RU2611395C2 - Activation of photopolymerization using near ir-radiation - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to additive technology, biotechnology and medicine, namely to a method for producing 3-dimensional structures within polymerized material. Photoactivator irradiated using continuous source of deep-penetrating near IR-radiation, which initiates polymerization process by nonradiative resonance energy transfer from nanoparticles to photoinitiator, where the photoinitiator is a molecular complex comprising blue and UV-emitting anti-stokes luminescent upconverting nanoparticles NaYF₄:Yb³⁺, Tm³⁺. The invention can be used for production of tissue-engineered structures, matrices for individual bioactive implants and artificial organs.

EFFECT: use of photoactivator instead of cytotoxic UV radiation to produce polymer compositions within cell culture systems.

3 dwg

Description

Изобретение относится к аддитивным технологиям, биотехнологии и медицине, созданию скаффолдов для регенеративной медицины, а именно к способу активации процесса фотополимеризации непрерывным ближним инфракрасным (ИК) излучением, включая выбор фотоактиватора, состоящего из апконвертируемых, обладающих антистоксовой люминесценцией наночастиц (ΑΚΗ) и фотоинициатора, причем фотоинициатор возбуждается при безызлучательной передаче энергии от линии антистоксовой люминесценции ΑΚΗ. Изобретение может быть использовано для создания различных тканеинженерных конструкций, матриц для индивидуальных биоактивных имплантов и искусственных органов.The invention relates to additive technologies, biotechnology and medicine, the creation of scaffolds for regenerative medicine, and in particular to a method for activating the process of photopolymerization by continuous near infrared (IR) radiation, including the choice of a photoactivator consisting of upconverted, having anti-Stokes luminescence nanoparticles (ΑΚΗ) and photoinitiator, and the photoinitiator is excited by non-radiative energy transfer from the anti-Stokes luminescence line ΑΚΗ. The invention can be used to create various tissue engineering structures, matrices for individual bioactive implants and artificial organs.

К способам прецизионного изготовления индивидуальных скаффолдов для тканевой инженерии и регенеративной медицины предъявляются весьма жесткие требования. Прежде всего, материал скаффолда должен быть биосовместимым. Материал должен обеспечивать механическую прочность и устойчивость структуры как в процессе ее имплантации, так и при дальнейшем ремоделировании требуемого типа ткани. В идеале, по своей форме, составу, структуре и биомеханическим свойствам скаффолд для тканеинженерной конструкции должен быть максимально приближен к природному межклеточному матриксу требуемого типа ткани или органа [Хенч Л., Джонс Д. "Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей" // Серия «Мир биологии и медицины», Москва, Техносфера (2007)]. В настоящее время наибольших успехов в решении тканеинженерных задач удалось достичь при использовании синтетических жидких, твердых и гидрогелевых полимерных композиций с помощью способов быстрого прототипирования. Эти способы базируются на послойном синтезе твердых копий трехмерных компьютерных образов и позволяют оперативно и с высокой точностью (порядка 0,1 мм) изготавливать объемные структуры практически любой сложности.Very precise requirements are imposed on methods for the precision manufacture of individual scaffolds for tissue engineering and regenerative medicine. First of all, the scaffold material must be biocompatible. The material should provide mechanical strength and stability of the structure both during its implantation and during further remodeling of the required type of tissue. Ideally, in its form, composition, structure and biomechanical properties, a scaffold for tissue engineering design should be as close as possible to the natural intercellular matrix of the required type of tissue or organ [Hench L., Jones D. "Biomaterials, artificial organs and tissue engineering" // Series “World of Biology and Medicine”, Moscow, Technosphere (2007)]. Currently, the greatest success in solving tissue engineering problems has been achieved using synthetic liquid, solid and hydrogel polymer compositions using rapid prototyping methods. These methods are based on layer-by-layer synthesis of solid copies of three-dimensional computer images and allow you to quickly and with high accuracy (about 0.1 mm) to produce volumetric structures of almost any complexity.

