RU2613368C2 - Multivalent antigen-binding fv molecule - Google Patents

Multivalent antigen-binding fv molecule Download PDF

Info

Publication number
RU2613368C2
RU2613368C2 RU2013157040A RU2013157040A RU2613368C2 RU 2613368 C2 RU2613368 C2 RU 2613368C2 RU 2013157040 A RU2013157040 A RU 2013157040A RU 2013157040 A RU2013157040 A RU 2013157040A RU 2613368 C2 RU2613368 C2 RU 2613368C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antigen
domain
binding molecule
cell
polypeptide
Prior art date
Application number
RU2013157040A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2013157040A (en
Inventor
Мелвин ЛИТЛ
Фабрис ЛЕ ГАЛЛ
Original Assignee
Аффимед Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Аффимед Гмбх filed Critical Аффимед Гмбх
Publication of RU2013157040A publication Critical patent/RU2013157040A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2613368C2 publication Critical patent/RU2613368C2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

FIELD: biochemistry.
SUBSTANCE: present invention relates to biochemistry and immunology, in particular, to a dimeric antigen-binding molecule, which is crosslinked with antigen A and antigen B. Said molecule consists of two polypeptide chains, each of which comprises a variable light chain domain, specific to antigen A (VLA), variable heavy chain domain, specific to antigen B (VHB), variable light chain domain, specific to antigen B (VLB) and a variable heavy chain domain, specific to antigen A (VHA). Domains are arranged in following order VLA-VHB-VLB-VHA. VLA of first polypeptide chain is linked to VHA of second polypeptide chain to form an antigen-binding site for antigen A, VHB of first polypeptide chain is bonded to VLB of second polypeptide chain to form an antigen-binding site for antigen B, VLB of first polypeptide chain is linked to VHB of second polypeptide chain to form an antigen-binding site for antigen B and VHA of first polypeptide chain is linked to VLA of second polypeptide chain to form an antigen-binding site for antigen A. Present invention discloses a composition for treating diseases, in which antigens A and B are expressed and containing said antigen-binding molecule.
EFFECT: present invention due to such arrangement of variable domains in antigen-binding molecule VLA-VHB-VLB-VHA from N-terminal to C-terminal of polypeptide, makes it possible to crosslink between antigens A and B, improves efficiency of binding with target antigens.
15 cl, 7 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Настоящее изобретение относится к новым тандемным Fv-диателам и их применению.The present invention relates to new tandem Fv diabodies and their use.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND

Разработаны различные форматы поливалентных рекомбинантных фрагментов антител в качестве альтернативы антителам квадромного происхождения.Various formats of polyvalent recombinant antibody fragments have been developed as an alternative to antibodies of quadromic origin.

В источниках US 7129330, Kipriyanov et al. J. Mol. Biol. (1999) 293, 41-56 и Kipriyanov Meth. Mol. Biol. (2009) 562, 177-193 описано конструирование и получение поливалентных фрагментов антител определенного формата, называемых "тандемными диателами" (TandAb®), поскольку их строение основано на межмолекулярном спаривании вариабельных доменов VH и VL двух различных полипептидов, как описано для диател (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448). Описанные антитела являются биспецифическими по отношению к CD19 и CD3. В отличие от двухвалентных тандемов scFv-scFv (scFv)2, тандемные диатела являются четырехвалентными, поскольку они содержат четыре антиген-связывающих сайта. Описаны полипептиды, образующие тандемные диатела, в соответствии с порядком доменов VHA-VLB-VHB-VLA с N-конца к C-концу. Порядок вариабельных доменов и линкерных пептидов между ними разработан таким образом, что каждый домен связывается с дополняющим доменом в еще одной идентичной молекуле с образованием димеризованного четырехвалентного тандемного диатела. Тандемные диатела не содержат константных иммуноглобулиновых доменов. Сообщалось, что тандемные диатела обладают такими преимуществами, как высокое сродство, повышенная авидность, сниженная скорость выведения, и демонстрируют приемлемую эффективность в условиях in vitro и in vivo.Sources US 7129330, Kipriyanov et al. J. Mol. Biol. (1999) 293, 41-56 and Kipriyanov Meth. Mol. Biol. (2009) 562, 177-193 describes the construction and preparation of multivalent antibody fragments specific format, called "tandem diabody" (TandAb ®), as their structure is based on intermolecular pairing of the variable domains V H and V L of two different polypeptides, as described for the diabody (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448). The antibodies described are bispecific with respect to CD19 and CD3. Unlike the divalent tandems scFv-scFv (scFv) 2 , tandem diabodies are tetravalent because they contain four antigen-binding sites. Polypeptides that form tandem diabodies are described in accordance with the order of the domains V H AV L BV H BV L A from the N-terminus to the C-terminus. The order of the variable domains and linker peptides between them is designed in such a way that each domain binds to the complementary domain in another identical molecule with the formation of a dimerized tetravalent tandem diatel. Tandem diabodies do not contain constant immunoglobulin domains. Tandem diabodies have been reported to have advantages such as high affinity, increased avidity, reduced excretion rate, and demonstrate acceptable efficacy in vitro and in vivo.

Известно несколько дополнительных тандемных диател, обладающих специфичностью антител, например антитела против CD16, антитела против ЕрСАМ и антитела против CD30. В то же время во всех случаях порядок четырех доменов антител в полипептидных цепях тандемного диатела от N-конца к C-концу всегда представлял собой VHA-VLB-VHB-VLA, где VH и VL представляют собой вариабельные домены тяжелой и легкой цепи антител со специфичностью по отношению к антигенам А и В, соответственно. Такие биспецифические тандемные диатела могут образовывать мостик между опухолевой клеткой (например, клеткой B-CLL) и эффекторной клеткой иммунной системы человека (NK-клеткой, Т-клеткой, моноцитом, макрофагом или гранулоцитом), таким образом, обеспечивая уничтожение опухолевой клетки. Прочное связывание опухолевой клетки и цитотоксической клетки приводит к разрушению опухолевой клетки. Хотя такие тандемные диатела оказались подходящими для терапевтического применения, например для терапевтической концепции лечения опухолей, в настоящее время остается потребность в усовершенствованных антиген-связывающих молекулах.Several additional tandem diabodies having antibody specificity are known, for example, anti-CD16 antibodies, anti-EpCAM antibodies and anti-CD30 antibodies. At the same time, in all cases, the order of the four antibody domains in the polypeptide chains of the tandem diatel from the N-terminus to the C-terminus has always been V H AV L BV H BV L A, where V H and V L are heavy and light variable domains antibody chains with specificity for antigens A and B, respectively. Such bispecific tandem diabodies can bridge the gap between a tumor cell (e.g., a B-CLL cell) and an effector cell of the human immune system (NK cell, T-cell, monocyte, macrophage or granulocyte), thus allowing the destruction of the tumor cell. Strong binding of the tumor cell and the cytotoxic cell leads to the destruction of the tumor cell. Although such tandem diabodies proved to be suitable for therapeutic use, for example, for the therapeutic concept of treating tumors, there remains a need for improved antigen-binding molecules.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

В одном аспекте настоящего изобретения предложена димерная антиген-связывающая молекула, содержащая первую и вторую полипептидную цепь, причем каждая из указанных первой и второй полипептидных цепей содержит (а) первый домен VLA, являющийся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным к первому антигену А; (b) второй домен VHB, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным ко второму антигену В; (с) третий домен VLB, являющийся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным ко второму антигену В; и (d) четвертый домен VHA, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным к первому антигену А, причем указанные домены упорядочены в указанных первой и второй полипептидных цепях в порядке VLA-VHB-VLB-VHA от N-конца к С-концу указанных полипептидных цепей, первый домен VLA первой полипептидной цепи связан с четвертым доменом VHA второй полипептидной цепи, образуя антиген-связывающий сайт первого антигена А; второй домен VHB первой полипептидной цепи связан с третьим доменом VLB второй полипептидной цепи, образуя антиген-связывающий сайт второго антигена В; третий домен VLB первой полипептидной цепи связан со вторым доменом VHB второй полипептидной цепи, образуя антиген-связывающий сайт второго антигена В; а четвертый домен VHA первой полипептидной цепи связан с первым доменом VLA второй полипептидной цепи, образуя антиген-связывающий сайт первого антигена А.In one aspect of the present invention, there is provided a dimeric antigen binding molecule comprising a first and second polypeptide chain, each of said first and second polypeptide chains comprising (a) a first domain V L A, which is a light chain variable domain specific for the first antigen A; (b) the second domain V H B, which is the variable domain of the heavy chain specific for the second antigen B; (c) a third domain V L B, which is the variable domain of the light chain specific for the second antigen B; and (d) the fourth domain V H A, which is the variable domain of the heavy chain specific for the first antigen A, and these domains are ordered in the indicated first and second polypeptide chains in the order V L AV H BV L BV H A from the N-end to C the end of said polypeptide chains, the first V L A domain of the first polypeptide chain is linked to the fourth V H A domain of the second polypeptide chain, forming the antigen-binding site of the first antigen A; the second domain V H B of the first polypeptide chain is linked to the third domain V L B of the second polypeptide chain, forming an antigen-binding site of the second antigen B; the third domain V L B of the first polypeptide chain is linked to the second domain V H B of the second polypeptide chain, forming an antigen-binding site of the second antigen B; and the fourth V H A domain of the first polypeptide chain is linked to the first V L A domain of the second polypeptide chain, forming an antigen-binding site of the first antigen A.

В некоторых вариантах реализации указанная антиген-связывающая молекула, описанная в настоящей заявке, является гомодимером, а первая и вторая полипептидные цепи имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах реализации первая и вторая полипептидные цепи нековалентно связаны. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающая молекула является четырехвалентной. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающая молекула является биспецифической. В некоторых вариантах реализации указанные домены являются доменами человека или гуманизированными доменами. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающая молекула содержит по меньшей мере одну дополнительную функциональную единицу. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающая молекула является специфичной по отношению к В-клетке, Т-клетке, клетке - естественному киллеру (NK), миелоидной клетке или фагоцитарной клетке. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающая молекула является биспецифической, причем указанная антиген-связывающая молекула дополнительно является специфичной к опухолевой клетке. В некоторых вариантах реализации вариабельный домен первой легкой цепи (VLA) и вариабельный домен первой тяжелой цепи (VHA) специфичны по отношению к опухолевой клетке. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающая молекула является биспецифической по отношению к альбумину и CD3.In some embodiments, said antigen binding molecule described herein is a homodimer, and the first and second polypeptide chains have the same amino acid sequence. In some embodiments, the first and second polypeptide chains are non-covalently linked. In some embodiments, the antigen binding molecule is tetravalent. In some embodiments, the antigen binding molecule is bispecific. In some embodiments, these domains are human domains or humanized domains. In some embodiments, the antigen binding molecule comprises at least one additional functional unit. In some embodiments, the antigen binding molecule is specific for a B cell, T cell, a natural killer (NK) cell, a myeloid cell, or a phagocytic cell. In some embodiments, the antigen binding molecule is bispecific, wherein said antigen binding molecule is further specific to a tumor cell. In some embodiments, the variable domain of the first light chain (V L A) and the variable domain of the first heavy chain (V H A) are specific for the tumor cell. In some embodiments, the antigen binding molecule is bispecific with respect to albumin and CD3.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает полипептидную цепь, содержащую (а) первый домен VLA, являющийся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным по отношению к первому антигену А; (b) второй домен VHB, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным по отношению ко второму антигену В; (с) третий домен VLB, являющимся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным по отношению ко второму антигену В; и (d) четвертый домен VHA, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным по отношению к первому антигену А; причем указанные домены расположены в полипептидной цепи в порядке VLA-VHB-VLB-VHA от N-конца к С-концу полипептидных цепей. В некоторых вариантах реализации первый домен VLA и четвертый домен VHA не связаны с образованием антиген-связывающего сайта первого антигена А, а второй домен VHB и третий домен VLB не связаны с образованием антиген-связывающего сайта второго антигена В. В некоторых вариантах реализации первый домен VLA и второй домен VHB, второй домен VHB и третий домен VLB, а также третий домен VLB и четвертый домен VHA отделены друг от друга не более чем приблизительно 12 аминокислотными остатками. В некоторых вариантах реализации полипептидная цепь содержит аминокислотные остатки выше первого домена VLA и/или ниже четвертого домена VHA. В некоторых вариантах реализации полипептидная цепь присоединена к дополнительной функциональной единице. В конкретном варианте реализации вариабельные домены являются специфичными по отношению к альбумину и CD3.In yet another aspect, the present invention provides a polypeptide chain comprising (a) a first V L A domain, which is a light chain variable domain specific for the first antigen A; (b) the second domain V H B, which is the variable domain of the heavy chain specific for the second antigen B; (c) a third domain V L B, which is the variable domain of the light chain, specific for the second antigen B; and (d) the fourth domain V H A, which is the variable domain of the heavy chain specific for the first antigen A; moreover, these domains are located in the polypeptide chain in the order of V L AV H BV L BV H A from the N-end to the C-end of the polypeptide chains. In some embodiments, the first V L A domain and the fourth V H A domain are not associated with the formation of the antigen binding site of the first antigen A, and the second V H B domain and the third V L B domain are not associated with the formation of the antigen binding site of the second antigen B In some embodiments, the first V L A domain and the second V H B domain, the second V H B domain and the third V L B domain, as well as the third V L B domain and the fourth V H A domain are not more than approximately separated from each other 12 amino acid residues. In some embodiments, the polypeptide chain contains amino acid residues above the first V L A domain and / or below the fourth V H A domain. In some embodiments, the polypeptide chain is attached to an additional functional unit. In a specific embodiment, the variable domains are specific for albumin and CD3.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептидную цепь согласно описанию настоящей заявки. В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антиген-связывающую молекулу, полипептидную цепь или молекулу нуклеиновой кислоты, описанные в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель.In yet another aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid molecule encoding a polypeptide chain as described herein. In yet another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising an antigen binding molecule, a polypeptide chain or a nucleic acid molecule described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено медицинское применение антиген-связывающей молекулы в качестве лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, инфекционного заболевания, аллергии, рака и/или в качестве иммунодепрессанта.In yet another aspect of the present invention, there is provided the medical use of an antigen-binding molecule as a medicament for treating an autoimmune disease, inflammatory disease, infectious disease, allergy, cancer, and / or as an immunosuppressant.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На Фиг. 1 показана генетическая организация конструкта, кодирующего антиген-связывающую молекулу в соответствии с настоящим изобретением, где VLA представляет собой вариабельный иммуноглобулиновый домен легкой цепи, специфичный по отношению к антигену A, VHB представляет собой вариабельный иммуноглобулиновый домен тяжелой цепи, специфичный по отношению к антигену В, VLB представляет собой вариабельный иммуноглобулиновый домен легкой цепи, специфичный по отношению к антигену В, VHA представляет собой вариабельный иммуноглобулиновый домен тяжелой цепи, специфичный по отношению к антигену A, L1 - пептидный линкер или пептидная связь, соединяющая VLA и VHB, L2 - пептидный линкер или пептидная связь, соединяющая VHB и VLB, a L3 - пептидный линкер или пептидная связь, соединяющая VLB и VHA.In FIG. 1 shows the genetic organization of a construct encoding an antigen-binding molecule in accordance with the present invention, where V L A is the variable immunoglobulin domain of the light chain specific for antigen A, V H B is the variable immunoglobulin domain of the heavy chain specific for The antigen, V L B represents the variable domain of the immunoglobulin light chain specific for the antigen B, V H a is an immunoglobulin variable domain COG loi chain specific for the antigen A, L1 - peptide linker or peptide bond connecting V L A, and V H B, L2 - peptide linker or peptide bond connecting V H B and V L B, a L3 - peptide linker or peptide bond connecting V L B and V H A.

На Фиг. 2 показано образование димерной антиген-связывающей молекулы в соответствии с настоящим изобретением от нефункциональных мономерных полипептидных цепей (А) за счет внутримолекулярного спаривания вариабельных доменов первой полипептидной цепи 1 и второй полипептидной цепи 2 друг с другом (В) до функциональной антиген-связывающей молекулы в соответствии с изобретениями в формате тандемного диатела, где "1" представляет собой первую полипептидную цепь, "2" представляет собой вторую полипептидную цепь, VLA представляет собой вариабельный иммуноглобулиновый домен легкой цепи, специфичный по отношению к антигену A, VHB представляет собой вариабельный иммуноглобулиновый домен тяжелой цепи, специфичный по отношению к антигену В, VLB представляет собой вариабельный иммуноглобулиновый домен легкой цепи, специфичный по отношению к антигену В, VHA представляет собой вариабельный иммуноглобулиновый домен тяжелой цепи, специфичный по отношению к антигену A, L1 - пептидный линкер или пептидная связь, соединяющая VLA и VHB, L2 - пептидный линкер или пептидная связь, соединяющая VHB и VLB, a L3 - пептидный линкер или пептидная связь, соединяющая VLB и VHA.In FIG. 2 shows the formation of a dimeric antigen-binding molecule in accordance with the present invention from non-functional monomeric polypeptide chains (A) due to intramolecular pairing of the variable domains of the first polypeptide chain 1 and the second polypeptide chain 2 with each other (B) to the functional antigen-binding molecule in accordance with the inventions in the format of a tandem diatel, where "1" is the first polypeptide chain, "2" is the second polypeptide chain, V L A is variable a light chain munoglobulin domain specific for antigen A, V H B is a variable immunoglobulin heavy chain domain specific for antigen B, V L B is a light chain variable immunoglobulin domain specific for antigen B, V H A is a variable immunoglobulin domain of the heavy chain specific for the antigen A, L1 is a peptide linker or peptide bond connecting V L A and V H B, L2 is a peptide linker or peptide bond connecting V H B and V L B, a L3 - a peptide linker or peptide bond connecting V L B and V H A.

На Фиг. 3 показывано сравнение тандемных диател CD19×CD3 в анализе цитотоксичности. Вариант 0 = антитело А1 с порядком доменов VHA-VLB-VHB-VLA. Вариант 2 = антитело В с порядком доменов VLA-VHB-VLB-VHA в соответствии с настоящим изобретением. 1×104 клеток Raji, меченых кальцеином, инкубировали с 5×105 МПК в присутствии возрастающих концентраций указанных тандемных диател CD19×CD3. МПК культивировали в течение ночи в присутствии 25 ед/мл IL-2 человека до использования в качестве эффекторных клеток в анализе. После 4 часов инкубирования измеряли флуоресцентный кальцеин, высвобождаемый из апоптозных клеток-мишеней, в клеточной культуральной среде при длине волны 520 нм, и рассчитывали % специфического лизиса. Значения ЕС50 анализировали с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad. На график наносили среднее значение и стандартное отклонение двух повторов.In FIG. Figure 3 shows a comparison of tandem CD19 × CD3 diabodies in a cytotoxicity assay. Option 0 = antibody A1 with the domain order V H AV L BV H BV L A. Option 2 = antibody B with the domain order V L AV H BV L BV H A in accordance with the present invention. 1 × 10 4 calcein-labeled Raji cells were incubated with 5 × 10 5 BMD in the presence of increasing concentrations of the indicated tandem CD19 × CD3 diabodies. MICs were cultured overnight in the presence of 25 u / ml human IL-2 before being used as effector cells in the assay. After 4 hours of incubation, fluorescent calcein released from apoptotic target cells was measured in a cell culture medium at a wavelength of 520 nm, and% specific lysis was calculated. EC 50 values were analyzed by non-linear regression using GraphPad software. The average value and standard deviation of two repetitions were plotted on the graph.

