RU2621163C1

RU2621163C1 - Antifibrolytic means

Info

Publication number: RU2621163C1
Application number: RU2016105143A
Authority: RU
Inventors: Сергей Николаевич Орлов
Priority date: 2016-02-16
Filing date: 2016-02-16
Publication date: 2017-05-31

Abstract

FIELD: pharmacology.

SUBSTANCE: invention discloses application of cardiac ouabain glycoside as an antifibrotic agent.

EFFECT: invention allows to expand the range of drugs for treatment of idiopathic pulmonary fibrosis, reduce the number of complications, increase accessibility for patients.

4 dwg

Description

Изобретение относится к области фармакологии и пульмонологии, а именно к антифибролитическим средствам для лечения идиопатического фиброза легких.The invention relates to the field of pharmacology and pulmonology, in particular to antifibrolytic agents for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis.

Идиопатический фиброз легких (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) - быстро прогрессирующая болезнь со смертельным исходом, обусловленная нарушением структурной организации легочных альвеол. Заболевание чаще всего встречается у пациентов в возрасте старше 50 лет. Отмечается преобладание заболевания у мужчин, соотношение полов составляет примерно 1,7:1 в пользу мужчин [1]. Прогноз заболевания неблагоприятный. В настоящее время отсутствуют какие-либо эффективные фармакологические подходы лечения этой болезни, поддерживаемые официальными медицинскими учреждениями, включая Food & Drag Administration (FDA). Трансплантация легкого успешна у больных терминальной стадией идиопатического фиброза легких, не страдающих сопутствующей патологией, в возрасте не старше 55 лет (что составляет <40% всех больных идиопатическим фиброзом легких). Следует особо отметить, что к настоящему времени в РФ было проведено около 50 успешно проведенных операций по пересадке легких, в то время как по данным НИИ Пульмонологии МЗ РФ количество больных с диагностированным фиброзом легких приближается к 500 тысяч. Сердечные гликозиды могут быть первым успешным подходом терапии этой болезни. Следует особо отметить, что для внедрения сердечных гликозидов в клинику не требуется дорогостоящих токсикологических исследований, т.к. эти соединения более 50 лет используются при лечении сердечной недостаточности [2].Idiopathic pulmonary fibrosis (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) is a rapidly progressing fatal disease caused by a violation of the structural organization of pulmonary alveoli. The disease most often occurs in patients over the age of 50 years. The prevalence of the disease in men is noted, the sex ratio is approximately 1.7: 1 in favor of men [1]. The prognosis of the disease is unfavorable. Currently, there are no effective pharmacological approaches to the treatment of this disease supported by official medical institutions, including the Food & Drag Administration (FDA). Lung transplantation is successful in patients with end-stage idiopathic pulmonary fibrosis, not suffering from concomitant pathology, at the age of not older than 55 years (which is <40% of all patients with idiopathic pulmonary fibrosis). It should be especially noted that to date, about 50 successfully performed lung transplant operations have been performed in the Russian Federation, while according to the Research Institute of Pulmonology of the Ministry of Health of the Russian Federation, the number of patients with diagnosed pulmonary fibrosis is approaching 500 thousand. Cardiac glycosides may be the first successful treatment for this disease. It should be especially noted that expensive toxicological studies are not required to introduce cardiac glycosides into the clinic. these compounds have been used in the treatment of heart failure for more than 50 years [2].

Известны лекарственные средства, применяемые для лечения фиброзных заболеваний легких. В настоящее время для лечения фиброзных заболеваний легких используют препараты из группы глюкокортикостероидов (преднизолон), цитостатиков (циклофосфамид), иммунодепрессанты (азатиоприн), а также колхицин - препарат из группы средств, влияющих на обмен мочевой кислоты, обладающий также антифиброзным действием. Основным препаратом, назначаемым при идиопатическом фиброзе легких, является преднизолон. Однако эффективность терапии глюкокортикостероидами при идиопатическом легочном фиброзе составляет лишь 20-30%. В случае его неэффективности или противопоказаний, которые ограничивают область его применения, в качестве дополнительных препаратов назначают лекарственные средства из других групп (иммунодепрессанты и цитостатики). Предпочтение отдают комбинированным режимам терапии [1].Known drugs used to treat fibrotic lung diseases. Currently, drugs from the group of glucocorticosteroids (prednisone), cytostatics (cyclophosphamide), immunosuppressants (azathioprine), and colchicine, a drug from the group of drugs that affect the metabolism of uric acid, which also has antifibrotic effects, are used to treat fibrotic lung diseases. The main drug prescribed for idiopathic pulmonary fibrosis is prednisone. However, the effectiveness of glucocorticosteroid therapy for idiopathic pulmonary fibrosis is only 20-30%. In case of its ineffectiveness or contraindications, which limit the scope of its application, drugs from other groups (immunosuppressants and cytostatics) are prescribed as additional drugs. Combination therapy regimens are preferred [1].

В феврале 2011 года Европейская комиссия одобрила для лечения взрослых пациентов, страдающих фиброзом легких, новый лекарственный препарат пирфенидон (коммерческое название Эсбриет). Управление контроля качества лекарственных средств и продуктов питания США (FDA) одобрило Эсбриет (пирфенидон) для лечения идиопатического легочного фиброза в США. В настоящее время препарат доступен на рынке 28-ми европейских стран и ряда стран мира (Канада, Япония, Южная Корея, Китай, Индия, Аргентина, Мексика и т.д.) [3, 4].In February 2011, the European Commission approved the treatment of adult patients with pulmonary fibrosis, the new drug pirfenidone (trade name Esbriet). The US Food and Drug Administration (FDA) approved Esbriet (pirfenidone) for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis in the United States. Currently, the drug is available on the market in 28 European countries and several countries of the world (Canada, Japan, South Korea, China, India, Argentina, Mexico, etc.) [3, 4].

Все эти препараты имеют выраженные побочные эффекты, ухудшающие качество жизни пациентов. Одним из них является иммуносупрессорное действие, приводящее к ряду нежелательных эффектов.All these drugs have pronounced side effects that worsen the quality of life of patients. One of them is an immunosuppressive effect, leading to a number of undesirable effects.

