RU2621866C1

RU2621866C1 - Amycolatopsis orientalis strain - producers of ehremomitcin antibiotic and method for ehremomitcin production

Info

Publication number: RU2621866C1
Application number: RU2016113795A
Authority: RU
Inventors: Вахтанг Витальевич Джавахия; Елена Викторовна Глаголева; Татьяна Михайловна Воинова; Евгения Дмитриевна Попова; Александр Игоревич Овчинников; Дмитрий Львович Шоболов; Вадим Юрьевич Балабаньян; Михаил Геннадьевич Чернобровкин
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Технология Лекарств"
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2017-06-07

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: Amycolatopsis orientalis strain, and a method for ehremomitcin antibiotic production are proposed. Amycolatopsis orientalis strain with high activity of ehremomitcin antibiotic production is deposited in the Russian National Collection of Microorganisms of the Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G.K. Skryabin, RAS under accession number VKMAc-2717D. Method for ehremomitcin antibiotic preparation includes antibiotic sorption from the culture fluid to the carboxyl cation exchanger Purolite C104 or C106 in H⁺-form, antibiotic elution by ammonia solution, eluate concentration, followed by neutralisation and crystallization as by precipitation by means of isopropanol.

EFFECT: high product yield.

2 cl, 2 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности и касается способа получения и выделения биологически активного соединения - эремомицина для использования в качестве антибиотика.The invention relates to the field of medicine and the pharmaceutical industry and relates to a method for producing and isolating a biologically active compound - eremomycin for use as an antibiotic.

Антибиотик эремомицин относится к группе полициклических гликопептидов (далгапептидов), в которую входят антибиотики ристомицин (ристоцетин), актиноидин, ванкомицин, тейкопланин, авопарцин [1].The antibiotic eremomycin belongs to the group of polycyclic glycopeptides (dalgapeptides), which includes the antibiotics ristomycin (ristocetin), actinoidin, vancomycin, teicoplanin, avoparcin [1].

Эремомицин эффективен при лечении заболеваний, вызываемых грамположительными возбудителями включая метициллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка (MRSA) и анаэроба Clostridium difficile - возбудителя псевдомембранного колита.Eremomycin is effective in the treatment of diseases caused by gram-positive pathogens, including methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus (MRSA) and the anaerobic Clostridium difficile, the causative agent of pseudomembrane colitis.

Эремомицин обладает более высокой химиотерапевтической активностью, чем известные антибиотики этой группы, и в 2-3,5 раза меньшей токсичностью. Эремомицин в 2-4 раза более активен в отношении метициллин-устойчивых штаммов стафилококка (MRSA), различных штаммов стрептококка, а также анаэробных грамположительных бактерий - клостидий и кокков, и в отличие от ванкомицина эремомицин не обладает местно-раздражающим действием и поэтому может вводиться не только внутривенно, но и внутримышечно [2].Eremomycin has a higher chemotherapeutic activity than the known antibiotics of this group, and is 2-3.5 times less toxic. Eremomycin is 2-4 times more active against methicillin-resistant strains of staphylococcus (MRSA), various strains of streptococcus, as well as anaerobic gram-positive bacteria - clostidia and cocci, and unlike vancomycin, eremomycin does not have a locally irritating effect and therefore can not be administered only intravenously, but also intramuscularly [2].

Эремомицин сульфатEremomycin sulfate

С 1997 года известен (Авторское свид. 1475150) антибиотик и способ получения антибиотика эремомицина, заключающийся в том, что культуру продуцента Nocardia orientalis штамма ИНА 238 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, органические и неорганические источники азота и минеральные соли, далее полученный нативный раствор собирают на смоле Амберлит ХАД-2 и целевой продукт элюируют смесью ацетон н-бутанол вода, взятых в соотношении 1:1:1 при рН 3, а затем осаждают целевой продукт из водного концентрата избытком ацетона и очищают хроматографически при рН 6,5 на карбоксильной смоле КБ-2 (NH⁺ ₄) 0,5 н раствором аммиака, далее осаждают антибиотик ацетоном и кристаллизуют из водного этанола [3].Since 1997, an antibiotic and a method for producing an eremomycin antibiotic have been known (Author's certificate 1475150), namely, that the culture of the producer Nocardia orientalis strain INA 238 is grown on a nutrient medium containing carbon sources, organic and inorganic sources of nitrogen and mineral salts, the resulting native the solution is collected on Amberlite XAD-2 resin and the target product is eluted with a 1: 1: 1 acetone n-butanol water mixture at pH 3, and then the target product is precipitated from the aqueous concentrate with an excess of acetone and purified by chromatography graphically at pH 6.5 on a KB-2 (NH ⁺ ₄ ) carboxyl resin with a 0.5 N ammonia solution, the antibiotic is precipitated with acetone and crystallized from aqueous ethanol [3].

Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 150 мг эремомицина на 1 л культуральной жидкости). Выход целевого продукта - эремомицина основания 35-37% от содержания в нативном растворе, чистота препарата 86,0-87,0%.The disadvantage of this strain is the low antibiotic content in the culture fluid (not more than 150 mg of eremomycin per 1 liter of culture fluid). The yield of the target product is eremomycin base 35-37% of the content in the native solution, the purity of the drug 86.0-87.0%.

В патенте RU 2110578 описывается получение антибиотика с использованием штамма ΒΚΜΠ-S 892, обладающего повышенной продуктивностью эремомицина (1800 мг в 1 л культуральной жидкости (КЖ)). Способ получения антибиотика эремомицина путем биосинтеза штамма-продуцента, сорбции нативного раствора, элюции антибиотика с последующим его выделением, концентрацией и кристаллизацией, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ΒКΠΜ-S 892, сорбцию проводят на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме, элюируют раствором аммиака, элюат нейтрализуют, обеззоливают, пропускают через сорбент ПТФЭ, антибиотик с сорбента вытесняют водой, концентрируют до содержания антибиотика 120-140 мг/мл и кристаллизуют в форме сульфата. Выход очищенного кристаллического препарата эремомицина сульфата от содержания в нативном растворе составляет 60,0-65,0%, чистота целевого продукта 97,0% (метод ВЭЖХ) [4].Patent RU 2110578 describes the preparation of an antibiotic using strain S-S 892, which has an increased productivity of eremomycin (1800 mg in 1 liter of culture fluid (QL)). A method of producing an eremomycin antibiotic by biosynthesis of a producer strain, sorption of a native solution, elution of an antibiotic followed by isolation, concentration and crystallization, characterized in that the producer uses the strain Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ΒКΠΜ-S 892, sorption is carried out on the KB-2 carboxyl cation exchanger in salt form, eluted with ammonia solution, the eluate is neutralized, desalted, passed through a PTFE sorbent, the antibiotic is displaced from the sorbent with water, concentrated to an antibiotic content of 120-140 mg / ml and crystallized in the form of sulfate. The yield of purified crystalline preparation of eremomycin sulfate from the content in the native solution is 60.0-65.0%, the purity of the target product is 97.0% (HPLC method) [4].

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения эремомицина, описанный в патенте RU 2352631 С2. Штамм ВКПМ-АС 807 - продуцент антибиотика эремомицина, имеющий уровень антибиотической активности - 2300 мг/л эремомицина в ферментационной жидкости, определенный методом диффузии в агар, используется для получения эремомицина.Closest to the claimed invention is a method for producing eremomycin, described in patent RU 2352631 C2. Strain VKPM-AC 807 - producer of the antibiotic eremomycin, having a level of antibiotic activity of 2300 mg / l of eremomycin in the fermentation liquid, determined by diffusion into agar, is used to obtain eremomycin.

С целью выделения эремомицина проводят его сорбцию из нативного раствора (отфильтрованной от мицелия культуральной жидкости) на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме, элюируют раствором аммиака, элюат нейтрализуют, обеззоливают, пропускают через сорбент ПТФЭ, антибиотик с сорбента вытесняют водой, концентрируют в вакууме до содержания эремомицина (120-140) мг/мл и кристаллизуют в форме сульфата. Выход эремомицина составляет 1200 мг с 1 литра нативного раствора [5].In order to isolate eremomycin, it is sorbed from the native solution (filtered from the mycelium of the culture fluid) on the KB-2 carboxylic cation exchanger in salt form, eluted with ammonia, the eluate is neutralized, desalted, passed through a PTFE sorbent, the antibiotic is displaced from the sorbent with water, concentrated in vacuo to an eremomycin content (120-140) mg / ml and crystallized in the form of sulfate. The yield of eremomycin is 1200 mg per 1 liter of native solution [5].

Многостадийность процесса усложняет реализацию способа в условиях производства.The multi-stage process complicates the implementation of the method in a production environment.

Задачей настоящего изобретения являлось создание нового продуцента антибиотика с высокой продуктивностью и оптимального способа выделения и очистки эремомицина.The present invention was the creation of a new antibiotic producer with high productivity and the optimal method for the isolation and purification of eremomycin.

Получен новый штамм - продуцент эремомицина штамм Amycolatopsis orientalis ТЛ-1.A new strain, the producer of eremomycin, strain Amycolatopsis orientalis TL-1, was obtained.

Штамм получен путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов известного штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ Ас-807. В качестве мутагенного фактора были использованы УФ-лучи с длиной волны 254 нм (лампа Mineralight, мощность 12,5 Вт). Водную суспензию спор помещали на расстоянии 40 см от лампы, при этом интенсивность излучения лампы составляла 0,25 мВт/см². Высокопродуктивный штамм был выделен после облучения исходной культуры в течение 15 минут.The strain was obtained by multistage selection using mutagenic factors and targeted methods for selecting modifiers of the known Amycolatopsis orientalis VKPM As-807 strain. UV rays with a wavelength of 254 nm (Mineralight lamp, power 12.5 W) were used as a mutagenic factor. An aqueous spore suspension was placed at a distance of 40 cm from the lamp, while the radiation intensity of the lamp was 0.25 mW / cm ² . A highly productive strain was isolated after irradiation of the original culture for 15 minutes.

