RU2611038C2 - Improved spacer membrane for enzyme sensor in vivo - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: group of inventions relates to biotechnology. Proposed are electrode system, based on it sensor for analyte in vivo conditions concentration measuring, as well as use of acrylic and/or methacryl monomers hydrophilic copolymer as spacer membrane for said electrode system. Electrode system comprises electrode with enzyme immobilized molecules, optionally diffusion barrier, and spacer membrane, forming at least part of electrode system external layer. Spacer membrane contains acrylic and/or methacryl monomers hydrophilic copolymer. At that, hydrophilic copolymer contains from 60 to 85 mol% of hydrophilic monomers and up to 40 mol% of acrylic and/or methacryl hydrophobic monomers.

EFFECT: advantage of inventions is lower water absorption by copolymer, which increases spacer membrane mechanical stability, as well as reducing tissue reaction to implant and capsule formation inhibition, separating sensor from the surrounding tissue and total body water.

18 cl, 14 dwg, 3 tbl, 7 ex

Description

Настоящее изобретение относится к электродной системе, предназначенной для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, которая содержит электрод с иммобилизованными молекулами фермента и улучшенный диффузионный барьер, контролирующий диффузию аналита из окружающей электродную систему общей воды организма к молекулам фермента.The present invention relates to an electrode system designed to measure analyte concentration in vivo, which contains an electrode with immobilized enzyme molecules and an improved diffusion barrier that controls the diffusion of the analyte from the body’s body water surrounding the electrode system to the enzyme molecules.

Кроме того, настоящее изобретение относится к электродной системе, предназначенной для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, которая содержит электрод с иммобилизованными молекулами фермента, необязательно диффузионный барьер, контролирующий диффузию аналита из внешней среды, окружающей электродную систему, и улучшенную спейсерную мембрану, которая образует по меньшей мере часть наружного слоя электродной системы.In addition, the present invention relates to an electrode system for measuring analyte concentration in vivo, which contains an electrode with immobilized enzyme molecules, optionally a diffusion barrier controlling the diffusion of the analyte from the environment surrounding the electrode system, and an improved spacer membrane that forms at least a portion of the outer layer of the electrode system.

Датчики, содержащие имплантируемые или встраиваемые электродные системы, облегчают измерения важных с физиологической точки зрения аналитов, таких, например, как лактат или глюкоза, в организме пациента. Рабочие электроды систем такого типа имеют электропроводящие ферментные слои, в которых связаны молекулы фермента, высвобождающие носители заряда посредством каталитического превращения молекул аналита. В процессе этого генерируется электрический ток, представляющий собой измеряемый сигнал, амплитуда которого коррелирует с концентрацией аналита.Sensors containing implantable or embedded electrode systems facilitate the measurement of physiologically important analytes, such as lactate or glucose, in the patient's body. The working electrodes of systems of this type have electrically conductive enzyme layers in which enzyme molecules are bound that release charge carriers through the catalytic conversion of analyte molecules. In the process, an electric current is generated, which is a measured signal, the amplitude of which correlates with the concentration of the analyte.

Такие электродные системы описаны, например, в WO 2007/147475 и WO 2010/028708, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.Such electrode systems are described, for example, in WO 2007/147475 and WO 2010/028708, the contents of which are incorporated herein by reference.

Рабочие электроды электродной системы снабжают диффузионным барьером, который контролирует диффузию подлежащего измерению аналита из общей воды организма или ткани, окружающей электродную систему, к молекулам фермента, иммобилизованным в ферментном слое. В WO 2010/028708 описан диффузионный барьер электродной системы, представляющий собой твердый раствор по меньшей мере двух различных полимеров, предпочтительно акрилатов. Полимеры могут представлять собой сополимеры, например, сополимеры метилметакрилата и гидроксиэтилметакрилата или сополимеры бутилметакрилата и гидроксиэтилметакрилата.The working electrodes of the electrode system are equipped with a diffusion barrier that controls the diffusion of the analyte to be measured from the total body water or tissue surrounding the electrode system to the enzyme molecules immobilized in the enzyme layer. WO 2010/028708 describes the diffusion barrier of an electrode system, which is a solid solution of at least two different polymers, preferably acrylates. The polymers can be copolymers, for example, copolymers of methyl methacrylate and hydroxyethyl methacrylate or copolymers of butyl methacrylate and hydroxyethyl methacrylate.

В WO 2007/147475 описан диффузионный барьер, который состоит из полимера, имеющего цвиттер-ионную структуру. Примером такого полимера является поли(2-метакрилоксиэтилфосфорилхолин-со-н-бутилметакрилат). Цвиттер-ионный полимер можно смешивать с другим полимером, например, полиуретаном.WO 2007/147475 describes a diffusion barrier that consists of a polymer having a zwitterionic structure. An example of such a polymer is poly (2-methacryloxyethylphosphorylcholine-co-n-butyl methacrylate). The zwitterionic polymer can be mixed with another polymer, for example polyurethane.

Однако применение смесей полимеров или сополимеров имеет недостатки, заключающиеся в том, что получение смеси и нанесение ее на датчик является сложным и может оказаться проблематичным. Как правило, предназначенные для смешения полимеры растворяют по отдельности и затем полученные растворы смешивают в требуемом соотношении. Однако это может приводить к осаждению одного из компонентов и, следовательно, к технологическим проблемам, например, при осуществлении процесса распыления. Повышенные сложности возникают в том случае, когда смеси содержат полимер, обладающий ионными характеристиками, т.е. в том случае, когда один из предназначенных для смешения полимеров содержит мономер, имеющий анионные или катионные группы. При этом присутствие таких заряженных групп оказывает сильное воздействие на растворимость, затрудняя поиск растворителя, пригодного и для заряженного полимера, и для незаряженного полимера.However, the use of mixtures of polymers or copolymers has the disadvantages that obtaining the mixture and applying it to the sensor is difficult and can be problematic. Typically, the polymers intended for mixing are dissolved separately and then the resulting solutions are mixed in the required ratio. However, this can lead to the deposition of one of the components and, consequently, to technological problems, for example, during the spraying process. Increased difficulties arise when the mixtures contain a polymer having ionic characteristics, i.e. in the case when one of the polymers intended for mixing contains a monomer having anionic or cationic groups. Moreover, the presence of such charged groups has a strong effect on solubility, making it difficult to find a solvent suitable for both a charged polymer and an uncharged polymer.

В WO 2006/058779 описан датчик на ферментной основе, имеющий объединенный диффузионный и ферментный слой, который содержит по меньшей мере один полимерный материал и частицы, несущие фермент, где частицы диспегированы в полимерном материале. Полимер может содержать последовательности как гидрофильных, так и гидрофобных полимерных цепей, например, полимер может представлять собой сополимер простого полиэфира и полиуретана, характеризующийся высоким или низким поглощением воды. Применение в качестве диффузионного слоя блок-сополимеров, имеющих по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок, не заявлено.WO 2006/058779 describes an enzyme-based sensor having a combined diffusion and enzyme layer that contains at least one polymer material and particles carrying the enzyme, where the particles are dispersed in the polymer material. The polymer may contain sequences of both hydrophilic and hydrophobic polymer chains, for example, the polymer may be a copolymer of polyester and polyurethane, characterized by high or low water absorption. The use as a diffusion layer of block copolymers having at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block is not claimed.

В ЕР-А-2163190 описана электродная система, предназначенная для измерения концентрации аналита in vivo, содержащая противоэлектрод с электрическим проводником и рабочий электрод с электрическим проводником, на котором находится ферментный слой, содержащий иммобилизованные молекулы фермента. Диффузионный барьер контролирует диффузию аналита из окружающей общей воды организма к молекулам фермента. Диффузионный барьер может содержать гидрофилизованные полиуретаны, которые можно получать путем поликонденсации 4,4'-метилен-бис-(циклогексилизоцианата) и смеси диолов, которые могут представлять собой полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль. На гидрофильный полиуретановый слой можно наносить покрытие, представляющее собой спейсер, например, сополимер бутилметакрилата и 2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина. Применение в качестве диффузионного слоя блок-сополимеров, имеющих по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок, не заявлено. Не заявлено также применение гидрофильного сополимера (мет)акриловых мономеров, содержащего более 50 мол.% гидрофильных мономеров.EP-A-2163190 describes an electrode system for measuring an in vivo analyte concentration, comprising a counter electrode with an electrical conductor and a working electrode with an electrical conductor, on which an enzyme layer containing immobilized enzyme molecules is located. The diffusion barrier controls the diffusion of the analyte from the surrounding body water to the enzyme molecules. The diffusion barrier may contain hydrophilized polyurethanes, which can be obtained by polycondensation of 4,4'-methylene-bis- (cyclohexylisocyanate) and a mixture of diols, which can be polyethylene glycol and polypropylene glycol. The hydrophilic polyurethane layer can be coated with a spacer, for example, a copolymer of butyl methacrylate and 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine. The use as a diffusion layer of block copolymers having at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block is not claimed. Also not claimed is the use of a hydrophilic copolymer of (meth) acrylic monomers containing more than 50 mol.% Hydrophilic monomers.

При создании настоящего изобретения была поставлена задача разработать диффузионный барьер на электродной системе ферментного датчика in vivo, который обладает требуемыми физико-химическими характеристиками и который легко изготавливать.When creating the present invention, the task was to develop a diffusion barrier on the electrode system of the in vivo enzyme sensor, which has the required physicochemical characteristics and which is easy to manufacture.

Эта задача решается с помощью диффузионного барьера, состоящего из единственного блок-сополимера, который имеет по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок. Гидрофильные и гидрофобные блоки ковалентно связаны друг с другом. Предпочтительно блоки представляют собой блоки (мет)акрилатного полимера.This problem is solved using a diffusion barrier, consisting of a single block copolymer that has at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block. Hydrophilic and hydrophobic blocks are covalently linked to each other. Preferably, the blocks are blocks of (meth) acrylate polymer.

Диффузионный барьер на основе блок-сополимера обладает очень высокими физико-химическими характеристиками, такими как:The diffusion barrier based on a block copolymer has very high physicochemical characteristics, such as:

(I) проницаемость диффузионного барьера для подлежащего определению аналита,(I) the permeability of the diffusion barrier for the analyte to be determined,

(II) характеристики проницаемости диффузионного барьера, пригодные для кратковременного режима работы (смачиваемость) и продолжительного режима работы (дрейф датчика) электрода,(II) the permeability characteristics of the diffusion barrier, suitable for short-term operation (wettability) and continuous operation (sensor drift) of the electrode,

(III) механическая гибкость диффузионного барьера, позволяющая изготавливать предназначенные для работы in vivo датчики с удлиненными несколькими электродами,(III) the mechanical flexibility of the diffusion barrier, allowing the manufacture of in vivo sensors with elongated multiple electrodes,

(IV) эффективное включение ионных групп в диффузионный слой, т.е. плотность катионных или анионных зарядов в полимере можно эффективно регулировать, это имеет значение для отталкивания или притягивания заряженных аналитов, и/или контроля клеточной адгезии, например, моноцитов из окружающей общей воды организма или ткани.(IV) effective incorporation of ionic groups into the diffusion layer, i.e. the density of cationic or anionic charges in the polymer can be effectively controlled, this is important for the repulsion or attraction of charged analytes, and / or the control of cell adhesion, for example, monocytes from the surrounding body water or tissue.

Объектом настоящего изобретения является электродная система, предназначенная для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, содержащая электрод с иммобилизованными молекулами фермента и диффузионный барьер, который контролирует диффузию аналита из окружающей электродную систему среды к молекулам фермента, отличающаяся тем, что диффузионный барьер содержит блок-сополимер, имеющий по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок.The object of the present invention is an electrode system for measuring the concentration of analyte in vivo, containing an electrode with immobilized enzyme molecules and a diffusion barrier that controls the diffusion of the analyte from the environment surrounding the electrode system to the enzyme molecules, characterized in that the diffusion barrier contains a block copolymer having at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block.

Предпочтительно диффузионный барьер содержит единственный блок-сополимер, т.е. блок-сополимер только одного типа, имеющий по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок, т.е. не содержит другие полимеры или сополимеры. Более предпочтительно, диффузионный барьер состоит из единственного блок-сополимера, имеющего по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок.Preferably, the diffusion barrier contains a single block copolymer, i.e. a block copolymer of only one type having at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block, i.e. does not contain other polymers or copolymers. More preferably, the diffusion barrier consists of a single block copolymer having at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block.