Для разработки и создания прочных полимерных конструкций используются три известных способа быстрого прототипирования - лазерная стереолитография, селективное лазерное спекание и многофотонная стереолитография.To develop and create durable polymer structures, three well-known methods of rapid prototyping are used - laser stereolithography, selective laser sintering and multiphoton stereolithography.

Известный способ лазерной стереолитографии основан на фотоинициированной лазерным излучением реакции полимеризации фотополимеризующейся композиции (ФПК). С помощью этого способа созданная на компьютере трехмерная модель объекта выращивается последовательно тонкими (0,1-0,2 мм) слоями, формируемыми под действием лазерного излучения на подвижной платформе, погружаемой в ванну с ФПК 100-200 мкм. Недостатком лазерной стереолитографии (ЛС) является токсичность исходных акриловых или эпоксидных мономеров, низкомолекулярных олигомеров, а также большинства фотоинициаторов и ингибиторов (следы которых, как правило, всегда присутствуют в конечном объекте) [Leong K.F., Cheah C.M., Chua С.К. "Solid free form fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs" // Biomaterials, 24, 2363-2378 (2003)]. Вторым недостатком способа ЛС является ограниченный набор исходных компонентов (мономеров) для изготовления биорезорбируемых матриксов [Liska R, Schuster M, Infuhr R, Tureeek C, Fritscher C, Seidl B, et al. "Photopolymers for rapid prototyping" // J. Coat. Technol. Res., 4, 505-510 (2007)]. Третьим недостатком является необходимость использования цитотоксичного ультрафиолетового (УФ) излучения для активации фотополимеризации, что не позволяет использовать способ для полимеризации сред, содержащих клеточные структуры.The known method of laser stereolithography is based on a photo-initiated laser radiation polymerization reaction of a photopolymerizable composition (FPK). Using this method, a three-dimensional model of an object created on a computer is grown sequentially in thin (0.1-0.2 mm) layers, formed under the action of laser radiation on a moving platform, immersed in a bath with a FPK of 100-200 microns. The disadvantage of laser stereolithography (LS) is the toxicity of the starting acrylic or epoxy monomers, low molecular weight oligomers, as well as most photoinitiators and inhibitors (traces of which, as a rule, are always present in the final object) [Leong K.F., Cheah C.M., Chua S.K. "Solid free form fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs" // Biomaterials, 24, 2363-2378 (2003)]. The second disadvantage of the drug method is the limited set of starting components (monomers) for the manufacture of bioresorbable matrices [Liska R, Schuster M, Infuhr R, Tureeek C, Fritscher C, Seidl B, et al. "Photopolymers for rapid prototyping" // J. Coat. Technol. Res., 4, 505-510 (2007)]. The third disadvantage is the need to use cytotoxic ultraviolet (UV) radiation to activate photopolymerization, which does not allow the use of the method for the polymerization of media containing cellular structures.

