RU2638787C1 - Method for obtaining of analytical test system based on suspension microchips for diseases markers detection - Google Patents
Method for obtaining of analytical test system based on suspension microchips for diseases markers detection Download PDFInfo
- Publication number
- RU2638787C1 RU2638787C1 RU2016149212A RU2016149212A RU2638787C1 RU 2638787 C1 RU2638787 C1 RU 2638787C1 RU 2016149212 A RU2016149212 A RU 2016149212A RU 2016149212 A RU2016149212 A RU 2016149212A RU 2638787 C1 RU2638787 C1 RU 2638787C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microspheres
- recognition molecules
- biological recognition
- biological
- molecules
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/05—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицинских исследований методами проточной цитометрии с применением суспензионных микрочипов. Предлагаемый способ служит для получения тест-системы, позволяющей детектировать и количественно определять множество различных белковых маркеров заболеваний, например онкологических заболеваний женской репродуктивной системы, методами проточной цитометрии на стандартных проточных цитометрах.The invention relates to the field of medical research using flow cytometry using suspension microarrays. The proposed method is used to obtain a test system that allows you to detect and quantify many different protein markers of diseases, for example, oncological diseases of the female reproductive system, by flow cytometry methods on standard flow cytometers.
Известен способ создания тест-системы на основе популяций спектрально кодированных микросфер для одновременного определения различных аналитов [1]. Для спектрального кодирования микросфер применяют не менее двух органических флуоресцентных красителей различного спектра флуоресценции, нанесенных в разных пропорциях на микросферы. При этом флуоресцентные красители наносят на микросферы путем их осаждения на поверхности микросфер из раствора, содержащего не менее двух органических красителей. На поверхность описанных микросфер методом пассивной адсорбции или ковалентного конъюгирования наносят биологические распознающие молекулы, аффинные к детектируемым маркерам заболеваний. Описанный способ позволяет создать тест-систему, содержащую как минимум 64 различные популяции микросфер, имеющих различные флуоресцентные коды, для одновременной детекции различных маркеров заболеваний. Недостатками упомянутого выше способа являются, во-первых, применение органических флуоресцентных красителей, которые имеют малое время высвечивания флуоресцентного сигнала, а также различную эффективность возбуждения при заданной длине волны, а во-вторых, т.к. флуоресцентные красители наносятся методом осаждения из раствора, то невозможно провести разделение флуоресцентных красителей в пространстве для более прецизионного оптического кодирования.A known method of creating a test system based on populations of spectrally encoded microspheres for the simultaneous determination of various analytes [1]. For spectral coding of microspheres, at least two organic fluorescent dyes of different fluorescence spectra are applied, applied in different proportions on the microspheres. In this case, fluorescent dyes are applied to microspheres by their deposition on the surface of microspheres from a solution containing at least two organic dyes. Biological recognition molecules affinity for detectable markers of diseases are applied to the surface of the described microspheres by passive adsorption or covalent conjugation. The described method allows you to create a test system containing at least 64 different populations of microspheres with different fluorescent codes, for the simultaneous detection of various markers of diseases. The disadvantages of the above method are, firstly, the use of organic fluorescent dyes, which have a short time of fluorescence signal fluorescence, as well as different excitation efficiency at a given wavelength, and secondly, because Since fluorescent dyes are applied by the method of precipitation from a solution, it is impossible to separate the fluorescent dyes in space for more precise optical coding.
