RU2627448C1 - Method of immunohistochemical antigens detection in preparations of productive and non-productive animals organs of long-term storage in fixtures - Google Patents
Method of immunohistochemical antigens detection in preparations of productive and non-productive animals organs of long-term storage in fixtures Download PDFInfo
- Publication number
- RU2627448C1 RU2627448C1 RU2016113045A RU2016113045A RU2627448C1 RU 2627448 C1 RU2627448 C1 RU 2627448C1 RU 2016113045 A RU2016113045 A RU 2016113045A RU 2016113045 A RU2016113045 A RU 2016113045A RU 2627448 C1 RU2627448 C1 RU 2627448C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- minutes
- sections
- distilled water
- buffer
- slices
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области иммуногистохимии, в частности к способу иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах, и может быть использовано для детекции субпопуляции клеток с помощью мультимерной безбиотиновой системы детекции путем окрашивания гистологических срезов тканей или органов на специфические антигены.The invention relates to the field of immunohistochemistry, in particular to a method for immunohistochemical detection of antigens in the preparations of organs of productive and unproductive animals of long-term storage in fixatives, and can be used to detect a subpopulation of cells using a multimeric bebi-free detection system by staining histological sections of tissues or organs for specific antigens.
Уровень техникиState of the art
Известен классический способ иммуногистохимического выявления антигенов, заключающийся в использовании специальных предметных стекол покрытых адгезивом «Поли-L-лизин», депарафинизации и регидратации препаратов обычным способом, путем перемещения предметных стекол по рабочим растворам: (ксилол 5 мин, ксилол 5 мин, спирт 96° 5 мин, спирт 96° 3 мин, спирт 70° 3 мин, промыть в дистиллированной воде), инкубировать при комнатной температуре в 0,3% растворе перекиси водорода (Hydrogen Peroxide Block) в течение 10 минут, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, провести тепловую демаскировку антигенов в цитратном буфере (рН 6.0), в микроволновой печи при высокой мощности (чтобы не было кипения) в течение 10 минут, охладить стекла в микроволновой печи в течение 20 минут, промыть стекла в водопроводной воде 1 минуту, затем промыть в PBS (Tween 20х) буфере дважды по 3 минуты, внести фосфатный буфер (Protein Block (рН 7,6) содержащий 0,5% БСА (бычья сыворотка) и 0,5% казеина), инкубировать 10 минут при комнатной температуре, стряхнуть излишки раствора, нанести на стекла первичное антитело и инкубировать при комнатной температуре 30 минут, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, нанести вторичные антитела (Complement №1 (кролик-анти-мышь) или (HRP Conjugate №2 (козьи-антикроличьи) меченные HRP), инкубировать 10 минут при комнатной температуре, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, добавить вторичное антитело, инкубировать при комнатной температуре 15 минут, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, сделать раствор из DAB Substrate (1 мл) и DAB Chromogen (20 мкл), добавить раствор хромогена, инкубировать при комнатной температуре 5 мин, промыть стекла в PBS (Tween 20х) буфере, провести контрастирующую подкраску гематоксилином (если требуется) в течение 1 минуты, промыть водопроводной водой, промыть в 2 сменах 96° спирта перенести в ксилол на 5 минут и заключить препарат под покровное стекло (см. Методики фирм изготовителей, вложенные в наборы антител и буферов и мультимерных наборов для визуализации (см. REVEAL BIOTIN-FREE POLYVALENT DAB; Spring Bioscience (США), www.springbio.com, дата производства 2013 г.).A classic method of immunohistochemical detection of antigens is known, which consists in the use of special slides coated with Poly-L-lysine adhesive, dewaxing and rehydration of drugs in the usual way by moving the slides through working solutions: (xylene 5 min, xylene 5 min, alcohol 96 ° 5 min, alcohol 96 ° 3 min, alcohol 70 ° 3 min, rinse with distilled water), incubate at room temperature in 0.3% hydrogen peroxide solution (Hydrogen Peroxide Block) for 10 minutes, rinse the glass in PBS (Tween 20x a) buffer, hold those fishing antigens in citrate buffer (pH 6.0), in a microwave oven at high power (to prevent boiling) for 10 minutes, cool the glass in the microwave for 20 minutes, rinse the glass in tap water for 1 minute, then rinse in PBS (Tween 20x) buffer twice for 3 minutes, add phosphate buffer (Protein Block (pH 7.6) containing 0.5% BSA (bovine serum) and 0.5% casein), incubate for 10 minutes at room temperature, shake off excess solution , apply the primary antibody to the glass and incubate at room temperature for 30 minutes, etc. wash the glass in PBS (Tween 20x) buffer, apply secondary antibodies (Complement No. 1 (rabbit anti-mouse) or (HRP Conjugate No. 2 (goat anti-rabbit) labeled HRP), incubate for 10 minutes at room temperature, rinse the glass in PBS (Tween 20x) buffer, add a secondary antibody, incubate at room temperature for 15 minutes, rinse the glass in PBS (Tween 20x) buffer, make a solution of DAB Substrate (1 ml) and DAB Chromogen (20 μl), add chromogen solution, incubate at room temperature for 5 min, rinse the glass in PBS (Tween 20x) buffer, carry out a contrasting tint with hematoxylin (if beats) for 1 minute, rinse with tap water, rinse in 2 shifts of 96 ° alcohol, transfer to xylene for 5 minutes and wrap the drug under a coverslip (see Manufacturer's methodologies embedded in antibody and buffer sets and multimeric imaging kits (see REVEAL BIOTIN-FREE POLYVALENT DAB; Spring Bioscience (USA), www.springbio.com, production date 2013).
Способ имеет ряд недостатков: антитела предназначены только для исследований биоптатов взятых от человека и фиксация материала должна проводиться не более 48 часов.The method has several disadvantages: antibodies are intended only for the study of biopsy samples taken from humans and the fixation of the material should be carried out no more than 48 hours.
Известна группа изобретений относящихся к области иммунологии и медицины и касается способа выявления аутоиммунного ответа против белка 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы, способа диагностики миопатии, а также способа определения целесообразности продолжения терапии статинами у субъекта, включающих выявление аутоантитела, распознающего указанный белок. Предложен также набор для диагностики миопатии. Группа изобретений обеспечивает возможность определить и выявить аутоантитела у субъекта с мышечной болью и слабостью, при этом выявляется необходимость прекращения терапии статинами и необходимость начала иммуносупрессивной терапии (см. патент RU 2574932, МПК51 G01N 33/573).A known group of inventions related to the field of immunology and medicine relates to a method for detecting an autoimmune response against a 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A-reductase protein, a method for diagnosing myopathy, as well as a method for determining the appropriateness of continuing statin therapy in a subject, including the detection of an autoantibody recognizing specified protein. A kit for the diagnosis of myopathy is also proposed. The group of inventions provides the ability to identify and identify autoantibodies in a subject with muscle pain and weakness, while the need for stopping statin therapy and the need for immunosuppressive therapy is identified (see patent RU 2574932, IPC 51 G01N 33/573).
Недостатком группы изобретений является исследование биоптатов взятых только от человека.A disadvantage of the group of inventions is the study of biopsy samples taken only from humans.
Известен способ иммуногистохимического выявления цитоархитектоники эндокринной части поджелудочной железы от 10 хищных птиц (беркута, сокола-сапсана, балобана, Турецкого стервятника, красного ястреба). Было выделено три типа островков: тип смешанных островков, состоящих, в основном из глюкагон (А)-секретирующих клеток. Тип "В" смешанных островков с преимущественным содержанием инсулин (В)-секретирующих клеток и типа М смешанных островков (Тип М), состоящих из разного количества глюкагон, инсулин и соматостатин (D)-секретирующих клеток. Последние были далее охарактеризованы в тип I, II или III в соответствии с распределением клеток трех типов клеток. А и D клеток были также беспорядочно разбросанные в экзокринной части поджелудочной железы.A known method of immunohistochemical detection of cytoarchitectonics of the endocrine pancreas from 10 birds of prey (golden eagle, peregrine Falcon, Saker Falcon, Turkish vulture, red hawk). Three types of islets were distinguished: the type of mixed islets, consisting mainly of glucagon (A) -secreting cells. Type “B” mixed islets with a predominant content of insulin (B) -secreting cells and type M mixed islets (Type M), consisting of different amounts of glucagon, insulin and somatostatin (D) -secreting cells. The latter were further characterized in type I, II or III in accordance with the distribution of cells of the three cell types. A and D cells were also randomly scattered in the exocrine part of the pancreas.