Электродную систему, предлагаемую в настоящем изобретении, можно встраивать или имплантировать в организм, например, в организм млекопитающего, например, в организм человека. Электродную систему адаптируют для измерения требуемого аналита в общей воде организма и/или ткани организма, например во внеклеточном пространстве (интерстиции), в кровеносных или лимфатических сосудах, или в трансклеточном пространстве.The electrode system proposed in the present invention can be integrated or implanted in the body, for example, in the body of a mammal, for example, in the human body. The electrode system is adapted to measure the required analyte in the total body water and / or body tissue, for example in the extracellular space (interstitium), in the blood or lymph vessels, or in the transcellular space.

Встроенная или имплантированная электродная система пригодна для кратковременного применения, например, в течение 3-14 дней, или для длительного применения, например, в течение 6-12 месяцев. В течение периода времени, когда указанная система встроена или имплантирована, можно осуществлять определение требуемого аналита путем непрерывных или периодических измерений.The integrated or implanted electrode system is suitable for short-term use, for example, for 3-14 days, or for long-term use, for example, for 6-12 months. During the time period when said system is integrated or implanted, it is possible to determine the desired analyte by continuous or periodic measurements.

Электронная система, предлагаемая в изобретении, предпочтительно представляет собой часть ферментного нежидкостного (ENF) датчика, посредством которого определяют ферментативное превращение аналита. Предпочтительно датчик содержит рабочий электрод с иммобилизованными молекулами фермента, предназначенными для превращения аналита, в результате которого генерируется электрический сигнал. Ферменты могут присутствовать в слое, покрывающем электрод. Кроме того, могут присутствовать медиаторы окисления-восстановления (редокс-медиаторы) и/или электрокатализаторы, а также проводящие частицы и порообразователи. Такой тип электродов описан, например, в WO 2007/147475, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.The electronic system of the invention is preferably part of an enzymatic non-liquid (ENF) sensor, by which the enzymatic conversion of the analyte is determined. Preferably, the sensor comprises a working electrode with immobilized enzyme molecules designed to convert the analyte, as a result of which an electrical signal is generated. Enzymes may be present in the electrode coating layer. In addition, oxidation-reduction mediators (redox mediators) and / or electrocatalysts, as well as conductive particles and pore formers, may be present. This type of electrode is described, for example, in WO 2007/147475, the contents of which are incorporated herein by reference.

Область рабочего электрода представляет собой чувствительную область датчика. Указанная чувствительная область снабжена диффузионным барьером, который контролирует диффузию аналита из внешней среды, например, из общей воды организма и/или ткани, окружающей электродную систему, к молекулам фермента. Диффузионный барьер может представлять собой, например, наложенный на слой фермента слой покрытия, т.е. слой, который не содержит фермент. Однако для формирования диффузионного барьера допустимо также встраивать контролирующие диффузию частицы в ферментный слой. Например, можно заполнять поры в ферментном слое полимером, контролирующим диффузию молекул аналита. Толщина диффузионного барьера, как правило, составляет примерно 2-20 мкм, например, примерно 2-15 мкм или примерно 5-20 мкм, прежде всего, примерно 5-10 мкм или примерно 10-15 мкм (в сухом состоянии).The area of the working electrode is the sensitive area of the sensor. The specified sensitive region is equipped with a diffusion barrier that controls the diffusion of the analyte from the external environment, for example, from the body’s total water and / or the tissue surrounding the electrode system, to the enzyme molecules. The diffusion barrier can be, for example, a coating layer applied to the enzyme layer, i.e. a layer that does not contain an enzyme. However, to form a diffusion barrier, it is also possible to incorporate diffusion-controlling particles into the enzyme layer. For example, you can fill the pores in the enzyme layer with a polymer that controls the diffusion of analyte molecules. The thickness of the diffusion barrier, as a rule, is about 2-20 microns, for example, about 2-15 microns or about 5-20 microns, especially about 5-10 microns or about 10-15 microns (in the dry state).

Диффузионный барьер электродной системы, предлагаемой в настоящем изобретении, содержит блок-сополимер, предпочтительно единственный блок-сополимер, имеющий по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок. Блок-сополимер может содержать чередующуюся последовательность блоков, т.е. гидрофильный блок связан с гидрофобным блоком. Гидрофильные и гидрофобные блоки ковалентно связаны друг с другом в молекуле полимера. Средняя молекулярная масса полимера (в единицах массы), как правило, составляет 20-70 кДа, предпочтительно 25-60 кДа, более предпочтительно 30-50 кДа. Молярное соотношение гидрофильной и гидрофобной частей в блок-сополимере, как правило, находится в диапазоне от примерно 75% (гидрофильная) : 25% (гидрофобная) до примерно 25% (гидрофильная) : 75% (гидрофобная), в диапазоне от примерно 65% (гидрофильная) : 35% (гидрофобная) до примерно 35% (гидрофильная) : 65% (гидрофобная) или в диапазоне от примерно 60% (гидрофильная) : 40% (гидрофобная) до примерно 40% (гидрофильная) : 60% (гидрофобная).The diffusion barrier of the electrode system of the present invention comprises a block copolymer, preferably a single block copolymer having at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block. The block copolymer may comprise an alternating sequence of blocks, i.e. a hydrophilic block is associated with a hydrophobic block. Hydrophilic and hydrophobic blocks are covalently linked to each other in a polymer molecule. The average molecular weight of the polymer (in mass units) is typically 20-70 kDa, preferably 25-60 kDa, more preferably 30-50 kDa. The molar ratio of hydrophilic and hydrophobic moieties in the block copolymer is typically in the range of about 75% (hydrophilic): 25% (hydrophobic) to about 25% (hydrophilic): 75% (hydrophobic), in the range of about 65% (hydrophilic): 35% (hydrophobic) to about 35% (hydrophilic): 65% (hydrophobic) or in the range of about 60% (hydrophilic): 40% (hydrophobic) to about 40% (hydrophilic): 60% (hydrophobic )

Гидрофильный блок блок-сополимера состоит по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% и предпочтительно полностью из гидрофильных мономерных звеньев. Как правило, он состоит из 50-400, например, из 50-200 или из 150-300, предпочтительно из 100-150 или из 200-250 мономерных молекул. Гидрофобный блок блок-сополимера состоит по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% и предпочтительно полностью из гидрофобных мономерных звеньев. Как правило, он состоит из 50-300, например, из 50-200 или из 150-250, предпочтительно из 80-150 или 170-200 мономерных звеньев.The hydrophilic block of the block copolymer consists of at least 90%, at least 95%, and preferably entirely of hydrophilic monomer units. As a rule, it consists of 50-400, for example, from 50-200 or from 150-300, preferably from 100-150 or from 200-250 monomer molecules. The hydrophobic block of the block copolymer consists of at least 90%, at least 95%, and preferably entirely of hydrophobic monomer units. As a rule, it consists of 50-300, for example, from 50-200 or from 150-250, preferably from 80-150 or 170-200 monomer units.

Гидрофильные блоки и/или гидрофобные блоки предпочтительно состоят из звеньев на основе (мет)акрила. Более предпочтительно как гидрофильные блоки, так и гидрофобные блоки состоят из мономерных звеньев на основе (мет)акрила.The hydrophilic blocks and / or hydrophobic blocks preferably consist of units based on (meth) acrylic. More preferably, both hydrophilic blocks and hydrophobic blocks consist of monomeric units based on (meth) acrylic.

Гидрофильные мономерные звенья гидрофильного блока предпочтительно выбирают из гидрофильных сложных (мет)акриловых эфиров, т.е. сложных эфиров с полярной группой, т.е. группой ОН, ОСН₃ или ОС₂Н₅ в спиртовом фрагменте сложного эфира, гидрофильных (мет)акриламидов с амидной (NH₂) или N-алкил- или N,N-диалкиламидной группой, где алкильная группа содержит 1-3 атома С и необязательно гидрофильные группы, такие как ОН, ОСН₃ или ОС₂Н₅, и пригодных (мет)акриловых звеньев, несущих заряженную, например, анионную или катионную группу, таких как акриловая кислота (акрилат) или метакриловая кислота (метакрилат). Кроме того, можно применять комбинации мономерных звеньев.The hydrophilic monomer units of the hydrophilic block are preferably selected from hydrophilic (meth) acrylic esters, i.e. esters with a polar group, i.e. the group of OH, OCH ₃ or OS ₂ H ₅ in the alcohol fragment of the ester, hydrophilic (meth) acrylamides with amide (NH ₂ ) or N-alkyl or N, N-dialkylamide group, where the alkyl group contains 1-3 C atoms and optionally hydrophilic groups such as OH, OCH ₃ or OC ₂ H ₅ , and suitable (meth) acrylic units carrying a charged, for example, anionic or cationic group, such as acrylic acid (acrylate) or methacrylic acid (methacrylate). In addition, combinations of monomer units may be used.

Конкретные примеры предпочтительных мономерных звеньев для гидрофильного блока выбирают из:Specific examples of preferred monomer units for a hydrophilic block are selected from:

2-гидроксиэтилакрилата,2-hydroxyethyl acrylate,

2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА),2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA),

2-метоксиэтилакрилата,2-methoxyethyl acrylate,

2-метоксиэтилметакрилата,2-methoxyethyl methacrylate,

2-этоксиэтилакрилата,2-ethoxyethyl acrylate,

2-этоксиэтилметакрилата,2-ethoxyethyl methacrylate,

2- или 3-гидроксипропилакрилата,2- or 3-hydroxypropyl acrylate,

2- или 3-гидроксипропилметакрилата (2- или 3-ГПМА),2- or 3-hydroxypropylmethacrylate (2- or 3-GPMA),

2- или 3-метоксипропилакрилата,2- or 3-methoxypropyl acrylate,

2- или 3-метоксипропилметакрилата,2- or 3-methoxypropylmethacrylate,

2- или 3-этоксипропилакрилата,2- or 3-ethoxypropyl acrylate,

2- или 3-этоксипропилметакрилата,2- or 3-ethoxypropylmethacrylate,

1- или 2-глицерилакрилата,1- or 2-glyceryl acrylate,

1- или 2-глицерилметакрилата,1- or 2-glyceryl methacrylate,

акриламида,acrylamide

метакриламида,methacrylamide

N-алкил- или N,N-диалкилакриламида иN-alkyl or N, N-dialkyl acrylamide and

N-алкил- или N,N-диалкилметиламида, где алкил содержит 1-3 атома С, например, представляет собой метил, этил или пропил,N-alkyl- or N, N-dialkylmethylamide, where the alkyl contains 1-3 C atoms, for example, represents methyl, ethyl or propyl,

акриловой кислоты (акрилата),acrylic acid (acrylate),

метакриловой кислоты (метакрилата)methacrylic acid (methacrylate)

и их комбинаций.and their combinations.

Предпочтительными гидрофильными мономерами являются 2-гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА) и/или 2- или 3-гидроксипропилметакрилат (2-или 3-ГПМА). Более предпочтительно гидрофильный блок состоит по меньшей мере из двух различных гидрофильных мономерных звеньев. Например, он может представлять собой статистический сополимер, состоящий по меньшей мере из двух различных гидрофильных мономерных звеньев, таких как ГЭМА и 2-ГПМА.Preferred hydrophilic monomers are 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and / or 2- or 3-hydroxypropylmethacrylate (2- or 3-GPMA). More preferably, the hydrophilic block consists of at least two different hydrophilic monomer units. For example, it may be a statistical copolymer consisting of at least two different hydrophilic monomer units, such as HEMA and 2-GPMA.

Для введения в мономер ионных групп можно встраивать в гидрофильный блок заряженные мономерные звенья, такие как акриловая кислота (акрилат) и/или метакриловая кислота (метакрилат). Так, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофильный блок может состоять по меньшей мере из одного неионного гидрофильного мономерного звена (такого, например, как описанное выше) и по меньшей мере из одного ионного гидрофильного мономерного звена, где ионное мономерное звено присутствует в молярном количестве, предпочтительно составляющем 1-20 мол.%. В том случае, когда гидрофильный блок содержит ионное мономерное звено, такое как акриловая кислота или метакриловая кислота, то сополимеризацию предпочтительно осуществляют с гидрофильным мономером, выбранным из группы (мет)акриламидов, прежде всего N,N-диалкилакрил- или метакриламидов.For introduction of ionic groups into the monomer, charged monomer units such as acrylic acid (acrylate) and / or methacrylic acid (methacrylate) can be incorporated into the hydrophilic block. Thus, in a specific embodiment of the present invention, the hydrophilic block may consist of at least one nonionic hydrophilic monomer unit (such as, for example, as described above) and at least one ionic hydrophilic monomer unit, where the ionic monomer unit is present in a molar amount, preferably comprising 1-20 mol.%. In the case where the hydrophilic block contains an ionic monomer unit, such as acrylic acid or methacrylic acid, the copolymerization is preferably carried out with a hydrophilic monomer selected from the group of (meth) acrylamides, especially N, N-dialkyl acryl or methacrylamides.

