RU2622762C1

RU2622762C1 - Antibacterial composition in form of suppository and method of its preparation

Info

Publication number: RU2622762C1
Application number: RU2016110068A
Authority: RU
Inventors: Андрей Владимирович Алешкин; Мария Николаевна Анурова; Ирина Анатольевна Киселева; Ольга Алексеевна Попова
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "АЛФАРМ"
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2016-03-21
Publication date: 2017-06-19

Abstract

FIELD: pharmacology.

SUBSTANCE: invention is an antibacterial composition in the form of a suppository and a method of its preparation, wherein the composition comprises a liquid substance of bacteriophages containing at least three bacteriophages with a titre of at least 2⋅10⁸ BFU per suppository of each strain, suppository base, including witepsol or tallow of type A, as well as Tween-80, wherein the composition components are in a certain ratio, in % per 1 suppository.

EFFECT: systemic antibacterial effect and maintenance of initial high phage lysate titre.

2 cl, 2 dwg, 7 tbl, 5 ex, 3 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической промышленности и касается лекарственных форм в виде суппозиториев, содержащих бактериофаги, и способа их получения.The invention relates to medicine, namely to the pharmaceutical industry and relates to dosage forms in the form of suppositories containing bacteriophages, and a method for their preparation.

Впервые возможность использования бактериофагов в профилактике и лечении инфекционных заболеваний была продемонстрирована в 1917 г., когда среди ученых-микробиологов распространилась сенсационная новость, что Феликс д'Эрелль открыл вирусы, «пожирающие бактерии», и на их основе ему удалось разработать препараты для лечения солдат, заразившихся дизентерией.The possibility of using bacteriophages in the prevention and treatment of infectious diseases was first demonstrated in 1917, when sensational news spread among microbiologists that Felix d'Herellle discovered viruses that “devour bacteria” and based on them he managed to develop drugs for treating soldiers infected with dysentery.

Бактериофаги - это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, с последующим лизисом клетки-хозяина (вирулентные фаги) или образованием лизогенов (умеренные фаги).Bacteriophages are viruses characterized by a specific ability to selectively infect bacterial cells, followed by lysis of the host cell (virulent phages) or the formation of lysogens (moderate phages).

Развитие новых представлений в конце XX - начале XXI века как о молекулярной биологии, так и об экологических взаимоотношениях бактериофагов и их хозяев, а также все более широкое распространение в биосфере антибиотикорезистентных микроорганизмов, актуализировали своего рода второе рождение вирусов бактерий. Существенно возросшее количество персистирующих антибиотикорезистентных патогенных и условно-патогенных штаммов бактерий, утяжеляющих клиническое течение патологических состояний и существенно ухудшающих показатели инфекционной заболеваемости во многих странах мира, связано как с бесконтрольным использованием антибиотиков при самолечении и профилактики нозокомиальных инфекций, так и с массовым применением консервантов и бактерицидных препаратов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Улучшение качества медицинской помощи инфекционным больным, а также переход на потребление экологически чистых не обработанных антибактериальными средствами продуктов питания подразумевает поиск новых и возрождение известных ранее форм и методов лечения инфекционных заболеваний, способов деконтаминации инструментария и помещений ЛПУ, а также консервации пищевой продукции.The development of new ideas at the end of the 20th - beginning of the 21st centuries about both molecular biology and the environmental relationships of bacteriophages and their hosts, as well as the wider spread of antibiotic-resistant microorganisms in the biosphere, actualized a kind of rebirth of bacterial viruses. A significantly increased number of persistent antibiotic-resistant pathogenic and conditionally pathogenic bacterial strains that aggravate the clinical course of pathological conditions and significantly worsen the incidence of infectious diseases in many countries of the world is associated both with the uncontrolled use of antibiotics in self-medication and the prevention of nosocomial infections, and with the massive use of preservatives and bactericidal preparations in the food industry and agriculture. Improving the quality of medical care for infectious patients, as well as switching to the consumption of environmentally friendly food products that have not been treated with antibacterial agents, implies the search for new and the revival of previously known forms and methods of treating infectious diseases, methods for decontamination of tools and facilities of hospitals, and preservation of food products.

Учитывая остроту проблемы распространения антибиотикоустойчивых возбудителей инфекций, решением Ученого Совета Роспотребнадзора от 21 июня 2011 года, а также в соответствии с протоколом совещания у руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 02 декабря 2015 года «О вопросах антимикробной резистентности» рекомендовано научно-исследовательским организациям совместно с фармпроизводителями направить усилия на разработку препаратов на основе бактериофагов, эффективных при осуществлении мероприятий по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации.Given the severity of the problem of the spread of antibiotic-resistant infectious agents, by the decision of the Scientific Council of Rospotrebnadzor dated June 21, 2011, as well as in accordance with the minutes of the meeting with the head of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Well-Being of December 2, 2015 “On Antimicrobial Resistance” It is recommended that research organizations, together with pharmaceutical manufacturers, direct efforts towards the development of drugs based on bacteriophages effective in the adoption of measures to ensure the sanitary and epidemiological well-being of the population of the Russian Federation.

Многочисленные исследования, проведенные отечественными и зарубежными учеными, подтверждают возможность использования бактериофагов в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур, в том числе вызванных антибиотикорезистентными штаммами.Numerous studies conducted by domestic and foreign scientists confirm the possibility of using bacteriophages as natural antimicrobial agents to combat bacterial infections in humans, animals and crops, including those caused by antibiotic-resistant strains.

Преимущества бактериофагов перед антибиотиками достаточно очевидны и заключаются в следующем:The advantages of bacteriophages over antibiotics are quite obvious and are as follows:

- способны уничтожать бактерии, устойчивые к антибиотикам;- able to destroy antibiotic resistant bacteria;

- в титре, не превышающем в готовой лекарственной форме 10¹⁰ БОЕ/мл, не вызывают побочных эффектов (реакция Яриша - Герксгеймера);- in the titer, not exceeding 10 ¹⁰ PFU / ml in the finished dosage form, do not cause side effects (Yarish-Herxheimer reaction);

- благодаря узкой видовой специфичности, не подавляют рост нормофлоры;- due to the narrow species specificity, normoflora does not inhibit the growth;

- сочетаются с другими лекарственными препаратами;- combined with other drugs;

- оказывают иммуностимулирующее действие.- have an immunostimulating effect.

Более восьмидесяти лет в бывшем Советском Союзе, а позднее и в Российской Федерации на филиалах НПО «Микроген» производятся свыше десятка наименований пероральных лекарственных средств как на основе отдельных видов бактериофагов, так и их комбинаций для лечения и профилактики острых кишечных инфекций и декомпенсированных форм дисбактериоза, а также гнойно-воспалительных заболеваний бактериального генеза.For more than eighty years in the former Soviet Union, and later in the Russian Federation, more than a dozen types of oral medicines have been produced at the branches of NPO Microgen based on certain types of bacteriophages and their combinations for the treatment and prevention of acute intestinal infections and decompensated forms of dysbiosis, as well as purulent-inflammatory diseases of bacterial origin.

Известен поливалентный дизентерийный бактериофаг в свечах, используемый для лечения дизентерии, вызванной Shigella flexneri разных серотипов или Shigella sonne (Чушков Ю.В. Издание: Фарматека Год издания: 2011 Объем: 8 с. - N 6. - С. 34-41).Known polyvalent dysenteric bacteriophage in suppositories used to treat dysentery caused by Shigella flexneri of various serotypes or Shigella sonne (Chushkov Yu.V. Edition: Farmateka Year of publication: 2011 Volume: 8 pp. - N 6. - P. 34-41).

Известны ректальные свечи, содержащие фильтрат фаголизатов наиболее распространенных сальмонелл групп А, В, С, Д, Е., а также свечи со стафилококковым бактериофагом в виде лиофилизированного концентрата (Чушков Ю.В. Издание: Фарматека Год издания: 2011 Объем: 8 с. - N 6. - С.34-41).Rectal suppositories containing filtrate of phagolysates of the most common salmonella groups A, B, C, D, E. are known, as well as suppositories with staphylococcal bacteriophage in the form of a lyophilized concentrate (Chushkov Yu.V. Edition: Farmateka Year of publication: 2011 Volume: 8 sec. - N 6. - S.34-41).

Недостатком данных препаратов является узкая сфера их применения и использование активного начала - бактериофага в виде лиофилизированного концентрата, который в процессе сублимационной сушки снижает литическую активность.The disadvantage of these drugs is the narrow scope of their use and the use of the active principle - the bacteriophage in the form of a lyophilized concentrate, which reduces the lytic activity during freeze-drying.

Известен препарат "Секстафаг" в виде ректальных суппозиториев, содержащий стафилококковый бактериофаг, стрептококковый бактериофаг, протейный бактериофаг, клебсиеллезный бактериофаг, синегнойный бактериофаг, коли бактериофаг со специфической активностью каждого концентрированного монофага не ниже 10^-7 (патент РФ №2366708).The known drug "Sextafag" in the form of rectal suppositories containing staphylococcal bacteriophage, streptococcal bacteriophage, proteus bacteriophage, Klebsiella bacteriophage, Pseudomonas bacteriophage, if the bacteriophage with specific activity of each concentrated monophage is not lower than 10 ^-7 (RF patent No. 2366708).

Под очищенным концентрированным фаголизатом бактерий в этом патенте подразумевают несколько высокоактивных фаговых рас или штаммов совместно и одновременно культивируемых на нескольких же штаммах бактерий одного вида. Реальная концентрация каждого штамма при таком культивировании как в фаголизате, так и в готовой лекарственной форме - суппозиториях, в том числе после хранения остается неизвестной. При использовании данного метода получения очищенного концентрированного фаголизата бактерий и отсутствии полногеномного секвенирования каждого нового штамма бактериофага, а также проверки на лизогенность исходных культур бактериальных штаммов-хозяев, повышается вероятность попадания в коктейль бактериофагов умеренных штаммов, что не только потенциально снижает терапевтические свойства препарата, но и является недопустимым с точки зрения безопасности использования бактериофагов в качестве лекарственных средств.By purified concentrated bacterial phagolysate in this patent is meant several highly active phage races or strains co-cultured simultaneously on several bacterial strains of the same species. The actual concentration of each strain during such cultivation both in the phagolysate and in the finished dosage form — suppositories, including after storage, remains unknown. When using this method of obtaining purified concentrated bacterial phagolysate and the absence of genome-wide sequencing of each new bacteriophage strain, as well as checking for the lysogenicity of the initial cultures of the bacterial host strains, the likelihood of moderate strains getting into the cocktail increases, which not only potentially reduces the therapeutic properties of the drug, but also is unacceptable from the point of view of the safety of the use of bacteriophages as medicines.

Защищен иммунобиологический бактерицидный препарат в виде суппозитория на основе бактериофага (патент №2366708), который содержит видоспецифические вирулентные бактериофаги и бактериофаги с индуцированной вирулентностью с литической активностью не ниже 10^-4по Аппельману в отношении тест-штаммов и выделенных из организма человека изолятов бактерий в фильтрате фаголизата (или в фильтрате концентрата фаголизата) нелизогенных бактерий, и фармацевтически приемлемые целевые добавки в количестве 50,0-95,0 мас. % от массы препарата.Protected immunobiological bactericidal preparation in the form of a suppository based on a bacteriophage (patent No. 2366708), which contains species-specific virulent bacteriophages and bacteriophages with induced virulence with lytic activity not lower than 10 ^-4 according to Appelman in relation to test strains and bacterial isolates isolated from the human body in the filtrate phagolysate (or in the filtrate of a concentrate of phagolysate) of non-isogenic bacteria, and pharmaceutically acceptable target additives in an amount of 50.0-95.0 wt. % by weight of the drug.