На Фиг. 4 показано сравнение тандемных диател CD19×CD3 в анализе цитотоксичности. Вариант 0 = антитело А2 с порядком доменов VHA-VLB-VHB-VLA. Вариант 2 = антитело C с порядком доменов VLA-VHB-VLB-VHA в соответствии с настоящим изобретением. ×104 клеток Raji, меченых кальцеином, инкубировали с 5×105 свежевыделенных МПК в присутствии возрастающих концентраций указанных тандемных диател CD19×CD3. После 4 часов инкубирования измеряли флуоресцентный кальцеин, высвобождаемый из апоптозных клеток-мишеней, в клеточной культуральной среде при длине волны 520 нм, и рассчитывали % специфического лизиса. Значения ЕС50 анализировали с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad. На график наносили среднее значение и стандартное отклонение двух повторов.In FIG. Figure 4 shows a comparison of the tandem CD19 × CD3 diabodies in a cytotoxicity analysis. Option 0 = antibody A2 with the order of domains V H AV L BV H BV L A. Option 2 = antibody C with the order of domains V L AV H BV L BV H A in accordance with the present invention. × 10 4 calcein-labeled Raji cells were incubated with 5 × 10 5 freshly isolated MICs in the presence of increasing concentrations of the indicated tandem CD19 × CD3 dies. After 4 hours of incubation, fluorescent calcein released from apoptotic target cells was measured in a cell culture medium at a wavelength of 520 nm, and% specific lysis was calculated. EC 50 values were analyzed by non-linear regression using GraphPad software. The average value and standard deviation of two repetitions were plotted on the graph.

На Фигуре 5 показана регуляция TCR тандемными антителами HSA×CD3 в Примере 2 в присутствии или в отсутствие HSA. Клетки CD3+ Jurkat культивировали в течение 2 ч в присутствии возрастающих концентраций варианта 0 (VHA-VLB-VHB-VLA; треугольники) или варианта 2 (VLA-VHB-VLB-VHA в соответствии с настоящим изобретением; квадраты) тандемного антитела HSA×CD3 с (темные символы) или без (светлые символы) добавления 50 мг/мл HSA. После промывки оставшиеся комплексы TCR/CD3 измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием РС5-конъюгированного антитела против TCR α/β. Средние значения флуоресценции использовали для анализа с помощью нелинейной регрессии (эксперимент САВ-306).Figure 5 shows the TCR regulation of HSA × CD3 tandem antibodies in Example 2 in the presence or absence of HSA. CD3 + Jurkat cells were cultured for 2 hours in the presence of increasing concentrations of option 0 (V H AV L BV H BV L A; triangles) or option 2 (V L AV H BV L BV H A in accordance with the present invention; squares) tandem HSA × CD3 antibodies with (dark symbols) or without (light symbols) addition of 50 mg / ml HSA. After washing, the remaining TCR / CD3 complexes were measured by flow cytometry using a PC5 conjugated anti-TCR α / β antibody. Average fluorescence values were used for analysis using nonlinear regression (experiment SAV-306).

На Фиг. 6 показана карта вектора pCDNA5FRT, кодирующего антитело В, с сайтами рестрикции. VH и VL: вариабельные домены тяжелой и легкой цепей.In FIG. 6 shows a map of the pCDNA5FRT vector encoding antibody B with restriction sites. VH and VL: variable domains of the heavy and light chains.

На Фиг. 7 показана карта вектора pSKK3, кодирующего антитело С, с сайтами рестрикции. VH и VL: вариабельные домены тяжелой и легкой цепей.In FIG. 7 shows a map of the pSKK3 vector encoding antibody C with restriction sites. VH and VL: variable domains of the heavy and light chains.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

В одном аспекте настоящего изобретения предложена рекомбинантная димерная и четырехвалентная антиген-связывающая молекула с четырьмя иммуноглобулиновыми доменами (двумя вариабельными доменами тяжелой цепи и двумя вариабельными доменами легкой цепи), присоединенными друг к другу в составе полипептидной цепи и расположенными в порядке VLA-VHB-VLB-VHA от N-конца к С-концу полипептидной цепи. Такая антиген-связывающая молекула согласно настоящему изобретению вызывает повышенную биологическую активность, например усиленный иммунный ответ или усиленное подавление иммунного ответа.In one aspect of the present invention, there is provided a recombinant dimeric and tetravalent antigen binding molecule with four immunoglobulin domains (two heavy chain variable domains and two light chain variable domains) joined together in a polypeptide chain and arranged in the order V L AV H BV L L BV H A from the N-terminus to the C-terminus of the polypeptide chain. Such an antigen binding molecule according to the present invention causes increased biological activity, for example, an enhanced immune response or enhanced suppression of the immune response.

В одном варианте реализации показано, что димерная, биспецифическая антиген-связывающая молекула формата тандемного диатела, являющаяся специфичной по отношению к CD3 и CD19 и содержащая полипептидные цепи с порядком доменов VLA-VHB-VLB-VHA, более чем в 60 раз активна в условиях in vitro, т.е. цитотоксична, чем соответствующая молекула тандемного диатела с аналогичными доменами, но расположенными в обратном порядке VHA-VLB-VHB-VLA.In one embodiment, it is shown that a dimeric, bispecific antigen-binding molecule of the tandem dietel format, which is specific for CD3 and CD19 and contains polypeptide chains with the domain order V L AV H BV L BV H A, is more than 60 times active in in vitro conditions, i.e. cytotoxic than the corresponding molecule of the tandem diabody with similar domains, but in the opposite order V H AV L BV H BV L A.

В еще одном варианте реализации показано, что димерная, биспецифическая антиген-связывающая молекула формата тандемного диатела, являющаяся специфичной по отношению к альбумину (HSA) и CD19 и содержащая полипептидные цепи с порядком доменов VLA-VHB-VLB-VHA, обладает значительно более эффективной модулирующей активностью по отношению к T-клеточному рецептору in vitro, т.е. является более эффективным иммунодепрессантом, чем соответствующая молекула тандемного диатела с аналогичными доменами, но расположенными в обратном порядке VHA-VLB-VHB-VLA.In yet another embodiment, it is shown that the dimeric, bispecific antigen-binding molecule of the tandem dietel format, which is specific for albumin (HSA) and CD19 and contains polypeptide chains with the domain order V L AV H BV L BV H A, has significantly more effective modulating activity against a T-cell receptor in vitro, i.e. is a more effective immunosuppressant than the corresponding tandem diabetic molecule with similar domains, but in the opposite order V H AV L BV H BV L A.

Таким образом, тандемные диатела с порядком доменов VLA-VHB-VLB-VHA от N-конца к С-концу полипептидных цепей обладает повышенным потенциалом для иммунотерапии. Дополнительным преимуществом улучшенной биологической активности является возможность снижения эффективных терапевтических дозировок для таких тандемных диател. Кроме того, побочные эффекты, вызванные вводимыми антиген-связывающими молекулами, также могут быть ослаблены за счет пониженных дозировок. Безотносительно к теоретическим представлениям, новый порядок доменов обеспечивает модифицированное перекрестное связывание димерной антиген-связывающей молекулы с антигеном А и антигеном В по сравнению с тандемными диателами, известными в данной области техники и, в некоторых аспектах изобретения, это позволяет указанной молекуле связываться с антигенами-мишенями, например рецепторами, более эффективно по сравнению с димерными антиген-связывающими молекулами, известными в данной области техники.Thus, tandem diabodies with a domain order of V L AV H BV L BV H A from the N-terminus to the C-terminus of the polypeptide chains have an increased potential for immunotherapy. An additional advantage of improved biological activity is the ability to reduce effective therapeutic dosages for such tandem diabodies. In addition, the side effects caused by the introduced antigen-binding molecules can also be attenuated by reduced dosages. Regardless of theoretical concepts, the new domain order provides a modified cross-linking of the dimeric antigen-binding molecule with antigen A and antigen B compared to tandem diabodies known in the art and, in some aspects of the invention, this molecule can bind to target antigens , for example, receptors, more efficiently compared to dimeric antigen-binding molecules known in the art.

Таким образом, биологическую активность димерной антиген-связывающей молекулы, например тандемного антитела, можно усилить, если четыре вариабельных домена каждой полипептидной цепи, образующей димерную антиген-связывающую молекулу, упорядочены в виде VLA-VHB-VLB-VHA от N-конца к С-концу каждой полипептидной цепи. Запускаемая "биологическая активность" зависит от специфичности антиген-связывающей молекулы и может охватывать цитотоксичность, фагоцитоз, презентацию антигена, высвобождение цитокинов или подавление иммунитета, например антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).Thus, the biological activity of a dimeric antigen binding molecule, for example, a tandem antibody, can be enhanced if the four variable domains of each polypeptide chain forming the dimeric antigen binding molecule are ordered as V L AV H BV L BV H A from the N-terminus The C-terminus of each polypeptide chain. Triggered "biological activity" depends on the specificity of the antigen-binding molecule and may encompass cytotoxicity, phagocytosis, antigen presentation, cytokine release or suppression of immunity, such as antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) and / or complement dependent cytotoxicity (CDC).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложена димерная антиген-связывающая молекула, содержащая первую и вторую полипептидную цепь, причем каждая из указанных первой и второй полипептидных цепей содержит первый домен VLA, являющийся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным по отношению к первому антигену А, второй домен VHB, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным по отношению к второму антигену В, третий домен VLB, являющимся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным по отношению к второму антигену В, четвертый домен VHA, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным по отношению к первому антигену А, и указанные домены расположены в каждой из указанных первой и второй полипептидной цепи в порядке VLA-VHB-VLB-VHA от N-конца к С-концу указанных полипептидных цепей.In some embodiments of the present invention, there is provided a dimeric antigen binding molecule comprising a first and second polypeptide chain, each of said first and second polypeptide chains containing a first domain V L A, which is a variable domain of a light chain specific for the first antigen A, the second domain V H B, which is the variable domain of the heavy chain specific for the second antigen B, the third domain V L B, which is the variable domain of the light chain, specific for the second antigen B, the fourth domain V H A, which is the variable domain of the heavy chain specific for the first antigen A, and these domains are located in each of these first and second polypeptide chains in the order V L AV H BV L BV H A from N -end to the C-terminus of said polypeptide chains.

В некоторых вариантах реализации первый, второй, третий и четвертый вариабельные домены расположены в ориентации, предотвращающей внутримолекулярное спаривание в пределах одной полипептидной цепи, и первая полипептидная цепь связана, т.е. димеризована со второй полипептидной цепью таким образом, что первый домен VLA первой полипептидной цепи связан с четвертым доменом VHA второй полипептидной цепи, образуя антиген-связывающий сайт первого антигена А, второй домен VHB первой полипептидной цепи связан с третьим доменом VLB второй полипептидной цепи, образуя антиген-связывающий сайт второго антигена В, третий домен VLB первой полипептидной цепи связан со вторым доменом VHB второй полипептидной цепи, образуя антиген-связывающий сайт второго антигена В, а четвертый домен VHA первой полипептидной цепи связан с первым доменом VLA второй полипептидной цепи, образуя антиген-связывающий сайт первого антигена А.In some embodiments, the first, second, third, and fourth variable domains are arranged in an orientation that prevents intramolecular pairing within the same polypeptide chain, and the first polypeptide chain is linked, i.e. dimerized with the second polypeptide chain so that the first V L A domain of the first polypeptide chain is linked to the fourth V H A domain of the second polypeptide chain, forming the antigen-binding site of the first antigen A, the second V H B domain of the first polypeptide chain is linked to the third V domain L B of the second polypeptide chain to form an antigen-binding site of the second antigen, the third domain V L B of the first polypeptide chain is linked to a second domain V H B of the second polypeptide chain to form an antigen-binding site of the second antigen, and the fourth domain V H a ne howl polypeptide chain is linked to the first domain V L A second polypeptide chain to form an antigen-binding site of a first antigen A.

Термин "антиген-связывающая молекула" относится к производному иммуноглобулина с поливалентными антиген-связывающими свойствами, предпочтительно содержащему по меньшей мере четыре антиген-связывающих сайта. Каждый антиген-связывающий сайт образован вариабельным доменом тяжелой цепи VH и вариабельным доменом легкой цепи VL с аналогичной антигенной, т.е. эпитопной, специфичностью. Предпочтительно антиген-связывающая молекула согласно настоящему изобретению лишена константных доменов иммуноглобулинов или фрагментов константных доменов иммуноглобулинов, но в некоторых случаях, описанных ниже, константный домен или его части могут быть присоединены к антиген-связывающей молекуле.The term "antigen binding molecule" refers to an immunoglobulin derivative with polyvalent antigen binding properties, preferably containing at least four antigen binding sites. Each antigen-binding site is formed by the V H heavy chain variable domain and V L light chain variable domain with a similar antigenic, i.e. epitope specificity. Preferably, the antigen binding molecule of the present invention lacks the constant domains of immunoglobulins or fragments of the constant domains of immunoglobulins, but in some cases described below, the constant domain or parts thereof may be attached to the antigen binding molecule.

Антиген-связывающая молекула является "димерной"; данный термин относится к комплексу двух полипептидных мономеров. Указанные два полипептидных мономера являются первой и второй полипептидными цепями. Предпочтительно указанная антиген-связывающая молекула является "гомодимером"; данный термин означает, что указанная антиген-связывающая молекула состоит из идентичных полипептидных мономеров. В предпочтительной гомодимерной антиген-связывающей молекуле согласно настоящему изобретению первая и вторая полипептидные цепи могут обладать одинаковой аминокислотной последовательностью, т.е. первая и вторая полипептидные цепи являются идентичными и, таким образом, кодируются и экспрессируются одним и тем же одиночным полинуклеотидом. Иная ситуация имеет место в случае так называемых биспецифических диател, являющихся гетеродимерами, кодируемыми двумя различными полинуклеотидами. В этом случае каждая из первой и второй полипептидных цепей содержит четыре вариабельных домена, образуется четыре сайта связывания, и антиген-связывающая молекула является четырехвалентной. Такие четырехвалентные гомодимерные антиген-связывающие молекулы получили определенное признание в данной области техники как тандемные диатела.The antigen binding molecule is "dimeric"; this term refers to a complex of two polypeptide monomers. These two polypeptide monomers are the first and second polypeptide chains. Preferably, said antigen binding molecule is a “homodimer”; this term means that the specified antigen-binding molecule consists of identical polypeptide monomers. In a preferred homodimeric antigen binding molecule of the present invention, the first and second polypeptide chains may have the same amino acid sequence, i.e. the first and second polypeptide chains are identical and are thus encoded and expressed by the same single polynucleotide. A different situation occurs in the case of the so-called bispecific diabodies, which are heterodimers encoded by two different polynucleotides. In this case, each of the first and second polypeptide chains contains four variable domains, four binding sites are formed, and the antigen-binding molecule is tetravalent. Such tetravalent homodimeric antigen binding molecules have gained some recognition in the art as tandem diabodies.

Предпочтительно в антиген-связывающей молекуле первая и вторая полипептидная цепь нековалентно связаны друг с другом, в частности предусматривается, что ковалентные связи между первой и второй полипептидной цепью отсутствуют. Однако при необходимости две полипептидные цепи можно дополнительно стабилизировать по меньшей мере одной ковалентной связью, например, посредством дисульфидного мостика между остатками цистеина различных полипептидных цепей. Термин "полипептидная цепь" относится к полимеру из аминокислотных остатков, соединенных друг с другом амидными связями. Предпочтительно первая и вторая полипептидные цепи являются одиночными гибридными неразветвленными белками. В каждой из первой и второй полипептидных цепей указанные четыре домена расположены так, что второй домен VHB расположен в С-направлении от первого домена VLA, третий домен VLB расположен в С-направлении от второго домена VHB, а четвертый домен VHA расположен в С-направлении от третьего домена VLB. Первая и вторая полипептидные цепи могут содержать дополнительные аминокислотные остатки в N-направлении от первого домена VLA и/или в С-направлении от четвертого домена VHA. Например, полипептидная цепь может содержать маркерную последовательность, предпочтительно на С-конце, которую можно использовать при очистке полипептида. Примером маркерной последовательности является His-маркер, например His-маркер, состоящий из шести His-остатков.Preferably, in the antigen binding molecule, the first and second polypeptide chain are non-covalently linked to each other, in particular, it is contemplated that there are no covalent bonds between the first and second polypeptide chain. However, if necessary, two polypeptide chains can be further stabilized by at least one covalent bond, for example, by means of a disulfide bridge between the cysteine residues of the various polypeptide chains. The term "polypeptide chain" refers to a polymer of amino acid residues joined together by amide bonds. Preferably, the first and second polypeptide chains are single hybrid unbranched proteins. In each of the first and second polypeptide chains, these four domains are located so that the second V H B domain is located in the C direction from the first V L A domain, the third V L B domain is located in the C direction from the second V H B domain, and the fourth V H A domain is located in the C direction from the third V L B domain. The first and second polypeptide chains may contain additional amino acid residues in the N direction from the first V L A domain and / or in the C direction from the fourth V H A domain For example, a polypeptide chain may contain a marker sequence Preferably at the C-terminus which can be used in the purification of the polypeptide. An example of a marker sequence is a His marker, for example a His marker consisting of six His residues.

В некоторых вариантах реализации первый, второй, третий и четвертый домены ковалентно связаны таким образом, что домены одной и той же полипептидной цепи не связываются, т.е. не спариваются друг с другом. Домены могут быть связаны между собой таким образом, что первый домен VLA связан со вторым доменом VHB с помощью первого линкера L1, второй домен VHB связан с третьим доменом VLB с помощью второго линкера L2, а третий домен VLB связан с четвертым доменом VHA с помощью третьего линкера L3, причем первый линкер L1 и третий линкер L3 расположены дистально по отношению к центральному линкеру L2 на каждой из первой и второй полипептидных цепей. Каждый из линкера L1, линкера L2 и линкера L3 может являться пептидным линкером, содержащим по меньшей мере один аминокислотный остаток, или пептидом, присоединенным без каких-либо промежуточных аминокислотных остатков между двумя соседними доменами.In some embodiments, the first, second, third and fourth domains are covalently linked in such a way that the domains of the same polypeptide chain do not bind, i.e. Do not mate with each other. The domains can be connected in such a way that the first domain V L A is connected to the second domain V H B using the first linker L1, the second domain V H B is connected to the third domain V L B using the second linker L2, and the third domain V L B is connected to the fourth domain V H A via a third L3 linker, wherein the first L1 linker and the third L3 linker are located distally with the central L2 linker on each of the first and second polypeptide chains. Each of the L1 linker, the L2 linker, and the L3 linker may be a peptide linker containing at least one amino acid residue, or a peptide attached without any intermediate amino acid residue between two adjacent domains.