Способ, наиболее близкий к предлагаемому, описанный в патенте [2], был взят за прототип. Оптическое кодирование микросфер в прототипе осуществляется использованием флуоресцентных красителей различного спектра испускания флуоресценции, а также применением микросфер различного диаметра. Стоит отметить, что в указанном прототипе для спектрального кодирования каждой отдельной популяции микросфер применяется флуоресцентный краситель одного определенного спектра испускания, и использованы микросферы, покрытые слоем золота, для усиление флуоресцентного сигнала красителей для обеспечения более чувствительного обнаружения маркеров. В качестве биологических распознающих молекул, конъюгированных с поверхностью микросферы, применены антитела, антигены, нуклеиновые кислоты, карбогидраты или связывающие белки. При этом для флуоресцентного мечения детектирующих компонент и микросфер применены флуоресцентные красители, испускающие в ближней инфракрасной области спектра. К недостаткам описанного выше способа стоит отнести то, что для флуоресцентного мечения микросфер одновременно используется всего один флуоресцентный краситель, что значительно сокращает количество различных цветовых кодов и ограничивает количество одновременно детектируемых различных маркеров, а также применение флуоресцентных красителей, флуоресцирующих в ближней инфракрасной области спектра, флуоресценция которых может детектироваться не на всех стандартных проточных цитометрах, которые, как правило, имеют возможность возбуждения и детекции сигнала в видимой области спектра.The method closest to the proposed, described in the patent [2], was taken as a prototype. The optical coding of the microspheres in the prototype is carried out using fluorescent dyes of different emission spectra of fluorescence, as well as the use of microspheres of different diameters. It is worth noting that in this prototype, for the spectral coding of each individual population of microspheres, a fluorescent dye of one specific emission spectrum is used, and microspheres coated with a layer of gold are used to enhance the fluorescent signal of the dyes to provide more sensitive detection of markers. Antibodies, antigens, nucleic acids, carbohydrates or binding proteins are used as biological recognition molecules conjugated to the surface of the microsphere. In this case, fluorescent dyes emitting in the near infrared region of the spectrum were used for fluorescent labeling of the detecting components and microspheres. The disadvantages of the method described above include the fact that for fluorescent labeling of microspheres, only one fluorescent dye is used at a time, which significantly reduces the number of different color codes and limits the number of different markers that can be detected simultaneously, as well as the use of fluorescent dyes that fluoresce in the near infrared region of the spectrum, fluorescence which may not be detected on all standard flow cytometers, which, as a rule, can excite eniya and detection signal in the visible region of the spectrum.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является способ получения аналитической тест-системы для одновременной высокочувствительной детекции различных маркеров заболеваний, совместимой с большинством стандартных проточных цитометров.The technical result of the invention is a method for obtaining an analytical test system for the simultaneous highly sensitive detection of various disease markers, compatible with most standard flow cytometers.
Технический результат достигается тем, что известный способ получения аналитической тест-системы на основе суспензионных микрочипов для детекции маркеров заболеваний, включающий создание суспензионных микрочипов, путем оптического кодирования микросфер различного диаметра флуоресцентными красителями с последующим конъюгированием их с биологическими распознающими молекулами и создания детектирующих компонент путем конъюгирования биологических детектирующих молекул с флуоресцентными красителями, дополнен тем, что для оптического кодирования микросфер различного диаметра используют полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы, которые наносят послойно на поверхность микросфер, при этом слой полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов одного цвета пространственно отделяют от соседнего слоя полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов другого цвета тремя и более слоями полиэлектролитов, причем для формирования внешнего слоя полиэлектролита используют полимер, включающий функциональные группы для специфического и/или ориентированного конъюгирования биологических распознающих молекул, а для маркирования биологических детектирующих молекул используют флуоресцентные красители, возбуждаемые на одной длине волны с используемыми полупроводниковыми флуоресцентными нанокристаллами.The technical result is achieved by the fact that the known method of obtaining an analytical test system based on suspension microarrays for the detection of disease markers, including the creation of suspension microarrays by optical coding of microspheres of various diameters with fluorescent dyes, followed by conjugation of them with biological recognition molecules and the creation of detecting components by conjugation of biological detecting molecules with fluorescent dyes, complemented by the fact that for optically For encoding microspheres of various diameters, semiconductor fluorescent nanocrystals are applied that are layered on the surface of the microspheres, while a layer of semiconductor fluorescent nanocrystals of one color is spatially separated from the adjacent layer of semiconductor fluorescent nanocrystals of a different color with three or more layers of polyelectrolytes, and a polyelectrolyte is used to form the outer polymer layer including functional groups for a specific and / or oriented conjugate of biological recognition molecules, and for labeling of biological detecting molecules use fluorescent dyes excited at the same wavelength with the used semiconductor fluorescent nanocrystals.