Недостатком предлагаемых суппозиториев является сочетание вирулентных - разрешенных к применению в медицинских целях, бактериофагов и бактериофагов с индуцированной вирулентностью - исходно умеренных, которые не только не будут оказывать терапевтического эффекта, но и не допускаются к использованию в лекарственных средств, а также то, что специфическую активность препарата бактериофагов, обозначаемую отрицательной степенью, определяли титрованием в жидкой питательной среде по методу Аппельмана. Данный параметр сложно интерпретировать в случае, когда в препарате используется несколько штаммов против одного вида бактерий, т.е невозможно стандартизировать препарат по содержанию фаговых частиц каждого штамма отдельно в 1 мл. Фармакокинетические исследования и возможный уровень патогенетического терапевтического эффекта - местный или системный данных свечей отсутствует, также не описана технология получения суппозиторий.The disadvantage of the proposed suppositories is the combination of virulent - approved for medical use, bacteriophages and bacteriophages with induced virulence - initially moderate, which not only will not have a therapeutic effect, but are not allowed to be used in drugs, as well as the fact that specific activity the preparation of bacteriophages, denoted by a negative degree, was determined by titration in a liquid nutrient medium according to the Appelman method. This parameter is difficult to interpret in the case when several strains are used in the preparation against one type of bacteria, i.e. it is impossible to standardize the preparation on the content of phage particles of each strain separately in 1 ml. Pharmacokinetic studies and the possible level of the pathogenetic therapeutic effect - there are no local or systemic suppository data; the technology for producing suppositories is also not described.

Наиболее близким аналогом изобретения (прототипом) является способ изготовления свечей с бактериофагом путем соединения очищенного концентрированного фаголизата бактерий с основой, отличающийся тем, что в основу непосредственно вводят жидкий фаголизат с титром не ниже 10^-7 по Аппельману в количестве не более 20% от общей массы композиции (патент RU №2188629).The closest analogue of the invention (prototype) is a method of manufacturing candles with a bacteriophage by combining a purified concentrated bacterial phagolysate with a base, characterized in that the liquid phagolysate with a titer of at least 10 ^-7 by Appelman in an amount of not more than 20% of the total mass is directly introduced into the base composition (patent RU No. 2188629).

Для получения свечей прототипа используется жидкая питательная среда. Сырьем для производства свечей служат фильтраты фаголизатов микробных культур, концентрированные методом ультрафильтрации и подвергнутые стерилизующей фильтрации. Надо отметить, что ультрафильтрация усложняет технологический процесс не меньше, чем лиофилизация. В качестве активного начала суппозиториев используются бактериофаги клебсиелл и комплексный бактериофаг (пентафаг), при этом количество штаммов не определено, указаны только виды бактериофагов. Хотя в патенте это не указано, следует уточнить, что отрицательной степенью обозначают специфическую активность препарата бактриофагов, определяемую титрованием в жидкой питательной среде по методу Аппельмана (Appelmans R. Le dosage du bacteriophage. C.R. Soc Biol. 1921; 85:1098-99) на посевных бактериальных штаммах. Данный параметр сложно интерпретировать в случае, когда в препарате используется несколько штаммов против одного вида бактерий, т.е. невозможно стандартизировать препарат по содержанию фаговых частиц каждого штамма отдельно в 1 мл, которое определяется методом агаровых слоев по Грациа (Gratia, A. Des relations numeriques entre bacteries lysogene set particules de bacterophage /A.Gratia//Annales de l'Institut Pasteur. - 1936. - Vol. 57. - P. 652-676). Таким образом, под очищенным концентрированным фаголизатом бактерий в этом патенте подразумевают несколько высокоактивных фаговых рас или штаммов совместно и одновременно культивируемых на нескольких же штаммах бактерий одного вида. Реальная концентрация каждого штамма как в фаголизате, так и в суппозитории, в том числе, после хранения остается неизвестной.To obtain the candles of the prototype, a liquid nutrient medium is used. The raw materials for the production of candles are filtrates of microbial culture phagolysates, concentrated by ultrafiltration and subjected to sterilizing filtration. It should be noted that ultrafiltration complicates the process no less than lyophilization. Klebsiella bacteriophages and a complex bacteriophage (pentaphage) are used as the active principle of suppositories, while the number of strains is not determined, only the types of bacteriophages are indicated. Although this is not indicated in the patent, it should be clarified that the specific activity of the bacteriophage preparation, determined by titration in a liquid nutrient medium by the Appelmans method (Appelmans R. Le dosage du bacteriophage. CR Soc Biol. 1921; 85: 1098-99) on inoculum bacterial strains. This parameter is difficult to interpret in the case when several strains are used in the preparation against one type of bacteria, i.e. it is impossible to standardize the preparation according to the phage content of each strain separately in 1 ml, which is determined by the Grazia method of agar layers (Gratia, A. Des relations numeriques entre bacteries lysogene set particules de bacterophage / A. Gratia // Annles de l'Institut Pasteur. - 1936. - Vol. 57. - P. 652-676). Thus, by purified concentrated bacterial phagolysate in this patent is meant several highly active phage races or strains co-cultured simultaneously on several bacterial strains of the same species. The actual concentration of each strain both in the phagolysate and in the suppository, including after storage, remains unknown.

Чрезмерным усложнением процесса изготовления суппозиториев в патенте RU №2188629 является также введение этапа стерилизации свечной основы перед внесением в нее АФС (активная фармацевтическая субстанция). Данная лекарственная форма не относится к стерильным и не требует стерилизации вспомогательных компонентов (проводится только стерилизующая фильтрация субстанции бактериофагов для избавления от патогенных культур бактериальных штаммов-хозяев).An excessive complication of the manufacturing process of suppositories in patent RU No. 2188629 is also the introduction of the stage of sterilization of the suppository base before the introduction of APS (active pharmaceutical substance). This dosage form does not belong to sterile and does not require sterilization of auxiliary components (only sterilizing filtration of the substance of bacteriophages is performed to get rid of pathogenic cultures of bacterial host strains).

Задачей настоящего изобретения является разработка суппозиторной лекарственной формы на основе комбинированной жидкой субстанции по меньшей мере трех бактериофагов с исходно высоким титром фаголизата от 2×10⁸ БОЕ/суппозиторий каждого штамма, снижающимся на конец срока годности препарата до уровня не ниже 1×10⁸ БОЕ/суппозиторий. Для достижения поставленной задачи по запатентованной технологии с выращиванием фаголизата на плотной питательной среде были получены высокоактивные стерильные фильтраты фаголизатов, подобраны вспомогательные компоненты и сконструирована готовая лекарственная форма - суппозитории, обладающие исходной высокой специфической антибактериальной активностью, сохраняющейся после всасывания фаговых частиц через слизистую кишечника, что было подтверждено в ходе фармакокинетических испытаний на кроликах.The objective of the present invention is to develop a suppository dosage form based on a combined liquid substance of at least three bacteriophages with an initially high titer of phagolysate from 2 × 10 ⁸ PFU / suppository of each strain, decreasing at the end of the shelf life of the drug to a level of at least 1 × 10 ⁸ PFU / suppository. To achieve the objective of the patented technology with the cultivation of the phagolysate on a solid nutrient medium, highly active sterile filtrates of the phagolysates were obtained, auxiliary components were selected and the finished dosage form was designed - suppositories with the initial high specific antibacterial activity that persists after the absorption of phage particles through the intestinal mucosa, which was confirmed during pharmacokinetic trials in rabbits.

При разработке суппозиториев на основе бактериофагов использовались микробиологические, молекулярно-генетические, биотехнологические методы и процедуры доклинических испытаний.When developing suppositories based on bacteriophages, microbiological, molecular genetic, biotechnological methods and preclinical testing procedures were used.

Техническим результатом заявленного изобретения является тот факт, что впервые в мире был разработан состав суппозиториев для ректального применения в отношении антибиотикоустойчивых микроорганизмов на основе коктейля из трех и более бактериофагов, обладающий необходимой специфической антибактериальной активностью (титром, измеряемым в БОЕ/мл по Грация и спектром литического действия - процент лизируемых штаммов внутри гомологичного вида бактерий) и системным механизмом действия при лечении инфекционных заболеваний за счет всасывания через слизистую кишечника в системный кровоток. Это в дальнейшем послужит основой для создания нового метода индивидуализированной антибактериальной терапии для лечения инфекций, вызванных лекарственно-устойчивыми штаммами возбудителей.The technical result of the claimed invention is the fact that for the first time in the world a composition of suppositories was developed for rectal administration in relation to antibiotic-resistant microorganisms based on a cocktail of three or more bacteriophages, possessing the necessary specific antibacterial activity (titer measured in PFU / ml by Grace and the spectrum of lytic actions - the percentage of lysed strains within the homologous type of bacteria) and the systemic mechanism of action in the treatment of infectious diseases due to absorption enter through the intestinal mucosa into the systemic circulation. This will serve as the basis for the creation of a new method of individualized antibacterial therapy for the treatment of infections caused by drug-resistant strains of pathogens.

Таким образом, технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемой группы изобретений заключается в обеспечении системного антибактериального действия композиции путем всасывая активного начала через слизистую кишечника в кровь, а также в сохранении исходного высокого титра фаголизата (не менее 2×10⁸ БОЕ/суппозиторий каждого штамма), снижающегося на конец срока годности препарата до уровня не ниже 1×10⁸ БОЕ/суппозиторий.Thus, the technical result achieved by the implementation of the proposed group of inventions is to provide a systemic antibacterial effect of the composition by absorbing the active principle through the intestinal mucosa into the bloodstream, as well as maintaining the initial high titer of phagolysate (at least 2 × 10 ⁸ PFU / suppository of each strain) decreasing at the end of the shelf life of the drug to a level of at least 1 × 10 ⁸ PFU / suppository.

Сущность заявляемой группы изобретений заключается в следующем. Предлагается антибактериальная композиция в виде суппозитория, которая содержит жидкую субстанцию бактериофагов, включающую, по меньшей мере, три бактериофага с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/суппозиторий, суппозиторную основу, включающую витепсол или твердый жир типа А, а также твин (полисорбат)-80 при следующем соотношении компонентов на 1 суппозиторий, масс. %:The essence of the claimed group of inventions is as follows. An antibacterial composition is proposed in the form of a suppository, which contains a liquid substance of bacteriophages, including at least three bacteriophages with a titer of at least 2 × 10 ⁸ PFU / suppository, a suppository base, including vitepsol or solid fat type A, as well as tween (polysorbate) -80 in the following ratio of components per 1 suppository, mass. %:

жидкая субстанция бактериофаговliquid substance of bacteriophages 13,3%13.3% витепсол или твердый жир типа Аvitepsol or type A solid fat 82-84%82-84% твин (полисорбат)-80twin (polysorbate) -80 2,7-4,7%2.7-4.7%

Предлагается также способ приготовления приведенной выше антибактериальной композиции, в котором сначала в расплавленный при температуре 43-50°С витепсол или твердый жир типа А вводят твин (полисорбат)-80. Затем полученную основу охлаждают до температуры 40-42°С и при перемешивании вводят в нее жидкую субстанцию бактериофагов. В связи с поставленной задачей был разработан алгоритм по созданию нового препарата на основе бактериофагов, включающий следующие этапы:A method for preparing the above antibacterial composition is also proposed, in which tween (polysorbate) -80 is introduced into the Vitepsol or type A solid fat melted at a temperature of 43-50 ° C. Then, the resulting base is cooled to a temperature of 40-42 ° C and, with stirring, a liquid substance of bacteriophages is introduced into it. In connection with the task, an algorithm was developed to create a new drug based on bacteriophages, which includes the following steps:

Согласно разработанного алгоритма, на первом этапе наших исследований были выделены и идентифицированы штаммы бактерий-мишеней. Для этого был использован комплекс инновационных лабораторных методов исследования, включающий классические микробиологические методы с посевом патологического материала на несколько видов питательных сред и использованием отечественных и импортных коммерческих биохимических тест-систем. Видовую идентификацию труднокультивируемых микроорганизмов проводили масс-спектрометрическим методом с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI-TOF MS. Чувствительность микроорганизмов исходно определяли диско-диффузным методом. Микроорганизмы с МЛУ (множественная лекарственная устойчивость) тестировали иммуноферментным методом для идентификации фактора, обеспечивающего резистентность. Известные локусы антибиотикорезистентности регистрировали с помощью амплификации со специфическими праймерами в ПЦР-реакции. Далее проводили выделение из объектов окружающей среды и селекцию вирулентных штаммов бактериофагов по спектру их специфической литической активности против идентифицированных бактерий-мишеней. Выделение бактериофагов и изучение их биологических свойств проводили методами, предложенными М. Адамсом (1959) и Д.М. Гольдфарбом (1961). Для определения титра фаговых частиц и морфологии негативных колоний использовали метод Грациа (1936). Обязательным этапом при выборе индикаторной бактериальной культуры, на которой в дальнейшем будет культивироваться бактериофаг, являлась ее проверка на лизогенность в тесте по индукции профага в клетке с помощью митомицина С или УФО (ультрафиолетовое облучение). Морфологическую структуру бактериофагов исследовали с помощью электронной микроскопии нативных фаговых частиц. Уникальность и вирулентную природу бактериофагов подтверждали в процессе биоинформационного анализа, представляющего из себя следующую процедуру: на основе данных высокопроизводительного секвенирования второго поколения Ion Torrent Sequencing проводилась сборка генома бактериофага в режиме de-novo с использованием пакета программного обеспечения NEWBLER. Собранный геном имел точность прочтения каждого нуклеотида не ниже 99,9%. Далее проводился поиск открытых рамок считывания с целью аннотирования генома - определения возможных генов. Потенциальные продукты этих генов анализировались при помощи программного обеспечения PHACTS. Данное программное обеспечение позволяло предсказать тип жизненного цикла бактериофага (умеренный или вирулентный). Подтверждение вирулентности бактериофага проводилось также в ходе выявления генов, кодирующих известные интегразы, репрессоры транскрипции или их гомологи. Такой поиск проводился с использованием собранной нами из различных открытых ресурсов базы данных аминокислотных последовательностей умеренных бактериофагов и алгоритма blastp. Высокоактивные стерильные фаголизаты получали способом, защищенным патентом RU №2525141 «Способ получения бактериофага». Оценку безопасности производственно-перспективных штаммов фагов, включающую микробиологические, биохимические и молекулярно-генетические тесты, а также испытания на лабораторных животных проводили в соответствии с собственными разработанными процедурами (Киселева И.А. Специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов: конструирование, технология производства, оценка безопасности и эффективности применения: автореферат диссертации кандидата биологических наук: 03.01.06, 03.02.03 - Москва, 2015. - 26 с).According to the developed algorithm, at the first stage of our research, strains of target bacteria were isolated and identified. For this, a complex of innovative laboratory research methods was used, including classical microbiological methods with the sowing of pathological material into several types of culture media and using domestic and imported commercial biochemical test systems. Species identification of difficult to cultivate microorganisms was carried out by the mass spectrometric method using a MALDI-TOF MS time-of-flight mass spectrometer. The sensitivity of microorganisms was initially determined by the disk diffusion method. Microorganisms with MDR (multidrug resistance) were tested by enzyme immunoassay to identify the factor that provides resistance. Known antibiotic resistance loci were recorded by amplification with specific primers in a PCR reaction. Further, isolation from environmental objects and selection of virulent strains of bacteriophages was carried out according to the spectrum of their specific lytic activity against identified target bacteria. The isolation of bacteriophages and the study of their biological properties was carried out by methods proposed by M. Adams (1959) and D.M. Goldfarbom (1961). To determine the titer of phage particles and the morphology of negative colonies, the Grazia method (1936) was used. An obligatory step when choosing an indicator bacterial culture, on which the bacteriophage will be further cultivated, was its test for lysogenicity in the test for the induction of prophage in the cell using mitomycin C or ultraviolet irradiation. The morphological structure of bacteriophages was investigated using electron microscopy of native phage particles. The uniqueness and virulent nature of bacteriophages was confirmed in the process of bioinformation analysis, which is the following procedure: on the basis of second-generation high-performance sequencing Ion Torrent Sequencing, the bacteriophage genome was assembled in de-novo mode using the NEWBLER software package. The assembled genome had a reading accuracy of each nucleotide of at least 99.9%. Next, a search was made for open reading frames in order to annotate the genome - to identify possible genes. Potential products of these genes were analyzed using PHACTS software. This software made it possible to predict the type of life cycle of a bacteriophage (moderate or virulent). Confirmation of the virulence of the bacteriophage was also carried out during the identification of genes encoding known integrase, transcriptional repressors, or their homologs. Such a search was carried out using the database of amino acid sequences of moderate bacteriophages and the blastp algorithm that we collected from various open resources. Highly active sterile phagolysates were obtained by the method protected by RU patent No. 2525141 "Method for the production of bacteriophage". The safety assessment of promising phage strains, including microbiological, biochemical and molecular genetic tests, as well as tests on laboratory animals, was carried out in accordance with our own developed procedures (I. Kiseleva Specialized dietetic preventive nutrition product based on a bacteriophage cocktail: design, technology production, safety and effectiveness assessment: abstract of the dissertation of the candidate of biological sciences: 03.01.06, 03.02.03 - Moscow, 2015 .-- 26 s).

В качестве АФС для разработки суппозиториев использовали высокоактивные стерильные фаголизаты в жидкой форме. Свечную основу подбирали исходя из максимального сохранения специфической активности АФС (титра бактериофагов) в готовой лекарственной форме, которую проверяли по методу Грациа, используя разработанную, в рамках данных исследований, процедуру пробоподготовки. Для подтверждения универсальности подобранной суппозиторной основы в качестве комбинированной намеренно АФС использовали бактериофаги разных видов, отобранные не по принципу нозологической общности, а на основании существенных различий их биологических и генетических характеристик.Highly active sterile phagolysates in liquid form were used as APS for the development of suppositories. The suppository base was selected based on the maximum preservation of the specific activity of the APS (bacteriophage titer) in the finished dosage form, which was checked by the Grazia method using the sample preparation procedure developed as part of the research data. To confirm the universality of the selected suppository base, bacteriophages of various species, selected not according to the principle of nosological community, but on the basis of significant differences in their biological and genetic characteristics, were used as intentionally combined APSs.

Пробоподготовка суппозиториев для определения подлиности и количественного содержания бактериофаговSample preparation of suppositories to determine the authenticity and quantitative content of bacteriophages

Помещали три суппозитория в стерильный контейнер, добавляли необходимое количество изотонического раствора хлорида натрия, контейнер закрывали крышкой и помещали для растворения на водяную баню, предварительно нагретую до 45°С, на 10 минут, периодически встряхивая емкость с суппозиторием до полного растворения и перехода в эмульсионное состояние. Далее отобрали 0,5 мл в пробирку с мясопептонным бульоном (МПБ) для определения титра бактериофагов по методу Грациа. В ходе фармакокинетических исследований, для подтверждения наличия в клиническом материале фаговых частиц, кровь, мочу и кал кроликов до и после однократного назначения бактериофагов последовательно исследовали микробиологическими: спот-тестом, методом Грация, и молекулярно-генетическими: двойной вложенной ПЦР (полимеразной цепной реакция), методами. Морфологическую полноценность фаговых частиц в крови кроликов подтверждали путем определения специфических антител к одному из бактериофагов, входящих в суппозитории. Для этого в рамках данного исследования была специально сконструирована иммуноферментная тест-система.Three suppositories were placed in a sterile container, the required amount of an isotonic sodium chloride solution was added, the container was closed with a lid and placed for dissolution in a water bath previously heated to 45 ° C for 10 minutes, periodically shaking the container with the suppository until it was completely dissolved and transferred to the emulsion state . Then, 0.5 ml was collected in a test tube with meat and peptone broth (MPB) to determine the titer of bacteriophages by the method of Grazia. In the course of pharmacokinetic studies, to confirm the presence of phage particles in the clinical material, the blood, urine and feces of rabbits before and after a single administration of bacteriophages were subsequently examined by microbiological: spot test, Grace method, and molecular genetic: double-nested PCR (polymerase chain reaction) methods. The morphological usefulness of phage particles in the blood of rabbits was confirmed by determining specific antibodies to one of the bacteriophages included in suppositories. For this, an enzyme-linked immunosorbent assay system was specifically designed as part of this study.

I. Микробиологические методы выделения бактериофагов из клинического материалаI. Microbiological methods for the isolation of bacteriophages from clinical material

Прямой метод выделения бактериофаговDirect method for the isolation of bacteriophages

Исследуемые жидкости (кровь, мочу) фильтровали через бактериальный фильтр (0,22 мкм, «Millipore»). Твердый исследуемый материал (оформленные испражнения - кал) предварительно измельчали, эмульгировали, фильтровали через бумажный фильтр, а затем через бактериальный. Наличие фага в полученном фильтрате определяли по методу спот-теста и Грациа.Test fluids (blood, urine) were filtered through a bacterial filter (0.22 μm, Millipore). The solid test material (formed feces - feces) was pre-crushed, emulsified, filtered through a paper filter, and then through a bacterial one. The presence of phage in the obtained filtrate was determined by the method of spot test and Grazia.

Выделение бактериофагов методом обогащения с «подсевом»Isolation of bacteriophages by enrichment method with "subseeding"

Жидкий исследуемый материал (кровь) засевали в МПБ. Одновременно с исследуемым материалом в питательную среду вносили 0,2 мл суточной культуры бактерий, чувствительных к выделяемому бактериофагу. Инкубировали в термостате при 37°С 18-20 часов. После инкубации содержимое фильтровали через бактериальный фильтр. Полученный фильтрат исследовали на наличие бактериофага к бактериальным культурам, взятым для обогащения.Liquid test material (blood) was seeded in BCH. Simultaneously with the test material, 0.2 ml of the daily culture of bacteria sensitive to the secreted bacteriophage was introduced into the nutrient medium. Incubated in a thermostat at 37 ° C for 18-20 hours. After incubation, the contents were filtered through a bacterial filter. The obtained filtrate was examined for the presence of a bacteriophage to bacterial cultures taken for enrichment.

II. Обнаружение бактериофага в исследуемых образцахII. Bacteriophage Detection in Test Samples

- методом нанесения фага (spot-тест) на газон бактериальной культуры. В чашки Петри разливали 1,5% мясопептонный агар (ΜΠΑ). После застывания и подсушивания агара на чашки Петри наносили по 0,1 мл 16-18 часовой бульонной культуры микроорганизмов, чувствительных к бактериофагам, находящимся в исследуемом фильтрате, растирали шпателем по всей поверхности чашки, чтобы получить равномерный сплошной рост культуры. После того, как культура впиталась и чашки подсохли, на них каплями (spot-тест) наносили исследуемый фильтрат. После подсушивания, чашки перевертывали вверх дном и ставили в термостат при 37°С на 18-24 часа. На следующие сутки производили учет результатов - наличие или отсутствие «пятна лизиса».- the method of applying phage (spot test) on the lawn of a bacterial culture. 1.5% meat peptone agar (ΜΠΑ) was poured into Petri dishes. After solidification and drying of the agar, 0.1 ml of a 16-18 hour broth culture of microorganisms sensitive to bacteriophages located in the studied filtrate was applied to Petri dishes, triturated with a spatula over the entire surface of the plate to obtain uniform continuous growth of the culture. After the culture was absorbed and the plates were dried, the studied filtrate was applied dropwise (spot test) on them. After drying, the plates were turned upside down and placed in a thermostat at 37 ° C for 18-24 hours. The next day, the results were recorded - the presence or absence of a "lysis spot".