Преднизолон (рег. №: П N013537/01, Код ATX: Н02АВ06 (Prednisolone))-иммунодепрессивное, противоаллергическое, противовоспалительное лекарственное средство. Тормозит развитие симптомов воспаления: угнетает фагоцитоз, высвобождение лизосомальных ферментов, а также синтез и высвобождение медиаторов воспаления. Вызывает уменьшение проницаемости капилляров, торможение миграции лейкоцитов. Усиливает синтез липомодулина, ингибитора фосфолипазы А₂, высвобождающей арахидоновую кислоту из фосфолипидных мембран, с одновременным ингибированием ее синтеза. Механизм иммунодепрессивного действия до конца не изучен. Известно, что преднизолон уменьшает количество Т-лимфоцитов, моноцитов и ацидофильных гранулоцитов. Уменьшает связывание иммуноглобулинов с рецепторами на поверхности клеток и тормозит синтез или высвобождение интерлейкинов путем уменьшения бластогенеза Т-лимфоцитов и уменьшения раннего иммунологического ответа. Тормозит проникновение иммунологических комплексов через мембраны и уменьшает концентрацию компонентов комплемента и иммуноглобулинов.Prednisolone (reg. No: P N013537 / 01, Code ATX: Н02АВ06 (Prednisolone)) is an immunosuppressive, anti-allergic, anti-inflammatory drug. It inhibits the development of symptoms of inflammation: inhibits phagocytosis, the release of lysosomal enzymes, as well as the synthesis and release of inflammatory mediators. It causes a decrease in capillary permeability, inhibition of white blood cell migration. Enhances the synthesis of lipomodulin, an inhibitor of phospholipase A ₂ , releasing arachidonic acid from phospholipid membranes, while inhibiting its synthesis. The mechanism of immunosuppressive action is not fully understood. Prednisone is known to reduce the number of T-lymphocytes, monocytes, and acidophilic granulocytes. It reduces the binding of immunoglobulins to receptors on the surface of cells and inhibits the synthesis or release of interleukins by reducing the blastogenesis of T-lymphocytes and decreasing the early immunological response. It inhibits the penetration of immunological complexes through membranes and reduces the concentration of complement components and immunoglobulins.

Противопоказания включают артериальную гипертензию, болезнь Иценко-Кушинга, психозы, почечную недостаточность, остеопороз, язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, сахарный диабет, бактериальный эндокардит, сифилис, туберкулез, беременность. К побочным эффектам относятся возбуждение, бессонница, артериальная гипертензия, отеки, гипокалиемия, алкалоз, аменорея, остеопороз, синдром Иценко-Кушинга, гипергликемия, иммунодефицит [5, 6].Contraindications include arterial hypertension, Itsenko-Cushing's disease, psychosis, renal failure, osteoporosis, gastric and duodenal ulcer, diabetes mellitus, bacterial endocarditis, syphilis, tuberculosis, pregnancy. Side effects include agitation, insomnia, arterial hypertension, edema, hypokalemia, alkalosis, amenorrhea, osteoporosis, Itsenko-Cushing's syndrome, hyperglycemia, immunodeficiency [5, 6].

Азатиоприн (рег. №: Р N001426/01, Код ATX: L04AX01 (Azathioprine)) - является структурным аналогом (антиметаболитом) аденина, гипоксантина и гуанина, входящих в состав нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), нарушает биосинтез нуклеотидов и подавляет пролиферацию тканей. Иммунодепрессивное действие обусловлено гипоплазией лимфоидной ткани, снижением количества Т-лимфоцитов, нарушением синтеза иммуноглобулинов, появлением в крови атипичных фагоцитов и в конечном итоге подавлением клеточно-опосредованных реакций гиперчувствительности. К противопоказаниям относятся гиперчувствительность, угнетение гемопоэза (гипопластическая и апластическая анемия, лейкопения, лимфопения, тромбоцитопения), печеночная недостаточность, беременность, период лактации, детский возраст.Azathioprine (reg. No: P N001426 / 01, ATX Code: L04AX01 (Azathioprine)) - is a structural analogue (antimetabolite) of adenine, hypoxanthine and guanine, which are part of nucleic acids (DNA and RNA), disrupts the biosynthesis of nucleotides and inhibits tissue proliferation . The immunosuppressive effect is due to hypoplasia of lymphoid tissue, a decrease in the number of T-lymphocytes, a violation of the synthesis of immunoglobulins, the appearance of atypical phagocytes in the blood, and ultimately the suppression of cell-mediated hypersensitivity reactions. Contraindications include hypersensitivity, inhibition of hematopoiesis (hypoplastic and aplastic anemia, leukopenia, lymphopenia, thrombocytopenia), liver failure, pregnancy, lactation, childhood.

К побочным эффектам относятся: угнетение костномозгового кроветворения (лейкопения, тромбоцитопения, анемия), мегалобластный эритропоэз, макроцитоз, гемолитическая анемия; диспепсические и аллергические реакции, в также панувеит, острая почечная недостаточность, развитие вторичных инфекций, менингеальные реакции, интерстициальный пневмонит, алопеция, при длительном применении может оказывать мутагенное действие, вызывая хромосомные аберрации у человека, тератогенность, канцерогенность (злокачественные опухоли: лимфоретикулярные, эпителиальные, опухоли кожи на участках, подвергаемых воздействию солнечных лучей) [5, 6].Side effects include: inhibition of bone marrow hematopoiesis (leukopenia, thrombocytopenia, anemia), megaloblastic erythropoiesis, macrocytosis, hemolytic anemia; dyspeptic and allergic reactions, as well as panuveitis, acute renal failure, the development of secondary infections, meningeal reactions, interstitial pneumonitis, alopecia, with prolonged use can have a mutagenic effect, causing chromosomal aberrations in humans, teratogenicity, carcinogenicity (malignant tumors, lymphoretic, skin tumors in areas exposed to sunlight) [5, 6].

Циклофосфамид (рег. №: ЛС-001048, Код ATX: L01AA01 (Cyclophosphamide)) - противоопухолевое, цитостатическое, иммунодепрессивное, алкилирующее лекарственное средство. Биотрансформируется в печени с образованием активных метаболитов, оказывающих алкилирующее действие. Алкилирующие метаболиты атакуют нуклеофильные центры белковых молекул, образуют поперечные сшивки между нитями ДНК и блокируют митоз клеток. Иммунодепрессивное действие проявляется в подавлении пролиферации лимфоцитарных клонов (преимущественно В-лимфоцитов), участвующих в иммунном ответе. Противопоказания: гиперчувствительность, тяжелые нарушения функции почек, гипоплазия костного мозга, лейкопения (число лейкоцитов менее 3,5⋅10⁹/л) и/или тромбоцитопения (число тромбоцитов менее 120⋅10⁹/л), выраженная анемия, выраженная кахексия, терминальные стадии онкологических заболеваний, беременность, кормление грудью.Cyclophosphamide (reg. No: LS-001048, ATX Code: L01AA01 (Cyclophosphamide)) is an antitumor, cytostatic, immunosuppressive, alkylating drug. It is biotransformed in the liver with the formation of active metabolites that have an alkylating effect. Alkylating metabolites attack the nucleophilic centers of protein molecules, form cross-links between DNA strands and block cell mitosis. The immunosuppressive effect is manifested in the suppression of proliferation of lymphocytic clones (mainly B-lymphocytes) involved in the immune response. Contraindications: hypersensitivity, severe renal impairment, bone marrow hypoplasia, leukopenia (white blood cell count less than 3.5⋅10 ⁹ / l) and / or thrombocytopenia (platelet count less than 120⋅10 ⁹ / l), severe anemia, severe cachexia, terminal stages of cancer, pregnancy, breastfeeding.