Возможность одновременной детекции множества различных маркеров заболеваний обусловлена путем создания суспензионных микрочипов с одновременным применением двух различных подходов для осуществления оптического кодирования, так, во-первых, использованы популяции микросфер различного диаметра, что позволяет различать микросферы по углу рассеивания света в канале проточного цитометра, а во-вторых, применено спектральное кодирование путем включения флуоресцентных меток на основе водорастворимых полупроводниковых нанокристаллов различного спектра испускания флуоресцентного сигнала, что позволяет различать микросферы еще и по спектру флуоресцентного сигнала. Данный способ оптического кодирования дает возможность создавать суспензионные микрочипы, оптические коды которых хорошо различимы при их определении на стандартных проточных цитометрах, а в силу применения оптического кодирования по диаметру микросфер и их спектральному коду, при этом конъюгирование различных по оптическим кодам популяций микросфер с заданными биологическими распознающими молекулами позволяет проводить одновременную детекцию множества различных маркеров заболеваний. Высокая чувствительность достигается, во-первых, применением флуоресцентных меток на основе полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов, которые обладают высоким квантовым выходом и длительным временем свечения, а послойное нанесение флуоресцентных нанокристаллов позволяет снизить перенос энергии между нанокристаллами различного цвета и повысить точность спектрального кодирования. Кроме того, применение ориентированного конъюгирования биологических распознающих молекул позволяет улучшить эффективность связывания детектируемых маркеров на поверхности микросфер и тем самым повысить чувствительность определения маркеров заболеваний.The possibility of simultaneous detection of many different disease markers is due to the creation of suspension microarrays with the simultaneous application of two different approaches for optical coding, for example, firstly, microsphere populations of various diameters are used, which makes it possible to distinguish microspheres by the angle of light scattering in the flow cytometer channel, secondly, spectral coding was applied by incorporating fluorescent labels based on water-soluble semiconductor nanocrystals of ra personal emission spectrum of the fluorescent signal, which allows to distinguish the microspheres also in the spectrum of the fluorescent signal. This optical coding method makes it possible to create suspension microarrays whose optical codes are clearly distinguishable when determined on standard flow cytometers, and due to the use of optical coding according to the diameter of microspheres and their spectral code, while conjugating populations of microspheres with different optical codes with given biological recognition molecules allows the simultaneous detection of many different disease markers. High sensitivity is achieved, firstly, by using fluorescent labels based on semiconductor fluorescent nanocrystals, which have a high quantum yield and a long luminescence time, and layer-by-layer deposition of fluorescent nanocrystals allows one to reduce the energy transfer between nanocrystals of various colors and improve the accuracy of spectral coding. In addition, the use of oriented conjugation of biological recognition molecules can improve the binding efficiency of detectable markers on the surface of microspheres and thereby increase the sensitivity of determining disease markers.
Возможен частный случай, в котором в качестве микросфер используют популяции полимерных микросфер с диаметром от 2 до 15 микрометров, поверхность которых предварительно функционализируют введением аминогрупп и/или карбоксильных групп.A particular case is possible in which populations of polymer microspheres with a diameter of 2 to 15 micrometers are used as microspheres, the surface of which is pre-functionalized by the introduction of amino groups and / or carboxyl groups.
Также возможен частный случай, в котором в качестве полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов используют полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы типа «ядро-оболочка», состоящие из атомов элементов II-VI или III-V групп периодической таблицы Менделеева и имеющие размер меньше радиуса экситона Бора для данного материала.A special case is also possible in which semiconductor fluorescence nanocrystals of the core-shell type, consisting of atoms of elements of the II-VI or III-V groups of the periodic table and having a size smaller than the radius of the Bohr exciton for this material, are used.
Существует частный случай, когда для оптического кодирования микросфер одного диаметра применяют полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы различного цвета в различных количественных соотношениях.There is a special case when semiconductor fluorescent nanocrystals of various colors in various quantitative ratios are used for optical coding of microspheres of the same diameter.