- с учетом эффективности фаговой инфекции: по 10 мкл из последовательных десятикратных разведений исследуемого фильтрата наносили на газон бактериальной культуры, чувствительной к искомым бактериофагам, в полужидком (0,7%) агаре. Учет производили после инкубации чашек при 37°С в течение 18-20 часов - наличие или отсутствие «пятна лизиса» или подсчет количества негативных колоний в «пятне лизиса».- taking into account the effectiveness of phage infection: 10 μl of successive ten-fold dilutions of the studied filtrate was applied to the lawn of a bacterial culture sensitive to the desired bacteriophages in semi-liquid (0.7%) agar. The count was made after the plates were incubated at 37 ° C for 18-20 hours — the presence or absence of a “lysis spot” or the count of the number of negative colonies in the “lysis spot”.

III. Метод определения литической активности (титра) бактериофаговIII. Method for determining the lytic activity (titer) of bacteriophages

Метод Грациа (метод агаровых слоев)Grazia method (agar layer method)

Этот метод основан на внесении различных разведений титруемого бактериофага в соответствующую культуру бактерий и посеве на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага. Накануне опыта готовили стерильные питательные среды: 1,5% ΜΠΑ на чашках Петри по 25 мл; пробирки MПБ по 4,5 мл в каждой; 0,7% ΜΠΑ в пробирках по 2,5 мл. В день постановки опыта из пробы, содержащей титруемый бактериофаг, готовили в пробирках ряд десятикратных последовательных разведений. Затем в пробирку с 0,7% ΜΠΑ, расплавленным и охлажденным до 50-52°С, вносили 1 мл образца соответствующего разведения исследуемого бактериофага, перемешивали, добавляли 0,1-0,2 мл 10⁹ микробных клеток в 1 мл по ОСО (отраслевому стандартном образцу мутности бактериальной взвеси) 42-28-85-2015 (10 ME), чувствительных к бактериофагу, опять слегка перемешивали и содержимое пробирки выливали в чашку с ΜΠΑ (вторым слоем). После остывания среды чашки инкубировали в термостате при 37°С в течение 18-20 ч. Титр фага определяли путем подсчета количества негативных колоний на параллельных чашках и умножением среднего арифметического на показатель разведения.This method is based on introducing various dilutions of the titrated bacteriophage into an appropriate bacterial culture and plating on a solid nutrient medium in order to obtain negative bacteriophage colonies. On the eve of the experiment, sterile nutrient media were prepared: 1.5% ΜΠΑ on 25 ml Petri dishes; MPB tubes of 4.5 ml each; 0.7% ΜΠΑ in 2.5 ml tubes. On the day of the experiment, from the sample containing titratable bacteriophage, a series of ten-fold serial dilutions were prepared in test tubes. Then, in a test tube with 0.7% ΜΠΑ, melted and cooled to 50-52 ° С, 1 ml of a sample of the corresponding dilution of the studied bacteriophage was added, mixed, 0.1-0.2 ml of 10 ⁹ microbial cells in 1 ml of OCO was added ( the industry standard sample for the turbidity of the bacterial suspension) 42-28-85-2015 (10 ME) sensitive to the bacteriophage was again slightly mixed and the contents of the tube were poured into a cup with с (second layer). After cooling the medium, the plates were incubated in an incubator at 37 ° C for 18-20 hours. The phage titer was determined by counting the number of negative colonies on parallel plates and multiplying the arithmetic mean by the dilution index.

IV. Метод двойной вложенной ПЦР (double-nested PCR)IV. Double-nested PCR method

Выделение ДНК бактериофагов из крови проводили с помощью набора для выделения К-сорб (ООО «НПФ Синтол», Москва). В реакцию брали 1 мкл выделенной ДНК. Высокочувствительное выявление фрагментов ДНК фагов осуществляли с помощью двойной вложенной ПЦР (double-nested PCR). Реакционные смеси готовили с использованием реагентов, входящих в комплект рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва). Для проведения реакций использовали олигонуклеотидные последовательности, приведенные в таблице 1. Детекцию результата амплификации проводили путем постановки горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле.Bacteriophage DNA was extracted from the blood using a K-sorb isolation kit (NPF Synthol, Moscow). 1 μl of the extracted DNA was taken into the reaction. Highly sensitive detection of phage DNA fragments was performed using double-nested PCR (double-nested PCR). Reaction mixtures were prepared using the reagents included in the recombinant Taq DNA polymerase kit (Fermentas, Lithuania). For the reactions used oligonucleotide sequences shown in table 1. Detection of the amplification result was carried out by staging horizontal electrophoresis in 1% agarose gel.

V. Методика определения антител к бактериофагу РА-5 с помощью иммуноферментного анализаV. Method for the determination of antibodies to bacteriophage RA-5 using enzyme immunoassay

А. Получение кроличьей антисыворотки к бактериофагу РА-5A. Obtaining rabbit antiserum to bacteriophage RA-5

Для получения антисыворотки проводили внутримышечную иммунизацию кролика.Intramuscular immunization of the rabbit was performed to obtain antiserum.

Схема иммунизации:Immunization schedule:

1. 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда + 0,5 мл раствора фага (концентрация 10¹⁰БОЕ/мл).1. 0.5 ml of complete Freund's adjuvant + 0.5 ml of phage solution (concentration 10 ¹⁰ PFU / ml).

2. через 10 дней 0,25 мл неполного адьюванта + 0,25 мл раствора фага.2. after 10 days, 0.25 ml of incomplete adjuvant + 0.25 ml of phage solution.

3. через 20 дней 0,1 мл неполного адьюванта + 0,1 мл раствора фага.3. after 20 days, 0.1 ml of incomplete adjuvant + 0.1 ml of phage solution.

4. через 30 дней 0,5 мл неполного адьюванта + 0,5 мл раствора фага.4. after 30 days, 0.5 ml of incomplete adjuvant + 0.5 ml of phage solution.

Б. Конструирование иммуноферментной тест-системыB. Construction of an enzyme-linked immunosorbent assay system

1. Сорбируем антиген на пластиковый планшет. В лунки планшета вносим по 100 мкл бактериофага РА-5 в концентрации 10¹⁰ БОЕ/мл, закрываем пленкой и оставляем на ночь в холодильнике. В последние лунки рядов антиген не вносим - данные лунки являются отрицательным контролем в отсутствии антигена.1. Sorb the antigen on a plastic tablet. Pipette 100 μl of the bacteriophage RA-5 at a concentration of 10 ¹⁰ PFU / ml into the wells of the plate, cover with a film and leave it in the refrigerator overnight. We do not introduce antigen into the last wells of the rows - these wells are a negative control in the absence of antigen.

2. Через 18-20 часов инкубации удаляем содержимое лунок (резко вытряхиваем). Промываем 5-6 раз в моющем растворе (BSM Diagnostics, США). После промывки тщательно удаляем промывочный раствор, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, сложенной в несколько раз, для полного удаления жидкости из лунок.2. After 18-20 hours of incubation, remove the contents of the wells (shake out sharply). We rinse 5-6 times in a washing solution (BSM Diagnostics, USA). After washing, carefully remove the washing solution by tapping the plate on filter paper folded several times to completely remove the liquid from the wells.

3. Разводим исследуемую сыворотку в физиологическом растворе.3. We dilute the test serum in physiological saline.

4. Вносим исследуемые образцы по 100 мкл в лунки планшета.4. Pipette the test samples of 100 μl into the wells of the tablet.

5. В качестве положительного контроля вносим сыворотку иммунизированного одноименным бактериофагом кролика в дубле или триплете.5. As a positive control, we introduce the serum of the rabbit immunized with the same bacteriophage in a double or triplet.

6. В качестве дополнительного отрицательного контроля вносим в дубле физ. раствор.6. As an additional negative control, we add in the duplicate physical. solution.

7. Инкубируем 60 мин при 37°С.7. Incubate for 60 minutes at 37 ° C.

8. После инкубации промываем планшет, как описано выше.8. After incubation, wash the plate as described above.

9. Для выявления связавшегося с сорбированным антигеном иммуноглобулина G, используем конъюгат Protein A-Peroxidase, Staphylococcus aureus/horseradish (Lot 084K132, Sigma, США). Данный конъюгат был выбран на том основании, что содержащийся в нем реагент Protein А стафилококка имеет сродство к иммуноглобулинам G разных видов млекопитающих, в том числе человека и кролика.9. To identify the immunoglobulin G bound to the adsorbed antigen, we use the Protein A-Peroxidase, Staphylococcus aureus / horseradish conjugate (Lot 084K132, Sigma, USA). This conjugate was chosen on the grounds that the staphylococcus Protein A reagent contained in it has an affinity for G immunoglobulins of various mammalian species, including humans and rabbits.

10. Для разведения конъюгата используем PBS-T (забуференный фосфатами физиологический раствор, содержащий твин-20 в концентрации 0,1%).10. For dilution of the conjugate we use PBS-T (phosphate buffered saline containing tween-20 at a concentration of 0.1%).

11. Рабочее разведение конъюгата - 1:64000 (подобрано в результате предварительных экспериментов).11. Working dilution of the conjugate - 1: 64000 (selected as a result of preliminary experiments).

12. Во все лунки планшета вносим по 100 мкл конъюгата в рабочем разведении.12. In all wells of the tablet we add 100 μl of conjugate in working dilution.

13. Инкубируем 60 мин при 37°С.13. Incubate for 60 minutes at 37 ° C.

14. Промываем планшет как описано ранее.14. Rinse the tablet as described previously.

15. Во все лунки планшета вносим по 100 мкл субстратного раствора, содержащего ТМБ (ВСМ Diagnostics).15. In all wells of the tablet we add 100 μl of substrate solution containing TMB (BCM Diagnostics).

16. Инкубируем 15 мин в темноте при комнатной температуре.16. Incubate for 15 minutes in the dark at room temperature.

17. Для прекращения реакции в каждую лунку вносим по 100 мкл стоп-реагента (ВСМ Diagnostics).17. To stop the reaction, add 100 μl stop reagent (BCM Diagnostics) to each well.

18. Проводим измерение оптической плотности при 450 нм на планшетном фотометре Infinite (Tecan, Австрия).18. We measure the optical density at 450 nm using an Infinite plate photometer (Tecan, Austria).