В некоторых вариантах реализации длина каждого из линкеров L1, L2 и L3 такова, что домены первой полипептидной цепи могут связываться с доменами второй полипептидной цепи с образованием димерной антиген-связывающей молекулы. Длина линкеров влияет на гибкость антиген-связывающей молекулы. Желательная гибкость антиген-связывающей молекулы зависит от плотности антигена-мишени и доступности антигена-мишени, т.е. эпитопов. Более длинные линкеры обеспечивают более гибкие антиген-связывающие молекулы с более гибкими антиген-связывающими сайтами. Влияние длины линкера на образование димерных антиген-связывающих молекул описано, например, в Todorovska et al., 2001 Journal of Immunological Methods 248:47-66; Perisic et al., 1994 Structure 2:1217-1226; Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17:357-366 и WO 94/13804.In some embodiments, the length of each of the linkers L1, L2, and L3 is such that the domains of the first polypeptide chain can bind to the domains of the second polypeptide chain to form a dimeric antigen-binding molecule. The length of the linkers affects the flexibility of the antigen binding molecule. The desired flexibility of the antigen binding molecule depends on the density of the target antigen and the availability of the target antigen, i.e. epitopes. Longer linkers provide more flexible antigen-binding molecules with more flexible antigen-binding sites. The effect of linker length on the formation of dimeric antigen-binding molecules is described, for example, in Todorovska et al., 2001 Journal of Immunological Methods 248: 47-66; Perisic et al., 1994 Structure 2: 1217-1226; Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17: 357-366 and WO 94/13804.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации линкеры L1, L2 и/или L3 являются "короткими", т.е. состоят из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или примерно 12 аминокислотных остатков. Такие короткие линкеры способствуют правильной димеризации первой и второй полипептидной цепи путем связывания и образования антиген-связывающих сайтов между вариабельными доменами легкой цепи и вариабельными доменами тяжелой цепи различных полипептидных цепей. В частности, центральный линкер L2 должен быть настолько коротким, чтобы он мог предотвращать образование одноцепочечной Fv (scFv) антиген-связывающей единицы в пределах одной полипептидной цепи двумя соседними областями VHB и VLB. Центральный линкер L2 влияет на гибкость полипептидной цепи. Если центральный линкер L2 является длинным и гибким (в общем случае состоит из приблизительно 12 или более аминокислотных остатков), полипептидная цепь может подвергаться фолдингу по типу "голова к хвосту" и образовать одноцепочечную антиген-связывающую молекулу, известную в данной области техники как одноцепочечное диатело. Если центральный линкер L2 является коротким и жестким, полипептидная цепь не может подвергаться фолдингу по типу "голова к хвосту" и димеризуется с другой полипептидной цепью. Количество аминокислотных остатков линкера для предотвращения фолдинга по типу "голова к хвосту" также зависит от вида вариабельных доменов, объединенных в составе полипептида. В общем случае, сокращение линкера до приблизительно 12 или менее аминокислотных остатков обычно предотвращает взаимодействие смежных областей одной и той же полипептидной цепи друг с другом. Таким образом, для предотвращения спаривания смежных областей одной и той же полипептидной цепи центральный линкер L2 и дистальные линкеры L1 и L3 должны предпочтительно состоять из приблизительно 12 или менее аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения линкеры L1, L2 и/или L3 состоят из приблизительно 3-10 смежных аминокислотных остатков. Линкеры могут состоять из различного числа аминокислотных остатков, однако, в предпочтительном случае дистальные линкеры L1 и L3 содержат одинаковое количество аминокислотных остатков или не отличаются по длине более чем на один или два аминокислотных остатка. В конкретном аспекте настоящего изобретения по меньшей мере один из линкеров L1, L2 и/или L3 состоит из девяти аминокислотных остатков. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения все три линкера L1, L2 и/или L3 состоят из девяти аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из линкеров L1, L2 и/или L3 состоит из менее чем 10-3 аминокислотных остатков.In some preferred embodiments, the linkers L1, L2 and / or L3 are “short”, i.e. consist of 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or about 12 amino acid residues. Such short linkers contribute to the proper dimerization of the first and second polypeptide chains by binding and formation of antigen-binding sites between the variable domains of the light chain and the variable domains of the heavy chain of different polypeptide chains. In particular, the central linker L2 must be so short that it can prevent the formation of a single chain Fv (scFv) antigen binding unit within the same polypeptide chain by two adjacent regions V H B and V L B. The central linker L2 affects the flexibility of the polypeptide chain. If the central linker L2 is long and flexible (in general, consists of approximately 12 or more amino acid residues), the polypeptide chain can undergo head-to-tail folding and form a single chain antigen-binding molecule, known in the art as a single chain diabody . If the central linker L2 is short and rigid, the polypeptide chain cannot undergo head-to-tail folding and dimerizes with another polypeptide chain. The amount of amino acid residues of the linker to prevent head-to-tail folding also depends on the type of variable domains combined in the polypeptide. In general, reducing the linker to about 12 or less amino acid residues typically prevents the adjacent regions of the same polypeptide chain from interacting with each other. Thus, to prevent pairing of adjacent regions of the same polypeptide chain, the central linker L2 and the distal linkers L1 and L3 should preferably consist of about 12 or less amino acid residues. In a preferred embodiment of the present invention, linkers L1, L2 and / or L3 consist of approximately 3-10 adjacent amino acid residues. Linkers may consist of a different number of amino acid residues, however, in the preferred case, the distal linkers L1 and L3 contain the same number of amino acid residues or do not differ in length by more than one or two amino acid residues. In a specific aspect of the present invention, at least one of the linkers L1, L2 and / or L3 consists of nine amino acid residues. In a specific embodiment of the present invention, all three linkers L1, L2 and / or L3 consist of nine amino acid residues. In some embodiments, at least one of the linkers L1, L2 and / or L3 consists of less than 10-3 amino acid residues.

Дополнительные аминокислотные остатки обеспечивают дополнительную гибкость. В альтернативном аспекте центральный линкер L2 может содержать приблизительно 12 или менее аминокислотных остатков для предотвращения фолдинга полипептидной цепи по типу "голова к хвосту" и по меньшей мере один из дистальных линкеров L1 и/или L3 может содержать более 12 аминокислотных остатков для обеспечения дополнительной гибкости. В еще одном варианте реализации две полипептидные цепи содержат центральный линкер L2 из более чем 12 аминокислотных остатков, правильно димеризуются друг с другом, образуя четырехвалентную, димерную антиген-связывающую молекулу (см., например, Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17:357-366). Однако при использовании более длинных линкеров, например, состоящих из приблизительно 13 или более, в частности приблизительно 15 или более аминокислотных остатков димерную антиген-связывающую молекулу можно дополнительно стабилизировать по меньшей мере одной ковалентной связью между такими двумя полипептидными цепями.Additional amino acid residues provide additional flexibility. In an alternative aspect, the central L2 linker may contain about 12 or less amino acid residues to prevent folding of the head-to-tail polypeptide chain and at least one of the distal L1 and / or L3 linkers may contain more than 12 amino acid residues to provide additional flexibility. In yet another embodiment, two polypeptide chains contain a central L2 linker of more than 12 amino acid residues, dimer correctly with each other to form a tetravalent, dimeric antigen-binding molecule (see, for example, Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17 : 357-366). However, when using longer linkers, for example consisting of about 13 or more, in particular about 15 or more amino acid residues, the dimeric antigen-binding molecule can be further stabilized by at least one covalent bond between such two polypeptide chains.

Что касается аминокислотного состава линкеров, в некоторых вариантах реализации выбирают пептиды, не нарушающие димеризацию первой и второй полипептидных цепей. Например, линкеры, содержащие остатки глицина и серина, обычно обеспечивают гибкость и устойчивость к протеазам. Аминокислотную последовательность линкеров можно оптимизировать с целью улучшения связывания антигена и выхода продукции молекул, например, с помощью способов фагового дисплея. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения линкер может содержать аминокислотную последовательность GGSGGSGGS.As for the amino acid composition of linkers, in some embodiments, peptides are selected that do not interfere with the dimerization of the first and second polypeptide chains. For example, linkers containing glycine and serine residues typically provide flexibility and protease resistance. The amino acid sequence of linkers can be optimized in order to improve antigen binding and yield of molecular products, for example, using phage display methods. In some embodiments of the present invention, the linker may comprise the amino acid sequence GGSGGSGGS.

Первый домен VLA, второй домен VHB, третий домен VLB и четвертый домен VHA являются вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи иммуноглобулина. Вариабельные домены включают гипервариабельные петли или комплементарные связывающие области (CDR), содержащие остатки, вступающие в контакт с антигеном, и сегменты, участвующие в правильном фолдинге и отображении CDR. В предпочтительном случае каждый из вариабельных доменов тяжелой цепи и легкой цепи содержит соответствующие три CDR. Указанные домены могут быть получены из иммуноглобулина любого класса, например IgA, IgD, IgE и IgM или их подкласса. Иммуноглобулин может быть получен из организма животного, в частности млекопитающего. Каждый домен может являться полным вариабельным доменом тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, мутантным доменом, фрагментом или производным вариабельного домена естественного происхождения, или синтетическим, например рекомбинантным доменом, полученным с помощью генной инженерии. Производное представляет собой вариабельный домен, отличающийся от аминокислотной последовательности вариабельного домена естественного происхождения делецией, заменой, добавлением или инсерцией по меньшей мере одной аминокислоты. Синтетические, например, рекомбинантные домены, можно получить, например, с помощью хорошо известных воспроизводимых способов из антител гибридомного происхождения или иммуноглобулиновых библиотек фагового дисплея. Например, способы фагового дисплея можно применять для получения вариабельных доменов антител человека к антигену путем скрининга библиотеки последовательностей иммуноглобулинов человека. Сродство первоначально отобранных антител можно дополнительно повысить путем созревания аффинности, например перетасовки цепей или случайного мутагенеза. Специалист в данной области техники должен быть знаком со способами получения доменов из природных или рекомбинантных антител (см., например, лабораторное руководство Antibody engineering: methods and protocols/edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.)). В общем случае, любое антитело, известное в данной области техники, можно использовать в качестве источника вариабельных доменов согласно настоящему изобретению.The first domain V L A, the second domain V H B, the third domain V L B and the fourth domain V H A are the variable domains of the immunoglobulin light chain and heavy chain. Variable domains include hypervariable loops or complementary binding regions (CDRs) containing residues that come into contact with the antigen and segments involved in the proper folding and display of CDRs. In a preferred case, each of the variable domains of the heavy chain and light chain contains the corresponding three CDRs. These domains can be obtained from immunoglobulin of any class, for example, IgA, IgD, IgE and IgM, or a subclass thereof. Immunoglobulin can be obtained from the body of an animal, in particular a mammal. Each domain can be a full variable domain of the heavy or light chain of an immunoglobulin, a mutant domain, a fragment or derivative of a variable domain of natural origin, or a synthetic, for example, recombinant domain obtained by genetic engineering. The derivative is a variable domain that is different from the amino acid sequence of the variable domain of natural origin by deletion, substitution, addition or insertion of at least one amino acid. Synthetic, for example, recombinant domains can be obtained, for example, using well-known reproducible methods from antibodies of hybridoma origin or immunoglobulin phage display libraries. For example, phage display methods can be used to obtain the variable domains of human antibodies to an antigen by screening a library of human immunoglobulin sequences. The affinity of the initially selected antibodies can be further enhanced by maturation of affinity, for example, chain shuffling or random mutagenesis. The person skilled in the art should be familiar with the methods for producing domains from natural or recombinant antibodies (see, for example, the laboratory manual Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny KC Lo; Benny KC II Series: Methods in molecular biology (Totowa, NJ)). In general, any antibody known in the art can be used as a source of the variable domains of the present invention.

В конкретном аспекте настоящего изобретения по меньшей мере один, предпочтительно все из первого домена VLA, второго домена VHB, третьего домена VLB и четвертого домена VHA являются полностью человеческими, гуманизированными или химерными доменами. Гуманизированный вариабельный домен содержит каркасную область, содержащую главным образом аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека и CDR из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. Гуманизированные антитела можно получить с помощью общепринятых способов, например пересадки CDR (см., например, Antibody engineering: methods and protocols/edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.)). Таким образом, специалист в данной области техники легко может получить гуманизированный или полностью человеческий вариант антиген-связывающих молекул и вариабельных доменов из источников, отличных от человека, например мыши, с помощью стандартных молекулярно-биологических методик, известных в данной области техники с целью снижения иммуногенности и улучшения эффективности указанной антиген-связывающей молекулы в иммунной системе человека. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения все домены (например, VLA, VHB, VLB и VHA) являются гуманизированными или полностью полученными от человека; наиболее предпочтительно димерная антиген-связывающая молекула согласно настоящему изобретению является гуманизированной или полностью полученной от человека. Термин "полностью полученный от человека", используемый в настоящей заявке, означает, что аминокислотные последовательности вариабельных доменов и пептидов, связывающих вариабельные домены в первой и второй полипептидных цепях, происходят или могут обнаруживаться в организме человека. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения вариабельные домены, но не пептиды, связывающие вариабельные домены, могут являться доменами человека или гуманизированными доменами.In a particular aspect of the present invention, at least one, preferably all of the first V L A domain, the second V H B domain, the third V L B domain, and the fourth V H A domain are fully human, humanized, or chimeric domains. The humanized variable domain contains a framework region containing mainly the amino acid sequence of a human immunoglobulin and a CDR from an immunoglobulin of non-human origin. Humanized antibodies can be obtained using conventional methods, for example, CDR transplantation (see, for example, Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny KC Lo; Benny KC II Series: Methods in molecular biology (Totowa, NJ)). Thus, a person skilled in the art can easily obtain a humanized or fully human version of antigen-binding molecules and variable domains from sources other than humans, such as mice, using standard molecular biological techniques known in the art to reduce immunogenicity and improving the effectiveness of said antigen binding molecule in the human immune system. In a preferred embodiment of the present invention, all domains (for example, V L A, V H B, V L B and V H A) are humanized or fully derived from humans; most preferably, the dimeric antigen binding molecule of the present invention is humanized or fully derived from humans. The term "fully derived from humans" as used in this application means that the amino acid sequences of the variable domains and peptides that bind the variable domains in the first and second polypeptide chains occur or can be found in the human body. In some embodiments of the present invention, the variable domains, but not the peptides that bind the variable domains, may be human domains or humanized domains.

В одном из вариантов реализации первый домен VLA, второй домен VHB, третий домен VLB и четвертый домен VHA специфичны к одному и тому же антигену, так что антиген-связывающие сайты, образованные указанными доменами, связываются с одним и тем же эпитопом или с различными эпитопами одного и того же антигена. В этом случае выражения "антиген А" и "антиген В" относятся к одному и тому же антигену. Такие антиген-связывающие молекулы являются моноспецифическими.In one embodiment, the first V L A domain, the second V H B domain, the third V L B domain, and the fourth V H A domain are specific for the same antigen, so that antigen-binding sites formed by these domains bind to one and the same epitope or with different epitopes of the same antigen. In this case, the expressions "antigen A" and "antigen B" refer to the same antigen. Such antigen binding molecules are monospecific.

В еще одном из вариантов реализации первый домен VLA, второй домен VHB, третий домен VLB и четвертый домен VHA специфичны к различным антигенам, так что VLA и VHA образуют антиген-связывающий сайт для антигена А, или первый сайт специфичности, a VHB и VLB образуют антиген-связывающий сайт для антигена В, или второй сайт специфичности. Различные антигены могут быть ассоциированы с различными видами клеток, или представляют собой различные антигены одного и того же типа клеток. Такие антиген-связывающие молекулы согласно изобретению являются биспецифическими.In yet another embodiment, the first V L A domain, the second V H B domain, the third V L B domain and the fourth V H A domain are specific for different antigens, so that V L A and V H A form an antigen-binding site for the antigen A, or the first site of specificity, a V H B and V L B form an antigen-binding site for antigen B, or a second site of specificity. Different antigens can be associated with different types of cells, or represent different antigens of the same type of cells. Such antigen binding molecules of the invention are bispecific.

В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один антиген-связывающий сайт может быть специфичным к веществу бактериального происхождения, вирусному белку, аутоиммунному маркеру или антигену, присутствующему на конкретной клетке, например поверхностному белку В-клеток, Т-клеток, естественных киллеров (NK-клеток), миелоидных клеток, фагоцитарных клеток, опухолевых клеток.In some embodiments, the at least one antigen-binding site may be specific for a substance of bacterial origin, a viral protein, an autoimmune marker, or an antigen present on a particular cell, for example, a surface protein of B cells, T cells, natural killers (NK cells) ), myeloid cells, phagocytic cells, tumor cells.

В одном аспекте настоящего изобретения димерная антиген-связывающая молекула является биспецифической и содержит первый сайт специфичности по отношению к эффекторной клетке и второй сайт специфичности по отношению к клетке-мишени, отличающейся от эффекторной клетки. Такие антиген-связывающие молекулы способны перекрестно связывать две клетки и могут применяться для нацеливания эффекторных клеток на определенную мишень. В еще одном аспекте настоящего изобретения димерная антиген-связывающая молекула может являться биспецифической по отношению к клетке-мишени и молекуле, выбранной из группы, состоящей из лекарственного средства, токсина, фермента, радионуклида, альбумина и липопротеина, природных лигандов, например цитокинов или хемокинов. Если молекула-мишень является альбумином, источник альбумина или сывороточного альбумина можно выбрать из группы, состоящей из человека, крупного рогатого скота, кролика, собаки и мыши.In one aspect of the present invention, the dimeric antigen binding molecule is bispecific and comprises a first site for specificity for an effector cell and a second site for specificity for a target cell that is different from an effector cell. Such antigen-binding molecules are capable of cross-linking two cells and can be used to target effector cells to a specific target. In another aspect of the present invention, the dimeric antigen binding molecule may be bispecific with respect to the target cell and a molecule selected from the group consisting of a drug, toxin, enzyme, radionuclide, albumin and lipoprotein, natural ligands, for example cytokines or chemokines. If the target molecule is albumin, the source of albumin or serum albumin can be selected from the group consisting of human, cattle, rabbit, dog and mouse.

"Эффекторные клетки", как правило, относятся к клеткам иммунной системы, способным стимулировать или запускать цитотоксичность, фагоцитоз, презентацию антигена, высвобождение цитокинов. Такие эффекторные клетки являются, например, Т-клетками, естественными киллерами (NK-клетками), гранулоцитами, моноцитами, макрофагами, дендритными клетками, эритроцитами и антиген-презентирующими клетками, но не ограничиваются ими. Примеры подходящих специфичностей для эффекторных клеток включают CD2, CD3, CD5, CD28 и другие компоненты Т-клеточного рецептора (TCR) для Т-клеток; CD16, CD38, CD44, CD56, CD69, CD335 (NKp46), CD336 (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2C и NKG2D для NK-клеток; CD18, CD64 и CD89 для гранулоцитов; CD18, CD64, CD89 и рецептор маннозы для моноцитов и макрофагов; CD64 и рецептор маннозы для дендритных клеток; CD35 для эритроцитов, но не ограничиваются ими. В некоторых аспектах изобретения указанные специфичности, т.е. молекулы клеточной поверхности эффекторных клеток подходят для опосредования уничтожения клеток, за счет связывания биспецифического антитела с такой молекулой клеточной поверхности, что приводит к цитолизу или апоптозу."Effector cells", as a rule, refer to cells of the immune system that can stimulate or trigger cytotoxicity, phagocytosis, presentation of antigen, release of cytokines. Such effector cells are, for example, T cells, natural killer cells (NK cells), granulocytes, monocytes, macrophages, dendritic cells, red blood cells, and antigen-presenting cells. Examples of suitable specificities for effector cells include CD2, CD3, CD5, CD28 and other components of the T cell receptor (TCR) for T cells; CD16, CD38, CD44, CD56, CD69, CD335 (NKp46), CD336 (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, NKG2C and NKG2D for NK cells; CD18, CD64 and CD89 for granulocytes; CD18, CD64, CD89 and mannose receptor for monocytes and macrophages; CD64 and mannose receptor for dendritic cells; CD35 for red blood cells, but not limited to. In some aspects of the invention, said specificities, i.e. molecules of the cell surface of effector cells are suitable for mediating cell destruction by binding a bispecific antibody to such a cell surface molecule, which leads to cytolysis or apoptosis.