Побочные действия: 1) со стороны органов ЖКТ: анорексия, стоматит, сухость во рту, тошнота, рвота, диарея, боль в желудке, желудочно-кишечные кровотечения, геморрагический колит, токсический гепатит, желтуха; 2) со стороны нервной системы и органов чувств: астения, головокружение, головная боль, спутанность сознания, нарушение зрения; 3) со стороны сердечно-сосудистой системы и крови (кроветворение, гемостаз): миелодепрессия, лейкопения, агранулоцитоз, тромбоцитопения, анемия, кровотечения и кровоизлияния, прилив крови к лицу, кардиотоксичность, сердечная недостаточность, сердцебиение, геморрагический миоперикардит, перикардит; 4) со стороны респираторной системы: одышка, пневмонит, интерстициальный пневмосклероз; 5) со стороны мочеполовой системы: геморрагический цистит, уретрит, фиброз мочевого пузыря, атипия клеток мочевого пузыря, гематурия, учащенное, болезненное или затрудненное мочеиспускание, гиперурикемия, нефропатия, отеки нижних конечностей, гиперурикозурия, некроз почечных канальцев, аменорея, угнетение функции яичников, азооспермия; 6) со стороны кожных покровов: алопеция, гиперпигментация (ногтей на пальцах рук, ладоней), в/к кровоизлияния, покраснение лица, сыпь, крапивница, зуд, гиперемия, отечность, боль в месте инъекции; 7)прочие: анафилактоидные реакции, болевой синдром (боль в спине, боку, костях, суставах), лихорадочный синдром, озноб, развитие инфекций, синдром неадекватной секреции АДГ, микседема (отечность губ), гипергликемия, повышение активности трансаминаз в крови.Side effects: 1) from the digestive tract: anorexia, stomatitis, dry mouth, nausea, vomiting, diarrhea, stomach pain, gastrointestinal bleeding, hemorrhagic colitis, toxic hepatitis, jaundice; 2) from the nervous system and sensory organs: asthenia, dizziness, headache, confusion, impaired vision; 3) on the part of the cardiovascular system and blood (hematopoiesis, hemostasis): myelode depression, leukopenia, agranulocytosis, thrombocytopenia, anemia, bleeding and hemorrhage, flushing of the face, cardiotoxicity, heart failure, palpitations, hemorrhagic myopericarditis; 4) from the respiratory system: shortness of breath, pneumonitis, interstitial pneumosclerosis; 5) from the genitourinary system: hemorrhagic cystitis, urethritis, fibrosis of the bladder, atypia of bladder cells, hematuria, rapid, painful or difficult urination, hyperuricemia, nephropathy, edema of the lower extremities, hyperuricosuria, necrosis of the tubules, azoospermia; 6) on the part of the skin: alopecia, hyperpigmentation (nails on the fingers, palms), intraocular hemorrhage, facial redness, rash, urticaria, itching, hyperemia, swelling, pain at the injection site; 7) others: anaphylactoid reactions, pain (back, side, bones, joints), fever, chills, development of infections, inadequate secretion of ADH, myxedema (lip swelling), hyperglycemia, increased transaminase activity in the blood.

При длительном применении (в течение нескольких лет) возможно развитие вторичных злокачественных опухолей (отдаленный эффект): миело- и лимфопролиферативные заболевания, рак мочевого пузыря (особенно у больных с геморрагическим циститом), рак почечной лоханки (отмечен у больного, находившегося на лечении по поводу церебрального васкулита) [5, 6].With prolonged use (for several years), the development of secondary malignant tumors (long-term effect) is possible: myelogenous and lymphoproliferative diseases, bladder cancer (especially in patients with hemorrhagic cystitis), renal pelvis cancer (noted in a patient who was being treated for cerebral vasculitis) [5, 6].

Колхицин (пр., в составе препарата колхикум-дисперт, рег. №: П №014955/01-2003, Код ATX: М04АС01 (Colchicin)) - колхицин угнетает синтез коллагена III типа и пролиферацию фибробластов, но не влияет на выработку медиаторов инициального повреждения (в особенности фактора а некроза опухолей и интерлейкина-1), угнетает лейко- и лимфопоэз, уменьшает утилизацию глюкозы фагоцитирующими и нефагоцитирующими лейкоцитами, стабилизирует мембраны лизосом нейтрофилов, препятствует образованию амилоидных фибрилл. Однако достоверных преимуществ по сравнению с преднизолоном не обнаружено [7]. К противопоказаниям относятся гиперчувствительность, заболевания желудочно-кишечного тракта и костного мозга, нейтропения, нарушения функции печени и почек, сердечно-сосудистая патология, гнойные инфекции, алкоголизм, беременность, пожилой возраст. В числе побочных эффектов диспептические явления, миелосупрессию (лейкопения, агранулоцитоз, апластическая анемия, тромбоцитопения - как правило, при длительном лечении), печеночная и почечная недостаточность [5, 6].Colchicine (eg, as part of a colchicum-dispersant preparation, reg. No: P No. 014955 / 01-2003, ATX code: M04AC01 (Colchicin)) - colchicine inhibits the synthesis of type III collagen and the proliferation of fibroblasts, but does not affect the production of initial mediators damage (especially tumor necrosis factor a and interleukin-1), inhibits leuko- and lymphopoiesis, reduces glucose utilization by phagocytic and non-phagocytic leukocytes, stabilizes neutrophil lysosome membranes, and prevents the formation of amyloid fibrils. However, significant advantages compared with prednisone were not found [7]. Contraindications include hypersensitivity, diseases of the gastrointestinal tract and bone marrow, neutropenia, impaired liver and kidney function, cardiovascular pathology, purulent infections, alcoholism, pregnancy, old age. Among the side effects are dyspeptic phenomena, myelosuppression (leukopenia, agranulocytosis, aplastic anemia, thrombocytopenia - as a rule, with long-term treatment), hepatic and renal failure [5, 6].

Таким образом, все вышеуказанные препараты обладают широким кругом противопоказаний, что ограничивает их использование у пациентов с соответствующей сопутствующей патологией, а также нежелательными побочными эффектами, среди которых - подавление иммунной системы. Наряду с этим, данные препараты не обладают достаточной эффективностью. Так, положительные результаты при терапии с использованием глюкокортикостероидов (преднизолон) наблюдаются только у 15-20% больных, а увеличение дозы препарата приводит к проявлению побочных эффектов у 90% пациентов [8], а применение таких препаратов, как азатиоприн и циклофосфамид существенно ограничено высоким риском развития побочных эффектов [9]. В связи с этим результаты использования данных препаратов терапии идиопатического фиброза легких нельзя назвать удовлетворительными - смертность от данного заболевания по-прежнему остается достаточно высокой [10].Thus, all of the above drugs have a wide range of contraindications, which limits their use in patients with appropriate concomitant pathology, as well as undesirable side effects, among which is suppression of the immune system. Along with this, these drugs do not have sufficient effectiveness. Thus, positive results in therapy using glucocorticosteroids (prednisone) are observed only in 15-20% of patients, and an increase in the dose of the drug leads to side effects in 90% of patients [8], and the use of drugs such as azathioprine and cyclophosphamide is significantly limited by high the risk of side effects [9]. In this regard, the results of using these drugs for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis cannot be called satisfactory - mortality from this disease is still quite high [10].

