RU2637371C2 - Histones and biodegradable lipides as means for nucleic acids delivery to eukaryotic cells - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: genetic material is delivered to the eukaryotic cells by binding the plasmid DNA in a complex with the recombinant H2A or H2A-TAT histone in the presence of a biodegradable lipide represented by choline fatty acid ester.

EFFECT: compared with non-viral analogs, the invention allows to deliver the genetic material to eukaryotic cells of interest more efficiently.

12 cl, 6 dwg, 10 ex

Description

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой средство для доставки нуклеиновых кислот или их производных в клетки эукариот, в частности, для доставки геннотерапевтических препаратов для медицинских целей.The present invention relates to the field of biotechnology and molecular biology, and is a means for the delivery of nucleic acids or their derivatives to eukaryotic cells, in particular, for the delivery of gene therapeutic drugs for medical purposes.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Одной из основных проблем при использовании геннотерапевтических препаратов в медицине остается доставка таких препаратов в клетки целевых органов. Используемые в практике и эксперименте способы доставки генетического материала можно разделить на вирусные и невирусные. В настоящее время в более чем в 70% случаев испытания геннотерапевтических препаратов проводят с использованием вирусных способов доставки. Достоинством вирусных систем является их высокая эффективность. Недостатками - иммуногенность и, в ряде случаев (аденоассоциированные вирусы), малая емкость для введения генетической информации. Высокая опасность встраивания вирусных векторов в геном клеток может приводить к возникновению рака и различных мутаций. Кроме того, выращивание вирусов довольно трудоемко и весьма дорого (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60. Mah et al. 2002. Clin Pharmacokinet, 2002, 41: 901-911. Giacca and Zacchigna. J Control Release, 2012, 161: 377-388. Balicki and Beutler. Medicine (Baltimore), 2002, 81: 69-86. Kovesdi et al. Curr Opin Biotechnol, 1997, 8: 583-589). Невирусные методы доставки генов имеют ряд преимуществ. Токсичность, патогенность или иммуногенность невирусных векторов ниже в сравнении с вирусными векторами. Использование невирусных методов характеризуется меньшей стоимостью, препараты на их основе проще изготовить и/или модифицировать определенным образом для достижения высокой специфичности. Главный недостаток невирусных способов доставки - меньшая эффективность трансфекции (Medina-Kauwe et al. Gene Ther, 2005, 12: 1734-1751). Поэтому основная цель, которая стоит перед разработчиками невирусных методов - сохранив перечисленные достоинства, приблизиться по эффективности к вирусным методам доставки.One of the main problems when using gene therapy drugs in medicine is the delivery of such drugs to the cells of target organs. The methods of delivery of genetic material used in practice and experiment can be divided into viral and non-viral. Currently, in more than 70% of cases, trials of gene therapy drugs are carried out using viral delivery methods. The advantage of viral systems is their high efficiency. The disadvantages are immunogenicity and, in some cases (adeno-associated viruses), a small capacity for introducing genetic information. The high risk of embedding viral vectors in the genome of cells can lead to cancer and various mutations. In addition, the cultivation of viruses is quite laborious and very expensive (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60. Mah et al. 2002. Clin Pharmacokinet, 2002, 41: 901-911. Giacca and Zacchigna. J Control Release, 2012, 161: 377-388. Balicki and Beutler. Medicine (Baltimore), 2002, 81: 69-86. Kovesdi et al. Curr Opin Biotechnol, 1997, 8: 583-589). Non-viral methods of gene delivery have several advantages. The toxicity, pathogenicity or immunogenicity of non-viral vectors is lower compared to viral vectors. The use of non-viral methods is less costly; preparations based on them are easier to manufacture and / or modify in a certain way to achieve high specificity. The main disadvantage of non-viral delivery methods is the lower transfection efficiency (Medina-Kauwe et al. Gene Ther, 2005, 12: 1734-1751). Therefore, the main goal that faces the developers of non-viral methods is to preserve the advantages listed above, to approach the effectiveness of viral delivery methods.

