RU2627450C1 - Extract of spinach leaves and method for its production - Google Patents

Abstract

FIELD: pharmacology.

SUBSTANCE: extract of spinach leaves, containing dry or liquid concentrate of biologically active substances, at that, the concentrate is enriched with 20-hydroxyecdysone in an amount from 1 to 20 mg per 1 g of dry matter, does not contain oxalates, is obtained by water extraction of spinach leaves and centrifugation, further extract ultrafiltration followed by solid-phase extraction of phytoecdysteroids using hydrophobic sorbents by passing the low molecular weight fraction through the sorbent or adding the sorbent to the low molecular weight fraction and incubating for 1 hour, then the sorbent is washed with water and phytoecdysteroids desorption is performed.

EFFECT: extract is enriched with phytoecdysteroids, does not contain oxalates, which avoids accumulation of oxalates contained in the raw material, which provoke kidney stones formation, in the enriched product.

1 dwg, 3 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к пищевой биотехнологии, а именно к получению обогащенных продуктов питания, для повышения адаптационных возможностей организма в условиях стресса, повышения умственной и физической работоспособности, улучшения кратковременной и долговременной памяти, улучшения углеводного и липидного обмена, профилактики и компенсации абдоминального ожирения. Изобретение находит применение в функциональном питании, восстановительной медицине, гериатрии и спорте.The invention relates to food biotechnology, namely to obtain enriched food products, to increase the adaptive capacity of the body under stress, increase mental and physical performance, improve short-term and long-term memory, improve carbohydrate and lipid metabolism, prevent and compensate for abdominal obesity. The invention finds application in functional nutrition, regenerative medicine, geriatrics and sports.

Известно, что современный человек подвергается действию факторов стресса различной природы, силы и продолжительности действия. В регуляции стресса принимает участие гормон стресса кортизол, который в ответ на утомление, физическую нагрузку, голодание, страх и другие экстренные стрессовые ситуации мобилизует в организме метаболические процессы: расщепление белков (в том числе мышечных) до аминокислот, запуск процессов глюконеогенеза в печени, повышение уровня глюкозы в крови, а также накопление жира. Стресс невысокой интенсивности и продолжительности выполняет защитное действие и помогает преодолеть человеческому организму вызовы на стрессовые воздействия. При этом после снятия стрессовой нагрузки уровень кортизола возвращается на базовый уровень. В условиях хронического стресса, когда уровень кортизола постоянно повышен, под его влиянием происходит подавление функций щитовидной железы, повышается артериальное давление, возникает гипергликемия, снижается иммунитет, нарастает количество брюшного жира при нормальной массе тела, уменьшается плотность костей. В свою очередь, это может привести к различным заболеваниям, таким как сахарный диабет, инфаркт миокарда, инсульт, атеросклероз и другие заболевания. Многие известные лекарственные средства, направленные на лечение отдельных сердечно-сосудистых заболеваний или нарушений обмена веществ, не устраняют их главную причину, обусловленную хроническим стрессом [Дильман В.М. Большие биологические часы (Введение в интегральную медицину). М.: Знание, 1981. 208 с.].It is known that modern man is exposed to stress factors of various nature, strength and duration of action. The stress hormone cortisol takes part in the regulation of stress, which in response to fatigue, physical exertion, starvation, fear and other emergency stressful situations mobilizes metabolic processes in the body: the breakdown of proteins (including muscle) to amino acids, the start of gluconeogenesis in the liver, increase blood glucose levels, as well as fat accumulation. Stress of low intensity and duration performs a protective effect and helps the human body overcome challenges to stressful effects. In this case, after the stress load is removed, the level of cortisol returns to the base level. Under conditions of chronic stress, when the level of cortisol is constantly increased, under its influence, thyroid function is suppressed, blood pressure rises, hyperglycemia occurs, immunity decreases, the amount of abdominal fat increases with normal body weight, and bone density decreases. In turn, this can lead to various diseases, such as diabetes mellitus, myocardial infarction, stroke, atherosclerosis and other diseases. Many well-known drugs aimed at treating individual cardiovascular diseases or metabolic disorders do not eliminate their main cause due to chronic stress [Dilman V.M. Big biological clock (Introduction to integrated medicine). M .: Knowledge, 1981. 208 p.].