Пирфенидон (входит в состав лекарственного препарата Esbriet, производитель Roche (Германия)) - новый препарат, обладающий антифибротическим действием и предназначенный для лечения идиопатического фиброза легких. Проникая в организм, он оказывает противовоспалительный эффект, блокирует фактор роста фибробластов, тромбоцитов, контролирует производство фиброзассоциированных белков и цитокинов [4]. Препарат также отнесен к группе иммунодепрессантов.Pirfenidone (part of the Esbriet drug, manufactured by Roche (Germany)) is a new drug with antifibrotic effect and intended for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis. Penetrating into the body, it has an anti-inflammatory effect, blocks the growth factor of fibroblasts, platelets, and controls the production of fibrosassociated proteins and cytokines [4]. The drug is also assigned to the group of immunosuppressants.

Пирфенидон представляет собой непептидную синтетическую молекулу с выраженным антифибротическим действием, основанным на снижении экспрессии TGF-β1, TNF-α, PDGF и коллагена I типа, благодаря чему снижается избыточное образование соединительной ткани в различных органах.Pirfenidone is a non-peptide synthetic molecule with a pronounced antifibrotic effect, based on a decrease in the expression of TGF-β1, TNF-α, PDGF and type I collagen, thereby reducing the excessive formation of connective tissue in various organs.

Инкубация с 500 и 1000 мг/мл существенно подавляет экспрессию коллагена I типа в течение 6 ч, стимулированную TGF-β1 в концентрации 5 нг/мл [11]. Клинические исследования также подтверждают способность препарата замедлять развитие фиброза [12]. В группе больных, получавших Пирфенидон, отмечалось повышение общей выживаемости. В ходе клинических испытаний Пирфенидон применялся в высоких (1800 мг) и низких дозах (1200 мг). У больных, которые получали Пирфенидон в высокой дозе, отмечалось существенное увеличение емкости легких по сравнению с пациентами, которые не принимали препарат.Incubation with 500 and 1000 mg / ml significantly suppresses the expression of type I collagen for 6 h, stimulated by TGF-β1 at a concentration of 5 ng / ml [11]. Clinical studies also confirm the ability of the drug to slow the development of fibrosis [12]. In the group of patients receiving Pirfenidone, there was an increase in overall survival. In clinical trials, Pirfenidone was used in high (1800 mg) and low doses (1200 mg). In patients who received high-dose Pirfenidone, there was a significant increase in lung capacity compared with patients who did not take the drug.

К противопоказаниям относятся детский возраст до 18 лет; беременность; период лактации и индивидуальная непереносимость компонентов лекарственного средства. Побочные эффекты включают диспептические расстройства и аллергические реакции, фоточувствительность. Все это позволяет использовать препарат у широкого круга пациентов в независимости от сопутствующей патологии.Contraindications include children under 18 years of age; pregnancy; lactation and individual intolerance to the components of the drug. Side effects include dyspeptic disorders and allergic reactions, photosensitivity. All this allows the use of the drug in a wide range of patients, regardless of the concomitant pathology.

Тем не менее существенным недостатком данного препарата является его высокая цена (от 800 евро), что существенно снижает его доступность для пациентов [3].Nevertheless, a significant disadvantage of this drug is its high price (from 800 euros), which significantly reduces its availability to patients [3].

Таким образом, в результате исследования уровня техники можно сделать вывод о том, что имеющийся ассортимент средств для лечения идиопатического фиброза легких ограничен, а известные для применения лекарственные средства обладают большим количеством осложнений и ограниченной в связи с этим, областью применения.Thus, as a result of a study of the prior art, it can be concluded that the available range of drugs for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis is limited, and known drugs have a large number of complications and, therefore, the scope of application is limited.

Новый технический результат - поиск новых лекарственных средств, обладающих антифибролитическим действием, дающих наименьшее число осложнений, для лечения идиопатического фиброза.A new technical result is the search for new drugs with antifibrolytic action, giving the least number of complications, for the treatment of idiopathic fibrosis.

Для достижения нового технического результата предложено использовать сердечный гликозид уабаин.To achieve a new technical result, it was proposed to use cardiac glycoside ouabain.

Новое свойство известного лекарственного средства было обнаружено в ходе проведения экспериментальных исследований.A new property of the well-known drug was discovered during experimental studies.

Сердечные гликозиды на протяжении длительного времени с успехом используются в терапии сердечной недостаточности. Основными представителями являются уабаин.Cardiac glycosides have long been used successfully in the treatment of heart failure. The main representatives are ouabain.

Уабаин - действующее вещество в составе препарата Строфантин-Г (Strophanthin-G) (рег. №: П №016231/01, Код ATX: С01АС01 (Strophantin G)). Оказывает кардиостимулирующее и антиаритмическое действие за счет угнетения Na+-K+-АТФазы клеточной мембраны миокардиоцитов [13]. Оказывает положительный инотропный эффект, отрицательный дромотропный эффект, отрицательный хронотропный эффект и стимулирует образование гетеротропных импульсов вследствие снижения порога возбудимости. При сердечной недостаточности увеличивает ударный и минутный объем сердца, улучшает опорожнение желудочков, уменьшает размеры сердца и понижает потребность миокарда в кислороде. Препараты, содержащие уабаин, используют при сердечной недостаточности IIb-III стадии (III и IV стадии по классификации NYHA), суправентрикулярной тахикардии, трепетании и мерцании предсердий [5, 6].Uabain - the active substance in the composition of the drug Strofantin-G (Strophanthin-G) (reg. No: P No. 016231/01, ATX code: C01AC01 (Strophantin G)). It has a cardiostimulating and antiarrhythmic effect due to inhibition of Na + -K + -ATPase of the cell membrane of myocardiocytes [13]. It has a positive inotropic effect, a negative dromotropic effect, a negative chronotropic effect and stimulates the formation of heterotropic impulses due to a decrease in the excitability threshold. In heart failure, it increases the stroke and minute volume of the heart, improves the emptying of the ventricles, reduces the size of the heart and lowers the need for oxygen in the myocardium. Preparations containing ouabain are used for heart failure stage IIb-III (stage III and IV according to NYHA classification), supraventricular tachycardia, flutter and atrial fibrillation [5, 6].

Новое свойство известного лекарственного средства уабаина, а именно применение в качестве антифибролитического средства для лечения идиопатического фиброза легких, было обнаружено в ходе проведения экспериментальных исследований.A new property of the well-known drug ouabain, namely, the use as an antifibrolytic agent for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis, was discovered during experimental studies.