Продуктивность штамма Amycolatopsis orientalis ТЛ-1 определялась методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Диапазон продуктивности штамма, зависящий от условий культивирования, составляет 3300-3900 мг в 1 л КЖ. Полученный новый штамм депонирован во Всероссийской коллекции культур Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под номером VKM Ac-2717D согласно правилам международного депонирования по правилам Будапештского договора.The productivity of the strain Amycolatopsis orientalis TL-1 was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The range of productivity of the strain, depending on the cultivation conditions, is 3300-3900 mg in 1 l of QOL. The resulting new strain was deposited in the All-Russian Collection of Cultures of the Federal State Budgetary Institution of Science Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G.K. Scriabin of the Russian Academy of Sciences under the number VKM Ac-2717D according to the rules of international deposit according to the rules of the Budapest Treaty.

Штамм VKM Ac-2717D обладает повышенной продуктивностью эремомицина (3300-3900 мг в 1 л КЖ).The strain VKM Ac-2717D has an increased productivity of eremomycin (3300-3900 mg in 1 l of QOL).

Культурально-морфологические признаки штамма VKM Ac-2717D. Температура 28°С; длительность выращивания 5-7 суток.Cultural and morphological characteristics of the strain VKM Ac-2717D. Temperature 28 ° C; the duration of cultivation is 5-7 days.

Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия прямые или слегка извилистые, распадающиеся на фрагменты различной длины; поверхность спор гладкая.Morphological signs. Hyphae of the aerial mycelium are straight or slightly sinuous, breaking up into fragments of various lengths; the surface of the spores is smooth.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С, оптимум роста 28°С и в диапазоне значений рН (6,0-9,0) с оптимумом роста при рН 7,5; желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с лимоннокислым железом.Physiological and biochemical properties. Aerobe. It grows at (24-37) ° C, a growth optimum of 28 ° C and in the range of pH values (6.0-9.0) with a growth optimum at pH 7.5; dilutes gelatin, milk peptones. Sucrose inverts. Starch hydrolyzes. Fiber does not grow. Restores nitrates to nitrites. It does not form melanoid pigments when growing on Tresner's medium with ferric citrate.

Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, фруктозу, лактозу, сахарозу, рамнозу, ксилозу, рибозу, арабинозу, маннит, мальтозу; не утилизирует рафинозу, сорбит, маннозу, целлюлозу.Use of carbon sources. It utilizes glucose, fructose, lactose, sucrose, rhamnose, xylose, ribose, arabinose, mannitol, maltose well; does not utilize raffinose, sorbitol, mannose, cellulose.

Антагонистические свойстваAntagonistic properties

Штамм Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D при росте на агаровых средах угнетает рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и не действует на грамотрицательные бактерии Escherichia coli, Comamonas terrigena, Providencia stuartii.When growing on agar media, the strain Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D inhibits the growth of gram-positive bacteria Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus and does not affect gram-negative bacteria Escherichia coli, Comamonas terrigenaii, Providencia.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫNutrient media

Агаризованная питательная средаAgar medium

Для поддержания, хранения и приготовления посевного материала культуры используется агаризованная среда состава, %: глюкоза - 2,0; соевый пептон - 1,5; дрожжевой экстракт - 0,1; агар - 2,0; рН - 7,0-7,2.To maintain, store and prepare the seed of the culture, an agar medium of the composition is used,%: glucose - 2.0; soy peptone - 1.5; yeast extract - 0.1; agar - 2.0; pH is 7.0-7.2.

Вегетативная питательная средаVegetative medium

Ферментационная питательная средаFermentation medium

Хранение культурыCulture preservation

Штамм Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D хранят на агаризованной среде состава, %: глюкоза - 2,0; соевый пептон - 1,5; дрожжевой экстракт - 0,1; агар - 2,0; рН - 7,0-7,2 не более трех месяцев при температуре около 5°С в холодильной камере. Для длительного хранения культуру лиофилизируют или хранят в жидком глицерине при - 70°С.The strain Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D is stored on an agar medium of the composition,%: glucose - 2.0; soy peptone - 1.5; yeast extract - 0.1; agar - 2.0; pH - 7.0-7.2 no more than three months at a temperature of about 5 ° C in the refrigerator. For long-term storage, the culture is lyophilized or stored in liquid glycerol at -70 ° C.