В настоящее время большое внимание уделяется антистрессовой фиторегуляции с применением лекарственных растений, которые эффективны не только для лечения различных заболеваний, но и как метод нормализации физиологических функций и психофизиологического состояния здоровых людей. Показана их эффективность для адаптации организма в ситуациях как острого стресса, так и длительного воздействия стрессоров, для повышения работоспособности и ускорения восстановления после нагрузок. Для профилактики и коррекции стрессовых состояний, к которым относятся утомление, астения, снижение работоспособности, используются адаптогены - вещества преимущественно растительного происхождения, повышающие неспецифическую устойчивость организма к неблагоприятным стрессовым воздействиям. Адаптогены действуют на центры гормональной регуляции, оптимизируя секрецию кортизола и обеспечивая тонизирующее и стимулирующее действие на функции нервной системы и организма в целом. Они эффективны как на ранней стадии стресса, так и на стадии стрессового истощения, активизируя метаболические процессы. Адаптогены характеризуются также антиоксидантным действием и обеспечивают защиту от повреждения клеточных структур свободными радикалами. Они обладают иммуностимулирующим действием, повышают физическую и умственную работоспособность, устойчивость к различным физиологическим и психологическим стресс-факторам, сокращают сроки адаптации к ним. Известными адаптогенами являются настойки и препараты на основе женьшеня, элеутерококка, аралии, лимонника, родиолы и некоторых других растений, однако они имеют противопоказания при бессоннице, повышенной нервной возбудимости и гипертонии [Дырдымов И.В. Женьшень, элеутерококк (к механизму биологического действия). М., 1976. 184 с.; Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены. СПб., 2007. 129 с.]. Этих недостатков лишены лекарственные препараты и биологически активные добавки на основе растений, содержащих фитоэкдистероиды [Володин В.В., Матаев С.И. Экдистероидсодержащие растения - источники новых адаптогенов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова, 2011. Т. 7. №2, С. 52-59.].Currently, much attention is paid to anti-stress phytoregulation using medicinal plants, which are effective not only for the treatment of various diseases, but also as a method of normalizing the physiological functions and psychophysiological state of healthy people. Their effectiveness has been shown to adapt the body in situations of both acute stress and prolonged exposure to stressors, to improve performance and accelerate recovery after exertion. For the prevention and correction of stressful conditions, which include fatigue, asthenia, decreased performance, adaptogens are used - substances of predominantly plant origin that increase the nonspecific resistance of the body to adverse stress effects. Adaptogens act on the centers of hormonal regulation, optimizing the secretion of cortisol and providing a tonic and stimulating effect on the functions of the nervous system and the body as a whole. They are effective both at an early stage of stress, and at a stage of stress exhaustion, activating metabolic processes. Adaptogens are also characterized by antioxidant action and provide protection against damage to cellular structures by free radicals. They have an immunostimulating effect, increase physical and mental performance, resistance to various physiological and psychological stress factors, and reduce the time for adaptation to them. Known adaptogens are tinctures and preparations based on ginseng, eleutherococcus, aralia, lemongrass, rhodiola and some other plants, but they have contraindications for insomnia, increased nervous irritability and hypertension [Dyrdymov I.V. Ginseng, Eleutherococcus (to the mechanism of biological action). M., 1976. 184 p .; Yaremenko K.V. The optimal state of the body and adaptogens. St. Petersburg, 2007.129 s.]. These shortcomings are deprived of drugs and biologically active additives based on plants containing phytoecdysteroids [Volodin V.V., Mataev S.I. Ecdysteroid-containing plants - sources of new adaptogens // Bulletin of Biotechnology and Physico-Chemical Biology named after Yu.A. Ovchinnikova, 2011. T. 7. No. 2, S. 52-59.].

Фитоэкдистероиды - полигидроксилированные стерины, являющиеся структурными аналогами гормонов линьки насекомых, обнаружены во многих видах дикорастущих растений. Фитоэкдистероиды не токсичны для млекопитающих. Выявлено выраженное актопротекторное [RU, патент №2276991, приоритет от 09.02.2005, опубликовано 27.05.2006], стресс- и гематопротекторное [RU, №2375071, приоритет от 06.11.2008, опубликовано 10.12.2009], противолучевое [RU, №2326672, приоритет от 21.03.06, опубликовано 20.06.2008], противодиабетическое [RU, патент №2337698, приоритет от 06.02.2007, опубликовано 10.11.2008], антиатеросклеротичекое и противоишемическое [RU, патент №2337701, приоритет от 06.02.2007, опубликовано 10.11.2008] действие.Phytoecdysteroids - polyhydroxylated sterols, which are structural analogues of insect molting hormones, are found in many species of wild plants. Phytoecdysteroids are not toxic to mammals. A pronounced actoprotective [RU, patent No. 2276991, priority from 02/09/2005, published May 27, 2006], stress and hematoprotective [RU, No. 2375071, priority from November 6, 2008, published December 10, 2009], anti-radiation [RU, No. 232666672 , priority of March 21, 2006, published on June 20, 2008], anti-diabetic [RU, patent No. 2337698, priority of February 6, 2007, published November 10, 2008], anti-atherosclerotic and anti-ischemic [RU, patent No. 2,337,701, priority of February 6, 2007, published 10/10/2008] action.

