RU2611408C1 - Method for fluorescence histological detection of amyloid - Google Patents

Method for fluorescence histological detection of amyloid Download PDF

Info

Publication number
RU2611408C1
RU2611408C1 RU2015140660A RU2015140660A RU2611408C1 RU 2611408 C1 RU2611408 C1 RU 2611408C1 RU 2015140660 A RU2015140660 A RU 2015140660A RU 2015140660 A RU2015140660 A RU 2015140660A RU 2611408 C1 RU2611408 C1 RU 2611408C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
amyloid
fluorescent
staining
fluorescence
cooh
Prior art date
Application number
RU2015140660A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Вадим Авенирович Козлов
Сергей Павлович Сапожников
Юрий Никитич Митрасов
Анжелика Анатольевна Авруйская
Павел Борисович Карышев
Алена Игоревна Шептухина
Оксана Владиславовна Николаева
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова" filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова"
Priority to RU2015140660A priority Critical patent/RU2611408C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2611408C1 publication Critical patent/RU2611408C1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7047—Fibrils-Filaments-Plaque formation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

FIELD: medicine, pharmacy.
SUBSTANCE: invention refers to experimental biology and medicine and provides a method of fluorescent histological detection of amyloid comprising fixation of organ tissue slices in 10% formaldehyde, staining by a fluorescent dye, water washing, dehydration, sealing into transparent non-fluorescent media, microscopy by means of a fluorescence microscope, using 4-N-aryl-3,5-dioxo-1-formyl-10-oxa-4-azatricyclo [5.2.11.7.02.6] Dec-8-enes
Figure 00000014
formula where Y = 2-NO23-NO24-NO23-COOH 4-COOH derivatives as fluorescent dye, and dyeing is carried out by 1.5% alcoholic dye solution, mixed with 1% aqueous sodium hydroxide with a ratio of 1: 1.
EFFECT: invention provides increased information content due to the increased contrast of surface relief, and contributes to greater safety of histological sections.
3 tbl, 2 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и предназначено для исследования вне- и внутриклеточной локализации амилоида в тканях, а также жидких средах.The invention relates to experimental biology and medicine, and is intended for the study of extra- and intracellular localization of amyloid in tissues, as well as in liquid media.

Известен флуоресцентный способ выявления растворенных в воде фибрилл амилоида с помощью бензантрона (3-морфолино-7Н-бензо[de]антрацен-7-он) (Gorbenko G., Trusova V., Kirilova Ε., Kirilov G., Kalnina I., Vasilev Α., Kaloyanova S., Deligeorgiev T. New fluorescent probes for detection and characterization of amyloid fibrils // Chemical Physics Letters. - 2010. - Vol. 495. - P. 275-279).A known fluorescent method for detecting amyloid fibrils dissolved in water using benzantrone (3-morpholino-7H-benzo [de] anthracene-7-one) (Gorbenko G., Trusova V., Kirilova Ε., Kirilov G., Kalnina I., Vasilev Α., Kaloyanova S., Deligeorgiev T. New fluorescent probes for detection and characterization of amyloid fibrils // Chemical Physics Letters. - 2010. - Vol. 495. - P. 275-279).

Figure 00000001
Figure 00000001

Недостатками данного способа являются то, что этот препарат не апробирован на гистологических срезах, не производится в промышленных масштабах для лабораторного использования и не лицензирован. Как антраценовое производное 3-морфолино-7Н-бензо[de]антрацен-7-он возможно является канцерогеном, что исключает возможность его использования как лекарственного средства.The disadvantages of this method are that this drug is not tested on histological sections, is not produced on an industrial scale for laboratory use and is not licensed. As an anthracene derivative of 3-morpholino-7H-benzo [de] anthracene-7-one, it is possibly a carcinogen, which excludes the possibility of its use as a medicine.