Другим известным способом создания трехмерных полимерных структур является способ лазерного спекания (ЛС), в основе которого лежит послойное лазерное формирование спеченных слоев по заданной программе. Элементарным шагом в этом процессе является связывание (спекание, сварка) между собой двух предварительно не связанных полимерных частиц, вызванное плавлением нагретого лазером материала частиц на границе их соприкосновения. Этот способ подходит только для изготовления полимерных структур и изделий из термопластичных материалов [Cruz F., Simoes J., Coole T., Bocking C. "Direct manufacturing of hydroxyapatite based bone implants by selective laser sintering" // in: Bartolo P. ed. Virtual Modeling and Rapid Manufacturing. Leiria, Portugal: CRC Press; 119-125 (2005)]. Объемное поглощение и полный расплав полимерных частиц позволяют использовать этот метод для спекания термоустойчивых систем, так как сильный лазерный перегрев приводит к деструкции с возможностью образования токсичных компонентов. Необходимость наличия высокой температуры процесса исключает возможность использования клеток в исходной полимерной композиции. Модернизированный способ ЛС описан в патенте РФ 100948, где используются светопоглощающие добавки, которые наносятся на поверхность структуры для каждого элементарного шага. К недостаткам способа следует отнести цитотоксичность добавок и высокий локальный нагрев материала структуры, что исключает возможность использовать способ для полимеризации сред, содержащих клеточные структуры.Another well-known method of creating three-dimensional polymer structures is the method of laser sintering (LS), which is based on layered laser formation of sintered layers according to a given program. An elementary step in this process is the bonding (sintering, welding) of two previously unrelated polymer particles to each other, caused by the melting of the particle material heated by the laser at the interface between them. This method is only suitable for the manufacture of polymer structures and products from thermoplastic materials [Cruz F., Simoes J., Coole T., Bocking C. "Direct manufacturing of hydroxyapatite based bone implants by selective laser sintering" // in: Bartolo P. ed . Virtual Modeling and Rapid Manufacturing. Leiria, Portugal: CRC Press; 119-125 (2005)]. Volumetric absorption and complete melt of polymer particles make it possible to use this method for sintering heat-resistant systems, since strong laser overheating leads to destruction with the formation of toxic components. The need for a high process temperature eliminates the possibility of using cells in the original polymer composition. The modernized drug method is described in RF patent 100948, which uses light-absorbing additives that are applied to the surface of the structure for each elementary step. The disadvantages of the method include cytotoxicity of additives and high local heating of the material structure, which excludes the possibility of using the method for the polymerization of media containing cellular structures.

Наиболее близким к заявляемому способу получения трехмерных структур является двухфотонная стереолитография. US Patent US 2005/0156147 A1 Akiba et al. «Two-photon polymerizable composition and process for polymerization thereof». При помощи этого способа в объеме ФПК последовательной, «поточечной», записью сфокусированным излучением фемтосекундного лазера могут формироваться произвольные трехмерные структуры с пространственным разрешением около 200 нм. Двухфотонный характер поглощения излучения позволяет добиться того, что этот процесс локализован в объеме, определяемом перетяжкой лазерного луча, что обеспечивает формирование трехмерных структур с высоким пространственным разрешением. Однако такой двухфотонный процесс имеет малое сечение поглощения типичных фотоинициаторов и, как следствие, требует высоких интенсивностей излучения (порядка 10⁹-10¹³ Вт/см²), что снижает эффективность процесса, требует использования оптики с большой числовой апертурой, высокой частоты повторения импульсов для обеспечения производительности способа. Для снижения тепловой нагрузки на материал ФПК под действием высокоинтенсивного излучения в указанном способе применяются фемтосекундные лазерные импульсы. Изготовление больших структур требует временных затрат, и практически способ двухфотонной стериолитографии для этих целей не используется.Closest to the claimed method for producing three-dimensional structures is two-photon stereolithography. US Patent US 2005/0156147 A1 Akiba et al. "Two-photon polymerizable composition and process for polymerization thereof." Using this method, arbitrary three-dimensional structures with a spatial resolution of about 200 nm can be formed in the FPK volume by a sequential, "point-to-point" recording by focused radiation of a femtosecond laser. The two-photon nature of the absorption of radiation allows us to ensure that this process is localized in the volume determined by the constriction of the laser beam, which ensures the formation of three-dimensional structures with high spatial resolution. However, such a two-photon process has a small absorption cross section for typical photoinitiators and, as a result, requires high radiation intensities (of the order of 10 ⁹ -10 ¹³ W / cm ² ), which reduces the efficiency of the process, requires the use of optics with a large numerical aperture, and a high pulse repetition rate for ensure the performance of the method. To reduce the thermal load on the FPK material under the action of high-intensity radiation, femtosecond laser pulses are used in this method. The manufacture of large structures is time-consuming, and in practice the two-photon sterolithography method is not used for these purposes.

Предлагаемый способ активации процесса фотополимеризации ближним инфракрасным (ИК) излучением лишен указанных недостатков.The proposed method for activating the process of photopolymerization by near infrared (IR) radiation is devoid of these disadvantages.