Результаты этого исследования позволяют предположить, что классическая концепция распределения у птиц островков, содержащих или А или В клеток - это не применимо у хищных птиц, и показывает отклонения у них в развитии механизмов эволюционной адаптации к пищевым привычкам (см. AN IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF THE ENDOCRINE PANCREAS IN RAPTORS / Palmieri C, Shivaprasad H.L. // Res Vet Sci. 2014 Dec; 97(3):58791. DOI: 10.1016/j.rvsc.2014.10.011. Epub 2014 Nov 4).The results of this study suggest that the classical concept of the distribution of birds of islands containing either A or B cells is not applicable to birds of prey, and shows deviations in their development of mechanisms of evolutionary adaptation to eating habits (see AN IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF THE ENDOCRINE PANCREAS IN RAPTORS / Palmieri C, Shivaprasad HL // Res Vet Sci. 2014 Dec; 97 (3): 58791. DOI: 10.1016 / j.rvsc.2014.10.10.011. Epub 2014 Nov 4).
Недостатком данного способа является то, что антитела предназначены только для исследований биоптатов взятых от птиц.The disadvantage of this method is that the antibodies are intended only for the study of biopsy samples taken from birds.
Известен способ изучения закономерностей распределения панкреатических островков в поджелудочной железе от четырех видов животных (крыс, собак, свиней и обезьяны), а также, выявление иммуногистохимических клеток панкреатических островков различных типов, их характеристики и количества, при этом гистологическое исследование проводят на срезах окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование с использованием поликлональных антител кролика (рАb) против инсулина, глюкагона, панкреатического полипептид (РР), соматостатина, хромогранина, кератина, бомбезина и гастрина, и мышиные моноклональные антитела (mAb) против синаптофизина, Leu-7 и на пролиферирующий ядерный антиген (PCNA) с использованием кроличьих антител в иммунопероксидазной (РАР) и стрептавидин/пероксидазой (StreptABC/HRP) реакций. Положительные иммуногистохимические реакции наблюдались в панкреатических островках всех видов животных со всеми антителами, за исключением анти-бомбезина и анти-гастрина. Наши результаты показали, что: 1) у каждого вида отмечается видовое структурное строение островков в поджелудочной железе, 2) каждый вид представляет собой характерное распределение клеток, продуцирующих различные гормоны. 3) иммунореактивность иммуногистохимических маркеров варьирует между видами и/или возрастом.A known method of studying the patterns of distribution of pancreatic islets in the pancreas from four species of animals (rats, dogs, pigs and monkeys), as well as the identification of immunohistochemical cells of pancreatic islets of various types, their characteristics and numbers, while histological examination is carried out on sections stained with hematoxylin and eosin. An immunohistochemical study using rabbit polyclonal antibodies (pAb) against insulin, glucagon, pancreatic polypeptide (PP), somatostatin, chromogranin, keratin, bombesin and gastrin, and mouse monoclonal antibodies (mAb) against synaptophysin, Leu-7 and proliferating antigen PCNA) using rabbit antibodies in immunoperoxidase (PAP) and streptavidin / peroxidase (StreptABC / HRP) reactions. Positive immunohistochemical reactions were observed in pancreatic islets of all animal species with all antibodies, with the exception of anti-bombesin and anti-gastrin. Our results showed that: 1) each species has a specific structural structure of the islands in the pancreas, 2) each species represents a characteristic distribution of cells that produce various hormones. 3) immunoreactivity of immunohistochemical markers varies between species and / or age.
Сравнительное иммуногистохимическое исследование полезно для ответов на вопросы, которые важны для понимания механизмов которые регулируют интегрированные функции эндокринной части поджелудочной железы (см. A comparative immunohistochemical study of pancreatic islets in laboratory animals (rats, dogs, minipigs, nonhuman primates / Wieczorek G, Pospischil A, Perentes E. // Exp Toxicol Pathol. 1998 Jim; 50(3): 151-72).A comparative immunohistochemical study of pancreatic islets in laboratory animals (rats, dogs, minipigs, nonhuman primates / Wieczorek G, Pospischil A is useful for answering questions that are important for understanding the mechanisms that regulate the integrated functions of the endocrine pancreas). Perentes E. // Exp Toxicol Pathol. 1998 Jim; 50 (3): 151-72).
Способ имеет ряд недостатков: антитела предназначены только для исследований биоптатов взятых от лабораторных животных и фиксация материала должна проводиться не более 48 часов.The method has several disadvantages: antibodies are intended only for the study of biopsy samples taken from laboratory animals and the fixation of the material should be carried out no more than 48 hours.
Известен также способ селективного выявления микроглии в препаратах головного мозга кроликов, включающий использование стрептавидина. Способ заключается в депарафинизации и регидратации препаратов обычным методом, затем промывают стекла в течение 5 минут в дистиллированной воде и проводят тепловое демаскирование антигенов в модифицированном цитратном буфере. Эту обработку осуществляют в пароварке или в сосуде Хелендахела в течение 25 минут, или применяют другие приборы - автоклав, скороварку, микроволновую печь, водяную баню - изменив сроки инкубации в растворе в зависимости от типа использованного прибора. Охлаждают стекла в остывающем буфере в течение 15-20 минут. Остывшие предметные стекла промывают дистиллированной водой для удаления остатков буфера и помещают в стаканчик с 3% перекисью водорода на 5-10 минут для блокировки эндогенной пероксидазы, удаляют из срезов перекись водорода путем промывки в дистиллированной воде, после чего предметные стекла переносят в 0,01 М фосфатно-солевой буфер на 5-7 минут. Создают гидрофобный барьер вокруг срезов для препятствия растекания реагентов по всему предметному стеклу и уменьшения объема используемых в дальнейшем дорогостоящих реагентов. Для этого необходимо аккуратно промокнуть стекло вокруг срезов фильтровальной бумагой (для образования сухого поля) и обвести область расположения срезов гидрофобным фломастером. Сразу после этого, не допуская подсыхания срезов, на них нанести необходимое количество (100-200 мкл.) блокировочного раствора - 5% раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ и оставить при комнатной температуре на 10 минут. Удалить излишек блокировочного раствора без промывки, нанести на срезы необходимое количество поликлональных козьих антител к белку Iba-1 (разведение 1:200). После этого поместить стекла во «влажные камеры» (можно использовать любые пластиковые коробки с крышками, например чашки Петри, на дно которых положить влажную фильтровальную бумагу и стеклянные палочки) и оставить в термостате при 27°С на 12-14 часов или на ночь. На этом завершается обработка препаратов в 1-й день, что занимает около 2-3 часов (в зависимости от числа одновременно обрабатываемых препаратов). На следующий день обработку препаратов начинают с извлечения контейнеров из термостата. Далее необходимо смыть антитела промывочным буфером и поместить стекла в стаканчик с аналогичным буфером на 5-7 минут. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество вторичных антикозьих биотинилированных антител (разведение 1:200) и поставить в термостат при 27°С на 60 минут. Смыть вторичные антитела промывочным буфером и поместить стекла в стаканчик с ФСБ на 5-7 минут. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов, нанести на срезы необходимое количество стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой и поставить в термостат при 27°С на 30 минут, затем смыть конъюгат стрептавидина промывочным буфером и поместить стекла в стаканчик с одним из этих буферов на 5-7 минут. Аккуратно промокнув фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов, нанести необходимое количество рабочего раствора 3,3-диаминобензидина. В течение 1-3 минут происходит образование окрашенного продукта гистохимической реакции (этот процесс желательно контролировать под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фона). Смыть раствор хромогена и промыть препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 3-5 минут в каждой. При необходимости препараты можно докрасить гематоксилином Майера в течение 0,5 минут с подсинением в щелочной воде (1 капля 10% аммиака на 100 мл дистиллированной воды). Обезводить препараты в этаноле восходящей крепости, просветлить в ксилоле обычным образом и заключить в полистирол (пермаунт) (см. Выявление микроглии в препаратах головного мозга, длительное время хранившихся в растворе формалина / Е.