"Клетки-мишени" обычно относятся к сайтам, на которые должны быть нацелены эффекторные клетки для индукции или запуска соответствующего биологического, например иммунного, ответа. Примеры клеток-мишеней могут являться опухолевыми клетками или инфекционными агентами, например вирусными или бактериальными патогенами, например вирусом денге, вирусом простого герпеса, вирусом гриппа, ВИЧ или клетками, несущими аутоиммунные мишени, например IL-2, аутоиммунный маркер или аутоиммунный антиген.“Target cells” generally refer to sites that effector cells must be targeted to induce or trigger an appropriate biological, eg, immune, response. Examples of target cells may be tumor cells or infectious agents, for example, viral or bacterial pathogens, for example dengue virus, herpes simplex virus, influenza virus, HIV, or cells carrying autoimmune targets, for example IL-2, an autoimmune marker or an autoimmune antigen.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения димерная антиген-связывающая молекула является биспецифической по отношению к опухолевой клетке и эффекторной клетке, в частности, Т-клетке или NK-клетке. Подходящие специфичности для опухолевых клеток могут являться опухолевыми антигенами и антигенами клеточной поверхности на соответствующей опухолевой клетке, например определенными опухолевыми маркерами. Такая биспецифическая димерная антиген-связывающая молекула связывается как с опухолевой клеткой, так и с иммунной эффекторной клеткой, тем самым запуская цитотоксический ответ, вызванный Т-клетками или NK-клетками. Термин "опухолевый антиген", используемый в настоящей заявке, включает опухоле-ассоциированный антиген (ТАА) и опухоле-специфический антиген (TSA). Термин "опухоле-ассоциированный антиген" (ТАА), используемый в настоящей заявке, относится к белку, присутствующему на опухолевых клетках, а также на нормальных клетках в течение эмбрионального периода (однократные эмбриональные антигены), и после родов в отдельных органах, однако в значительно более низкой концентрации, чем на опухолевых клетках. ТАА могут также присутствовать в строме в непосредственной близости от опухолевой клетки, однако в строме других частей тела они экспрессируются в низких количествах. В противоположность этому, термин "опухоль-специфический антиген" (TSA) относится к белку, экспрессируемому опухолевыми клетками. Термин "антиген клеточной поверхности" относится к любому антигену или его фрагменту, который может распознаваться антителом на поверхности клетки.In a preferred embodiment of the present invention, the dimeric antigen binding molecule is bispecific with respect to the tumor cell and the effector cell, in particular the T cell or NK cell. Suitable specificities for the tumor cells may be tumor antigens and cell surface antigens on the corresponding tumor cell, for example, specific tumor markers. Such a bispecific dimeric antigen-binding molecule binds to both a tumor cell and an immune effector cell, thereby triggering a cytotoxic response induced by T cells or NK cells. The term “tumor antigen” as used herein includes a tumor-associated antigen (TAA) and a tumor-specific antigen (TSA). The term "tumor-associated antigen" (TAA), as used in this application, refers to a protein present on tumor cells as well as on normal cells during the embryonic period (single embryonic antigens), and after delivery in individual organs, however, significantly lower concentration than on tumor cells. TAA may also be present in the stroma in the immediate vicinity of the tumor cell, but in the stroma of other parts of the body they are expressed in low amounts. In contrast, the term “tumor-specific antigen” (TSA) refers to a protein expressed by tumor cells. The term "cell surface antigen" refers to any antigen or fragment thereof that can be recognized by an antibody on a cell surface.

Примеры специфичностей для опухолевых клеток включают CD19, CD20, CD30, белок-предшественник рецептора ламинина, EGFR1, EGFR2, EGFR3, Ер-САМ, PLAP, антиген Томсона-Фриденрайха (TF), MUC-1 (муцин), IGFR, CD5, IL-4-R альфа, IL13-R, FcεRI и IgE, как описано в данной области техники, но не ограничиваются ими.Examples of tumor cell specificities include CD19, CD20, CD30, laminin receptor precursor protein, EGFR1, EGFR2, EGFR3, Ep-CAM, PLAP, Thomson-Friedenreich antigen (TF), MUC-1 (mucin), IGFR, CD5, IL -4-R alpha, IL13-R, FcεRI and IgE, as described in the art, but are not limited to.

В одном варианте реализации специфичности для эффекторных клеток могут представлять собой CD3 или CD16, а специфичности для опухолевых клеток можно выбрать из CD19, CD20, CD30, предшественника рецептора ламинина, Ер-САМ, EGFR1, EGFR2, EGFR3, PLAP, антигена Томсона-Фриденрайха (TF), MUC-1 (муцина), IGFR, CD5, IL-4-R альфа, IL13-R, FcεRI и IgE. Конкретные примеры таких антиген-связывающих молекул являются биспецифическими по отношению к CD3 и CD19 или CD16 и CD30.In one embodiment, the specificities for effector cells can be CD3 or CD16, and the specificities for tumor cells can be selected from CD19, CD20, CD30, the precursor of the laminin receptor, Ep-CAM, EGFR1, EGFR2, EGFR3, PLAP, Thomson-Friedenreich antigen ( TF), MUC-1 (mucin), IGFR, CD5, IL-4-R alpha, IL13-R, FcεRI and IgE. Specific examples of such antigen binding molecules are bispecific with respect to CD3 and CD19 or CD16 and CD30.

В конкретном аспекте настоящего изобретения первый домен VLA и четвертый домен VHA обладают специфичностью по отношению к опухолевой клетке, а два других домена, а именно второй домен VHB и третий домен VLB, обладают специфичностью по отношению к эффекторной клетке, в частности Т-клетке или NK-клетке. В одном варианте реализации первый домен VLA и четвертый домен VHA обладают специфичностью по отношению к опухолевой клетке, а два других домена, а именно второй домен VHB и третий домен VLB, обладают специфичностью по отношению к CD3 или CD16. В определенном варианте реализации первый домен VLA и четвертый домен VHA обладают специфичностью по отношению к CD19, CD20, CD30, предшественнику рецептора ламинина, Ер-САМ, EGFR1, EGFR2, EGFR3, PLAP, антигену Томсона-Фриденрайха (TF), MUC-1 (муцину), IGFR, CD5, IL-4-R альфа, IL13-R, FcεRI, а два других домена, а именно второй домен VHB и третий домен VLB, обладают специфичностью по отношению к CD3.In a specific aspect of the present invention, the first V L A domain and the fourth V H A domain have specificity for the tumor cell, and the other two domains, namely the second V H B domain and the third V L B domain, have specificity for the effector cell , in particular a T cell or NK cell. In one embodiment, the first V L A domain and the fourth V H A domain are specific for the tumor cell, and the other two domains, namely the second V H B domain and the third V L B domain, are specific for CD3 or CD16 . In a specific embodiment, the first V L A domain and the fourth V H A domain are specific for CD19, CD20, CD30, a laminin receptor precursor, Ep-CAM, EGFR1, EGFR2, EGFR3, PLAP, Thomson-Fridenreich antigen (TF), MUC-1 (mucin), IGFR, CD5, IL-4-R alpha, IL13-R, FcεRI, and the other two domains, namely the second V H B domain and the third V L B domain, are specific for CD3.

В еще одном аспекте настоящего изобретения первый домен VLA и четвертый домен VHA обладают специфичностью по отношению к эффекторной клетке, в частности Т-клетке или NK-клетке, а два других домена, а именно второй домен VHB и третий домен VLB, обладают специфичностью по отношению к опухолевой клетке. В одном варианте реализации первый домен VLA и четвертый домен VHA обладают специфичностью по отношению к CD3 или CD16, а два других домена, а именно второй домен VHB и третий домен VLB, обладают специфичностью по отношению к опухолевой клетке. В особенно предпочтительном варианте реализации первый домен VLA и четвертый домен VHA обладают специфичностью по отношению к CD3, а два других домена, а именно второй домен VHB и третий домен VLB, обладают специфичностью по отношению опухолевой клетке, выбранной из группы, состоящей из CD19, CD20, CD30, предшественника рецептора ламинина, Ер-САМ, EGFR1, EGFR2, EGFR3, PLAP, антигена Томсона-Фриденрайха (TF), MUC-1 (муцина), IGFR, CD5, IL-4-R альфа, IL13-R, FcεRI и IgE.In yet another aspect of the present invention, the first V L A domain and the fourth V H A domain are specific for an effector cell, in particular a T cell or NK cell, and two other domains, namely a second V H B domain and a third domain V L B, have specificity for the tumor cell. In one embodiment, the first V L A domain and the fourth V H A domain have specificity for CD3 or CD16, and the other two domains, namely the second V H B domain and the third V L B domain, have specificity for the tumor cell . In a particularly preferred embodiment, the first V L A domain and the fourth V H A domain have specificity for CD3, and the other two domains, namely the second V H B domain and the third V L B domain, have specificity for the tumor cell selected from the group consisting of CD19, CD20, CD30, a laminin receptor precursor, Ep-CAM, EGFR1, EGFR2, EGFR3, PLAP, Thomson-Fridenreich antigen (TF), MUC-1 (mucin), IGFR, CD5, IL-4- R alpha, IL13-R, FcεRI and IgE.

Антиген CD3 связан с комплексом Т-клеточного рецептора на Т-клетках. В случае, когда специфичность для эффекторной клетки представляет собой CD3, связывание димерной антиген-связывающей молекулы согласно настоящему изобретению с CD3 может вызвать цитотоксическую активность Т-клеток по отношению к клеткам-мишеням. А именно, биспецифическое связывание димерной антиген-связывающей молекулы с CD3 и с клеткой-мишенью, например опухолевой клеткой, может индуцировать лизис клетки-мишени. Димерные антиген-связывающие молекулы со специфичностью к CD3 и их получение известны в данной области техники (и описаны, например, в Kipriyanov et al., 1999, Journal of Molecular Biology 293:41-56, Le Gall et al., 2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17/4:357-366).The CD3 antigen is associated with a T-cell receptor complex on T cells. In the case where the specificity for the effector cell is CD3, the binding of the dimeric antigen-binding molecule of the present invention to CD3 can cause the cytotoxic activity of T cells with respect to the target cells. Namely, the bispecific binding of a dimeric antigen-binding molecule to CD3 and to a target cell, for example a tumor cell, can induce lysis of the target cell. Dimeric antigen-binding molecules with specificity for CD3 and their preparation are known in the art (and are described, for example, in Kipriyanov et al., 1999, Journal of Molecular Biology 293: 41-56, Le Gall et al., 2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17/4: 357-366).

Моноспецифические антиген-связывающие молекулы против CD3 известны своими иммуносупрессивными свойствами при связывании с Т-клеточным рецептором и его модуляции (например, как описано в WO 2004/024771). В одном варианте реализации антиген-связывающая молекула согласно настоящему изобретению является биспецифической по отношению к CD3 и альбумин для применения в качестве иммунодепрессанта, например при трансплантации.Monospecific antigen-binding molecules against CD3 are known for their immunosuppressive properties upon binding to and modulating a T-cell receptor (for example, as described in WO 2004/024771). In one embodiment, the antigen binding molecule of the present invention is bispecific with respect to CD3 and albumin for use as an immunosuppressant, for example, for transplantation.

Антиген CD16 (FcγIIIA) является рецептором, экспрессируемым на поверхности NK-клеток. NK-клетки обладают характерной цитолитической активностью, и биспецифическое связывание димерной антиген-связывающей молекулы согласно настоящему изобретению с CD16 может запустить цитотоксическую активность NK-клеток по отношению к клеткам-мишеням. Описан пример биспецифической антиген-связывающей молекулы, обладающей специфичностью по отношению к CD16, например в Arndt et al., 1999, Blood, 94:2562-2568. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из вариабельных доменов тяжелой или легкой цепи получен из антитела против CD16, описанного в WO 2006/125668, в частности антител, распознающих изоформу CD16A, но не изоформу CD16B.The CD16 antigen (FcγIIIA) is a receptor expressed on the surface of NK cells. NK cells have characteristic cytolytic activity, and the bispecific binding of the dimeric antigen-binding molecule of the present invention to CD16 can trigger the cytotoxic activity of NK cells with respect to target cells. An example of a bispecific antigen-binding molecule that is specific for CD16 is described, for example, in Arndt et al., 1999, Blood, 94: 2562-2568. In a particular embodiment of the present invention, at least one of the heavy or light chain variable domains is derived from an anti-CD16 antibody described in WO 2006/125668, in particular antibodies that recognize the CD16A isoform, but not the CD16B isoform.

Димерные антиген-связывающие молекулы согласно изобретению, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к антигену CD19, можно применять для иммунотерапии В-клеточных злокачественных новообразований, поскольку антиген CD19 экспрессируется практически на всех злокачественных новообразованиях В-ряда от лимфобластного лейкоза (ALL) до неходжкинской лимфомы (NHL). В частности, для лечения неходжкинской лимфомы можно применять димерные антиген-связывающие молекулы, специфичные по отношению к CD19 или CD20. Димерные антиген-связывающие молекулы, обладающие специфичностью к CD19, и их получение известны в данной области техники (и описаны, например, в Cochlovius et al., 2000, Cancer Research 60:4336-4341).Dimeric antigen-binding molecules according to the invention, in which tumor specificity is provided by affinity for the CD19 antigen, can be used for immunotherapy of B-cell malignant neoplasms, since the CD19 antigen is expressed on almost all B-malignant neoplasms from lymphoblastic leukemia (ALL) to non-Hodgkin's lymphoma ( NHL). In particular, dimeric antigen-binding molecules specific for CD19 or CD20 can be used to treat non-Hodgkin lymphoma. Dimeric antigen binding molecules specific for CD19 and their preparation are known in the art (and are described, for example, in Cochlovius et al., 2000, Cancer Research 60: 4336-4341).

Димерные антиген-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к рецептору ламинина или предшественнику рецептора ламинина, можно применять, например не ограничиваясь этим, для лечения хронического В-клеточного лимфолейкоза (B-CLL), неходжкинской лимфомы, лимфомы Ходжкина, рака легкого, рака толстой кишки, карциномы молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, в частности состояний метастазирующего рака или минимального остаточного рака. Димерные антиген-связывающие молекулы, обладающие специфичностью по отношению к предшественнику рецептора ламинина, описаны, например, в Zuber et al., 2008, J. Mol. Biol., 378:530-539.Dimeric antigen-binding molecules of the present invention, in which tumor specificity is provided by an affinity for a laminin receptor or a precursor of a laminin receptor, can be used, for example, but not limited to the treatment of chronic B-cell lymphocytic leukemia (B-CLL), non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin’s lymphoma lung cancer, colon cancer, breast carcinoma, pancreatic cancer, prostate cancer, in particular metastatic cancer conditions or minimal residual cancer. Dimeric antigen-binding molecules that are specific for a laminin receptor precursor are described, for example, in Zuber et al., 2008, J. Mol. Biol., 378: 530-539.

Димерные антиген-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к EGFR1, могут быть особенно полезны при лечении рака, при котором стимулируется или изменяется экспрессия EGFR1, например рака молочной железы, мочевого пузыря, головы и шеи, предстательной железы, почек, немелкоклеточного рака легкого, рака толстой кишки и глиомы.Dimeric antigen-binding molecules of the present invention, in which tumor specificity is provided by affinity for EGFR1, can be particularly useful in the treatment of cancer in which the expression of EGFR1, for example, breast, bladder, head and neck, prostate, kidney, cancer is stimulated or altered. non-small cell lung cancer, colon cancer and glioma.

Димерные антиген-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к TF-антигену, могут быть особенно полезны при лечении рака молочной железы или толстой кишки и/или метастазов в печень.The dimeric antigen-binding molecules of the present invention, in which tumor specificity is provided by affinity for the TF antigen, can be particularly useful in the treatment of breast or colon cancer and / or liver metastases.

Димерные антиген-связывающие молекулы, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к CD30, могут быть особенно полезны при лечении болезни Ходжкина. Антиген-связывающие молекулы, обладающие специфичностью по отношению к CD30, описаны, например, в Arndt et al., 1999, Blood, 94:2562-2568.Dimeric antigen-binding molecules in which tumor specificity is provided by an affinity for CD30 may be particularly useful in the treatment of Hodgkin's disease. Antigen-binding molecules having specificity for CD30 are described, for example, in Arndt et al., 1999, Blood, 94: 2562-2568.

Димерные антиген-связывающие молекулы, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к альфа-цепи рецептора IL-4 (IL4R альфа), могут быть особенно полезны при лечении солидных опухолей, в частности карцином молочной железы, яичников, выделительной системы, головы и шеи, злокачественной меланомы и саркомы Капоши при СПИДе. Димерные антиген-связывающие молекулы, содержащие по меньшей мере одну дополнительную специфичность по отношению к EGFR3/HER3 и/или EGFR2/neu, могут быть особенно полезны при лечении рака молочной железы. Димерные антиген-связывающие молекулы, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к IGFR, могут быть особенно полезны при лечении рака предстательной железы, толстой кишки, яичников или молочной железы.Dimeric antigen-binding molecules in which tumor specificity is provided by an affinity for the alpha chain of the IL-4 receptor (IL4R alpha) can be especially useful in the treatment of solid tumors, in particular carcinomas of the mammary gland, ovaries, excretory system, head and neck, malignant Kaposi's melanomas and sarcomas in AIDS. Dimeric antigen-binding molecules containing at least one additional specificity for EGFR3 / HER3 and / or EGFR2 / neu may be particularly useful in the treatment of breast cancer. Dimeric antigen-binding molecules in which tumor specificity is provided by an affinity for IGFR may be particularly useful in the treatment of cancer of the prostate, colon, ovary, or breast.

Димерные антиген-связывающие молекулы, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к CD5, могут быть особенно полезны при лечении хронического лимфоцитарного лейкоза.Dimeric antigen-binding molecules in which tumor specificity is provided by an affinity for CD5 may be particularly useful in the treatment of chronic lymphocytic leukemia.

Димерные антиген-связывающие молекулы, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к MUC-I, могут быть особенно полезны при лечении рака желудка и рака яичников.Dimeric antigen-binding molecules in which tumor specificity is provided by affinity for MUC-I may be particularly useful in the treatment of stomach cancer and ovarian cancer.

Димерные антиген-связывающие молекулы, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к ЕрСАМ, могут быть особенно полезны при лечении карцином ободочной кишки, почек и молочной железы.Dimeric antigen-binding molecules in which tumor specificity is provided by affinity for EpCAM may be particularly useful in the treatment of carcinomas of the colon, kidney, and mammary gland.

Димерные антиген-связывающие молекулы, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к PLAP, могут быть особенно полезны при лечении рака яичников или яичек.Dimeric antigen-binding molecules in which tumor specificity is provided by an affinity for PLAP may be particularly useful in the treatment of ovarian or testicular cancer.

Димерные антиген-связывающие молекулы, в которых опухолевая специфичность обеспечивается сродством к OFA-iLR, могут быть особенно полезны при лечении метастатических опухолей.Dimeric antigen-binding molecules in which tumor specificity is provided by an affinity for OFA-iLR may be particularly useful in the treatment of metastatic tumors.