Гидрофобные мономерные звенья гидрофобного блока предпочтительно выбирают из гидрофобных акриловых и/или метакриловых звеньев, мономерных звеньев на основе стирола или их комбинаций. Предпочтительно гидрофобные мономерные звенья выбирают из гидрофобных сложных (мет)акриловых эфиров, например, сложных эфиров, которые содержат спиртовый фрагмент, включающий 1-3 атома С, и не содержат гидрофильную группу.The hydrophobic monomer units of the hydrophobic block are preferably selected from hydrophobic acrylic and / or methacrylic units, styrene-based monomer units, or combinations thereof. Preferably, the hydrophobic monomer units are selected from hydrophobic (meth) acrylic esters, for example, esters that contain an alcohol moiety comprising 1 to 3 C atoms and do not contain a hydrophilic group.

Конкретные примеры мономерных звеньев для гидрофобного блока выбирают из:Specific examples of monomer units for a hydrophobic block are selected from:

метилакрилата,methyl acrylate

метилметакрилата (ММА),methyl methacrylate (MMA),

этилакрилатаethyl acrylate

этилметакрилата (ЭМА),ethyl methacrylate (EMA),

н-пропилакрилата или изопропилакрилата,n-propyl acrylate or isopropyl acrylate,

н-пропилметакрилата или изопропилметакрилата,n-propyl methacrylate or isopropyl methacrylate,

н-бутилакрилата,n-butyl acrylate,

н-бутилметакрилата (БМА),n-butyl methacrylate (BMA),

неопентилакрилата,neopentyl acrylate

неопентилметакрилатаneopentyl methacrylate

и их комбинаций.and their combinations.

Гидрофобный блок предпочтительно содержит по меньшей мере два различных гидрофобных мономерных звена, которые присутствуют, например, в виде статистического сополимера. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гидрофобный блок содержит метилметакрилат (ММА) и н-бутилметакрилат (БМА). В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения гидрофобный блок представляет собой статистический сополимер ММА и БМА. Молярное соотношение ММА и БМА предпочтительно составляет от примерно 60% (ММА) : 40% (БМА) до примерно 40% (ММА) : 60% (БМА), например, примерно 50% (ММА) : 50% (БМА). Температура стеклования гидрофобного блока предпочтительно составляет 100°С или менее, 90°С или менее, или 80°С или менее, например, примерно 40-80°С. В альтернативном варианте осуществления изобретения гидрофобный блок может состоять из стироловых звеньев, например, из полистирола, имеющего температуру стеклования примерно 95°С.The hydrophobic block preferably contains at least two different hydrophobic monomer units that are present, for example, in the form of a random copolymer. In a preferred embodiment, the hydrophobic block contains methyl methacrylate (MMA) and n-butyl methacrylate (BMA). In a most preferred embodiment, the hydrophobic block is a random copolymer of MMA and BMA. The molar ratio of MMA to BMA is preferably from about 60% (MMA): 40% (BMA) to about 40% (MMA): 60% (BMA), for example, about 50% (MMA): 50% (BMA). The glass transition temperature of the hydrophobic block is preferably 100 ° C or less, 90 ° C or less, or 80 ° C or less, for example, about 40-80 ° C. In an alternative embodiment, the hydrophobic block may consist of styrene units, for example, polystyrene, having a glass transition temperature of about 95 ° C.

Блок-сополимеры, применяемые согласно настоящему изобретению, можно изготавливать известными методами (Böker и др., Macromolecules 34, 2001, сс. 7477-7488).The block copolymers used according to the present invention can be made by known methods (Böker et al., Macromolecules 34, 2001, pp. 7477-7488).

Блок-сополимеры можно наносить на электродную систему с использованием общепринятых методов, например, путем приготовления раствора блок-сополимера в пригодном растворителе или смеси растворителей, например, в простом эфире, который наносят на предварительно изготовленную электродную систему и затем сушат.The block copolymers can be applied to the electrode system using conventional methods, for example, by preparing a solution of the block copolymer in a suitable solvent or mixture of solvents, for example, ether, which is applied to a prefabricated electrode system and then dried.

При контакте блок-сополимера с водой он характеризуется поглощением воды, которое составляет предпочтительно примерно 15-30 мас.% (в пересчете на массу полимера в сухом состоянии) при температуре 37°С и рН 7,4 (водный фосфатный буфер: 10 мМ KH₂PO₄, 10 мМ NaH₂PO₄ и 147 мМ NaCl).Upon contact of the block copolymer with water, it is characterized by water absorption, which is preferably about 15-30 wt.% (Calculated on the weight of the polymer in the dry state) at a temperature of 37 ° C and a pH of 7.4 (aqueous phosphate buffer: 10 mM KH ₂ PO ₄ , 10 mM NaH ₂ PO ₄ and 147 mM NaCl).

Помимо блок-сополимера диффузионный барьер может содержать также другие компоненты, прежде всего неполимерные компоненты, которые могут быть диспергированы и/или растворены в полимере. К указанным другим компонентам относятся пластификаторы, прежде всего биосовместимые пластификаторы, такие как три-(2-этилгексил)тримеллитат и/или глицерин.In addition to the block copolymer, the diffusion barrier may also contain other components, especially non-polymer components, which can be dispersed and / or dissolved in the polymer. These other components include plasticizers, especially biocompatible plasticizers, such as tri- (2-ethylhexyl) trimellitate and / or glycerin.

Диффузионный барьер, предлагаемый в изобретении, характеризуется высоким эффективным коэффициентом диффузии D_eff для глюкозы, который предпочтительно составляет ≥10^-10 см²/с, более предпочтительно ≥5⋅10^-10 см²/с, и еще более предпочтительно ≥10^-9 см²/с, например, вплоть до 10^-7 или 10^-8 см²/с при температуре 37°С и рН 7,4. Эффективный коэффициент диффузии предпочтительно определяют методом, описанным в примере 4, согласно уравнению:The diffusion barrier of the invention has a high effective diffusion coefficient D _eff for glucose, which is preferably ≥10 ^-10 cm ² / s, more preferably ≥5 ≥10 ^-10 cm ² / s, and even more preferably ≥10 ^-9 cm ² / s, for example, up to 10 ^-7 or 10 ^-8 cm ² / s at a temperature of 37 ° C and a pH of 7.4. The effective diffusion coefficient is preferably determined by the method described in example 4, according to the equation:

D_eff=SE_m/F⋅L_m⋅5182⋅10^-8,D _eff = SE _m / F⋅L _m ⋅5182⋅10 ^-8 ,

в котором SE_m обозначает чувствительность рабочего электрода, F обозначает площадь рабочего электрода и L_m обозначает толщину слоя диффузионного барьера. Величины SE_m и L_m можно определять согласно методу, описанному в примерах.in which SE _m denotes the sensitivity of the working electrode, F denotes the area of the working electrode and L _m denotes the thickness of the diffusion barrier layer. The values of SE _m and L _m can be determined according to the method described in the examples.

Электродную систему, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, т.е. после встраивания или имплантации в организм. Аналит может представлять собой любую молекулу или ион, присутствующий в ткани или в общей воде организма, например, кислород, диоксид углерода, соли (катионы или анионы), жиры или жировые компоненты, углеводы или углеводные компоненты, белки или белковые компоненты, или другие типы биомолекул. Наиболее предпочтительным является определение аналитов, которые могут эффективно перемещаться между общей водой организма, например, кровью, и тканью, таких как кислород, диоксид углерода, катионы натрия, анионы хлора, глюкоза, мочевина, глицерин, лактат и пируват.The electrode system of the present invention can be used to measure analyte concentration in vivo, i.e. after incorporation or implantation into the body. An analyte can be any molecule or ion present in the tissue or in the body’s total water, for example, oxygen, carbon dioxide, salts (cations or anions), fats or fatty components, carbohydrates or carbohydrate components, proteins or protein components, or other types biomolecules. Most preferred is the determination of analytes that can efficiently move between the body’s total water, such as blood, and tissue, such as oxygen, carbon dioxide, sodium cations, chlorine anions, glucose, urea, glycerin, lactate and pyruvate.

Электродная система содержит фермент, иммобилизованный на электроде. Фермент пригоден для определения требуемого аналита. Предпочтительно фермент обладает способностью осуществлять каталитическое превращение аналита и тем самым генерировать электрический сигнал, который можно обнаруживать электрическим проводником рабочего электрода. Фермент, предназначенный для измерения аналита, предпочтительно представляет собой оксидазу, например, глюкозооксидазу или лактатоксидазу, или дегидрогеназу, например, глюкозодегидрогеназу или лактатдегидрогеназу. Помимо фермента ферментный слой может содержать также электрокатализатор или редокс-медиатор, который способствует переносу электронов к проводящим компонентам рабочего электрода, например, частицы графита. Пригодными электрокатализаторами являются оксиды металлов, такие как диоксид марганца, или металлорганические соединения, такие как фталоцианин кобальта. В предпочтительном варианте осуществления изобретения редокс-медиатор обладает способностью расщеплять пероксид водорода, тем самым препятствуя истощению кислорода в среде, окружающей рабочий электрод. В различных вариантах осуществления изобретения редокс-медиатор может быть ковалентно связан с ферментом и благодаря этому осуществлять непосредственно перенос электронов к рабочему электроду. Пригодными редокс-медиаторами для непосредственного переноса электронов являются простетические группы, такие как пирролохинолинхинон (ПХХ), флавинадениндинуклеотид (ФАД) или другие известные простетические группы. Ферменты, иммобилизованные на электродах, представляют собой, например, ферменты, описанные в WO 2007/147475, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.The electrode system contains an enzyme immobilized on the electrode. The enzyme is suitable for determining the desired analyte. Preferably, the enzyme has the ability to carry out the catalytic conversion of the analyte and thereby generate an electrical signal that can be detected by the electrical conductor of the working electrode. The enzyme for measuring the analyte is preferably an oxidase, for example, glucose oxidase or lactate oxidase, or a dehydrogenase, for example, glucose dehydrogenase or lactate dehydrogenase. In addition to the enzyme, the enzyme layer may also contain an electrocatalyst or a redox mediator, which facilitates the transfer of electrons to the conductive components of the working electrode, for example, graphite particles. Suitable electrocatalysts are metal oxides, such as manganese dioxide, or organometallic compounds, such as cobalt phthalocyanine. In a preferred embodiment, the redox mediator has the ability to cleave hydrogen peroxide, thereby preventing oxygen depletion in the environment surrounding the working electrode. In various embodiments of the invention, the redox mediator can be covalently linked to the enzyme and thereby directly transfer electrons to the working electrode. Suitable redox mediators for direct electron transfer are prosthetic groups such as pyrroloquinoline quinone (PX), flavin adenine dinucleotide (FAD) or other known prosthetic groups. Enzymes immobilized on electrodes are, for example, the enzymes described in WO 2007/147475, the contents of which are incorporated herein by reference.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения электродная система содержит противоэлектрод с электрическим проводником и рабочий электрод с электрическим проводником, на котором расположены ферментный слой и диффузионный барьер. Ферментный слой предпочтительно располагают на проводнике в форме нескольких полей на расстоянии друг от друга, составляющем, например, по меньшей мере 0,3 мм или по меньшей мере 0,5 мм. Индивидуальные поля рабочего электрода могут образовывать ряды индивидуальных рабочих электродов. На расположенные между указанными полями области проводника рабочего электрода можно наносить покрытие в виде изолирующего слоя. Посредством размещения полей ферментного слоя поверх окон в электроизолирующем слое можно улучшать соотношение сигнала к шуму. Такое расположение описано в WO 2010/028708, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.In a preferred embodiment of the invention, the electrode system comprises a counter electrode with an electrical conductor and a working electrode with an electrical conductor, on which the enzyme layer and the diffusion barrier are located. The enzyme layer is preferably placed on the conductor in the form of several fields at a distance from each other, for example, at least 0.3 mm or at least 0.5 mm. The individual fields of the working electrode can form rows of individual working electrodes. The regions of the conductor of the working electrode located between these fields can be coated with an insulating layer. By placing the fields of the enzyme layer on top of the windows in the electrically insulating layer, the signal to noise ratio can be improved. Such an arrangement is described in WO 2010/028708, the contents of which are incorporated herein by reference.