Для эффективной невирусной доставки вектор должен обладать способностью конденсировать ДНК в более компактное состояние, обеспечивать эффективное прохождение через клеточные и ядерные мембраны, защищать транспортируемые нуклеиновые кислоты от действия нуклеаз и при этом не ингибировать транскрипцию ДНК. В качестве нуклеиновых кислот могут использоваться плазмиды. В отличие от рекомбинантных вирусов, плазмиды довольно просто конструировать и нарабатывать в больших количествах (Williams and Kingston. Cardiovasc Res, 2011, 91: 565-576). Существует две большие группы соединений, способных образовывать стабильные комплексы с нуклеиновыми кислотами - катионные липиды и катионные полимеры. Комплексы в обоих случаях образуются за счет электростатических взаимодействий между отрицательно заряженной ДНК и положительно заряженным носителем, в результате получаются компактные частицы, которые могут поглощаться клеткой, чаще всего путем эндоцитоза (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202. Wang et al. Сurr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60). Использование катионных полимеров или липидов сопряжено с меньшей опасностью для организма и слабой иммуногенностью, комплексы на их основе проще и дешевле изготовить. Одним из основных недостатков этой группы веществ является то, что эффективные системы, как правило, высокотоксичны, а при снижении токсичности снижается и эффективность. Чем выше молекулярная масса полимера, тем компактнее комплекс и эффективнее трансфекция клеток, но при этом ниже биоразлагаемость, а следовательно, тем больше токсичность (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60; Jin et al. Theranostics, 2014, 4: 240-255). В ряде случаев совместное использование катионных липидов и полимеров позволяет уменьшить размер всего комплекса и увеличить поглощение препарата клеткой (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60). Для доставки нуклеиновых кислот в клетку могут использоваться некоторые природные полимеры или их фрагменты, в частности белки и пептиды. Достоинствами природных полимеров является их биосовместимость и биоразлагаемость, низкая токсичность и иммуногенность, возможность химических модификаций по аминным и гидроксильным группам, также невысока стоимость получения таких соединений. В последние годы все больше внимания уделяется использованию для доставки ДНК в клетки природных заряженных белков и пептидов, в частности, так называемых, пептидов, проникающих в клетки (Cell-penetrating peptides - СРР). Полагают, что СРР проникают в клетки и в ядра энергонезависимым путем без участия поверхностных клеточных рецепторов (Wagstaff and Jans. Curr Med Chem, 2006, 13: 1371-1387; Gupta et al. Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57: 637-651; Morris et al. Curr Opin Biotechnol, 2000, 11: 461-466; Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232-2242). Эти пептиды/белки при образовании комплекса с ДНК обеспечивают прямую трансдукцию в ядра клеток. Было показано, что СРР не обладают выраженными антигенными свойствами и их использование может значительно повысить эффективность доставки невирусных векторов (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-74717; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232-2242). Процесс проникновения белков через клеточные мембраны обеспечивается специальными белок-трансдуцирующие домены (БТД) размером 10-30 остатков, обогащенными основными аминокислотами. СРР может связываться с доставляемой молекулой ковалентно или нековалетно - за счет электростатических взаимодействий (Vasconcelos et al. Ther Deliv, 2013, 4: 573-591). Нековалентное связывание является более выгодным так как такую конструкцию намного легче синтезировать и она более универсальна для доставки в клетки разных типов нуклеиновых кислот (Alhakamy et al. Ther Deliv, 2013, 4: 741-757). СРР при использовании их для доставки нуклеиновых кислот характеризуются высокой эффективностью трансфекции, невысокими токсичностью и иммуногенностью (Vasconcelos et al. Ther Deliv, 2013, 4: 573-591). Особое место в группе БТД белков занимают гистоны, роль которых в клетке заключается в связывании и компактизации ДНК. Гистоны представляют собой основные белки небольшого размера, представленные в ядрах эукариотических клеток в виде комплекса с геномной ДНК, которая благодаря гистонам упаковывается в специальные структурные образования - нуклеосомы. В состав нуклеосомы стандартно входят 4 гистона Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Нуклеосомы соединены между собой линкерной ДНК, с которой связан линкерный гистон H1. Было показано, что все четыре коровых гистона (Н2А, Н2В, Н3 и Н4), имеющие в своей структуре сигналы ядерной локализации, способны к прямой клеточной трансдукции и могут быть использованы как векторы для эффективной доставки ДНК в ядра клеток (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232-2242). Хотя гистон H1 не содержит сайта ядерной локализации, предполагается, что за его транспорт в ядро ответственна последовательность из нескольких положительно заряженных аминокислот. В исследованных случаях использование гистонов для доставки ДНК в клетки было эффективнее, чем у ряда других известных невирусных систем (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-7471; Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731). По имеющимся данным, наилучшей эффективностью в доставке плазмидной ДНК и обеспечении синтеза кодируемого ею продукта обладают гистоны Н2А и Н2В (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731; Kaouass et al. J Control Release, 2006, 113: 245-254). В большинстве работ для доставки ДНК в ядра используют гистоны, выделенные из тимуса теленка или других доступных тканей животных (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2000, 97: 11500-11504). Одним из путей развития данного направления является создание рекомбинантных гистонов, содержащих модификации, улучшающие их векторные свойства. Описано получение рекомбинантных гистонов Н2А и Н2В, каждый из которых представляет химерную молекулу гистона с зеленым флуоресцентным белком (GFP) и дополнительными сайтами ядерной локализации (Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731). В работах данной группы показано, что такие белки способны проникать в клетки и переносить в клетки плазмидную ДНК, также показано, что сигнал ядерной локализации, присутствующий в структуре гистонов, слабее некоторых вирусных сигналов ядерной локализации (Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731). Механизм переноса генетического материала в клетки с помощью гистонов и СРР до конца не изучен. Было показано, что гистон Н2А содержит в своем составе сигнал ядерной локализации (NLS), что обеспечивает его трафик из цитоплазмы в ядро, кроме того, он обладает достаточно низкой иммуногенностью (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-7471). Определено, что N-концевая последовательность гистона Н2А, соответствующая первым 37 аминокислотным остаткам, способна конденсировать ДНК и обеспечивать трансфекцию клеток млекопитающих (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-71). Описано использование различных фрагментов гистона Н2А, полученного из тимуса теленка или синтезированных, для трансфекции клеток in vivo и in vitro для антираковой генной терапии (Pat. US 20040102606 A1). Было предложено для трансфекции клеток использовать гистоны Н3 и Н4 и их производные, выделенных из разных тканей животных, из культур клеток, а также рекомбинантных белки (Pat. WO 1999019502 A1). Гистоны, полученные разными способами, демонстрируют сходные результаты при трансфекции клеток. В патенте WO 2000015825 A1 в качестве трансфицирующего агента использовали выделенный из тканей суммарный гистон (смесь гистонов H1, Н2, Н3, Н4) или только гистон Н4. В патенте US 6180784 В1 описывается использование как выделенного из тканей, так и рекомбинантного гистона H1 для трансфекции клеток. В этом же патенте использовались и полученные из тканей гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Кроме того, показано, что добавление гистонов, преимущественно H1, к известным липидам, используемым для липофекции, значительно повышает уровень трансфекции нуклеиновых кислот.For effective non-viral delivery, the vector must be able to condense DNA into a more compact state, ensure efficient passage through cell and nuclear membranes, protect the transported nucleic acids from the action of nucleases and not inhibit DNA transcription. As nucleic acids, plasmids can be used. In contrast to recombinant viruses, plasmids are quite simple to construct and produce in large quantities (Williams and Kingston. Cardiovasc Res, 2011, 91: 565-576). There are two large groups of compounds capable of forming stable complexes with nucleic acids - cationic lipids and cationic polymers. Complexes in both cases result from electrostatic interactions between negatively charged DNA and a positively charged carrier, resulting in compact particles that can be absorbed by the cell, most often through endocytosis (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202. Wang et al. Surr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60). The use of cationic polymers or lipids is associated with less danger to the body and weak immunogenicity; complexes based on them are simpler and cheaper to manufacture. One of the main disadvantages of this group of substances is that effective systems, as a rule, are highly toxic, and when toxicity is reduced, efficiency also decreases. The higher the molecular weight of the polymer, the more compact the complex and the more efficient the transfection of cells, but the lower the biodegradability and, consequently, the greater the toxicity (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60; Jin et al. Theranostics, 2014 4: 240-255). In some cases, the combined use of cationic lipids and polymers can reduce the size of the entire complex and increase the absorption of the drug by the cell (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60). Some natural polymers or fragments thereof, in particular proteins and peptides, can be used to deliver nucleic acids to the cell. The advantages of natural polymers are their biocompatibility and biodegradability, low toxicity and immunogenicity, the possibility of chemical modifications of amine and hydroxyl groups, and the low cost of obtaining such compounds. In recent years, more and more attention has been paid to the use of naturally charged proteins and peptides, in particular, the so-called peptides penetrating the cells (Cell-penetrating peptides - CPP), for delivering DNA to cells. It is believed that CPP penetrates into cells and nuclei in a non-volatile manner without the involvement of surface cell receptors (Wagstaff and Jans. Curr Med Chem, 2006, 13: 1371-1387; Gupta et al. Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57: 637-651 ; Morris et al. Curr Opin Biotechnol, 2000, 11: 461-466; Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232-2242). These peptides / proteins, when complexed with DNA, provide direct transduction into cell nuclei. It was shown that CPP does not have pronounced antigenic properties and their use can significantly increase the efficiency of delivery of non-viral vectors (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-74717; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232 -2242). The process of penetration of proteins through cell membranes is provided by special protein-transducing domains (BTC) of 10-30 residues in size, enriched in basic amino acids. CPP can bind covalently or non-covalently to the delivered molecule through electrostatic interactions (Vasconcelos et al. Ther Deliv, 2013, 4: 573-591). Non-covalent binding is more advantageous since such a construct is much easier to synthesize and is more versatile for delivery of different types of nucleic acids to cells (Alhakamy et al. Ther Deliv, 2013, 4: 741-757). CPP when used for the delivery of nucleic acids is characterized by high transfection efficiency, low toxicity and immunogenicity (Vasconcelos et al. Ther Deliv, 2013, 4: 573-591). A special place in the BTC protein group is occupied by histones, the role of which in the cell is to bind and compact DNA. Histones are the main proteins of a small size, present in the nuclei of eukaryotic cells as a complex with genomic DNA, which, thanks to histones, is packed into special structural formations - nucleosomes. The composition of the nucleosome standard includes 4 histones H2A, H2B, H3 and H4. Nucleosomes are linked by linker DNA, to which linker histone H1 is linked. It was shown that all four core histones (Н2А, Н2В, Н3, and Н4), which have nuclear localization signals in their structure, are capable of direct cell transduction and can be used as vectors for efficient delivery of DNA to cell nuclei (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232-2242). Although histone H1 does not contain a nuclear localization site, it is assumed that a sequence of several positively charged amino acids is responsible for its transport to the nucleus. In the studied cases, the use of histones for delivering DNA to cells was more effective than in several other known non-viral systems (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-7471; Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721 -731). According to reports, histones H2A and H2B have the best efficiency in delivering plasmid DNA and in synthesizing the product encoded by it (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721- 731; Kaouass et al. J Control Release, 2006, 113: 245-254). Most studies use histones isolated from calf thymus or other available animal tissue to deliver DNA to the nucleus (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2000, 97: 11500-11504). One of the ways of development of this direction is the creation of recombinant histones containing modifications that improve their vector properties. The preparation of recombinant histones H2A and H2B has been described, each of which represents a chimeric histone molecule with a green fluorescent protein (GFP) and additional nuclear localization sites (Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731). The work of this group showed that such proteins are able to penetrate into cells and transfer plasmid DNA into cells, and it was also shown that the nuclear localization signal present in the histone structure is weaker than some viral nuclear localization signals (Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15 : 721-731). The mechanism of transfer of genetic material into cells using histones and CPP is not fully understood. It has been shown that histone H2A contains a nuclear localization signal (NLS), which ensures its traffic from the cytoplasm to the nucleus, in addition, it has a fairly low immunogenicity (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467- 7471). It has been determined that the N-terminal sequence of histone H2A, corresponding to the first 37 amino acid residues, is able to condense DNA and provide transfection of mammalian cells (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-71). The use of various fragments of histone H2A obtained from calf thymus or synthesized for transfection of cells in vivo and in vitro for anticancer gene therapy has been described (Pat. US 20040102606 A1). It has been proposed to use histones H3 and H4 and their derivatives isolated from different animal tissues, from cell cultures, as well as recombinant proteins for transfection of cells (Pat. WO 1999019502 A1). Histones obtained in different ways show similar results in transfection of cells. In the patent WO 2000015825 A1, the total histone isolated from the tissues (a mixture of histones H1, H2, H3, H4) or only histone H4 was used as a transfecting agent. US Pat. No. 6,180,784 B1 describes the use of both tissue isolated and recombinant histone H1 for transfecting cells. In the same patent, histones Н2А, Н2В, Н3, and Н4 obtained from tissues were also used. In addition, it was shown that the addition of histones, mainly H1, to known lipids used for lipofection, significantly increases the level of transfection of nucleic acids.

