RU2614119C9 - Method of producing human immunoglobulin - Google Patents
Method of producing human immunoglobulin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2614119C9 RU2614119C9 RU2014135665A RU2014135665A RU2614119C9 RU 2614119 C9 RU2614119 C9 RU 2614119C9 RU 2014135665 A RU2014135665 A RU 2014135665A RU 2014135665 A RU2014135665 A RU 2014135665A RU 2614119 C9 RU2614119 C9 RU 2614119C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exchange chromatography
- human immunoglobulin
- anion exchange
- iii
- solution
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к способу получения препаратов крови, и в частности к способу получения иммуноглобулина человека.The present invention relates to a method for producing blood products, and in particular to a method for producing human immunoglobulin.
Уровень техникиState of the art
Иммуноглобулин включает по меньшей мере IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, из которых IgG является самым важным, и отсутствие IgG приведет к снижению защиты организма. Препараты иммуноглобулина можно подразделить в основном на три группы: иммуноглобулин человека для внутримышечной инъекции, специфический иммуноглобулин и иммуноглобулин для внутривенной инъекции. В настоящее время препараты иммуноглобулинов в основном выделяют из плазмы.Immunoglobulin includes at least IgG, IgM, IgA, IgE and IgD, of which IgG is the most important, and the absence of IgG will reduce the body's defense. Immunoglobulin preparations can be divided mainly into three groups: human immunoglobulin for intramuscular injection, specific immunoglobulin and immunoglobulin for intravenous injection. Currently, immunoglobulin preparations are mainly isolated from plasma.
В 1940-х годах профессор Е.Ю. Кон (Е.J. Cohn) из Гарвардского университета изобрел способ отделения белков плазмы низкотемпературным этанолом. После этого Нисчманн и Кистлер с соавторами (Nistchmann and Kistler, et. al.) модернизировали низкотемпературный этанольный способ Кона и предложили усовершенствованный способ разделения белков плазмы низкотемпературным этанолом, который отличается упрощенными этапами и сокращенным временем получения. Тем не менее способ разделения низкотемпературным этанолом имеет определенные ограничения при производстве иммуноглобулина, и восстановление глобулинов колеблется в диапазоне от 3,8 до 4,4 г/л. Кроме того, содержание IgA в составе препарата иммуноглобулина, полученного низкотемпературным этанольным способом, является относительно высоким, и, таким образом, у пациентов, страдающих врожденной селективной недостаточностью IgA, могут возникнуть побочные эффекты после инъекций.In the 1940s, Professor E.Yu. Cohn (E.J. Cohn) of Harvard University invented a method for separating plasma proteins with low temperature ethanol. After that, Nischmann and Kistler et al. (Nistchmann and Kistler, et. Al.) Upgraded Kohn's low-temperature ethanol method and proposed an improved method for separating plasma proteins with low-temperature ethanol, which is characterized by simplified steps and reduced production time. Nevertheless, the method of separation by low-temperature ethanol has certain limitations in the production of immunoglobulin, and the recovery of globulins ranges from 3.8 to 4.4 g / L. In addition, the IgA content of the immunoglobulin preparation obtained by the low-temperature ethanol method is relatively high, and thus, patients suffering from congenital selective IgA deficiency may experience side effects after injection.
В 1969 году Штейнбрах с соавторами (Steinbruch, et al.) описали способ отделения IgG от плазмы млекопитающих с помощью осаждения каприловой кислотой в сочетании с анионообменной хроматографией. Под воздействием слабокислой среды с pH≥4,5 можно осаждать другие примесные белки, помимо иммуноглобулина. Тем не менее этот способ требует дальнейшей очистки IgG с помощью диэтиламиноэтилцеллюлозы (ДЭАЭ-целлюлозы) в качестве среды анионного обмена, и характеризуется сложностью процесса и высокой стоимостью.In 1969, Steinbruch et al. (Steinbruch, et al.) Described a method for separating IgG from mammalian plasma by caprylic acid precipitation in combination with anion exchange chromatography. Under the influence of a weakly acidic medium with pH≥4.5, other impurity proteins can be precipitated, in addition to immunoglobulin. However, this method requires further purification of IgG using diethylaminoethyl cellulose (DEAE cellulose) as an anion exchange medium, and is characterized by the complexity of the process and high cost.
В патенте США №6,307,028 предложен способ очистки с помощью осаждения каприловой кислотой в комбинации с двухэтапной анионообменной хроматографией, и был получен препарат иммуноглобулина высокой чистоты с тем же распределением подклассов IgG, как в нормальной плазме.US Pat. No. 6,307,028 proposes a purification method by means of precipitation with caprylic acid in combination with two-stage anion exchange chromatography, and a high-purity immunoglobulin preparation with the same distribution of IgG subclasses as in normal plasma was obtained.