Известен способ гистохимического определения амилоида с помощью красителя Конго красный [по Н.Н. Benhold (1923), в кн.: Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 646 с]. Недостатком данного способа является низкая информативность, заключающаяся в отсутствии возможности получения количественного результата.A known method of histochemical determination of amyloid using the Congo red dye [according to N.N. Benhold (1923), in the book: Lilly R. Pathological technology and practical histochemistry. M.: Mir, 1969. 646 s]. The disadvantage of this method is the low information content, which consists in the absence of the possibility of obtaining a quantitative result.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является диагностический способ флуоресцентного выявления амилоида в гистологических срезах органов людей, умерших от амилоидоза, с помощью окрашивания срезов тиофлавином Т, либо S (Bums J., Pennock C.A., Steward P.J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine Τ // Journal of pathology and bacteriology. - 1967. - Vol.94. - P. 337; Bancroft J.D., Stevens A. Theory and practice of histological techniques Ed. 2 / Churchill Livingstone. - Edinburgh & London, 1982 UK.), который заключается в том, что парафиновые срезы органов, зафиксированные в 10% формалине, предварительно окрашивают железным гематоксилином, после чего докрашивают 1% раствором тиофлавина Τ или S.The closest in technical essence and the achieved result is a diagnostic method for the fluorescence detection of amyloid in histological sections of organs of people who died from amyloidosis by staining sections with thioflavin T or S (Bums J., Pennock CA, Steward PJ The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine Τ // Journal of pathology and bacteriology. - 1967. - Vol. 94. - P. 337; Bancroft JD, Stevens A. Theory and practice of histological techniques Ed. 2 / Churchill Livingstone. - Edinburgh & London, 1982 UK.), Which consists in the fact that paraffin sections of organs fixed in 10% formalin are pre-stained with jelly hematoxylin, and then stained with a 1% solution of thioflavin Τ or S.

Figure 00000002
Figure 00000002

Докрашенные срезы подкисляют в растворе лимонной кислоты, высушивают, заделывают в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопируют на флуоресцентном микроскопе. При окрашивании тиофлавином Τ амилоид выглядит как зелено-коричневые флуоресцирующие объекты (рисунки 1а, 1б). Например, на рис. 1а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочке (Кл), канальцах (Кн) и цитоплазме эпителия канальцев (Э) (объектив 40х), а на рис. 1б - свечение амилоидных депозитов в клубочке, после окрашивания тиофлавином Т.The stained sections were acidified in a citric acid solution, dried, sealed in transparent non-fluorescent media, and microscopied under a fluorescence microscope. When stained with thioflavin Τ, the amyloid looks like green-brown fluorescent objects (Figures 1a, 1b). For example, in fig. Figure 1a shows the luminescence of amyloid deposits located in the glomerulus (C), tubules (C) and the cytoplasm of the tubular epithelium (E) (40 x lens), and Fig. 1b - luminescence of amyloid deposits in the glomerulus, after staining with thioflavin T.

На препаратах почки амилоидные депозиты в просвете канальцев и растворенные в цитоплазме эпителия канальцев выглядят как ярко-зеленые практически однородные объекты. В стенках сосудов и между капиллярными петлями почечных клубочков амилоид светится менее интенсивно коричневатым оттенком. Участки тканей, не содержащие амилоид, выглядят темно-зелеными, практически черными. Клеточные ядра дифференцируются как округлые несветящиеся объекты.On kidney preparations, amyloid deposits in the lumen of the tubules and the tubular epithelium dissolved in the cytoplasm look like bright green almost homogeneous objects. In the walls of blood vessels and between the capillary loops of the renal glomeruli, the amyloid glows with a less intensely brownish tint. Areas of tissue that do not contain amyloid look dark green, almost black. Cell nuclei differentiate as round, non-luminous objects.

При замерах интенсивности свечения с помощью фотоумножителя максимум флуоресценции тиофлавина приходился на 534 нм. Интенсивность свечения интактных и пораженных амилоидом тканей приведена в таблице 1. Высокий размах вариационного ряда свидетельствует о том, что интенсивность флуоресценции амилоида, меченого тиофлавином, значительно различается в разных участках ткани почки, что может свидетельствовать о наличии концентрационной зависимости.When measuring the luminous intensity using a photomultiplier, the maximum fluorescence of thioflavin was at 534 nm. The luminescence intensity of intact and amyloid-affected tissues is shown in Table 1. A high variation range indicates that the fluorescence intensity of thioflavin-labeled amyloid varies significantly in different parts of the kidney tissue, which may indicate a concentration dependence.