В настоящее время системы доставки с использованием гистонов в качестве векторов только начинают разрабатываться. Одним из путей развития данного направления является создание рекомбинантных гистонов, содержащих модификации, улучшающие их векторные свойства. Большим преимуществом гистонов перед другими системами доставки генов является их низкая токсичность. Получение и использование рекомбинантных гистонов, в отличие от выделенных из тканей животных, позволяет стандартизовать процесс получения таких белков, а также дает широкие возможности для получения различных модифицированных форм гистонов. В частности, получение химерных белков, представляющих собой гистон и фрагмент другого СРР-пептида - ТАТ-белка. Пептид ТАТ, представляющий фрагмент регуляторного белка вируса иммунодифицита ВИЧ-1, исследован лучше других из негистоновых СРР (Green et al., Cell, 1988, 55: 1179-1188; Torchilin. Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60: 548-558; Sawant and Torchilin, 2010, 6: 628-640). Фрагмент ТАТ-пептида, состоящий из 10-15 аминокислотных остатков, в настоящее время используется при создании комплексов ДНК с поликатионами (полиплексов) и вводят в состав липидных векторов (Kleemann et al. J Control. Release 2005, 109: 299-316). Показано, что введение TAT-пептида в состав полиплекса значительно увеличивает эффективность трансфекции (Morris et al. Nat Biotechnology 2001, 19: 1173-1176).Currently, delivery systems using histones as vectors are just beginning to be developed. One of the ways of development of this direction is the creation of recombinant histones containing modifications that improve their vector properties. The great advantage of histones over other gene delivery systems is their low toxicity. The preparation and use of recombinant histones, unlike those isolated from animal tissues, makes it possible to standardize the process of obtaining such proteins, and also provides ample opportunities for obtaining various modified forms of histones. In particular, the production of chimeric proteins, which are a histone and a fragment of another CPP peptide - the TAT protein. The TAT peptide, which is a fragment of the regulatory protein of the HIV-1 immunodeficiency virus, has been better studied than other non-histone CPPs (Green et al., Cell, 1988, 55: 1179-1188; Torchilin. Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60: 548-558; Sawant and Torchilin, 2010, 6: 628-640). A fragment of the TAT peptide, consisting of 10-15 amino acid residues, is currently used to create DNA complexes with polycations (polyplexes) and introduced into the composition of lipid vectors (Kleemann et al. J Control. Release 2005, 109: 299-316). The introduction of a TAT peptide into a polyplex has been shown to significantly increase transfection efficiency (Morris et al. Nat Biotechnology 2001, 19: 1173-1176).

Как указано выше, использования катионных липидов совместно с ССР позволяет повысить стабильность образуемого комплекса, а также увеличивает эффективность трансфекций в случае невирусных конструкций. Например, комбинация катионного липосомального реагента DOSPER и гистона H1 повышает эффективность трансфекции кардиомиоцитов (Kott et al. Somatic Cell and Molecular Genetics, 1998, 24: 257-261). Однако подобные липосомальные реагенты являются чужеродными для организма и обычно высокотоксичны.As indicated above, the use of cationic lipids in conjunction with SSR improves the stability of the complex formed, and also increases the efficiency of transfections in the case of non-viral constructs. For example, the combination of the cationic liposomal reagent DOSPER and histone H1 increases the transfection efficiency of cardiomyocytes (Kott et al. Somatic Cell and Molecular Genetics, 1998, 24: 257-261). However, such liposomal reagents are foreign to the body and are usually highly toxic.

Приведенные данные указывают на определенные недостатки использования существующих соединений для трансфекции клеток. Требуется разработка новых более безопасных препаратов, сочетающих эффективные ДНК-связывающие свойства природных пистонов и стабилизирующих свойств биодеградируемых природных липидов.These data indicate certain disadvantages of using existing compounds for transfection of cells. The development of new safer drugs that combine the effective DNA-binding properties of natural pistons and the stabilizing properties of biodegradable natural lipids is required.

Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention

Данное изобретение решает задачу расширения номенклатуры конструкций для доставки терапевтически значимых нуклеиновых кислот в клетки эукариот. Поставленная задача решается путем получения рекомбинантного гистона Н2А и химерного гистона Н2А-ТАТ, представляющего собой слитно экспрессирующийся белок, содержащий гистон Н2А и ТАТ-пептид, и холинового эфира жирной кислоты для их конденсирования с ДНК с последующей доставкой образовавшихся комплексов в клетки эукариот. Это достигается путем конструирования экспрессионных плазмидных векторов, содержащих последовательности генов Н2А и Н2А-ТАТ человека, полученные с набором специфических праймеров, трансформации этими плазмидами клеток E.coli, экспрессии кодируемых белков, наработки рекомбинантных белков и их очистки. Липидный компонент представляет собой холиновый эфир жирной кислоты с длиной углеродной цепи от 16 до 22 атомов и включающих от 0 до 6 двойных связей. После совместной инкубации ДНК с рекомбинантным гистоном Н2А или химерным белком Н2А-ТАТ, а также с рекомбинантным гистоном Н2А или химерным белком Н2А-ТАТ в присутствии липида проводится трансфекция эукариотических клеток.This invention solves the problem of expanding the range of constructs for the delivery of therapeutically significant nucleic acids to eukaryotic cells. The problem is solved by obtaining recombinant histone H2A and chimeric histone H2A-TAT, which is a fused protein containing histone H2A and TAT peptide and choline fatty acid ester for their condensation with DNA and subsequent delivery of the resulting complexes to eukaryotic cells. This is achieved by constructing expression plasmid vectors containing the sequences of human H2A and H2A-TAT genes obtained with a set of specific primers, transformation of E. coli cells with these plasmids, expression of encoded proteins, production of recombinant proteins and their purification. The lipid component is a choline fatty acid ester with a carbon chain length of 16 to 22 atoms and including from 0 to 6 double bonds. After co-incubation of the DNA with recombinant histone H2A or chimeric protein H2A-TAT, as well as with recombinant histone H2A or chimeric protein H2A-TAT in the presence of lipid, transfection of eukaryotic cells is performed.

Технический результат изобретенияThe technical result of the invention

Техническим результатом, обеспечиваемым настоящим изобретением, является эффективная доставка ДНК в клетки эукариот с помощью биодеградируемых рекомбинантных белков и липидов. В соответствии с изобретением в эукариотические клетки с помощью рекомбинантного гистона Н2А и химерного белка Н2А-ТАТ или в присутствии этих белков при добавлении холинового эфира жирной кислоты попадает ДНК и наблюдается синтез белков, гены которых входят в состав доставляемой ДНК.The technical result provided by the present invention is the efficient delivery of DNA to eukaryotic cells using biodegradable recombinant proteins and lipids. In accordance with the invention, in eukaryotic cells using recombinant histone H2A and the chimeric protein H2A-TAT or in the presence of these proteins, DNA is added when choline fatty acid ester is added and protein synthesis is observed whose genes are part of the delivered DNA.

Список нуклеотидных и аминокислотных последовательностейList of nucleotide and amino acid sequences

1. Набор праймеров, используемых для клонирования гистона Н2А (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2); химерного белка Н2А-ТАТ (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4).1. A set of primers used for cloning histone H2A (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2); chimeric protein H2A-TAT (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4).

2. Аминокислотные последовательности белков гистонов Н2А - SEQ ID NO: 5 и H2A-TAT - SEQ ID NO: 6.2. Amino acid sequences of histone proteins H2A - SEQ ID NO: 5 and H2A-TAT - SEQ ID NO: 6.

Изобретение иллюстрируют следующие фигурыThe invention is illustrated by the following figures

Фиг. 1. Схематическое изображение экспрессионных конструкций. CDS - фрагменты, соответствующие генам, кодирующим белки гистона Н2А или Н2А-ТАТ.FIG. 1. Schematic representation of expression constructs. CDS - fragments corresponding to the genes encoding the histone H2A or H2A-TAT proteins.

Фиг. 2. Формулы холиновых эфиров жирных кислот.FIG. 2. Formulas of choline fatty acid esters.

Фиг. 3. Активность люциферазы после трансфекции клеток линии НТ1080 плазмидой pCMV-Luc с рекомбинантными гистонами Н2А и Н2А-ТАТ.FIG. 3. The activity of luciferase after transfection of HT1080 cells with plasmid pCMV-Luc with recombinant histones H2A and H2A-TAT.

По оси ординат приведены значения люминесценции в условных единицах. По оси абсцисс обозначены весовые соотношения плазмиды и конденсирующего белка, используемого для образования комплекса при трансфекции. Гис Н2А – клетки, трансфицированные с помощью белка гистона Н2А, Н2А-ТАТ – клетки, трансфицированные с помощью химерного белка Н2А-ТАТ. Плазмида - трансфекция с помощью «голой» плазмиды.The ordinates show the luminescence values in arbitrary units. The abscissa indicates the weight ratio of the plasmid and the condensing protein used to form the complex during transfection. Gis H2A - cells transfected with histone H2A protein, H2A-TAT - cells transfected with chimeric protein H2A-TAT. Plasmid - transfection using a naked plasmid.

Фиг. 4. Активность люциферазы после трансфекции клеток линии HT1080 плазмидой pCMV-Luc с рекомбинантным гистоном Н2А в присутствии арахидоноилхолина (АХ). По оси ординат приведены значения люминесценции в условных единицах. По оси абсцисс обозначены весовые соотношения плазмиды и конденсирующего белка, используемого для образования комплекса при трансфекции. Гис Н2А – клетки, трансфицированные только с помощью белка гистона Н2А, Гис Н2А+АХ – клетки, трансфицированные с помощью белка гистона Н2А и араходоноилхолина. Пл+АХ – клетки, трансфицированные только с помощью араходоноилхолина.FIG. 4. The activity of luciferase after transfection of HT1080 cells with plasmid pCMV-Luc with recombinant histone H2A in the presence of arachidonoylcholine (AX). The ordinates show the luminescence values in arbitrary units. The abscissa indicates the weight ratio of the plasmid and the condensing protein used to form the complex during transfection. His H2A - cells transfected only with histone H2A protein, His H2A + AH - cells transfected with histone H2A protein and arahodonoylcholine. Pl + AH - cells transfected only with the help of arahodonoylcholine.