Поддержание культурыMaintaining culture

Культуру продуцента эремомицина Amycolatopsis orientalis VKM Ас-2717D поддерживают на синтетической среде Эмерсона, состава, %: мясной экстракт - 0,4; дрожжевой экстракт - 0,1; мясной пептон - 0,4; глюкоза - 1,0; NaCl - 0,25; агар - 2,0 рН=7,0-7,2. Для поддержания уровня продуктивности культуры, перед каждым пересевом ее на свежие питательные среды, проводят моноспоровый рассев на чашки Петри.The culture of the producer of eremomycin Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D is maintained on Emerson synthetic medium, composition,%: meat extract - 0.4; yeast extract - 0.1; meat peptone - 0.4; glucose - 1.0; NaCl - 0.25; agar - 2.0 pH = 7.0-7.2. To maintain the level of crop productivity, before each reseeding it on fresh nutrient media, monospore sieving on Petri dishes is carried out.

Выращивание культуры продуцента в чашках Петри проводят в течение 10-14 суток при температуре 28°С.The culture of the producer in Petri dishes is grown for 10-14 days at a temperature of 28 ° C.

Для пересева на чашки Петри отбирают от 20 до 30 типичных колоний продуцента.From 20 to 30 typical producer colonies were selected for transfer to Petri dishes.

Таким образом, создан новый мутантный штамм Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D, отличающийся от известного по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения источников углерода (сахароза, инозит, галактоза) и по продуктивности, которая на 30% превосходит продуктивность штамма-прототипа Amycolatopsis orientalis ВКПМ - Ас-807. Продуктивность нового штамма Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D, определенная методом ВЭЖХ, составляет 3300-3900 мг в 1 л культуральной жидкости, в зависимости от условий культивирования, что значительно превосходит продуктивность известных штаммов продуцентов эремомицина. Использование нового штамма Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D, как продуцента для биосинтеза эремомицина, позволяет значительно увеличить выход целевого продукта в культуральной жидкости. Кроме этого, авторами проведено успешное масштабирование процесса биосинтеза и тем самым продемонстрирована возможность проведения процесса биосинтеза в промышленном масштабе.Thus, a new mutant strain of Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D was created, which differs from the known growth pattern on diagnostic agar media, the degree of assimilation of carbon sources (sucrose, inositol, galactose) and productivity, which is 30% higher than the productivity of the prototype strain Amycolatopsis orientalis VKPM - Ac-807. The productivity of the new strain Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D, determined by HPLC, is 3300-3900 mg per 1 liter of culture fluid, depending on the cultivation conditions, which significantly exceeds the productivity of the known strains of eremomycin producers. The use of a new strain of Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D, as a producer for the biosynthesis of eremomycin, can significantly increase the yield of the target product in the culture fluid. In addition, the authors successfully scaled the biosynthesis process and thereby demonstrated the possibility of carrying out the biosynthesis process on an industrial scale.

Согласно настоящему изобретению предлагается следующий способ выделения и очистки препарата.According to the present invention, the following method of isolation and purification of the drug.

Эмпирическим путем были подобраны гелевые полиакриловые слабокислотные сорбенты Пьюролайт С104 и С106 в Н⁺-форме, которые добавляют прямо в культуральную жидкость и которые позволяют очень избирательно сорбировать антибиотик из культуральной жидкости. Сорбент способен работать при повышенных температурах (это позволяет не проводить охлаждения культуральной жидкости) и понижает уровень рН, что также позволяет сократить еще одну операцию при обработке культуральной жидкости. Сорбент способствует практически полному устранению сопутствующих целевому продукту примесей - минорных компонентов, пигментов, продуктов белкового характера, солей и др., которые остаются в культуральной жидкости. Затем сорбент отделяют от культуральной жидкости, тщательно отмывают водой и десорбируют антибиотик раствором аммиака, элюат нейтрализуют, концентрируют до 2/3 первоначального объема и кристаллизуют в форме сульфата. Получают эремомицин сульфат с выходом 75-80% (от содержания в культуральной жидкости) с содержанием основного вещества не менее 98%.Empirically, we selected gel polyacrylic weakly acidic sorbents Purolight C104 and C106 in the H ⁺ form, which are added directly to the culture fluid and which allow very selective sorption of the antibiotic from the culture fluid. The sorbent is able to work at elevated temperatures (this allows you to not carry out cooling of the culture fluid) and lowers the pH level, which also allows you to reduce another operation when processing the culture fluid. The sorbent contributes to the almost complete elimination of impurities associated with the target product - minor components, pigments, protein products, salts, etc. that remain in the culture fluid. Then the sorbent is separated from the culture fluid, washed thoroughly with water and the antibiotic is stripped with an ammonia solution, the eluate is neutralized, concentrated to 2/3 of the original volume and crystallized in the form of sulfate. Get eremomycin sulfate with a yield of 75-80% (of the content in the culture fluid) with a basic substance content of at least 98%.

Предложенный способ позволяет существенно упростить выделение и очистку целевого продукта при сохранении высокого выхода и качества препарата (существующие способы, описанные выше, предполагают проведение как минимум 15 операций по выделению и очистке антибиотика, а предлагаемый способ только 7).The proposed method can significantly simplify the selection and purification of the target product while maintaining a high yield and quality of the drug (existing methods described above involve at least 15 operations for the isolation and purification of the antibiotic, and the proposed method is only 7).