Тем не менее у китайцев содержание IgM в плазме более высокое, чем у некитайцев (содержание IgM в плазме у китайцев составляет около 10% от общего содержания белка, в то время как содержание IgM в плазме у некитайцев колеблется от 1% до 3% от общего содержание белка). Для получения иммуноглобулина с подходящей чистотой в соответствии с предыдущим способом требуется хроматографическая колонка большого объема для абсорбции большого количества IgM, что влечет повышенные расходы. Этот фактор затрудняет возможность реализации способа в промышленном масштабе.Nevertheless, the Chinese plasma IgM content is higher than that of non-Chinese (Chinese plasma IgM content is about 10% of the total protein content, while plasma IgM content in non-Chinese ranges from 1% to 3% of the total protein content). To obtain immunoglobulin with suitable purity in accordance with the previous method, a large volume chromatographic column is required to absorb a large amount of IgM, which entails increased costs. This factor makes it difficult to implement the method on an industrial scale.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Для решения вышеупомянутой проблемы в настоящем изобретении предложен новый способ получения иммуноглобулина человека.To solve the aforementioned problem, the present invention provides a new method for producing human immunoglobulin.
Прежде всего, настоящее изобретение относится к способу получения иммуноглобулина человека, включающему следующие этапы:First of all, the present invention relates to a method for producing human immunoglobulin, comprising the following steps:
(1) растворение: растворение компонента Кона (Cohn component) I+II+III или компонента Кона II+III в воде для инъекций;(1) dissolution: dissolving the Cohn component I + II + III or the Cohn component II + III in water for injection;
(2) осаждение каприловой кислотой: осаждение примесей каприловой кислотой или каприлатом, фильтрация и получение фильтрата;(2) precipitation with caprylic acid: precipitation of impurities with caprylic acid or caprylate, filtering and obtaining a filtrate;
(3) первый этап анионообменной хроматографии: доведение рН фильтрата, полученного на этапе (2), до 5,2, очистка анионообменной хроматографией и получение элюирующего раствора;(3) the first stage of anion exchange chromatography: adjusting the pH of the filtrate obtained in step (2) to 5.2, purification by anion exchange chromatography and obtaining an eluting solution;
(4) осаждение IgM: регулировка проводимости элюирующего раствора, полученного на этапе (3), до 500-1000 мкСм/см с помощью воды и дальнейшее доведение рН до 6,0-7,3, с последующим выдерживанием в течение 1-2 ч, фильтрация и получение фильтрата;(4) IgM precipitation: adjusting the conductivity of the eluting solution obtained in step (3) to 500-1000 μS / cm with water and then adjusting the pH to 6.0-7.3, followed by aging for 1-2 hours filtering and obtaining filtrate;
(5) второй этап анионообменной хроматографии: доведение рН фильтрата, полученного на этапе (4), до 5,6, последующая очистка анионообменной хроматографией и получение элюирующего раствора;(5) the second stage of anion exchange chromatography: adjusting the pH of the filtrate obtained in step (4) to 5.6, subsequent purification by anion exchange chromatography and obtaining an eluting solution;
(6) получение продукта иммуноглобулина человека посредством ультрафильтрации или диализа, получение фармацевтического препарата и инактивация вирусов.(6) obtaining a human immunoglobulin product by ultrafiltration or dialysis, obtaining a pharmaceutical preparation and inactivating viruses.
На этапе (1) компонент Кона I+II+III или компонент Кона II+III добавляют в воду для инъекций и перемешивают при температуре 2-8°C, до растворения с доведением рН до 3,8-4,9. Как правило, количество воды для инъекций составляет: отношение объема к массе воды для инъекций к компоненту Кона I+II+III или компоненту Кона II+III 10:1-15:1.In step (1), the Cohn component I + II + III or the Cohn component II + III is added to water for injection and stirred at a temperature of 2-8 ° C until dissolved to bring the pH to 3.8-4.9. Typically, the amount of water for injection is: the ratio of the volume to the mass of water for injection to the Cohn component I + II + III or Cohn component II + III 10: 1-15: 1.
На этапе (2) добавляют каприловую кислоту или каприлат в концентрации 10 мМ - 20 мМ и доводят рН до 5,0-5,3.In step (2), caprylic acid or caprylate is added at a concentration of 10 mM - 20 mM and the pH is adjusted to 5.0-5.3.
На этапе (3) в качестве носителя для указанной анионообменной хроматографии используют Capto Q, Gigacap Q или Unosphere Q, причем объем колонки для анионообменной хроматографии составляет 1/105-1/50 от объема образца.In step (3), Capto Q, Gigacap Q, or Unosphere Q is used as a carrier for the indicated anion exchange chromatography, the column volume for anion exchange chromatography being 1 / 105-1 / 50 of the sample volume.
На этапе (4) предпочтительное значение рН составляет 6,3-6,74, еще более предпочтительное 6,51-6,7, и еще более предпочтительное 6,51 или 6,7.In step (4), the preferred pH is 6.3-6.74, even more preferred 6.51-6.7, and even more preferred 6.51 or 6.7.
На этапе (5) в качестве носителя для указанной анионообменной хроматографии используют Macrocap Q, причем объем колонки обменной хроматографии составляет 1/50-1/35 от объема образца.In step (5), Macrocap Q is used as the carrier for the indicated anion exchange chromatography, wherein the volume of the column for exchange chromatography is 1 / 50-1 / 35 of the volume of the sample.