Фиг. 5. Результаты теста на цитотоксичность HSVtk в присутствии ганцикловира. Плазмида CMV-HSVtk-mGMCSF-pGL3. Клетки линии НТ1080, трансфекция с помощью гистона Н2А. По оси ординат приведен процент выживших клеток. По оси абсцисс обозначены концентрации ганцикловира (GCV). HSVtk - тимидинкиназа вируса простого герпеса (Herpes Simplex Virus timidine kinase). Н/тр - нетрансфицированные контрольные клетки. LFA – клетки, трансфицированные с помощью Липофектамина 2000 (Invitrogen, США). Гис Н2А – клетки, трансфицированные с помощью гистона Н2А.FIG. 5. The results of the cytotoxicity test of HSVtk in the presence of ganciclovir. Plasmid CMV-HSVtk-mGMCSF-pGL3. Cells of the NT1080 line, transfection with histone H2A. The ordinate shows the percentage of surviving cells. The abscissa indicates the concentration of ganciclovir (GCV). HSVtk - herpes simplex virus thymidine kinase (Herpes Simplex Virus timidine kinase). N / tr - non-transfected control cells. LFA - cells transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA). His H2A - cells transfected with histone H2A.

Фиг. 6. Результаты теста на цитотоксичность FCU1 в присутствии 5-FC. Плазмида CMV -FCY11-FUR1-pGL3. Клетки линии HT1080, трансфекция с помощью гистона Н2А и липида. По оси ординат приведен процент выживших клеток. По оси абсцисс обозначены концентрации 5-фторцитозина в мкМ (5-FC). FCUI - цитозин дезаминаза. Н/тр - нетрансфицированные контрольные клетки. LFA – клетки, трансфицированные с помощью Липофектамина 2000 (Invitrogen, США). Гис Н2А – клетки, трансфицированные с помощью гистона Н2А. Гис Н2А+АХ – клетки, трансфицированные с помощью гистона Н2А в присутствии араходоноилхолина (АХ).FIG. 6. Results of the cytotoxicity test of FCU1 in the presence of 5-FC. Plasmid CMV -FCY11-FUR1-pGL3. HT1080 cell line, transfection with histone H2A and lipid. The ordinate shows the percentage of surviving cells. The abscissa indicates the concentration of 5-fluorocytosine in μM (5-FC). FCUI - cytosine deaminase. N / tr - non-transfected control cells. LFA - cells transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA). His H2A - cells transfected with histone H2A. His H2A + AX - cells transfected with histone H2A in the presence of arachodonoylcholine (AX).

Изобретение иллюстрируют, но не исчерпывают примеры.The invention is illustrated but not exhaustive.

Пример 1. Создание конструкции, содержащей фрагмент гистона Н2А человекаExample 1. Creating a construct containing a fragment of histone H2A person

Фрагмент кДНК получен ПЦР-амплификацией с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, несущих последовательности, комплиментарные сайтам рестрикции NdeI и HindIII - H2Afor (SEQ ID NO: 1; GTTAGCATATGTCGGGACGTGGCAAGC) и H2Arev (SEQ ID NO: 2; ACTAAGCTTC TACTTGCCCTTGG CCTTGT). В качестве матрицы используют кДНК из лимфоцитов человека. Фрагмент длиной 393 п.о. очищают методом электрофореза в агарозном геле и клонируют в экспрессионную плазмиду рЕТ-30а(+) (Novagen, США, il.biochem.uhttp:// siowa.edu/vectors/pET/pET-30a_map.pdf), гидролизованную эндонуклеазами NdeI и HindIII. Полученную конструкцию Н2А-рЕТ секвенируют для исключения ошибок работы Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген», Россия). Полученная конструкция на основе вектора рЕТ-30а(+) несет фрагмент гена гистона Н2А человека (Н2А) под контролем раннего промотора фага Т7. Участок 5'-концевой части плазмиды, кодирующий синтез гексагистидинового пептида, тромбина и энтерокиназы удаляют при клонировании (Фиг. 1).The cDNA fragment was obtained by PCR amplification using a set of primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, carrying sequences complementary to the restriction sites NdeI and HindIII - H2Afor (SEQ ID NO: 1; GTTAGCATATGTCGGGACGTGGCAAGC) and H2Arev (SEQ ID NO: 1) ; ACTAAGCTTC TACTTGCCCTTGG CCTTGT). As a matrix, cDNA from human lymphocytes is used. A fragment of 393 bp in length purified by agarose gel electrophoresis and cloned into the expression plasmid pET-30a (+) (Novagen, USA, il.biochem.uhttp: // siowa.edu/vectors/pET/pET-30a_map.pdf) hydrolyzed by NdeI and HindIII endonucleases . The resulting H2A-pET construct was sequenced to eliminate Taq polymerase operation errors (ZAO Evrogen, Russia). The resulting construct based on the pET-30a (+) vector carries a fragment of the human histone H2A (H2A) gene under the control of the early promoter of the T7 phage. The 5'-terminal portion of the plasmid encoding the synthesis of hexahistidine peptide, thrombin and enterokinase is removed by cloning (Fig. 1).

Пример 2. Создание конструкции, содержащей фрагмент гистона Н2А человека и фрагмент регуляторного белка ТАТ вируса иммунодифицита ВИЧ-1Example 2. Creating a construct containing a fragment of histone H2A human and a fragment of the regulatory protein TAT of HIV-1 immunodeficiency virus

Фрагмент гистона Н2А амплифицируют с помощью набора праймеров, несущих последовательности, комплиментарные сайтам рестрикции NdeI и HindIII - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, один праймер комплиментарен последовательности гистона и обратный праймер комплиментарен последовательности ТАТ-фрагмента и 3'-области гистона Н2А - TATfor (SEQ ID NO: 3; TATACATATGTCGGGACGTGGCAAG) и TATrev - (SEQ ID NO: 4; ACTAAGCTTCTAACGGCGACGCTGGCGACGTTTCTTACGACCGTACTTGCCCTTGGCCTTGTGG). В качестве матрицы используют конструкцию, описанную в примере 1. Фрагмент длиной 435 п.о. очищают методом электрофореза в агарозном геле и клонируют в экспрессионную плазмиду рЕТ-30а(+). Определение нуклеотидной последовательности подтверждает структуру химерного гена Н2А-ТАТ.The H2A histone fragment is amplified using a set of primers carrying sequences complementary to the NdeI and HindIII restriction sites — SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, one primer is complementary to the histone sequence, and the reverse primer is complementary to the sequence of the TAT fragment and the histone 3 ′ region H2A - TATfor (SEQ ID NO: 3; TATACATATGTCGGGACGTGGCAAG) and TATrev - (SEQ ID NO: 4; ACTAAGCTTCTAACGGCGACGCTGGCGACGTTTCTTACGACCGTACTTGCCCTTGGCCTTGTGG). As the matrix, use the design described in example 1. A fragment of 435 bp in length purified by agarose gel electrophoresis and cloned into the expression plasmid pET-30a (+). The determination of the nucleotide sequence confirms the structure of the chimeric H2A-TAT gene.

Пример 3. Культивирование клеток и очистка рекомбинантного гистона Н2АExample 3. Cell cultivation and purification of recombinant histone H2A