Электродная система, предлагаемая в изобретении, может дополнительно содержать референс-электрод, который обладает способностью поставлять референс-потенциал для рабочего электрода, например, референс-электрод из Ag/Ag-Cl. Кроме того, электродная система, предлагаемая в изобретении, может иметь дополнительные противоэлектроды и/или рабочие электроды.The electrode system of the invention may further comprise a reference electrode that is capable of supplying a reference potential for the working electrode, for example, a reference electrode of Ag / Ag-Cl. In addition, the electrode system proposed in the invention may have additional counter electrodes and / or working electrodes.

Электродная система может представлять собой часть датчика, например, будучи присоединенной к стабилизатору напряжения и усилителю для усиления измеряемых электродной системой сигналов. Датчик предпочтительно представляет собой ферментный нежидкостной (ENF) датчик, более предпочтительно электрохимический ENF-датчик. Электроды электродной системы можно располагать на субстрате, на котором находится стабилизатор напряжения, или их можно присоединять к схемной плате, на которой находится стабилизатор напряжения.The electrode system may be part of a sensor, for example, being connected to a voltage stabilizer and amplifier to amplify the signals measured by the electrode system. The sensor is preferably an enzymatic non-liquid (ENF) sensor, more preferably an electrochemical ENF sensor. The electrodes of the electrode system can be placed on the substrate on which the voltage stabilizer is located, or they can be connected to the circuit board on which the voltage stabilizer is located.

Следующим объектом изобретения является применение блок-сополимера, содержащего по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок, в качестве диффузионного барьера для несущего фермент электрода. Блок-сополимер предпочтительно представляет собой, как описано выше, например, единственный блок-сополимер. Диффузионный барьер и несущий фермент электрод также предпочтительно представляют собой описанные выше элементы.A further object of the invention is the use of a block copolymer containing at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block as a diffusion barrier for an enzyme-carrying electrode. The block copolymer is preferably, as described above, for example, a single block copolymer. The diffusion barrier and the enzyme-carrying electrode are also preferably the elements described above.

Дополнительные подробности и преимущества изобретения пояснены с помощью представленных в качестве примеров вариантов осуществления изобретения со ссылкой на прилагаемые чертежи.Further details and advantages of the invention are explained with reference to the exemplary embodiments of the invention with reference to the accompanying drawings.

На чертежах показано:The drawings show:

на фиг. 1 - пример варианта осуществления электродной системы, предлагаемой в изобретении;in FIG. 1 is an example of an embodiment of an electrode system of the invention;

на фиг. 2 - более подробное изображение конструкции, представленной на фиг. 1;in FIG. 2 is a more detailed view of the structure of FIG. one;

на фиг. 3 - еще одно более подробное изображение конструкции, представленной на фиг. 1;in FIG. 3 is another more detailed illustration of the structure shown in FIG. one;

на фиг. 4 - сечение по линии разреза СС конструкции, представленной на фиг. 2;in FIG. 4 is a section along the section line CC of the structure shown in FIG. 2;

на фиг. 5 - чувствительность (с указанием стандартных отклонений) четырех глюкозных датчиков (при концентрации глюкозы 10 мМ), обеспечиваемая при использовании различных блок-сополимеров (В, Е, Г, Б) в качестве барьерных слоев;in FIG. 5 - sensitivity (indicating standard deviations) of four glucose sensors (at a glucose concentration of 10 mM) provided by using various block copolymers (B, E, G, B) as barrier layers;

на фиг. 6 - дрейф датчика для четырех глюкозных датчиков, обеспечиваемый при использовании различных блок-сополимеров (А, В, Г, Е) в качестве барьерных слоев;in FIG. 6 - sensor drift for four glucose sensors, provided by using various block copolymers (A, B, G, E) as barrier layers;

на фиг. 7 - проводимость блок-сополимера А в зависимости от времени; (2 эксперимента).in FIG. 7 - the conductivity of the block copolymer A as a function of time; (2 experiments).

на фиг. 8 - проводимость блок-сополимера F в зависимости от времени; (3 эксперимента).in FIG. 8 - conductivity of the block copolymer F as a function of time; (3 experiments).

на фиг. 9 - проводимость блок-сополимера Н в зависимости от времени при толщине слоя 2,77 мкм или 4,43 мкм соответственно;in FIG. 9 - the conductivity of the block copolymer H as a function of time with a layer thickness of 2.77 μm or 4.43 μm, respectively;

на фиг. 10 - адгезия фибриногена к различным полимерам спейсерной мембраны in-vitro (Adapt® и Eudragit E100) по сравнению с адгезией к пластине без покрытия (контроль).in FIG. 10 - adhesion of fibrinogen to various in-vitro spacer membrane polymers (Adapt® and Eudragit E100) compared to adhesion to an uncoated plate (control).

на фиг. 11 - экспрессия поверхностного белка CD54 клетками линии ТНР-1 после инкубации с датчиками, покрытых спейсерной мембраной (Adapt® и Lipidure СМ5206), или без покрытия (контроль представляет собой необработанные клетки);in FIG. 11 - expression of surface CD54 protein by THP-1 cells after incubation with sensors coated with a spacer membrane (Adapt® and Lipidure CM5206) or without coating (the control is untreated cells);

на фиг. 12а и 12б - секреция цитокина IL-8 и МСР-1 соответственно клетками линии ТНР-1 после инкубации с датчиками, покрытыми спейсерной мембраной (Adapt® и Lipidure СМ5206), или без покрытия (контроль представляет собой необработанные клетки);in FIG. 12a and 12b show the secretion of the cytokine IL-8 and MCP-1, respectively, by THP-1 cells after incubation with sensors coated with a spacer membrane (Adapt® and Lipidure CM5206) or without coating (the control is untreated cells);

на фиг. 13 - секреция цитокина IL-8 ТНР-1 клетками линии ТНР-1 после инкубации с планшетами для тканевых культур, покрытых спейсерной мембраной (Adapt®, Lipidure СМ5206 и Eudragit E100), или без покрытия (полистирол), и с дополнительным слоем фибриногена;in FIG. 13 - secretion of the IL-8 THP-1 cytokine by THP-1 cells after incubation with tissue culture plates coated with a spacer membrane (Adapt®, Lipidure CM5206 and Eudragit E100), or without coating (polystyrene), and with an additional layer of fibrinogen;

на фиг. 14 - гемолиз после инкубации с датчиками, покрытыми спейсерной мембраной (Adapt® и Lipidure СМ5206), или без покрытия по сравнению со спейсерным полимером Adapt® без датчика (отрицательный контроль представляет собой только инкубационную среду; положительный контроль обозначает 100%-ный осмотический лизис).in FIG. 14 - hemolysis after incubation with sensors coated with a spacer membrane (Adapt® and Lipidure CM5206) or without coating compared to an Adapt® spacer polymer without a sensor (negative control represents only incubation medium; positive control means 100% osmotic lysis) .

На фиг. 1 представлен в качестве примера вариант осуществления электродной системы, предназначенной для встраивания в ткань организма человека или животного, например в кожу или подкожную жировую ткань. Увеличенное подробное изображение области А представлено на фиг. 2, увеличенное подробное изображение области Б представлено на фиг. 3. На фиг. 4 представлен соответствующий вид сечения вдоль линии разреза СС, показанной на фиг. 2.In FIG. 1 shows, by way of example, an embodiment of an electrode system for incorporating into a tissue of a human or animal body, for example, into skin or subcutaneous adipose tissue. An enlarged detailed image of region A is shown in FIG. 2, an enlarged detailed image of region B is shown in FIG. 3. In FIG. 4 is a corresponding sectional view along the section line CC shown in FIG. 2.

Представленная электродная система имеет рабочий электрод 1, противоэлектрод 2 и референс-электрод 3. Электрические проводники электродов 1а, 2а, 3а размещены в форме металлических токопроводящих дорожек, предпочтительно изготовленных из палладия или золота, на субстрате 4. В представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения субстрат 4 представляет собой гибкую пластиковую пластину, например, сделанную из сложного полиэфира. Субстрат 4 имеет толщину менее 0,5 мм, например от 100 до 300 мкм, следовательно, он легко поддается изгибу и поэтому после его встраивания может адаптироваться к перемещениям окружающих тканей организма. Субстрат 4 имеет узкий стержень, позволяющий вводить его в ткань организма пациента, и широкую головку для присоединения к электронной системе, расположенной вне организма. Стержень субстрата 4 предпочтительно имеет длину, равную по меньшей мере 1 см, прежде всего от 2 до 5 см.The present electrode system has a working electrode 1, a counter electrode 2 and a reference electrode 3. The electrical conductors of the electrodes 1a, 2a, 3a are placed in the form of metal conductive paths, preferably made of palladium or gold, on the substrate 4. In an exemplary embodiment of the invention substrate 4 is a flexible plastic plate, for example, made of polyester. The substrate 4 has a thickness of less than 0.5 mm, for example from 100 to 300 microns, therefore, it is easily amenable to bending and therefore, after its incorporation, it can adapt to the movements of the surrounding body tissues. The substrate 4 has a narrow rod that allows you to enter it into the tissue of the patient’s body, and a wide head for attachment to an electronic system located outside the body. The core of the substrate 4 preferably has a length of at least 1 cm, especially from 2 to 5 cm.

В представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения одна часть измерительного устройства, а именно, головка субстрата, при его применении выступает из тела пациента. Однако в альтернативном варианте можно также имплантировать измерительное устройство целиком и передавать измеряемые данные беспроводным путем в приемник, размещенный вне тела.In an exemplary embodiment of the invention, one part of the measuring device, namely the substrate head, protrudes from the patient’s body when used. However, in an alternative embodiment, it is also possible to implant the entire measuring device and transmit the measured data wirelessly to a receiver located outside the body.

Рабочий электрод 1 несет ферментный слой 5, который содержит иммобилизованные молекулы фермента, требуемые для каталитического превращения аналита. Ферментный слой 5 можно наносить, например, в форме отвердевающей пасты, содержащей углеродные частицы, полимерный связующий агент, редокс-медиатор или электрокатализатор и молекулы фермента. Подробное описание получения ферментного слоя 5 указанного типа изложено, например, в WO 2007/147475, на которую сделана ссылка в указанном контексте.The working electrode 1 carries an enzyme layer 5, which contains the immobilized enzyme molecules required for the catalytic conversion of the analyte. The enzyme layer 5 can be applied, for example, in the form of a hardening paste containing carbon particles, a polymeric binder, a redox mediator or an electrocatalyst and enzyme molecules. A detailed description of the preparation of the enzyme layer 5 of this type is set forth, for example, in WO 2007/147475, which is referred to in this context.

В представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения ферментный слой 5 нанесен на проводник 1а рабочего электрода 1 не непрерывно, а в форме индивидуальных полей, размещенных на некотором расстоянии друг от друга. Индивидуальные поля ферментного слоя 5 в представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения расположены в виде рядов.In an exemplary embodiment of the invention, the enzyme layer 5 is applied to the conductor 1a of the working electrode 1 not continuously, but in the form of individual fields placed at some distance from each other. The individual fields of the enzyme layer 5 in an exemplary embodiment are arranged in rows.

На проводнике 1а рабочего электрода 1 имеются узкие области между полями ферментного слоя, которые особенно четко видны на фиг. 2. Контур проводника 2а противоэлектрода 2 отслеживает контур проводника 1а рабочего электрода 1. Такой подход приводит к интеркалирующему или переплетенному взаимному расположению рабочего электрода 1 и противоэлектрода 2, что является выгодным, поскольку обеспечивает короткие токопроводящие дорожки и низкую плотность тока.On the conductor 1a of the working electrode 1 there are narrow regions between the fields of the enzyme layer, which are particularly clearly visible in FIG. 2. The contour of conductor 2a of counter electrode 2 traces the contour of conductor 1a of working electrode 1. This approach leads to an intercalating or interlaced relative position of working electrode 1 and counter electrode 2, which is advantageous because it provides short current paths and low current density.