В активации процесса образования патологической фиброзной ткани важную роль играет трансформирующий ростовой фактор -β1 (TGF-β1) [14]. Под действием TGF-β1 в фибробластах происходит увеличение экспрессии белков цитоскелета и сократительных белков (среди них - гладкомышечный α-актин), которые в норме обнаруживаются в гладкомышечных клетках [15]. Дополнительно происходит усиление секреции белков внеклеточного матрикса (коллагена и фибронектина). Такие фибробласты, имеющие промежуточный фенотип между фибробластами и гладкомышечными клетками, называются миофибробласты [16]. Миофибробласты неизменно обнаруживаются в гистологических пробах из легких больных легочным фиброзом, а их дифференцировка является ключевым процессом в патогенезе фиброзных заболеваний [15].An important role in the activation of the formation of pathological fibrous tissue is played by the transforming growth factor -β1 (TGF-β1) [14]. Under the influence of TGF-β1, fibroblasts increase the expression of cytoskeleton proteins and contractile proteins (among them smooth muscle α-actin), which are normally found in smooth muscle cells [15]. Additionally, there is an increase in the secretion of extracellular matrix proteins (collagen and fibronectin). Such fibroblasts having an intermediate phenotype between fibroblasts and smooth muscle cells are called myofibroblasts [16]. Myofibroblasts are invariably found in histological samples from the lungs of patients with pulmonary fibrosis, and their differentiation is a key process in the pathogenesis of fibrotic diseases [15].

На основе экспериментальных исследований защитное действие сердечных гликозидов было обнаружено при исследовании маркеров дифференцировки миофибробластов и экспрессии стрессовых волокон (α- и β-актина) в фибробластах, изолированных из легких пациентов, подвергшихся трансплантации легких. При этом была выявлена возможность лечения фиброзных заболеваний легких с применением сердечных гликозида уабаина.Based on experimental studies, the protective effect of cardiac glycosides was found in the study of markers of differentiation of myofibroblasts and expression of stress fibers (α- and β-actin) in fibroblasts isolated from the lungs of patients undergoing lung transplantation. At the same time, the possibility of treating pulmonary fibrotic diseases with the use of cardiac ouabain glycoside was revealed.

Фибробласты легких для экспериментальных исследований изолировали согласно описанной ранее методике [17].Lung fibroblasts for experimental studies were isolated according to the previously described method [17].

Уабаин. Влияние уабаина на образование стрессовых волокон (α- и β-актин) в фибробластах легких человека (HLF) исследовали методом флуоресцентной микроскопии, как описано в [18]. Для визуализации стрессовых волокон клетки, выращенные на подложке, фиксировали в 4% фармальдегиде и PBS и обрабатывали 0.2% Triton Х-100 в PBS. Клетки инкубировали с фаллоидином, конъюгированным с родамином (Life Technologies, Grand Island, NY) в течение 1 часа при комнатной температуре, отмывали и помещали на покровные стекла с использованием фиксирующей среды Vectashield, содержащей DAPI для окрашивания ядер клеток (Vector Laboratories, Burlingame, СА).Ouabain. The effect of ouabain on the formation of stress fibers (α- and β-actin) in human lung fibroblasts (HLF) was studied by fluorescence microscopy, as described in [18]. To visualize stress fibers, cells grown on a substrate were fixed in 4% farmaldehyde and PBS and treated with 0.2% Triton X-100 in PBS. Cells were incubated with rhodamine-conjugated phalloidin (Life Technologies, Grand Island, NY) for 1 hour at room temperature, washed and placed on coverslips using Vectashield fixation medium containing DAPI for staining of cell nuclei (Vector Laboratories, Burlingame, CA) )

Изменение экспрессии α- и β- актина оценивали методом вестерн-блот анализа. Для этого клетки обрабатывали индуктором образования стрессовых волокон трансформирующим ростовым фактором β1 (TGF-β1) [18]. Изолирование стрессовых волокон и последующий вестерн-блот анализ проводили согласно методикам, описанным в [18, 19].The change in the expression of α- and β-actin was evaluated by Western blot analysis. For this, the cells were treated with a transforming growth factor β1 (TGF-β1) inducer of the formation of stress fibers [18]. Isolation of stress fibers and subsequent Western blot analysis were performed according to the procedures described in [18, 19].

Как показано на Фиг. 1, уабаин вдвое уменьшал общее содержание актина и нарушал структуру стрессовых волокон.As shown in FIG. 1, ouabain halved the total actin content and disturbed the structure of stress fibers.

Чтобы определить влияние уабаина на дифференцировку миофибробластов, последние обрабатывали трансформирующим ростовым фактором β1 (TGF-β1) - индуктором процессов дифференцировки. Влияние уабаина на дифференцировку миофибробластов оценивали по изменению экспрессии маркеров дифференцировки миофибробластов: гладкомышечного α-актина, фибронектина и коллагена-1 согласно методике, описанной в [18]. Для этого клетки инкубировали 48 ч в присутствии 1 нг/мл TGF-b1, 30 и 100 нМ уабаина, после чего клетки лизировали и определяли экспрессию белков мотодом вестерн-блот анализа с использованием первичных антител против коллагена-1, фибронектина, гладкомышечного α-актина. Как показано на Фиг. 2А, обработка фибробластов легких человека TGF-β1 вызывала выраженное увеличение экспрессии маркеров дифференцировки миофибробластов (специфического гладкомышечного α-актина, фибронектина и коллагена-1). Уабаин (30 и 100 нМ) ингибировал экспрессию маркеров миофибробластов в ответ на действие TGF-β1.To determine the effect of ouabain on the differentiation of myofibroblasts, the latter were treated with transforming growth factor β1 (TGF-β1), an inducer of differentiation processes. The effect of ouabain on the differentiation of myofibroblasts was assessed by the change in the expression of differentiation markers of myofibroblasts: smooth muscle α-actin, fibronectin and collagen-1 according to the method described in [18]. For this, the cells were incubated for 48 h in the presence of 1 ng / ml TGF-b1, 30 and 100 nM ouabain, after which the cells were lysed and protein expression was determined by Western blot analysis using primary antibodies against collagen-1, fibronectin, smooth muscle α-actin . As shown in FIG. 2A, treatment of human lung fibroblasts with TGF-β1 caused a marked increase in the expression of differentiation markers of myofibroblasts (specific smooth muscle α-actin, fibronectin and collagen-1). Uabain (30 and 100 nM) inhibited the expression of myofibroblast markers in response to the action of TGF-β1.

Полученные данные указывают на то, что уабаин снижает TGF-P-индуцированную дифференцировку миофибробластов посредством разрушения актиновых стрессовых волокон.The data obtained indicate that ouabain reduces TGF-P-induced differentiation of myofibroblasts by breaking down actin stress fibers.

Основной мишенью действия сердечного гликозида уабаина, является Na⁺-K⁺-АТФаза. Ингибирование Na⁺-K⁺-АТФазы приводит к увеличению соотношения внутриклеточных концентраций ионов натрия и калия ([Na⁺]i/[K⁺]i), которое может стимулировать экспрессию циклооксигеназы-2 (СОХ-2) - фермента, ограничивающего скорость синтеза простагландинов [20, 21]. Учитывая антифибротическое действие простагландинов через активацию протеинкиназы А (PKA) [22], изучили, оказывают ли сердечные гликозиды стимулирующее действие на экспрессию СОХ-2 в фибробластах легких человека (HLF) и как они влияют на дифференцировку миофибробластов.The main target of the action of cardiac glycoside of ouabain is Na ⁺ -K ⁺ -ATPase. Inhibition of Na ⁺ -K ⁺ -ATPase leads to an increase in the ratio of intracellular concentrations of sodium and potassium ions ([Na ⁺ ] i / [K ⁺ ] i), which can stimulate the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2), an enzyme that limits the synthesis rate prostaglandins [20, 21]. Considering the antifibrotic effect of prostaglandins through the activation of protein kinase A (PKA) [22], it was studied whether cardiac glycosides have a stimulating effect on the expression of COX-2 in human lung fibroblasts (HLF) and how they affect the differentiation of myofibroblasts.