Также в настоящем изобретении предложен иммуноглобулин человека, полученный вышеуказанным способом.The present invention also provides a human immunoglobulin obtained by the above method.
В настоящем изобретении в конечном счете предложена фармацевтическая композиция, которая получена из указанного выше иммуноглобулина человека в качестве активного ингредиента совместно с фармацевтически приемлемым адъювантом или вспомогательными ингредиентами.The present invention ultimately provides a pharmaceutical composition which is prepared from the aforementioned human immunoglobulin as an active ingredient together with a pharmaceutically acceptable adjuvant or adjuvant.
Способ получения, предложенный в настоящем изобретении, включает дополнительный этап осаждения IgM, добавленный, согласно изобретению, между двумя этапами анионной хроматографии, и, таким образом, объем второго этапа анионообменной хроматографии, очевидно, уменьшается, стоимость производства снижается, и, таким образом, данный способ имеет многообещающие перспективы по применению на рынке.The production method proposed in the present invention includes an additional IgM precipitation step, added according to the invention, between the two steps of anion chromatography, and thus, the volume of the second step of anion exchange chromatography is obviously reduced, the production cost is reduced, and thus The method has promising prospects for use in the market.
Очевидно, что в соответствии с указанным выше описанием настоящего изобретения в сочетании с общими техническими знаниями и обычными техническими средствами в данной области, можно осуществлять различные замены или изменения или модификации в отсутствие отклонений от основной технической концепции согласно настоящему изобретению, упомянутой и выше.Obviously, in accordance with the above description of the present invention, in combination with general technical knowledge and conventional technical means in this field, various replacements or changes or modifications can be made without deviating from the basic technical concept according to the present invention mentioned above.
Приведенное выше описание настоящего изобретения далее более подробно раскрыто в отдельных вариантах реализации в виде примеров, которые, однако, не следует понимать как ограничивающие объем настоящего изобретения следующими примерами. Все способы реализации на основании вышеупомянутого описания попадают в пределы объема настоящего изобретения.The above description of the present invention is hereinafter described in more detail in separate embodiments as examples, which, however, should not be construed as limiting the scope of the present invention by the following examples. All implementation methods based on the above description fall within the scope of the present invention.
Описание чертежейDescription of drawings
На Фиг. 1 схематически представлен способ получения иммуноглобулина человека согласно настоящему изобретению.In FIG. 1 schematically shows a method for producing a human immunoglobulin according to the present invention.
На Фиг. 2 показана взаимосвязь между рН, количеством осажденного IgM и выходом IgG.In FIG. Figure 2 shows the relationship between pH, amount of precipitated IgM, and IgG yield.
Варианты реализацииImplementation options
Пример 1. Получение иммуноглобулина человека способом согласно настоящему изобретениюExample 1. Obtaining human immunoglobulin by the method according to the present invention
1. Экспериментальные материалы1. Experimental materials
Компонент Кона I+II+III или компонент II+III: полученный низкотемпературным методом осаждения с использованием этанола, как описано на стр. 1194 книги Medical Biologicology, 2nd edition (Peopleʹs Medical Publishing House Co., LTD).Cohn component I + II + III or component II + III: obtained by the low-temperature ethanol precipitation method as described on page 1194 of Medical Biologicology, 2 nd edition (Peopleʹs Medical Publishing House Co., LTD).
Соляная кислота, каприловая кислота, носитель Capto Q, носитель Gigacap Q, носитель Unosphere Q, Macrocap Q, диатомит и набор для обнаружения IgA Beckman IMMAGE - все коммерчески доступны.Hydrochloric acid, caprylic acid, Capto Q carrier, Gigacap Q carrier, Unosphere Q carrier, Macrocap Q, diatomite and Beckman IMMAGE IgA detection kit are all commercially available.