Для увеличения эффективной поверхности на противоэлектрод 2 можно наносить пористый электропроводящий слой 6, который размещают в форме индивидуальных полей на проводнике 2а противоэлектрода 2. Подобно ферментному слою 5 рабочего электрода 1, указанный слой 6 можно наносить в форме отвердевающей пасты, содержащей углеродные частицы и полимерный связующий агент. Поля слоя 6 предпочтительно имеют такие же размеры, что и поля ферментного слоя 5, хотя это не является обязательным. Однако так же, как и в предыдущем варианте, следует принимать меры по увеличению поверхности противоэлектрода, и можно создавать противоэлектрод 2 с линейной электропроводящей дорожкой без какого-либо покрытия или с покрытием из описанного блок-сополимера и необязательно спейсер.To increase the effective surface, a porous conductive layer 6 can be applied to the counter electrode 2, which is placed in the form of individual fields on the conductor 2a of the counter electrode 2. Like the enzyme layer 5 of the working electrode 1, this layer 6 can be applied in the form of a hardening paste containing carbon particles and a polymer binder agent. The fields of the layer 6 are preferably the same dimensions as the fields of the enzyme layer 5, although this is not necessary. However, as in the previous embodiment, measures should be taken to increase the surface of the counter electrode, and it is possible to create a counter electrode 2 with a linear electrically conductive track without any coating or coated with the described block copolymer and optionally a spacer.

Референс-электрод 3 размещают между проводником 1а рабочего электрода 1 и проводником 2а противоэлектрода 2. Референс-электрод, представленный на фиг. 3, состоит из проводника 3а, на котором размещено поле 3б из электропроводящей пасты серебро/хлорид серебра.The reference electrode 3 is placed between the conductor 1a of the working electrode 1 and the conductor 2a of the counter electrode 2. The reference electrode shown in FIG. 3, consists of a conductor 3a, on which is placed a field 3b of an electrically conductive paste silver / silver chloride.

На фиг. 4 представлено схематическое изображение сечения вдоль линии разреза СС, указанной на фиг. 2. Линия разреза СС проходит через одно из ферментных полей 5 рабочего электрода 1 и между полями проводящего слоя 6 противоэлектрода 2. Между полями ферментного слоя 5 на проводник 1а рабочего электрода 1 можно наносить покрытие из электроизолирующего слоя 7, так же, как и на проводник 2а противоэлектрода 2, между областями проводящих слоев 6, для того чтобы предупреждать создающие помехи реакции, которые в противном случае могут катализироваться металлом электропроводящих дорожек 1а, 2а. Следовательно, поля ферментного слоя 5 размещают в окнах в изолирующем слое 7. Аналогично этому поля проводящего слоя 6 на противоэлектроде 2 можно также помещать поверх окон в изолирующем слое 7.In FIG. 4 is a schematic representation of a section along the section line CC indicated in FIG. 2. The CC cutting line passes through one of the enzyme fields 5 of the working electrode 1 and between the fields of the conductive layer 6 of the counter electrode 2. Between the fields of the enzyme layer 5, the conductor 1a of the working electrode 1 can be coated with an electrically insulating layer 7, just like the conductor 2a of the counter electrode 2, between the regions of the conductive layers 6, in order to prevent interfering reactions that might otherwise be catalyzed by the metal of the electrically conductive tracks 1a, 2a. Therefore, the fields of the enzyme layer 5 are placed in the windows in the insulating layer 7. Similarly, the fields of the conductive layer 6 on the counter electrode 2 can also be placed on top of the windows in the insulating layer 7.

На ферментный слой 5 наносят покрытие из покрывающего слоя 8, которое обладает диффузионным сопротивлением для подлежащего анализу аналита и следовательно действует в качестве диффузионного барьера. Диффузионный барьер 8 состоит из единственного сополимера, описанного выше, с чередующимися гидрофильными и гидрофобными блоками.The enzyme layer 5 is coated with a coating layer 8, which has diffusion resistance for the analyte to be analyzed and therefore acts as a diffusion barrier. The diffusion barrier 8 consists of the only copolymer described above, with alternating hydrophilic and hydrophobic blocks.

Предпочтительно толщина покрывающего слоя 8 составляет, например, от 3 до 30 мкм, прежде всего примерно 5-10 мкм или примерно 10-15 мкм. Благодаря своему диффузионному сопротивлению покрывающий слой 8 позволяет меньшему количеству молекул аналита достигать ферментного слоя 5 в единицу времени. Таким образом, покрывающий слой 8 снижает скорость, с которой происходит превращение молекул аналита, и, следовательно, противодействует истощению концентрации аналита в среде, окружающей рабочий электрод.Preferably, the thickness of the coating layer 8 is, for example, from 3 to 30 microns, especially about 5-10 microns or about 10-15 microns. Due to its diffusion resistance, the coating layer 8 allows a smaller number of analyte molecules to reach the enzyme layer 5 per unit time. Thus, the coating layer 8 reduces the rate at which the analyte molecules are converted, and therefore counteracts the depletion of the analyte concentration in the environment surrounding the working electrode.

Покрывающий слой 8 непрерывно простирается практически по всей площади проводника 1а рабочего электрода 1. На покрывающий слой 8 можно помещать биосовместимую мембрану в качестве спейсера 9, который устанавливает минимальное расстояние между ферментным слоем 5 и клетками окружающей ткани организма. Преимущество такого подхода состоит в том, что он позволяет создать резервуар для молекул аналита, из которого молекулы аналита могут поступать в соответствующее поле ферментного слоя 5 в случае кратковременного нарушения жидкостного обмена в среде, окружающей поле ферментного слоя 5. Если обмен общей воды организма в среде, окружающей электродную систему, кратковременно нарушается или даже прекращается, то молекулы аналита, запасенные в спейсере 9, продолжают диффундировать к ферментному слою 5 рабочего электрода 1, где происходит их превращение. Таким образом, спейсер 9 обеспечивает то, что заметное истощение концентрации аналита и соответствующее искажение результатов измерений происходит только по истечении существенно более длительного периода времени. В представленном в качестве примера варианте осуществления изобретения мембрана, образующая спейсер 9, покрывает также противоэлектрод 2 и референс-электрод 3.The coating layer 8 continuously extends over almost the entire area of the conductor 1a of the working electrode 1. A biocompatible membrane can be placed on the coating layer 8 as a spacer 9, which sets the minimum distance between the enzyme layer 5 and the cells of the surrounding body tissue. The advantage of this approach is that it allows you to create a reservoir for analyte molecules, from which analyte molecules can enter the corresponding field of the enzyme layer 5 in the event of a short-term disturbance of fluid exchange in the environment surrounding the field of the enzyme layer 5. If the exchange of total body water in the environment surrounding the electrode system is broken for a short time or even stopped, then the analyte molecules stored in the spacer 9 continue to diffuse to the enzyme layer 5 of the working electrode 1, where they pre rotation. Thus, the spacer 9 ensures that a noticeable depletion of the analyte concentration and a corresponding distortion of the measurement results occurs only after a significantly longer period of time. In an exemplary embodiment, the membrane forming the spacer 9 also covers the counter electrode 2 and the reference electrode 3.

Спейсерная мембрана 9 может, например, представлять собой диализирующую мембрану. В контексте настоящего изобретения под диализирующей мембраной понимают мембрану, которая не проницаема для молекул, размер которых превышает определенный максимальный размер. Диализирующую мембрану можно изготавливать заранее с помощью отдельного процесса производства, и затем ее можно накладывать при изготовлении электродной системы. Максимальный размер молекул, для которых диализирующая мембрана является проницаемой, выбирают таким образом, чтобы она могла пропускать молекулы аналита, удерживая при этом более крупные молекулы.The spacer membrane 9 may, for example, be a dialysis membrane. In the context of the present invention, a dialysis membrane is understood to mean a membrane that is not permeable to molecules whose size exceeds a certain maximum size. The dialysis membrane can be made in advance using a separate manufacturing process, and then it can be applied in the manufacture of the electrode system. The maximum size of the molecules for which the dialysis membrane is permeable is chosen so that it can pass analyte molecules while retaining larger molecules.

В альтернативном варианте вместо диализирующей мембраны на электродную систему можно наносить в качестве спейсерной мембраны 9 покрытие, изготовленное из обладающего высокой проницаемостью для аналита и воды полимера, например, на основе полиуретана или акрилата.Alternatively, instead of a dialysis membrane, a coating made of a polymer having high permeability for analyte and water, for example, based on polyurethane or acrylate, can be applied to the electrode system as a spacer membrane 9.

Предпочтительно спейсер изготавливают из сополимера (мет)акрилатов. Предпочтительно спейсерная мембрана состоит из сополимера по меньшей мере 2 или 3 (мет)акрилатов. Более предпочтительно спейсерная мембрана содержит более 50 мол.%, по меньшей мере 60 мол.% или по меньшей мере 70 мол.% гидрофильных мономерных звеньев, например, ГЭМА и/или 2-ГПМА, и вплоть до 40 мол.% или вплоть до 30 мол.% гидрофобных звеньев, например, БМА и/или ММА. Спейсер может представлять собой статистический или блок-сополимер. Наиболее предпочтительная спейсерная мембрана содержит ММА или БМА в качестве гидрофобных фрагментов и 2-ГЭМА и/или 2-ГПМА в качестве гидрофильных фрагментов. Предпочтительно на долю гидрофильных мономеров ГЭМА и/или ГПМА приходится от 80 мол.% до 85 мол.%, а на долю гидрофобных компонентов ММА и/или БМА приходится от 15 мол.% до 20 мол.%.Preferably, the spacer is made from a copolymer of (meth) acrylates. Preferably, the spacer membrane consists of a copolymer of at least 2 or 3 (meth) acrylates. More preferably, the spacer membrane contains more than 50 mol%, at least 60 mol% or at least 70 mol% of hydrophilic monomer units, for example, HEMA and / or 2-GPMA, and up to 40 mol% or up to 30 mol.% Hydrophobic units, for example, BMA and / or MMA. The spacer may be a statistical or block copolymer. The most preferred spacer membrane contains MMA or BMA as hydrophobic fragments and 2-HEMA and / or 2-GPMA as hydrophilic fragments. Preferably, the hydrophilic monomers of HEMA and / or GPMA comprise from 80 mol% to 85 mol%, and the hydrophobic components of MMA and / or BMA comprise from 15 mol% to 20 mol%.

Наиболее предпочтительную спейсерную мембрану, предлагаемую в изобретении, изготавливают из сополимера Adapt® (фирма BioInteractions Ltd, Ридинг, Великобритания). Adapt® содержит БМА в качестве гидрофобного фрагмента и 2-ГЭМА и 2-ГПМА в качестве гидрофильных фрагментов, при этом на долю гидрофильных мономеров 2-ГЭМА приходится примерно 80 мол.%.The most preferred spacer membrane of the invention is made from Adapt® copolymer (BioInteractions Ltd, Reading, UK). Adapt® contains BMA as a hydrophobic moiety and 2-HEMA and 2-GPMA as hydrophilic moieties, with approximately 80 mol% of hydrophilic 2-HEMA monomers.

Спейсерная мембрана обладает очень высокой проницаемостью для аналита, т.е. это существенно снижает чувствительность на единицу площади рабочего электрода, например, на 20% или менее, или на 5% или менее, при толщине слоя менее чем примерно 20 мкм, предпочтительно менее чем примерно 5 мкм. Наиболее предпочтительная толщина спейсерной мембраны составляет от примерно 1 до примерно 3 мкм.The spacer membrane has a very high permeability for the analyte, i.e. this significantly reduces the sensitivity per unit area of the working electrode, for example, by 20% or less, or 5% or less, with a layer thickness of less than about 20 microns, preferably less than about 5 microns. The most preferred thickness of the spacer membrane is from about 1 to about 3 microns.

Ферментный слой 5 электродной системы может содержать в качестве каталитического редокс-медиатора частицы оксида металла, предпочтительно частицы диоксида марганца. Диоксид марганца осуществляет каталитическое превращение образующегося пероксида водорода, например, при ферментативном окислении глюкозы и других биоаналитов. В процессе расщепления пероксида водорода частицы диоксида марганца переносят электроны к проводящим компонентам рабочего электрода 1, например, к графитовым частицам, присутствующим в ферментном слое 5. Каталитическое расщепление пероксида водорода противодействует любому снижению концентрации кислорода в ферментном слое 5. Преимуществом является то, что в этом случае конверсия подлежащего обнаружению аналита в ферментном слое 5 не должна ограничиваться местной концентрацией кислорода. Таким образом, применение каталитического редокс-медиатора препятствует искажению результата измерения, обусловленному снижением концентрации кислорода. Другое преимущество каталитического редокс-медиатора заключается в том, что он препятствует образованию повреждающих клетку концентраций пероксида водорода.The enzyme layer 5 of the electrode system may contain metal oxide particles, preferably manganese dioxide particles, as a catalytic redox mediator. Manganese dioxide catalyzes the formation of hydrogen peroxide, for example, during the enzymatic oxidation of glucose and other bioanalites. During the decomposition of hydrogen peroxide, manganese dioxide particles transfer electrons to the conductive components of the working electrode 1, for example, to graphite particles present in the enzyme layer 5. The catalytic decomposition of hydrogen peroxide counteracts any decrease in the oxygen concentration in the enzyme layer 5. The advantage is that in this in the case of conversion of the analyte to be detected in the enzyme layer 5 should not be limited to local oxygen concentration. Thus, the use of a catalytic redox mediator prevents distortion of the measurement result due to a decrease in oxygen concentration. Another advantage of the catalytic redox mediator is that it prevents the formation of cell-damaging hydrogen peroxide concentrations.

