, Inc. | Treatment for heart disease |
| US20070212390A1 (en) | 2005-09-22 | 2007-09-13 | Ludwig Institute For Cancer Research | Protease-resistant forms of VEGF-D, method of making and method of use |
| KR20080082629A (ko) | 2005-11-10 | 2008-09-11 | 리셉터 바이오로직스 인크 | 간세포 성장인자 인트론 융합 단백질 |
| US20090130761A1 (en) | 2006-05-17 | 2009-05-21 | Yoshiyuki Koyama | Freeze-Dried Product for Introducing Nucleic Acid, Oligonucleic Acid or Derivative Thereof |
| WO2007142651A1 (en) | 2006-06-09 | 2007-12-13 | Caritas St. Elizabeth Medical Center Of Boston, Inc. | Methods and compositions for the treatment of neuropathy |
| ES2520044T3 (es) | 2007-03-30 | 2014-11-11 | The Cleveland Clinic Foundation | SDF-1 para su uso en el tratamiento de trastornos vasculares periféricos isquémicos |
| ATE543507T1 (de) | 2007-11-07 | 2012-02-15 | Ono Pharmaceutical Co | Sdf-1 enthaltende zusammensetzung mit anhaltender freisetzung |
| US20090202606A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-08-13 | Viromed Co., Ltd. | Treatment and Prevention of Cardiac Conditions Using Two or More Isoforms of Hepatocyte Growth Factor |
| CA2720611C (en) | 2008-04-09 | 2016-07-12 | Viromed Co., Ltd. | Lyophilized dna formulations for enhanced expression of plasmid dna |
| DK2516648T3 (en) | 2009-12-23 | 2018-02-12 | Curna Inc | TREATMENT OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST HGF |
| WO2012025925A1 (en) | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Methods of improving transplantation using sdf-1alpha |
| WO2013037521A1 (en) | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Medical Research Council | Modified hgf-1k1 polypeptide |
| WO2013037520A1 (en) | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Glaxo Group Limited | Modified hgf-1k1 polypeptide |
| JP2013129661A (ja) * | 2013-02-20 | 2013-07-04 | Toshiichi Nakamura | 筋萎縮性側索硬化症治療剤 |
-
2014
- 2014-10-22 MX MX2016005006A patent/MX2016005006A/es active IP Right Grant
- 2014-10-22 CN CN201480058075.3A patent/CN105682676B/zh active Active
- 2014-10-22 RU RU2016119116A patent/RU2639582C2/ru active
- 2014-10-22 BR BR112016008267A patent/BR112016008267A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-10-22 SG SG11201602452SA patent/SG11201602452SA/en unknown
- 2014-10-22 CA CA2926607A patent/CA2926607C/en active Active
- 2014-10-22 US US15/030,999 patent/US10639351B2/en active Active
- 2014-10-22 AU AU2014337870A patent/AU2014337870B2/en active Active
- 2014-10-22 JP JP2016546724A patent/JP6240337B2/ja active Active
- 2014-10-22 ES ES14856385T patent/ES2773305T3/es active Active
- 2014-10-22 KR KR1020140143377A patent/KR101779775B1/ko active IP Right Grant
- 2014-10-22 EP EP14856385.1A patent/EP3061457B1/en active Active
-
2016
- 2016-07-06 HK HK16107864.0A patent/HK1219873A1/zh unknown
-
2017
- 2017-08-31 KR KR1020170110892A patent/KR101860452B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2413524C1 (ru) * | 2009-07-31 | 2011-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "КриоЦентр" | Способ лечения психических и неврологических расстройств |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| GU Y. et al. A phase I clinical study of naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor to treat patients with critical limb ischemia. J Gene Med. 2011 Nov; 13(11): 602-610. * |