2. Методика проведения экспериментов2. The methodology of the experiments
Как показано на Фиг. 1, иммуноглобулин получали следующим образом:As shown in FIG. 1, immunoglobulin was prepared as follows:
(1) Компонент Кона I+II+III: 4 кг осадка компонента Кона I+II+III растворяли в 40 л ВДИ (вода для инъекций) при 5°C и перемешивали в течение 1 часа. рН доводили до 4,20 хлористоводородной кислотой 0,5М и полученный раствор нагревали и перемешивали в водяной бане при 25°C в течение 2 ч;(1) Component of Cohn I + II + III: 4 kg of a precipitate of the Cohn component I + II + III was dissolved in 40 L of WFI (water for injection) at 5 ° C and stirred for 1 hour. The pH was adjusted to 4.20 with 0.5M hydrochloric acid and the resulting solution was heated and stirred in a water bath at 25 ° C for 2 hours;
(2) осаждение каприловой кислотой: каприловая кислота была непосредственно добавлена до достижения конечной концентрации 15 мМ, и рН доводили до 5,20 при помощи 0,5М NaOH. Полученный раствор нагревали и перемешивали на водяной бане при 25°C в течение 2 ч, а затем оставляли на 2 ч при 8°C;(2) precipitation with caprylic acid: caprylic acid was directly added until a final concentration of 15 mM was reached, and the pH was adjusted to 5.20 with 0.5 M NaOH. The resulting solution was heated and stirred in a water bath at 25 ° C for 2 hours, and then left for 2 hours at 8 ° C;
(3) Первый этап анионообменной хроматографии: суспензия, полученная в результате реакции осаждения каприловой кислотой, была подвергнута фильтрации фильтрующим слоем обычной глубины, и рН фильтрата доводили до 5,20 хлористоводородной кислотой 0,5М или NaOH 0,5М. Впоследствии первый этап анионообменной хроматографии проводили с носителем Capto Q, при рН хроматографии 5,20 и с линейной скоростью потока 200 см/час. Объем колонны обменной хроматографии составлял 1/75 от объема образца;(3) The first stage of anion exchange chromatography: the suspension obtained by the precipitation reaction with caprylic acid was filtered with a filter layer of a usual depth, and the pH of the filtrate was adjusted to 5.20 with 0.5 M hydrochloric acid or 0.5 M NaOH. Subsequently, the first step of anion exchange chromatography was carried out with a Capto Q support, at a pH of 5.20 and with a linear flow rate of 200 cm / h. The volume of the column for exchange chromatography was 1/75 of the volume of the sample;
(4) осаждение IgM: сначала проводимость хроматографического элюирующего раствора доводили до 700 мкСм/см. Затем рН раствора доводили до 6,3 с 0,5М NaOH, с последующим выдерживанием в течение 1 ч;(4) IgM precipitation: first, the conductivity of the chromatographic elution solution was adjusted to 700 μS / cm. Then the pH of the solution was adjusted to 6.3 with 0.5 M NaOH, followed by aging for 1 h;
(5) второй этап анионообменной хроматографии: была осуществлена фильтрация с добавлением диатомита и при проведении второго этапа анионообменной хроматографии рН фильтрата доводили до 5,6. Использовали носитель Macrocap Q с линейной скоростью потока 75 см/ч, а объем колонки обменной хроматографии составлял 1/40 от объема образца;(5) the second stage of anion exchange chromatography: filtration was carried out with the addition of diatomite, and during the second stage of anion exchange chromatography, the pH of the filtrate was adjusted to 5.6. A Macrocap Q support with a linear flow rate of 75 cm / h was used, and the volume of the exchange chromatography column was 1/40 of the volume of the sample;
(6) собирали хроматографический элюирующий раствор и его рН доводили до 3,9-4,2 хлористоводородной кислотой 0,5М. Затем раствор был подвержен ультрафильтрационной концентрации до достижения концентрация белка 20 мг/мл. Для того чтобы осуществить фильтрацию вирусов, раствор пропускали через вирусные фильтры с размером пор 200-15 нм, такие как DV50, DV20, Planova75, Planova35 и подобные. После завершения этого этапа раствор концентрировали до концентрации белка, требуемой для конечного препарата, такой как 5% или 10% (вес/объем). После этого добавляли подходящие добавки, чтобы осмотическое давление раствора удовлетворяло требованию для внутривенного введения, при этом добавки могут представлять собой сахара или аминокислоты. рН раствора доводили до 4,0-4,8. Раствор инкубировали при 25°C в течение 21 дня и по отдельности упаковывали в инфузионные бутылки в соответствии с требованиями по получению фармацевтического препарата.(6) the chromatographic elution solution was collected and its pH was adjusted to 3.9-4.2 with 0.5M hydrochloric acid. The solution was then subjected to ultrafiltration concentration until a protein concentration of 20 mg / ml was reached. In order to filter viruses, the solution was passed through virus filters with pore sizes of 200-15 nm, such as DV50, DV20, Planova75, Planova35 and the like. After completing this step, the solution was concentrated to the protein concentration required for the final preparation, such as 5% or 10% (w / v). After that, suitable additives were added so that the osmotic pressure of the solution met the requirement for intravenous administration, and the additives could be sugars or amino acids. The pH of the solution was adjusted to 4.0-4.8. The solution was incubated at 25 ° C for 21 days and individually packaged in infusion bottles in accordance with the requirements for obtaining a pharmaceutical preparation.
3. Определение продукта3. Product Definition
(1) Способ определения(1) Method for determining
В соответствии с методикой, указанной для исполнения в Фармакопее Китая (Chinese Pharmacopoeia) (2010), были соответственно определены индексы, такие как чистота продукта, распределение мономера продукта + димера (т.е. размер молекулы), распределение подкласса продукта, и прочие.According to the methodology specified for execution in the Chinese Pharmacopoeia (2010), indices were appropriately determined, such as product purity, product monomer + dimer distribution (i.e. molecule size), product subclass distribution, and others.
Содержание IgA в продукте было определено на анализаторе белка плазмы Beckman IMMAGE с помощью метода иммунной турбидиметрии. Кроме того, определение проводили с использованием набора для определения IgA Beckman IMMAGE, конкретный способ определения указан на инструкциях упомянутого набора для определения.The IgA content in the product was determined on a Beckman IMMAGE plasma protein analyzer using an immune turbidimetry method. In addition, the determination was carried out using a Beckman IMMAGE IgA determination kit, a specific determination method is indicated on the instructions of said determination kit.