Г. Сухорукова, М.С. Захряпин, Н.М. Аничков, Д.Э. Коржевский // Морфология. 2012. Т. 142. №5. С. 68-70.).There is also known a method for the selective detection of microglia in preparations of the brain of rabbits, including the use of streptavidin. The method consists in the dewaxing and rehydration of drugs in the usual way, then the glasses are washed for 5 minutes in distilled water and the antigens are thermally unmasked in a modified citrate buffer. This treatment is carried out in a double boiler or in a Helendachel vessel for 25 minutes, or other devices are used - an autoclave, pressure cooker, microwave, water bath - changing the incubation time in the solution depending on the type of device used. Cool the glass in a cooling buffer for 15-20 minutes. The cooled glass slides are washed with distilled water to remove buffer residues and placed in a glass with 3% hydrogen peroxide for 5-10 minutes to block endogenous peroxidase, hydrogen peroxide is removed from the sections by washing in distilled water, after which the glass slides are transferred to 0.01 M phosphate-buffered saline for 5-7 minutes. A hydrophobic barrier is created around the sections to prevent the spread of reagents throughout the slide and reduce the amount of expensive reagents used in the future. To do this, gently blot the glass around the sections with filter paper (to form a dry field) and circle the area of the sections with a hydrophobic felt-tip pen. Immediately after this, preventing the sections from drying out, apply the necessary amount (100-200 μl) of the blocking solution - 5% bovine serum albumin solution to FSB on them and leave them at room temperature for 10 minutes. Remove excess blocking solution without washing, apply the required amount of polyclonal goat antibodies to Iba-1 protein to the sections (dilution 1: 200). After that, place the glasses in the “wet chambers” (you can use any plastic boxes with lids, for example Petri dishes, on the bottom of which you can put wet filter paper and glass sticks) and leave them in the thermostat at 27 ° C for 12-14 hours or overnight. This completes the processing of drugs on the 1st day, which takes about 2-3 hours (depending on the number of simultaneously processed drugs). The next day, the treatment of drugs begins with the extraction of containers from the thermostat. Next, it is necessary to wash off the antibodies with wash buffer and place the glass in a glass with the same buffer for 5-7 minutes. Gently wetting the glass around the sections with filter paper, apply the required amount of secondary anti-goat biotinylated antibodies to the sections (dilution 1: 200) and place in a thermostat at 27 ° C for 60 minutes. Rinse the secondary antibodies with wash buffer and place the glass in a glass with FSB for 5-7 minutes. Having gently patted the glass around the sections with filter paper, apply the required amount of streptavidin conjugated with peroxidase to the sections and put in a thermostat at 27 ° С for 30 minutes, then rinse the streptavidin conjugate with washing buffer and place the glasses in a glass with one of these buffers for 5-7 minutes. Gently wetting the glass slide around the sections with filter paper, apply the required amount of a working solution of 3,3-diaminobenzidine. Within 1-3 minutes, a colored product of the histochemical reaction is formed (it is desirable to control this process under a microscope to stop the reaction until a non-specific background appears). Rinse the chromogen solution and rinse the preparations in 2-3 portions of distilled water for 3-5 minutes each. If necessary, the preparations can be stained with Mayer hematoxylin for 0.5 minutes with blueing in alkaline water (1 drop of 10% ammonia per 100 ml of distilled water). Dehydrate preparations in ethanol of an ascending strength, enlighten in xylene in the usual way and enclose in polystyrene (permount) (see Detection of microglia in brain preparations stored for a long time in formalin solution / E.G. Sukhorukova, M.S. Zakhryapin, N. M. Anichkov, D.E. Korzhevsky // Morphology. 2012.V. 142. No. 5. P. 68-70.).
Данный способ позволяет селективно выявлять микроглию в препаратах головного мозга только лабораторных животных (кроликов), находившихся в растворе формалина свыше 2 месяцев.This method allows you to selectively detect microglia in brain preparations of only laboratory animals (rabbits) that have been in formalin solution for more than 2 months.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип, является способ окрашивания срезов, включающий проведение иммуногистохимических реакций, причем депарафинированные и регидратированные срезы обрабатывают 3% раствором Н2О2 в течение 10-12 мин. для блокирования эндогенной пероксидазы, затем срезы подвергают высокотемпературной обработке в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) в течение 40-45 мин. Инкубацию срезов с первичными антителами на C-kit(CD117), a-SMA, инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид проводят во влажной камере при температуре 27°С в течение 24-26 часов. Со вторыми козьими антителами инкубацию проводят в течение 60 минут во влажной камере при температуре 27°С, после инкубации применяют высокочувствительную систему визуализации Reveal biotin-free polyvalent DAB (SpringBioScience, США). Микроскопию срезов проводят на световом микроскопе Olympus ВХ45 со встроенным фотоаппаратом (см. Цитоархитектоника эндокриноцитов поджелудочной железы крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе / О.В. Дилекова // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №3. - с. 542; C-KIT/SCF-R эндокриноцитов поджелудочной железы крупного рогатого скота / О.В. Дилекова // Вестник АПК. - 2015. - №1 - с. 29-33).The closest in technical essence and the achieved positive effect and adopted by the authors for the prototype is a method for staining sections, including immunohistochemical reactions, and dewaxed and rehydrated sections are treated with a 3% solution of H 2 O 2 for 10-12 minutes to block endogenous peroxidase, then the sections are subjected to high temperature treatment in 0.01 M citrate buffer (pH 6.0) for 40-45 minutes Incubation of sections with primary antibodies on a C-kit (CD117), a-SMA, insulin, glucagon, somatostatin and pancreatic polypeptide is carried out in a humid chamber at a temperature of 27 ° C for 24-26 hours. With the second goat antibodies, the incubation is carried out for 60 minutes in a humid chamber at a temperature of 27 ° C, after the incubation, a highly sensitive Reveal biotin-free polyvalent DAB imaging system is used (SpringBioScience, USA). Microscopy of sections was carried out using an Olympus BX45 light microscope with an integrated camera (see Cytoarchitectonics of endocrinocytes of cattle pancreas in postnatal ontogenesis / OV Dilekova // Modern problems of science and education. - 2015. - No. 3. - p. 542; C-KIT / SCF-R of endocrinocytes of the pancreas of cattle / OV Dilekova // Vestnik APK. - 2015. - No. 1 - p. 29-33).
Недостатком данного способа является выявление и изучение антигенов в материале полученного только от крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе.The disadvantage of this method is the identification and study of antigens in the material obtained only from cattle in postnatal ontogenesis.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах путем проведения иммуногистохимического окрашивания гистологических срезов, полученных от крупного рогатого скота, мелкого рогатого скота, свиней, собак и кошек из материала стандартного размера (1 см3) который фиксируется в формалине от 1 года до 2 лет, обладающего качеством выявления антигенов.The objective of the invention is to develop a method for immunohistochemical detection of antigens in the preparations of organs of productive and unproductive animals of long-term storage in fixatives by immunohistochemical staining of histological sections obtained from cattle, small cattle, pigs, dogs and cats from standard size material (1 cm 3 ) which is fixed in formalin from 1 year to 2 years, with the quality of detection of antigens.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к высокому качеству выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения.The technical result that can be obtained using the present invention is reduced to the high quality of detection of antigens in the preparations of organs of productive and unproductive animals of long-term storage.