В конкретном аспекте настоящего изобретения антиген-связывающая молекула, как описано в настоящей заявке, является димерной и биспецифической по отношению к CD3 и CD19, или антиген-связывающая молекула является димерной и биспецифической по отношению к CD16 и CD19. В конкретном варианте реализации первый домен VLA и четвертый домен VHA обладают специфичностью по отношению к CD3 и CD16, соответственно, в то время как второй домен VHB и третий домен VLB обладают специфичностью по отношению к CD19. В обоих случаях первая и вторая полипептидные цепи обладают порядком доменов

Figure 00000001
or
Figure 00000002
от N-конца к С-концу полипептидных цепей. В предпочтительном варианте реализации первый, второй, третий и четвертый домены являются гуманизированными или полностью полученными от человека. В наиболее предпочтительном варианте реализации первая и вторая полипептидная цепь, как установлено выше, являются гуманизированными или полностью полученными от человека. В еще одном аспекте настоящего изобретения димерная антиген-связывающая молекула может являться биспецифической, например, по отношению к ЕрСАМ и CD3; альбумину, например HSA и CD3 или EGFR и CD3.In a specific aspect of the present invention, the antigen binding molecule as described herein is dimeric and bispecific with respect to CD3 and CD19, or the antigen binding molecule is dimeric and bispecific with respect to CD16 and CD19. In a specific embodiment, the first V L A domain and the fourth V H A domain have specificity for CD3 and CD16, respectively, while the second V H B domain and the third V L B domain have specificity for CD19. In both cases, the first and second polypeptide chains have the order of domains
Figure 00000001
or
Figure 00000002
from the N-terminus to the C-terminus of polypeptide chains. In a preferred embodiment, the first, second, third and fourth domains are humanized or fully derived from humans. In a most preferred embodiment, the first and second polypeptide chain, as stated above, are humanized or fully derived from humans. In yet another aspect of the present invention, the dimeric antigen binding molecule may be bispecific, for example, with respect to EpCAM and CD3; albumin, for example HSA and CD3 or EGFR and CD3.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения антиген-связывающая молекула, как описано в настоящей заявке, является специфической по отношению к альбумину, например сывороточному альбумину человека, и еще одному антигену, не являющемуся альбумином. Такая антиген-связывающая молекула связывается с сывороточным альбумином, что увеличивает период полужизни в сыворотке крови и in vivo. Таким образом, такие антиген-связывающие молекулы являются предпочтительными для медицинского или диагностического применения и фармацевтических композиций, в которых полипептид таких антиген-связывающих молекул содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи терапевтического или диагностического антитела и вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, специфичные по отношению к альбумину. Известные и/или коммерчески доступные терапевтические, диагностические антитела или антитела против альбумина можно применять в качестве источников вариабельных доменов легких цепей и вариабельных доменов тяжелой цепи. Кроме того, в данной области техники известны способы стимуляции синтеза и получения антител или Fv-фрагментов, специфичных по отношению к альбумину, например HSA. В таких антиген-связывающих молекулах домены полипептидной цепи расположены в порядке VLA-VHB-VLB-VHA, где антиген А или антиген В является альбумином. В предпочтительном варианте реализации альбумин является антигеном А. В определенном аспекте настоящего изобретения другой антиген представляет собой CD3. В конкретном варианте реализации антиген А является сывороточным альбумином человека (HSA), и полипептид антиген-связывающей молекулы HSA×CD3 обладает порядком доменов

Figure 00000003
, как показано в Примере 2. Для получения такой антиген-связывающей молекулы, например, можно получить и встроить в соответствующем порядке вариабельные домены антител или фрагментов антител против HSA и против CD3, например, аналогично описанию для CD3×CD19 в Примере 1 в экспрессирующую плазмиду, показанную на Фиг. 7, путем замены показанных доменов против CD3 и против CD19, или в любую другую подходящую экспрессирующую плазмиду или экспрессирующий конструкт.In an additional aspect of the present invention, the antigen binding molecule, as described herein, is specific for albumin, for example human serum albumin, and another non-albumin antigen. Such an antigen-binding molecule binds to serum albumin, which increases the half-life in serum and in vivo. Thus, such antigen binding molecules are preferred for medical or diagnostic use and pharmaceutical compositions in which the polypeptide of such antigen binding molecules comprises a light chain variable domain and a therapeutic or diagnostic antibody heavy chain variable domain and a light chain variable domain and a heavy variable domain chains specific for albumin. Known and / or commercially available therapeutic, diagnostic or anti-albumin antibodies can be used as sources of the variable domains of the light chains and the variable domains of the heavy chain. In addition, methods are known in the art for stimulating the synthesis and production of antibodies or Fv fragments specific for albumin, such as HSA. In such antigen-binding molecules, the domains of the polypeptide chain are arranged in the order V L AV H BV L BV H A, where antigen A or antigen B is albumin. In a preferred embodiment, albumin is antigen A. In a specific aspect of the present invention, the other antigen is CD3. In a specific embodiment, antigen A is human serum albumin (HSA), and the polypeptide of the antigen binding molecule HSA × CD3 has a domain order
Figure 00000003
as shown in Example 2. To obtain such an antigen-binding molecule, for example, it is possible to obtain and insert in the appropriate order the variable domains of antibodies or anti-HSA and anti-CD3 antibody fragments, for example, similarly to the description for CD3 × CD19 in Example 1 in an expression plasmid shown in FIG. 7, by replacing the shown anti-CD3 and anti-CD19 domains, or any other suitable expression plasmid or expression construct.

Дополнительный аспект настоящего изобретения обеспечивает димерную антиген-связывающую молекулу по любому из вышеописанных вариантов реализации, связанную с дополнительной функциональной единицей, например функциональным доменом или агентом, независимо опосредующим биологическую функцию, в частности биохимическое событие. Дополнительная функциональная единица может входить в состав комплекса с или являться ковалентно связанной с по меньшей мере одной из двух отдельных полипептидных цепей димерной антиген-связывающей молекулы. В одном аспекте указанная дополнительная функциональная единица может быть ковалентно связана с только одной из отдельных полипептидных цепей, а в другом аспекте указанная дополнительная функциональная единица может быть ковалентно связана с обеими полипептидными цепями димерной антиген-связывающей молекулы, таким образом, соединяя две полипептидные цепи. В дополнительном аспекте каждая из двух полипептидных цепей по отдельности ковалентно связана с дополнительной функциональной единицей. Если указанная дополнительная функциональная единица ковалентно связана с по меньшей мере одной из двух полипептидных цепей, указанную дополнительную функциональную единицу можно объединить с по меньшей мере одной из двух полипептидных цепей с помощью пептидной связи или пептидного линкера. Кроме того, указанная дополнительная функциональная единица может быть присоединена посредством химического конъюгирования, например дисульфидного мостика, например, между остатком цистеина по меньшей мере одной полипептидной цепи и остатком цистеина дополнительной функциональной единицы, сложноэфирной связи или химического перекрестного связывания. В определенном аспекте настоящего изобретения указанная дополнительная функциональная единица может быть связана с антиген-связывающей молекулой с помощью расщепляемого линкера, например, дисульфидной связи.An additional aspect of the present invention provides a dimeric antigen-binding molecule according to any of the above embodiments, associated with an additional functional unit, for example, a functional domain or an agent, independently mediating a biological function, in particular a biochemical event. An additional functional unit may be part of complex C or be covalently linked to at least one of two separate polypeptide chains of a dimeric antigen-binding molecule. In one aspect, said additional functional unit can be covalently linked to only one of the individual polypeptide chains, and in another aspect, said additional functional unit can be covalently linked to both polypeptide chains of a dimeric antigen binding molecule, thereby connecting two polypeptide chains. In an additional aspect, each of the two polypeptide chains individually is covalently linked to an additional functional unit. If the specified additional functional unit is covalently linked to at least one of the two polypeptide chains, the specified additional functional unit can be combined with at least one of the two polypeptide chains using a peptide bond or peptide linker. Furthermore, said additional functional unit may be coupled by chemical conjugation, for example, a disulfide bridge, for example, between a cysteine residue of at least one polypeptide chain and a cysteine residue of an additional functional unit, an ester bond or chemical crosslinking. In a specific aspect of the present invention, said additional functional unit may be coupled to the antigen-binding molecule via a cleavable linker, for example, a disulfide bond.

Указанная дополнительная функциональная единица может быть связана с N-концом или С-концом первой и/или второй полипептидных цепей. Если одна дополнительная функциональная единица присоединена к обеим (первой и второй) полипептидным цепям, указанную дополнительную функциональную единицу можно присоединить по N-концу к одной полипептидной цепи и по С-концу к другой полипептидной цепи.The specified additional functional unit may be associated with the N-terminus or the C-terminus of the first and / or second polypeptide chains. If one additional functional unit is attached to both (first and second) polypeptide chains, this additional functional unit can be attached at the N-terminus to one polypeptide chain and at the C-terminus to the other polypeptide chain.

Гомобифункциональные и гетеробифункциональные реагенты для химического перекрестного связывания полипептидной цепи с дополнительной функциональной единицей, например дополнительным полипептидом или агентом, хорошо известны в данной области техники. Примеры включают 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту) (DTNB), о-фенилендималеимид (o-PDM), сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) или гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)бутановой кислоты (МРВН), но не ограничиваются ими. Способы перекрестного связывания полипептидных цепей, включающих иммуноглобулиновые цепи с дополнительным полипептидом или химическим агентом, описаны, например, в Graziano et al., Methods in Molecular Biology, 2004, vol. 283, 71-85 and Hermanson, G.T. "Bioconjugate Techniques" Academic Press, London, 1996.Homobifunctional and heterobifunctional reagents for chemical cross-linking of a polypeptide chain with an additional functional unit, for example, an additional polypeptide or agent, are well known in the art. Examples include 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), o-phenylenedimaleimide (o-PDM), succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), N-succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA ), succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) or 4- (4-N-maleimidophenyl) butanoic acid hydrazide (MRVH), but are not limited to. Methods for cross-linking polypeptide chains including immunoglobulin chains with an additional polypeptide or chemical agent are described, for example, in Graziano et al., Methods in Molecular Biology, 2004, vol. 283, 71-85 and Hermanson, G.T. "Bioconjugate Techniques" Academic Press, London, 1996.

В одном аспекте указанная дополнительная функциональная единица может являться по меньшей мере одним дополнительным вариабельным доменом иммуноглобулина. Дополнительный вариабельный домен иммуноглобулина может являться специфичным по отношению к первому антигену А или второму антигену В, к которым специфичны сайты связывания димерной антиген-связывающей молекулы или, в качестве альтернативы, специфичным по отношению к третьему антигену С, который отличается от антигена А и антигена В. В конкретном аспекте изобретения с каждой из двух полипептидных цепей можно объединить дополнительный вариабельный домен легкой цепи VL и дополнительный вариабельный домен тяжелой цепи VH, так что один дополнительный домен, в частности VH, присоединен к N-концу, а другой дополнительный домен, в частности VL, присоединен к С-концу, что приводит к получению полипептида, содержащего шесть вариабельных доменов, связывающегося с другим идентичным полипептидом с образованием димерной антиген-связывающей молекулы, содержащей шесть антиген-связывающих сайтов. В еще одном аспекте изобретения один дополнительный вариабельный домен иммуноглобулина можно объединить с одной из полипептидных цепей антиген-связывающей молекулы, которая затем нековалентно связывается с комплементарным вариабельным доменом иммуноглобулина с аналогичным сайтом специфичности дополнительного третьего полипептида, тем самым образуя дополнительный антиген-связывающий сайт с участием димерной антиген-связывающей молекулы и дополнительного третьего полипептида. В еще одном аспекте изобретения дополнительная антиген-связывающая единица, в том числе scFv или диатело, может быть связана в качестве дополнительной функциональной единицы с димерной антиген-связывающей молекулой.In one aspect, said additional functional unit may be at least one additional immunoglobulin variable domain. An additional immunoglobulin variable domain may be specific for the first antigen A or the second antigen B, to which the binding sites of the dimeric antigen-binding molecule are specific, or, alternatively, specific for the third antigen C, which is different from antigen A and antigen B In a particular aspect of the invention, an additional light chain variable domain V L and an additional heavy chain variable domain V H can be combined with each of the two polypeptide chains, so that one up to a complementary domain, in particular V H , is attached to the N-terminus, and another additional domain, in particular V L , is attached to the C-terminus, which results in a polypeptide containing six variable domains that binds to another identical polypeptide to form a dimeric antigen -binding molecule containing six antigen-binding sites. In another aspect of the invention, one additional immunoglobulin variable domain can be combined with one of the polypeptide chains of the antigen binding molecule, which then non-covalently binds to the complementary variable domain of the immunoglobulin with a similar specificity site for the additional third polypeptide, thereby forming an additional antigen-binding site involving dimeric an antigen binding molecule and an additional third polypeptide. In yet another aspect of the invention, an additional antigen binding unit, including scFv or diatelo, may be linked as an additional functional unit to a dimeric antigen binding molecule.

В конкретном аспекте изобретения указанная дополнительная функциональная единица может являться по меньшей мере одной дополнительной димерной антиген-связывающей молекулой, как описано в настоящей заявке. Соответственно, две или более димерные антиген-связывающие молекулы согласно изобретению можно присоединить друг к другу с целью повышения валентности и авидности антиген-связывающих молекул.In a specific aspect of the invention, said additional functional unit may be at least one additional dimeric antigen-binding molecule, as described herein. Accordingly, two or more dimeric antigen-binding molecules according to the invention can be attached to each other in order to increase the valency and avidity of the antigen-binding molecules.

В еще одном аспекте изобретения дополнительная функциональная единица может являться эффекторным доменом, в том числе Fc-доменом, CH2-доменом, CH3-доменом, шарнирным доменом или их фрагментом. Такая единица может придавать антиген-связывающей молекуле эффекторные свойства в случае связывания с Fc-рецепторами. Такие функциональные единицы могут также применяться для увеличения времени полужизни антиген-связывающей молекулы в сыворотке.In yet another aspect of the invention, the additional functional unit may be an effector domain, including an Fc domain, a CH2 domain, a CH3 domain, a hinge domain, or a fragment thereof. Such a unit can confer antigen-binding molecule effector properties upon binding to Fc receptors. Such functional units can also be used to increase the half-life of an antigen-binding molecule in serum.

В еще одном аспекте изобретения указанная дополнительная функциональная единица может являться ферментом. В случае, если фермент способен превращать пролекарство в активное лекарство, такую антиген-связывающую молекулу можно применять при антитело-зависимой терапии с использованием ферментов и пролекарств (ADEPT). Для этого антиген-связывающая молекула нацеливает фермент на ткань, представляющую интерес, и при связывании антиген-связывающей молекулы с указанной тканью в этой области активируется пролекарство. Кроме того, в данной области техники известно применение биспецифических антиген-связывающих молекул для нацеливания ферментов на терапевтические средства для лечения рака, например биспецифических антиген-связывающих молекул, обладающих специфичностью по отношению к CD30 и щелочной фосфатазе, которая катализирует превращение фосфата митомицина в спирт митомицина, или специфичностью по отношению к плацентарной щелочной фосфатазе и β-лактамазе, которые активируют противораковые пролекарства на основе цефалоспорина, но не ограничиваясь ими. Кроме того, возможно применение биспецифических антиген-связывающих молекул, обладающих специфичностью по отношению к фибрину и тканевому активатору плазминогена, для фибринолиза, и применение конъюгированных с ферментом антиген-связывающих молекул для иммуноферментного анализа.In yet another aspect of the invention, said additional functional unit may be an enzyme. If the enzyme is able to convert a prodrug into an active drug, such an antigen-binding molecule can be used in antibody-dependent therapy using enzymes and prodrugs (ADEPT). For this, the antigen-binding molecule targets the enzyme on the tissue of interest, and when the antigen-binding molecule binds to the specified tissue, a prodrug is activated in this area. In addition, it is known in the art to use bispecific antigen binding molecules to target enzymes to cancer therapeutics, for example bispecific antigen binding molecules that are specific for CD30 and alkaline phosphatase, which catalyzes the conversion of mitomycin phosphate to mitomycin alcohol, or specificity for placental alkaline phosphatase and β-lactamase, which activate cephalosporin-based anti-cancer prodrugs, but not limiting with them. In addition, it is possible to use bispecific antigen-binding molecules with specificity for fibrin and tissue plasminogen activator for fibrinolysis, and the use of enzyme-conjugated antigen-binding molecules for enzyme immunoassay.

В еще одном аспекте изобретения указанная функциональная единица может являться лекарством, токсином, радиоактивным изотопом, лимфокином, хемокином или молекулой-меткой. Такая антиген-связывающая молекула доставляет функциональную единицу к желательному месту действия. Например, химиотерапевтическое лекарственное средство, присоединенное к антиген-связывающей молекуле, специфичной по отношению к опухолевому антигену, можно доставлять к опухолевой клетке, а токсины можно доставлять к патогенам или опухолевым клеткам. Антиген-связывающую молекулу, присоединенную к токсину, можно применять для нацеливания NK-клеток или макрофагов; предпочтительно, она специфична по отношению к CD16. Примерами токсинов являются, не ограничиваясь ими, рибозилтрансферазы, сериновые протеазы, активатор гуанилциклазы, кальмодулин-зависимая аденилциклаза, рибонуклеаза, ДНК-алкилирующий агент или ингибитор митоза, например доксорубицин. Молекула-метка может являться, например, флуоресцентной, люминесцентной или радиоактивной молекулой, металлохелатом или ферментом (например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, бета-галактозидазой, малатдегидрогеназой, глюкозооксидазой, уреазой, каталазой и т.д.), который, в свою очередь, при взаимодействии с субстратом реагирует с ним с получением обнаруживаемого химического радикала и который можно применять для визуализации или иммуноанализа in vivo при связывании с антиген-связывающей молекулой в соответствии с изобретением. При применении для иммуноанализа димерную антиген-связывающую молекулу также можно иммобилизовать на нерастворимом носителе, например стекле, полистироле, полипропилене, полиэтилене, декстране, нейлоне, природных и модифицированных целлюлозах, полиакриламидах, агарозе и магнитных гранулах.In yet another aspect of the invention, said functional unit may be a drug, toxin, radioactive isotope, lymphokine, chemokine, or label molecule. Such an antigen binding molecule delivers a functional unit to a desired site of action. For example, a chemotherapeutic drug attached to an antigen-binding molecule specific for a tumor antigen can be delivered to a tumor cell, and toxins can be delivered to pathogens or tumor cells. An antigen binding molecule attached to a toxin can be used to target NK cells or macrophages; preferably, it is specific for CD16. Examples of toxins include, but are not limited to, ribosyl transferases, serine proteases, guanyl cyclase activator, calmodulin-dependent adenyl cyclase, ribonuclease, DNA alkylating agent or mitosis inhibitor, for example, doxorubicin. The label molecule can be, for example, a fluorescent, luminescent or radioactive molecule, a metal chelate or an enzyme (for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase, malate dehydrogenase, glucose oxidase, urease, catalase, etc.) , when interacting with a substrate, reacts with it to produce a detectable chemical radical and which can be used for in vivo imaging or immunoassay by binding to an antigen-binding molecule in accordance with the invention. When used for immunoassay, a dimeric antigen-binding molecule can also be immobilized on an insoluble carrier, for example glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, natural and modified celluloses, polyacrylamides, agarose and magnetic granules.

Для увеличения времени полужизни антиген-связывающих молекул согласно изобретению в организме, антиген-связывающую молекулу при желании можно объединить с альбумином или пегилировать, сиалировать или гликозилировать (см., например, Stork et al., 2008, J. Biol. Chem., 283:7804-7812). В качестве альтернативы для объединения дополнительной молекулы альбумина с антиген-связывающей молекулой в соответствии с настоящим изобретением, сама указанная антиген-связывающая молекула может быть специфична по отношению к альбумину и другому антигену, как описано выше в настоящем документе.To increase the half-life of the antigen-binding molecules of the invention in the body, the antigen-binding molecule can, if desired, be combined with albumin or pegylated, sialylated or glycosylated (see, e.g., Stork et al., 2008, J. Biol. Chem., 283 : 7804-7812). As an alternative to combining an additional albumin molecule with an antigen binding molecule in accordance with the present invention, said antigen binding molecule itself may be specific for albumin and another antigen, as described above in this document.

Димерную антиген-связывающую молекулу по любому из вариантов реализации, описанных выше в настоящей заявке, можно получить путем экспрессии полинуклеотидов, кодирующих отдельные полипептидные цепи, которые связываются друг с другом с образованием димерной антиген-связывающей молекулы. Таким образом, дополнительным вариантом реализации настоящего изобретения являются полинуклеотиды, например ДНК или РНК, кодирующие полипептидные цепи димерной антиген-связывающей молекулы, как описано выше в настоящей заявке.A dimeric antigen binding molecule according to any of the embodiments described hereinabove can be obtained by expression of polynucleotides encoding individual polypeptide chains that bind to each other to form a dimeric antigen binding molecule. Thus, an additional embodiment of the present invention are polynucleotides, for example DNA or RNA, encoding the polypeptide chains of a dimeric antigen-binding molecule, as described above in this application.