Используя в качестве ингибитора Na⁺, K⁺-АТФазы уабаин, исследовали действие уабаина на [Na⁺]i/[K⁺]i, содержание СОХ-2 и экспрессию маркеров миофибробластов.Using ouabain as Na ⁺ , K ⁺ -ATPase inhibitor, we studied the effect of ouabain on [Na ⁺ ] i / [K ⁺ ] i, the content of COX-2 and the expression of myofibroblast markers.

Концентрации ионов K⁺ и Na⁺оценивали по распределению вне- и внутри клеток ⁸⁶Rb и ²²Na соответственно согласно методике, описанной в [23]. Было выявлено, что в клетках, обработанных TGF-β, уабаин (10 нМ) приводил к 3-кратному увеличению [Na⁺]i и 2-кратному снижению [K⁺]i (Фиг. 3А).The concentrations of K ⁺ and Na ⁺ ions were estimated by the distribution of ⁸⁶ Rb and ²² Na outside and inside the cells, respectively, according to the procedure described in [23]. It was found that in cells treated with TGF-β, ouabain (10 nM) led to a 3-fold increase in [Na ⁺ ] i and a 2-fold decrease in [K ⁺ ] i (Fig. 3A).

Исследование влияния уабаина на экспрессию СОХ-2 и маркеров дифференцировки фибробластов проводили методом вестерн-блот анализа, как описано выше. Уабаин (10, 30 и 100 нМ) существенно ингибировал экспрессию гладкомышечного -α-актина, коллагена-1 и фибронектина, при этом стимулирующее влияние на экспрессию СОХ-2 наблюдалось при действии уабаина в концентрациях свыше 10 нМ (Фиг. 3Б).A study of the effect of ouabain on the expression of COX-2 and fibroblast differentiation markers was carried out by Western blot analysis, as described above. Uabain (10, 30, and 100 nM) significantly inhibited the expression of smooth muscle α-actin, collagen-1, and fibronectin, while a stimulating effect on the expression of COX-2 was observed with ouabain at concentrations above 10 nM (Fig. 3B).

Таким образом, действие сердечного гликозида уабаина, связанное с подавлением TGF-β1-индуцированной дифференцировки фибробластов, обусловлено частичным ингибированием Na⁺-K⁺-АТФазы и увеличением соотношения внутриклеточных концентрации ионов натрия и калия ([Na⁺]i/[K⁺]i).Thus, the action of cardiac ouabain glycoside associated with the suppression of TGF-β1-induced differentiation of fibroblasts is due to partial inhibition of Na ⁺ -K ⁺ -ATPase and an increase in the ratio of intracellular concentrations of sodium and potassium ions ([Na ⁺ ] i / [K ⁺ ] i )

Следует особо отметить, что при исследовании влияния уабаина на экспрессию маркеров дифференцировки миофибробластов и циклоокисгеназы СОХ-2 в фибробластах, изолированных из легких трех больных идиопатическим фиброзом методом вестерн-блот анализа, описанным выше, были получены схожие результаты: наблюдалось снижение экспрессии маркеров дифференцировки миофиоброластов и увеличение экспрессии СОХ-2 в фибробластах, изолированных у 3 больных идиопатическим фиброзом легких (IPF-1,2,3) (Фиг. 4). Полученные данные однозначно указывают на перспективность применения этого соединения для лечения данной формы легочной патологии.It should be especially noted that when studying the effect of ouabain on the expression of differentiation markers of myofibroblasts and COX-2 cyclooxygenase in fibroblasts isolated from the lungs of three patients with idiopathic fibrosis using the Western blot analysis described above, similar results were obtained: a decrease in the expression of differentiation markers of myofiobrolast and increased expression of COX-2 in fibroblasts isolated in 3 patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF-1,2,3) (Fig. 4). The data obtained clearly indicate the promise of using this compound for the treatment of this form of pulmonary pathology.

Предлагаемый препарат сердечный гликозид уабаин на протяжении длительного периода времени с успехом используются в медицинской практике, как кардиотонический и антиаритмический препарат, в связи с чем, для внедрения сердечных гликозидов в клинику не требуется дорогостоящих токсикологических исследований. Как показали наши исследования, сердечный гликозид уабаин полностью подавляет дифференцировку фибробластов, индуцированную TGF-β1 (Фиг. 1, 2). Такое действие обусловлено частичным ингибированием Na⁺, K⁺-АТФ-азы и увеличением соотношения внутриклеточных концентраций ионов натрия и калия. The proposed drug, cardiac glycoside ouabain for a long period of time, has been successfully used in medical practice as a cardiotonic and antiarrhythmic drug, and therefore, expensive toxicological studies are not required to introduce cardiac glycosides into the clinic. As our studies have shown, cardiac glycoside ouabain completely suppresses the differentiation of fibroblasts induced by TGF-β1 (Fig. 1, 2). This effect is due to a partial inhibition of Na ⁺ , K ⁺ -ATPase and an increase in the ratio of intracellular concentrations of sodium and potassium ions.

Приведенные выше экспериментальные данные, демонстрирующие антифибролитическое действие сердечного гликозида, получены для уабаина.The above experimental data demonstrating the antifibrolytic effect of cardiac glycoside were obtained for ouabain.

Известно, что к побочным эффектам данного препарата относятся диспептические расстройства, изменения со стороны центральной нервной системы (головная боль, депрессия, галлюцинации) [5]. Однако сердечные гликозид уабаин не оказывают иммуносупрессорного действия.Side effects of this drug are known to include dyspeptic disorders, changes in the central nervous system (headache, depression, hallucinations) [5]. However, cardiac glycoside ouabain does not have an immunosuppressive effect.

Еще одним важным преимуществом сердечного гликозида уабаина, помимо эффективного подавления фибротических процессов, является низкая по сравнению с пирфенидоном цена препаратов, что повышает его доступность для более широкого круга населения.In addition to the effective suppression of fibrotic processes, another important advantage of ouabain cardiac glycoside is the low cost of drugs compared to pirfenidone, which increases its availability for a wider population.

Источники информацииInformation sources

1) Клинические рекомендации. Пульмонология // Под редакцией А.Г. Чучалина. - Москва: ГЭОТАР. - 2007. - 225 с.1) Clinical recommendations. Pulmonology // Edited by A.G. Chuchalina. - Moscow: GEOTAR. - 2007 .-- 225 s.

2) Dmitrieva R.I. and Doris PA. Cardiotonic steroids: potential endogenous sodium pump ligands with diverse function / R.I. Dmitrieva, P.A. Doris // Experimental biology and medicine. - 2002. - 227. - P. 561-569.2) Dmitrieva R.I. and Doris PA. Cardiotonic steroids: potential endogenous sodium pump ligands with diverse function / R.I. Dmitrieva, P.A. Doris // Experimental biology and medicine. - 2002. - 227. - P. 561-569.