Возможен частный случай, в котором слои полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов разных цветов разделяют между собой слоями положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитов.A particular case is possible in which layers of semiconductor fluorescent nanocrystals of different colors are separated by layers of positively and negatively charged polyelectrolytes.
В частном случае, в качестве отрицательно заряженных полиэлектролитов используют поликислоты, например, такие как поливинилсульфоновая кислота, полистиролсульфоновая кислота, полиакриловая кислота, полиметакриловая кислота, полиглутаминовая кислота или полифосфорная кислота и/или соли этих поликислот.In the particular case, polyacids are used as negatively charged polyelectrolytes, for example, such as polyvinyl sulfonic acid, polystyrenesulfonic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyglutamic acid or polyphosphoric acid and / or salts of these polyacids.
Возможен частный случай, когда в качестве положительно заряженных полиэлектролитов используют полиоснования, например, такие как полиаллиламин, поливиниламин, политриметил-аммоний-этилметакриалат, полилизин, поли-4-винилпиридин, гидроксид поли-N-триметилвиниламмония и/или соли этих полиоснований.A particular case is possible when polybases are used as positively charged polyelectrolytes, for example, polyallylamine, polyvinylamine, polytrimethyl-ammonium-ethyl methacrylate, polylysine, poly-4-vinylpyridine, poly-N-trimethylvinylammonium hydroxide and / or salts of these polybases.
Также возможен частный случай, в котором между слоями полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов различных цветов наносят слои полиэлектролитов разных зарядов, таким образом, чтобы суммарная толщина слоев полиэлектролитов разных зарядов между соседними слоями полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов различных цветов превышала 10 нанометров.A special case is also possible in which layers of polyelectrolytes of different charges are deposited between layers of semiconductor fluorescent nanocrystals of different colors, so that the total thickness of layers of polyelectrolytes of different charges between adjacent layers of semiconductor fluorescent nanocrystals of different colors exceeds 10 nanometers.
Помимо этого, предлагается частный случай, в котором для формирования внешнего слоя полиэлектролита используют поликислоту или соль этой поликислоты, содержащую одну или несколько карбоксильных групп или аминогрупп.In addition, a special case is proposed in which a polyacid or a salt of this polyacid containing one or more carboxyl groups or amino groups is used to form the outer layer of a polyelectrolyte.
Возможен частный случай, в котором одну или несколько карбоксильных групп или аминогрупп внешнего слоя полиэлектролита химически связывают с аминогруппами или карбоксильными группами биологических распознающих молекул.A particular case is possible in which one or more carboxyl groups or amino groups of the outer layer of the polyelectrolyte are chemically bonded to amino groups or carboxyl groups of biological recognition molecules.
Существует частный случай, когда для химического связывания карбоксильных групп или аминогрупп внешнего слоя полиэлектролита и аминогрупп или карбоксильных групп биологических распознающих молекул используют карбодиимиды.There is a particular case when carbodiimides are used for chemical bonding of carboxyl groups or amino groups of the outer layer of a polyelectrolyte and amino groups or carboxyl groups of biological recognition molecules.
Возможны частные случаи, когда в качестве биологических распознающих молекул применены:Particular cases are possible when the following are used as biological recognition molecules:
- нативные белки;- native proteins;
- модифицированные белки;- modified proteins;
- поликлональные антитела;- polyclonal antibodies;
- моноклональные антитела;- monoclonal antibodies;
- однодоменные антитела;- single domain antibodies;
- высокоаффинные биологические компоненты;- high affinity biological components;
- стрептавидин;- streptavidin;
- биотин;- biotin;
- пептиды;- peptides;
- нуклеиновые кислоты;- nucleic acids;
- биологические распознающие молекулы, аффинные к белковым маркерам онкологических заболеваний женской репродуктивной системы.- biological recognition molecules affinity for protein markers of oncological diseases of the female reproductive system.