VI. Метод определения антифагового иммунного ответа in vitro в реакции нейтрализацииVI. In vitro antiphase immune response determination method in a neutralization reaction

Вирусная природа бактериофага подразумевает, при системном действии последнего, инициацию иммунного ответа млекопитающих. Оценить иммунный ответ in vitro можно в реакция нейтрализации, заключающейся в падении силы литической активности (титра) бактериофага при его добавлении в сыворотку крови животного. Ниже представлена отработанная методика:The viral nature of the bacteriophage implies, with the systemic action of the latter, the initiation of the mammalian immune response. The in vitro immune response can be assessed in the neutralization reaction, which consists in a decrease in the lytic activity (titer) of the bacteriophage when it is added to the blood serum of an animal. Below is a proven technique:

Сыворотку крови кролика разводили в 1500 раз в стандартном фосфатном буфере (PBS), затем к 450 мкл разведенной сыворотки добавляли 50 мкл фаголизата исследуемого бактериофага в титре 10⁶ БОЕ/мл. Полученную смесь инкубировали в термостате в течение 30 минут при температуре 37°С. После инкубации смесь разводили в 100 раз МПБ и титровали по методу Грациа (подраздел III). Падение титра бактериофага в сыворотке крови интактного кролика свидетельствовало о наличие неспецифического иммунного ответа, достоверное отличие в величине титра бактериофага у иммунизированного и интактного животного свидетельствовало о выработке специфических антифаговых антител.Rabbit blood serum was diluted 1,500 times in standard phosphate buffer (PBS), then 50 μl of the studied bacteriophage phagolysate in titer 10 ⁶ PFU / ml was added to 450 μl of diluted serum. The resulting mixture was incubated in a thermostat for 30 minutes at a temperature of 37 ° C. After incubation, the mixture was diluted 100 times with BCH and titrated according to the Grazia method (subsection III). A drop in the titer of the bacteriophage in the blood serum of an intact rabbit indicated the presence of a nonspecific immune response, a significant difference in the titer of the bacteriophage in an immunized and intact animal indicated the development of specific antiphage antibodies.

Получение жидкой субстанции бактериофагов в титре, достаточном для определения терапевтической дозы в готовой лекарственной формеObtaining a liquid substance of bacteriophages in a titer sufficient to determine the therapeutic dose in the finished dosage form

С целью подготовки АФС для суппозиториев на основе коктейля бактериофагов были отобраны следующие штаммы P. aeruginosa РА5, Е. coli V18, S. Enteritidis SE40.The following strains of P. aeruginosa PA5, E. coli V18, S. Enteritidis SE40 were selected for the preparation of APS for suppositories based on a cocktail of bacteriophages.

Сравнительная фенотипическая и молекулярно-генетическая характеристика отобранных для суппозиториев штаммов бактериофагов представлены в таблице 2.Comparative phenotypic and molecular genetic characteristics of bacteriophage strains selected for suppositories are presented in table 2.

Штаммы бактериофагов P. aeruginosa РА5, Е. coli V18, S. Enteritidis SE40 различаются как по длине ДНК, так и по размеру фаговых частиц, что в дальнейшем позволит сформировать полное представление о фармакокинетике бактериофагов разных видов, введенных с помощью суппозиториев per rectum лабораторным животным.The strains of bacteriophages P. aeruginosa PA5, E. coli V18, S. Enteritidis SE40 differ both in the length of the DNA and in the size of phage particles, which will subsequently form a complete picture of the pharmacokinetics of different types of bacteriophages introduced into laboratory animals using per rectum suppositories .

Получение жидкой субстанции бактериофаговObtaining a liquid substance of bacteriophages

Культивирование бактериофагов на плотных питательных средах с высоким титром вирусных частиц и предельно низкими значениями эндотоксина согласно патенту RU на изобретение №2525141 включает следующие этапы:The cultivation of bacteriophages on solid nutrient media with a high titer of viral particles and extremely low endotoxin values according to RU patent for invention No. 2525141 includes the following steps:

1 этап - получение 18-ти часовой культуры штамма-хозяина на плотной питательной среде. Бактериальные культуры микробиологической петлей засевают в МПБ, разлитый по 4,5 мл из расчета одна пробирка на одну матрасную колбу. Посеянные таким образом индикаторные штаммы культивируют в термостате 18 часов при 37°С, через 18 часов экспозиции достигая 10⁸-10⁹ КОЕ/мл.Stage 1 - obtaining an 18-hour culture of the host strain in a dense nutrient medium. Bacterial cultures are sown with a microbiological loop in the BCH, spilled at 4.5 ml per one tube per mattress flask. The indicator strains thus seeded are cultured in an incubator for 18 hours at 37 ° C, after 18 hours of exposure reaching 10 ⁸ -10 ⁹ CFU / ml.

2 этап - нанесение штамма-хозяина на поверхность плотной питательной среды.Stage 2 - application of the host strain to the surface of a dense nutrient medium.

Раскатывают культуру по всей поверхности питательной среды, создавая монослой. Культивируют в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина.Roll out the culture over the entire surface of the nutrient medium, creating a monolayer. Cultivate for 3.5 hours at the optimum temperature for the growth of the culture of the strain of the host.

3 этап - нанесение маточного штамма бактериофага.Stage 3 - application of the uterine strain of the bacteriophage.

В образовавшийся таким образом газон культуры вносят шприцем или стерильной микробиологической пипеткой 2 мл одноименного (маточного) бактериофага в титре 10⁵-10⁶ БОЕ/мл. Покачивающим движением распределяют бактериофаг так, чтобы он тонким слоем покрыл всю поверхность газона бактериальной культуры. Инкубируют в термостате 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина и одноименного бактериофага.2 ml of the eponymous (uterine) bacteriophage in a titer of 10 ⁵ -10 ⁶ PFU / ml are introduced into the culture lawn thus formed by means of a syringe or a sterile microbiological pipette. The bacteriophage is distributed with a swaying motion so that it covers the entire surface of the lawn of the bacterial culture with a thin layer. Incubated in an incubator for 13-15 hours at the optimum temperature for growth of the culture of the host strain and the bacteriophage of the same name.

4 этап - сбор бактериофага.Stage 4 - collection of bacteriophage.

В матрас в асептических условиях вносят физиологический раствор с рН 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см² (9 мл на один матрас). Плавным покачивающим движением производят смыв фага с поверхности питательного агара. Стерильной микробиологической пипеткой собирают жидкую фракцию и переносят в стерильные центрифужные пробирки. Для освобождения фаголизата от нелизированных бактерий в пробирки добавляют хлороформ из расчета 1/10. Экспонируют полученную суспензию 30 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют 30 мин при 5000-6000 об/мин. Собирают полученный супернатант в стерильную емкость.In aseptic conditions, a physiological saline solution with a pH of 7.0-7.2 in the amount of 0.04-0.045 ml per 1 cm ² (9 ml per one mattress) is introduced into the mattress. With a smooth swaying motion, the phage is washed off the surface of nutrient agar. A sterile microbiological pipette collects the liquid fraction and transfers to sterile centrifuge tubes. To release the phagolysate from non-lysed bacteria, chloroform (1/10) is added to the tubes. The resulting suspension is exposed for 30 minutes with continuous shuttling, centrifuged for 30 minutes at 5000-6000 rpm. Collect the resulting supernatant in a sterile container.

5 этап - очистка и контроль фаголизата.Stage 5 - purification and control of the phagolysate.

Полученные раздельно фаголизаты сводят в коктейль бактериофагов, включая в него виды фагов, отобранные для изготовления суппозиториев, стерилизуют фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и затем очищают от эндотоксинов на хроматографической колонке типа Endo Trap Blue или Endo Trap HD (Hyglos GmbH, Германия) согласно инструкции производителя с использованием буфера поставляемого в комплекте с колонкой.Separately obtained phagolysates are brought into a cocktail of bacteriophages, including phage species selected for the manufacture of suppositories, sterilized by filtration through a 0.22 μm filter with a pore diameter and then purified from endotoxins on an Endo Trap Blue or Endo Trap HD chromatographic column (Hyglos GmbH, Germany) according to the manufacturer's instructions using the buffer supplied with the column.

Технология изготовления суппозиториев заключается в следующем: в расплавленный при температуре 43-47 градусов витепсол, вводят твин (полисорбат)-80, перемешивают, основу охлаждают до температуры 40 градусов и постепенно при перемешивании вводят жидкую субстанцию бактериофагов, затем суппозиторную массу выливают в ячейки для суппозиториев, охлаждают, запаивают, нарезают и готовые суппозитории упаковывают. Возможно применение заявленной технологии с использованием специализированных технологических линий.The technology for the manufacture of suppositories is as follows: in the Vitepsol molten at a temperature of 43-47 degrees, tween (polysorbate) -80 is introduced, mixed, the base is cooled to a temperature of 40 degrees, and the bacteriophage liquid substance is gradually introduced with stirring, then the suppository mass is poured into the suppository cells , cool, solder, cut and packaged suppositories. It is possible to use the claimed technology using specialized processing lines.

Технология изготовления суппозиториев при использовании твердого жира типа А заключается в следующем: в расплавленный при температуре 45-50 градусов твердый жир типа А, вводят твин (полисорбат)-80, перемешивают, основу охлаждают до температуры 40-42 градусов и постепенно при перемешивании вводят жидкую субстанцию бактериофагов, затем суппозиторную массу выливают в ячейки для суппозиториев, охлаждают, запаивают, нарезают и готовые суппозитории упаковывают. Возможно применение заявленной технологии с использованием специализированных технологических линий.The manufacturing technology of suppositories using type A solid fat is as follows: type A solid fat melted at a temperature of 45-50 degrees, tween (polysorbate) -80 is introduced, mixed, the base is cooled to a temperature of 40-42 degrees and liquid is gradually introduced with stirring the substance of bacteriophages, then the suppository mass is poured into the cells for suppositories, cooled, sealed, cut and the finished suppositories are packaged. It is possible to use the claimed technology using specialized processing lines.

Определение титра бактериофагов в готовой лекарственной формеDetermination of the titer of bacteriophages in the finished dosage form

Пробы образцов суппозиториев опытных серий на основе жидкой субстанции бактериофагов по схеме пробоподготовки, приведенной в разделе «Пробоподготовка суппозиториев для определения подлинности и количественного содержания бактериофагов», были исследованы по методу Грациа с целью определения титра фаговых частиц в готовой лекарственной форме, а также сравнение данного показателя с исходными значениями определенными для субстанций. В таблице 5 приведены средние значения титров бактериофагов, определенные в суппозиториях заявленного.Samples of suppository samples of the experimental series based on the liquid substance of bacteriophages according to the sample preparation scheme given in the section “Sample preparation of suppositories for determining the authenticity and quantitative content of bacteriophages” were studied by the Grazia method to determine the titer of phage particles in the finished dosage form, as well as comparing this indicator with initial values defined for substances. Table 5 shows the average titer of bacteriophages determined in the suppositories of the claimed.

Фармакокинетические испытания суппозиторной лекарственной формы на основе коктейля бактериофагов на лабораторных животных (кроликах), подтверждающие достижение терапевтического уровня бактериофагов в крови, моче и фекалиях животныхPharmacokinetic tests of a suppository dosage form based on a cocktail of bacteriophages in laboratory animals (rabbits), confirming the achievement of a therapeutic level of bacteriophages in the blood, urine and feces of animals

В эксперимент были включены 6 кроликов обоего пола с весом от 2,5 до 3 кг. Кроликам вводили ректально суппозитории на основе заявляемой жидкой субстанции бактериофагов. У кроликов исследовали образцы крови (с ЭДТА), мочи, кала с помощью качественного - спот-теста и количественного метода Грациа до и после введения суппозиториев.The experiment included 6 rabbits of both sexes weighing from 2.5 to 3 kg. Rabbits were administered rectally suppositories based on the claimed liquid substance of bacteriophages. Blood samples (with EDTA), urine, and feces were studied in rabbits using a qualitative spot test and a quantitative Grazia method before and after the administration of suppositories.