3) Esbriet: EPAR - European Medicines Agency - Europa [Электронный ресурс] URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Product_Information/human/002154/WC500103049.pdf3) Esbriet: EPAR - European Medicines Agency - Europa [Electronic resource] URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Product_Information/human/002154/WC500103049.pdf

4) Pirfenidone and anti-fibrotic therapy in selected patients: патент WO 2012162592 A1. № PCT/US 2012/039538; заявл. 25.05.2012; опубл. 29.11.2012.4) Pirfenidone and anti-fibrotic therapy in selected patients: patent WO 2012162592 A1. No. PCT / US 2012/039538; declared 05/25/2012; publ. 11/29/2012.

5) Энциклопедия лекарств [Электронный ресурс] URL: http://www.rlsnet.ru/.5) Encyclopedia of drugs [Electronic resource] URL: http://www.rlsnet.ru/.

6) Vidal.ru - справочник лекарственных препаратов [Электронный ресурс] URL: http://www.vidal.ru/drugs/6) Vidal.ru - a directory of medicines [Electronic resource] URL: http://www.vidal.ru/drugs/

7) Douglas W.W. Colchicine versus prednisone in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis: a randomized prospective study / W.W. Douglas, J.H. Ryu, S.J. Swensen, K.P. Offord, D.R. Schroeder, G.M. Caron, R.A. DeRemee // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1998. - V. 158. - P. 220-225.7) Douglas W.W. Colchicine versus prednisone in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis: a randomized prospective study / W.W. Douglas, J.H. Ryu, S.J. Swensen, K.P. Offord, D.R. Schroeder, G.M. Caron, R.A. DeRemee // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1998. - V. 158. - P. 220-225.

8) Daniels C.E. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis / C.E. Daniels, J.H. Ryu // Semin Respir Crit Care Med. - 2006. - V. 27. - P. 668-676.8) Daniels C.E. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis / C.E. Daniels, J.H. Ryu // Semin Respir Crit Care Med. - 2006. - V. 27. - P. 668-676.

9) Авдеев C.H. Идиопатические интерстициальные пневмонии: особенности клинической картины и лечения / С.Н. Авдеев // Фарматека. - 2009. - №19. - С.12-19.9) Avdeev C.H. Idiopathic interstitial pneumonia: features of the clinical picture and treatment / S.N. Avdeev // Farmateka. - 2009. - No. 19. - S.12-19.

10) Spagnolo P. Idiopathic pulmonary fibrosis: Recent advances on pharmacological therapy / P. Spagnolo, T.M. Maher, L. Richeldi // Pharmacol Ther. - 2015. - 152. - P. 18-27.10) Spagnolo P. Idiopathic pulmonary fibrosis: Recent advances on pharmacological therapy / P. Spagnolo, T.M. Maher, L. Richeldi // Pharmacol Ther. - 2015. - 152. - P. 18-27.

11) Hisatomi K. Pirfenidone inhibits TGF-β1-induced over-expression of collagen type I and heat shock protein 47 in A549 cells / K. Hisatomi, H. Mukae, N. Sakamoto, Y. Ishimatsu, T. Kakugawa, S. Hara, H. Fujita, S. Nakamichi, H. Oku, Y. Urata, H. Kubota, K. Nagata, S. Kohno // BMC Pulmonary Medicine. - 2012. - 12. - P. 24.11) Hisatomi K. Pirfenidone inhibits TGF-β1-induced over-expression of collagen type I and heat shock protein 47 in A549 cells / K. Hisatomi, H. Mukae, N. Sakamoto, Y. Ishimatsu, T. Kakugawa, S. Hara, H. Fujita, S. Nakamichi, H. Oku, Y. Urata, H. Kubota, K. Nagata, S. Kohno // BMC Pulmonary Medicine. - 2012. - 12. - P. 24.

12) Raghu G. Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis with a New Antifibrotic Agent, Pirfenidone Results of a Prospective, Open-label Phase II Study / G. Raghu, W.C. Johnson, D. Lockhart, Y. Mageto // AM J RESPIR CRIT CARE MED. - 1999. - 159. - P. 1061-1069.12) Raghu G. Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis with a New Antifibrotic Agent, Pirfenidone Results of a Prospective, Open-label Phase II Study / G. Raghu, W.C. Johnson, D. Lockhart, Y. Mageto // AM J RESPIR CRIT CARE MED. - 1999. - 159. - P. 1061-1069.

13) Skou J.C. Further investigation on a Mg2++-Na+-activated adenosinetriphosphatase possibly related to the active transport of Na+ and K+across the nerve cell membrane / J.C. Skou // BiochimB iophys Acta. - 1960. - 42. - P. 6-23.13) Skou J.C. Further investigation on a Mg2 ++ - Na + -activated adenosinetriphosphatase possibly related to the active transport of Na + and K + across the nerve cell membrane / J.C. Skou // Biochim B iophys Acta. - 1960 .-- 42. - P. 6-23.

14) Sime P.J. Adenovector-mediated gene transfer of active transforming growth factor-betal induces prolonged severe fibrosis in rat lung / P.J. Sime, Z. Xing, F.L. Graham, K.G. Csaky, J. Gauldie // The Journal of clinical investigation. - 1997. - 100. - P. 768-776.14) Sime P.J. Adenovector-mediated gene transfer of active transforming growth factor-betal induces prolonged severe fibrosis in rat lung / P.J. Sime, Z. Xing, F.L. Graham, K.G. Csaky, J. Gauldie // The Journal of clinical investigation. - 1997. - 100. - P. 768-776.

15) Leask A. TGF-beta signaling and the fibrotic response / A. Leask, D.J. Abraham // Faseb J. - 2004. - 18. - P. 816-827.15) Leask A. TGF-beta signaling and the fibrotic response / A. Leask, D.J. Abraham // Faseb J. - 2004 .-- 18. - P. 816-827.

16) Hinz B. The Myofibroblast. One Function, Multiple Origins / B. Hinz, S.H. Phan, V.J. Thannickal, A. Galli, M.L. Bochaton-Piallat, G. Gabbiani // Am J Pathol. - 2007. - 170(6). P. 1807-16.16) Hinz B. The Myofibroblast. One Function, Multiple Origins / B. Hinz, S.H. Phan, V.J. Thannickal, A. Galli, M.L. Bochaton-Piallat, G. Gabbiani // Am J Pathol. - 2007 .-- 170 (6). P. 1807-16.

17) Sandbo N. Critical role of serum response factor in pulmonary myofibroblast differentiation induced by TGF-beta / N. Sandbo, S. Kregel, S. Taurin, S. Bhorade, N.O. Dulin // American journal of respiratory cell and molecular biology. - 2009. - 41. - P. 332-338.17) Sandbo N. Critical role of serum response factor in pulmonary myofibroblast differentiation induced by TGF-beta / N. Sandbo, S. Kregel, S. Taurin, S. Bhorade, N.O. Dulin // American journal of respiratory cell and molecular biology. - 2009. - 41. - P. 332-338.