Технический результат достигается с помощью способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах, включающий обработку поверхности предметного стекла для наклеивания срезов адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1, депарафинирование и регидратацию срезов, обработку 3% аптечной Н2О2 в течение 10 минут, инкубирование стекол в 0,01 М цитратном буфере при рН 6,0 для демаскировки антигенов в пароварке в течение 40-45 минут, инкубирование стекол со срезами с первичными антителами во «влажной камере» при температуре 27°С в течение 24 часов, со вторичными антителами инкубирование проводят в течении 60 минут во «влажной камере» при температуре 27°С, после чего применяют высокочувствительную систему визуализации Reveal biotin-free polyvalent DAB, микроскопию срезов проводят на световом микроскопе со встроенным фотоаппаратом, при этом после депарафинизации и регидратации, срезы опускают на 5 минут в чистую емкость с дистиллированной водой, затем срезы помещают в Н2O2 на 10-12 минут, после работы пароварки, содержащей цитратный буфер в течение 40-45 минут, при этом стекла из пароварки не вынимают в течение 20 минут после прекращения ее работы, после этого промывают срезы дистиллированной водой, затем помещают в буфер (Твин 20х), далее для образования сухого поля срезы промакивают одноразовыми бумажными полотенцами, причем делают гидрофобный слой специальными маркерами, далее наносят блокировочный раствор, в качестве которого используют 5% бычий сывороточный альбумин, на 10-12 минут, при этом не допуская подсыхания, наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24-26 часов во «влажной камере», через 14-15 часов смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5-7 минут, при этом срезы промакивают одноразовыми полотенцами, далее на срезы наносят вторичные антитела и ставят в термостат на 1-2 часа во «влажной камере» при температуре 27°С, далее смывают вторичные антитела, при этом используют хромоген на безбиотиновой системе детекции, и окрашивают в течение 3 минут, смывают хромоген в трех порциях дистиллированной воды по 5-7 минут, докрашивают срезы гематоксилином Майера 5-7 минут, далее ополаскивают стекла в дистиллированной воде и опускают в щелочную воду на 10-15 секунд.The technical result is achieved using the method of immunohistochemical detection of antigens in the preparations of organs of productive and unproductive animals of long-term storage in fixatives, including surface treatment of a glass slide for gluing slices with adhesive based on egg protein and glycerol in a ratio of 2: 1, dewaxing and rehydration of slices, processing 3% pharmacy Н 2 О 2 for 10 minutes, incubation of glasses in 0.01 M citrate buffer at pH 6.0 to unmask antigens in a double boiler for 40-45 minutes, incubating glass with sections with primary antibodies in a “wet chamber” at a temperature of 27 ° C for 24 hours, incubation with secondary antibodies is carried out for 60 minutes in a “wet chamber” at a temperature of 27 ° C, after which a highly sensitive Reveal biotin imaging system is used -free polyvalent DAB, the microscopy of the slices is carried out under a light microscope with an integrated camera, and after dewaxing and rehydration, the slices are lowered for 5 minutes in a clean container with distilled water, then the slices are placed in H 2 O 2 for 10-12 minutes, after bots of a double boiler containing citrate buffer for 40-45 minutes, while the glass from the double boiler is not removed for 20 minutes after it stops working, then the sections are washed with distilled water, then placed in a buffer (Tween 20x), then to form a dry field the sections are blotted with disposable paper towels, and the hydrophobic layer is made with special markers, then a blocking solution is applied, which is used as 5% bovine serum albumin for 10-12 minutes, while not allowing drying, apply primary antibodies and put in a thermostat at 27 ° C for 24-26 hours in a "wet chamber", after 14-15 hours, wash off the primary antibodies with buffer (Tween 20x) for 5-7 minutes, while the sections are blotted with disposable towels, then on the sections apply secondary antibodies and put in a thermostat for 1-2 hours in a "wet chamber" at a temperature of 27 ° C, then wash off the secondary antibodies, use a chromogen on a bezbiinny detection system, and stain for 3 minutes, wash off the chromogen in three portions of distilled water for 5-7 minutes, stained with hematoxylin sections om Mayer for 5-7 minutes, then rinse the glass in distilled water and lower it into alkaline water for 10-15 seconds.
Таким образом, технический результат достигается с помощью способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах и включающий покрытие предметных стекол адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1, депарафинизацию и регидратацию (обычным способом), ополаскивание в дистиллированной воде в течение 5 минут, инкубирование стекол в пароварке в цитратном буфере (рН 6,0) в течение 40-45 минут в стаканах из химического стекла, при этом, после прекращения работы пароварки стекла в ней оставляют для остывания на 20 минут, далее срезы промывают дистиллированной водой (2 смены) для смывания остатков буфера, помещают в 3% аптечную Н2O2 на 10-12 минут. Далее стекла промывают в дистиллированной воде и помещают в буфер (Твин 20х) на 10-12 минут. После буфера стекла вокруг срезов аккуратно промакивают одноразовыми бумажными полотенцами, делают вокруг срезов гидрофобный слой специальным маркером для иммуногистохимических исследований, не допуская подсыхания срезов и наносят на срезы блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10 минут, затем опять подсушивают одноразовыми бумажными полотенцами, наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24-26 часов. (Для того чтобы не подсыхали срезы, стекла укладываются на пластиковый планшет срезами вверх, и под стекла подкладывают смоченные дистиллированной водой одноразовые бумажные полотенца. Сверху планшет накрывают прозрачной пленкой вырезанной из скоросшивателя. Таким образом, жидкость не испаряется). На следующий день, через 14-15 часов смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут, промакивают одноразовыми бумажными полотенцами и наносят на срезы вторичные антитела и ставят в термостат при температуре 27°С на 1 час или на 1 час 15 минут. Затем смывают вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут, наносят на срезы безбиотиновую систему детекции с хромогеном на 3 минуты, после чего смывают хромоген в 3-х порциях дистиллированной воды по 5 минут каждая порция, докрашивают срезы гематоксилином Майера 5-7 минут, удаляют излишки красителя путем ополаскивания стекол в дистиллированной воде и опускают препараты в щелочную воду (1 мл ХЧ 100% аммиака на 300 мл воды) и ополаскивают в течение 10-15 секунд (до посинения срезов), после чего обезвоживают препараты в этаноле восходящей крепости, просветляют в карболксилоле в течение 5 минут, и в 2 сменах ксилола по 5 минут, после чего заключают в полистирол или другую синтетическую среду.Thus, the technical result is achieved using the method of immunohistochemical detection of antigens in the preparations of organs of productive and unproductive animals of long-term storage in fixatives and includes coating the slides with adhesive based on egg protein and glycerol in a ratio of 2: 1, dewaxing and rehydration (in the usual way), rinsing in distilled water for 5 minutes, incubation of the glasses in a double boiler in citrate buffer (pH 6.0) for 40-45 minutes in beakers made of chemical glass, while after the work of the double boiler is stopped, the glass in it is left to cool for 20 minutes, then the sections are washed with distilled water (2 shifts) to wash off the remaining buffer, placed in 3% pharmacy N 2 O 2 for 10-12 minutes. Next, the glasses are washed in distilled water and placed in a buffer (Tween 20x) for 10-12 minutes. After the buffer, the glass around the slices is carefully blotted with disposable paper towels, the hydrophobic layer is made around the slices with a special marker for immunohistochemical studies to prevent drying of the slices and a blocking solution is applied to the slices - 5% bovine serum albumin for 10 minutes, then again dried with disposable paper towels, applied primary antibodies and put in a thermostat at 27 ° C for 24-26 hours. (In order not to dry out the slices, the glasses are stacked upside down on the plastic tablet, and disposable paper towels moistened with distilled water are placed under the glasses. The top of the tablet is covered with a transparent film cut from the binder. Thus, the liquid does not evaporate). The next day, after 14-15 hours, wash the primary antibodies with buffer (Tween 20x) for 5 minutes, blot them with disposable paper towels and apply secondary antibodies to the sections and put in a thermostat at a temperature of 27 ° C for 1 hour or 1 hour and 15 minutes . Then, secondary antibodies are washed off with buffer (Tween 20x) for 5 minutes, the bezbiotic detection system with the chromogen is applied to the sections for 3 minutes, after which the chromogen is washed off in 3 portions of distilled water for 5 minutes each portion, the sections are stained with Mayer hematoxylin 5-7 minutes, excess dye is removed by rinsing the glasses in distilled water and the preparations are dipped in alkaline water (1 ml of 100% ammonia per 300 ml of water) and rinsed for 10-15 seconds (until the sections turn blue), then the preparations are dehydrated in ascending ethanol crepe spines, enlighten in carbolxylene for 5 minutes, and in 2 xylene shifts for 5 minutes, after which they are enclosed in polystyrene or other synthetic medium.
Сущность способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных, длительного хранения в фиксаторах, заключается в следующем.The essence of the method of immunohistochemical detection of antigens in the preparations of organs of productive and unproductive animals, long-term storage in fixatives, is as follows.