Экдистероиды вводятся в организм в чистом виде или в форме экстрактов растений. Для этого используются лекарственные растения с относительно высоким содержанием экдистероидов, например, левзея сафлоровидная, из корневищ которой получают жидкие и сухие экстракты и выделяют очищенный 20-гидроксиэкдизон в качестве субстанции тонизирующего лекарственного препарата экдистен [Куракина И.О., Булаев В.М. Экдистен - тонизирующее средство в таблетках по 0.005 г // Новые лекарственные препараты. М., 1990. Вып. 6. С. 16-18.]. Для получения биологически активных добавок к пище в последнее время не рекомендовано использование растений, относящихся к списку лекарственных. В этих целях могут быть использованы пищевые растения, однако примеров известных видов пищевых растений, содержащих фитоэкдистероиды, мало. К ним относятся, например, шпинат и квиноа [Bakrim A., Maria A., Sayah F. et al. Ecdysteroids in spinach (Spinacia oleracea L.): biosynthesis, transport and regulation of levels // Plant Physiology and Biochemistry, 2008. V. 46. P. 844-854.; Foucaultetal A.-S., Even P., Lafont R. et al. Quinoa extract enriched in 20-hydroxyecdysone affects energy homeostasis and intestinal fat absorption in mice fed a high-fat diet // Physiology and Behavior, 2014. V. 128. P. 226-231.]. Указанные пищевые растения содержат незначительное количество фитоэкдистероидов, поэтому фармакологическая ценность продуктов, полученных непосредственно из вышеназванных видов пищевых растений или из экстрактов, получаемых традиционным путем, является недостаточной из-за низкого содержания в них фитоэкдистероидов. По этой же причине выделение индивидуальных фитоэкдистероидов из названных видов растений экономически нерентабельно. Таких недостатков в значительной степени лишены специальным образом получаемые растительного сырья с низким содержанием ценных микронутриентов обогащенные продукты питания.Ecdysteroids are introduced into the body in pure form or in the form of plant extracts. To do this, medicinal plants with a relatively high content of ecdysteroids are used, for example, safflower levze, from which rhizomes liquid and dry extracts are obtained and purified 20-hydroxyecdysone is isolated as the substance of the tonic drug ecdysten [Kurakina I.O., Bulaev V.M. Ecdisten - a tonic in tablets of 0.005 g each // New drugs. M., 1990. Issue. 6. S. 16-18.]. To obtain biologically active food additives, the use of plants belonging to the list of medicinal products has not been recommended recently. Food plants can be used for this purpose, however, there are few examples of known types of food plants containing phytoecdysteroids. These include, for example, spinach and quinoa [Bakrim A., Maria A., Sayah F. et al. Ecdysteroids in spinach (Spinacia oleracea L.): biosynthesis, transport and regulation of levels // Plant Physiology and Biochemistry, 2008. V. 46. P. 844-854 .; Foucaultetal A.-S., Even P., Lafont R. et al. Quinoa extract enriched in 20-hydroxyecdysone affects energy homeostasis and intestinal fat absorption in mice fed a high-fat diet // Physiology and Behavior, 2014. V. 128. P. 226-231.]. These food plants contain a small amount of phytoecdysteroids, therefore the pharmacological value of products obtained directly from the above types of food plants or from extracts obtained in the traditional way is insufficient due to the low content of phytoecdysteroids in them. For the same reason, the isolation of individual phytoecdysteroids from these plant species is economically unprofitable. Enriched food products are largely devoid of such shortcomings in a special way obtained plant materials with a low content of valuable micronutrients.

Известен функциональный пищевой продукт для снижения избыточной массы тела, содержащий фитоэкдистероиды из пищевого растения квиноа, и способ его получения [RU, патент №2491083, конвенционный приоритет от 19.11.2008, опубликовано 27.08.2013]. Квиноа или рисовая лебеда (Chenopodium quinoa) - псевдозерновая культура, однолетнее растение семейства Маревые (Chenopodiaceae), произрастающее на склонах гор Анд в Южной Америке. Квиноа как сельскохозяйственная культура, имеет древнее происхождение и была одним из важнейших видов пищи индейцев. Содержание фитоэкдистероидов в зернах квиноа не выше 0,01-0,02%. Чтобы организм человека получил эффективную концентрацию фитоэкдистероидов, необходимо потребить не менее 100 г необработанных сухих зерен. Авторами данного изобретения предлагается использовать обогащенный продукт, содержащий в 50 раз больше фитоэкдистероидов, чем исходные зерна квиноа. Согласно заявленному способу для получения обогащенного продукта зерна квиноа вначале экстрагируют кипящей водой в соотношении 1:4 для удаления сапонинов, придающих экстракту горький вкус. Экдистероиды извлекают из зерен квиноа путем вторичной экстракции смесью этанол-вода (1:1) при температуре 80°С. Сухой экстракт обрабатывают абсолютным этанолом. Этанольную фракцию фильтруют и конечный продукт высушивают. Способ предполагает также использование бутанола вместо этанола. Содержание фитоэкдистероидов в обогащенном продукте от 2 до 7%, что на два порядка выше, чем в исходном сырье. Данный обогащенный экстракт добавляют в пищевые продукты, например, йогурты, другие молочные продукты и напитки, или включают в состав желатиновых капсул для получения биологически активных добавок к пище. Согласно патенту содержание фитоэкдистероидов в одной капсуле содержится 7,5 мг фитоэкдистероидов. Рекомендуемая доза для профилактики или компенсации абдоминального ожирения составляет 4 капсулы или 30 мг фитоэкдистероидов в сутки. Указанный способ имеет ряд недостатков, таких как использование импортного растительного сырья зерна квиноа, неизбежные потери фитоэкдистероидов на стадии первичной водной экстракции при удалении сапонинов (растворимость фитоэкдистероидов в воде составляет около 2 г/л), применение больших объемов этанола удорожает производство, а использование бутанола нежелательно при получении пищевых добавок.Known functional food product to reduce excess body weight containing phytoecdysteroids from a food plant quinoa, and a method for its production [RU, patent No. 2491083, convention priority of 11/19/2008, published on 08/27/2013]. Quinoa or rice quinoa (Chenopodium quinoa) is a pseudo-grain crop, an annual plant of the Chenopodiaceae family, growing on the slopes of the Andes in South America. Quinoa as an agricultural crop, has an ancient origin and was one of the most important types of food of the Indians. The content of phytoecdysteroids in quinoa grains is not higher than 0.01-0.02%. For the human body to receive an effective concentration of phytoecdysteroids, it is necessary to consume at least 100 g of untreated dry grains. The authors of this invention propose to use an enriched product containing 50 times more phytoecdysteroids than the original quinoa grains. According to the claimed method, to obtain an enriched product, quinoa grains are first extracted with boiling water in a ratio of 1: 4 to remove saponins, which impart a bitter taste to the extract. Ecdysteroids are extracted from quinoa grains by secondary extraction with a mixture of ethanol-water (1: 1) at a temperature of 80 ° C. The dry extract is treated with absolute ethanol. The ethanol fraction is filtered and the final product is dried. The method also involves the use of butanol instead of ethanol. The content of phytoecdysteroids in the enriched product is from 2 to 7%, which is two orders of magnitude higher than in the feedstock. This enriched extract is added to food products, for example, yogurts, other dairy products and drinks, or included in gelatin capsules to obtain dietary supplements. According to the patent, the content of phytoecdysteroids in one capsule contains 7.5 mg of phytoecdysteroids. The recommended dose for the prevention or compensation of abdominal obesity is 4 capsules or 30 mg of phytoecdysteroids per day. This method has several disadvantages, such as the use of imported plant raw materials of quinoa grain, the inevitable loss of phytoecdysteroids at the stage of primary water extraction during the removal of saponins (the solubility of phytoecdysteroids in water is about 2 g / l), the use of large volumes of ethanol increases the cost of production, and the use of butanol is undesirable upon receipt of nutritional supplements.