Изобретение поясняется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1Example 1

Биосинтез эремомицина в ферментере объемом 15 литров.Eremomycin biosynthesis in a 15 liter fermenter.

Подготовка посевного материала.Sowing preparation.

Для приготовления посевного материала в чашках Петри используют агаризованную среду состава, %: глюкоза - 2,0; соевый пептон - 1,5; дрожжевой экстракт - 0,1; агар - 2,0; рН=7,0 до стерилизации.For the preparation of seed in Petri dishes, an agar medium of the composition is used,%: glucose - 2.0; soy peptone - 1.5; yeast extract - 0.1; agar - 2.0; pH = 7.0 before sterilization.

Проверенную агаризованную среду засевают мицелием исходной посевной культуры, полученной моноспоровым рассевом, и выдерживают в термостате от 5 до 7 суток, при температуре 28°С. Культура на чашках должна давать сплошной газон, поверхность складчатая, мицелий бежевого цвета.The tested agar medium is seeded with the mycelium of the initial seed culture obtained by monospore sieving, and incubated for 5 to 7 days at a temperature of 28 ° C. The culture on the cups should give a solid lawn, a folded surface, beige mycelium.

Выращивание посевного материала.Growing seed.

Выращивание посевного материала в колбах проводят в одну стадию на вегетативной среде, %: соевая мука - 0,5, глицерин - 3,0, калий азотнокислый - 1,0, натрия хлорид - 1,0, магний сернокислый - 0,01, вода водопроводная до 1 л, рН 7,0 до стерилизации.The cultivation of seed in flasks is carried out in one stage on a vegetative medium,%: soy flour - 0.5, glycerin - 3.0, potassium nitrate - 1.0, sodium chloride - 1.0, magnesium sulfate - 0.01, water tap to 1 liter, pH 7.0 before sterilization.

Мицелием культуры Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D, после инкубации в течение 5-7 суток при 28°С на агаризованной среде состава, %: глюкоза - 2,0; соевый пептон - 1,5; дрожжевой экстракт - 0,1; агар - 2,0, засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 1,0 л), и выращивают при 28°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 230-250 об/мин (эксцентриситет 5 см). При микроскопии наблюдается негустая базофильная сетка, протоплазма в гифах дифференцирована.Mycelium culture Amycolatopsis orientalis VKM Ac-2717D, after incubation for 5-7 days at 28 ° C on an agar medium,%: glucose - 2.0; soy peptone - 1.5; yeast extract - 0.1; agar - 2.0, inoculate culture medium (100 ml in 1.0 L Erlenmeyer flasks), and grow at 28 ° C for 24-48 hours on a thermostatic rocking machine at 230-250 rpm (5 cm eccentricity) . During microscopy, a thin basophilic network is observed, protoplasm in hyphae is differentiated.

Биосинтез эремомицина.Eremomycin biosynthesis.

В ферментер заливают питьевую воду и при перемешивании загружают навески всех компонентов, %: глицерин - 6,0; соевая мука - 2,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,02; хлорид магния - 0,02; нитрат калия - 0,6; хлорид кальция - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,3; СОМ - 0,3. Доводят объем среды питьевой водой до 9 литров.Drinking water is poured into the fermenter and, with stirring, samples of all components are loaded,%: glycerol - 6.0; soy flour - 2.0; monosubstituted potassium phosphate - 0.02; magnesium chloride - 0.02; potassium nitrate - 0.6; calcium chloride - 0.3; yeast extract - 0.3; COM - 0.3. Bring the volume of the medium with drinking water to 9 liters.

В качестве дополнительного источника углеводов используется глицерин, в количестве 5 г/л среды в сутки. Подпитку глицерина вносят на 2-е, 3-е и 4-е сутки культивирования.Glycerin is used as an additional source of carbohydrates, in an amount of 5 g / l of medium per day. Glycerol supplementation is introduced on the 2nd, 3rd and 4th day of cultivation.

В питательной среде создают рН (7,0±0,2) с помощью 20%-го раствора едкого натра и стерилизуют в течение часа. После стерилизации ферментер со средой охлаждают до 29-30°С. Среда должна быть стерильна и иметь рН (7,6±0,3).In a nutrient medium, create a pH (7.0 ± 0.2) with a 20% sodium hydroxide solution and sterilize for one hour. After sterilization, the fermenter with the medium is cooled to 29-30 ° C. The medium should be sterile and have a pH (7.6 ± 0.3).

Посев ферментера осуществляют в асептических условиях, при этом количество посевного материала составляет 10% от объема среды в ферментере. После засева ферментера температуру культуральной жидкости поддерживают на уровне 28±1°С.The sowing of the fermenter is carried out under aseptic conditions, while the amount of seed is 10% of the volume of medium in the fermenter. After inoculation of the fermenter, the temperature of the culture fluid is maintained at 28 ± 1 ° C.