Ниже на фиг. 1 приведен конкретный пример реализации предлагаемого способа, иллюстрирующий один суспензионный микрочип, полученный по предлагаемому способу. Суспензионный микрочип состоит из микросферы 1, покрытой слоями полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов 2, чередующихся со слоями полиэлектролитов 3, и слоя внешнего полимера 4, покрывающего микросферу, к функциональным группам которого ориентированно конъюгированы биологические распознающие молекулы 5. Детектируемый маркер 6, связанный с биологическими распознающими молекулами 5, и биологическими детектирующими молекулами 7, конъюгированными с флуоресцентным красителем 8.Below in FIG. 1 shows a specific example of the implementation of the proposed method, illustrating one suspension microchip obtained by the proposed method. The suspension microchip consists of a
Конкретный пример поэтапного создания восьми популяций микросфер различного диаметра, спектрально кодированных флуоресцентными нанокристаллами, поясняется фиг. 2 и включает выполнение нижеследующих действий. Водную суспензию, содержащую 3,1×107 меламин-формальдегидных карбоксилированных микросфер диаметром 4,08 мкм, содержащих на поверхности карбоксильные группы, доводят до объема 0,5 мл и смешивают с 0,5 мл раствора поливиниламина в качестве положительно заряженного полиэлектролита с концентрацией 2 мг/мл. Смесь вортексируют в течение 30 секунд, затем помещают в ультразвуковую баню на 1 минуту, затем инкубируют в течение 20 минут при мягком перемешивании. После этого суспензию осаждают путем центрифугирования в течение 5 минут при 3000 об/мин, отбирают супернатант и ресуспендируют в 1 мл воды. Процедуру отмывки водой повторяют 3 раза для удаления избытка несвязавшегося полиэлектролита. После этого ресуспендируют микросферы в 0,5 мл воды и добавляют 0,5 мл раствора полиакриловой кислоты в качестве отрицательно заряженного полиэлектролита с концентрацией 2 мг/мл. Повторяют процедуры инкубаций и отмывки для формирования пяти полиэлектролитных слоев, последний из которых является положительно заряженным. После этого микросферы ресуспендируют в 1 мл воды и разделяют на две равные части, к каждой добавляют по 0,5 мл водных растворов водорастворимых отрицательно заряженных флуоресцентных нанокристаллов с максимумом флуоресценции 525 нм с концентрациями 0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл. Смеси вортексируют в течение 30 секунд, затем инкубируют в темноте в течение 20 минут при мягком перемешивании. Смеси трехкратно отмывают от избытка несвязавшихся нанокристаллов, затем наносят еще по три полиэлектролитных слоя. Каждую популяцию микросфер ресуспендируют в 1 мл воды и разделяют на две равные части, к каждой части добавляют по 0,5 мл водных растворов водорастворимых отрицательно заряженных флуоресцентных нанокристаллов с максимумом флуоресценции 585 нм с концентрациями 0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл. Смеси вортексируют в течение 30 секунд, инкубируют в темноте в течение 20 минут при мягком перемешивании затем повторяют процедуры отмывки и наносят 5 полиэлектролитных слоев, последним из которых является слой полимера, в качестве которого выступает полиметакриловая кислота. В результате получают четыре различные популяции двухцветных микросфер диаметром 4,08 мкм с условными спектральными кодами: 22, 21, 12, 11. Для получения четырех популяций двухцветных микросфер с условными спектральными кодами - 22, 21, 12, 11, диаметром 6,1 мкм, необходимо повторить описанные выше действия с аналогичными меламин-формальдегидными карбоксилированными микросферами диаметром 6,1 мкм.A specific example of the phased creation of eight populations of microspheres of various diameters spectrally encoded by fluorescent nanocrystals is illustrated in FIG. 2 and includes the following actions. An aqueous suspension containing 3.1 × 10 7 melamine-formaldehyde carboxylated microspheres with a diameter of 4.08 μm, containing carboxyl groups on the surface, is brought to a volume of 0.5 ml and mixed with 0.5 ml of a solution of polyvinylamine as a positively charged polyelectrolyte with a
Пример различного оптического кодирования конкретных популяций микросфер, полученных по предлагаемому способу и различающихся по размеру (использованы популяции микросфер трех различных диаметров - 4,08 мкм, 6,1 мкм и 8,24 мкм) и спектральным кодам (использованы два различных спектральных кода для популяции микросфер каждого диаметра), показан на фиг. 3. Видно, что при анализе популяций на проточном цитометре при детекции флуоресцентного сигнала и определении угла светорассеивания популяции микросфер с различными спектральными кодами формируют две хорошо различимые группы, в каждой из которых различимы популяции микросфер трех различных размеров.An example of various optical coding of specific populations of microspheres obtained by the proposed method and varying in size (populations of microspheres of three different diameters - 4.08 μm, 6.1 μm and 8.24 μm were used) and spectral codes (two different spectral codes for the population were used microspheres of each diameter) shown in FIG. 3. It can be seen that when analyzing populations on a flow cytometer when detecting a fluorescent signal and determining the light scattering angle, populations of microspheres with different spectral codes form two distinct groups, in each of which populations of microspheres of three different sizes are distinguished.