Figure 00000003
Figure 00000003

Figure 00000004
Figure 00000004

Этот же способ используется для выявления амилоида в биологических средах (плазма крови, спинно-мозговая жидкость) больных людей, а также изучения амилоида in vitro, как выделенного из тканей больных людей или животных, так и искусственно приготовленных из белков-амилоидогенов (Козлов В.А., Сапожников С.П., Шептухина А.И., Голенков А.В. Сравнительный анализ различных моделей амилоидоза // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2015. - №1. - С. 5-11; Сулацкая А.И., Волова Е.А., Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С., Маскевич Α.Α., Дробченко Е.А., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. Исследование кинетики образования амилоидных фибрилл на основе инсулина // Цитология. - 2013. - Ν 11. - С.809-814).The same method is used to detect amyloid in biological media (blood plasma, cerebrospinal fluid) of sick people, as well as in vitro study of amyloid, both isolated from the tissues of sick people or animals, and artificially prepared from amyloidogen proteins (Kozlov V. A., Sapozhnikov S.P., Sheptukhina A.I., Golenkov A.V. Comparative analysis of various models of amyloidosis // Herald of the Russian Academy of Medical Sciences. - 2015. - No. 1. - P. 5-11; Sulatskaya A. I., Volova E.A., Komissarchik Y.Yu., Snigirevskaya E.S., Maskevich Α.Α., Drobchenko E.A., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. Study of the kinetics of the formation of insulin-based amyloid fibrils // Cytology. - 2013. - - 11. - S.809-814).

Недостатком данного способа является дороговизна тиофлавинов (стоимость 25 г составляет 3318,16 руб., http://www.zymophore.ru/), они не производятся в Российской Федерации и закупаются за рубежом.The disadvantage of this method is the high cost of thioflavins (the cost of 25 g is 3318.16 rubles., Http://www.zymophore.ru/), they are not produced in the Russian Federation and purchased abroad.

Задачей изобретения является расширение ассортимента препаратов со свойствами окрашивания гистологических срезов для оценки интенсивности амилоидогенеза, которые могут заменить дорогостоящий тиофлавин.The objective of the invention is to expand the range of drugs with staining properties of histological sections to assess the intensity of amyloidogenesis, which can replace expensive thioflavin.

Технический результат - повышение экономичности за счет пониженной стоимости препаратов, информативности за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности.The technical result is an increase in efficiency due to the reduced cost of drugs, information content due to the increased contrast of the surface topography.

Технический результат достигается тем, что способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида, включающий фиксирование срезов ткани органов в 10%-ном формалине, окрашивание флуоресцентным красителем, промывку водой, обезвоживание, заделку в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопирование на флуоресцентном микроскопе согласно изобретению, в качестве флуоресцентного красителя используют производные 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.117.02.6]дец-8-енов формулыThe technical result is achieved by the fact that the method of fluorescent histological detection of amyloid, including fixing sections of organ tissue in 10% formalin, staining with fluorescent dye, washing with water, dehydration, embedding in transparent non-fluorescent media and microscopy using a fluorescent microscope according to the invention, as a fluorescent dye according to the invention, derivatives of 4-N-aryl-3,5-dioxo-1-formyl-10-oxa-4-azatricyclo [5.2.1 17 .0 2.6 ] dec-8-enes of the formula are used

Figure 00000005
Figure 00000005

где Y=2-NO2, 3-NO2, 4-NO2, 3-COOH, 4-COOH, а окрашивание осуществляют 1,5% спиртовым раствором красителя, смешанным с 1% водным раствором гидроксида натрия в соотношении 1:1.where Y = 2-NO 2 , 3-NO 2 , 4-NO 2 , 3-COOH, 4-COOH, and staining is carried out with a 1.5% alcohol dye solution mixed with 1% aqueous sodium hydroxide in a 1: 1 ratio .

Сущность способа флуоресцентного гистологического выявления амилоида заключается в следующем.The essence of the method of fluorescent histological detection of amyloid is as follows.