Способ определения выхода: после концентрации ультрафильтрацией, концентрация белка препарата была определена по способу определения Кьельдаля (который представляет собой первый способ, указанный в приложении VI В в Фармакопее Китая 2010), при этомThe method for determining the yield: after concentration by ultrafiltration, the protein concentration of the drug was determined by the method of determination of Kjeldahl (which is the first method specified in Appendix VI B in the Pharmacopoeia of China 2010), while
выход = концентрация белка × объем состава/объем плазмы.yield = protein concentration × composition volume / plasma volume.
(2) Результат определения(2) Definition result
Результат определения показан в таблице 1:The result of the determination is shown in table 1:
Согласно таблице 1, все показатели иммуноглобулина человека, полученного в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, отвечают требованиям, изложенным в Фармакопее Китая. По сравнению с традиционным способом с использованием низкотемпературного этанола, способ согласно настоящему изобретению может повысить чистоту препарата, уменьшить содержание мультимера и IgA, и дополнительно повысить безопасность в случае вливания высоких доз. Кроме того, способ получения иммуноглобулина человека согласно настоящей заявке имеет высокий выход, который увеличен более чем на 10% по сравнению с существующим способом с использованием низкотемпературного этанола.According to table 1, all indicators of human immunoglobulin obtained in accordance with the method according to the present invention meet the requirements set forth in the Pharmacopoeia of China. Compared with the traditional method using low-temperature ethanol, the method according to the present invention can increase the purity of the drug, reduce the content of multimer and IgA, and further improve safety in case of infusion of high doses. In addition, the method for producing human immunoglobulin according to the present application has a high yield, which is increased by more than 10% compared to the existing method using low-temperature ethanol.
Пример 2. Эксперименты по оптимизации параметровExample 2. Experiments to optimize parameters
Были определены значения рН и проводимость при осаждении IgM на этапе (4) способа настоящего изобретения:The pH values and conductivity during IgM precipitation were determined in step (4) of the method of the present invention:
(1) Эксперимент по оптимизации проводимости(1) Conductivity Optimization Experiment
Методика проведения эксперимента: при постоянных прочих условиях, были изменены проводимость и рН на этапе (4) примера 1 для определения взаимосвязи между проводимостью и количеством осадка IgM и выходом IgG.The experimental procedure: under constant other conditions, the conductivity and pH were changed in step (4) of Example 1 to determine the relationship between the conductivity and the amount of IgM precipitate and IgG yield.
Результат эксперимента: посредством множества экспериментов было обнаружено, что, когда проводимость хроматографического раствора элюирования выше, чем 1 мкСм/см, даже если рН раствора поднимали, осаждения IgM не было. Когда проводимость хроматографического элюирующего раствора была между 500 и 1000 мкСм/см, рН доводили до 6,0 и выше, и IgM, очевидно, выпадал в осадок.Experimental result: through many experiments, it was found that when the conductivity of the chromatographic elution solution was higher than 1 μS / cm, even if the pH of the solution was raised, there was no IgM precipitation. When the conductivity of the chromatographic elution solution was between 500 and 1000 μS / cm, the pH was adjusted to 6.0 and higher, and IgM apparently precipitated.
(2) Эксперимент по оптимизации рН(2) pH Optimization Experiment
Методика эксперимента: при постоянных прочих условиях, были изменен рН на этапе (4) примера 1 для определения взаимосвязи между рН, количеством осадка IgM и выходом IgG.Experimental procedure: under constant other conditions, the pH was changed in step (4) of Example 1 to determine the relationship between pH, amount of IgM precipitate and IgG yield.
Результат эксперимента: посредством множества экспериментов было обнаружено, что скорость удаления IgM увеличивалась при увеличении рН, но чрезмерно высокое значение рН привело к увеличению потерь IgG.Experiment result: through many experiments it was found that the IgM removal rate increased with increasing pH, but an excessively high pH led to an increase in IgG loss.
В Таблице 2 и на Фиг. 1 показано:In Table 2 and in FIG. 1 shows:
Согласно Таблице 2 и Фиг. 1, при рН между 6,2 и 7,3 IgM, очевидно, выпадает в осадок. При рН между 6,3 и 6,74 IgM осаждается в высокой степени и выход IgG также высок. При рН между 6,51 и 6,7 как осаждение IgM, так и выход IgG проявлены лучше.According to Table 2 and FIG. 1, at a pH between 6.2 and 7.3, IgM obviously precipitates. At a pH between 6.3 and 6.74, IgM precipitates to a high degree and the yield of IgG is also high. At pH between 6.51 and 6.7, both IgM precipitation and IgG yield are better manifested.
В целом, для сбалансирования скорости удаления IgM и выхода IgG, на этапе (4) способа согласно настоящему изобретению проводимость доводили до 500-1000 мкСм/см и рН доводили до 6,0-7,0.In general, to balance the rate of IgM removal and IgG yield, in step (4) of the method according to the present invention, the conductivity was adjusted to 500-1000 μS / cm and the pH adjusted to 6.0-7.0.