Плазмидой Н2А-рЕТ трансформируют клетки штамма E.coli BL21(DE3) (Novagen, США). Выросшие на селективной агаризованной среде LB с канамицином (30 мг/мл) колонии переносят в жидкую питательную среду LB с канамицином и культивируют при 37°С до оптической плотности OD₆₀₀-0,3-0,5. Затем к культуре добавляют индуктор экспрессии изопропил-β,D-галактотиопиранозид (IPTG) до концентрации 1 мМ и культивируют бактерии при 37°С в течение 3 часов. После этого клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в лизирующем буфере (50 мМ трис HCl, рН 9,0, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF) и разрушают при помощи ультразвукового дезинтегратора (Labsonic Ρ, Sartorius, США, цикл 0,5 сек, амплитуда - 50%) в течение 20 мин при 4°С. Лизат центрифугируют 12 минут при 12000 g. Полученный после разрушения клеток супернатант разбавляют в 2 раза водой, доводят значение рН до 9,0 и фильтруют через фильтры с размером пор 0,45 мкм (HAWP04700, Millipore, США). Для очистки рекомбинантного гистона Н2А используют хроматографию на колонке ХK 16/20 (GE Healthcare, США) с 25 мл катионнообменного сорбента SP Sepharose HP (GE Healthcare, США). Элюцию очищенного белка проводят буфером 50 мМ трис HCl, рН 9,0, 5 мМ ЭДТА, содержащим 500 мМ NaCl. На следующей стадии очистку белка осуществляют с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Диасорб-130-С16Т 7 мкм, 16×250 мм (БиоХимМак, Россия). К 70 мл белкового раствора, полученного после ионообменной хроматографии, добавляют 7 мл ацетонитрила и 80 мкл 100% TFA и наносят на колонку. Хроматографию осуществляют в градиенте 80% ацетонитрила (от 10 до 60%) в 0.1% TFA. Фракции, содержащие целевой белок с чистотой более 99%, объединяют и лиофильно высушивают на центробежном концентраторе CentriVap Acid-Resistant System (Labconco Corp, США). Очищенный рекомбинантный гистон анализируют с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Prosphere С-18 300 Α 5μ, 150×4.6 мм в градиенте 80% ацетонитрила (8-64%), 0.1% ТФУ при скорости потока 0.75 мл/мин с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1200 с времяпролетным масс-спектрометрическим детектором ESI-TOF (LS/MS) Agilent 6224. Для рекомбинантного гистона Н2А была определена молекулярная масса 13976,5 Да. Аминокислотная последовательность полученного белка - SEQ ID NO: 5. Чистоту препарата определяют методом денатурирующего электрофореза в 15% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием Кумасси G250.Plasmid H2A-pET transform cells of E. coli strain BL21 (DE3) (Novagen, USA). Colonies grown on selective agarized medium LB with kanamycin (30 mg / ml) are transferred to liquid LB medium with kanamycin and cultured at 37 ° C to an optical density of OD ₆₀₀ -0.3-0.5. Then, an expression inducer of isopropyl-β, D-galactothiopyranoside (IPTG) was added to the culture to a concentration of 1 mM and bacteria were cultured at 37 ° C for 3 hours. After this, the cells are harvested by centrifugation, resuspended in lysis buffer (50 mM Tris HCl, pH 9.0, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF) and destroyed using an ultrasonic disintegrator (Labsonic Ρ, Sartorius, USA, 0.5 sec cycle, amplitude - 50%) for 20 min at 4 ° C. The lysate is centrifuged for 12 minutes at 12,000 g. The supernatant obtained after cell disruption was diluted 2 times with water, adjusted to pH 9.0 and filtered through 0.45 μm filters (HAWP04700, Millipore, USA). For purification of recombinant histone H2A, chromatography on an XK 16/20 column (GE Healthcare, USA) with 25 ml of cation exchange sorbent SP Sepharose HP (GE Healthcare, USA) was used. The purified protein was eluted with 50 mM Tris HCl buffer, pH 9.0, 5 mM EDTA, containing 500 mM NaCl. At the next stage, protein purification is carried out using RP HPLC on a Diasorb-130-C16T column 7 μm, 16 × 250 mm (BioChemMak, Russia). To 70 ml of the protein solution obtained after ion exchange chromatography, 7 ml of acetonitrile and 80 μl of 100% TFA were added and applied to the column. Chromatography is carried out in a gradient of 80% acetonitrile (from 10 to 60%) in 0.1% TFA. Fractions containing the target protein with a purity of more than 99% are combined and freeze-dried on a centrifugal concentrator CentriVap Acid-Resistant System (Labconco Corp, USA). Purified recombinant histone was analyzed by RP HPLC on a Prosphere C-18 300 × 5μ, 150 × 4.6 mm column in a gradient of 80% acetonitrile (8-64%), 0.1% TFA at a flow rate of 0.75 ml / min using an Agilent 1200 liquid chromatograph with an Agilent 6224 ESI-TOF (LS / MS) time-of-flight mass spectrometric detector. A molecular weight of 13976.5 Da was determined for recombinant histone H2A. The amino acid sequence of the obtained protein is SEQ ID NO: 5. The purity of the drug is determined by denaturing electrophoresis in 15% polyacrylamide gel followed by Coomassie G250 staining.

Пример 4. Культивирование клеток и очистка химерного белка Н2А-ТАТExample 4. Cell cultivation and purification of the chimeric protein H2A-TAT

Культивирование клеток, трансформированных плазмидой Н2А-ТАТ-рЕТ, синтез химерного белка Н2А-ТАТ, очистку и анализ полученного продукта проводят так же, как в примере 3. Аминокислотная последовательность белка Н2А-ТАТ - SEQ ID NO: 6).The cultivation of cells transformed with the plasmid H2A-TAT-PET, the synthesis of the chimeric protein H2A-TAT, purification and analysis of the obtained product is carried out as in example 3. The amino acid sequence of the protein H2A-TAT - SEQ ID NO: 6).

Пример 5. Синтезы липидовExample 5. Lipid Synthesis

Синтез арахидоноилхолин иодидаSynthesis of Arachidonoylcholine Iodide

Синтез арахидоноилдиметиламиноэтанола (AA-DMAE) проводят следующим образом.The synthesis of arachidonoyldimethylaminoethanol (AA-DMAE) is carried out as follows.

К раствору арахидоновой кислоты (80.4 мг, 0.26 ммоль) в 1.5 мл перегнанного над Р₂О₅ хлороформа, прибавляют 45 мкл диизопропилкарбодиимида (0.28 ммоль), 32 мг диметиламинопиридина (0.28 ммоль) и 29 мкл диметиламиноэтанола (0.28 ммоль). Колбу с реакционной смесью перемешивают при 0°С 3 часа и затем оставляют на 17 часов под аргоном. Кристаллический осадок отфильтровывают. Органический слой упаривают на роторном испарителе, остаток растворяют в этилацетате и проводят экстракцию, добавляя 3 мл NaHSO₄, в первую водную промывку. Далее проводят хроматографическую очистку целевого продукта, используя систему В. Собрали 57.9 мг (50% от теор.) AA-DMAE. R_f=0.34 (бензол : этил ацетат, 6:1).To a solution of arachidonic acid (80.4 mg, 0.26 mmol) in 1.5 ml of chloroform distilled over P ₂ O ₅ , 45 μl of diisopropylcarbodiimide (0.28 mmol), 32 mg of dimethylaminopyridine (0.28 mmol) and 29 μl of dimethylaminoethanol (0.28 mmol) are added. The flask with the reaction mixture was stirred at 0 ° C for 3 hours and then left for 17 hours under argon. The crystalline precipitate is filtered off. The organic layer was concentrated on a rotary evaporator, the residue is dissolved in ethyl acetate and extracted by adding 3 ml of NaHSO ₄ in the first aqueous wash. Next, chromatographic purification of the target product is carried out using system B. 57.9 mg (50% of theory) of AA-DMAE were collected. R _f = 0.34 (benzene: ethyl acetate, 6: 1).

¹Н-ЯМР (CDCl₃; м.д., J, Гц) 0.87 (3Н, т, J6.8, Н20), 1.28 (4Н, м, Н18; Н19), 1.33 (2Н, м, Н17), 1.66 (2Н, квинт, J7.5, Н3), 2.01 (2Н, дт, J 6.4; 7.6, Н16), 2.08 (2Н, дт, J 6.5; 6.8, Н4), 2.21 (2Н, с, Н3`), 2.26 (2Н, т, J7.6; Н2), 2.48 (2Н, т, J6.2; H2`), 2.75 (6Н, м, Н7, Н10, Н13), 4.09 (2Н, т, J6; Н1`), 5.29 (8Н, м, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н12, Н14, Н15). <sup>1</sup> H-NMR (CDCl <sub>3</sub> ; ppm, J, Hz) 0.87 (3H, t, J6.8, H20), 1.28 (4H, m, H18; H19), 1.33 (2H, m, H17), 1.66 (2H, fifth, J7.5, H3), 2.01 (2H, dt, J 6.4; 7.6, H16), 2.08 (2H, dt, J 6.5; 6.8, H4), 2.21 (2H, s, H3`) 2.26 (2H, t, J7.6; H2), 2.48 (2H, t, J6.2; H2`), 2.75 (6H, m, H7, H10, H13), 4.09 (2H, t, J6; H1 `), 5.29 (8Н, m, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н12, Н14, Н15).

Масс-спектр: C₂₄H₄₁NO₂ [М]⁺ 375.3137 (вычислено), 376.3299 [М+Н]⁺ Mass spectrum: C ₂₄ H ₄₁ NO ₂ [M] ⁺ 375.3137 (calculated), 376.3299 [M + H] ⁺

Синтез арахидоноилхолинаSynthesis of Arachidonoylcholine

К раствору 46 мг (0.12 ммоль) AA-DMAE в 500 мкл ацетона, перегнанного над Р₂О₅, прибавляют избыток метил иодида (30 мкл) (по 3 экв. на каждую группу) и оставляют на 40 мин под аргоном, затем упаривают на роторном испарителе и высушивают в вакууме масляного насоса. Собрали 54.4 мг (94% от теор.) арахидоноилхолина. R_f=0.28 (хлороформ: метанол, 5:1).To a solution of 46 mg (0.12 mmol) of AA-DMAE in 500 μl of acetone distilled over P ₂ O ₅ , an excess of methyl iodide (30 μl) (3 eq. Per group) was added and left under argon for 40 min, then evaporated on a rotary evaporator and dried in a vacuum oil pump. 54.4 mg (94% of theory) of arachidonoylcholine were collected. R _f = 0.28 (chloroform: methanol, 5: 1).