Ценным пищевым растением, содержащим фитоэкдистероиды, является шпинат огородный (Spinacia oleracea) - однолетнее травянистое растение из семейства маревых (Chenopodiaceae). Шпинат культивируется в зонах умеренного климата, в частности, в России. В пищу употребляются, в основном, листья этого растения, которые содержат белок, сахара, аскорбиновую кислоту, витамины группы В, каротин, лютеин, полифенолы, органические кислоты, фитоэкдистероиды, минеральные соли (железо, магний, калий, фосфор, натрий, кальций, йод). Листья шпината употребляют вареными (в супах и в качестве гарнира для вторых блюд) и сырыми (в салатах). Свои ценные питательные качества они сохраняют в консервированном и свежезамороженном виде. Листья также можно сушить и после размалывания использовать в виде порошка как приправу для различных блюд. Используется сок из свежих листьев шпината.A valuable food plant containing phytoecdysteroids is garden spinach (Spinacia oleracea), an annual herbaceous plant from the crows family (Chenopodiaceae). Spinach is cultivated in temperate zones, in particular in Russia. Leaves of this plant, which contain protein, sugars, ascorbic acid, B vitamins, carotene, lutein, polyphenols, organic acids, phytoecdysteroids, mineral salts (iron, magnesium, potassium, phosphorus, sodium, calcium, iodine). Spinach leaves are consumed cooked (in soups and as a side dish for main dishes) and raw (in salads). They retain their valuable nutritional qualities in canned and freshly frozen form. The leaves can also be dried and, after grinding, used in powder form as a seasoning for various dishes. Used juice from fresh spinach leaves.

Шпинат рекомендуется вводить в рацион здоровых людей для повышения функциональных резервов человека в периоды гиповитаминоза, при переутомлении, при интенсивных физических нагрузках, а также для компенсации неблагоприятного воздействия факторов внешней (например, низкие температуры, неоптимальный световой режим, повышенный радиационный фон) и производственной среды (ионизирующее излучение, вредные химические факторы), для регуляции углеводного и липидного обмена лицам с диабетом 2 типа, страдающих ишемической болезнью сердца, различными формами анемии, а также при ослаблении зрения и памяти у пожилых людей.It is recommended to introduce spinach into the diet of healthy people in order to increase the functional reserves of a person during periods of hypovitaminosis, during overwork, during intense physical exertion, and also to compensate for the adverse effects of external factors (for example, low temperatures, suboptimal light conditions, increased background radiation) and the production environment ( ionizing radiation, harmful chemical factors), for the regulation of carbohydrate and lipid metabolism for persons with type 2 diabetes suffering from coronary heart disease, different forms of anemia, as well as with weakening of vision and memory in the elderly.