Предпочтительный представленный в настоящем описании полимер, образующий спейсерную мембрану, можно применять в качестве наружного покрытия для диффузионного барьера, предлагаемого в настоящем изобретении, а также в качестве наружного покрытия электродной системы в целом, прежде всего электродной системы, предназначенной для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, которая содержит электрод с иммобилизованными молекулами фермента и диффузионный барьер, контролирующий диффузию аналита из окружающей электродную систему среды к молекулам фермента. Так, спейсерную мембрану можно размещать на диффузионном барьере, однако спейсерную мембрану можно размещать также непосредственно на ферментном слое. В указанном последнем случае спейсерная мембрана может функционировать также в качестве самого диффузионного барьера и замедлять диффузию молекул аналита к ферментному слою.The preferred spacer membrane-forming polymer described herein can be used as an outer coating for the diffusion barrier of the present invention, and also as an outer coating for the electrode system as a whole, especially an electrode system for measuring analyte concentration under in vivo, which contains an electrode with immobilized enzyme molecules and a diffusion barrier that controls the diffusion of the analyte from the environment surrounding the electrode system to the molecules of the enzyme. So, the spacer membrane can be placed on the diffusion barrier, however, the spacer membrane can also be placed directly on the enzyme layer. In the latter case, the spacer membrane can also function as the diffusion barrier itself and slow down the diffusion of analyte molecules to the enzyme layer.

Когда электродную систему, предлагаемую в изобретении, встраивают или имплантируют в организм, то спейсерная мембрана представляет собой поверхность раздела между имплантированным датчиком и окружающей общей водой организма или тканью. Следовательно, спейсерная мембрана, предлагаемая в изобретении, должна быть механически прочной, чтобы при воздействии общей воды организма или ткани, она не деформировалась или не отсоединялась от датчика. Для этой цели необходимо ограничивать поглощение воды сополимером, образующим спейсерную мембрану, и связанное с этим набухание сополимера, несмотря на присущую сополимеру гидрофильность.When the electrode system of the invention is embedded or implanted in the body, the spacer membrane is the interface between the implanted sensor and the surrounding body water or tissue. Therefore, the spacer membrane proposed in the invention must be mechanically strong so that when exposed to total body water or tissue, it does not deform or detach from the sensor. For this purpose, it is necessary to limit the absorption of water by the copolymer forming the spacer membrane, and the associated swelling of the copolymer, despite the inherent hydrophilicity of the copolymer.

Предпочтительно относительное поглощение воды сополимером спейсерной мембраны не должно превышать 50 мас.%, предпочтительно 40 мас.%, более предпочтительно 30 мас.%, в пересчете на общее содержание сополимера. В контексте настоящего изобретения измерение относительного поглощения воды осуществляют, подвергая сухой сополимер воздействию в течение 48 ч при температуре 37°С избытка фосфатного буфера (рН 7,4). Относительное поглощение воды (WU%) предпочтительно определяют согласно уравнению:Preferably, the relative absorption of water by the spacer membrane copolymer should not exceed 50 wt.%, Preferably 40 wt.%, More preferably 30 wt.%, Based on the total copolymer content. In the context of the present invention, the measurement of the relative absorption of water is carried out by exposing the dry copolymer to an excess of phosphate buffer (pH 7.4) for 48 hours at 37 ° C. The relative absorption of water (WU%) is preferably determined according to the equation:

WU%=(m₂-m₁)/m₁×100,WU% = (m ₂ -m ₁ ) / m ₁ × 100,

в котором m₁ и m₂ обозначают массу сухого сополимера и массу сополимера после гидратации, проведенной в указанных выше условиях, соответственно.in which m ₁ and m ₂ denote the mass of the dry copolymer and the mass of the copolymer after hydration carried out under the above conditions, respectively.

При создании настоящего изобретения было установлено, что предпочтительная спейсерная мембрана, изготовленная из сополимера Adapt®, поглощает в течение 48 ч при 37°С 33±1,8 мас.% фосфатного буфера (рН 7,4) в пересчете на ее собственную массу. В тех же самых условиях мембрана из полимера Lipidure СМ5206 (фирма NOF Corporation, Япония) поглощает 157±9,7 мас.% фосфатного буфера в пересчете на ее собственную массу. Более низкое поглощение воды полимером является преимуществом, поскольку повышает механическую стабильность спейсерной мембраны, предлагаемой в настоящем изобретении. В отличие от этого, Lipidure СМ5206 характеризуется более высоким поглощением воды и набухает до состояния гидрогеля, который является более хрупким, легко деформируемым или отделяющимся, прежде всего в тех случаях, когда он нанесен на электродную систему ферментного датчика для измерений in vivo.When creating the present invention, it was found that the preferred spacer membrane made from Adapt® copolymer absorbs within 33 hours at 37 ° C 33 ± 1.8 wt.% Phosphate buffer (pH 7.4) in terms of its own weight. Under the same conditions, a Lipidure CM5206 polymer membrane (NOF Corporation, Japan) absorbs 157 ± 9.7% by weight of phosphate buffer, calculated on its own weight. Lower polymer water absorption is an advantage because it increases the mechanical stability of the spacer membrane of the present invention. In contrast, Lipidure CM5206 is characterized by a higher absorption of water and swells to the state of a hydrogel, which is more fragile, easily deformable or detachable, especially when it is applied to the electrode system of an enzyme sensor for in vivo measurements.

Кроме того, в процессе встраивания и применения электродной системы спейсер находится в непосредственном контакте с тканью и/или общей водой организма, такой как интерстициальная жидкость или кровь, которая содержит биомолекулы, такие как белки и клетки. Предпочтительно спейсерная мембрана должна защищать встроенный и имплантированный датчик в ткани и/или общей воде организма и тем самым минимизировать тканевую реакцию организма на имплантат. Действительно, реакции организма на имплантированный материал известны под названием «реакция на чужеродные тела» («foreign body response» (FBR)). С помощью FBR организм старается разрушить имплантат или, если это оказывается невозможным, создать капсулу, отделяющую его от окружающей ткани (гранулема инородного тела). Первая стадии FBR-реакции заключается в связывании белков (например, фибриногена, альбумина, иммуноглобулина, комплемента) с поверхностью указанного выше материала, т.е. имплантата. На этой белковой оболочке присутствуют сайты связывания для рецепторов иммунных клеток. Например, фибриноген содержит структурный мотив, который связывается с рецептором моноцитов МАС-1. Когда фибриноген связывается с поверхностью имплантата, то он изменяет свою конформацию и экспонирует сайт связывания для МАС-1. После этого происходит рекрутинг к имплантату и активация иммунных клеток, таких как моноциты, секретирующих ферменты и радикалы, атакующие имплантат. Кроме того, иммунные клетки секретируют растворимые факторы, т.е. цитокины, вызывающие рекрутинг и активацию других иммунных клеток, усиливая тем самым иммунный ответ. Если имплантат не может быть удален, то клетки соединительной ткани и белки формируют фиброзную капсулу. Однако эта капсула представляет собой диффузионный барьер для аналитов, препятствующий достижению ими датчика. В совокупности, описанные выше явления, связанные с реакцией на чужеродное тело, по-видимому, оказывают негативное воздействие на функцию электродной системы in vivo и на срок ее службы.In addition, during the incorporation and use of the electrode system, the spacer is in direct contact with the tissue and / or total body water, such as interstitial fluid or blood, which contains biomolecules, such as proteins and cells. Preferably, the spacer membrane should protect the built-in and implanted sensor in the tissue and / or total body water and thereby minimize the body's tissue response to the implant. Indeed, the body’s response to the implanted material is known as the “foreign body response” (FBR). Using FBR, the body tries to destroy the implant or, if this is not possible, create a capsule that separates it from the surrounding tissue (foreign body granuloma). The first stage of the FBR reaction is the binding of proteins (e.g., fibrinogen, albumin, immunoglobulin, complement) to the surface of the above material, i.e. implant. On this protein coat, binding sites for immune cell receptors are present. For example, fibrinogen contains a structural motif that binds to the MAC-1 monocyte receptor. When fibrinogen binds to the implant surface, it changes its conformation and exposes the binding site for MAC-1. After this, recruitment to the implant and activation of immune cells, such as monocytes, secreting enzymes and radicals attacking the implant, occur. In addition, immune cells secrete soluble factors, i.e. cytokines that cause recruitment and activation of other immune cells, thereby enhancing the immune response. If the implant cannot be removed, then connective tissue cells and proteins form a fibrous capsule. However, this capsule is a diffusion barrier for analytes, preventing them from reaching the sensor. In total, the above-described phenomena associated with a reaction to a foreign body, apparently, have a negative effect on the function of the electrode system in vivo and on its service life.

Таким образом, улучшенная спейсерная мембрана на электродной системе ферментного датчика, предназначенного для измерений in vivo, обеспечивает снижение тканевой реакции на имплантат и ингибирует формирование капсулы, отделяющей датчик от окружающей ткани и общей воды организма.Thus, the improved spacer membrane on the electrode system of an enzyme sensor designed for in vivo measurements reduces the tissue response to the implant and inhibits the formation of a capsule that separates the sensor from the surrounding tissue and the body’s total water.

Таким образом, следующая задача настоящего изобретения заключалась в том, чтобы создать электродную систему для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, содержащую электрод с иммобилизованными молекулами фермента и предпочтительно диффузионный барьер, который контролирует диффузию аналита из внешней среды, окружающей электродную систему, к молекулам фермента, отличающуюся тем, что спейсерная мембрана образует по меньшей мере часть наружного слоя электродной системы, где спейсерная мембрана содержит гидрофильный сополимер акриловых и/или метакриловых мономеров, где полимер содержит более 50 мол.% гидрофильных мономеров.Thus, the next objective of the present invention was to create an electrode system for measuring the concentration of analyte in vivo, containing an electrode with immobilized enzyme molecules and preferably a diffusion barrier that controls the diffusion of the analyte from the environment surrounding the electrode system to the enzyme molecules characterized in that the spacer membrane forms at least part of the outer layer of the electrode system, where the spacer membrane contains a hydrophilic copolymer a silt and / or methacrylic monomers wherein the polymer contains more than 50 mol.% of hydrophilic monomers.

Как указано выше, спейсерная мембрана, предлагаемая в изобретении должна обладать ограниченной белоксвязывающей способностью для защиты электродной системы датчика от адсорбции белков, которые могут запускать клеточный иммунный ответ и могут ограничивать или оказывать неблагоприятное воздействие на ее функционирование in vivo. В примерах 5 и 6 продемонстрировано, что предпочтительная спейсерная мембрана, предлагаемая в изобретении, характеризуется незначительным связыванием с фибриногеном и препятствует конформационному изменению фибриногена, которое может приводить к экспонированию связывающего МАС-1 мотива для моноцитов. Предпочтительно материал спейсерной мембраны, представляющий собой сополимер, не активирует сами иммунные клетки. В примере 6 оказалось возможным продемонстрировать, что сополимер спейсерной мембраны, предлагаемый в изобретении, позволяет ослаблять активацию иммунных клеток, вызываемую имплантированным датчиком. Кроме того, предпочтительно спейсерная мембрана состоит из биосовместимого материала, прежде всего совместимого с общей водой организма, например, с кровью. В примере 7 продемонстрировано, что образующий спейсерную мембрану сополимер, предлагаемый в настоящем изобретении, обладает способностью предупреждать гемолиз и активацию системы комплемента имплантированным датчиком. Таким образом, преимуществом спейсерной мембраны, предлагаемой в изобретении, является то, что она не только характеризуется высокой механической стабильностью, но также обладает оптимальными свойствами биосовместимости, что является неожиданным следствием низкого поглощения воды при смачивании.As indicated above, the spacer membrane of the invention must have limited protein binding ability to protect the sensor electrode system from adsorption of proteins that can trigger a cellular immune response and can limit or adversely affect its functioning in vivo. Examples 5 and 6 demonstrate that the preferred spacer membrane of the invention is characterized by slight binding to fibrinogen and inhibits the conformational change in fibrinogen, which can lead to exposure of the MAC-1 binding motif to monocytes. Preferably, the copolymer spacer membrane material does not activate the immune cells themselves. In example 6, it turned out to be possible to demonstrate that the spacer membrane copolymer of the invention reduces the activation of immune cells caused by an implanted sensor. In addition, preferably the spacer membrane consists of a biocompatible material, especially compatible with the body’s total water, for example, blood. Example 7 demonstrates that the spacer membrane forming copolymer of the present invention has the ability to prevent hemolysis and activation of the complement system by an implanted sensor. Thus, the advantage of the spacer membrane of the invention is that it not only has high mechanical stability, but also has optimal biocompatibility properties, which is an unexpected consequence of low water absorption upon wetting.