В целях более подробного исследования преимуществ способа согласно настоящему изобретению, был проведен следующий сравнительный эксперимент:In order to more thoroughly study the advantages of the method according to the present invention, the following comparative experiment was carried out:
1. Получение иммуноглобулина человека1. Obtaining human immunoglobulin
(1) Способ получения согласно настоящему изобретению: как описано в Примере 1;(1) The production method according to the present invention: as described in Example 1;
(2) Сравнительный способ получения:(2) Comparative production method:
1) растворение компонента Кона I+II+III: 4 кг осадка компонента Кона I+II+III растворяли в 40 л ВДИ (вода для инъекций) при 5°C и перемешивали в течение 1 часа. рН доводили до 4,20 хлористоводородной кислотой 0,5М и полученный раствор нагревали и перемешивали на водяной бане при 25°C в течение 2 ч;1) dissolution of the Cohn component I + II + III: 4 kg of the precipitate of the Cohn component I + II + III was dissolved in 40 l of VDI (water for injection) at 5 ° C and stirred for 1 hour. The pH was adjusted to 4.20 with 0.5M hydrochloric acid and the resulting solution was heated and stirred in a water bath at 25 ° C for 2 hours;
2) осаждение каприловой кислотой: каприловая кислота была непосредственно добавлена до достижения конечной концентрации 15 мМ, и рН доводили до 5,20 при помощи 0,5М NaOH. Полученный раствор нагревали и перемешивали на водяной бане при 25°C в течение 2 ч, а затем оставляли на 2 ч при 8°C;2) precipitation with caprylic acid: caprylic acid was directly added until a final concentration of 15 mM was reached, and the pH was adjusted to 5.20 with 0.5 M NaOH. The resulting solution was heated and stirred in a water bath at 25 ° C for 2 hours, and then left for 2 hours at 8 ° C;
3) первый этап анионообменной хроматографии: суспензия реакции осаждения каприловой кислотой была подвергнута фильтрации с использованием фильтрующего слоя обычной глубины, рН фильтрата доводили до 5,20 хлористоводородной кислотой 0,5М или NaOH 0,5М. Впоследствии первый этап анионообменной хроматографии проводили с носителем Capto Q, при рН хроматографии 5,20 и с линейной скоростью потока 200 см/час;3) the first stage of anion exchange chromatography: the suspension of the precipitation reaction of caprylic acid was filtered using a filter layer of usual depth, the pH of the filtrate was adjusted to 5.20 with 0.5M hydrochloric acid or 0.5M NaOH. Subsequently, the first step of anion exchange chromatography was carried out with a Capto Q support, at a pH of 5.20 and with a linear flow rate of 200 cm / h;
4) второй этап анионообменной хроматографии: сбор хроматографического элюирующего раствора, фильтрация была осуществлена с добавлением диатомита, при проведении второй ступени анионообменной хроматографии рН фильтрата доводили до 5,6. Использовали носитель Macrocap Q с линейной скоростью потока 75 см/ч, а объем колонки обменной хроматографии составлял 1/19 от объема образца;4) the second stage of anion exchange chromatography: the chromatographic elution solution was collected, the filtration was carried out with the addition of diatomite; during the second stage of anion exchange chromatography, the pH of the filtrate was adjusted to 5.6. A Macrocap Q support with a linear flow rate of 75 cm / h was used, and the volume of the exchange chromatography column was 1/19 of the volume of the sample;
5) собирали хроматографический элюирующий раствор, его рН доводили до 3,9-4,2 хлористоводородной кислотой 0,5М. Затем раствор был подвержен ультрафильтрационной концентрации до достижения концентрация белка 20 мг/мл. Для того чтобы осуществить фильтрацию вирусов, раствор пропускали через вирусные фильтры с размером пор 200-15 нм, такие как DV50, DV20, Planova75, Planova35 и подобные. После завершения этого этапа раствор концентрировали до концентрации белка, требуемой для конечного состава, такой как 5% или 10% (вес/объем). После этого добавляли подходящие добавки, чтобы осмотическое давление раствора удовлетворяло требованию для внутривенного введения, при этом добавки могут представлять собой сахара или аминокислоты. рН раствора доводили до 4,0-4,8. Раствор инкубировали при 25°C в течение 21 дня и по отдельности упаковывали в инфузионные бутылки в соответствии с требованием для приготовления.5) the chromatographic elution solution was collected, its pH was adjusted to 3.9-4.2 with 0.5M hydrochloric acid. The solution was then subjected to ultrafiltration concentration until a protein concentration of 20 mg / ml was reached. In order to filter viruses, the solution was passed through virus filters with pore sizes of 200-15 nm, such as DV50, DV20, Planova75, Planova35 and the like. After completing this step, the solution was concentrated to the protein concentration required for the final composition, such as 5% or 10% (w / v). After that, suitable additives were added so that the osmotic pressure of the solution met the requirement for intravenous administration, and the additives could be sugars or amino acids. The pH of the solution was adjusted to 4.0-4.8. The solution was incubated at 25 ° C for 21 days and individually packaged in infusion bottles in accordance with the requirement for preparation.
2. Определение продукта2. Product Definition
(1) Способ определения(1) Method for determining
Способ определения такой же, как в Примере 1.The method of determination is the same as in Example 1.