Цель изобретения состоит в реализации способа активации фотоинициатора, который легко осуществлять в объеме полимеризуемого материала непрерывным ИК-излучением и который исключает наличие цитотоксичного УФ-излучения.The purpose of the invention is to implement a method of activation of a photoinitiator, which is easy to carry out in the volume of the polymerized material by continuous infrared radiation and which eliminates the presence of cytotoxic UV radiation.

С этой целью способ согласно изобретению включает:To this end, the method according to the invention includes:

- выбор фотоактиваторов, состоящих из апконвертирующих наночастиц и фотоинициатора, способного инициировать процесс полимеризации;- the choice of photoactivators consisting of up-converting nanoparticles and a photoinitiator capable of initiating the polymerization process;

- облучение фотоктиватора глубоко проникающим в полимеризуемую композицию непрерывным источником света ближнего ИК-диапазона.- irradiation of the photoactivator with a deep source of near-infrared light that penetrates deeply into the polymerizable composition.

Фотоинициаторы относятся к классам веществ, активирующих полимеризацию при воздействии светового излучения. Типичные фотоинициаторы процесса полимеризации, применяемые на практике в биотехнологии и медицине, это: Irgacure 2959, Camphorquinone, Isopropyl thioxanthone, Eosin Y, Рибофлавин и т.п. Цитотоксичность фотоинициатора и фотопродуктов зависит от типа клеток [NE Fedorovich, MN Oudshoorn, etc "The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels " Biomaterials 30 (209) 344-353]. Главный недостаток существующих методов фотополимеризации заключается в необходимости использования света УФ или видимого спектрального диапазона для возбуждения фотоинициаторов. К сожалению, такой свет проникает в ткани в десятки раз хуже, чем свет в ближней ИК-области спектра, и фотополимеризация возможна в достаточно тонком слое. Так, если излучение 365 нм проникает в среду на глубину менее 100 мкм, то излучение на 975 нм - на несколько сантиметров. Второе ограничение применения фотоинициаторов - это цитотоксичность самого УФ-излучения. Указанных недостатков, лишены предлагаемые в данном изобретении фотоактиваторы. Создание комплекса, способного активировать процесс полимеризации при возбуждении непрерывным светом в ближней РЖ области спектра, где существует окно прозрачности биологической ткани, имеет реальную практическую значимость.Photoinitiators belong to the classes of substances that activate polymerization when exposed to light radiation. Typical photoinitiators of the polymerization process used in practice in biotechnology and medicine are: Irgacure 2959, Camphorquinone, Isopropyl thioxanthone, Eosin Y, Riboflavin, etc. The cytotoxicity of photoinitiator and photoproducts depends on the type of cells [NE Fedorovich, MN Oudshoorn, etc "The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels" Biomaterials 30 (209) 344-353]. The main drawback of existing photopolymerization methods is the need to use UV light or the visible spectral range to excite photoinitiators. Unfortunately, such light penetrates into tissues tens of times worse than light in the near infrared region of the spectrum, and photopolymerization is possible in a sufficiently thin layer. So, if the radiation of 365 nm penetrates the medium to a depth of less than 100 microns, then the radiation at 975 nm - by several centimeters. The second limitation of the use of photoinitiators is the cytotoxicity of the UV radiation itself. These disadvantages are deprived proposed in this invention photoactivators. The creation of a complex capable of activating the polymerization process when excited by continuous light in the near RJ region of the spectrum, where there is a transparency window for biological tissue, has real practical significance.

В частности, в этом случае фотоактивацию процесса полимеризации можно осуществлять в присутствии клеточных культур в полимеризумой композиции.In particular, in this case, photoactivation of the polymerization process can be carried out in the presence of cell cultures in the polymerizable composition.