Недостатками шпината, используемого в пищу в цельном виде - листьях (свежих, свежезамороженных, вареных или высушенных) или свежеприготовленном соке, является относительно низкое в суточном рационе содержание фитоэкдистероидов, ответственных за биологическую ценность и лечебно-профилактическое действие шпината. В то же время в шпинате содержится большое количество оксалатов, которые противопоказаны людям, страдающим или предрасположенным к почечнокаменной болезни, ревматизму и подагре. В одной чашке сырых не нарезанных листьев шпината массой 30 г содержится около 200 мг оксалата. При допустимой суточной норме оксалатов 50 мг в день человек, страдающий этими заболеваниями, может употреблять в день всего лишь 0,25 чашки (или 6 г) сырого шпината, что явно недостаточно для получения экдистероидов и других микронутриентов в количествах, необходимых для проявления ими своего метаболического действия. При содержании 20-гидроксиэкдизона в свежих листьях шпината 0,02-0,04% лица, страдающие почечнокаменной болезнью, и с другими противопоказаниями приема оксалатов получат приблизительно 1,0-2,0 мг экдистероидов с разрешенной порцией шпината в четверть чашки. Для проявления своего лечебно-профилактического действия в отношении нарушения липидного и углеводного обмена, компенсации метаболического синдрома минимальная суточная доза экдистероидов должна составлять от 5 до 30 мг, а для лиц, занятых тяжелым физическим трудом, испытывающих вредные производственные факторы, такие как повышенный радиационный фон, действие экотоксикантов, а также для спортсменов эти дозы должны быть еще выше - до 50-100 мг в сутки.The disadvantages of spinach, used in whole food - leaves (fresh, freshly frozen, boiled or dried) or freshly prepared juice, are the relatively low content of phytoecdysteroids in the daily diet, which are responsible for the biological value and therapeutic effect of spinach. At the same time, spinach contains a large number of oxalates, which are contraindicated for people suffering from or predisposed to kidney stones, rheumatism and gout. About 30 mg of oxalate are contained in one cup of raw uncut spinach leaves weighing 30 g. With a permissible daily norm of oxalates of 50 mg per day, a person suffering from these diseases can consume only 0.25 cups (or 6 g) of raw spinach per day, which is clearly not enough to obtain ecdysteroids and other micronutrients in the quantities necessary for their manifestation metabolic action. With the content of 20-hydroxyecdysone in fresh spinach leaves 0.02-0.04%, persons suffering from kidney stone disease and with other contraindications for taking oxalates will receive approximately 1.0-2.0 mg of ecdysteroids with a permitted portion of spinach in a quarter cup. For the manifestation of its therapeutic and prophylactic effect in relation to lipid and carbohydrate metabolism disorders, compensation of the metabolic syndrome, the minimum daily dose of ecdysteroids should be from 5 to 30 mg, and for people who are engaged in hard physical work, experiencing harmful production factors, such as increased radiation background, the effect of ecotoxicants, as well as for athletes, these doses should be even higher - up to 50-100 mg per day.

Известен способ приготовления полифенольных экстрактов из листьев шпината [RU 2519640, приоритет 04.05.2009, опубликовано 20.06.2014], который принят нами за прототип. Способ получения экстрактов шпината включает добавление к водному экстракту листьев шпината пищевого масла, проведение экстракции, концентрирование в вакууме и разделение масляной и водной фазы. Предложенный способ позволяет получить экстракт (концентрат) из водной фазы, обогащенной полифенолами более 50%. Недостатками данного способа и полученных полифенольных экстрактов является то, что способ получения не учитывает достижение необходимого концентрирования фитоэкдистероидов в конечном продукте и не предполагает удаление из целевой водной фазы экстракта оксалатов, ухудшающих потребительские свойства экстракта и ограничивающих его применение для большого круга лиц, для которых противопоказано употребление оксалатов.A known method of preparing polyphenolic extracts from spinach leaves [RU 2519640, priority 04.05.2009, published 20.06.2014], which we adopted as a prototype. A method for producing spinach extracts includes adding edible oil to spinach leaf extract, extracting, concentrating in vacuo and separating the oil and water phases. The proposed method allows to obtain an extract (concentrate) from the aqueous phase enriched in polyphenols of more than 50%. The disadvantages of this method and the obtained polyphenolic extracts is that the production method does not take into account the achievement of the necessary concentration of phytoecdysteroids in the final product and does not involve the removal of oxalates from the target aqueous phase of the extract, which impair the consumer properties of the extract and limit its use for a wide range of people for whom use is contraindicated oxalates.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение экстракта (концентрата) из листьев шпината, обогащенного фитоэкдистероидами (по большей части 20-гидроксиэкдизоном) и не содержащего оксалатов и разработка эффективного способа получения экстракта из листьев шпината, позволяющего увеличить содержание 20-гидроксиэкдизона в сухом обогащенном концентрате до 1,0-20,0 мг на 1 г сухого экстракта и уменьшить содержание оксалатов до 0,01%.The technical result of the present invention is to obtain an extract (concentrate) from spinach leaves enriched in phytoecdysteroids (mostly 20-hydroxyecdysone) and not containing oxalates and to develop an effective method for producing extract from spinach leaves to increase the content of 20-hydroxyecdysone in a dry enriched concentrate to 1 , 0-20.0 mg per 1 g of dry extract and reduce the content of oxalates to 0.01%.

Получаемый экстракт (концентрат) может быть применен в качестве профилактического средства для преодоления негативных последствий стресса, ускорения восстановления после сильных физических и умственных нагрузок, в частности, для людей экстремальных профессий, спортсменов и для лиц, занятых тяжелым физическим трудом, подверженных вредным природным и производственным факторам, пожилым людям, испытывающих состояние хронического стресса.The resulting extract (concentrate) can be used as a prophylactic to overcome the negative effects of stress, accelerate recovery after strong physical and mental stress, in particular, for people of extreme professions, athletes and for people engaged in hard physical work, prone to harmful natural and industrial factors, older people experiencing chronic stress.