Проводят обработку поверхности предметного стекла для среза адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1 (для приклеивания срезов), депарафинизацию и регидратацию срезов, ополаскивание стекол со срезами в дистиллированной воде в течение 5 минут. Затем следует демаскировка антигенов в пароварке в цитратном буфере 40-45 минут в стаканах из химического стекла. После прекращения работы пароварки стекла из нее не вынимают 20 минут. Далее стекла со срезами промывают дистиллированной водой (для смывания остатков буфера) в 2-х сменах, помещают в 3% аптечную перекись водорода на 10-12 минут, после чего срезы промывают в дистиллированной воде и помещают в буфер (Твин 20х) на 10 минут. Затем вынимают стекла из буфера и вокруг срезов аккуратно промакивают стекло одноразовыми бумажными полотенцами и делают вокруг срезов гидрофобный слой специальным маркером для иммуногистохимических реакций. После этого, не допуская подсыхания срезов наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10 минут, затем опять подсушивают одноразовыми бумажными полотенцами и наносят первичные антитела, после чего ставят стекла в термостат при 27°С на 24-26 часов (для того чтобы не подсыхали срезы стекла укладываются на планшет из пластика, под стекла подкладывают смоченные дистиллированной водой одноразовые бумажные полотенца и сверху накрывают прозрачной пленкой вырезанной из скоросшивателя. Таким образом, жидкость не испаряется). Через 14-15 часов смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут, промакивают срезы одноразовыми бумажными полотенцами и наносят на срезы вторичные антитела и предметные стекла ставят в термостат при 27°С на 1 час - 1 час 15 минут. После пройденного времени вторичные антитела смывают буфером (Твин 20х) 5 минут и наносят на срезы хромоген на 3 минуты. Далее хромоген смывают в 3-х порциях дистиллированной воды по 5 минут. Докрашивают срезы гематоксилином Майера в течение 5-7 минут, затем споласкивают в дистиллированной воде (для смывания остатков буфера), после чего опускают стекла в щелочную воду и ополаскивают 10-15 секунд (до посинения).The surface of the glass slide is cut for adhesion with an egg white and glycerol adhesive in a ratio of 2: 1 (for gluing the slices), the dewaxing and rehydration of the slices, rinsing of the sliced glasses in distilled water for 5 minutes. This is followed by unmasking the antigens in a double boiler in citrate buffer for 40-45 minutes in beakers made of chemical glass. After stopping the work of the double boiler, the glass cannot be taken out of it for 20 minutes. Next, the sliced glass is washed with distilled water (to wash off the remaining buffer) in 2 shifts, placed in a 3% pharmacy hydrogen peroxide for 10-12 minutes, after which the slices are washed in distilled water and placed in a buffer (Tween 20x) for 10 minutes . Then the glasses are removed from the buffer and the glass is carefully blotted around the sections with disposable paper towels and a hydrophobic layer is made around the sections with a special marker for immunohistochemical reactions. After that, preventing the sections from drying out, a blocking solution is applied to them - 5% bovine serum albumin for 10 minutes, then again dried with disposable paper towels and primary antibodies are applied, after which the glasses are placed in a thermostat at 27 ° C for 24-26 hours (for so that the slices do not dry, the glass is stacked on a plastic tablet, disposable paper towels moistened with distilled water are placed under the glass and covered with a transparent film cut out of the folder on top. Thus, the liquid does not evaporate Xia). After 14-15 hours, the primary antibodies are washed off with buffer (Tween 20x) for 5 minutes, the sections are blotted with disposable paper towels and secondary antibodies are applied to the sections and the slides are placed in a thermostat at 27 ° C for 1 hour - 1 hour 15 minutes. After the elapsed time, the secondary antibodies are washed off with a buffer (Tween 20x) for 5 minutes and applied to the chromogen sections for 3 minutes. Next, the chromogen is washed off in 3 portions of distilled water for 5 minutes. The sections were stained with Mayer hematoxylin for 5-7 minutes, then rinsed in distilled water (to wash off the remaining buffer), then the glasses were lowered into alkaline water and rinsed for 10-15 seconds (until blue).
Краткое описание чертежей и иных материаловBrief description of drawings and other materials
На фиг. 1 дан способ иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах, А - эндокриноциты в эндокринном островке поджелудочной железы свиньи. Ув. × 1000. Плохое качество (окрашивание клеток и межклеточного пространства и ациноцитов железы).In FIG. 1 shows a method for the immunohistochemical detection of antigens in the preparations of organs of productive and unproductive animals of long-term storage in fixatives, A - endocrinocytes in the endocrine islet of a pancreas of a pig. SW × 1000. Poor quality (staining of cells and intercellular space and gland acinocytes).
На фиг. 2 – то же, a-SMA маркер поджелудочной железы собак. Ув. × 1000. Плохое качество (фоновое окрашивание ядер островка и цитоплазмы ациноцитов железы).In FIG. 2 - same, a-SMA marker for dogs pancreas. SW × 1000. Poor quality (background staining of the nuclei of the islet and cytoplasm of the gland acinocytes).
На фиг. 3 – то же, a-SMA маркер поджелудочной железы собак. Ув. × 1000In FIG. 3 - the same, a-SMA marker for dogs pancreas. SW × 1000
На фиг. 4, тоже, А - эндокриноциты в эндокринном островке поджелудочной железы свиньи. Ув. × 1000.In FIG. 4, also, A - endocrinocytes in the endocrine islet of the pancreas of a pig. SW × 1000.
На фиг. 5 – то же, C-kit маркер поджелудочной железы овцы. Ув. × 1000.In FIG. 5 - The same, C-kit marker of a sheep’s pancreas. SW × 1000.
На фиг. 6 и то же, В - эндокриноциты в эндокринном островке поджелудочной железы крупного рогатого скота. Ув. × 1000.In FIG. 6 and the same, B - endocrinocytes in the endocrine islet of the pancreas of cattle. SW × 1000.
На фиг. 7 – то же, В - эндокриноциты в эндокринном островке поджелудочной железы крупного рогатого скота. Ув. × 1000. Плохое качество (интенсивное фоновое окрашивание).In FIG. 7 - the same, B - endocrinocytes in the endocrine islet of the pancreas of cattle. SW × 1000. Poor quality (intense background staining).
На фиг. 8 и то же, C-kit маркер поджелудочной железы овцы. Ув. × 1000. Плохое качество (слабая экспрессия маркера и фоновое окрашивание ацинусов).In FIG. 8 and the same, a sheep’s pancreatic C-kit marker. SW × 1000. Poor quality (poor marker expression and background staining of acini).
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Примеры конкретного выполнения способа иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах.Examples of specific performance of the method of immunohistochemical detection of antigens in the preparations of organs of productive and unproductive animals of long-term storage in fixatives.
Пример 1. Исследования проводят на базе Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» в гистологической лаборатории.Example 1. Research is carried out on the basis of the Scientific and Diagnostic and Medical Veterinary Center of the Federal State Budget Educational Institution of Higher Professional Education “Stavropol State Agrarian University” in the histological laboratory.
При проведении иммуногистохимических реакций со стекол классическим гистологическим методом срезы приклеивают к стеклу без адгезива (для избегания фонового окрашивания структур среза) (см. фиг. 1, 2), удаляют парафин (депарафинизация и регидратация): 2 порции ксилола по 5 минут, 2 порции спирта 96% по 5 минут, полоскание в 70% спирте, полоскание в дистиллированной воде, затем стекла помещают в 3% аптечную Н2О2 на 10 мин, в котором происходит блокировка эндогенной пероксидазы. В пароварке в стакане из химического стекла проводят тепловую демаскировку антигенов в цитратном буфере рН 6,0 в течении 40 минут, где происходит разрыв SH-мостиков белка, которые образуются при фиксации формалином, обнажаются рецепторы клетки, промывают дистиллированной водой для смывания остатков буфера (2 смены), далее помещают в буфер (Твин 20х) на 10 минут, затем срезы аккуратно промокают фильтровальной бумагой для образования сухого поля, наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10 минут. Немного подсушивают фильтровальной бумагой, наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24 часа.When conducting immunohistochemical reactions with glasses using the classical histological method, the sections are glued to the glass without adhesive (to avoid background staining of the section structures) (see Fig. 1, 2), paraffin is removed (dewaxing and rehydration): 2 portions of xylene for 5 minutes, 2 portions alcohol of 96% for 5 minutes, rinsing in 70% alcohol, rinsing in distilled water, then the glasses are placed in a 3% pharmacy N 2 O 2 for 10 min, in which the endogenous peroxidase is blocked. In a double boiler in a beaker of chemical glass, the antigens are unmasked thermally in citrate buffer pH 6.0 for 40 minutes, where the protein SH-bridges are broken, which are formed during formalin fixation, the cell receptors are exposed, washed with distilled water to wash off the remaining buffer (2 shifts), then placed in a buffer (Tween 20x) for 10 minutes, then the slices are carefully blotted with filter paper to form a dry field, a blocking solution is applied to them - 5% bovine serum albumin for 10 minutes. Dry slightly with filter paper, apply the primary antibody and put in a thermostat at 27 ° C for 24 hours.