В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве 300-600 л/час. Перемешивание со скоростью 100-500 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 50%.In the fermenter is continuously fed sterile air in an amount of 300-600 l / h. Mixing at a speed of 100-500 rpm. The concentration of dissolved oxygen is maintained at 50%.

Время ферментации 144-168 часов.Fermentation time 144-168 hours.

Начиная с 72 часов роста ведут контроль содержания эремомицина методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении эремомицина на 6-7 сутки процесс ферментации прекращают.Starting from 72 hours of growth, the eremomycin content is monitored by HPLC. With a maximum accumulation of eremomycin on the 6-7th day, the fermentation process is stopped.

К концу биосинтеза (144±24 часа) культуральная жидкость имеет значение рН 8,3±0,25.By the end of biosynthesis (144 ± 24 hours), the culture fluid has a pH value of 8.3 ± 0.25.

Содержание эремомицина не менее 3300 мг/л (ВЭЖХ).The content of eremomycin is not less than 3300 mg / l (HPLC).

Микроскопическое описание мицелия: в препарате, окрашенном метиленовым синим, наблюдаются короткие, слабоветвящиеся, членистые, базофильные гифы.Microscopic description of mycelium: in a preparation stained with methylene blue, short, weakly branching, segmented, basophilic hyphae are observed.

Пример 2Example 2

Биосинтез эремомицина в ферментере объемом 100 литров.Eremomycin biosynthesis in a 100 liter fermenter.

Подготовка посевного материала.Sowing preparation.

Проверенную агаризованную среду засевают мицелием исходной посевной культуры, полученной моноспоровым рассевом, и выдерживают в термостате от 5 до 7 суток при температуре 28°С. Культура на чашках должна давать сплошной газон, поверхность складчатая, мицелий бежевого цвета.The tested agar medium is seeded with the mycelium of the initial seed culture obtained by monospore sieving, and incubated for 5 to 7 days at a temperature of 28 ° C. The culture on the cups should give a solid lawn, a folded surface, beige mycelium.

Выращивание посевного материала 1 генерации.Cultivation of seed 1 generation.

Мицелием культуры Amycolatopsis orientalis VKMAc-2717D, после инкубации в течение 5-7 суток при 28°С на агаризованной среде состава, %: глюкоза - 2,0; соевый пептон - 1,5; дрожжевой экстракт - 0,1; агар - 2,0, засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 1,0 л), и выращивают при 28°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при (230-250) об/мин (эксцентриситет 5 см). При микроскопии наблюдается негустая базофильная сетка, протоплазма в гифах дифференцирована. Посторонняя микрофлора в посевном материале должна отсутствовать.Mycelium culture Amycolatopsis orientalis VKMAc-2717D, after incubation for 5-7 days at 28 ° C on an agar medium composition,%: glucose - 2.0; soy peptone - 1.5; yeast extract - 0.1; agar - 2.0, inoculate culture medium (100 ml in 1.0 L Erlenmeyer flasks), and grow at 28 ° C for 24-48 hours on a thermostatically controlled rocking machine at (230-250) rpm (eccentricity 5 cm). During microscopy, a thin basophilic network is observed, protoplasm in hyphae is differentiated. Foreign microflora in the seed should be absent.

Выращивание посевного материала 2 генерации.Cultivation of seed 2 generations.

В ферментер заливают 2,0 л питьевой воды и при перемешивании загружают навески всех компонентов, %: соевая мука - 0,5, глицерин - 3,0, калий азотнокислый - 1,0, натрия хлорид - 1,0, магний сернокислый - 0,01. Доводят объем среды питьевой водой до 6 литров.2.0 L of drinking water is poured into the fermenter and, while stirring, samples of all components are loaded,%: soy flour - 0.5, glycerin - 3.0, potassium nitrate - 1.0, sodium chloride - 1.0, magnesium sulfate - 0 , 01. Bring the volume of the medium with drinking water to 6 liters.

В питательной среде создают рН (7,2±0,1) с помощью 20%-го раствора едкого натра и стерилизуют в течение часа. После стерилизации ферментер со средой охлаждают до 29-30°С. Среда должна быть стерильна и иметь рН (7,2±0,3).In a nutrient medium, create a pH (7.2 ± 0.1) with a 20% sodium hydroxide solution and sterilize for one hour. After sterilization, the fermenter with the medium is cooled to 29-30 ° C. The medium should be sterile and have a pH (7.2 ± 0.3).

В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве 210 л/час. Перемешивание со скоростью 250 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 50%. Время ферментации 12-24 часов.The fermenter is continuously supplied with sterile air in an amount of 210 l / h. Stirring at a speed of 250 rpm. The concentration of dissolved oxygen is maintained at 50%. Fermentation time is 12-24 hours.