Технический результат достигается тем, что высушенные измельченные листья шпината экстрагируют водой при соотношении вода:листья 40:1 при температуре 40-90°С в течение 10-90 мин, получаемый водный экстракт отделяют от биомассы, в частном случае, центрифугированием. Водный экстракт подвергают ультрафильтрации при комнатной температуре для удаления взвешенных и коллоидных веществ, преимущественно, пигментов и липидов. Затем низкомолекулярную фракцию экстрагируют путем твердофазной экстракцией фитоэкдистероидов с использованием гидрофобных сорбентов при соотношении сорбент:фракция 7:1 или в низкомолекулярную фракцию добавляют сорбент, при соотношении фракция:сорбент 7,5:1 и инкубируют 1 час, далее сорбент промывают водой. Десорбцию фитоэкдистероидов с сопутствующими веществами проводят известными способами, например водными растворами низших спиртов с концентрацией спирта от 5 по 80 объемных процентов, в частном случае, 70%-ным этанолом. Полученный экстракт упаривают и высушивают, в частном случае, с помощью лиофильной сушки. Содержание 20-гидроксиэкдизона в сухом концентрате варьируется от 1,0 до 20,0 мг на 1 г сухого препарата в зависимости от объемной доли низшего спирта в растворителе, применяемом на стадии десорбции экдистероидов. Содержание оксалатов не превышает 0,01%.The technical result is achieved by the fact that the dried chopped spinach leaves are extracted with water at a water: leaf ratio of 40: 1 at a temperature of 40-90 ° C for 10-90 minutes, the resulting aqueous extract is separated from the biomass, in particular, by centrifugation. The aqueous extract is ultrafiltered at room temperature to remove suspended and colloidal substances, mainly pigments and lipids. Then the low molecular weight fraction is extracted by solid-phase extraction of phytoecdysteroids using hydrophobic sorbents at a sorbent: fraction ratio of 7: 1 or a sorbent is added to the low molecular weight fraction, at a ratio of fraction: sorbent 7.5: 1 and incubated for 1 hour, then the sorbent is washed with water. The desorption of phytoecdysteroids with related substances is carried out by known methods, for example, aqueous solutions of lower alcohols with an alcohol concentration of 5 to 80 volume percent, in particular, 70% ethanol. The extract obtained is evaporated and dried, in the particular case, by freeze drying. The content of 20-hydroxyecdysone in a dry concentrate varies from 1.0 to 20.0 mg per 1 g of dry preparation, depending on the volume fraction of lower alcohol in the solvent used in the desorption stage of ecdysteroids. The content of oxalates does not exceed 0.01%.

Примеры осуществления способаExamples of the method

Пример 1. Листья шпината измельчают и проводят водную экстракцию при соотношении вода/листья шпината 40:1 в интервале температуре 40-90°С в течение 10-90 мин. Разделение проводят центрифугированием в течение 15 минут при скорости 2000 об/мин с отбрасыванием осадка. Удаление взвешенных и коллоидных частиц из экстракта проводят ультрафильтрацией на установке «Minitan» («Millipore», США) в тангенциальном потоке с использованием мембран с диаметром пор 10 кД при комнатной температуре. Полученную высокомолекулярную фракцию отбрасывают. Низкомолекулярную фракцию пропускают через слой сорбента «Диасорб-100 С₁₆» (ЗАО «БиоХимМак») при соотношении сорбент:фракция 7:1 с последующей двукратной промывкой сорбента дистиллированной водой для удаления оксалатов. Десорбцию экдистероидов с сопутствующими веществами проводят 70%-ным раствором этилового спирта при соотношении сорбент:растворитель 1:10. Растворитель отгоняют под вакуумом, а конечный продукт высушивают на лиофильной сушилке. Конечный обогащенный концентрат представляет собой легкие хлопья бежевого цвета, хорошо растворимые в воде. Содержание 20-гидроксиэкдизона составляет 20 мг на 1 г сухого экстракта (концентрата). Потери 20-гидроксиэкдизона в процессе обогащения экстракта составляют не более 5%. Продукт не содержит оксалатов.Example 1. The leaves of spinach are crushed and water extraction is carried out at a ratio of water / leaves of spinach 40: 1 in the range of temperature 40-90 ° C for 10-90 minutes Separation is carried out by centrifugation for 15 minutes at a speed of 2000 rpm with the rejection of sediment. The removal of suspended and colloidal particles from the extract is carried out by ultrafiltration on a Minitan installation (Millipore, USA) in a tangential flow using membranes with a pore diameter of 10 kD at room temperature. The resulting high molecular weight fraction is discarded. The low molecular weight fraction is passed through a layer of sorbent "Diasorb-100 C ₁₆ " (CJSC "BioChemMac") at a ratio of sorbent: fraction 7: 1, followed by twice washing the sorbent with distilled water to remove oxalates. The desorption of ecdysteroids with related substances is carried out with a 70% solution of ethyl alcohol at a sorbent: solvent ratio of 1:10. The solvent is distilled off under vacuum, and the final product is dried on a freeze dryer. The final enriched concentrate is light beige flakes that are highly soluble in water. The content of 20-hydroxyecdysone is 20 mg per 1 g of dry extract (concentrate). Losses of 20-hydroxyecdysone during the enrichment of the extract are not more than 5%. The product does not contain oxalates.