На следующий день смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Промокают срезы фильтровальной бумагой (но не сушить). Далее на срезы необходимо нанести вторичные антитела поставить в термостат при 27°С на 1 час. Далее смыть вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Затем нанести конъюгированный стрептавидин на 5 минут, а затем его смыть буфером (Твин 20х). Затем нанести хромоген на 5 минут. Далее смыть хромоген в 2-х порциях дистиллированной воды по 5 минут. Затем докрасить срезы гематоксилином Майера 5 минут, после чего опустить стекла в щелочную воду (на 100 мл дистиллированной воды 1 мл ХЧ 100% аммиака и полоскать 10 сек). Далее по классической гистологической схеме стекла ополаскивают в 70% спирте 1 минуту, затем проводят через 2 смены 96% спирта по 3 минуты, далее опускают в карболксилол на 5 минут, после чего проводят через 2 смены ксилола по 5 минут и заключают в полистирол или другую синтетическую среду.The next day, wash the primary antibodies with buffer (Tween 20x) for 5 minutes. Blot the sections with filter paper (but do not dry). Next, secondary antibodies must be applied to the sections and placed in a thermostat at 27 ° C for 1 hour. Then wash off the secondary antibodies with buffer (Tween 20x) for 5 minutes. Then apply conjugated streptavidin for 5 minutes, and then wash it off with buffer (Tween 20x). Then apply chromogen for 5 minutes. Then wash off the chromogen in 2 portions of distilled water for 5 minutes. Then stain the sections with Mayer hematoxylin for 5 minutes, then lower the glass into alkaline water (100 ml of distilled water 1 ml of 100% ammonia ChP and rinse for 10 seconds). Further, according to the classical histological scheme, the glasses are rinsed in 70% alcohol for 1 minute, then after 2 shifts, 96% alcohol for 3 minutes, then immersed in carbolxylene for 5 minutes, after which it is carried out after 2 shifts of xylene for 5 minutes and enclosed in polystyrene or other synthetic medium.
Данный способ иммуногистохимического выявления антигенов при вышеуказанных параметрах имеет ряд недостатков: после температурной демаскировки антигенов в цитратном буфере происходит отскакивание срезов со стекол, вокруг срезов происходит растекание реагентов, (см. фиг. 1, 2),что приводит к их большому расходованию, из-за большой плотности фильтровальной бумаги не происходит быстрого впитывания реагентов вокруг срезов при их промакивании, из-за большой плотности фильтровальной бумаги при ее контакте со срезами происходит их отскакивание со стекла.This method of immunohistochemical detection of antigens with the above parameters has several disadvantages: after temperature unmasking of the antigens in citrate buffer, the slices bounce off the glasses, reagents spread around the slices (see Fig. 1, 2), which leads to their large expenditure, because because of the high density of the filter paper, reagents do not quickly absorb around the sections when they are blotted, because of the high density of the filter paper, when they come in contact with the sections, they bounce ie from the glass.
Пример 2. Проводят аналогично примера №1, но предметные стекла обрабатывают адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1, срезы помещают на 10 минут в 3% аптечную Н2O2, после их инкубации в стаканах из химического стекла, причем инкубирование стекол проводят в 0,01 М цитратном буфере при рН 6,0 для демаскировки антигенов в пароварке в течение 40 минут. После прекращения работы пароварки, стекла не вынимают из пароварки в течение 20 минут. Затем их промывают дистиллированной водой для смывания остатков буфера (2 смены). После Н2O2 срезы промывают в дистиллированной воде. Далее помещают в буфер (Твин 20х) на 10 минут, после чего срезы аккуратно промакивают одноразовыми бумажными полотенцами для образования сухого поля вокруг срезов, но стекла при этом вынимают из буфера поочередно, во избежание подсыхания срезов (если реакция проводится на 3-х и более стекол, при однократном вынимании сразу всех стекол, происходит подсыхание срезов, что приводит к их порче). Далее вокруг срезов делают гидрофобный слой маркером для иммуногистохимических реакций (для предотвращения растекания реактивов). Не допуская подсыхания срезов, наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10 минут. Затем со срезов удаляют блокировочный раствор путем подсушивания их одноразовыми бумажными полотенцами (не допуская подсыхания срезов). Затем наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24 ч, причем для того чтобы не подсыхали срезы стекла укладывают на планшет из пластика, под стекла подкладывают смоченные одноразовыми бумажные полотенца дистиллированной водой и сверху накрывают прозрачной пленкой, таким образом, жидкость не испаряется и создается «влажная камера». На следующий день смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Опять промакивают одноразовыми бумажными полотенцами (но не сушат). Наносят на срезы вторичные антитела и опять ставят в термостат при 27°С на 1 ч, после чего смывают вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Наносят на срезы хромоген содержащий безбиотиновую систему детекции антител на 3 минуты. Затем смывают хромоген в 3-х порциях дистиллированной воды по 5 минут. Докрашивают срезы гематоксилином Майера в течение 5 минут. Ополаскивают срезы в дистиллированной воде (для удаления излишка красителя) и опускают препараты в щелочную воду и ополаскивают 10 секунд (до посинения). Далее по классической гистологической схеме препараты ополаскивают в 70% спирте 1 минуту, затем проводят через 2 смены 96% спирта по 3 минуты, далее опускают в карболксилол на 3 минуты, затем проводят через 2 смены ксилола по 5 минут и заключают в полистирол или другую синтетическую среду.Example 2. Carried out analogously to example No. 1, but the slides are treated with an adhesive based on egg white and glycerin in a ratio of 2: 1, the slices are placed for 10 minutes in 3% pharmacy N 2 O 2 , after incubation in beakers made of chemical glass, and glass incubation is carried out in 0.01 M citrate buffer at pH 6.0 to unmask antigens in a double boiler for 40 minutes. After stopping the operation of the double boiler, the glass is not removed from the double boiler for 20 minutes. Then they are washed with distilled water to wash off the remaining buffer (2 shifts). After H 2 O 2, the sections were washed in distilled water. Next, they are placed in a buffer (Tween 20x) for 10 minutes, after which the slices are gently blotted with disposable paper towels to form a dry field around the slices, but the glasses are removed from the buffer alternately to avoid drying of the slices (if the reaction is carried out for 3 or more glasses, with a single removal of all glasses at once, the sections dry out, which leads to their damage). Then, around the sections, a hydrophobic layer is made a marker for immunohistochemical reactions (to prevent reagent spreading). Preventing the sections from drying out, a blocking solution of 5% bovine serum albumin is applied to them for 10 minutes. Then, the blocking solution is removed from the slices by drying them with disposable paper towels (preventing the slices from drying out). Then, primary antibodies are applied and placed in a thermostat at 27 ° C for 24 hours, in order to prevent sections from drying out, the glass is placed on a plastic tablet, paper towels moistened with disposable paper with distilled water are placed under the glass and covered with a transparent film, so that the liquid does not evaporates and creates a "wet chamber". The next day, wash the primary antibodies with buffer (Tween 20x) for 5 minutes. Again, blot with disposable paper towels (but not dried). Secondary antibodies are applied to the sections and again placed in a thermostat at 27 ° C for 1 h, after which the secondary antibodies are washed off with buffer (Tween 20x) for 5 minutes. A chromogen containing a biotin-free antibody detection system is applied to the sections for 3 minutes. Then wash the chromogen in 3 portions of distilled water for 5 minutes. The sections were stained with Mayer hematoxylin for 5 minutes. Rinse sections in distilled water (to remove excess dye) and lower the preparations into alkaline water and rinse for 10 seconds (until blue). Then, according to the classical histological scheme, the preparations are rinsed in 70% alcohol for 1 minute, then carried out after 2 shifts of 96% alcohol for 3 minutes, then dipped in carbolxylene for 3 minutes, then carried out after 2 shifts of xylene for 5 minutes and enclosed in polystyrene or other synthetic Wednesday
Этот способ позволяет производить иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов, срезы не отскакивают со стекол и нет фонового окрашивания среза (см. фиг. 3, 4).This method allows immunohistochemical staining of histological sections, sections do not bounce off the glass and there is no background staining of the section (see Fig. 3, 4).