Процесс ориентированной конъюгации биологических распознающих молекул с функциональными группами внешнего слоя полиэлектролита раскрыт на примере конъюгирования однодоменных антител к CEA (раково-эмбриональный антиген) и меламин-формальдегидных карбоксилированных микросфер, покрытых внешним слоем полиаллиламин гидрохлорида. Для реакции берут 70 мкг однодоменных антител, несущих на своем С-конце аминокислотную последовательность с большим числом карбоксильных групп, растворяют их в 100 мкл натрий-фосфатного буферного раствора, добавляют 0,9 мкг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Затем однодоменные антитела очищают от избытка EDC на колонках для обессоливания белков, уравновешенных натрий-фосфатным буферным раствором. К полученным таким образом антителам сразу же добавляют суспензию, содержащую 4⋅106 микросфер, и инкубируют их смесь на холоде, в темноте в течение 12 часов при мягком перемешивании. На следующий день суспензию центрифугируют 4 мин при 1200 g, ресуспендируют и отмывают в натрий-фосфатном буфере. Для блокирования не специфического связывания маркеров на поверхности микросферы ресуспендируют в натрий-фосфатном буфере, содержащем 2% казеина, затем инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем однократно отмывают микросферы в натрий-фосфатном буфере. Полученные микросферы с иммобилизованными на поверхности однодоменными антителами можно хранить в натрий-фосфатном буфере (с добавлением 0,5% казеина) при +4°С в темноте.The process of oriented conjugation of biological recognition molecules with functional groups of the outer layer of the polyelectrolyte is disclosed by the example of conjugation of single domain antibodies to CEA (cancer-embryonic antigen) and melamine-formaldehyde carboxylated microspheres coated with an outer layer of polyallylamine hydrochloride. For the reaction, 70 μg of single-domain antibodies carrying an amino acid sequence with a large number of carboxyl groups at their C-terminus are taken, dissolved in 100 μl of sodium phosphate buffer solution, 0.9 μg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide are added (EDC) and incubated for 10 minutes at room temperature. Then single domain antibodies are purified from excess EDC on columns to desalinate proteins balanced with sodium phosphate buffer solution. A suspension containing 4 × 10 6 microspheres is immediately added to the antibodies thus obtained, and their mixture is incubated in the cold, in the dark, for 12 hours with gentle stirring. The next day, the suspension was centrifuged for 4 min at 1200 g, resuspended and washed in sodium phosphate buffer. To block non-specific binding of markers on the surface, the microspheres are resuspended in sodium phosphate buffer containing 2% casein, then incubated at room temperature for 1 hour, and then the microspheres are washed once in sodium phosphate buffer. The obtained microspheres with single domain antibodies immobilized on the surface can be stored in sodium phosphate buffer (with the addition of 0.5% casein) at + 4 ° C in the dark.