¹Н-ЯМР (CDCl₃; м.д., J, Гц) 0.84 (3Н, т, J6.7, Н20), 1.25 (4Н, м, H18; H19), 1.31 (2Н, м, H17), 1.66 (2Н, квинт, J7.5, Н3), 2.01 (2Н, дт, J7.0;7.8, Н16), 2.07 (2Н, дт, J68;7.6, Н4), 2.36 (2Н, т, J7.6; Н2), 2.76 (6Н, м, Н7, Н10, Н13), 3.51 (2Н, с, Н3`), 4.07 (2Н, т, м, Н2`), 4.55 (2Н, т., Н1`), 5.32 (8Н, м, Н5, Н6, Н8, Н9, H11, Н12, Н14, Н15). <sup>1</sup> H-NMR (CDCl <sub>3</sub> ; ppm, J, Hz) 0.84 (3H, t, J6.7, H20), 1.25 (4H, m, H18; H19), 1.31 (2H, m, H17), 1.66 (2H, fifth, J7.5, H3), 2.01 (2H, dt, J7.0; 7.8, H16), 2.07 (2H, dt, J68; 7.6, H4), 2.36 (2H, t, J7.6 ; Н2), 2.76 (6Н, m, Н7, Н10, Н13), 3.51 (2Н, s, Н3`), 4.07 (2Н, t, m, Н2`), 4.55 (2Н, t, Н1`), 5.32 (8Н, m, Н5, Н6, Н8, Н9, H11, Н12, Н14, Н15).

Замену иодида на хлорид или бромид осуществляют стандартным ионным обменом с избытком желаемого иона с использованием растворов хлорида или бромида натрия.The replacement of iodide with chloride or bromide is carried out by standard ion exchange with an excess of the desired ion using solutions of chloride or sodium bromide.

Синтез докозагексаноилхолин иодидаSynthesis of docosahexanoylcholine iodide

Синтез докозагексаеноилхолина (DHA-CLH) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 50 мг (0.15 ммоль) докозагексаеновой кислоты.The synthesis of docosahexaenoylcholine (DHA-CLH) is carried out as described for arachidonoylcholine. 50 mg (0.15 mmol) of docosahexaenoic acid are taken in the reaction.

Выход DHA-DMAE составляет 30 мг (49.3%).The yield of DHA-DMAE is 30 mg (49.3%).

Масс-спектр: C₂₆H₄₁NO₂ [М]⁺ 399.314 (вычислено), 400.329 [М+Н]⁺ (измерено)Mass spectrum: C ₂₆ H ₄₁ NO ₂ [M] ⁺ 399.314 (calculated), 400.329 [M + H] ⁺ (measured)

Выход DHA-CLN 25.3 мг (62.2%).The yield of DHA-CLN is 25.3 mg (62.2%).

Синтез олеоилхолин иодидаSynthesis of oleoylcholine iodide

Синтез олеоилхолина (Ol-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 127 мг (0.45 ммоль) олеиновой кислоты. Выход Ol-DMAE составляет 93 мг (46.8% от теоретического). Масс-спектр: C₂₂H₄₃NO₂ [М]⁺ 353.329 (вычислено), 354.318 [М+Н]⁺ (измерено). Выход Ol-CLN - 70%.The synthesis of oleoylcholine (Ol-CHL) is carried out as described for arachidonoylcholine. 127 mg (0.45 mmol) of oleic acid are taken in the reaction. The yield of Ol-DMAE is 93 mg (46.8% of theory). Mass spectrum: C ₂₂ H ₄₃ NO ₂ [M] ⁺ 353.329 (calculated), 354.318 [M + H] ⁺ (measured). The yield of Ol-CLN is 70%.

Синтез пальмитоилхолин иодидаSynthesis of palmitoylcholine iodide

Синтез пальмитоилхолина (Pt-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.58 ммоль) пальмитиновой кислоты. Выход Pt -DMAE составляет 104 мг (54.3% от теоретического).The synthesis of palmitoylcholine (Pt-CHL) is carried out as described for arachidonoylcholine. 150 mg (0.58 mmol) of palmitic acid are taken in the reaction. The yield of Pt-DMAE is 104 mg (54.3% of theory).

Масс-спектр: C₂₀H₄₁NO₂ [М]⁺ 327.314 (вычислено), 328.299 [М+Н]⁺ (измерено).Mass spectrum: C ₂₀ H ₄₁ NO ₂ [M] ⁺ 327.314 (calculated), 328.299 [M + H] ⁺ (measured).

Выход Pt-CHL 75%.Yield Pt-CHL 75%.

Синтез стеароилхолин иодидаSynthesis of stearoylcholine iodide

Синтез стеароилхолина (St-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.52 ммоль) стеариновой кислоты. Выход St-DMAE составляет 109 мг (58.1% от теоретического).The synthesis of stearoylcholine (St-CHL) is carried out as described for arachidonoylcholine. 150 mg (0.52 mmol) of stearic acid are taken in the reaction. The yield of St-DMAE is 109 mg (58.1% of theory).

Масс-спектр: C₂₂H₄₅NO₂ [М]⁺ 355.345 (вычислено), 356.338 [М+Н]⁺ (измерено)Mass spectrum: C ₂₂ H ₄₅ NO ₂ [M] ⁺ 355.345 (calculated), 356.338 [M + H] ⁺ (measured)

Выход St-CHL 80%Yield St-CHL 80%

Синтез линолеоилхолин иодидаSynthesis of linoleoylcholine iodide

Синтез линолеоилхолина (Ln-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.54 ммоль) линолевой кислоты. Выход Ln -DMAE составляет 87 мг (46.2% от теоретического).The synthesis of linoleoylcholine (Ln-CHL) is carried out as described for arachidonoylcholine. 150 mg (0.54 mmol) of linoleic acid are taken in the reaction. The yield of Ln-DMAE is 87 mg (46.2% of theory).

Масс-спектр: C₂₂H₄₁NO₂ [М]⁺ 351.314 (вычислено), 352.319 [М+Н]⁺ (измерено)Mass spectrum: C ₂₂ H ₄₁ NO ₂ [M] ⁺ 351.314 (calculated), 352.319 [M + H] ⁺ (measured)

Выход Ln-CHL 65%.Yield Ln-CHL 65%.

Синтез линоленоилхолин иодидаSynthesis of linolenoylcholine iodide

Синтез линоленоилхолина (Lnn-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.54 ммоль) линоленовой кислоты. Выход Lnn -DMAE составляет 101 мг (53.6% от теоретического).The synthesis of linolenoylcholine (Lnn-CHL) is carried out as described for arachidonoylcholine. 150 mg (0.54 mmol) of linolenic acid are taken in the reaction. The yield of Lnn-DMAE is 101 mg (53.6% of theory).

Масс-спектр: C₂₂H₃₉NO₂ [М]⁺ 349.298 (вычислено), 350.312 [М+Н]⁺ (измерено)Mass spectrum: C ₂₂ H ₃₉ NO ₂ [M] ⁺ 349.298 (calculated), 350.312 [M + H] ⁺ (measured)

Выход Lnn-CHL 63%.Yield Lnn-CHL 63%.

Синтез эйкозапенаеноилхолин иодидаSynthesis of eicosapenaenoylcholine iodide

Синтез эйкозапенаеноилхолина (EPA-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.49 ммоль) эйкозапентаеновой кислоты.The synthesis of eicosapenoenoylcholine (EPA-CHL) is carried out as described for arachidonoylcholine. 150 mg (0.49 mmol) of eicosapentaenoic acid are taken in the reaction.

Выход EPA-DMAE составляет 87 мг (42.6% от теоретического).The yield of EPA-DMAE is 87 mg (42.6% of theory).

Масс-спектр: C₂₄H₃₉NO₂ [М]⁺ 373. 298 (вычислено), 374.322 [М+Н]⁺ (измерено)Mass spectrum: C ₂₄ H ₃₉ NO ₂ [M] ⁺ 373. 298 (calculated), 374.322 [M + H] ⁺ (measured)

Выход EPA-CHL 60%EPA-CHL yield 60%

Пример 6. Трансфекция клеток комплексом плазмидной ДНК с различными вариантами положительно заряженных белков (гистоны Н2А, Н2А-ТАТ)Example 6. Transfection of cells with a complex of plasmid DNA with various variants of positively charged proteins (histones H2A, H2A-TAT)

Трансфекцию проводят в 24-луночной плашке. Используют смесь плазмид pCMV-Luc/ pRL-TK в соотношении 9:1, несущих гены люциферазы Photinus pyralis под контролем раннего промотора цитомегаловируса и люциферазы Renilla reniformis под контролем промотора тимидин киназы вируса простого герпеса (Promega, США). Клетки линии НТ1080 (фибросаркома человека) (АТСС, CCL-121, США) рассевают по 100000 в лунку в среде ДМЕМ (Dulbecco's modified Eagle's medium) без антибиотика, инкубируют 24 часа при 37°С в 5% СО₂. В пробирке смешивают 1 мкг плазмиды с 10 мкг (или 25 мкг, 50 мкг) гистона и добавляют до 100 мкл PBS. Исходная концентрация гистона и плазмиды в PBS составляет соответственно 2 мкг/мкл и 1 мкг/мл. Смесь гистона и плазмиды инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 100 мкл среды OPTI-MEM, перемешивают и переносят смесь в лунки планшета. Инкубируют 3 часа при 37°С в 5% СО₂, отбирают трансфекционную смесь и добавляют 0,5 мл ростовой среды ДМЕМ без антибиотика. Через 48 часов проводят анализ люциферазной активности с помощью набора "Dual-Luciferase Reporter Assay System" (Promega, США). Полученные результаты представлены на Фиг. 3. Люциферазная активность при трансфекции плазмиды pCMV-Luc с рекомбинантными белками Н2А и Н2А-ТАТ одинакова, и значительно превышает трансфекцию плазмидой без гистона («голой» плазмидой).Transfection is carried out in a 24-well plate. A 9: 1 pCMV-Luc / pRL-TK plasmid mixture was used, carrying the Photinus pyralis luciferase genes under the control of the early cytomegalovirus and Renilla reniformis luciferase promoter under the control of the herpes simplex virus thymidine kinase promoter (Promega, USA). Cells of the NT1080 line (human fibrosarcoma) (ATCC, CCL-121, USA) are scattered at 100,000 per well in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) without antibiotic, incubated for 24 hours at 37 ° C in 5% CO ₂ . In a test tube, 1 μg of the plasmid is mixed with 10 μg (or 25 μg, 50 μg) of histone and up to 100 μl of PBS is added. The initial concentration of histone and plasmid in PBS is 2 μg / μl and 1 μg / ml, respectively. A mixture of histone and plasmid was incubated for 30 minutes at room temperature. Then add 100 μl of OPTI-MEM medium, mix and transfer the mixture to the wells of the tablet. Incubate 3 hours at 37 ° C in 5% CO _2, transfection mixture was withdrawn and added to 0.5 ml of DMEM growth medium without antibiotic. After 48 hours, a luciferase activity assay was performed using the Dual-Luciferase Reporter Assay System kit (Promega, USA). The results obtained are presented in FIG. 3. The luciferase activity during transfection of the plasmid pCMV-Luc with the recombinant proteins H2A and H2A-TAT is the same, and significantly exceeds transfection with a plasmid without histone (a naked plasmid).