Пример 3. Проводят аналогично примера №1 и 2, но предметные стекла обрабатывают адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1, срезы помещают на 12 минут в 3% аптечную Н2О2, после их инкубации в стаканах из химического стекла, причем инкубирование стекол проводят в 0,01 М цитратном буфере при рН 6,0 для демаскировки антигенов в пароварке, в течение 45 минут. После прекращения работы пароварки стекла не вынимают из пароварки 20 минут. Затем промывают дистиллированной водой для смывания остатков буфера (2 смены). После Н2О2 срезы промывают в дистиллированной воде. Далее помещают в буфер (Твин 20х) на 10 минут, после чего срезы аккуратно промакивают также одноразовыми бумажными полотенцами для образования сухого поля вокруг срезов, но стекла при этом вынимают из буфера поочередно, во избежание подсыхания срезов (если реакция проводится на 3-х и более стекол, при однократном вынимании сразу всех стекол, происходит подсыхание срезов, что приводит к их порче). Далее вокруг срезов делают гидрофобный слой маркером для иммуногистохимических реакций (для предотвращения растекания реактивов). Не допуская подсыхания срезов, наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 12 минут. Затем со срезов удаляют блокировочный раствор путем подсушивания их одноразовыми бумажными полотенцами (не допуская подсыхания срезов). Затем наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 26 часов, при этом для того чтобы не подсыхали срезы стекла укладываются на планшет из пластика, под стекла подкладывают смоченные одноразовыми бумажные полотенца дистиллированной водой и сверху накрывают прозрачной пленкой, таким образом, жидкость не испаряется и создается «влажная камера». Через 14-15 часов смывают первичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут, снова промакивают одноразовыми бумажными полотенцами (но не сушат). Наносят на срезы вторичные антитела и опять ставят в термостат при 27°С на 1 час 15 минут, после чего смывают вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Наносят на срезы хромоген содержащий безбиотиновую систему детекции антител на 3 минуты. Затем смывают хромоген в 3-х порциях дистиллированной воды по 7 минут. Докрашивают срезы гематоксилином Майера в течение 7 минут. Ополаскивают срезы в дистиллированной воде (для удаления излишка красителя) и опускают препараты в щелочную воду и ополаскивают 15 секунд (до посинения). Далее по классической гистологической схеме препараты ополаскивают в 70% спирте 1 минуту, затем проводят через 2 смены 96% спирта по 3 минуты, далее опускают в карболксилол на 3 минуты, затем проводят через 2 смены ксилола по 5 минут и заключают в полистирол или другую синтетическую среду.Example 3. Carried out analogously to examples No. 1 and 2, but the slides are treated with an adhesive based on egg protein and glycerin in a ratio of 2: 1, the slices are placed for 12 minutes in 3% pharmacy N 2 O 2 , after incubation in glasses made of chemical glass moreover, the incubation of the glasses is carried out in 0.01 M citrate buffer at pH 6.0 to unmask the antigens in a double boiler for 45 minutes. After stopping the work of the double boiler, the glass is not removed from the double boiler for 20 minutes. Then washed with distilled water to wash off the remaining buffer (2 shifts). After H 2 O 2, the sections were washed in distilled water. Next, they are placed in a buffer (Tween 20x) for 10 minutes, after which the slices are carefully blotted with disposable paper towels to form a dry field around the slices, but the glasses are removed from the buffer one by one, in order to avoid drying of the slices (if the reaction is carried out for 3 and more glasses, with a single removal of all glasses at once, the sections dry out, which leads to their damage). Then, around the sections, a hydrophobic layer is made a marker for immunohistochemical reactions (to prevent reagent spreading). Preventing sections from drying out, a blocking solution is applied to them - 5% bovine serum albumin for 12 minutes. Then, the blocking solution is removed from the slices by drying them with disposable paper towels (preventing the slices from drying out). Then, primary antibodies are applied and placed in a thermostat at 27 ° C for 26 hours, in order to prevent the sections from drying out, the glass is stacked on a plastic tablet, paper towels moistened with disposable paper with distilled water are placed under the glass and covered with a transparent film, so that the liquid does not evaporate and creates a "wet chamber". After 14-15 hours, the primary antibodies are washed off with buffer (Tween 20x) for 5 minutes, again blotted with disposable paper towels (but not dried). Secondary antibodies are applied to the sections and again placed in a thermostat at 27 ° C for 1 hour 15 minutes, after which the secondary antibodies are washed off with buffer (Tween 20x) for 5 minutes. A chromogen containing a biotin-free antibody detection system is applied to the sections for 3 minutes. Then wash the chromogen in 3 portions of distilled water for 7 minutes. The sections were stained with Mayer hematoxylin for 7 minutes. Rinse the sections in distilled water (to remove excess dye) and lower the preparations into alkaline water and rinse for 15 seconds (until blue). Then, according to the classical histological scheme, the preparations are rinsed in 70% alcohol for 1 minute, then carried out after 2 shifts of 96% alcohol for 3 minutes, then dipped in carbolxylene for 3 minutes, then carried out after 2 shifts of xylene for 5 minutes and enclosed in polystyrene or other synthetic Wednesday
Этот способ по примеру 3, проведенный при вышеуказанных параметрах, также позволяет производить иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов, при этом срезы не отскакивают со стекол и нет фонового окрашивания среза (см. фиг. 5, 6).This method according to example 3, carried out at the above parameters, also allows immunohistochemical staining of histological sections, while the sections do not bounce off the glasses and there is no background staining of the section (see Fig. 5, 6).
Пример 4. Проводят аналогично примера №1, но стекла имеют фабричное покрытие адгезивом «поли-L-лизин». Срезы помещают на 10-20 минут в 3% аптечную Н2О2, после их нахождения в пароварке, где они инкубировались в цитратном буфере 40-55 минут в стаканах из химического стекла. После прекращения работы пароварки стекла не вынимают из нее в течение 20-30 минут. Затем промывают дистиллированной водой для смывания остатков буфера (3 смены). После перекиси водорода срезы промывают в дистиллированной воде. Далее помещают в буфер (Твин 20х) на 10-20 минут. Срезы аккуратно промакивают одноразовыми бумажными полотенцами. Далее вокруг срезов делают гидрофобный слой маркером для иммуногистохимических реакций. Не допуская подсыхания срезов, наносят на них блокировочный раствор - 5% бычий сывороточный альбумин на 10-20 минут. Затем опять подсушивают одноразовыми бумажными полотенцами (не допуская подсыхания срезов). Наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24-48 часов. После инкубации срезов с первичными антителами стекла опускают в буфер (Твин 20х) на 5 минут для смывания антител. Затем промакивают срезы одноразовыми бумажными полотенцами (но не сушат). Наносят на срезы вторичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 1-2 часа. Смывают вторичные антитела буфером (Твин 20х) в течение 5 минут. Наносят на срезы специальный хромоген с безбиотиновой системой детекции на 5-10 минут. Смывают хромоген в 3-х порциях дистиллированной воды по 7-10 минут. Докрашивают срезы гематоксилином Майера 7-10 минут. Опускают препараты в щелочную воду и ополаскивают 15-20 секунд (до посинения). Далее по классической гистологической схеме препараты ополаскивают в 70% спирте 1 минуту, затем проводят через 2 смены 96% спирта по 3 минуты, далее опускают в карболксилол на 5 минут, затем проводят через 2 смены ксилола по 5 минут и заключают в полистирол.Example 4. Carried out analogously to example No. 1, but the glass has a factory coating with adhesive "poly-L-lysine". Slices are placed for 10-20 minutes in a 3% pharmacy N 2 O 2 , after being in a double boiler, where they were incubated in citrate buffer for 40-55 minutes in beakers made of chemical glass. After stopping the work of the double boiler, the glass is not removed from it for 20-30 minutes. Then washed with distilled water to wash off the remaining buffer (3 shifts). After hydrogen peroxide, the sections are washed in distilled water. Next, place in a buffer (Tween 20x) for 10-20 minutes. Slices are carefully blotted with disposable paper towels. Then, around the sections, a hydrophobic layer is made a marker for immunohistochemical reactions. Preventing sections from drying out, a blocking solution is applied to them - 5% bovine serum albumin for 10-20 minutes. Then again dried with disposable paper towels (preventing drying of the slices). Primary antibodies are applied and placed in a thermostat at 27 ° C for 24-48 hours. After incubation of the sections with primary antibodies, the glasses are lowered into the buffer (Tween 20x) for 5 minutes to wash off the antibodies. Then the sections are blotted with disposable paper towels (but not dried). Secondary antibodies are applied to the sections and placed in a thermostat at 27 ° C for 1-2 hours. Wash off secondary antibodies with buffer (Tween 20x) for 5 minutes. Apply a special chromogen to the slices with a bezbiin-free detection system for 5-10 minutes. Wash off the chromogen in 3 portions of distilled water for 7-10 minutes. The sections were stained with Mayer hematoxylin for 7-10 minutes. Dip the preparations in alkaline water and rinse for 15-20 seconds (until blue in the blue). Further, according to the classical histological scheme, the preparations are rinsed in 70% alcohol for 1 minute, then carried out after 2 shifts of 96% alcohol for 3 minutes, then dipped in carbolxylene for 5 minutes, then carried out after 2 shifts of xylene for 5 minutes and enclosed in polystyrene.