В настоящем описании представлены отличительные признаки указанного варианта осуществления изобретения, касающиеся структуры электродной системы, аналита и молекул фермента. Диффузионный барьер предпочтительно представляет собой барьер, представленный в настоящем описании, однако он может иметь также другой состав или может отсутствовать. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения диффузионный барьер предпочтительно содержит блок-сополимер, имеющий, как описано выше, по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок.In the present description, the distinguishing features of the indicated embodiment of the invention are presented regarding the structure of the electrode system, analyte and enzyme molecules. The diffusion barrier is preferably a barrier described herein, however, it may also have a different composition or may be absent. According to one preferred embodiment of the invention, the diffusion barrier preferably comprises a block copolymer having, as described above, at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения диффузионный барьер содержит гидрофильные полиуретаны. Гидрофильные полиуретаны, применяемые в качестве диффузионной мембраны, можно получать посредством аддитивной полимеризации (поли)диизоцианата, предпочтительно 4-4-метилен-бис(циклогексилизоцианата), с многоатомным спиртом, предпочтительно смесью диолов.According to another preferred embodiment of the invention, the diffusion barrier comprises hydrophilic polyurethanes. Hydrophilic polyurethanes used as a diffusion membrane can be prepared by the addition polymerization of a (poly) diisocyanate, preferably 4-4-methylene bis (cyclohexyl isocyanate), with a polyhydric alcohol, preferably a mixture of diols.

Компонентами смеси диолов предпочтительно являются полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полипропиленгликоль (ППГ), и алифатические диолы, такие как этиленгликоль. Предпочтительно гидрофильный полиуретан содержит 45-55 мол.%, предпочтительно 50 мол.% изоцианата и 25-35 мол.%, предпочтительно 30 мол.% этиленгликоля. Затем степень гидрофилизации регулируют путем выбора соотношения ПЭГ и ППГ. Предпочтительно, полиуретан содержит 2-3 мол.%, более предпочтительно 2,5 мол.% ПЭГ и 17-18 мол.%, предпочтительно 17,5 мол.% ППГ. Для повышения гидрофильности полиуретана можно увеличивать относительное содержание ПЭГ, например, до 4,5-5,5 мол.%, предпочтительно до 5 мол.% ПЭГ, для получения полиуретана с очень большой гидрофильностью. Для оптимизации свойств диффузионного барьера можно также смешивать различные гидрофильные варианты полиуретанов.The components of the diol mixture are preferably polyalkylene glycols, such as polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol (PPG), and aliphatic diols, such as ethylene glycol. Preferably, the hydrophilic polyurethane contains 45-55 mol%, preferably 50 mol% of isocyanate and 25-35 mol%, preferably 30 mol% of ethylene glycol. Then, the degree of hydrophilization is adjusted by choosing the ratio of PEG to PPG. Preferably, the polyurethane contains 2-3 mol.%, More preferably 2.5 mol.% PEG and 17-18 mol.%, Preferably 17.5 mol.% PPG. To increase the hydrophilicity of polyurethane, it is possible to increase the relative content of PEG, for example, to 4.5-5.5 mol.%, Preferably up to 5 mol.% PEG, to obtain a polyurethane with very high hydrophilicity. To optimize the properties of the diffusion barrier, various hydrophilic variants of polyurethanes can also be mixed.

Предпочтительными акриловыми и метакриловыми мономерами сополимера спейсерной мембраны, являются мономеры, указанные в настоящем описании.Preferred acrylic and methacrylic monomers of the spacer membrane copolymer are the monomers described herein.

Гидрофильные мономерные звенья предпочтительно выбирают из гидрофильных сложных (мет)акриловых эфиров, т.е. сложных эфиров, имеющих полярную группу, т.е. группу ОН, ОСН₃ или ОС₂Н₅ в спиртовом фрагменте сложного эфира, гидрофильных (мет)акриламидов, имеющих амидную (NH₂) или N-алкил- или N,N-диалкиламидную группу, где алкильная группа содержит 1-3 атома С и необязательно гидрофильные группы, такие как ОН, ОСН₃ или ОС₂Н₅, и пригодных (мет)акриловых звеньев, имеющих заряженную, например, анионную или катионную группу, таких как акриловая кислота (акрилат) или метакриловая кислота (метакрилат). Кроме того, можно применять комбинации мономерных звеньев.The hydrophilic monomer units are preferably selected from hydrophilic (meth) acrylic esters, i.e. esters having a polar group, i.e. a group of OH, OCH ₃ or OC ₂ H ₅ in the alcohol fragment of an ester, hydrophilic (meth) acrylamides having an amide (NH ₂ ) or N-alkyl or N, N-dialkylamide group, where the alkyl group contains 1-3 C atoms and optionally hydrophilic groups such as OH, OCH ₃ or OC ₂ H ₅ , and suitable (meth) acrylic units having a charged, for example, anionic or cationic group, such as acrylic acid (acrylate) or methacrylic acid (methacrylate). In addition, combinations of monomer units may be used.

Конкретные примеры предпочтительных мономерных звеньев для гидрофильного блока выбирают из:Specific examples of preferred monomer units for a hydrophilic block are selected from:

2-гидроксиэтилакрилата,2-hydroxyethyl acrylate,

2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА),2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA),

2-метоксиэтилакрилата,2-methoxyethyl acrylate,

2-метоксиэтилметакрилата,2-methoxyethyl methacrylate,

2-этоксиэтилакрилата,2-ethoxyethyl acrylate,

2-этоксиэтилметакрилата,2-ethoxyethyl methacrylate,

2- или 3-гидроксипропилакрилата,2- or 3-hydroxypropyl acrylate,

2- или 3-гидроксипропилметакрилата (2- или 3-ГПМА),2- or 3-hydroxypropylmethacrylate (2- or 3-GPMA),

2- или 3-метоксипропилакрилата,2- or 3-methoxypropyl acrylate,

2- или 3-метоксипропилметакрилата,2- or 3-methoxypropylmethacrylate,

2- или 3-этоксипропилакрилата,2- or 3-ethoxypropyl acrylate,

2- или 3-этоксипропилметакрилата,2- or 3-ethoxypropylmethacrylate,

1- или 2-глицерилакрилата,1- or 2-glyceryl acrylate,

1- или 2-глицерилметакрилата,1- or 2-glyceryl methacrylate,

акриламида,acrylamide

метакриламида,methacrylamide

N-алкил- или N,N-диалкилакриламида иN-alkyl or N, N-dialkyl acrylamide and

N-алкил- или N,N-диалкилметиламида, где алкил содержит 1-3 атома С, например, представляет собой метил, этил или пропил,N-alkyl- or N, N-dialkylmethylamide, where the alkyl contains 1-3 C atoms, for example, represents methyl, ethyl or propyl,

акриловой кислоты (акрилат),acrylic acid (acrylate),

метакриловой кислоты (метакрилат)methacrylic acid (methacrylate)

и их комбинаций.and their combinations.

Предпочтительными гидрофильными мономерами являются 2-гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА) и/или 2- или 3-гидроксипропилметакрилат (2- или 3-ГПМА).Preferred hydrophilic monomers are 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and / or 2- or 3-hydroxypropylmethacrylate (2- or 3-GPMA).

Гидрофобные мономерные звенья предпочтительно выбирают из гидрофобных акриловых и/или метакриловых звеньев или их комбинаций. Предпочтительно гидрофобные мономерные звенья выбирают из гидрофобных сложных (мет)акриловых эфиров, например, сложных эфиров, имеющих спиртовой фрагмент, содержащий 1-3 атома С и не содержащий гидрофильную группу.The hydrophobic monomer units are preferably selected from hydrophobic acrylic and / or methacrylic units or combinations thereof. Preferably, the hydrophobic monomer units are selected from hydrophobic (meth) acrylic esters, for example, esters having an alcohol moiety containing 1-3 C atoms and not containing a hydrophilic group.

Конкретные примеры мономерных звеньев для гидрофобного блока выбирают из:Specific examples of monomer units for a hydrophobic block are selected from:

метилакрилата,methyl acrylate

метилметакрилата (ММА),methyl methacrylate (MMA),

этилакрилата,ethyl acrylate

этилметакрилата (ЭМА),ethyl methacrylate (EMA),

н-пропилакрилата или изопропилакрилата,n-propyl acrylate or isopropyl acrylate,

н-пропилметакрилата или изопропилметакрилата,n-propyl methacrylate or isopropyl methacrylate,

н-бутилакрилата,n-butyl acrylate,

н-бутилметакрилата (БМА),n-butyl methacrylate (BMA),

неопентилакрилата,neopentyl acrylate

неопентилметакрилатаneopentyl methacrylate

и их комбинаций.and their combinations.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения гидрофобный блок содержит метилметакрилат (ММА) и н-бутилметакрилат (БМА).In a preferred embodiment, the hydrophobic block contains methyl methacrylate (MMA) and n-butyl methacrylate (BMA).

Наружная спейсерная мембрана предпочтительно покрывает по меньшей мере часть рабочего электрода, содержащую молекулы фермента, и необязательно также другие части, например, противоэлектрод. Спейсерная мембрана покрывает также референс-электрод, если он присутствует. Спейсерная мембрана предпочтительно покрывает всю имплантированную поверхность электродной системы. Спейсерная мембрана предпочтительно покрывает рабочий электрод, необязательно противоэлектрод и референс-электрод, если он присутствует, в форме непрерывного слоя.The outer spacer membrane preferably covers at least a portion of the working electrode containing the enzyme molecules, and optionally also other parts, for example, a counter electrode. The spacer membrane also covers the reference electrode, if present. The spacer membrane preferably covers the entire implanted surface of the electrode system. The spacer membrane preferably covers the working electrode, optionally the counter electrode and the reference electrode, if present, in the form of a continuous layer.

Электродная система, содержащая улучшенную спейсерную мембрану, предлагаемую в изобретении, может представлять собой часть датчика, например, будучи присоединенной к стабилизатору напряжения и усилителю для усиления измеряемых электродной системой сигналов. Датчик предпочтительно представляет собой ферментный нежидкостной (ENF) датчик, более предпочтительно электрохимический ENF-датчик. Электроды электродной системы можно размещать на субстрате, на котором расположен стабилизатор напряжения, или присоединять к схемной плате, на которой находится стабилизатор напряжения. Предпочтительно датчик предназначен для измерения глюкозы.The electrode system containing the improved spacer membrane of the invention may be part of a sensor, for example, being connected to a voltage regulator and amplifier to amplify the signals measured by the electrode system. The sensor is preferably an enzymatic non-liquid (ENF) sensor, more preferably an electrochemical ENF sensor. The electrodes of the electrode system can be placed on the substrate on which the voltage stabilizer is located, or attached to the circuit board on which the voltage stabilizer is located. Preferably, the sensor is for measuring glucose.

Следующий объект изобретения относится к применению гидрофильного сополимера акриловых и/или метакриловых мономеров, где в гидрофильном сополимере на долю гидрофильных мономеров приходится более 50 мол.%, в качестве спейсерной мембраны для ферментного электрода. Гидрофильный сополимер предпочтительно представляет собой сополимер, представленный выше в настоящем описании. Предпочтительно спейсерную мембрану применяют для минимизации реакции на чужеродное тело (FRB), вызываемой против ферментного электрода при его встраивании или имплантации в организм.The next object of the invention relates to the use of a hydrophilic copolymer of acrylic and / or methacrylic monomers, where in the hydrophilic copolymer the share of hydrophilic monomers is more than 50 mol.%, As a spacer membrane for the enzyme electrode. The hydrophilic copolymer is preferably the copolymer described above in the present description. Preferably, a spacer membrane is used to minimize the reaction to a foreign body (FRB) caused against the enzyme electrode when it is inserted or implanted into the body.