На основе представлений о супрамолекулярном неферментативном взаимодействии амилоида с известными флуоресцентными зондами тиофлавином Т (Сулацкая А.И. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя: автореф. дис. … докт.биол. наук / А.И. Сулацкая; Институт цитологии РАН. - Санкт-Петербург, 2013. - 22 с. ) и конго-красным (Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid like proteins with a pleated sheet conformation // J. Histochem. and Cytochem. - 1989. - Vol.37. - N 1273. 1281) осуществлен синтез производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.1.7.02.6]дец-8-енов формулы (1a-д), перспективных как флуоресцентные зонды, селективных к амилоиду.Based on the concepts of supramolecular non-enzymatic interaction of amyloid with known fluorescent probes with thioflavin T (Sulatskaya A.I. Interaction of thioflavin T with amyloid fibrils: incorporation mechanism, binding parameters, change in the photophysical characteristics of the dye: abstract of dissertation ... doctor of biological sciences / A .I. Sulatskaya; Institute of Cytology RAS. - St. Petersburg, 2013 .-- 22 pp.) And Congo red (Klunk WE, Pettegrew JW, Abraham DJ Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid like proteins with a pleated sheet conformation / / J. Histochem. And Cytochem. - 1989. - Vol. 37. - N 1273. 1281) carried out by mes derivatives of 4-N-aryl-3,5-dioxo-1-formyl-10-oxa-4-azatricyclo [5.2. 1.7 .0 2.6 ] dec-8-enes of the formula (1a-d), promising as fluorescent probes, selective for amyloid.

Синтез исследуемых веществ (1a-д) осуществляли взаимодействием легкодоступных N-арил-2,5-дигидропиррол-2,5-дионов с фуран-2-карбальдегидом при эквимольном соотношении реагентов при комнатной температуре. В качестве растворителя использовали абсолютный 1,4-диоксан. Чистоту синтезированных продуктов контролировали по данным тонкослойной хроматографии, а структуру подтверждали методами ИК, ЯМР 1Н-спектроскопии.The synthesis of the studied substances (1a-d) was carried out by the interaction of readily available N-aryl-2,5-dihydropyrrol-2,5-diones with furan-2-carbaldehyde at an equimolar reagent ratio at room temperature. Absolute 1,4-dioxane was used as a solvent. The purity of the synthesized products was monitored by thin layer chromatography, and the structure was confirmed by IR, 1 H NMR spectroscopy.

Figure 00000006
Figure 00000006

Соединения (1a-д) представляют собой кристаллические вещества светло-желтого или оранжевого цвета, константы и данные элементного анализа которых приведены в таблице №2.Compounds (1a-d) are crystalline substances of a light yellow or orange color, the constants and data of elemental analysis of which are shown in table No. 2.

Figure 00000007
Figure 00000007

Figure 00000008
Figure 00000008

Флуоресцентные свойства апробированных веществ (1a-д), имеющих, подобно тиофлавину Т, строение молекулярного ротора, в сухом кристаллическом виде проявлялись при возбуждении ультрафиолетом в видимом диапазоне 421-435,5 нм. Ни спиртовой, ни водно-спиртовой растворы этих веществ в диапазоне концентраций от 0,75% до 1,5% регистрируемой с помощью ФЭУ-39 флуоресценции не обнаруживали.The fluorescent properties of the tested substances (1a-d), having, like thioflavin T, the molecular rotor structure, in a dry crystalline form were manifested upon excitation with ultraviolet light in the visible range of 421-435.5 nm. Neither alcohol nor water-alcohol solutions of these substances in the concentration range from 0.75% to 1.5% of fluorescence detected using PMT-39 were detected.

Примеры выполнения способа.Examples of the method.