На фигуре 1 представлена динамика средних значений титров бактериофагов в моче (а) и кале (б) кроликов, получавших суппозитории заявляемого состава. Максимальные значения титров бактериофагов в исследованных образцах достигаются через 4,5-6 часов после однократного введения суппозиториев и через 24 часа их концентрации снижаются до минимума. В процессе исследования выявлены определенные закономерности в изменении уровня бактериофагов в моче, крови и кале, которые могут быть связаны с размером вирусных частиц, влияющим на их способность преодолевать слизистую оболочку кишечника и проникать в кровь. В таблице 2 приведены приблизительные размеры фагов и их ДНК, позволяющие выстроить их в порядке убывания этих размеров следующим образом: V18>PA5>SE40. Логично, что фаги, обладающие меньшим размером, (SE40 и РА5) должны быстрее, чем бактериофаги большего размера (V18), проникать из просвета прямой кишки кроликов в кровь и далее в мочу. На фигуре 1а первый пик концентраций фагов меньшего размера приходится на 3 часа после введения суппозиториев в прямую кишку. Более высокие, относительно первых, вторые (6-тичасовые) пики концентраций бактериофагов SE40 и РА5 при определении их в кале (фиг. 1б) свидетельствуют о выведении фаговых частиц, поступивших в кровь, с желчью обратно в кишечник животных. Фаги, обладающие большим размером (V18), медленнее (или с большим трудом) преодолевают слизистый барьер кишечника - пиковые значения их титров, фиксируемые в моче, соответствуют 4,5 часам после введения суппозиториев в прямую кишку кроликов (фиг. 1а). Отсутствие второго пика у фага V18 на фигуре 16 свидетельствуют о нейтрализации фаговых частиц, вторично всосавшихся в кровь, иммунной системой кролика (иллюстрация данного процесса представлена в таблице 6). Вторично выводящиеся через кишечник фаговые частицы (V18) не обладают исходной литической активностью в отношении бактерий-хозяев, что и не позволяет определить их исходно высокие титры в кале спустя 4,5 часа после введения суппозиториев в прямую кишку животных.The figure 1 presents the dynamics of the average titer of bacteriophages in the urine (a) and feces (b) of rabbits receiving suppositories of the claimed composition. The maximum titer values of bacteriophages in the studied samples are achieved 4.5-6 hours after a single administration of suppositories and after 24 hours their concentrations are reduced to a minimum. The study revealed certain patterns in the change in the level of bacteriophages in urine, blood and feces, which may be related to the size of viral particles, affecting their ability to overcome the intestinal mucosa and penetrate the blood. Table 2 shows the approximate sizes of phages and their DNA, allowing them to be arranged in descending order of these sizes as follows: V18> PA5> SE40. It is logical that phages with a smaller size (SE40 and PA5) should faster than bacteriophages of a larger size (V18) penetrate from the lumen of the rectum of rabbits into the blood and then into the urine. In figure 1A, the first peak concentration of smaller phages occurs at 3 hours after the introduction of suppositories into the rectum. Higher, relative to the first, second (6-hour) peaks of the concentrations of bacteriophages SE40 and PA5 when determining them in the feces (Fig. 1b) indicate the excretion of phage particles entering the bloodstream with bile back into the intestines of animals. Phages with a large size (V18), more slowly (or with great difficulty) cross the intestinal mucosa - the peak values of their titers recorded in urine correspond to 4.5 hours after the administration of suppositories into the rectum of rabbits (Fig. 1a). The absence of a second peak in phage V18 in figure 16 indicates the neutralization of phage particles, secondarily absorbed into the blood, by the rabbit immune system (an illustration of this process is presented in table 6). Secondary phage particles (V18), which are excreted through the intestines, do not have the initial lytic activity against host bacteria, which does not allow us to determine their initially high titers in feces 4.5 hours after the introduction of suppositories into the rectum of animals.

Высокочувствительное выявление фрагментов ДНК фагов в крови животных осуществляли с помощью метода двойной вложенной ПЦР. На фигуре 2 представлен горизонтальный электрофорез продуктов (ампликонов) 2 и 3 раундов ПЦР, подтверждающий наличие в крови кроликов ДНК бактериофагов от 100-200 копий (3 раунд ПЦР) до 1000-10000 копий (2 раунд ПЦР). Вероятность выявления фаговых ДНК (максимальные количества копий различных штаммов фагов) увеличивается к 6 часам после введения суппозиториев кроликам.Highly sensitive detection of phage DNA fragments in the blood of animals was carried out using the double-nested PCR method. The figure 2 shows the horizontal electrophoresis of products (amplicons) of 2 and 3 rounds of PCR, confirming the presence of bacteriophage DNA in the blood of rabbits from 100-200 copies (3 round PCR) to 1000-10000 copies (2 round PCR). The likelihood of detecting phage DNA (the maximum number of copies of various phage strains) increases by 6 hours after administration of suppositories to rabbits.

На фигуре 2 представлена динамика наличия ДНК сальмонеллезного (а), синегнойного (б) и эширихиозного (в) бактериофагов в крови кроликов. Номерами 6-11 обозначены кролики, 100 п. н. - маркер длин ДНК, К- - отрицательный контроль (реакционная смесь), К+ - положительный контроль (ДНК определяемых бактериофагов)The figure 2 presents the dynamics of the presence of salmonella (a) DNA, (b) Pseudomonas aeruginosa and (c) eschirichiosis bacteriophages in the blood of rabbits. Numbers 6-11 denote rabbits, 100 bp - DNA length marker, K- - negative control (reaction mixture), K + - positive control (DNA of determined bacteriophages)

Косвенным подтверждением наличия небольшого количества полноценных фаговых частиц (а не только ДНК бактериофагов), всосавшихся в кровь подопытных кроликов, может служить наличие IgG-антител к бактериофагу РА-5, определенных методом иммуноферментного анализа (ИФА); причем схема иммунизация животного соответствовала методу, используемому для белковой структуры антигена (в нашем случае - белковый капсид фаговой частицы).The indirect confirmation of the presence of a small number of full-fledged phage particles (and not just bacteriophage DNA) absorbed into the blood of experimental rabbits can be the presence of IgG antibodies to the bacteriophage RA-5 determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); moreover, the immunization schedule of the animal corresponded to the method used for the protein structure of the antigen (in our case, the protein capsid of the phage particle).

Определение IgG-антител к бактериофагу РА-5 методом иммуноферментного анализа (ИФА).Determination of IgG antibodies to the bacteriophage RA-5 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

1. В сыворотке крови иммунизированного кролика методом ИФА обнаружены IgG-антитела к бактериофагу РА-5, причем в высоком титре, что показано при двукратном титровании сыворотки от неразведенной до разведения 1/524280. Даже в лунке с сывороткой в разведении 1/32768 регистрировалась достаточно высокая оптическая плотность (1,013). Оптическая плотность в контрольных лунках (без антигена) не превышала 0,100.1. In the blood serum of an immunized rabbit by ELISA, IgG antibodies to the bacteriophage RA-5 were detected, and in a high titer, which is shown by double titration of serum from undiluted to dilution 1/524280. Even in a well with serum at a dilution of 1/32768, a sufficiently high optical density was recorded (1.013). The optical density in the control wells (without antigen) did not exceed 0.100.

2. В качестве дополнительной контрольной точки исследована сыворотка неиммунизированного кролика. Антитела к бактериофагу РА-5 у данного кролика не обнаружены (оптическая плотность в лунках с неразведенной сывороткой - около 0,200).2. As an additional control point, the serum of an unimmunized rabbit was studied. No antibodies to the bacteriophage RA-5 were detected in this rabbit (optical density in the wells with undiluted serum is about 0.200).

3. Была проанализирована сыворотка кролика до и после приема ректальной свечи с бактериофагом РА-5. До однократного введения суппозитория антител к бактериофагу в сыворотке животного обнаружено не было. Спустя 23 дня после однократного введения суппозитория с бактериофагом обнаружены антитела к бактериофагу РА-5 в невысоком титре (оптическая плотность - около 0,600).3. The rabbit serum was analyzed before and after receiving a rectal suppository with bacteriophage RA-5. Prior to a single administration of a suppository of antibodies to a bacteriophage, no serum was detected in the animal serum. 23 days after a single administration of a suppository with a bacteriophage, antibodies to the bacteriophage RA-5 were detected in a low titer (optical density - about 0.600).

Дополнительно было проведено определение антител к бактериофагу РА-5 в реакции преципитации:Additionally, the determination of antibodies to the bacteriophage RA-5 in the precipitation reaction was carried out:

Спустя 10 дней после иммунизации кролика (четыре цикла внутримышечных инъекций с интервалом в 10 дней, в качестве антигена использовали бактериофаг РА-5 в концентрации 10¹⁰ БОЕ/мл) была поставлена реакция преципитации в геле по Оухтерлони. Используемые реагенты: в качестве антигена - бактериофаг РА-5 в максимальном титре 10¹⁰ БОЕ/мл, в качестве антитела - сыворотка иммунизированного кролика, раститрованная от неразведенной до разведения 1/32. Были обнаружены линии преципитации между лунками с антигеном и неразведенной сывороткой кролика свидетельствующие о наличии в сыворотке антител к бактериофагу РА-5.10 days after immunization of the rabbit (four cycles of intramuscular injections with an interval of 10 days, the bacteriophage RA-5 at a concentration of 10 ¹⁰ PFU / ml was used as an antigen) the precipitation reaction in gel according to Ouchterloni was performed. Reagents used: as an antigen - bacteriophage RA-5 in a maximum titer of 10 ¹⁰ PFU / ml, as an antibody - serum of an immunized rabbit, cultivated from undiluted to dilution 1/32. Precipitation lines were detected between wells with antigen and undiluted rabbit serum indicating the presence of antibodies to the bacteriophage RA-5 in the serum.

Даже однократное введение суппозиториев, из-за всасывания фаговых частиц в кровь животного, запускает у млекопитающих иммунный ответ. Наличие механизмов неспецифического антифагового иммунитета было продемонстрировано в опытах in vitro на примере т.н. реакции нейтрализации. Неспецифические факторы защиты снижают исходный титр фаголизата на 10²-10⁴ БОЕ/мл, в то время как сыворотка иммунизированного животного, содержащая IgG-антитела к бактериофагу РА-5, в неразведенном образце полностью блокирует литическую активность фаговых частиц (табл.6).Even a single administration of suppositories, due to the absorption of phage particles into the blood of an animal, triggers an immune response in mammals. The presence of mechanisms of non-specific antiphage immunity was demonstrated in in vitro experiments using the so-called neutralization reactions. Nonspecific protective factors reduce the initial titer of the phagolysate by 10 ² -10 ⁴ PFU / ml, while the serum of an immunized animal containing IgG antibodies to the bacteriophage RA-5 completely blocks the lytic activity of phage particles in an undiluted sample (Table 6).

На итоговом графике (фиг. 3) приведена динамика титра бактериофага SE40 в крови, моче и кале кроликов. Траектории уровней фаговых частиц в исследованных локусах по своей форме (синхронизация минимумов и максимумов значений) практически полностью повторяют друг друга, что свидетельствует, также, как и выработка специфических антител, о системном действии бактериофагов, проникающих после введения per rectum, в органы кровообращения, легкие, печень, желчный пузырь, почки, мочевой пузырь, тонкий и толстый кишечник.The final graph (Fig. 3) shows the dynamics of the titer of the bacteriophage SE40 in the blood, urine and feces of rabbits. The trajectories of the levels of phage particles in the studied loci in their form (synchronization of minima and maxima of values) almost completely repeat each other, which indicates, like the development of specific antibodies, the systemic action of bacteriophages that penetrate the circulatory organs, lungs after perrectum , liver, gall bladder, kidneys, bladder, small and large intestines.

Примеры осуществления изобретенияExamples of carrying out the invention

Пример 1. Суппозитории для профилактики и лечения нозокомиальных инфекций.Example 1. Suppositories for the prevention and treatment of nosocomial infections.