(2) Результат определения(2) Definition result
Результат определения показан в Таблице 3:The result of the determination is shown in Table 3:
Как показано в таблице 3, показатели качества иммуноглобулинов, полученных двумя способами, не имеют никакой существенной разницы, и их выход составляет 5,5-6,0 г/л плазмы и 5,7 г/л плазмы, соответственно, также без каких-либо существенных различий.As shown in table 3, the quality indicators of immunoglobulins obtained by the two methods have no significant difference, and their yield is 5.5-6.0 g / l of plasma and 5.7 g / l of plasma, respectively, also without any or significant differences.
Во втором этапе анионообменной хроматографии объем колонны обменной хроматографии был 1/40 от объема образца в способе по настоящему изобретению, в то время как в сравнительном способе он составлял 1/19.In the second step of anion exchange chromatography, the volume of the exchange chromatography column was 1/40 of the volume of the sample in the method of the present invention, while in the comparative method it was 1/19.
Экспериментами доказано, что для получения иммуноглобулинов с соответствующими показателями качества на втором этапе анионообменной хроматографии способ по настоящему изобретению способен существенно сократить требуемой объем хроматографической колонки по сравнению со сравнительным способом.The experiments proved that to obtain immunoglobulins with appropriate quality indicators at the second stage of anion exchange chromatography, the method of the present invention is able to significantly reduce the required volume of the chromatographic column compared to the comparative method.
Таким образом, способ, предложенный в настоящем изобретении, позволяет успешно решить проблему высокой стоимости производства иммуноглобулина человека, вызванного чрезмерно высоким содержанием IgM в плазме китайцев; существенно снизить стоимость производства, делает возможным промышленное производство иммуноглобулинов человека в крупных масштабах и обладает многообещающими перспективами применения на рынке.Thus, the method proposed in the present invention, can successfully solve the problem of the high cost of production of human immunoglobulin caused by an excessively high content of IgM in Chinese plasma; significantly reduce the cost of production, makes possible the industrial production of human immunoglobulins on a large scale and has promising prospects for use on the market.
Claims (15)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210041098.6 | 2012-02-22 | ||
CN2012100410986A CN102532307B (en) | 2012-02-22 | 2012-02-22 | Method for preparing human immunoglobulin |
PCT/CN2013/071754 WO2013123889A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-02-22 | Method for preparing human immunoglobulin |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014135665A RU2014135665A (en) | 2016-04-10 |
RU2614119C2 RU2614119C2 (en) | 2017-03-22 |
RU2614119C9 true RU2614119C9 (en) | 2017-08-15 |
Family
ID=46340458
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014135665A RU2614119C9 (en) | 2012-02-22 | 2013-02-22 | Method of producing human immunoglobulin |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102532307B (en) |
BR (1) | BR112014020734B1 (en) |
CO (1) | CO7141451A2 (en) |
IN (1) | IN2014DN07228A (en) |
PH (1) | PH12014501909B1 (en) |
RU (1) | RU2614119C9 (en) |
WO (1) | WO2013123889A1 (en) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104356231B (en) * | 2014-11-10 | 2017-08-08 | 北海开元生物科技有限公司 | A kind of effective method for removing human immunoglobulin(HIg) polymer |
CN105126100B (en) * | 2015-09-23 | 2021-01-26 | 成都蓉生药业有限责任公司 | IgM-rich human immunoglobulin preparation and preparation method thereof |
AU2016231646B2 (en) * | 2016-09-26 | 2021-04-08 | Instituto Grifols, S.A. | Method for the preparation of immunoglobulins |
CN108101981B (en) * | 2018-01-15 | 2019-06-04 | 四川远大蜀阳药业有限责任公司 | A kind of production technology of intravenous immunoglobulin |
CN109575129B (en) * | 2018-12-29 | 2022-04-26 | 贵州泰邦生物制品有限公司 | Preparation process of intravenous injection human immunoglobulin |
CN110330565B (en) * | 2019-07-11 | 2021-07-30 | 国药集团武汉血液制品有限公司 | Method for extracting intravenous injection human immune globulin from plasma separation component I and III |
CN111234009A (en) * | 2020-01-20 | 2020-06-05 | 华兰生物工程重庆有限公司 | Chromatography process for removing IgA and IgM in specific human immunoglobulin |
BE1029863B1 (en) * | 2022-05-10 | 2023-05-12 | Prothya Biosolutions Belgium | METHODS FOR PRODUCING IMMUNOGLOBULIN G (IgG) PREPARATIONS AND/OR SOLUTIONS |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2361612C1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-20 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Immunoglobulin marker base for immunobiological preparations and way of its reception, suppositories and ointment for prevention and therapy of bacteriemic and virus diseases |