Пример 7. Трансфекция клеток комплексом плазмидной ДНК с рекомбинантным гистоном Н2А в присутствии липида арахидоноилхолинаExample 7. Transfection of cells with a complex of plasmid DNA with recombinant histone H2A in the presence of arachidonoylcholine lipid

Трансфекцию проводят в 24-луночной плашке как описано в п. 6. При приготовлении комплекса ДНК-гистон одновременно добавляют арахидоноилхолин, конечная концентрация которого составляла от 1 мкМ до 10 мкМ, что соответствовало соотношению по заряду липида к плазмиде от 1:1 до 10:1. Добавление липида демонстрирует увеличение активности люциферазы, причем наибольший эффект достигается при низких концентрациях гистона (Фиг. 4). Использование одного липида без белков не приводит к заметной трансфекции клеток различными плазмидами.Transfection is carried out in a 24-well plate as described in paragraph 6. In the preparation of the DNA-histone complex, arachidonoylcholine is simultaneously added, the final concentration of which was from 1 μM to 10 μM, which corresponded to a ratio of lipid to plasmid from 1: 1 to 10: one. The addition of lipid demonstrates an increase in luciferase activity, with the greatest effect being achieved at low histone concentrations (Fig. 4). The use of a single lipid without proteins does not lead to a noticeable transfection of cells with various plasmids.

Добавление арахидоноилхолина при увеличении количества гистонов не приводит к сильному увеличению люциферазной активности.The addition of arachidonoylcholine with an increase in the number of histones does not lead to a strong increase in luciferase activity.

Добавление арахидоноилхолина одновременно с гистоном к плазмидной ДНК приводит к увеличению трансфекции более чем в 10 раз и снижению количества используемого гистона.Adding arachidonoylcholine simultaneously with histone to plasmid DNA leads to an increase in transfection by more than 10 times and a decrease in the amount of histone used.

Пример 8. Эффективность трансфекции клеток линии HT1080 плазмидой pEGFP-N1 с помощью рекомбинантного гистона Н2А и липида арахидоноилхолинаExample 8. The efficiency of transfection of HT1080 cells with plasmid pEGFP-N1 using recombinant histone H2A and arachidonoylcholine lipid

Трансфекцию проводят в 6 луночной плашке. Используют плазмидный вектор pEGFP-N1 (Clontech, США), несущий в своем составе ген репортерного зеленого флуоресцентного белка под контролем раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Образование комплексов плазмиды и гистонов в присутствии или отсутствии арахидоноилхолина, проводят аналогично описанному в пп. 6 и 7. В каждую ячейку вносят комплекс, состоящий из 4 мкг плазмиды pEGFP-N1, смешанной в описанных выше соотношениях с конденсирующим белком и липидом. Через 48 часов клетки фотографируют, затем клетки собирают, промывают PBS и анализируют на проточном флуориметре. Результаты были аналогичны эффектам, полученным с плазмидами pCMV-Luc/ pRL-TK. Уровень трансфекции при использовании рекомбинантных белков Н2А и Н2А-ТАТ составляет 7-15%. Уровень трансфекции значительно увеличивается при добавлении липида арахидоноилхолина.Transfection is carried out in a 6 well plate. The plasmid vector pEGFP-N1 (Clontech, USA) is used, which contains the gene of the reporter green fluorescent protein under the control of the early promoter of cytomegalovirus (CMV). The formation of complexes of plasmids and histones in the presence or absence of arachidonoylcholine is carried out similarly to that described in paragraphs. 6 and 7. A complex consisting of 4 μg of the plasmid pEGFP-N1 mixed in the ratios described above with the condensing protein and lipid is introduced into each well. After 48 hours, the cells are photographed, then the cells are harvested, washed with PBS and analyzed on a flow fluorimeter. The results were similar to the effects obtained with pCMV-Luc / pRL-TK plasmids. The level of transfection using recombinant H2A and H2A-TAT proteins is 7-15%. The level of transfection increases significantly with the addition of arachidonoylcholine lipid.

Пример 9. Тест на цитотоксичность HSVtk в присутствии ганцикловира после трансфекции клеток линии OSA плазмидной ДНК в комплексе с рекомбинантным гистоном Н2АExample 9. Test for cytotoxicity of HSVtk in the presence of ganciclovir after transfection of plasmid DNA OSA line cells in combination with recombinant histone H2A

Клетки линии OSA (остеосаркома человека) трансфицируют с помощью рекомбинантного гистона Н2А плазмидой CMV-HSVtk-mGMCSF-pGL3, несущей гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) мыши под контролем раннего промотора цитомегаловируса, в шестилуночных планшетах. В качестве положительного контроля клетки той же лиинии трансфицируют плазмидой CMV-HSVtk- mGM-CSF-pGL3 с помощью широко применяемого трансфекционного агента - Липофектамина 2000 (Invitrogen, США). Спустя 48 часов после трансфекции к клеткам добавляют раствор ганцикловира («Cymeven, Roche», Швейцария) в среде DMEM/F12 (1:1) с антибиотиками в концентрации 0, 12,5, 50 и 200 мкМ. Через 216 часов после добавления ганцикловира проводят MTS -тест с целью определения количества живых клеток (Promega, США). Результаты проведенного эксперимента приведены на Фиг. 5. Использовании клеток линии OSA показывает, что выживаемость контрольной группы клеток (нетрансфицированные клетки) при концентрации ганцикловира от 0 до 200 мкМ около 100%, выживаемость клеток, трансфицированных комплексом плазмиды CMV-HSVtk-mGM-CSF-pGL3 и гистона Н2А снижается при концентрации ганцикловира выше 12,5 мкМ.Cells of the OSA line (human osteosarcoma) are transfected with recombinant histone H2A with plasmid CMV-HSVtk-mGMCSF-pGL3 carrying the herpes simplex virus thymidine kinase (HSVtk) genes and mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor (CM-CS) six well tablets. As a positive control, cells of the same line are transfected with plasmid CMV-HSVtk-mGM-CSF-pGL3 using the widely used transfection agent, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA). 48 hours after transfection, a ganciclovir solution (Cymeven, Roche, Switzerland) in DMEM / F12 medium (1: 1) with antibiotics at a concentration of 0, 12.5, 50, and 200 μM was added to the cells. 216 hours after the addition of ganciclovir, an MTS test was performed to determine the number of living cells (Promega, USA). The results of the experiment are shown in FIG. 5. Using cells of the OSA line shows that the survival rate of the control group of cells (untransfected cells) at a ganciclovir concentration of 0 to 200 μM is about 100%, the survival rate of cells transfected with the complex of plasmid CMV-HSVtk-mGM-CSF-pGL3 and histone H2A decreases with concentration ganciclovir above 12.5 μM.

Данный эксперимент свидетельствует о возможности использования рекомбинантных гистонов для доставки в клетки терапевтических конструкций, содержащих суицидальные гены.This experiment suggests the possibility of using recombinant histones for delivery to cells of therapeutic constructs containing suicidal genes.