Состав на один суппозиторий массой 1,5 г: жидкая субстанция бактериофагов в количестве 0,2 г, состоящая из трех штаммов фагов, синегнойного РА5 - 2×10⁸ БОЕ/супп, эшерихиозного V18 - 6,0×10⁸ БОЕ/супп и сальмонеллезного SE40 - 1×10⁹ БОЕ/супп, Витепсол W 35 - 1,23, Твин (полисорбат)-80 - 0,07 г. Composition per suppository weighing 1.5 g: liquid substance of bacteriophages in an amount of 0.2 g, consisting of three phage strains, Pseudomonas aeruginosa RA - 2 × 10 ⁸ PFU / supp, Escherichia V18 - 6.0 × 10 ⁸ PFU / supp and salmonella SE40 - 1 × 10 ⁹ PFU / supp, Vitepsol W 35 - 1.23, Tween (polysorbate) -80 - 0.07 g.

Технология изготовления суппозиториев заключается в следующем: в расплавленный при температуре 43-47 градусов витепсол W 35, вводят твин (полисорбат)-80, перемешивают, основу охлаждают до температуры 40 градусов и постепенно при перемешивании вводят жидкую субстанцию бактериофагов, затем суппозиторную массу выливают в ячейки для суппозиториев, охлаждают, запаивают, нарезают и готовые суппозитории упаковывают.The technology for the manufacture of suppositories is as follows: in the Witepsol W 35 molten at a temperature of 43-47 degrees, tween (polysorbate) -80 is introduced, mixed, the base is cooled to a temperature of 40 degrees, and the bacteriophage liquid substance is gradually introduced with stirring, then the suppository mass is poured into cells for suppositories, it is cooled, sealed, cut and the finished suppositories are packaged.

Пример 2. Суппозитории для профилактики и лечения инфекций, передающихся пищевым путем (Food-borne infections).Example 2. Suppositories for the prevention and treatment of food borne infections (Food-borne infections).

Состав на один суппозиторий массой 1,5 г: жидкая субстанция бактериофагов в количестве 0,2 г, состоящая из трех штаммов фагов, листериозного Lm2 - 2×10⁸ БОЕ/супп, эшерихиозного V18 - 6,0×10⁸ БОЕ/супп и сальмонеллезного SE40 - 1×10⁹ БОЕ/супп, Витепсол W 35 - 1,23, Твин (полисорбат)-80 - 0,07 г. Composition per suppository weighing 1.5 g: liquid substance of bacteriophages in an amount of 0.2 g, consisting of three phage strains, Listeriosis Lm2 - 2 × 10 ⁸ PFU / supp, Escherichial V18 - 6.0 × 10 ⁸ PFU / supp and salmonella SE40 - 1 × 10 ⁹ PFU / supp, Vitepsol W 35 - 1.23, Tween (polysorbate) -80 - 0.07 g.

Технология изготовления суппозиториев заключается в следующем: в расплавленный при температуре 43-47 градусов витепсол, вводят твин (полисорбат)-80, перемешивают, основу охлаждают до температуры 40 градусов и постепенно при перемешивании вводят жидкую субстанцию бактериофагов, затем суппозиторную массу выливают в ячейки для суппозиториев, охлаждают, запаивают, нарезают и готовые суппозитории упаковывают.The technology of manufacturing suppositories is as follows: in the Vitepsol molten at a temperature of 43-47 degrees, tween (polysorbate) -80 is introduced, mixed, the base is cooled to a temperature of 40 degrees and gradually the bacteriophage substance is injected with stirring, then the suppository mass is poured into suppository cells , cool, solder, cut and packaged suppositories.

Пример 3. Суппозитории для профилактики и лечения инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП).Example 3. Suppositories for the prevention and treatment of infections associated with the provision of medical care (IASP).

Состав на один суппозиторий массой 1,5 г: жидкая субстанция бактериофагов в количестве 0,2 г, состоящая из четырех штаммов фагов, стафилококкового SCH111 - 3×10⁸ БОЕ/супп, клебсиеллезного KPV811 - 2×10⁸ БОЕ/супп, ацинетобактерного АМ24 - 1×10⁹ БОЕ/супп и синегнойного РА5 - 2×10⁸ БОЕ/супп, Витепсол W 35 - 1,26, Твин (полисорбат)-80 - 0,04 г. Composition per suppository weighing 1.5 g: liquid substance of bacteriophages in an amount of 0.2 g, consisting of four phage strains, staphylococcal SCH111 - 3 × 10 ⁸ PFU / supp, Klebsiellosis KPV811 - 2 × 10 ⁸ PFU / supp, acinetobacter AM24 - 1 × 10 ⁹ PFU / supp and pseudomonas PA5 - 2 × 10 ⁸ PFU / supp, Witepsol W 35 - 1.26, Twin (polysorbate) -80 - 0.04 g.

Пример 4. Суппозитории для профилактики и лечения острых кишечных и пищевых токсикоинфекций.Example 4. Suppositories for the prevention and treatment of acute intestinal and food toxicoinfections.

Состав на один суппозиторий массой 1,5 г: жидкая субстанция бактериофагов в количестве 0,2 г, состоящая из пяти штаммов фагов, стафилококкового SCH111 - 3×10⁸ БОЕ/супп, клебсиеллезного KPV811 - 2×10⁸ БОЕ/супп, листериозного Lm2 - 2×10⁸ БОЕ/супп, эшерихиозного V18 - 6,0×10⁸ БОЕ/супп и сальмонеллезного SE40 - 1×10⁹ БОЕ/супп, твердый жир типа А - 1,23, Твин (полисорбат)-80 - 0,07 г. Composition per suppository weighing 1.5 g: liquid substance of bacteriophages in an amount of 0.2 g, consisting of five phage strains, staphylococcal SCH111 - 3 × 10 ⁸ PFU / supp, Klebsiellosis KPV811 - 2 × 10 ⁸ PFU / supp, listeriosis Lm2 - 2 × 10 ⁸ PFU / supp, Escherichia V18 - 6.0 × 10 ⁸ PFU / supp and salmonella SE40 - 1 × 10 ⁹ PFU / supp, type A solid fat - 1.23, Tween (polysorbate) -80 - 0 07 g.

Технология изготовления суппозиториев заключается в следующем: в расплавленный при температуре 45-50 градусов твердый жир типа А, вводят твин (полисорбат)-80, перемешивают, основу охлаждают до температуры 40-42 градусов и постепенно при перемешивании вводят жидкую субстанцию бактериофагов, затем суппозиторную массу выливают в ячейки для суппозиториев, охлаждают, запаивают, нарезают и готовые суппозитории упаковывают.The manufacturing technology of suppositories is as follows: type A solid fat melted at a temperature of 45-50 degrees, tween (polysorbate) -80 is introduced, mixed, the base is cooled to a temperature of 40-42 degrees, and the bacteriophage liquid substance is gradually introduced with stirring, then the suppository mass it is poured into suppository cells, cooled, sealed, cut and the finished suppositories are packaged.

Пример 5. Определение специфической антибактериальной активности (титра бактериофагов) опытной серии суппозиториев на основе бактериофагов на конец срока годности препарата 1 год при температуре хранения 4±2°С.Example 5. Determination of specific antibacterial activity (bacteriophage titer) of an experimental series of suppositories based on bacteriophages at the end of the shelf life of the drug 1 year at a storage temperature of 4 ± 2 ° C.

В результате проведенного исследования нами заявлено получение жидкой субстанции бактериофагов в качестве АФС для суппозиторной лекарственной формы в титре 10¹⁰ БОЕ/мл, что является исходно достаточным количеством фаговых частиц с точки зрения последующего определения специфической антибактериальной активности бактериофагов в готовой лекарственной форме. Так, в оптимальном по технологии и физическим показателям (определенным в ГФ) заявляемом составе минимальная концентрация бактериофага составляет 2×10⁸ БОЕ/супп, что при сравнении с зарегистрированными пероральными средствами на основе бактериофагов, позволяет сделать вывод о соответствии концентрации АФС в суппозитории терапевтической дозе, не менее 10⁶ БОЕ/мл. Доклинические испытания заявляемой суппозиторной лекарственной формы, проведенные на лабораторных животных (кроликах), также подтверждают безопасность и оптимальность разработанного состава суппозиториев с точки зрения обеспечиваемого уровня биодоступности АФС. Уровень бактериофагов в образцах клинического материала, полученного от кроликов после однократного введения суппозиториев, достигал максимума через 4,5-6 часов после введения суппозиториев. Бактериофаги сохранялись в крови, моче и кале неинфицированных бактерией-хозяином животных до 24 часов и более. Подтвержденный фармакокинетическими и иммунологическими методами исследований системный механизм действия ректально введенного препарата на основе субстанции бактериофагов предполагает создание нового подхода к индивидуализированной антибактериальной терапии для лечения инфекций, вызванных лекарственно-устойчивыми штаммами возбудителей.As a result of our study, we claimed to obtain a liquid substance of bacteriophages as APS for a suppository dosage form in a titer of 10 ¹⁰ PFU / ml, which is initially a sufficient number of phage particles from the point of view of subsequent determination of the specific antibacterial activity of bacteriophages in a finished dosage form. Thus, in the claimed composition that is optimal in terms of technology and physical parameters (defined in the Global Fund), the minimum concentration of bacteriophage is 2 × 10 ⁸ PFU / supp, which, when compared with registered oral agents based on bacteriophages, allows us to conclude that the concentration of APS in the suppository corresponds to a therapeutic dose , at least 10 ⁶ PFU / ml. Preclinical trials of the claimed suppository dosage form, conducted on laboratory animals (rabbits), also confirm the safety and optimality of the developed composition of the suppositories in terms of the level of bioavailability of the APS. The level of bacteriophages in the samples of clinical material obtained from rabbits after a single administration of suppositories reached a maximum of 4.5-6 hours after administration of suppositories. Bacteriophages persisted in the blood, urine and feces of animals not infected with the host bacterium for up to 24 hours or more. Confirmed by pharmacokinetic and immunological research methods, the systemic mechanism of action of a rectally administered drug based on the substance of bacteriophages suggests the creation of a new approach to individualized antibacterial therapy for the treatment of infections caused by drug-resistant strains of pathogens.

Список литературыBibliography

1. «Bacteriophages and Probiotics - Alternatives to Antibiotics» dedicated to the 120th birth anniversary of Professor George Eliava, July 1-4, 2012, Tbilisi, Georgia.1. “Bacteriophages and Probiotics - Alternatives to Antibiotics” dedicated to the 120th birth anniversary of Professor George Eliava, July 1-4, 2012, Tbilisi, Georgia.

2. Abuladze Τ, Li M, Menetrez MY, Dean T, Senecal A, Sulakvelidze A. Bacteriophages reduce experimental contamination of hard surfaces, tomato, spinach, broccoli, and ground beef by Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 2008; 74(20):6230-8.2. Abuladze Τ, Li M, Menetrez MY, Dean T, Senecal A, Sulakvelidze A. Bacteriophages reduce experimental contamination of hard surfaces, tomato, spinach, broccoli, and ground beef by Escherichia coli O157: H7. Appl Environ Microbiol. 2008; 74 (20): 6230-8.

3. Alisky J, Iczkowski K, Rapoport A, Troitsky N. Bacteriophages show promise as antimicrobial agents. J Infect. 1998;36:5-15.3. Alisky J, Iczkowski K, Rapoport A, Troitsky N. Bacteriophages show promise as antimicrobial agents. J Infect. 1998; 36: 5-15.

4. Bacteriophages. Ed. Ipek Kurtboke, InTech, 2012; 268. Abedon TS, Kuhl JS, Blasdel GB, Kutter ME. Phage treatment of human infections. Bacteriophage, 2011; 1(2):66-85.4. Bacteriophages. Ed. Ipek Kurtboke, InTech, 2012; 268. Abedon TS, Kuhl JS, Blasdel GB, Kutter ME. Phage treatment of human infections. Bacteriophage, 2011; 1 (2): 66-85.