Указанные полинуклеотиды можно сконструировать с применением способов, известных специалистам, например, путем комбинирования генов, кодирующих первый домен VLA, второй домен VHB, третий домен VLB и четвертый домен VHA, разделенные пептидными линкерами или непосредственно связанные между собой пептидными связями, в едином генетическом конструкте, функционально связанном с подходящим промотором и, необязательно, подходящим терминатором транскрипции, и их экспрессии в бактерии или другой соответствующей системе экспрессии. В зависимости от выбранных векторной системы и хозяина, можно использовать любой набор подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы. Промотор выбирают так, чтобы он управлял экспрессией полинуклеотида в соответствующей клетке-хозяине.These polynucleotides can be constructed using methods known to those skilled in the art, for example, by combining genes encoding the first V L A domain, the second V H B domain, the third V L B domain and the fourth V H A domain, separated by peptide linkers or directly linked peptide bonds, in a single genetic construct, operably linked to a suitable promoter and, optionally, a suitable transcriptional terminator, and their expression in bacteria or other appropriate expression system. Depending on the selected vector system and host, any set of suitable transcription and translation elements, including constitutive and inducible promoters, can be used. The promoter is chosen so that it controls the expression of the polynucleotide in the corresponding host cell.

Полинуклеотиды можно подвергать оптимизации кодонов путем изменения смещения использования кодонов в соответствии с экспрессией в выбранном хозяине.Polynucleotides can be subjected to codon optimization by changing the codon usage bias according to expression in a selected host.

Полинуклеотид можно встроить в векторы, предпочтительно экспрессирующие векторы, которые представляют собой дополнительный вариант реализации настоящего изобретения. Указанные рекомбинантные векторы можно сконструировать в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, см., например, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.The polynucleotide can be inserted into vectors, preferably expressing vectors, which are an additional embodiment of the present invention. These recombinant vectors can be constructed in accordance with methods well known to those skilled in the art, see, for example, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.

Для встраивания и экспрессии полинуклеотидов, кодирующих полипептидные цепи по настоящему изобретению, можно использовать множество систем экспрессионных векторов/хозяев. Указанные системы включают, не ограничиваясь ими, микроорганизмы, например бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНК-экспрессирующими векторами, дрожжи, трансформированные дрожжевыми экспрессирующими векторами; клетки насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); системы на основе клеток растений, трансформированных вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты CaMV; вирусом табачной мозаики, TMV) или бактериальными экспрессирующими векторами (например, плазмидами Ti или pBR322); или системы на основе клеток животных, для которых можно использовать экспрессирующие системы на основе вирусов.A variety of expression vector / host systems can be used to insert and express polynucleotides encoding the polypeptide chains of the present invention. These systems include, but are not limited to, microorganisms, for example, bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors; insect cells infected with viral expression vectors (e.g., baculovirus); systems based on plant cells transformed with viral expression vectors (e.g. Cauliflower mosaic virus CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or bacterial expression vectors (e.g. Ti or pBR322 plasmids); or animal cell systems for which virus-based expression systems can be used.

Конкретный предпочтительный экспрессирующий вектор для экспрессии в E. coli представляет собой pSKK (LeGall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27), или pcDNA5 (Invitrogen) для экспрессии в клетках млекопитающих.A particular preferred expression vector for expression in E. coli is pSKK (LeGall et al., J Immunol Methods. (2004) 285 (1): 111-27), or pcDNA5 (Invitrogen) for expression in mammalian cells.

Таким образом, димерную антиген-связывающую молекулу, как описано в настоящей заявке, можно получить путем встраивания полинуклеотида или вектора, кодирующего полипептидную цепь, как описано выше, в клетку-хозяина и культивирования указанной клетки-хозяина в условиях, при которых экспрессируется указанная полипептидная цепь. Димерную антиген-связывающую молекулу, полученную из экспрессированных полипептидных цепей, можно выделить и, при необходимости, дополнительно очистить. Условия для роста и поддержания клеток-хозяев, экспрессии, выделения и очистки димерных антиген-связывающих молекул согласно изобретению из этих клеток-хозяев полностью описаны в литературе.Thus, a dimeric antigen binding molecule, as described herein, can be obtained by embedding a polynucleotide or vector encoding a polypeptide chain, as described above, in a host cell and culturing said host cell under conditions under which said polypeptide chain is expressed . A dimeric antigen-binding molecule derived from expressed polypeptide chains can be isolated and, if necessary, further purified. The conditions for the growth and maintenance of host cells, the expression, isolation and purification of the dimeric antigen-binding molecules of the invention from these host cells are fully described in the literature.

В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения предложены композиции, содержащие димерную антиген-связывающую молекулу или полинуклеотид, как описано выше, и по меньшей мере один дополнительный компонент. Для применения при профилактике или лечении заболевания или расстройства указанную композицию, содержащую димерную антиген-связывающую молекулу или молекулу-полинуклеотид, кодирующую полипептидные цепи, образующие антиген-связывающую молекулу, предпочтительно объединяют с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. Подразумевается, что термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой носитель, не влияющий на биологическую активность ингредиентов и нетоксичный для пациента при введении. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области техники и включают физиологические растворы с фосфатным буфером, воду, эмульсии, например эмульсии масло/вода, различные типы смачивающих агентов, стерильные растворы и т.д. Такие носители можно составить обычными способами и вводить субъекту в подходящей дозе. Предпочтительно указанные композиции являются стерильными. Указанные композиции также могут содержать адъюванты, например консерванты, эмульгаторы и диспергаторы. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечить путем включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов. Введение подходящих композиций можно осуществлять различными способами, например, путем внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, местного или внутрикожного введения. Путь введения, разумеется, зависит от лечения и типа соединения, содержащегося в фармацевтической композиции. Схему приема может определить лечащий врач с учетом других клинических факторов. Как известно в области медицины, дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, пол, конкретное соединение, подлежащее введению, время и путь введения, вид лечения, общее состояние здоровья и другие одновременно вводимые препараты.In a further embodiment of the present invention, there are provided compositions comprising a dimeric antigen-binding molecule or polynucleotide as described above and at least one additional component. For use in the prophylaxis or treatment of a disease or disorder, said composition comprising a dimeric antigen binding molecule or a polynucleotide molecule encoding polypeptide chains forming an antigen binding molecule is preferably combined with a suitable pharmaceutically acceptable carrier. The term “pharmaceutically acceptable carrier” is intended to include any carrier that does not affect the biological activity of the ingredients and is non-toxic to the patient upon administration. Examples of suitable pharmaceutical carriers are well known in the art and include phosphate buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, various types of wetting agents, sterile solutions, etc. Such carriers can be formulated by conventional methods and administered to the subject in a suitable dose. Preferably, said compositions are sterile. These compositions may also contain adjuvants, for example preservatives, emulsifiers and dispersants. Prevention of the action of microorganisms can be achieved by the inclusion of various antibacterial and antifungal agents. The introduction of suitable compositions can be carried out in various ways, for example, by intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, local or intradermal administration. The route of administration, of course, depends on the treatment and the type of compound contained in the pharmaceutical composition. The regimen may be determined by the attending physician taking into account other clinical factors. As is known in the medical field, dosages for any patient depend on many factors, including patient size, body surface area, age, gender, specific compound to be administered, time and route of administration, type of treatment, general health status and other simultaneously administered drugs.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает медицинское применение или способ, в котором димерную антиген-связывающую молекулу, как описано выше, вводят в эффективной дозе субъекту, например пациенту, для иммуносупрессивной терапии, например при трансплантации, лечении аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, инфекционного заболевания, аллергии или рака (например, неходжкинской лимфомы; хронического лимфолейкоза; лимфомы Ходжкина; солидных опухолей, например, при раке молочной железы, раке яичников, раке толстой кишки, раке почки или раке желчного протока; минимальной остаточной болезни; метастатических опухолей, например метастазирующих в легкие, кости, печень или головной мозг). Антиген-связывающую молекулу можно применять в профилактических или терапевтических целях, отдельно или в сочетании с текущей терапией.In addition, the present invention provides medical use or a method in which a dimeric antigen-binding molecule, as described above, is administered in an effective dose to a subject, for example a patient, for immunosuppressive therapy, for example, transplantation, treatment of autoimmune disease, inflammatory disease, infectious disease, allergies or cancer (e.g., non-Hodgkin’s lymphoma; chronic lymphocytic leukemia; Hodgkin’s lymphomas; solid tumors, such as breast cancer, ovarian cancer, colon cancer and cancer of the kidney or bile duct cancer, minimal residual disease, metastatic tumors such as metastasizing to the lungs, bones, liver or brain). The antigen-binding molecule can be used for prophylactic or therapeutic purposes, alone or in combination with current therapy.

Рак, который можно лечить с применением антиген-связывающей молекулы по настоящему изобретению, включает первичный и метастазирующий рак коры надпочечников, рак заднего прохода, апластическую анемию, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак костей, метастазы в кости, опухоли ЦНС, рак периферической ЦНС, рак молочной железы, болезнь Кастлемена, рак шейки матки, неходжкинскую лимфому у детей, рак ободочной и прямой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, семейство опухолей Юинга (например, саркому Юинга), рак глаза, рак желчного пузыря, карциноидные опухоли желудочно-кишечного тракта, опухоли стромы желудочно-кишечного тракта, гестационную трофобластическую болезнь, волосатоклеточный лейкоз, болезнь Ходжкина, саркому Капоши, рак почек, рак гортани и гипофаринкса, острый лимфолейкоз, острый миелолейкоз, лейкоз у детей, хронический лимфолейкоз, хронический миелолейкоз, рак печени, рак легких, карциноидные опухоли легких, неходжкинскую лимфому, рак молочной железы у мужчин, злокачественную мезотелиому, множественную миелому, миелодиспластический синдром, миелопролиферативные заболевания, рак носовой полости и придаточных пазух, рак носоглотки, нейробластому, рак ротовой полости и ротоглотки, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак полового члена, рак гипофиза, рак предстательной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнных желез, саркому (рак мягких тканей у взрослых), меланому, немеланомный рак кожи, рак желудка, рак яичек, рак тимуса, рак щитовидной железы, рак матки (например, саркому матки), рак влагалища, рак вульвы и макроглобулинемию Вальденстрема, но не ограничивается ими.Cancer that can be treated using the antigen-binding molecule of the present invention includes primary and metastatic cancer of the adrenal cortex, cancer of the anus, aplastic anemia, cancer of the bile duct, cancer of the bladder, bone cancer, bone metastases, CNS tumors, peripheral cancer CNS, breast cancer, Castleman’s disease, cervical cancer, non-Hodgkin’s lymphoma in children, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, Ewing's family of tumors (e.g. Ewing's sarcoma), eye cancer, gall bladder cancer, Karts foreign tumors of the gastrointestinal tract, tumors of the stroma of the gastrointestinal tract, gestational trophoblastic disease, hairy cell leukemia, Hodgkin's disease, Kaposi’s sarcoma, kidney cancer, larynx and hypopharynx cancer, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, leukemia in children, chronic lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia , liver cancer, lung cancer, carcinoid tumors of the lung, non-Hodgkin’s lymphoma, breast cancer in men, malignant mesothelioma, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, myeloproliferative diseases, nasal cavity and sinus cancer, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, oral and oropharyngeal cancer, osteosarcoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, penile cancer, pituitary cancer, prostate cancer, retinoblastoma, rhabdomyosarcoma, salivary gland cancer, sarcoma (adult soft tissue cancer), melanoma, non-melanoma skin cancer, stomach cancer, testicular cancer, thymus cancer, thyroid cancer, uterine cancer (e.g., uterine sarcoma), vaginal cancer, vulvar cancer, and Waldenstrom macroglobulinemia.

"Эффективная доза" относится к количеству активного ингредиента, достаточному для влияния на ход и тяжесть заболевания, что приводит к ослаблению или ремиссии патологии. "Эффективную дозу" для лечения и/или профилактики указанных заболеваний или расстройств можно определить с помощью способов, известных специалисту (см., например, Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goddman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46 (1975)).An “effective dose” refers to an amount of an active ingredient sufficient to influence the course and severity of a disease, resulting in a weakening or remission of the pathology. An “effective dose” for treating and / or preventing said diseases or disorders can be determined using methods known to one skilled in the art (see, for example, Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goddman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46 (1975)).

В еще одном аспекте настоящего изобретения димерную антиген-связывающую молекулу, как описано выше, применяют при производстве иммунодепрессанта или медикамента для лечения аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, инфекционного заболевания, аллергии или рака (например, неходжкинской лимфомы; хронического лимфолейкоза; лимфомы Ходжкина; солидных опухолей, например, при раке молочной железы, раке яичников, раке толстой кишки, раке почки или раке желчного протока; минимальной остаточной болезни; метастатических опухолей, например, метастазирующих в легкие, кости, печень или головной мозг). Если указано, что полиспецифические связывающие молекулы описаны выше как имеющие особую ценность при лечении указанного заболевания, указанные связывающие молекулы также можно применять при производстве лекарственного средства для указанного заболевания.In yet another aspect of the present invention, a dimeric antigen binding molecule as described above is used in the manufacture of an immunosuppressant or medicament for the treatment of an autoimmune disease, inflammatory disease, infectious disease, allergy or cancer (e.g., non-Hodgkin lymphoma; chronic lymphocytic leukemia; Hodgkin lymphoma; solid tumors e.g. breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, kidney cancer, or bile duct cancer; minimal residual disease; metastatic tumors, for example, metastatic to the lungs, bones, liver or brain). If it is indicated that the multispecific binding molecules are described above as being of particular value in the treatment of said disease, said binding molecules can also be used in the manufacture of a medicament for said disease.

Способы изготовления фармацевтических композиций, т.е. лекарственных средств, и клинического применения антиген-связывающих молекул при профилактике и/или лечении таких заболеваний, как, например, рак, известны специалистам.Methods for the manufacture of pharmaceutical compositions, i.e. drugs, and the clinical use of antigen-binding molecules in the prevention and / or treatment of diseases such as, for example, cancer, are known in the art.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения димерная антиген-связывающая молекула является биспецифической и применяется для лечения рака, поскольку такие антитела можно применять для перенацеливания цитотоксических эффекторных клеток против опухолевых клеток. Указанная терапевтическая концепция широко известна в данной области техники. Например, клинические исследования продемонстрировали регрессию опухоли у пациентов, получавших биспецифическое антитело против CD3 и опухолей (например, Canevari, S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 87:1463-1469,1996) или у пациентов, получавших биспецифическое антитело против CD16 и опухолей (например, Hartmann et al.; Clin Cancer Res. 2001; 7(7):1873-81). Кроме того, продемонстрировано доказательство правильности концепции для различных молекул рекомбинантных биспецифических антител, включающих только вариабельные домены (Fv), например, димерных и четырехвалентных антиген-связывающих молекул CD3×CD19, характеризующихся порядком доменов VHA-VLB-VHB-VLA (Cochlovius et al.; Cancer Research, 2000, 60:4336-4341) или в недавних клинических исследованиях с применением молекул мономерных одноцепочечных Fv-антител формата BiTE® (два одноцепочечных антитела различной специфичности, присоединенные друг к другу; Micromet AG, Germany; Bargou R. et al., Science, 2008, 321(5891):974-977; Baeuerle PA and Reinhardt C, Cancer Res. 2009, 69(12):4941-4944). Димерные антиген-связывающие молекулы, описанные в настоящем документе, можно применять в качестве лекарственных средств и в способах лечения аналогично биспецифическим антителам, известным в данной области техники, поскольку они способны перенаправлять терапевтические, например, цитотоксические механизмы с использованием аналогичных комбинированных специфичностей антител. Кроме того, известно применение иммуносупрессивных антител, моноспецифических по отношению к CD3, например муромонаб-CD3, для лечения отторжения трансплантата, острого отторжения трансплантатов почек (аллотрансплантатов), трансплантатов печени и сердца. Таким образом, антиген-связывающие молекулы, биспецифические по отношению к альбумину и CD3, можно применять в тех же способах лечения, как и известные моноспецифические антитела против CD3. Кроме того, антиген-связывающие молекулы, специфичные по отношению к альбумину и другому антигену, т.е. мишени терапии или диагностики, как описано в настоящем документе, можно использовать для соответствующего клинического применения антигенной специфичности, отличающейся от альбумина.In a preferred aspect of the present invention, the dimeric antigen-binding molecule is bispecific and is used to treat cancer, since such antibodies can be used to redirect cytotoxic effector cells against tumor cells. Said therapeutic concept is well known in the art. For example, clinical studies have shown tumor regression in patients receiving a bispecific anti-CD3 antibody and tumors (e.g., Canevari, S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 87: 1463-1469.1996) or in patients receiving a bispecific an antibody against CD16 and tumors (e.g., Hartmann et al .; Clin Cancer Res. 2001; 7 (7): 1873-81). In addition, evidence of the correctness of the concept has been demonstrated for various molecules of recombinant bispecific antibodies that include only variable domains (Fv), for example, dimeric and tetravalent antigen-binding molecules CD3 × CD19, characterized by the order of the domains V H AV L BV H BV L A (Cochlovius et al .; Cancer Research, 2000, 60: 4336-4341) or in recent clinical studies using BiTE® format monomeric single chain Fv antibody molecules (two single chain antibodies of different specificity attached to each other; Micromet AG, Germany; Bargou R. et al., Science, 2008, 321 (5891): 974-977; Baeuerle PA and Reinhardt C, Cancer Res. 2009, 69 (12): 4941-4944). The dimeric antigen-binding molecules described herein can be used as drugs and in methods of treatment similar to bispecific antibodies known in the art, as they can redirect therapeutic, for example, cytotoxic mechanisms using similar combined antibody specificities. In addition, it is known to use immunosuppressive antibodies monospecific for CD3, for example muromonab-CD3, for the treatment of transplant rejection, acute rejection of kidney transplants (allografts), liver and heart transplants. Thus, antigen-binding molecules that are bispecific with respect to albumin and CD3 can be used in the same treatment methods as the well-known monospecific antibodies against CD3. In addition, antigen-binding molecules specific for albumin and another antigen, i.e. targets for therapy or diagnosis, as described herein, can be used for appropriate clinical use of antigenic specificity other than albumin.

Антиген-связывающие молекулы и их композиции могут быть представлены в форме для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного введения, или другой фармацевтически приемлемой лекарственной форме. В некоторых вариантах реализации указанную композицию вводят перорально, и лекарственная форма представляет собой таблетку, капсулу, каплет или другую перорально доступную форму. В некоторых вариантах реализации композиция предназначена для парентерального введения, например внутривенного, внутрибрюшинного, внутримышечного, подкожного введения; ее вводят с помощью раствора, содержащего антиген-связывающую молекулу.Antigen-binding molecules and their compositions can be presented in the form for oral, intravenous, intraperitoneal administration, or other pharmaceutically acceptable dosage form. In some embodiments, the composition is orally administered and the dosage form is a tablet, capsule, caplet, or other orally available form. In some embodiments, the composition is for parenteral administration, for example, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous administration; it is administered using a solution containing an antigen-binding molecule.

Специалист легко может сконструировать и получить антиген-связывающие молекулы, описанные в настоящем документе, используя установленные методики и стандартные способы, известные в данной области техники, см., например, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.; The Protein Protocols Handbook, edited by John M. Walker, Humana Press Inc. (2002); или Antibody engineering: methods and protocols/edited by Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.)). Кроме того, специалист может изготовить антиген-связывающие молекулы, описанные в настоящем документе, с использованием стандартных методов, известных в данной области техники, и модифицируя способы, описанные в патенте США 7129330, Kipriyanov et al. J. Mol. Biol. (1999) 293, 41-56 or Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17:357-366, таким образом, что образуются димерные антиген-связывающие молекулы, как описано выше, включающие две полипептидные цепи, характеризующиеся порядком доменов VLA-VHB-VLB-VHA от N-конца к С-концу каждой полипептидной цепи.One skilled in the art can easily construct and prepare the antigen binding molecules described herein using established techniques and standard methods known in the art, see, for example, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY ; The Protein Protocols Handbook, edited by John M. Walker, Humana Press Inc. (2002); or Antibody engineering: methods and protocols / edited by Benny KC Lo; Benny KC II Series: Methods in molecular biology (Totowa, NJ)). In addition, one skilled in the art can make the antigen binding molecules described herein using standard methods known in the art and by modifying the methods described in US Pat. No. 7,129,330 by Kipriyanov et al. J. Mol. Biol. (1999) 293, 41-56 or Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17: 357-366, so that dimeric antigen-binding molecules are formed, as described above, including two polypeptide chains characterized by the order of V L domains AV H BV L BV H A from the N-terminus to the C-terminus of each polypeptide chain.