Таким образом, предложенный способ получения аналитической тест-системы на основе суспензионных микрочипов для одновременной детекции различных маркеров заболеваний позволяет добиться создания тест-систем с высокой чувствительностью, а также совместимых с большинством стандартных проточных цитометров, в силу использования оптического кодирования с помощью диаметра частиц и различных спектральных кодов, полученных применением полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов. Также предлагаемый способ служит для создания тест-систем для одновременного определение концентраций раково-эмбрионального антигена (CEA), специфических маркеров рака молочной железы (СА15-3, СА27-29), маркера рака яичников (СА125), маркера рака шейки матки (SCCA), а также маркера агрессивности рака молочной железы и яичников (фрагмент р105 белка HER2/neu) для целей научных исследований в области онкологии или проведения диагностики.Thus, the proposed method for producing an analytical test system based on suspension microarrays for the simultaneous detection of various disease markers allows the creation of test systems with high sensitivity, as well as compatible with most standard flow cytometers, due to the use of optical coding using particle diameters and various spectral codes obtained using semiconductor fluorescent nanocrystals. The proposed method also serves to create test systems for the simultaneous determination of concentrations of cancer-embryonic antigen (CEA), specific markers of breast cancer (CA15-3, CA27-29), ovarian cancer marker (CA125), cervical cancer marker (SCCA) as well as a marker of the aggressiveness of breast and ovarian cancer (p105 fragment of the HER2 / neu protein) for the purposes of scientific research in oncology or diagnostic purposes.
Источники информацииInformation sources
1. Don J. Chandler et al. Precision fluorescently dyed particles and methods of making and using same. Патент US 6599331 B2.1. Don J. Chandler et al. Precision fluorescently dyed particles and methods of making and using same. US Patent 6,599,331 B2.
2. Bo Zhang et al. Plasmonic beads for multiplexed analysis by flow detection systems. Патент WO 2015038797 A1.2. Bo Zhang et al. Plasmonic beads for multiplexed analysis by flow detection systems. Patent WO 2015038797 A1.
Claims (22)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016149212A RU2638787C1 (en) | 2016-12-14 | 2016-12-14 | Method for obtaining of analytical test system based on suspension microchips for diseases markers detection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016149212A RU2638787C1 (en) | 2016-12-14 | 2016-12-14 | Method for obtaining of analytical test system based on suspension microchips for diseases markers detection |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2638787C1 true RU2638787C1 (en) | 2017-12-15 |
Family
ID=60718988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016149212A RU2638787C1 (en) | 2016-12-14 | 2016-12-14 | Method for obtaining of analytical test system based on suspension microchips for diseases markers detection |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2638787C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2701742C1 (en) * | 2018-07-23 | 2019-10-01 | Российская Федерация, от имени Министерства здравоохранения Российской Федерации | Kit for differential diagnosis of diseases |
| CN110554178A (en) * | 2019-04-23 | 2019-12-10 | 杭州深度生物科技有限公司 | Suspension type liquid biochip detection method |
| CN116794313A (en) * | 2023-08-18 | 2023-09-22 | 江西赛基生物技术有限公司 | Kit and method for simultaneously detecting three tumor markers based on flow cytometry |
| CN117491648A (en) * | 2023-11-16 | 2024-02-02 | 广州敏特生物技术有限公司 | Human body autoantibody detection material and preparation method thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532559C1 (en) * | 2013-03-28 | 2014-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Method of multifunctional microsystem formation |
| WO2015038797A1 (en) * | 2013-09-13 | 2015-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Plasmonic beads for multiplexed analysis by flow detection systems |
-
2016
- 2016-12-14 RU RU2016149212A patent/RU2638787C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2532559C1 (en) * | 2013-03-28 | 2014-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Method of multifunctional microsystem formation |
| WO2015038797A1 (en) * | 2013-09-13 | 2015-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Plasmonic beads for multiplexed analysis by flow detection systems |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NOLAN J P et al., Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm, Trends Biotechnol. 2002 Jan; 20(1):9-12-. * |