| GU Y. et al. A phase I clinical study of naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor to treat patients with critical limb ischemia. J Gene Med. 2011 Nov; 13(11): 602-610. Лекция 5. Белки. BioBox All Secrets. 29.09.2012; стр.1-10 [Найдено 04.07.2017] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://biobox.spb.ru/lektsii/biokhimiya/135-belki.html. * |
| ISHIGAKI A. et al. Intrathecal delivery of hepatocyte growth factor from amyotrophic lateral sclerosis onset suppresses disease progression in rat amyotrophic lateral sclerosis model. J Neuropathol Exp Neurol. 2007 Nov; 66(11): 1037-1044. * |
| ISHIGAKI A. et al. Intrathecal delivery of hepatocyte growth factor from amyotrophic lateral sclerosis onset suppresses disease progression in rat amyotrophic lateral sclerosis model. J Neuropathol Exp Neurol. 2007 Nov; 66(11): 1037-1044. NAKAMURA T. et al. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J Gastroenterol Hepatol. 2011 Jan; 26 Suppl 1: 188-202. DATABASE, GenBank, * |
| NAKAMURA T. et al. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J Gastroenterol Hepatol. 2011 Jan; 26 Suppl 1: 188-202. DATABASE, GenBank, BAF84363.1, 09.01.2008. * |
| Лекция 5. Белки. BioBox All Secrets. 29.09.2012; стр.1-10 [Найдено 04.07.2017] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://biobox.spb.ru/lektsii/biokhimiya/135-belki.html. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3061457A2 (en) | 2016-08-31 |
| KR20150047108A (ko) | 2015-05-04 |
| BR112016008267A2 (pt) | 2017-10-03 |
| CA2926607A1 (en) | 2015-04-30 |
| EP3061457A4 (en) | 2017-06-07 |
| KR101779775B1 (ko) | 2017-09-21 |
| SG11201602452SA (en) | 2016-05-30 |
| EP3061457B1 (en) | 2020-01-22 |
| CA2926607C (en) | 2018-10-23 |
| AU2014337870B2 (en) | 2019-11-28 |
| KR20170104129A (ko) | 2017-09-14 |
| JP6240337B2 (ja) | 2017-11-29 |
| US10639351B2 (en) | 2020-05-05 |
| AU2014337870A1 (en) | 2016-05-05 |
| JP2016534149A (ja) | 2016-11-04 |
| RU2016119116A (ru) | 2017-11-28 |
| HK1219873A1 (zh) | 2017-04-21 |
| ES2773305T3 (es) | 2020-07-10 |
| CN105682676B (zh) | 2020-10-23 |
| MX2016005006A (es) | 2016-07-14 |
| US20160250291A1 (en) | 2016-09-01 |
| CN105682676A (zh) | 2016-06-15 |
| KR101860452B1 (ko) | 2018-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20210103469A (ko) | 재조합 바이러스 벡터 및 이를 생산하기 위한 핵산 | |
| RU2639582C2 (ru) | Композиция для предупреждения или лечения бокового амиотрофического склероза с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов | |
| US20240002462A1 (en) | Treatment of neuropathy with igf-1-encoding dna constructs and hgf-encoding dna constructs | |
| CA3136004A1 (en) | Gene therapies for lysosomal disorders | |
| MX2014005318A (es) | Terapia genica para la neuropatia diabetica usando una isoforma hgf. | |
| AU2017218583B2 (en) | Vector | |
| KR20230044522A (ko) | 척수성 근위축을 치료하기 위한 핵산 구축물 및 이의 용도 | |
| CN116438311A (zh) | 可用于治疗夏科-马里-图思病的组合物 | |
| JP2019070001A (ja) | 肝細胞増殖因子及びストローマ細胞由来因子１αを用いた末梢動脈疾患の予防または治療用組成物 | |
| RU2767335C1 (ru) | Химерные белки на основе утрофина и дистрофина человека и их применение для лечения миодистрофии Дюшенна | |
| Takeda et al. | Gene therapy for muscular dystrophies: current status and future prospects | |
| WO2015060650A2 (ko) | 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 | |
| WO2024125494A1 (zh) | 一种基因调节的方法及其应用 |