Пример 1Example 1

Эксперименты проведены на 5 мкм парафиновых срезах почек человека с ранее клинически установленным и гистологически подтвержденным диагнозом амилоидоза. Обезличенные препараты были предоставлены «Республиканским бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Чебоксары. Депарафинированные срезы были предварительно окрашены гематоксилином, а затем в течение 3 мин дополнительно обработаны водно-спиртовыми растворами любого из производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло-[5.2.11.7.02.6]дец-8-енов формулы (1а-д). Водно-спиртовые растворы были получены следующим путем. Вначале соединения формулы (1а-д) растворяли в 96% спирте с получением спиртового раствора 1,5% концентрации, а затем к полученному раствору добавляли 1% водный раствор гидроксида натрия в соотношении 1:1 по объему. Конечная концентрация препаратов (1а-д) в полученном водно-спиртовом растворе составляла 0,75%, а среда такого раствора щелочная (рН>7). После окрашивания срезы были промыты водой, обезвожены и заделаны в полистирол.The experiments were performed on 5 μm paraffin sections of human kidneys with a previously clinically established and histologically confirmed diagnosis of amyloidosis. Anonymized drugs were provided by the Republican Bureau of Forensic Medical Examination, Cheboksary. Deparaffined sections were pre-stained with hematoxylin, and then additionally treated with water-alcohol solutions of any of the derivatives of 4-N-aryl-3,5-dioxo-1-formyl-10-oxa-4-azatricyclo- for 3 minutes [5.2.1 1.7 .0 2.6 ] dec-8-enes of the formula (1a-d). Water-alcohol solutions were obtained in the following way. First, the compounds of formula (1a-d) were dissolved in 96% alcohol to obtain an alcohol solution of 1.5% concentration, and then a 1% aqueous solution of sodium hydroxide was added to the resulting solution in a ratio of 1: 1 by volume. The final concentration of preparations (1a-d) in the resulting aqueous-alcoholic solution was 0.75%, and the medium of such a solution was alkaline (pH> 7). After staining, the sections were washed with water, dehydrated and embedded in polystyrene.

Микроскопию срезов осуществляли на микроскопе «Люмам-4». Флуориметрию осуществляли с помощью микролюминиметра ФМЭЛ-1А, запирающий светофильтр ЖС18, λвозбужд.=410 нм, светофильтры ФС, БС, СЗС. Электрические параметры на всех замерах определялись следующими параметрами: входное напряжение 900 В, сопротивление усилителя 106 Ом. В насадке был установлен зонд 0,5. Для измерения использовали ФЭУ-39, показания снимали с цифрового вольтметра, данные представлены в милливольтах (мВ). Микрофотографии получены с помощью цифровой камеры Levenhuk С800 NG 8М, USB 2.0.Sections microscopy was carried out using a Lumam-4 microscope. Fluorimetry was carried out using an FMEL-1A microluminometer, locking filter ZhS18, λ excitation. = 410 nm, FS, BS, SZS light filters. The electrical parameters for all measurements were determined by the following parameters: input voltage 900 V, amplifier resistance 10 6 Ohms. A probe 0.5 was installed in the nozzle. A PMT-39 was used for measurements, readings were taken from a digital voltmeter, data are presented in millivolts (mV). Microphotographs were taken using a Levenhuk C800 NG 8M digital camera, USB 2.0.

На окрашенных препаратах максимум флуоресценции наблюдался при 534 нм.On stained preparations, maximum fluorescence was observed at 534 nm.

После обработки парафиновых срезов амилоидной почки подщелоченными водно-спиртовыми растворами всех исследуемых веществ структуры (1a-д) наблюдалось интенсивное зеленое свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцевых структурах (рисунки 2а-2д, объектив 40х). Например, на рис. 2а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцевых структурах, после окрашивания препаратом (1а); на рис. 2г изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцах, после окрашивания препаратом (1г); на рис. 2д изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцах, после окрашивания препаратом (1д).After processing the paraffin sections of the amyloid kidney with alkalized aqueous-alcoholic solutions of all the studied substances of the structure (1a-e), an intense green glow of amyloid deposits located in the tubular structures was observed (Figures 2a-2d, 40 x lens). For example, in fig. 2a shows the luminescence of amyloid deposits located in the tubular structures after staining with the drug (1a); in fig. 2g shows the luminescence of amyloid deposits located in the tubules, after staining with the drug (1g); in fig. 2d shows the luminescence of amyloid deposits located in the tubules after staining with the drug (1d).

Меньшее по интенсивности свечение обнаруживалось в клубочках с хорошо выявляемым париетальным листком капсулы и темно-зелеными депозитами амилоида, расположенными между петель клубочка, эпителия канальцев и эндотелии артериол. Например, на рис. 2а1 изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1а); на рис. 2б изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1б); на рис. 2в изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1в).A lower intensity luminescence was found in the glomeruli with a well-defined parietal leaf of the capsule and dark green deposits of amyloid located between the glomerulus loops, tubule epithelium and arteriole endothelium. For example, in fig. 2a 1 shows the luminescence of amyloid deposits located in the glomeruli after staining with the drug (1a); in fig. 2b shows the luminescence of amyloid deposits located in the glomeruli after staining with the drug (1b); in fig. 2c shows the luminescence of amyloid deposits located in the glomeruli after staining with the drug (1c).