Пример 10. Тест на цитотоксичность FCU1 в присутствии 5-FC после трансфекции клеток HT1080 плазмидной ДНК в комплексе с рекомбинантным гистоном Н2А и липидом арахидоноилхолиномExample 10. Test for cytotoxicity of FCU1 in the presence of 5-FC after transfection of HT1080 cells with plasmid DNA in combination with recombinant histone H2A and arachidonoylcholine lipid

Клетки линии HT1080 (фибросаркома человека) трансфицируют в шестилуночных планшетах плазмидой CMV-FCY11-FUR1-pGL3, несущей химерную конструкцию FCY11-FUR1, под контролем раннего промотора цитомегаловируса, с помощью рекомбинантного гистона Н2А и рекомбинантного гистона Н2А в присутствии липида арахидоноилхолина. В качестве контроля используют нетрансфицированные клетки той же линии и клетки, трансфицированные с помощью липофектамина. Спустя 48 часов после трансфекции к клеткам добавляют раствор 5-фторцитозина («Sigma-Aldrich», США) в среде DMEM/F12 с антибиотиками в концентрации 0, 10, 50, 200 и 500 мкМ. Через 216 часов после добавления 5-фторцитозина проводят MTS -тест. Результаты проведенного эксперимента приведены на Фиг. 6. Было показано, что выживаемость контрольной группы клеток (нетрансфицированные клетки) при концентрации 5-фторцитозина от 0 до 500 мкМ была около 100%, выживаемость клеток, трансфицированных комплексами плазмиды CMV -FCY11-FUR1-pGL3 с гистоном Н2А или с гистоном Н2А и араходоноилхолином, снижается на 40% при концентрации 5-фторцитозина выше 200 мкм. Добавление арахидоноилхолина не влияло на процент выживаемости клеток. Данный эксперимент подтверждает возможность использования гистонов и природных липидов для доставки терапевтических конструкций, содержащих суицидальные гены.Cells of the HT1080 line (human fibrosarcoma) are transfected in six-well plates with plasmid CMV-FCY11-FUR1-pGL3, carrying the chimeric construct FCY11-FUR1, under the control of the early cytomegalovirus promoter, using recombinant histone H2A and recombinant histone histone 2. Non-transfected cells of the same line and cells transfected with lipofectamine are used as a control. 48 hours after transfection, a solution of 5-fluorocytosine (Sigma-Aldrich, USA) in DMEM / F12 medium with antibiotics at a concentration of 0, 10, 50, 200, and 500 μM was added to the cells. 216 hours after the addition of 5-fluorocytosine, an MTS test was performed. The results of the experiment are shown in FIG. 6. It was shown that the survival of the control group of cells (untransfected cells) at a concentration of 5-fluorocytosine from 0 to 500 μM was about 100%, the survival rate of cells transfected with complexes of plasmid CMV-FCY11-FUR1-pGL3 with histone H2A or histone H2A and arahodonoylcholine decreases by 40% at a concentration of 5-fluorocytosine above 200 microns. The addition of arachidonoylcholine did not affect cell survival. This experiment confirms the possibility of using histones and natural lipids to deliver therapeutic constructs containing suicidal genes.

SEQUENCE LISTING                         SEQUENCE LISTING

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки <110> Federal State Budgetary Institution of Science

Институт биоорганической химии им. М.А. Шемякина и Ю.А.        Institute of Bioorganic Chemistry M.A. Shemyakina and Yu.A.

Овчинникова Российской академии наук       Ovchinnikov Russian Academy of Sciences

Federal'noe gosudarstvennoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki        Federal'noe gosudarstvennoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki

Institut bioorganicheskoi chemii Rossiiskoi akademii nauk       Institut bioorganicheskoi chemii Rossiiskoi akademii nauk

<120> ГИСТОНЫ И БИОДЕГРАДИРУЕМЫЕ ЛИПИДЫ КАК СРЕДСТВО ДЛЯ <120> Histones and Biodegradable Lipids as a Means for

ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКИ ЭУКАРИОТ       DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS TO EUCARIOT CELLS

<130> IBOC<130> IBOC

<160> 7 <160> 7

<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <210> 1

<211> 27 <211> 27

<212> DNA <212> DNA

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

<220><220>

<221> misc_feature <221> misc_feature

<223> Primer H2A forward <223> Primer H2A forward

<400> 1 <400> 1

GTTAGCATAT GTCGGGACGT GGCAAGC 27GTTAGCATAT GTCGGGACGT GGCAAGC 27

<210> 2<210> 2

<211> 29<211> 29

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> misc_feature<221> misc_feature

<223> Primer H2A revers<223> Primer H2A revers

<400> 2<400> 2

ACTAAGCTTC TACTTGCCCT TGGCCTTGT 29ACTAAGCTTC TACTTGCCCT TGGCCTTGT 29

<210> 3<210> 3

<211> 25<211> 25

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> misc_feature<221> misc_feature

<223> Primer H2A-TAT forward<223> Primer H2A-TAT forward

<400> 3<400> 3

TATACATATG TCGGGACGTG GCAAG 25TATACATATG TCGGGACGTG GCAAG 25

<210> 4<210> 4

<211> 64<211> 64

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<221> misc_feature<221> misc_feature

<223> Primer H2A-TAT forward<223> Primer H2A-TAT forward

<400> 4<400> 4

ACTAAGCTTC TAACGGCGAC GCTGGCGACG TTTCTTACGA CCGTACTTGC CCTTGGCCTT 60ACTAAGCTTC TAACGGCGAC GCTGGCGACG TTTCTTACGA CCGTACTTGC CCTTGGCCTT 60

GTGG 64GTGG 64

<210> 5<210> 5

<211> 129<211> 129

<212> Protein<212> Protein

<213> Homo sapiens <213> Homo sapiens

<220><220>

<223> Recombinant histone H2A<223> Recombinant histone H2A

<400> 5<400> 5

SGRGKQGGKA RAKAKSRSSR AGLQFPVGRV HRLLRKGNYA ERVGAGAPVY AAVLEYLTA 60SGRGKQGGKA RAKAKSRSSR AGLQFPVGRV HRLLRKGNYA ERVGAGAPVY AAVLEYLTA 60

EILELAGNAA RDNKKTRIIP RHLQLAIRND EELNKLLGRV TIAQGGVLPN QAVLLPKKT 120EILELAGNAA RDNKKTRIIP RHLQLAIRND EELNKLLGRV TIAQGGVLPN QAVLLPKKT 120

ESHHKAKGK 129ESHHKAKGK 129

<210> 6<210> 6

<211> 140<211> 140

<212> Protein<212> Protein

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Recombinant protein H2A-TAT<223> Recombinant protein H2A-TAT

<400> 6<400> 6

SGRGKQGGKA RAKAKSRSSR AGLQFPVGRV HRLLRKGNYA ERVGAGAPVY AAVLEYLTA 60SGRGKQGGKA RAKAKSRSSR AGLQFPVGRV HRLLRKGNYA ERVGAGAPVY AAVLEYLTA 60

EILELAGNAA RDNKKTRIIP RHLQLAIRND EELNKLLGRV TIAQGGVLPN QAVLLPKKT 120EILELAGNAA RDNKKTRIIP RHLQLAIRND EELNKLLGRV TIAQGGVLPN QAVLLPKKT 120

ESHHKAKGKY GRKKRRQRRR 140ESHHKAKGKY GRKKRRQRRR 140

Claims (12)

1. Способ доставки плазмидной ДНК в эукариотические клетки, включающий смешивание плазмидной ДНК с рекомбинантным гистоном и холиновым эфиром жирной кислоты с длиной углеродной цепи от 16 до 22 атомов, включающих от 0 до 6 двойных связей, и инкубирование эукариотических клеток с полученной смесью.1. A method of delivering plasmid DNA to eukaryotic cells, comprising mixing plasmid DNA with recombinant histone and choline fatty acid ester with a carbon chain length of 16 to 22 atoms, comprising from 0 to 6 double bonds, and incubating eukaryotic cells with the resulting mixture. 2. Способ по п. 1, где в качестве рекомбинантного гистона используют гистон Н2А, смешанный с холиновым эфиром жирной кислоты в заданном соотношении.2. The method according to claim 1, where histone H2A mixed with choline fatty acid ester in a predetermined ratio is used as a recombinant histone. 3. Способ по п. 1, где в качестве рекомбинантного гистона используют химерный гистон Н2А-ТАТ, смешанный с холиновым эфиром жирной кислоты.3. The method of claim 1, wherein the chimeric histone H2A-TAT mixed with choline fatty acid ester is used as the recombinant histone. 4. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют арахидоноилхолин иодид.4. The method according to PP. 2 and 3, where arachidonoylcholine iodide is used as the choline fatty acid ester. 5. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют арахидоноилхолин.5. The method according to PP. 2 and 3, where arachidonoylcholine is used as the choline fatty acid ester. 6. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют докозагексаноилхолин иодид.6. The method according to PP. 2 and 3, where docosahexanoylcholine iodide is used as the choline fatty acid ester. 7. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют олеоилхолин иодид.7. The method according to PP. 2 and 3, where oleoylcholine iodide is used as a choline fatty acid ester. 8. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют пальмитоилхолин иодид.8. The method according to PP. 2 and 3, where palmitoylcholine iodide is used as the choline fatty acid ester. 9. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют стеароилхолин иодид.9. The method according to PP. 2 and 3, where stearoylcholine iodide is used as the choline fatty acid ester. 10. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют линолеоилхолин иодид.10. The method according to PP. 2 and 3, where linoleoylcholine iodide is used as the choline fatty acid ester. 11. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют линоленоилхолин иодид.11. The method according to PP. 2 and 3, where linolenoylcholine iodide is used as the choline fatty acid ester. 12. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют эйкозапентаеноилхолин иодид.12. The method according to PP. 2 and 3, where eicosapentaenoylcholine iodide is used as the choline fatty acid ester.

Images