Для активации реакции фотополимеризации ИК излучением были синтезированы новые комплексы, содержащие Рибофлавин в качестве фотоинициатора и апконвертирующие наночастицы типа NaYF₄: Yb³⁺Tm³⁺ в качестве первичного акцептора ИК-излучения.To activate the photopolymerization reaction by IR radiation, new complexes were synthesized containing Riboflavin as a photoinitiator and up-converting nanoparticles of the type NaYF ₄ : Yb ³⁺ Tm ³⁺ as a primary acceptor of IR radiation.

Эффективность полимеризации зависит от эффективности передачи энергии от возбужденных апконвертирующих наночастиц к фотоинициатору. Для резонансной безызлучательной передачи энергии по ферстеровскому механизму (FRET, Forster Resonance Energy Transfer) необходимо, прежде всего, чтобы донор (наночастица) и акцептор (Рибофлавин) находились на малом расстоянии друг от друга, т.к. эффективность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния между ними. Кроме того, линии фотолюминесценции донора должны попадать в полосу поглощения акцептора.The polymerization efficiency depends on the efficiency of energy transfer from excited up-converting nanoparticles to the photoinitiator. For resonant non-radiative energy transfer according to the Förster mechanism (FRET, Forster Resonance Energy Transfer), it is necessary, first of all, that the donor (nanoparticle) and acceptor (Riboflavin) be at a small distance from each other, because FRET efficiency is inversely proportional to the sixth power of the distance between them. In addition, the photoluminescence lines of the donor should fall into the absorption band of the acceptor.

На фиг. 1 приведена структура фотоактиватора и схема фотоактивации процесса полимеризации с использованием фотоактиватора. Фотоактиватор (3) состоит из апконвертирующей наночастицы (1) и фотоинициатора (2). ИК-излучение (4) возбуждает апконвертирующую наночастицу активатора. Энергия возбуждения переносится безызлучательным резонансным способом (5) на фотоинициатор. Возбужденный фотоинициатор способен активировать процесс полимеризации (6).In FIG. 1 shows the structure of the photoactivator and the photoactivation scheme of the polymerization process using a photoactivator. The photoactivator (3) consists of an upconverting nanoparticle (1) and a photoinitiator (2). IR radiation (4) excites an upconverting activator nanoparticle. The excitation energy is transferred by the non-radiative resonance method (5) to the photoinitiator. An excited photoinitiator is able to activate the polymerization process (6).

В качестве фотоинициатора может быть использован рибофлавин, являющийся эндогенным фотоинициатором, а в качестве апконвертирующей наночастицы NaYF₄:Yb³⁺Tm³⁺.Riboflavin, which is an endogenous photoinitiator, can be used as a photoinitiator, and NaYF ₄ : Yb ³⁺ Tm ³⁺ as an up-converting nanoparticle.

На фиг. 2 дан спектр антистоксовой люминесценции NaYF₄:Yb³⁺Tm³⁺ при возбуждении излучением полупроводникового лазера на длине волны 975 нм (7) и спектр излучения фотоактиватора NaYF₄:Yb³⁺Tm³⁺/Рибофлавин (8). В спектре фотоактиватора при возбуждении ИК-излучением регистрируется широкая полоса флуоресценции Рибофлавина с максимумом на 540 нм, а линии антистоксовой люминесценции апконвертирующих наночастиц, попадающие в полосу возбуждения Рибофлавина, практически отсутствуют. Люминесценция Рибофлавина при ИК-возбуждении свидетельствует об эффективном безызлучательном переносе энергии в фотоактиваторе. Возбуждение фотоинициатора в фотоактиваторе активирует процесс полимеризации.In FIG. Figure ₂ shows the anti-Stokes luminescence spectrum of NaYF ₄ : Yb ³⁺ Tm ³⁺ when excited by radiation from a semiconductor laser at a wavelength of 975 nm (7) and the emission spectrum of the NaYF ₄ photoactivator: Yb ³⁺ Tm ³⁺ / Riboflavin (8). In the spectrum of the photoactivator upon excitation by IR radiation, a broad Riboflavin fluorescence band with a maximum at 540 nm is recorded, and the anti-Stokes luminescence lines of up-converting nanoparticles falling into the Riboflavin excitation band are practically absent. Riboflavin luminescence upon IR excitation indicates an efficient non-radiative energy transfer in a photoactivator. Excitation of the photoinitiator in the photoactivator activates the polymerization process.