5. Boratyński J, Syper D, Weber-Dabrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages. Cell mol boil lett. 2004; 9:253-9.5. Boratyński J, Syper D, Weber-Dabrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages. Cell mol boil lett. 2004; 9: 253-9.

6. Borysowski J, Dabrowska K, Ohams M, et al. The response of the immune system to phage: potential associations with phage therapy. Abstract book, conference.6. Borysowski J, Dabrowska K, Ohams M, et al. The response of the immune system to phage: potential associations with phage therapy. Abstract book, conference.

7. Breitbart M, Haynes M, Kelley S, Angly F, Edwards RA, Felts B, et al. Viral diversity and dynamics in an infant gut. Research in Microbiology. 2008; 159:367-73.7. Breitbart M, Haynes M, Kelley S, Angly F, Edwards RA, Felts B, et al. Viral diversity and dynamics in an infant gut. Research in Microbiology. 2008; 159: 367-73.

8. Bruce S. Seal, Nikolay V. Volozhantsev, Brian B. Oakley, Cesar A. Morales, Johnna K. Garrish, Mustafa Simmons, Edward A. Svetoch and Gregory R. Siragusa. Bacteriophages of Clostridium perfringens. In book: Bacteriophages, Edited by Ipek Kurtboke, ISBN 978-953-51-0272-4, 268 pages, Publisher: InTech, Chapters published March 14, 2012 under CC BY 3.0 license. DOI: 10.5772/1065.8. Bruce S. Seal, Nikolay V. Volozhantsev, Brian B. Oakley, Cesar A. Morales, Johnna K. Garrish, Mustafa Simmons, Edward A. Svetoch and Gregory R. Siragusa. Bacteriophages of Clostridium perfringens. In book: Bacteriophages, Edited by Ipek Kurtboke, ISBN 978-953-51-0272-4, 268 pages, Publisher: InTech, Chapters published March 14, 2012 under CC BY 3.0 license. DOI: 10.5772 / 1065.

9. Brussow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005; 151:2133-40.9. Brussow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005; 151: 2133-40.

10. Carlton RM, Noordman WH, Biswas B, de Meester ED, Loessner MJ. Bacteriophage Ρ100 for control of Listeria monocytogenes in foods: Genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study, and application. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2005; 43:301-12.10. Carlton RM, Noordman WH, Biswas B, de Meester ED, Loessner MJ. Bacteriophage Ρ100 for control of Listeria monocytogenes in foods: Genome sequence, bioinformatic analyses, oral toxicity study, and application. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2005; 43: 301-12.

11. Fortuna W, Miedzybrodzki R, Weber-Dabrowska B, Górski A. Bacteriophage therapy in children: Facts and prospects. Med Sci Monit. 2008; 14(8): 126-32.11. Fortuna W, Miedzybrodzki R, Weber-Dabrowska B, Górski A. Bacteriophage therapy in children: Facts and prospects. Med Sci Monit. 2008; 14 (8): 126-32.

12. Greer GG. Bacteriophage control of foodborne bacteria. J of Food Protection. 2005; 68(5):1102-11.12. Greer GG. Bacteriophage control of foodborne bacteria. J of Food Protection. 2005; 68 (5): 1102-11.

13. Guenther S, Huwyler D, Richard S, Loessner MJ. Virulent bacteriophage for efficient biocontrol of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods. Appl Environ Microbiol. 2009; 75(1):93-100.13. Guenther S, Huwyler D, Richard S, Loessner MJ. Virulent bacteriophage for efficient biocontrol of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods. Appl Environ Microbiol. 2009; 75 (1): 93-100.

14. Hooton SP, Atterbury RJ, Connerton IF. Application of a bacteriophage cocktail to reduce Salmonella Typhimurium U288 contamination on pig skin. Int J Food Microbiol. 2011 Dec; 151(2):157-63.14. Hooton SP, Atterbury RJ, Connerton IF. Application of a bacteriophage cocktail to reduce Salmonella Typhimurium U288 contamination on pig skin. Int J Food Microbiol. 2011 Dec; 151 (2): 157-63.

15. Lawrence DG, Abedon TS. Bacteriophage biocontrol and bioproccessing: application of phage therapy to industry. SIM News. 2003; 53(6):254-62.15. Lawrence DG, Abedon TS. Bacteriophage biocontrol and bioproccessing: application of phage therapy to industry. SIM News. 2003; 53 (6): 254-62.

16. Lawrence DG, Bledar B. Phage-based biocontrol strategies to reduce foodborne pathogens in foods. Bacteriophage. 2011; 1(3): 130-7.16. Lawrence DG, Bledar B. Phage-based biocontrol strategies to reduce foodborne pathogens in foods. Bacteriophage. 2011; 1 (3): 130-7.

17. Letarov A.V. Bacteriophages as a part of the human microbiome. In book: Bacteriophages in Health and Disease 2012. C. 6-20.17. Letarov A.V. Bacteriophages as a part of the human microbiome. In book: Bacteriophages in Health and Disease 2012. C. 6-20.

18. Leverentz B, Conway WS, Janisiewicz W, Camp MJ. Optimizing Concentration and Timing of a Phage Spray Application To Reduce Listeria monocytogenes on Honeydew Melon Tissue. Journal of Food Protection. 2004; 67(8): 1682-6.18. Leverentz B, Conway WS, Janisiewicz W, Camp MJ. Optimizing Concentration and Timing of a Phage Spray Application To Reduce Listeria monocytogenes on Honeydew Melon Tissue. Journal of Food Protection. 2004; 67 (8): 1682-6.

19. Loe-Carrillo C, Abedon TS. Pros and cons of phage therapy. Bacteriophage. 2011;1(2):111-14.19. Loe-Carrillo C, Abedon TS. Pros and cons of phage therapy. Bacteriophage. 2011; 1 (2): 111-14.

20. Lusiak-Szelachowska M, Annabhani Abdulhabib, Weber-Dabrowska B, et al. Escherichia coli bacteriophages in human stool of patients with gastrointestinal tract diseases. Gastroenterologia Polska. 2008; 15(2):87-90.20. Lusiak-Szelachowska M, Annabhani Abdulhabib, Weber-Dabrowska B, et al. Escherichia coli bacteriophages in human stool of patients with gastrointestinal tract diseases. Gastroenterologia Polska. 2008; 15 (2): 87-90.

21. Mai V, Ukhanova M, Visone L, et al. Bacteriophage administration reduces the Concentration of Listeria monocytogenes in the gastrointestinal tract and its translocation to spleen and liver in experimentally infected mice. International J of Microbiology. 2010; 1-6.21. Mai V, Ukhanova M, Visone L, et al. Bacteriophage administration reduces the Concentration of Listeria monocytogenes in the gastrointestinal tract and its translocation to spleen and liver in experimentally infected mice. International J of Microbiology. 2010; 1-6.

22. Merabishvili M, Pimay JP, Verbeken G, Chanishvili N, Tediashvili M, Lashkhi N, et al. Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS One. 2009; 4:e4944.22. Merabishvili M, Pimay JP, Verbeken G, Chanishvili N, Tediashvili M, Lashkhi N, et al. Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. Plos one. 2009; 4: e4944.

23. Sulakvelidze A. A new journal for the most ubiquitous organisms on Earth. Bacteriophage. 2011; 1:1-2.23. Sulakvelidze A. A new journal for the most ubiquitous organisms on Earth. Bacteriophage. 2011; 1: 1-2.

24. Walker K. Use of bacteriophages as novel food additives. Food Regulation in the United States, Michigan State University, 2006; 9. FS06 ANR 490/811.24. Walker K. Use of bacteriophages as novel food additives. Food Regulation in the United States, Michigan State University, 2006; 9. FS06 ANR 490/811.

25. Акимкин В.Г. Перспективы научных исследований в области неспецифической профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Дезинфекционное дело. 2014. Т. 89. №3. С. 5-10.25. Akimkin V.G. Prospects for scientific research in the field of non-specific prevention of infections associated with the provision of medical care. Disinfection business. 2014.V. 89. No. 3. S. 5-10.

26. Асланов Б.И., Зуева Л.П., Кафтырева Л.А., Бойцов А.Г., Акимкин В.Г., Долгий А.А., Брусина Е.Б., Дроздова О.М. Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике. Федеральные клинические (методические) рекомендации. Москва, 2014.26. Aslanov B.I., Zueva L.P., Kaftyreva L.A., Boytsov A.G., Akimkin V.G., Dolgiy A.A., Brusina E.B., Drozdova O.M. The rational use of bacteriophages in medical and anti-epidemic practice. Federal clinical (methodological) recommendations. Moscow, 2014.

27. Дарбеева О.С., Майская Л.М., Перепанова Т.С. Опыт использования адаптированных препаратов бактериофагов // БИОпрепараты. 2002. №1. С. 13-17.27. Darbeeva O.S., Maiskaya L.M., Perepanova T.S. The experience of using adapted preparations of bacteriophages // Biologics. 2002. No. 1. S. 13-17.

28. Дроздова О.М., Брусина Е.Б. Применение бактериофагов в эпидемиологической практике: взгляд через столетие. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010. №5. С. 20-24.28. Drozdova O.M., Brusina E.B. The use of bacteriophages in epidemiological practice: a look through a century. Epidemiology and infectious diseases. 2010. No5. S. 20-24.

29. Миришников К.А. Геномика и протеомика литических бактериофагов Pseudomonas aeruginosa. // Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. - Москва. - 2013. - 234 с. 29. Mirishnikov K.A. Genomics and proteomics of lytic bacteriophages Pseudomonas aeruginosa. // Thesis for the degree of Doctor of Chemical Sciences. - Moscow. - 2013 .-- 234 p.

30. Феоктистова Н.А., Васильев Д.А., Золотухин C.H., Алешкин А.В. Бактериофаги рода Bacillus и перспективы их применения. Инфекция и иммунитет. 2014. №S. С. 116-117.30. Feoktistova N.A., Vasiliev D.A., Zolotukhin C.H., Aleshkin A.V. Bacteriophages of the genus Bacillus and prospects for their use. Infection and immunity. 2014. No. S. S. 116-117.

Claims

1. Антибактериальная композиция в виде суппозитория, характеризующаяся тем, что содержит жидкую субстанцию бактериофагов, включающую по меньшей мере три бактериофага с титром не менее 2×10⁸ БОЕ/суппозиторий каждый, суппозиторную основу, включающую витепсол или твердый жир типа А, а также твин-80, при следующем соотношении компонентов на 1 суппозиторий, масс. %:1. An antibacterial composition in the form of a suppository, characterized in that it contains a liquid substance of bacteriophages, including at least three bacteriophages with a titer of at least 2 × 10 ⁸ PFU / suppository each, a suppository base, including vitepsol or type A solid fat, as well as tween -80, in the following ratio of components per 1 suppository, mass. %:

жидкая субстанция бактериофаговliquid substance of bacteriophages 13,313.3 витепсол или твердый жир типа Аvitepsol or type A solid fat 82-8482-84 твин-80twin 80 2,7-4,72.7-4.7

2. Способ приготовления антибактериальной композиции в виде суппозитория по п. 1, отличающийся тем, что сначала в расплавленный при температуре 43-50°C витепсол или твердый жир типа А вводят твин-80, затем полученную основу охлаждают до температуры 40-42°C и при перемешивании вводят в нее жидкую субстанцию бактериофагов.2. A method of preparing an antibacterial composition in the form of a suppository according to claim 1, characterized in that tween-80 is introduced into the Vitepsol or solid fat type A melted at a temperature of 43-50 ° C, then the resulting base is cooled to a temperature of 40-42 ° C and with stirring, the liquid substance of bacteriophages is introduced into it.