Биосинтез эремомицина.Eremomycin biosynthesis.

Ферментационную среду состава, %: глицерин - 6,0; соевая мука - 2,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,02; хлорид магния - 0,02; нитрат калия - 0,6; хлорид кальция - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,3; СОМ - 0,3, растворяют в 10 л горячей водопроводной воды в ферментере и доводят объем до 60 литров.The fermentation medium composition,%: glycerin - 6.0; soy flour - 2.0; monosubstituted potassium phosphate - 0.02; magnesium chloride - 0.02; potassium nitrate - 0.6; calcium chloride - 0.3; yeast extract - 0.3; COM - 0.3, dissolved in 10 liters of hot tap water in the fermenter and bring the volume to 60 liters.

В качестве дополнительного источника углеводов используется глицерин, в количестве 5 г/л среды в сутки. В качестве дополнительного источника азота используют дрожжевой экстракт, в количестве 3 г/л среды в сутки. Подпитку глицерина и дрожжевого экстракта вносят на 2-е, 3-е и 4-е сутки культивирования.Glycerin is used as an additional source of carbohydrates, in an amount of 5 g / l of medium per day. As an additional source of nitrogen, yeast extract is used in an amount of 3 g / l of medium per day. Make-up of glycerol and yeast extract is introduced on the 2nd, 3rd and 4th day of cultivation.

В ферментер непрерывно подают стерильный воздух в количестве 2,1-4,2 м³/час. Перемешивание со скоростью 100-350 об/мин. Концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 50%. Время ферментации 144-168 часов.The fermenter is continuously fed with sterile air in an amount of 2.1-4.2 m ³ / h. Mixing at a speed of 100-350 rpm. The concentration of dissolved oxygen is maintained at 50%. Fermentation time 144-168 hours.

К концу биосинтеза (144±24) часа культуральная жидкость имеет следующие показатели:By the end of biosynthesis (144 ± 24) hours, the culture fluid has the following indicators:

рН достигает значения (8,3±0,25);pH reaches a value of (8.3 ± 0.25);

содержание эремомицина не менее 3900 мг в 1 л культуральной жидкости (ВЭЖХ).the content of eremomycin is not less than 3900 mg in 1 liter of culture fluid (HPLC).

Пример 3Example 3

Сорбция на катионите С104 в Н+ -форме.Sorption on C104 cation exchanger in the H + form.

К культуральной жидкости объемом 10 л (содержание эремомицина 3300 мг/л) добавляют в один прием 150 г слабокислотного катионита Purolite С104 в Н+ -форме (далее по тексту - катионит), перемешивают суспензию в течение 1,5 часов и отбирают пробу для определения остаточного содержания эремомицина в культуральной жидкости (ВЭЖХ). При отсутствии эремомицина в отобранной пробе перемешивание останавливают и отделяют катионит от культуральной жидкости. Катионит тщательно трижды промывают водой. Затем к отмытому таким образом катиониту добавляют 600 мл воды и при интенсивном перемешивании по каплям добавляют аммиак до рН 9. Отфильтровывают смолу и повторно обрабатывают ее так, как описано выше. Фильтраты, полученные после первой и второй обработки, объединяют и концентрируют в вакууме при температуре 29-34°С до 2/3 исходного объема, а затем нейтрализуют 40%-ным раствором серной кислоты до рН 6,9.To a culture fluid with a volume of 10 l (eremomycin content 3300 mg / l), 150 g of weakly acidic Purolite C104 cation exchanger in H + form (hereinafter referred to as cation exchanger) are added in one step, the suspension is mixed for 1.5 hours and a sample is taken for determination the residual content of eremomycin in the culture fluid (HPLC). In the absence of eremomycin in the selected sample, stirring is stopped and cation exchange resin is separated from the culture fluid. Cation exchange resin is thoroughly washed three times with water. Then, 600 ml of water are added to the cation exchange resin thus washed, and with vigorous stirring, ammonia is added dropwise to pH 9. The resin is filtered off and re-treated as described above. The filtrates obtained after the first and second treatment are combined and concentrated in vacuo at a temperature of 29-34 ° C to 2/3 of the initial volume, and then neutralized with a 40% sulfuric acid solution to a pH of 6.9.

Из полученного концентрата эремомицин кристаллизуют в форме сульфата при добавлении двухкратного объема изопропилового спирта, охлаждают до 8-10°С и выдерживают в течение 2 часов. Затем фильтруют, промывают на фильтре небольшим количеством изопропилового спирта и сушат в вакууме при 30°С в течение 6 часов. Получают 28 г эремомицина сульфата. Выход целевого продукта от содержания в культуральной жидкости составляет 80% (содержание основного вещества не менее 98%)From the obtained concentrate, eremomycin is crystallized in the form of sulfate with the addition of a double volume of isopropyl alcohol, cooled to 8-10 ° C and incubated for 2 hours. It is then filtered, washed on the filter with a small amount of isopropyl alcohol and dried in vacuum at 30 ° C for 6 hours. Obtain 28 g of eremomycin sulfate. The yield of the target product from the content in the culture fluid is 80% (the content of the main substance is not less than 98%)

Пример 4Example 4

Сорбция на катионите С106 в Н+ -форме.Sorption on C106 cation exchange resin in the H + form.