На фиг. 3 представлена фотография образца заполимеризованной ИК светом структуры, полученного с использованием фотоактиватора, состоящего из ΑΚΗ типа NaYF₄:Yb³⁺, Tm³⁺ и эндогенного фотоинициатора рибофлавина в водорастворимой форме флавин мононуклеотида, который вводился в раствор метакрилированной гиалуроновой кислоты.In FIG. Figure 3 shows a photograph of a sample of a polymerized IR light structure obtained using a photoactivator consisting of ΑΚΗ type NaYF ₄ : Yb ³⁺ , Tm ³⁺ and the endogenous photoinitiator riboflavin in the water-soluble form of flavin mononucleotide, which was introduced into a solution of methacrylated hyaluronic acid.

Для рисования 3D полимерной структуры применялся ИК полупроводниковый лазер (975 нм), излучение которого фокусировалось в объем фотоотверждаемой композиции объективом с фокусным расстоянием 10 см. Отклонение луча в плоскости XY обеспечивалось гальванозеркалами, подвижка с микрометрическим винтом позволяла перемещать образец по Ζ координате.To draw a 3D polymer structure, we used an IR semiconductor laser (975 nm), the radiation of which was focused into the volume of the photocurable composition by a lens with a focal length of 10 cm. The beam deflection in the XY plane was provided by galvanic mirrors, movement with a micrometer screw allowed moving the sample along the Ζ coordinate.

Таким образом, предложенный способ позволяет создавать трехмерные конструкции с использованием непрерывного излучения в ближней ИК-области спектра для возбуждения антистоксовой люминесценции апконвертирующих наночастиц и активации процесса фотополимеризации при резонансной безызлучательной передачи энергии инициатору. При этом исключается цитотоксическое действие УФ-излучения, так как в этом процессе отсутствуют кванты УФ-излучения.Thus, the proposed method allows you to create three-dimensional structures using continuous radiation in the near infrared region of the spectrum to excite anti-Stokes luminescence upconverting nanoparticles and activate the photopolymerization process with resonant non-radiative energy transfer to the initiator. In this case, the cytotoxic effect of UV radiation is excluded, since in this process there are no quanta of UV radiation.

Claims (1)

Способ получения трехмерных конструкций в объеме полимеризуемого материала, отличающийся тем, что осуществляют облучение фотоктиватора глубоко проникающим в полимеризуемую композицию непрерывным источником света ближнего ИК-диапазона, что приводит к активации процесса полимеризации посредством безызлучательного резонансного переноса энергии от наночастицы на фотоинициатор, при этом фотоактиватор представляет собой молекулярный комплекс, состоящий из апконвертирующей наночастицы NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺, обладающей антистоксовой люминесценцией в ультрафиолетовой (УФ) и синей области спектра, в качестве фотоинициатора используется рибофлавин в водорастворимой форме флавин мононуклеотида, в качестве полимеризуемого материала используется раствор метакрилированной гиалуроновой кислоты.A method for producing three-dimensional structures in the volume of a polymerizable material, characterized in that the photoactivator is irradiated with a continuous near-infrared light source that penetrates deep into the polymerizable composition, which leads to the activation of the polymerization process through non-radiative resonant energy transfer from the nanoparticle to the photoinitiator, wherein the photoactivator is molecular complex consisting of nanoparticles apkonvertiruyuschey NaYF _4: Yb ^3+, Tm ^3+, possessing anti-Stokes luminescence tion in the ultraviolet (UV) and blue region of the spectrum, as photoinitiator is used in water-soluble form of riboflavin is flavin mononucleotide, as the polymerizable material used methacrylated hyaluronic acid solution.

Images