Данный способ не позволяет проводить иммуногистохимические окрашивания гистологических срезов, так как: происходит частичное отскакивание срезов со стекол покрытых адгезивом «поли-L-лизин», при инкубации срезов в термостате происходит быстрое подсыхание реактивов и срезов, при окрашивании хромогеном в течение 5-10 минут происходит сильное фоновое окрашивание срезов, при переносе срезов из гематоксилина Майера непосредственно в щелочную воду (без ополаскивания в дистиллированной воде), происходит выпадение красителя в виде хлопьев синего цвета, без окрашивания основных структур клеток (см. фиг. 7, 8).This method does not allow immunohistochemical staining of histological sections, as: sections partially bounce off glasses coated with poly-L-lysine adhesive, when the sections are incubated, the reagents and sections are rapidly dried, when stained with chromogen for 5-10 minutes there is a strong background staining of the slices, when the slices are transferred from Mayer hematoxylin directly to alkaline water (without rinsing in distilled water), the dye precipitates in the form of blue flakes th color without staining the basic structures of cells (see. FIGS. 7, 8).
Таким образом, наиболее оптимальными являются примеры №2 и 3, так как способ по предлагаемому изобретению с предлагаемыми параметрами по примерам 2 и 3, позволяет проводить иммуногистохимические окрашивания гистологических срезов, полученных от крупного рогатого скота, мелкого рогатого скота, свиней, собак и кошек, из материала стандартного размера (1 см3) который фиксировался в формалине от 1 года до 2 лет с проведением качественного выявления антигенов.Thus, the most optimal are examples No. 2 and 3, since the method according to the invention with the proposed parameters according to examples 2 and 3, allows immunohistochemical staining of histological sections obtained from cattle, small cattle, pigs, dogs and cats, from a material of standard size (1 cm3) which was fixed in formalin from 1 year to 2 years with the qualitative detection of antigens.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями, имеет следующие преимущества:The invention in comparison with the prototype and other known technical solutions has the following advantages:
- качество выявления антигенов у домашних продуктивных и непродуктивных животных;- the quality of detection of antigens in domestic productive and unproductive animals;
- возможность производить иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов, при этом срезы не отскакивают со стекол и нет фонового окрашивания среза.- the ability to produce immunohistochemical staining of histological sections, while the sections do not bounce off the glass and there is no background staining of the section.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016113045A RU2627448C1 (en) | 2016-04-05 | 2016-04-05 | Method of immunohistochemical antigens detection in preparations of productive and non-productive animals organs of long-term storage in fixtures |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016113045A RU2627448C1 (en) | 2016-04-05 | 2016-04-05 | Method of immunohistochemical antigens detection in preparations of productive and non-productive animals organs of long-term storage in fixtures |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2627448C1 true RU2627448C1 (en) | 2017-08-08 |
Family
ID=59632534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016113045A RU2627448C1 (en) | 2016-04-05 | 2016-04-05 | Method of immunohistochemical antigens detection in preparations of productive and non-productive animals organs of long-term storage in fixtures |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2627448C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2719163C1 (en) * | 2019-11-22 | 2020-04-17 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Method of antigen retrieval during immunocytochemical reactions |
| CN111551705A (en) * | 2020-04-23 | 2020-08-18 | 苏州泽岑生物科技有限公司 | Method for improving immunohistochemical efficiency |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050032129A1 (en) * | 2003-06-26 | 2005-02-10 | Kagoshima University | Detection of antigen by immunohistochemical staining |
| RU2525428C2 (en) * | 2012-11-07 | 2014-08-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России) | Diagnostic technique for tuberculosis |
| JP2015187611A (en) * | 2007-03-27 | 2015-10-29 | イミュノヴィア・アーベー | Protein signature/marker for detecting glandular cancer |
-
2016
- 2016-04-05 RU RU2016113045A patent/RU2627448C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050032129A1 (en) * | 2003-06-26 | 2005-02-10 | Kagoshima University | Detection of antigen by immunohistochemical staining |
| JP2015187611A (en) * | 2007-03-27 | 2015-10-29 | イミュノヴィア・アーベー | Protein signature/marker for detecting glandular cancer |
| RU2525428C2 (en) * | 2012-11-07 | 2014-08-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России) | Diagnostic technique for tuberculosis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ДИЛЕКОВА О.В. C-KIT SCF-R эндокриноцитов поджелудочной железы крупного рогатого скота, Вестник АПК, 2015, N 1, с. 29-33. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2719163C1 (en) * | 2019-11-22 | 2020-04-17 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Method of antigen retrieval during immunocytochemical reactions |
| CN111551705A (en) * | 2020-04-23 | 2020-08-18 | 苏州泽岑生物科技有限公司 | Method for improving immunohistochemical efficiency |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zaqout et al. | Immunofluorescence staining of paraffin sections step by step | |
| Hintz et al. | Immunohistochemical localization of LDH-X during spermatogenesis in mouse testes | |
| Spiegel et al. | Fibronectin in the developing sea urchin embryo. | |
| Suthipintawong et al. | Immunostaining of cell preparations: a comparative evaluation of common fixatives and protocols | |
| Celada et al. | A fluorochromatic test for immunocytotoxicity against tumor cells and leucocytes in agarose plates | |
| Slepecky et al. | Evidence for calcium-binding proteins and calcium-dependent regulatory proteins in sensory cells of the organ of Corti | |
| RU2627448C1 (en) | Method of immunohistochemical antigens detection in preparations of productive and non-productive animals organs of long-term storage in fixtures | |
| Handke et al. | Towards long term cultivation of Drosophila wing imaginal discs in vitro | |
| DK142824B (en) | Process for preparing an object carrier with applied immunologically reactive material in lyophilized and self-adhesive form. | |
| Müller | Immunolabeling of embryos | |
| Anuracpreeda et al. | Distribution of 28.5 kDa antigen in the tegument of adult Fasciola gigantica | |
| Shukla et al. | Mast cell ultrastructure and staining in tissue | |
| Joyner et al. | Immunohistochemistry of whole-mount mouse embryos | |
| CN113281515A (en) | TIPE3 immunohistochemical detection kit and use method and application thereof | |
| Rodig | Cell staining | |
| Bunton et al. | Reactivity of tissue-specific antigens in N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced neoplasms and normal tissues from medaka (Oryzias latipes) | |
| Shi et al. | Immunohistochemical study of intermediate filament proteins on routinely processed, celloidin-embedded human temporal bone sections by using a new technique for antigen retrieval | |
| Ribatti et al. | The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as an | |
| Kruger et al. | The supporting-cell antigen: a receptor-like protein tyrosine phosphatase expressed in the sensory epithelia of the avian inner ear | |
| Smith-Clerc et al. | Immunofluorescence detection of the cytoskeleton and extracellular matrix in tissue and cultured cells | |
| Byrne et al. | Evolution of larval form in the sea star genus Patiriella: conservation and change in the larval nervous system | |
| Pal et al. | Immunohistochemistry | |
| Strnadová et al. | Melanoma xenotransplant on the chicken chorioallantoic membrane: a complex biological model for the study of cancer cell behaviour | |
| RU2386137C1 (en) | Coat of slides for immunocytochemical and histological studies | |
| El‐Ghali et al. | New methods for chicken embryo manipulations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180406 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20190514 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200406 |