Обработка проводится аналогично примеру 3 при использовании сорбента Purolite С106 в Н+ -форме.Processing is carried out analogously to example 3 when using the sorbent Purolite C106 in the H + form.

Получают 26,9 г эремомицина сульфата. Выход целевого продукта от содержания в культуральной жидкости составляет 77% (содержание основного вещества 98%).26.9 g of eremomycin sulfate are obtained. The yield of the target product from the content in the culture fluid is 77% (the content of the main substance is 98%).

Источники информацииInformation sources

1. Van Bambeke F., Van Laethem Y., Courvalin P., Tulkens P.M. Glycopeptide antibiotics: from conventional molecules to new derivatives. // Drugs. - 2004. - V. 64. - P. 913-936.1. Van Bambeke F., Van Laethem Y., Courvalin P., Tulkens P.M. Glycopeptide antibiotics: from conventional molecules to new derivatives. // Drugs. - 2004. - V. 64. - P. 913-936.

2. Gause G.F., Brazhnikova M.G., Lomakina N.N., Berdnikova T.F., Fedorova G.B., Tokareva N.L., Borisova V.N., Batta G. Eremomycin - new glycopeptide antibiotics. Chemical properties and structure. J. Antibiotics, 1989, V. 42, P. 1790-1799.2. Gause G.F., Brazhnikova M.G., Lomakina N.N., Berdnikova T.F., Fedorova G. B., Tokareva N.L., Borisova V.N., Batta G. Eremomycin - new glycopeptide antibiotics. Chemical properties and structure. J. Antibiotics, 1989, V. 42, P. 1790-1799.

3. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Лайко А.В., Селезнева Т.И., Свешникова М.А., Бражникова М.Г. Антибиотик "эремомицин" и способ его получения. Авторское свидетельство РФ №1475150, 06.02.1981.3. Gauze G. F., Preobrazhenskaya T. P., Laiko A. V., Selezneva T. I., Sveshnikova M. A., Brazhnikova M. G. Antibiotic "eremomycin" and method for its preparation. Copyright certificate of the Russian Federation No. 1475150, 02/06/1981.

4. Бражникова М.Г., Лайко А.В., Федорова Г.Б., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Лапчинская О.А., Сабурова Т.П., Погожева В.В. Штамм Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ S-892 - продуцент антибиотика эремомицина и способ получения антибиотика эремомицина. Патент РФ №2110578, 18.06.1997.4. Brazhnikova MG, Laiko AV, Fedorova GB, Preobrazhenskaya TP, Sveshnikova MA, Lapchinskaya OA, Saburova TP, Pogozheva V.V. Strain Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini VKPM S-892 - producer of the antibiotic eremomycin and a method for producing the antibiotic eremomycin. RF patent No. 2110578, 06/18/1997.

5. Лапчинская О.А., Федорова Г.Б., Погожева В.В., Преображенская М.Н., Катруха Г.С, Пономаренко В.И. Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807-продуцент эремомицина. Патент РФ №2352631, 26.03.2007.5. Lapchinskaya OA, Fedorova GB, Pogozheva VV, Preobrazhenskaya M.N., Katruha G.S., Ponomarenko V.I. The strain Amycolatopsis orientalis VKPM-Ac-807-producer of eremomycin. RF patent No. 2352631, March 26, 2007.

Claims

1. Штамм Amycolatopsis orientalis VKMAc-2717D - продуцент антибиотика эремомицина.1. The strain Amycolatopsis orientalis VKMAc-2717D is a producer of the antibiotic eremomycin.

2. Способ получения антибиотика эремомицина путем биосинтеза штамма-продуцента, сорбции и элюции антибиотика с последующей концентрацией элюата до 2/3 первоначального объема с последующей нейтрализацией и кристаллизацией в форме сульфата путем высаживания изопропанолом, отличающийся тем, что в качестве продуцента антибиотика используют штамм Amycolatopsis orientalis VKMAc-2717D, сорбцию проводят из культуральной жидкости карбоксильным катионитом Пьюролайт С104 или С106 в H⁺-форме.2. A method of producing an eremomycin antibiotic by biosynthesis of a producer strain, sorption and elution of an antibiotic, followed by concentration of the eluate to 2/3 of the initial volume, followed by neutralization and crystallization in sulfate form by precipitation with isopropanol, characterized in that the Amycolatopsis orientalis strain is used as an antibiotic producer VKMAc-2717D, sorption is carried out from the culture fluid with carboxyl cation exchanger Purolight C104 or C106 in the H ⁺ form.