Обнаруживаемое свечение равномерно располагалось в цитоплазме клеток. Клеточные ядра выглядели как темные нефлуоресцирующие овальные объекты. Интенсивность флуоресценции депозитов в канальцах различается на порядок, что может быть обусловлено количественными различиями содержания амилоида на разных участках срезов (таблица 3).The detected glow was evenly located in the cytoplasm of the cells. Cell nuclei looked like dark non-fluorescent oval objects. The fluorescence intensity of deposits in the tubules varies by an order of magnitude, which may be due to quantitative differences in the content of amyloid in different sections of the sections (table 3).

Figure 00000009
Figure 00000009

Как следует из данных, представленных в таблице, интенсивность флуоресценции исследуемых препаратов (1а-д) значительно не различается, что объясняется близостью их химического строения.As follows from the data presented in the table, the fluorescence intensity of the studied drugs (1a-d) does not differ significantly, due to the proximity of their chemical structure.

При применении соединений (1а-д), по сравнению с окраской тиофлавином Т, увеличивается информативность окраски за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности. Кроме того, при окрашивании тиофлавином необходима инкубация срезов в 1% растворе лимонной кислоты, что необходимо для возбуждения флуоресценции тиофлавина. Тогда как в заявленном способе окрашивания необходимости в такой обработке нет. Поскольку рН растворов красителей, приготавливаемых по заявленному способу, имеет щелочную реакцию, то он более физиологичен, поскольку нативные (живые) ткани имеют рН≥7,37 (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник / Под. ред. акад. АМН СССР С.С. Дебова. - 2-е изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 1990. - 528 с, С. 452-455. ISBN 5-225-01515-8). Данное обстоятельство должно способствовать большей сохранности гистологических срезов, чем при их обработке кислотами.When using compounds (1a-d), in comparison with the staining with thioflavin T, the informativeness of the color increases due to the increased contrast of the surface topography. In addition, when staining with thioflavin, incubation of sections in a 1% citric acid solution is necessary, which is necessary to excite fluorescence of thioflavin. While in the claimed method of staining, the need for such processing is not. Since the pH of the dye solutions prepared by the claimed method has an alkaline reaction, it is more physiological, since native (living) tissues have a pH ≥ 7.37 (Berezov T.T., Korovkin B.F. Biological chemistry: Textbook / Under. Edited by Academician of the USSR Academy of Medical Sciences S.S. Debov. - 2nd ed., revised and enlarged.- M .: Medicine, 1990. - 528 s, S. 452-455. ISBN 5-225-01515-8 ) This circumstance should contribute to a greater preservation of histological sections than when treated with acids.

Заявленный способ позволяет селективно локализовать амилоид как свободно расположенный в межклеточном пространстве, так и внутриклеточно, а также в жидких средах и может быть использован в судебно-медицинской экспертизе, клинической диагностике амилоидоза, экспериментальной биологии и медицине.The claimed method allows you to selectively localize amyloid both freely located in the intercellular space and intracellular, as well as in liquid media and can be used in forensic examination, clinical diagnosis of amyloidosis, experimental biology and medicine.

Claims (4)

Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида, включающий фиксирование срезов ткани органов в 10%-ном формалине, окрашивание флуоресцентным красителем, промывку водой, обезвоживание, заделку в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопирование на флуоресцентном микроскопе, отличающийся тем, что в качестве флуоресцентного красителя используют производные 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.11.7.02.6]дец-8-енов формулыA method for fluorescence histological detection of amyloid, including fixing sections of organ tissue in 10% formalin, staining with a fluorescent dye, washing with water, dehydration, incorporation into transparent non-fluorescent media and microscopy using a fluorescence microscope, characterized in that 4 are used as fluorescent dye N-aryl-3,5-dioxo-1-formyl-10-oxa-4-azatricyclo [5.2.1 1.7 .0 2.6 ] dec-8-enes of the formula
Figure 00000010
Figure 00000010
 где Y=2-NO2, 3-NO2, 4-NO2, 3-СООН, 4-СООН,where Y = 2-NO 2, 3-NO 2 4-NO 2, 3-COOH 4-COOH а окрашивание осуществляют 1,5% спиртовым раствором красителя, смешанным с 1% водным раствором гидроксида натрия в соотношении 1:1.and staining is carried out with a 1.5% alcohol dye solution mixed with a 1% aqueous solution of sodium hydroxide in a ratio of 1: 1.
RU2015140660A 2015-09-23 2015-09-23 Method for fluorescence histological detection of amyloid RU2611408C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015140660A RU2611408C1 (en) 2015-09-23 2015-09-23 Method for fluorescence histological detection of amyloid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015140660A RU2611408C1 (en) 2015-09-23 2015-09-23 Method for fluorescence histological detection of amyloid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2611408C1 true RU2611408C1 (en) 2017-02-21