| БРАЖНИК К.И. и др. Aналитические характеристики суспензионной системы на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, для одновременной количественной детекции свободного и общего пса в сыворотке крови человека. Российский биотерапевтический журнал, 2015, т. 14, N 4, с. 31-38. * |
| БРАЖНИК К.И. и др. Aналитические характеристики суспензионной системы на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами, для одновременной количественной детекции свободного и общего пса в сыворотке крови человека. Российский биотерапевтический журнал, 2015, т. 14, N 4, с. 31-38. NOLAN J P et al., Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm, Trends Biotechnol. 2002 Jan; 20(1):9-12-реферат. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2701742C1 (en) * | 2018-07-23 | 2019-10-01 | Российская Федерация, от имени Министерства здравоохранения Российской Федерации | Kit for differential diagnosis of diseases |
| CN110554178A (en) * | 2019-04-23 | 2019-12-10 | 杭州深度生物科技有限公司 | Suspension type liquid biochip detection method |
| CN116794313A (en) * | 2023-08-18 | 2023-09-22 | 江西赛基生物技术有限公司 | Kit and method for simultaneously detecting three tumor markers based on flow cytometry |
| CN116794313B (en) * | 2023-08-18 | 2023-11-03 | 江西赛基生物技术有限公司 | Kit and method for simultaneously detecting three tumor markers based on flow cytometry |
| CN117491648A (en) * | 2023-11-16 | 2024-02-02 | 广州敏特生物技术有限公司 | Human body autoantibody detection material and preparation method thereof |
| CN117491648B (en) * | 2023-11-16 | 2024-04-09 | 广州敏特生物技术有限公司 | Human body autoantibody detection material and preparation method thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2638787C1 (en) | Method for obtaining of analytical test system based on suspension microchips for diseases markers detection | |
| Martynenko et al. | Magneto-fluorescent microbeads for bacteria detection constructed from superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles and AIS/ZnS quantum dots | |
| US7076092B2 (en) | High-throughput, dual probe biological assays based on single molecule detection | |
| CN101334406B (en) | Method and device for biomolecule preparation and detection using magnetic array | |
| US20020164271A1 (en) | Wavelength-coded bead for bioassay and signature recogniton | |
| Xu et al. | Rapid synthesis of nitrogen doped carbon dots and their application as a label free sensor array for simultaneous discrimination of multiple proteins | |
| CN106662580B (en) | Test and analyze newly clustering for object | |
| US20160216252A1 (en) | Plasmonic beads for multiplexed analysis by flow detection systems | |
| Ma et al. | Multicolor quantum dot-encoded microspheres for the detection of biomolecules | |
| Generalova et al. | Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystals CdSe/ZnS for bioassays | |
| Jun et al. | Protein separation and identification using magnetic beads encoded with surface-enhanced Raman spectroscopy | |
| US20090004670A1 (en) | Methods for fabricating surface enhanced fluorescent (sef) nanoparticles and their applications in bioassays | |
| CN113167791A (en) | Ultrabright fluorescent nano-constructs as universal enhancers | |
| TW201113523A (en) | Integrated sample preparation and analyte detection | |
| Tasso et al. | Oriented bioconjugation of unmodified antibodies to quantum dots capped with copolymeric ligands as versatile cellular imaging tools | |
| JP2005501238A (en) | Particles modified with affinity tags | |
| CN105717287B (en) | A kind of 3D probe magnetic micro-beads compounds and its application based on protein nano line | |
| US20200081012A1 (en) | Methods apparatuses and systems for detecting and quantifying phosphoproteins | |
| EP3513186A1 (en) | Methods and systems for multiplex assays | |
| KR100985603B1 (en) | Method and apparatus for detecting molecules | |
| Wang et al. | Discovering of tumor-targeting peptides using bi-functional microarray | |
| RU2624853C2 (en) | Method of creation of kits of microspheres optically coded by fluorescent nanocrystals and carrying recognizing biological molecules on their surface | |
| US20240168034A1 (en) | Methods and systems for single cell protein analysis | |
| EP3588087A1 (en) | Biomaterial immobilizing method and uses thereof | |
| EP2430447A1 (en) | Method for characterizing and/or determining samples |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20181130 Effective date: 20181130 |