Пример 2. Экстракцию листьев шпината водой и ультрафильтрацию водного экстракта проводят, как в примере 1. Далее 30 мл низкомолекулярной фракции встряхивают 30 минут, добавляют 4,0 г сорбента «Диасорб-100 C₁₆» и инкубируют 1 час при встряхивании. Сорбент отделяют от водного экстракта центрифугированием. Супернатант №1 декантируют и отбрасывают. Сорбент дважды промывают дистиллированной водой. Далее к сорбенту добавляют 40 мл 70%-ного этанола и встряхивают 1 час. Сорбент отделяют от супернатанта №2 центрифугированием. Сорбент повторно промывают 70%-ным этанолом. Отделяют сорбент, собирают супернатант №3 и объединяют его с супернатантом №2. Растворитель удаляют под вакуумом на роторном испарителе при 60°С и проводят лиофильную сушку конечного обогащенного концентрата. Содержание 20-гидроксиэкдизона составляет 15 мг на 1 г сухого экстракта (концентрата). Продукт не содержит оксалатов.Example 2. Extraction of spinach leaves with water and ultrafiltration of the aqueous extract is carried out as in Example 1. Next, 30 ml of the low molecular weight fraction are shaken for 30 minutes, 4.0 g of Diasorb-100 C ₁₆ sorbent are added and incubated for 1 hour with shaking. The sorbent is separated from the aqueous extract by centrifugation. Supernatant No. 1 is decanted and discarded. The sorbent is washed twice with distilled water. Next, 40 ml of 70% ethanol is added to the sorbent and shaken for 1 hour. The sorbent is separated from supernatant No. 2 by centrifugation. The sorbent is repeatedly washed with 70% ethanol. Separate the sorbent, collect supernatant No. 3 and combine it with supernatant No. 2. The solvent is removed under vacuum on a rotary evaporator at 60 ° C and freeze drying of the final concentrated concentrate is carried out. The content of 20-hydroxyecdysone is 15 mg per 1 g of dry extract (concentrate). The product does not contain oxalates.

Пример 3. Продукт получают по примеру 1 до стадии высушивания продукта. Далее растворитель отгоняют до образования густого экстракта, и продукт применяют в жидком виде.Example 3. The product is obtained according to example 1 to the stage of drying the product. Next, the solvent is distilled off to form a thick extract, and the product is used in liquid form.

Пример 4. Продукт получают по примеру 2 до стадии высушивания продукта. Далее растворитель отгоняют до образования густого экстракта, и продукт применяют в жидком виде.Example 4. The product is obtained according to example 2 to the stage of drying the product. Next, the solvent is distilled off to form a thick extract, and the product is used in liquid form.

Оборудование и условия проведения анализа 20-гидроксиэкдизона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Колонка Luna С18 (250*4.6 мм), 5 мкм с форколонкой; скорость элюирования 0,75 мл/мин; ультрафиолетовый проточный детектор UV/VIS 151, длина волны 254 нм; Элюент А - 20% ацетонитрил, Элюент В - 60% ацетонитрил; линейный градиент В от 0 до 50% за 25 минут. Сухой образец растворяют в 50%-ном этиловом спирте в течение 1 часа на лабораторном встряхивателе, затем помещают в ультразвуковую ванну на 15 минут и отфильтровывают через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего вводят в колонку хроматографа.Equipment and conditions for the analysis of 20-hydroxyecdysone by high performance liquid chromatography: Luna C18 column (250 * 4.6 mm), 5 μm with a forcolumn; the elution rate of 0.75 ml / min; ultraviolet flow detector UV / VIS 151, wavelength 254 nm; Eluent A - 20% acetonitrile; Eluent B - 60% acetonitrile; linear gradient B from 0 to 50% in 25 minutes. The dry sample is dissolved in 50% ethanol for 1 hour on a laboratory shaker, then placed in an ultrasonic bath for 15 minutes and filtered through a syringe filter with a pore diameter of 0.22 μm, and then introduced into the column of the chromatograph.

Пример применения. Влияние экстракта (концентрата экдистероидов) на биомаркеры общего адаптационного синдрома (ОАО) у крыс после стрессорного воздействия. Стрессорное воздействие моделировали электрокожным раздражением током 0,4 мА в течение 8 секунд на лапы крыс линии Вистар. Крысы опытных групп получали ежесуточно в индивидуальных поилках водный раствор экстракта из расчета 2 мг 20-гидроксиэкдизона (суммарно) на 1 кг массы тела крысы в течение 30 дней (эксперимент 1) и 5 мг 20-гидроксиэкдиона в течение 15 дней (эксперимент 2). Животные контрольной группы получали в течение всех экспериментов воду. Стрессорное воздействие проводилось в предпоследние дни экспериментов.Application example. The effect of the extract (ecdysteroid concentrate) on the biomarkers of the general adaptation syndrome (JSC) in rats after stress exposure. The stress effect was simulated by electrodermal stimulation with a current of 0.4 mA for 8 seconds on the paws of Wistar rats. The rats of the experimental groups received daily in individual drinkers an aqueous solution of the extract at the rate of 2 mg of 20-hydroxyecdysone (total) per 1 kg of rat body weight for 30 days (experiment 1) and 5 mg of 20-hydroxyecdion for 15 days (experiment 2). Animals of the control group received water during all experiments. Stressful effects were carried out in the penultimate days of the experiments.