RU2010134944A (en) * | 2010-08-23 | 2012-02-27 | Андрей Германович Лютов (RU) | METHOD FOR PRODUCING IMMUNOGLOBULIN FOR INTRAVENOUS ADMINISTRATION ENRICHED WITH IMMUNOGLOBULIN M AND THE PRODUCT OBTAINED BY THIS METHOD |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4374763A (en) * | 1979-09-17 | 1983-02-22 | Morishita Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for producing gamma-globulin for use in intravenous administration and method for producing a pharmaceutical preparation thereof |
JPS58180433A (en) * | 1982-04-16 | 1983-10-21 | Fujirebio Inc | Removing method of anticomplementary substance from immunoglobulin |
ATE277950T1 (en) * | 1998-06-09 | 2004-10-15 | Statens Seruminstitut | METHOD FOR PRODUCING IMMUNOGLOBULINS FOR INTRAVENOUS ADMINISTRATION AND OTHER IMMUNOGLOBULIN PRODUCTS |
EP3127916A1 (en) * | 2004-06-07 | 2017-02-08 | Therapure Biopharma Inc. | Isolation of plasma or serum proteins |
MY157239A (en) * | 2009-05-27 | 2016-05-13 | Baxalta Inc | A method to produce a highly concentrated immunoglobulin preparation for subcutaneous use |
-
2012
- 2012-02-22 CN CN2012100410986A patent/CN102532307B/en active Active
-
2013
- 2013-02-22 WO PCT/CN2013/071754 patent/WO2013123889A1/en active Application Filing
- 2013-02-22 RU RU2014135665A patent/RU2614119C9/en active
- 2013-02-22 BR BR112014020734-8A patent/BR112014020734B1/en active IP Right Grant
- 2013-02-22 IN IN7228DEN2014 patent/IN2014DN07228A/en unknown
-
2014
- 2014-08-22 PH PH12014501909A patent/PH12014501909B1/en unknown
- 2014-09-18 CO CO14207099A patent/CO7141451A2/en unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2361612C1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-20 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Immunoglobulin marker base for immunobiological preparations and way of its reception, suppositories and ointment for prevention and therapy of bacteriemic and virus diseases |
RU2010134944A (en) * | 2010-08-23 | 2012-02-27 | Андрей Германович Лютов (RU) | METHOD FOR PRODUCING IMMUNOGLOBULIN FOR INTRAVENOUS ADMINISTRATION ENRICHED WITH IMMUNOGLOBULIN M AND THE PRODUCT OBTAINED BY THIS METHOD |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112014020734A2 (en) | 2017-08-22 |
WO2013123889A1 (en) | 2013-08-29 |
RU2014135665A (en) | 2016-04-10 |
CN102532307A (en) | 2012-07-04 |
CO7141451A2 (en) | 2014-12-12 |
RU2614119C2 (en) | 2017-03-22 |
PH12014501909A1 (en) | 2014-11-24 |
CN102532307B (en) | 2013-06-12 |
IN2014DN07228A (en) | 2015-04-24 |
BR112014020734B1 (en) | 2021-03-02 |
PH12014501909B1 (en) | 2014-11-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2614119C2 (en) | Method of producing human immunoglobulin | |
CN110526982B (en) | Purification method of human glucagon-like peptide-1 analogue fusion protein | |
JP4359347B2 (en) | A chromatographic method for high yield purification of antibodies and virus inactivation. | |
ES2229784T3 (en) | IMMUNOGLOBULIN PRODUCTION PROCESS FOR INTRAVENOUS ADMINISTRATION AND OTHER IMMUNOGLOBULIN PRODUCTS. | |
CA2941232C (en) | Method for purifying immunoglobulin | |
JP2018503620A (en) | Methods for purifying recombinant proteins | |
CN106459140B (en) | Method for purifying immunoglobulins | |
CN106536565A (en) | Process for the purification of TNFR:Fc fusion protein | |
CN109575129B (en) | Preparation process of intravenous injection human immunoglobulin | |
JP6132839B2 (en) | Method for producing multivalent immunoglobulin concentrate | |
JP7073333B2 (en) | Process for preparing an immunoglobulin composition | |
US20050080238A1 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates | |
CN103319592B (en) | Method for obtaining an IgG composition by heat treatment | |
CN107849086B (en) | Method for producing hepatitis B immunoglobulins derived from plasma | |
CN104001172B (en) | A kind of preparation technology of hepatitis b human immunoglobulin for intravenous injection | |
US20240092828A1 (en) | Systems and methods for process scale isolation of a protein | |
CN107964044B (en) | Method for purifying anti-CD 20 monoclonal antibody from milk sample | |
US20130172536A1 (en) | Intravenous Cytomegalovirus Human Immune Globulin and Manufacturing Method Thereof | |
CN111944043B (en) | Method for extracting IgM from plasma waste | |
CN115768789A (en) | Method for obtaining a composition comprising human plasma-derived immunoglobulins M | |
CN111471101A (en) | Method for removing residual IgA in human immunoglobulin products | |
EA043526B1 (en) | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGLOBULIN G FOR INTRAVENOUS ADMINISTRATION | |
WO2023024214A1 (en) | Method for purifying fusion protein of recombinant human serum albumin | |
CN111234009A (en) | Chromatography process for removing IgA and IgM in specific human immunoglobulin | |
CN111205363A (en) | Chromatographic process for improving capacity of removing IgA in human immunoglobulin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TH4A | Reissue of patent specification | ||
TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -FG4A - IN JOURNAL: 9-2017 |