Примеры, приведенные ниже, дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, не ограничивая его.The examples below further illustrate the present invention without limiting it.

Пример 1Example 1

Для конструирования функциональных димерных тандемных диател (TandAb®) при использовании порядка доменов, отличающегося от VHA-VLB-VHB-VLA, несколько таких димерных тандемных диател сконструировали с использованием порядка доменов VLA-VHB-VLB-VHA в соответствии с настоящим изобретением, используя два домена гуманизированного одноцепочечного антитела против CD19 и гуманизированного одноцепочечного антитела против CD3, соответственно. Полученные результаты подтвердили с использованием двух вариантов каждой антиген-связывающей молекулы, представляющих собой продукты различных стадий процедуры созревания аффинности, выполненной как для гуманизированного антитела против CD19, так и гуманизированного антитела против CD3.To construct functional dimer tandem diabody (TandAb ®) using the domain order, different from the V H AV L BV H BV L A, some such dimeric tandem diabody constructed using the domains of the order V L AV H BV L BV H A according to the present the invention using two domains of a humanized single chain anti-CD19 antibody and a humanized single chain anti-CD3 antibody, respectively. The results were confirmed using two variants of each antigen-binding molecule, which are products of different stages of the affinity maturation procedure, performed both for a humanized anti-CD19 antibody and a humanized anti-CD3 antibody.

Моноклональные антитела мыши HD37 и UCHT против CD19 и CD3, соответственно, являлись исходным материалом для получения гуманизированных антител с относительно высоким сродством. В каждом случае VH-домен вначале объединяли с библиотекой VL человека в фагмидном scFv-векторе с целью выбора подходящей VL-цепи человека с помощью фагового дисплея. На втором этапе выбранную VL-цепь человека объединяли с библиотекой VH-доменов, в которых область CDR3 оставалась постоянной. Эта процедура привела к получению гуманизированных антител против CD19 и против CD3, соответственно, которые содержали короткую последовательность мыши лишь в области VHCDR3. Затем эти клоны подвергали созреванию аффинности путем введения точечных мутаций в остатки, предположительно вовлеченные в связывание антигена. Затем осуществляли отбор мутантов, характеризовавшихся лучшим связыванием, с помощью фагового дисплея. Клоны, выбранные для построения TandAb, являлись M13 и M39, связывавшимися с CD19 и C4, и LcHC21, связывавшимся с CD3.Mouse monoclonal antibodies HD37 and UCHT against CD19 and CD3, respectively, were the starting material for the production of humanized antibodies with relatively high affinity. In each case, the V H domain was initially combined with a human V L library in a phagemid scFv vector to select a suitable human V L chain using a phage display. At the second stage, the selected human V L chain was combined with a library of VH domains in which the CDR3 region remained constant. This procedure resulted in humanized anti-CD19 and anti-CD3 antibodies, respectively, which contained a short mouse sequence only in the VHCDR3 region. These clones were then subjected to affinity maturation by introducing point mutations into residues presumably involved in antigen binding. Then the selection of mutants, characterized by better binding, using phage display. The clones selected for the construction of TandAb were M13 and M39, binding to CD19 and C4, and LcHC21, binding to CD3.

Были получены следующие антитела:The following antibodies were obtained:

Антитело A1:

Figure 00000004
Antibody A1:
Figure 00000004

Антитело В:

Figure 00000005
Antibody B:
Figure 00000005

Антитело A2:

Figure 00000006
Antibody A2:
Figure 00000006

Антитело C:

Figure 00000007
Antibody C:
Figure 00000007

Плазмиды, кодирующие гибридные мономеры

Figure 00000008
антитела В и
Figure 00000009
антитела С, были получены поставщиком услуг по инженерии и обработке ДНК. Последовательность каркаса мономера
Figure 00000010
содержала последовательности ДНК двух scFv-антител, а именно scFvCD19M39 и scFvCD3C4, соответственно. Последовательность мономера
Figure 00000011
объединяла вариабельные домены одноцепочечного Fv CD19M13 и одноцепочечного Fv CD3LCHC21. Все четыре scFv были получены путем отбора одноцепочечных антител против антигенов CD19 и CD3 с использованием фагового дисплея. В обоих случаях информацию о последовательности использовали для конструирования вышеуказанных гибридных мономеров. 9-аминокислотный (G2S)3 линкер использовали для присоединения доменов друг к другу. Синтезированный ген, кодировавший
Figure 00000012
, клонировали в экспрессирующем векторе млекопитающих pCDNA5FRT (Invitrogen). Ген
Figure 00000013
также клонировали в экспрессирующем векторе и амплифицировали с помощью ПЦР с использованием прямого праймера, внедряющего сайт расщепления Ncol, и обратного праймера, внедряющего сайт расщепления Notl. После анализа и выделения в агарозном геле продукт ПЦР дважды расщепляли с помощью Ncol и Notl и клонировали в Ncol и Notl-линеаризованном векторе pSKK3. Правильность клонирования подтверждали с помощью секвенирования ДНК.Plasmids Encoding Hybrid Monomers
Figure 00000008
antibodies B and
Figure 00000009
antibodies C were obtained by a DNA engineering and processing service provider. Monomer Frame Sequence
Figure 00000010
contained the DNA sequences of two scFv antibodies, namely scFvCD19 M39 and scFvCD3 C4 , respectively. Monomer sequence
Figure 00000011
combined the variable domains of single-chain Fv CD19 M13 and single-chain Fv CD3 LCHC21 . All four scFvs were obtained by selecting single chain antibodies against CD19 and CD3 antigens using phage display. In both cases, sequence information was used to construct the above hybrid monomers. A 9-amino acid (G 2 S) 3 linker was used to join the domains to each other. Synthesized Gene Encoding
Figure 00000012
, cloned in a mammalian expression vector pCDNA5FRT (Invitrogen). Gene
Figure 00000013
also cloned in an expression vector and amplified by PCR using a forward primer introducing the Ncol cleavage site and a reverse primer introducing the Notl cleavage site. After analysis and isolation on an agarose gel, the PCR product was digested twice with Ncol and Notl and cloned into the Ncol and Notl-linearized pSKK3 vector. The correctness of cloning was confirmed by DNA sequencing.

Карта вектора pCDNA5FRT, кодирующего антитело В, показана на Фиг. 6. Карта вектора pSKK3, кодирующего антитело С, показана на Фиг. 7.A map of the pCDNA5FRT vector encoding antibody B is shown in FIG. 6. A map of the pSKK3 vector encoding antibody C is shown in FIG. 7.

Для интенсивного производства вектор, содержащий ген

Figure 00000014
, временно трансфицировали (с помощью CaPO4) в адгезивные клетки HEK293. Ферментацию белка осуществляли в ростовых условиях, широко известных в данной области техники.For intensive production, a vector containing a gene
Figure 00000014
were temporarily transfected (using CaPO 4 ) into HEK293 adhesive cells. Protein fermentation was carried out under growth conditions widely known in the art.

Рекомбинантный белок экспрессировали в виде His-Tag-гибридного белка с сигнальным пептидом. Белок выделяли из супернатанта клеточной культуры с помощью аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (IMAC), как описано (Kipriyanov et al., 1999, J. Mol. Biol., 293, 41-56). Очищенный материал затем анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Окрашивание ДСН-ПААГ Кумасси и эксклюзионной хроматографии на калиброванной колонке Superdex 200 HR10/30 (Amersham Pharmacia, Фрайбург, Германия) в натрий-фосфатном буфере (30 мМ NaPO4, 0,75 М аргинин/HCl, pH 6,0) выявило чистый и правильно собранный рекомбинантный белок (антитело В).The recombinant protein was expressed as a His-Tag fusion protein with a signal peptide. Protein was isolated from cell culture supernatant by affinity chromatography using immobilized metals (IMAC) as described (Kipriyanov et al., 1999, J. Mol. Biol., 293, 41-56). The purified material was then analyzed by SDS-PAGE electrophoresis. Coomassie SDS-PAGE staining and size exclusion chromatography on a calibrated Superdex 200 HR10 / 30 column (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) in sodium phosphate buffer (30 mM NaPO 4 , 0.75 M arginine / HCl, pH 6.0) revealed pure and correctly assembled recombinant protein (antibody B).

Для интенсивной экспрессии ген, кодирующий гуманизированный мономер

Figure 00000015
с последующим 6×His-маркером, клонировали в плазмиде pSKK3, содержавшей систему генов клеточного суицида hok/sok и ген skp, кодирующий периплазматический фактор Skp/OmpH (LeGall et al., 2004, J. Immunol. Methods, 285, 111-127). Указанную плазмиду трансфицировали в штамм E. coli K12 (АТСС 31608™).For intense expression, a gene encoding a humanized monomer
Figure 00000015
followed by a 6 × His marker, was cloned into pSKK3 plasmid containing the hok / sok cell suicide gene system and the skp gene encoding the periplasmic factor Skp / OmpH (LeGall et al., 2004, J. Immunol. Methods, 285, 111-127 ) The indicated plasmid was transfected into E. coli K12 strain (ATCC 31608 ™).

Трансформированные бактерии выращивали во встряхиваемых колбах и индуцировали практически в соответствии с предшествующим описанием (Cochlovius et al., 2000, J. Immunol., 165, 888-895). Рекомбинантные белки выделяли как из растворимой периплазматической фракции, так и из супернатанта бактериальной культуры с помощью аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (IMAC), как описано (Kipriyanov et al., 1999, J. Mol. Biol., 293, 41-56).Transformed bacteria were grown in shake flasks and induced almost as previously described (Cochlovius et al., 2000, J. Immunol. 165, 888-895). Recombinant proteins were isolated from both the soluble periplasmic fraction and the supernatant of the bacterial culture using affinity chromatography using immobilized metals (IMAC) as described (Kipriyanov et al., 1999, J. Mol. Biol., 293, 41-56) .

Затем очищенный материал анализировали с помощью окрашивания ДСН-ПААГ Кумасси голубым и эксклюзионной хроматографии на калиброванной колонке Superdex 200 HR10/30 (Amersham Pharmacia, Фрайбург, Германия) в натрий-фосфатном буфере (30 мМ NaPO4, 0,75 М аргинин/HCl, pH 6,0). Полученный продукт был чистым и правильно собранным.The purified material was then analyzed by Coomassie Blue SDS-PAGE staining and size exclusion chromatography on a calibrated Superdex 200 HR10 / 30 column (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) in sodium phosphate buffer (30 mM NaPO 4 , 0.75 M arginine / HCl, pH 6.0). The resulting product was clean and correctly assembled.

Антитела для сравнения А1 и А2 получили аналогично антителам В и С соответственно, причем порядок доменов в антителах А1 и А2 соответственно был обратным по сравнению с антителами В и С соответственно.Antibodies for comparison A1 and A2 were obtained analogously to antibodies B and C, respectively, and the order of the domains in antibodies A1 and A2, respectively, was reversed compared to antibodies B and C, respectively.

Анализ цитотоксичности проводили, как описано в Т. Dreier et al. (2002, Int J Cancer 100, 690-697). МПК, использованные в качестве эффекторных клеток, выделили из периферической крови здоровых добровольцев путем центрифугирования в градиенте плотности. В некоторых случаях МПК культивировали в течение ночи в присутствии 25 ед/мл IL-2 человека до использования в качестве эффекторных клеток в анализе цитотоксичности. Чистоту и экспрессию антигена выделенными МПК в каждом случае проверяли с помощью проточной цитометрии (данные не показаны).A cytotoxicity assay was performed as described in T. Dreier et al. (2002, Int J Cancer 100, 690-697). MICs used as effector cells were isolated from the peripheral blood of healthy volunteers by density gradient centrifugation. In some cases, MICs were cultured overnight in the presence of 25 u / ml human IL-2 before being used as effector cells in a cytotoxicity assay. The purity and expression of antigen by isolated MPC in each case was checked using flow cytometry (data not shown).

Клетки-мишени CD19+ JOK-1 или Raji культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, 2 mM L-глутамина и 100МЕ/мл натрий-пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата (называемой в настоящем документе средой RPMI; все компоненты приобрели в Invitrogen). Для анализа цитотоксичности клетки метили 10 мкМ кальцеина AM (Molecular Probes/Invitrogen) в течение 30 мин в среде RPMI без FCS при 37°C. После осторожного промывания меченые клетки ресуспендировали в среде RPMI до плотности 1×105/мл. Затем 1×104 клеток-мишеней высевали вместе с 5×105 МПК с указанными антителами в отдельных лунках круглодонного 96-луночного микропланшета в общем объеме 200 мкл/лунку. После центрифугирования в течение 2 мин при 200 g анализируемые клетки инкубировали в течение 4 часов при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. За 15 мин до конца инкубирования в лунки, содержавшие только клетки-мишени, добавляли 20 мкл 10% Тритона Х-100 в среде RPMI. Во все остальные лунки добавляли 20 мкл среды RPMI. Из каждой лунки собирали 100 мкл супернатанта клеточной культуры после дополнительного центрифугирования в течение 5 мин при 500 g и измеряли флуоресценцию высвобожденного кальцеина при 520 нм с использованием флуоресцентного планшет-ридера (Victor 3, Perkin Elmer). На основании измеренного количества импульсов рассчитывали специфический лизис клеток по следующей формуле: [флуоресценция (образец) - флуоресценция (спонтанная)] / [флуоресценция (максимальная) - флуоресценция (спонтанная)] × 100%. Флуоресценция (спонтанная) представляет собой количество флуоресцентных импульсов клеток-мишеней в отсутствие эффекторных клеток и антител, а флуоресценция (максимальная) представляет собой полный лизис клеток, вызванный добавлением тритона X100. Сигмоидные кривые зависимости "доза-ответ" и значения ЕС50 рассчитывали с помощью программного обеспечения Prism (GraphPad Software).CD19 + JOK-1 or Raji target cells were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine and 100 IU / ml sodium penicillin G and 100 μg / ml streptomycin sulfate (referred to herein as RPMI; all components purchased from Invitrogen). For cytotoxicity analysis, cells were labeled with 10 μM calcein AM (Molecular Probes / Invitrogen) for 30 min in RPMI medium without FCS at 37 ° C. After careful washing, labeled cells were resuspended in RPMI medium to a density of 1 × 10 5 / ml. Then 1 × 10 4 target cells were seeded with 5 × 10 5 MICs with the indicated antibodies in individual wells of a round-bottom 96-well microplate in a total volume of 200 μl / well. After centrifugation for 2 min at 200 g, the analyzed cells were incubated for 4 hours at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 . 15 minutes prior to the end of incubation, 20 μl of 10% Triton X-100 in RPMI medium was added to wells containing only target cells. All other wells were added 20 μl of RPMI medium. 100 μl of cell culture supernatant was collected from each well after further centrifugation for 5 min at 500 g, and the fluorescence of released calcein at 520 nm was measured using a fluorescent plate reader (Victor 3, Perkin Elmer). Based on the measured number of pulses, specific cell lysis was calculated using the following formula: [fluorescence (sample) —fluorescence (spontaneous)] / [fluorescence (maximum) —fluorescence (spontaneous)] × 100%. Fluorescence (spontaneous) is the number of fluorescent impulses of the target cells in the absence of effector cells and antibodies, and fluorescence (maximum) is the complete lysis of cells caused by the addition of Triton X100. Sigmoid dose-response curves and EC 50 values were calculated using Prism software (GraphPad Software).

Результатыresults

Результаты анализа цитотоксичности тандемных диател, характеризующихся порядком доменов, начиная с N-конца VHA-VLB-VHB-VLA (антитело А) и VLA-VHB-VLB-VHA (антитело В) соответственно, с использованием варианта M39 антитела против CD19 и варианта C4 антитела против CD3, показаны на Фигуре 3.The results of the analysis of cytotoxicity of tandem diabodies characterized by the order of domains, starting from the N-terminus of V H AV L BV H BV L A (antibody A) and V L AV H BV L BV H A (antibody B), respectively, using variant M39 of anti CD19 and variant C4 antibodies against CD3 are shown in Figure 3.

Неожиданным образом цитотоксическая активность указанных двух тандемных диател значительно различалась. Тандемное диатело, характеризующееся порядком доменов согласно изобретению, обозначенное как "антитело В", обладало более чем в 60 раз повышенной активностью по сравнению с тандемным диателом, обозначенным как "антитело В", согласно определению путем сравнения значений их EC50 при данных условиях.Unexpectedly, the cytotoxic activity of these two tandem diabodies significantly varied. The tandem diabody characterized by the order of the domains according to the invention, designated as “antibody B”, was more than 60 times more active than the tandem diabody designated as “antibody B", as determined by comparing their EC 50 values under these conditions.

Превосходство расположения доменов, представленного в настоящем изобретении (антитело С) с точки зрения цитотоксичности подтвердили с помощью двух дополнительных вариантов антител против CD19 и против CD3 (см. Фигуру 4).The superiority of the arrangement of the domains of the present invention (antibody C) in terms of cytotoxicity was confirmed using two additional antibody variants against CD19 and against CD3 (see Figure 4).

Значение EC50 тандемного диатела с порядком доменов в соответствии с изобретением, представленного в варианте 2, являлось крайне низким (0,1 пМ). Оно было в 27 раз более активным, чем TandAb, представленное в варианте 0, согласно сравнению значений EC50 в данных условиях.The EC 50 value of the tandem domain-order dyatel in accordance with the invention of embodiment 2 was extremely low (0.1 pM). It was 27 times more active than TandAb, presented in option 0, according to a comparison of EC 50 values under these conditions.

Пример 2Example 2

Модуляция T-клеточного рецептора антителами TandAb против сывороточного альбумина человека (HSA)×CD3 in vitroModulation of the T-cell receptor with TandAb antibodies against human serum albumin (HSA) × CD3 in vitro

Для определения различий в эффективности антител TandAb HSA×CD3 с разным порядком доменов при индукции модулирования T-клеточного рецептора (TCR)/CD3 на T-клетках in vitro клетки CD3+ Jurkat культивировали в присутствии возрастающих концентраций биспецифических антител TandAb HSA×CD3, а затем анализировали оставшиеся TCR. Анализ модулирования проводили в присутствии или в отсутствие HSA для измерения влияния HSA на активность TandAb.To determine differences in the efficacy of TandAb HSA × CD3 antibodies with different domain orders in inducing T-cell receptor (TCR) / CD3 modulation on T cells in vitro, CD3 + Jurkat cells were cultured in the presence of increasing concentrations of bispecific TandAb HSA × CD3 antibodies, and then analyzed the remaining TCR. A modulation assay was performed in the presence or absence of HSA to measure the effect of HSA on TandAb activity.