При использованной в эксперименте 1 низкой дозировки экстракта не было выявлено достоверных различий содержания в плазме крови биомаркеров центральной стресс-системы и стресс-лимитирующих систем: кортикостерона, β-эндорфина, норадреналина и простагландина Е2 (таблица 1).When the extract was used in experiment 1 at a low dosage, no significant differences were found in the plasma content of biomarkers of the central stress system and stress-limiting systems: corticosterone, β-endorphin, norepinephrine, and prostaglandin E2 (table 1).

Однако произошло достоверное увеличение массы тимуса на 18% (таблица 2) и снижение активности апоптоза на 7% для степени ДНК повреждений и на 24% для индекса апоптоза в этом органе по сравнению со стрессированными крысами контрольной группы (рис. 1).However, there was a significant increase in thymus mass by 18% (Table 2) and a decrease in apoptosis activity by 7% for the degree of DNA damage and by 24% for the apoptosis index in this organ compared to stressed rats in the control group (Fig. 1).

Потребление обогащенного экстракта даже в весьма низкой дозировке (2 мг/кг), не влияя на уровень биохимических маркеров в крови, оказало адаптогенное действие, снижая активность апоптоза в клетках этого органа у стрессированных животных.The consumption of the enriched extract even in a very low dosage (2 mg / kg), without affecting the level of biochemical markers in the blood, had an adaptogenic effect, reducing the activity of apoptosis in the cells of this organ in stressed animals.

В отличие от низкой дозировки ежесуточное потребление экстракта в дозе 5 мг 20-гидроксиэкдизона на 1 кг массы тела в течение 15 дней (эксперимент 2) достоверно снижало экскрецию с мочой кортикостерона более чем в 2,5 раза и норадреналина в 1,9 раз (таблица 3).In contrast to the low dosage, the daily intake of the extract at a dose of 5 mg of 20-hydroxyecdysone per 1 kg of body weight for 15 days (experiment 2) significantly reduced urinary excretion of corticosterone by more than 2.5 times and norepinephrine by 1.9 times (table 3).

Таким образом, потребление экстракта ограничивает напряженность протекания у животных общего адаптационного синдрома, вызываемого электрокожным раздражением. В зависимости от дозировки экстракта показателями его стресс-протекторного действия были или снижение экскреции с мочой основных медиаторов стресса-кортикостерона и норадреналина или активности апоптоза в тимусе. При этом потребление экстракта в дозах 2-5 мг 20-гидроксиэкдизона на кг массы тела не оказывало неблагоприятного воздействия на ростовые показатели крыс в экспериментах продолжительностью 15-30 суток.Thus, the consumption of the extract limits the tension in the animals of the general adaptation syndrome caused by electrodermal irritation. Depending on the dosage of the extract, indicators of its stress-protective effect were either a decrease in urine excretion of the main mediators of stress-corticosterone and norepinephrine or the activity of apoptosis in the thymus. Moreover, the consumption of the extract in doses of 2-5 mg of 20-hydroxyecdysone per kg of body weight did not adversely affect the growth parameters of rats in experiments lasting 15-30 days.

Claims (1)

Экстракт из листьев шпината, содержащий в сухом или жидком виде концентрат биологически активных веществ, отличающийся тем, что концентрат обогащен 20-гидроксиэкдизоном в количестве от 1 до 20 мг на 1 г сухого вещества, не содержит оксалатов и получен путем водной экстракции листьев шпината при соотношении вода:листья 40:1 при температуре 40-90°С в течение 10-90 мин и центрифугирования, дальнейшей ультрафильтрации экстракта при комнатной температуре с последующей твердофазной экстракцией фитоэкдистероидов с использованием гидрофобных сорбентов путем пропускания низкомолекулярной фракции через сорбент при соотношении сорбент:фракция 7:1 или добавления сорбента в низкомолекулярную фракцию при соотношении сорбент:фракция 1:7,5 и инкубирования в течение 1 часа, далее сорбент промывают водой и проводят десорбцию фитоэкдистероидов.An extract from spinach leaves, containing a dry or liquid concentrate of biologically active substances, characterized in that the concentrate is enriched with 20-hydroxyecdysone in an amount of 1 to 20 mg per 1 g of dry matter, does not contain oxalates and is obtained by aqueous extraction of spinach leaves at a ratio water: leaves 40: 1 at a temperature of 40-90 ° C for 10-90 min and centrifugation, further ultrafiltration of the extract at room temperature, followed by solid-phase extraction of phytoecdysteroids using hydrophobic sorbents by passing a low molecular weight fraction through a sorbent at a sorbent: fraction ratio of 7: 1 or adding a sorbent to a low molecular weight fraction at a sorbent: fraction ratio of 1: 7.5 and incubating for 1 hour, then the sorbent is washed with water and phytoecdysteroids are desorbed.

Images