18) Sandbo N. Delayed stress fiber formation mediates pulmonary myofibroblast differentiation in response to TGF-beta / N. Sandbo, A. Lau, J. Kach, C. Ngam, D. Yau, N.O. Dulin // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2011. - 301. - P. L656-666.18) Sandbo N. Delayed stress fiber formation mediates pulmonary myofibroblast differentiation in response to TGF-beta / N. Sandbo, A. Lau, J. Kach, C. Ngam, D. Yau, N.O. Dulin // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2011. - 301. - P. L656-666.

19) Katoh К. Isolation and in vitro contraction of stress fibers / K. Katoh, Y. Kano, K. Fujiwara // Methods Enzymol. 2000. - 325. P. 369-380.19) Katoh K. Isolation and in vitro contraction of stress fibers / K. Katoh, Y. Kano, K. Fujiwara // Methods Enzymol. 2000. - 325.P. 369-380.

20) Wilborn J. Cultured lung fibroblasts isolated from patients with idiopathic pulmonary fibrosis have a diminished capacity to synthesize prostaglandin E2 and to express cyclooxygenase-2 / J. Wilborn, L.J. Crofford, M.D. Burdick, S.L. Kunkel, R.M. Strieter, M. Peters-Golden // The Journal of clinical investigation. 1995. - 95. P. 1861-1868.20) Wilborn J. Cultured lung fibroblasts isolated from patients with idiopathic pulmonary fibrosis have a diminished capacity to synthesize prostaglandin E2 and to express cyclooxygenase-2 / J. Wilborn, L.J. Crofford, M.D. Burdick, S.L. Kunkel, R.M. Strieter, M. Peters-Golden // The Journal of clinical investigation. 1995.- 95. P. 1861-1868.

21) Xaubet A. Cyclooxygenase-2 is up-regulated in lung parenchyma of chronic obstructive pulmonary disease and down-regulated in idiopathic pulmonary fibrosis / A. Xaubet, J. Roca-Ferrer, L. Pujols, J. Ramirez, J. Mullol, A. Marin-Arguedas, A. Torrego, J.M. Gimferrer, C. Picado // Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis. - 2004. - 21. - P. 35-42.21) Xaubet A. Cyclooxygenase-2 is up-regulated in lung parenchyma of chronic obstructive pulmonary disease and down-regulated in idiopathic pulmonary fibrosis / A. Xaubet, J. Roca-Ferrer, L. Pujols, J. Ramirez, J. Mullol , A. Marin-Arguedas, A. Torrego, JM Gimferrer, C. Picado // Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis. - 2004. - 21. - P. 35-42.

22) Huang S.K. Prostaglandin E2 Inhibits Specific Lung Fibroblast Functions Via Selective Actions of PKA and Epac-1 / S.K. Huang, S.H. Wettlaufer, J. Chung, M. Peters-Golden // American journal of respiratory cell and molecular biology. - 2008. - 39(4). - P. 482-489.22) Huang S.K. Prostaglandin E2 Inhibits Specific Lung Fibroblast Functions Via Selective Actions of PKA and Epac-1 / S.K. Huang, S.H. Wettlaufer, J. Chung, M. Peters-Golden // American journal of respiratory cell and molecular biology. - 2008 .-- 39 (4). - P. 482-489.

23) Akimova O.A. Cardiotonic steroids differentially affect intracellular Na+ and [Na+]i/[K+]i-independent signaling in C7-MDCK cells / O.A. Akimova, A.Y. Bagrov, O.D. Lopina, A.V. Kamernitsky, J. Tremblay, P. Hamet, S.N. Orlov // The Journal of biological chemistry. - 2005. - 280. P. 832-839.23) Akimova O.A. Cardiotonic steroids differentially affect intracellular Na + and [Na +] i / [K +] i-independent signaling in C7-MDCK cells / O.A. Akimova, A.Y. Bagrov, O.D. Lopina, A.V. Kamernitsky, J. Tremblay, P. Hamet, S.N. Orlov // The Journal of biological chemistry. - 2005 .-- 280.P. 832-839.

Приложениеapplication

Фиг. 1. Уабаин подавляет образование фибриллярного актина в ответ на стимуляцию клеток TGF-β. Синим прокрашены ядра, красный показан фибриллярный актин.FIG. 1. Uabain inhibits the formation of fibrillar actin in response to stimulation of TGF-β cells. The nuclei are stained with blue, fibrillar actin is shown in red.

Фиг. 2. (А) Эффект уабаина и TGF-b1 на экспрессию коллагена-1, фибронектина, гладкомышечного а-актина в фибробластах легких человека. Клетки инкубировали 48 ч в присутствии 1 нг/мл TGF-b1, 30 и 100 нМ уабаина, после чего был приготовлен клеточный лизат и проанализирован методом иммуноблотинга с использованием первичных антител против коллагена-1, фибронектина, гладкомышечного а-актина.FIG. 2. (A) The effect of ouabain and TGF-b1 on the expression of collagen-1, fibronectin, smooth muscle a-actin in human lung fibroblasts. Cells were incubated for 48 h in the presence of 1 ng / ml TGF-b1, 30 and 100 nM ouabain, after which a cell lysate was prepared and analyzed by immunoblotting using primary antibodies against collagen-1, fibronectin, smooth muscle a-actin.

Фиг. 3. Дозо-зависимое действие уабаина на внутриклеточное содержание Na⁺ и K⁺ экспрессию СОХ-2, и экспрессию маркеров дифференцировки миофибробластов. A, HLF обрабатывали уабаином в течение 48 часов и оценивали его влияние на внутриклеточные концентрации Na⁺и K⁺. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего в экспериментах, полученных в трех пробах. Б, Клетки HLF обрабатывали TGF-β (1 нг/мл) в присутствии возрастающих доз уабаина в течение 48 часов. Экстракты клеток исследовали методом Вестерн-блоттинга для определения экспрессии СОХ-2 и маркеров дифференцировки миофибробластов.FIG. 3. The dose-dependent effect of ouabain on the intracellular content of Na ⁺ and K ⁺ expression of COX-2, and the expression of markers of differentiation of myofibroblasts. A, HLF was treated with ouabain for 48 hours and its effect on intracellular concentrations of Na ⁺ and K ⁺ was evaluated. Data are presented as mean ± error of the mean in experiments obtained in three samples. B, HLF cells were treated with TGF-β (1 ng / ml) in the presence of increasing doses of ouabain for 48 hours. Cell extracts were examined by Western blotting to determine the expression of COX-2 and differentiation markers of myofibroblasts.

Фиг. 4. Действие уабаина и TGF-b на содержание TGFBR2, СОХ-2 и маркеров дифференцировки миофиобробластов в фибробластах, изолированных у 3 больных идиопатическим фиброзом легких (IPF-1,2,3).FIG. 4. The effect of ouabain and TGF-b on the content of TGFBR2, COX-2 and markers of differentiation of myofiobroblasts in fibroblasts isolated in 3 patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF-1,2,3).

Claims

Применение сердечного гликозида уабаина в качестве средства, обладающего антифибротическим действием.The use of cardiac ouabain glycoside as an agent with antifibrotic effect.