Вкратце, 1×106 клеток Jurkat высевали в отдельные лунки круглодонного 96-луночного микропланшета в среде RPMI 1640 с добавлением 2 тМ L-глутамина и 100 МЕ/мл натрий-пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата (все компоненты приобрели в Invitrogen). В отдельный микропланшет высевали клетки Jurkat в среде RPMI, как описано выше, но с добавлением 50 мг/мл HSA (Sigma). После добавления указанных антител клетки инкубировали в общем объеме 200 мкл/лунку при 37°C в увлажненном инкубаторе в присутствии 5% CO2. В качестве контроля клетки культивировали в отсутствие антител. После промывки ледяным физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS, Invitrogen, Карлсруэ, Германия) с добавлением 2% FCS, инактивированной нагреванием (Invitrogen, Карлсруэ, Германия) и 0,1% азида натрия (Roth, Карлсруэ, Германия) (называемого FACS-буфером) клетки окрашивали 10 мкл PC5-конъюгированного антитела против TCR α/β (Beckman-Coulter) в общем объеме 100 мкл FACS-буфера в течение 45 на льду в темноте. После двукратной промывки FACS-буфером измеряли флуоресценцию 104 клеток при 675 нм на проточном цитометре FC500 MPL (Beckman-Coulter). Средние значения флуоресценции определяли с помощью программного обеспечения СХР (Beckman-Coulter) и использовали для анализа путем нелинейной регрессии/4-параметрической логистической аппроксимации с использованием GraphPad Prism версии 3.03 для Windows, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США.Briefly, 1 × 10 6 Jurkat cells were plated in separate wells of a round-bottom 96-well microplate in RPMI 1640 medium supplemented with 2 tM L-glutamine and 100 IU / ml sodium penicillin G and 100 μg / ml streptomycin sulfate (all components purchased from Invitrogen ) Jurkat cells were plated on a separate microplate in RPMI medium as described above, but with the addition of 50 mg / ml HSA (Sigma). After the addition of these antibodies, the cells were incubated in a total volume of 200 μl / well at 37 ° C in a humidified incubator in the presence of 5% CO 2 . As a control, cells were cultured in the absence of antibodies. After washing with ice-cold saline with phosphate buffer (PBS, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) with the addition of 2% FCS, heat inactivated (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) and 0.1% sodium azide (Roth, Karlsruhe, Germany) (called FACS- buffer) cells stained 10 μl of PC5-conjugated anti-TCR α / β antibody (Beckman-Coulter) in a total volume of 100 μl of FACS buffer for 45 on ice in the dark. After washing twice with FACS buffer, the fluorescence of 10 4 cells was measured at 675 nm using a FC500 MPL flow cytometer (Beckman-Coulter). Average fluorescence values were determined using Beckman-Coulter software and used for nonlinear regression / 4-parameter logistic approximation analysis using GraphPad Prism version 3.03 for Windows, GraphPad Software, San Diego, California, USA.

Результаты, полученные в ходе эксперимента по модулированию TCR САВ-306, отображенные на Фиг. 5 и сведенные в Таблице 1, демонстрировали сопоставимую эффективность модулирования TCR с помощью TandAb HSA×CD3 с порядком доменов VHA-VLB-VHB-VLA (= вариант 0) и VLA-VHB-VLB-VHA (= вариант 2), которые демонстрировали эффективность модулирования, если HSA являлся антигеном В. В то же время, в присутствии физиологических концентраций HSA эффективность модулирования в случае TandAb варианта 0 (VHA-VLB-VHB-VLA) значительно снижалась, в то время как значение EC50 TandAb с вариантом ориентации 2 (VLA-VHB-VLB-VHA) повышалось лишь в 2,6 раза.The results obtained from the TCR CAB-306 TCR modulation experiment shown in FIG. 5 and summarized in Table 1, showed a comparable TCR modulation efficiency using TandAb HSA × CD3 with the order of domains V H AV L BV H BV L A (= option 0) and V L AV H BV L BV H A (= option 2) that demonstrated modulation efficiency if HSA was antigen B. At the same time, in the presence of physiological concentrations of HSA, the modulation efficiency in the case of TandAb variant 0 (V H AV L BV H BV L A) was significantly reduced, while the EC 50 value TandAb with orientation option 2 (V L AV H BV L BV H A) increased only 2.6 times.

Указанные данные ясно показывают превосходство TandAb HSA×CD3 с вариантом ориентации доменов 2 (VLA-VHB-VLB-VHA) по сравнению с TandAb HSA×CD3 варианта 0 (VHA-VLB-VHB-VLA).These data clearly show the superiority of TandAb HSA × CD3 with option domain orientation 2 (V L AV H BV L BV H A) compared to TandAb HSA × CD3 with option 0 (V H AV L BV H BV L A).

Figure 00000016
Figure 00000016

Значения EC50, полученные в эксперименте по модулированию TCR двумя антителами TandAb HSA×CD3 в присутствии или в отсутствие HSA (Фиг. 5; эксперимент САВ-306), определяли с помощью нелинейной регрессии/4-параметрической логистической аппроксимации.EC 50 values obtained in the TCR modulation experiment with two TandAb HSA × CD3 antibodies in the presence or absence of HSA (Fig. 5; experiment CAB-306) were determined using non-linear regression / 4-parameter logistic approximation.

Хотя в настоящем документе показаны и описаны предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, для специалистов в данной области техники очевидно, что такие варианты реализации приведены лишь в качестве примера. Специалисты могут осуществить различные модификации, изменения и замены без выхода за рамки настоящего изобретения. Следует понимать, что при осуществлении настоящего изобретения возможно использование различных альтернативных вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Предполагается, что следующая формула изобретения определяет рамки настоящего изобретения и что она охватывает способы и структуры в рамках указанных пунктов формулы изобретения и их эквиваленты.Although preferred embodiments of the present invention are shown and described herein, it will be apparent to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Specialists can make various modifications, changes and replacements without going beyond the scope of the present invention. It should be understood that in the implementation of the present invention it is possible to use various alternative embodiments of the present invention described herein. It is intended that the following claims define the scope of the present invention and that it encompasses methods and structures within the scope of these claims and their equivalents.

Claims (27)

1. Димерная антиген-связывающая молекула тандемного диатела для перекрестного связывания с антигеном А и антигеном В, состоящая из первой и второй полипептидной цепи, причем каждая из указанных первой и второй полипептидных цепей содержит1. Dimeric antigen-binding molecule of the tandem diabody for cross-linking with antigen A and antigen B, consisting of the first and second polypeptide chains, each of these first and second polypeptide chains contains - первый домен VLA, являющийся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным по отношению к первому антигену А;- the first domain V L A, which is the variable domain of the light chain specific for the first antigen A; - второй домен VHB, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным по отношению ко второму антигену В;- the second domain V H B, which is the variable domain of the heavy chain specific for the second antigen B; - третий домен VLB, являющийся вариабельным доменом легкой цепи, специфичным по отношению ко второму антигену В; и- third domain V L B, which is the variable domain of a light chain specific for a second antigen B; and - четвертый домен VHA, являющийся вариабельным доменом тяжелой цепи, специфичным по отношению к первому антигену А, причем- the fourth domain V H A, which is the variable domain of the heavy chain specific to the first antigen A, and - указанные домены расположены в каждой из указанных первой и второй полипептидных цепей в порядке VLA-VHB-VLB-VHA от N-конца к С-концу указанных полипептидных цепей,- these domains are located in each of the specified first and second polypeptide chains in the order of V L AV H BV L BV H A from the N-end to the C-end of these polypeptide chains, - первый домен VLA связан со вторым доменом VHB посредством первого линкера L1, второй домен VHB связан с третьим доменом VLB посредством второго линкера L2, и третий домен VLB связан с четвертым доменом VHA посредством третьего линкера L3;- the first domain V L A is connected to the second domain V H B through the first linker L1, the second domain V H B is connected to the third domain V L B through the second linker L2, and the third domain V L B is connected to the fourth domain V H A through the third linker L3; - линкер L2 состоит из 12 или менее аминокислотных остатков;- L2 linker consists of 12 or less amino acid residues; иand - первый домен VLA первой полипептидной цепи связан с четвертым доменом VHA второй полипептидной цепи с образованием антиген-связывающего сайта для первого антигена А;- the first domain V L A of the first polypeptide chain is linked to the fourth domain V H A of the second polypeptide chain with the formation of an antigen-binding site for the first antigen A; - второй домен VHB первой полипептидной цепи связан с третьим доменом VLB второй полипептидной цепи с образованием антиген-связывающего сайта для второго антигена В;- the second domain V H B of the first polypeptide chain is linked to the third domain V L B of the second polypeptide chain with the formation of an antigen-binding site for the second antigen B; - третий домен VLB первой полипептидной цепи связан со вторым доменом VHB второй полипептидной цепи с образованием антиген-связывающего сайта для второго антигена В; и- the third domain V L B of the first polypeptide chain is associated with the second domain V H B of the second polypeptide chain with the formation of an antigen-binding site for the second antigen B; and - четвертый домен VHA первой полипептидной цепи связан с первым доменом VLA второй полипептидной цепи с образованием антиген-связывающего сайта для первого антигена А.the fourth V H A domain of the first polypeptide chain is linked to the first V L A domain of the second polypeptide chain to form an antigen-binding site for the first antigen A. 2. Антиген-связывающая молекула по п. 1, отличающаяся тем, что первая и вторая полипептидные цепи нековалентно связаны.2. The antigen-binding molecule according to claim 1, characterized in that the first and second polypeptide chains are non-covalently linked. 3. Антиген-связывающая молекула по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанная антиген-связывающая молекула является четырехвалентной.3. The antigen binding molecule according to claim 1 or 2, characterized in that said antigen binding molecule is tetravalent. 4. Антиген-связывающая молекула по п. 1, отличающаяся тем, что указанная антиген-связывающая молекула является биспецифичной, и первый антиген А или второй антиген В является альбумином.4. The antigen binding molecule according to claim 1, characterized in that said antigen binding molecule is bispecific, and the first antigen A or the second antigen B is albumin. 5. Антиген-связывающая молекула по п. 1, отличающаяся тем, что указанная антиген-связывающая молекула является биспецифичной по отношению к (i) HSA и CD3, (ii) CD3 и CD19 или (iii) CD16 и CD19.5. The antigen binding molecule according to claim 1, characterized in that said antigen binding molecule is bispecific with respect to (i) HSA and CD3, (ii) CD3 and CD19, or (iii) CD16 and CD19. 6. Антиген-связывающая молекула по п. 1, отличающаяся тем, что указанные домены являются доменами человека или гуманизированными доменами.6. The antigen-binding molecule according to claim 1, characterized in that said domains are human domains or humanized domains. 7. Антиген-связывающая молекула по п. 1, отличающаяся тем, что указанная антиген-связывающая молекула содержит по меньшей мере одну дополнительную функциональную единицу.7. The antigen-binding molecule according to claim 1, characterized in that said antigen-binding molecule contains at least one additional functional unit. 8. Антиген-связывающая молекула по п. 1, отличающаяся тем, что указанная антиген-связывающая молекула является специфичной по отношению к В-клетке, Т-клетке, естественному киллеру (NK-клетке), миелоидной клетке или фагоцитарной клетке.8. The antigen binding molecule according to claim 1, characterized in that said antigen binding molecule is specific for a B cell, T cell, natural killer (NK cell), myeloid cell, or phagocytic cell. 9. Антиген-связывающая молекула по п. 8, отличающаяся тем, что указанная антиген-связывающая молекула является биспецифичной, причем указанная антиген-связывающая молекула дополнительно является специфичной к опухолевой клетке.9. The antigen-binding molecule according to claim 8, characterized in that said antigen-binding molecule is bispecific, wherein said antigen-binding molecule is additionally specific for a tumor cell. 10. Антиген-связывающая молекула по п. 9, отличающаяся тем, что указанная биспецифичная антиген-связывающая молекула специфична по отношению к (а) антигену, присутствующему в опухолевой клетке, или (b) Т-клетке или NK-клетке.10. The antigen binding molecule according to claim 9, characterized in that said bispecific antigen binding molecule is specific for (a) an antigen present in a tumor cell, or (b) a T cell or NK cell. 11. Антиген-связывающая молекула по п. 1 для перекрестного связывания с антигеном А на поверхности клетки и антигеном В на поверхности другой клетки.11. The antigen-binding molecule according to claim 1 for cross-linking with antigen A on the surface of the cell and antigen B on the surface of another cell. 12. Антиген-связывающая молекула по п. 1, отличающаяся тем, что указанные линкеры L1 и L3 состоят из 12 или менее аминокислотных остатков.12. The antigen binding molecule according to claim 1, characterized in that said linkers L1 and L3 consist of 12 or less amino acid residues. 13. Антиген-связывающая молекула по п. 12, отличающаяся тем, что указанные линкеры L1, L2 и L3 состоят из 3-10 аминокислотных остатков.13. The antigen-binding molecule according to p. 12, characterized in that said linkers L1, L2 and L3 consist of 3-10 amino acid residues. 14. Композиция для лечения заболевания, при котором экспрессируются антиген А и антиген В, содержащая антиген-связывающую молекулу по любому из пп. 1-13 и фармацевтически приемлемый носитель.14. A composition for treating a disease in which antigen A and antigen B are expressed, comprising an antigen-binding molecule according to any one of claims. 1-13 and a pharmaceutically acceptable carrier. 15. Композиция по п. 14 для применения в качестве лекарственного средства.15. The composition according to p. 14 for use as a medicine.
RU2013157040A 2011-07-22 2011-07-22 Multivalent antigen-binding fv molecule RU2613368C2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2011/062673 WO2013013700A1 (en) 2011-07-22 2011-07-22 Multivalent antigen-binding fv molecule

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013157040A RU2013157040A (en) 2015-08-27
RU2613368C2 true RU2613368C2 (en) 2017-03-16

Family

ID=44719851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013157040A RU2613368C2 (en) 2011-07-22 2011-07-22 Multivalent antigen-binding fv molecule

Country Status (8)

Country Link
JP (1) JP5938473B2 (en)
CN (1) CN103687879B (en)
AU (1) AU2011373925B2 (en)
BR (1) BR112014001573B8 (en)
CA (1) CA2842649C (en)
MX (1) MX347829B (en)
RU (1) RU2613368C2 (en)
WO (1) WO2013013700A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021034227A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Complementarity-determining regions for binding cd3, and bispecific antigen-binding molecule containing said cdrs

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220025917A (en) 2014-05-29 2022-03-03 마크로제닉스, 인크. Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
US9212225B1 (en) * 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
WO2016001810A1 (en) 2014-07-01 2016-01-07 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
RU2017129236A (en) 2015-01-26 2019-03-07 Макродженикс, Инк. MULTIValent MOLECULES CONTAINING DR5-BINDING DOMAINS
EA201792581A1 (en) 2015-05-29 2018-07-31 Амфивена Терапьютикс, Инк. METHODS OF APPLICATION OF BISPECIFIC CD33- and CD3-BINDING PROTEINS
TWI773646B (en) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 Lag-3-binding molecules and methods of use thereof
GEP20227419B (en) 2015-07-30 2022-10-10 Macrogenics Inc Pd-1-binding molecules and methods of use thereof
WO2017106061A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof
US20170233472A1 (en) 2016-02-17 2017-08-17 Macrogenics, Inc. ROR1-Binding Molecules, and Methods of Use Thereof
BR112018071105A2 (en) 2016-04-15 2019-02-26 Macrogenics, Inc. drug and antibody conjugate, binding molecule, pharmaceutical composition and use
US11242402B2 (en) 2016-12-23 2022-02-08 Macrogenics, Inc. ADAM9-binding molecules, and methods of use thereof
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
JP7115758B2 (en) * 2017-02-28 2022-08-09 アッフィメッド・ゲー・エム・ベー・ハー Tandem diabodies for CD16A-directed NK cell engagement
US20200181263A1 (en) * 2017-06-05 2020-06-11 Numab Therapeutics AG Hetero-dimeric multi-specific antibody format targeting at least cd3 and hsa
EP3700782B1 (en) 2017-10-26 2022-04-27 Saint-Gobain Glass France Vehicle attachment with integrated camera module
BR112020011810A2 (en) 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. cd16 binding molecule x disease antigen, pharmaceutical composition, use of pharmaceutical composition, and method for treating a disease
PE20220278A1 (en) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc VARIABLE DOMAINS OF ANTIBODIES TARGETING THE NKG2D RECEPTOR
SG11202007572VA (en) 2018-02-15 2020-09-29 Macrogenics Inc Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
AU2019282836A1 (en) * 2018-06-07 2021-01-07 Cullinan Oncology, Inc. Multi-specific binding proteins and methods of use thereof
GB201912681D0 (en) 2019-09-04 2019-10-16 Eth Zuerich Bispecific binding agent that binds to cd117/c-kit and cd3

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1500665A1 (en) * 2002-04-15 2005-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR CONSTRUCTING scDb LIBRARIES

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3720353B2 (en) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル Multivalent and multispecific binding proteins, their production and use
DE19819846B4 (en) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalent antibody constructs
EP1400534B1 (en) 2002-09-10 2015-10-28 Affimed GmbH Human CD3-specific antibody with immunosuppressive properties
JPWO2005056605A1 (en) * 2003-12-12 2007-12-06 中外製薬株式会社 Modified antibody that recognizes a trimer or higher receptor
JP5057967B2 (en) * 2005-03-31 2012-10-24 中外製薬株式会社 sc (Fv) 2 structural isomer
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
WO2010109924A1 (en) * 2009-03-25 2010-09-30 国立大学法人東北大学 Lh-type bispecific antibody
PL2361936T3 (en) * 2010-02-25 2016-10-31 Antigen-binding molecule and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1500665A1 (en) * 2002-04-15 2005-01-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR CONSTRUCTING scDb LIBRARIES

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIPRIYANOV S.M., et al., Bispecific tandem diabody for tumor therapy with improved antigen binding and pharmacokinetics, J Mol. Biol., 1999, No.293, pp.41-56, eps. abstract, fig.9, pp.49-50;EP 1500665 A1, 26.01.2005. *
KIPRIYANOV S.M., et al., Bispecific tandem diabody for tumor therapy with improved antigen binding and pharmacokinetics, J Mol. Biol., 1999, No.293, pp.41-56, eps. abstract, fig.9, pp.49-50;ДЕЕВ С.М., и др., Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения, Acta nature, 2009, No.1, с.32-50. *
ДЕЕВ С.М., и др., Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения, Acta nature, 2009, No.1, с.32-50. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021034227A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Complementarity-determining regions for binding cd3, and bispecific antigen-binding molecule containing said cdrs

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014527515A (en) 2014-10-16
CA2842649C (en) 2020-01-21
AU2011373925A1 (en) 2014-01-16
CA2842649A1 (en) 2013-01-31
AU2011373925B2 (en) 2016-04-28
JP5938473B2 (en) 2016-06-22
MX2014000816A (en) 2014-07-09
BR112014001573B8 (en) 2022-11-08
RU2013157040A (en) 2015-08-27
BR112014001573A2 (en) 2017-02-21
CN103687879B (en) 2016-05-04
MX347829B (en) 2017-05-15
BR112014001573B1 (en) 2022-08-30
CN103687879A (en) 2014-03-26
WO2013013700A1 (en) 2013-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2613368C2 (en) Multivalent antigen-binding fv molecule
US20180346590A1 (en) Antigen-binding molecule and uses thereof
US11945879B2 (en) Multispecific antigens binding fragments and multispecific antibodies
EP2371866A2 (en) Multivalent antigen-binding Fv molecule
JP6669722B2 (en) CD3 binding domain
US20180222996A1 (en) Bispecific scfv immunofusion (bif)
CA2978381C (en) Chimeric antigen receptor (car) comprising a cd19-binding domain
AU2010299895B2 (en) Anti-CD33 antibodies and use thereof for immunotargeting in treating CD33-associated illnesses
CA3187442A1 (en) Compositions including ex vivo armed t cells with multi-specific antibodies and uses thereof
WO2021044008A1 (en) Bispecific binding agent that binds to CD117/c-KIT and CD3
KR20230162013A (en) Multispecific protein containing NKP46-binding site, cancer antigen binding site fused to cytokines for NK cell engagement
WO2020011706A1 (en) Two chimeric antigen receptors specifically binding cd19 and igkappa
WO2023199927A1 (en) Use of anti-tspan8-anti-cd3 bispecific antibody combined with pd-1 signal inhibitor for cancer treatment
WO2023031300A1 (en) Personalized vnar-based chimeric antigen receptors (vnar-car) for the treatment of clonal b-and t cell malignancies, and methods for producing vnar-cars

Legal Events

Date Code Title Description
HZ9A Changing address for correspondence with an applicant