Family

ID=58458977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015140660A RU2611408C1 (en) 2015-09-23 2015-09-23 Method for fluorescence histological detection of amyloid

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2611408C1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2012129184A (en) * 2009-12-11 2014-01-20 Араклон Байотек, С.Л. METHODS AND REAGENTS FOR IMPROVING DETECTION OF AMYLOID BETA-PEPTIDES

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2012129184A (en) * 2009-12-11 2014-01-20 Араклон Байотек, С.Л. METHODS AND REAGENTS FOR IMPROVING DETECTION OF AMYLOID BETA-PEPTIDES

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Freire S., de Araujo M. H., Al-Soufi W., Novo M. Photophysical study of Thioflavin T as fluorescence marker of amyloid fibrils // Dyes and Pigments. - 2014. - Vol.110. - P.97-105. *
Толстикова Т.Г. и др. Нейропротекторная активность аддуктов ламбертиановой кислоты с N-замещенными малеинимидами // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - Т.38, No.10. - С.13-15. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kumar et al. FLIM FRET technology for drug discovery: Automated multiwell‐plate high‐content analysis, multiplexed readouts and application in situ
JP6019500B2 (en) Method for detecting cancer cells using fluorescently labeled L-glucose derivative and imaging agent for cancer cells containing the derivative
Kuimova Molecular rotors image intracellular viscosity
WO2010074325A1 (en) Labeling composition for intraocular tissue, labeling method of intraocular tissue, and screening method
CN106632188B (en) The fluorescence probe of one kind detection formaldehyde and its preparation and application
Si et al. A curcumin-based NIR fluorescence probe for detection of amyloid-beta (Aβ) plaques in Alzheimer's disease
Kim et al. A ratiometric two-photon probe for Ca2+ in live tissues and its application to spinal cord injury model
CN111116574B (en) Viscosity fluorescent probe with mitochondrial targeting function and preparation method and application thereof
Dai et al. Development of a novel NIR viscosity fluorescent probe for visualizing the kidneys in diabetic mice
JP6950922B2 (en) Dyeing method, dyeing agent, and dyeing kit
GB2433117A (en) Histology staining agent for use in endoscopy
WO2022054755A1 (en) Fluorescent dye and method for detecting tumor cells
Jarvis et al. Time-lapse imaging of cell death in cell culture and whole living organisms using turn-on deep-red fluorescent probes
RU2611408C1 (en) Method for fluorescence histological detection of amyloid
Li et al. Advanced multimodal solid-state optochemical pH and dual pH/O2 sensors for cell analysis
US9335321B2 (en) Method for screening agent with angiogenic-modulating activities using teleost embryo
Winfree et al. Intravital microscopy of biosensor activities and intrinsic metabolic states
US9636021B2 (en) Flavonoid compounds of low toxicity for biological imaging applications
Sapozhnikov et al. Novel fluorescent probes for amyloid detection
Gusel’nikova et al. Fluorescent characterization of amyloid deposits in the kidneys of mdx mice
Guselnikova et al. A Novel Method for Amyloid Detection in Human Tissue Load Using a Fluorescent Dye—Congo Red Analogue
Posokhov Fluorescent probes sensitive to changes in the cholesterol-to-phospholipids molar ratio in human platelet membranes during atherosclerosis
US20080045796A1 (en) Histofluorescent stain composition for endoscopy
Hakvoort et al. Shedding light on human cerebral lipofuscin: An explorative study on identification and quantification
Wu et al. Triethylene glycol-modified iridium (iii) complexes for fluorescence imaging of Schistosoma japonicum

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180924