Пример 1. Проницаемость ферментного нежидкостного (ENF) глюкозного датчика с распределенными электродами, предназначенного для чрескожной имплантации, который имеет диффузионный слой, состоящий из единственного блок-сополимераExample 1. Permeability of an enzymatic non-fluid (ENF) glucose sensor with distributed electrodes intended for percutaneous implantation, which has a diffusion layer consisting of a single block copolymer

Датчик создавали на предварительно изготовленной структуре палладиевого полоскового проводника, расположенной на субстрате из сложного полиэфира, толщиной 250 мкм. Рабочий электрод (WE) и противоэлектрод (СЕ) размещали в определенном порядке (как продемонстрировано на фиг. 1-2).The sensor was created on a prefabricated structure of a palladium strip conductor located on a 250 μm thick polyester substrate. The working electrode (WE) and counter electrode (CE) were placed in a specific order (as shown in Fig. 1-2).

Поля СЕ печатали с использованием углеродной пасты, оставшуюся часть полоскового проводника изолировали. Поля WE печатали с использованием смеси сшитой глюкозооксидазы (фермент), проводящей полимерной пасты и электрокатализатора, в данном случае оксида марганца(IV) (фирма Technipur). И в этом случае также изолировали оставшиеся дорожки на полосковом проводнике. Референс-электрод (RE) состоял из Ag/AgCl-пасты. Электроды покрывали примерно 1 см стержня датчика.CE fields were printed using carbon paste, the remainder of the strip conductor was isolated. The WE fields were printed using a mixture of crosslinked glucose oxidase (enzyme), a conductive polymer paste and an electrocatalyst, in this case manganese (IV) oxide (Technipur). And in this case, the remaining tracks on the strip conductor were also isolated. The reference electrode (RE) consisted of an Ag / AgCl paste. The electrodes covered about 1 cm of the probe rod.

WE-поля покрывали диффузионным слоем из блок-сополимера, состоящего из ГЭМА-блока и БМА-блока. Толщина слоя составляла 7 мкм.WE fields were coated with a diffusion layer of a block copolymer consisting of a HEMA block and a BMA block. The layer thickness was 7 μm.

Были изготовлены четыре партии датчиков, каждый из которых был снабжен диффузионным слоем из конкретного блок-сополимера (см. представленный ниже перечень). Все блок-сополимеры получали от фирмы Polymer Source, Монреаль, и они указаны в представленной ниже таблице 1.Four batches of sensors were made, each of which was equipped with a diffusion layer from a specific block copolymer (see the list below). All block copolymers were obtained from Polymer Source, Montreal, and are listed in Table 1 below.

Соответствующий блок-сополимер растворяли в органическом растворителе (концентрация 25%) и наносили в виде покрытия на датчики. После сушки с помощью ленточных сушилок (2 мин, 30-50°С), проводили тестирование in vitro датчиков с нанесенным покрытием в растворах глюкозы с различными концентрациями. Измерения проводили с использованием 10 датчиков из каждой партии, представлявших собой случайную выборку. Для определения чувствительности in vitro рассчитывали сигнал в виде разницы токов, измеренных при концентрации глюкозы 10 мМ и 0 мМ, который затем делили на 10 мМ (см. пример 4).The corresponding block copolymer was dissolved in an organic solvent (concentration of 25%) and applied to the sensors as a coating. After drying with tape dryers (2 min, 30-50 ° C), in vitro testing of sensors with a coating in glucose solutions with various concentrations was performed. The measurements were carried out using 10 sensors from each batch, representing a random sample. To determine the sensitivity in vitro, the signal was calculated as the difference between the currents measured at a glucose concentration of 10 mM and 0 mM, which was then divided by 10 mM (see Example 4).

Все датчики работали при напряжении поляризации 350 мВ относительно Ag/AgCl, измеряемую температуру поддерживали на постоянном уровне 37°С. Датчики, применявшиеся для этой серии измерений, не содержали спейсер, описанный в WO 2010/028708, что, однако, не приводило к каким-либо различиям с точки зрения уровня тестируемых сигналов. На фиг. 5 представлены данные о чувствительности датчиков с указанием стандартных отклонений для четырех различных диффузионных слоев.All sensors operated at a polarization voltage of 350 mV relative to Ag / AgCl, and the measured temperature was maintained at a constant level of 37 ° C. The sensors used for this series of measurements did not contain the spacer described in WO 2010/028708, which, however, did not lead to any differences in terms of the level of the tested signals. In FIG. 5 presents data on the sensitivity of sensors indicating standard deviations for four different diffusion layers.

Касательно блок-сополимеров С, D и F, обнаружена выраженная связь между чувствительностью in vitro и молярным соотношением между гидрофобным блоком и гидрофильным блоком. Общие длины цепей сополимеров были почти идентичными, при этом чувствительность возрастала при увеличении содержания гидрофильного блока (ГЭМА).Regarding block copolymers C, D, and F, a pronounced relationship was found between in vitro sensitivity and the molar ratio between the hydrophobic block and the hydrophilic block. The total chain lengths of the copolymers were almost identical, while the sensitivity increased with an increase in the content of the hydrophilic block (HEMA).

Исключением являлись датчики, которые имели диффузионный слой из блок-сополимера В. Даже хотя соотношение гидрофобных и гидрофильных блоков в полимере В было примерно таким же, что и в полимере F, чувствительность и, следовательно, проницаемость для глюкозы, снижались. Эмпирически можно считать, что в случае полимера В общая длина цепи - соответствующая молекулярной массе (всей) молекулы сополимера - является настолько большой, что это приводит к снижению проницаемости слоя. Это можно обнаружить также при сравнении определяемого гравиметрическим методом поглощения воды блок-сополимером В и остальными полимерами. Полимер В характеризовался поглощением воды, составляющим 10,6% ± 1,5% (мас.% в пересчете на массу полимера в сухом состоянии). Соответствующие величины для полимера С составляют 15,6% ± 0,0%, для полимера F - 16,5±3,1% и для полимера D - 27% ± 1,7%.An exception was sensors that had a diffusion layer of block copolymer B. Even though the ratio of hydrophobic and hydrophilic blocks in polymer B was about the same as in polymer F, sensitivity and, therefore, permeability for glucose were reduced. Empirically, it can be considered that in the case of polymer B, the total chain length — corresponding to the molecular weight (of the whole) of the copolymer molecule — is so large that this leads to a decrease in the permeability of the layer. This can also be detected by comparing the block copolymer B and other polymers determined by the gravimetric method of water absorption. Polymer B was characterized by a water absorption of 10.6% ± 1.5% (wt.%, Calculated on the weight of the polymer in the dry state). The corresponding values for polymer C are 15.6% ± 0.0%, for polymer F - 16.5 ± 3.1% and for polymer D - 27% ± 1.7%.

Пример 2. Механическая гибкость диффузионного слоя глюкозного ENF-датчикаExample 2. The mechanical flexibility of the diffusion layer of glucose ENF-sensor

Датчик изготавливали согласно методу, описанному в WO 2010/028708, однако он имел диффузионный слой, предлагаемый в настоящем изобретении. Предполагалось, что температура стеклования (Т_ст) является косвенным параметром, характеризующим механическую гибкость. Кроме того, предполагалось, что температура стеклования, которая может быть установлена для гидрофобного блока, определяет механическую гибкость при применении in vivo. Следует иметь в виду, что для одного блок-сополимера могут быть идентифицированы несколько величин Т_ст, которые соответствуют количеству блоков.The sensor was manufactured according to the method described in WO 2010/028708, however, it had a diffusion layer according to the present invention. It was assumed that the glass transition temperature (T _article ) is an indirect parameter characterizing mechanical flexibility. In addition, it was assumed that the glass transition temperature, which can be set for the hydrophobic block, determines the mechanical flexibility when used in vivo. It should be borne in mind that for one block copolymer can be identified several values of T _article that correspond to the number of blocks.

На датчики наносили покрытия с помощью тех же самых электродных паст, которые описаны в примере 1. После этого на некоторые датчики наносили покрытие из сополимера, выбранного из ММА-ГЭМА (производство фирмы Polymer Source, Монреаль). Указанный полимер (обозначенный как Д) имел общую молекулярную массу 41 кДа, молярное соотношение ММА (гидрофобный блок) и ГЭМА составляло 60%:40%. Температура стеклования гидрофобного блока составляла 111°С по данным измерений методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) при скорости нагрева 10°С/мин.The sensors were coated using the same electrode pastes as described in Example 1. After that, some sensors were coated with a copolymer selected from MMA-HEMA (manufactured by Polymer Source, Montreal). The specified polymer (designated as D) had a total molecular weight of 41 kDa, the molar ratio of MMA (hydrophobic block) and HEMA was 60%: 40%. The glass transition temperature of the hydrophobic block was 111 ° C according to measurements by differential scanning calorimetry (DSC) at a heating rate of 10 ° C / min.

Кроме этого, были изготовлены другие датчики с диффузионным слоем из блок-сополимера, предлагаемого в изобретении (обозначенный как А). Гидрофобный блок указанного сополимера А содержал ММА и БМА в равных молярных количествах в виде рандомизированной последовательности. И в этом случае также молярное соотношение гидрофобной части и гидрофильной части составляло 60%:40%. Молекулярная масса была равна 36 кДа. Величина Т_ст гидрофобного блока снижалась до 73°С вследствие наличия рандомизированной последовательности ММА и БМА (Т_ст примерно 45°С).In addition, other sensors with a diffusion layer were made from the block copolymer of the invention (designated as A). The hydrophobic block of the indicated copolymer A contained MMA and BMA in equal molar amounts in the form of a randomized sequence. And in this case also, the molar ratio of the hydrophobic part to the hydrophilic part was 60%: 40%. The molecular weight was 36 kDa. The value of T _{article of the} hydrophobic block decreased to 73 ° C due to the presence of a randomized sequence of MMA and BMA (T _{article of} about 45 ° C).

Оба диффузионных слоя создавали с использованием соответствующего раствора (25%) сополимеров в простом эфире и сушили согласно процедуре, описанной в примере 1. Толщина диффузионных слоев составляла 7 мкм. Затем наносили спейсерный слой путем погружения в покрытие и сушили в течение 24 ч при комнатной температуре. Спейсерный слой состоял из Lipidure СМ 5206 (производство фирмы NOF, Япония).Both diffusion layers were created using the corresponding solution (25%) of copolymers in ether and dried according to the procedure described in example 1. The thickness of the diffusion layers was 7 μm. The spacer layer was then applied by immersion in the coating and dried for 24 hours at room temperature. The spacer layer consisted of Lipidure CM 5206 (manufactured by NOF, Japan).

После эксплантации из ткани на датчиках, имевших диффузионный слой из сополимера Д, обнаружены спорадические трещины в диффузионном слое. Это рассматривается как результат воздействия механической нагрузки. В отличие от этого, на датчиках, имевших диффузионный слой из сополимера А, не было обнаружено никаких трещин под воздействием идентичной нагрузки. По-видимому, это обусловлено снижением Т_ст, что повышает механическую стабильность сополимера. В этом случае физическая смесь двух сополимеров, описанная в WO 2010/028708, более не требовалась.After explantation from tissue, sporadic cracks in the diffusion layer were detected on sensors that had a diffusion layer of copolymer D. This is considered as a result of mechanical stress. In contrast, on the sensors having a diffusion layer of copolymer A, no cracks were detected under the influence of an identical load. Apparently, this is due to a decrease in T _article , which increases the mechanical stability of the copolymer. In this case, the physical mixture of the two copolymers described in WO 2010/028708 was no longer required.

Пример 3. Оптимальная характеристика проницаемости глюкозного ENF-датчика с распределенным электродом и диффузионным слоем, предлагаемым в изобретенииExample 3. The optimal characteristic of the permeability of glucose ENF-sensor with a distributed electrode and a diffusion layer, proposed in the invention

Датчик изготавливали согласно методу, описанному в примере 1, но он имел дополнительный спейсерный слой на всем стержне датчика. Датчики с соответствующим диффузионным слоем изготавливали с использованием сополимеров А, В, Г и Е, описанных в примерах 1 и 2. Для этой цели приготавливали 24%-ный раствор полимера в простом эфире. Каждый раствор наносили на партию датчиков (N=10) и затем сушили в ленточной сушилке. Таким путем получали диффузионные слои толщиной 7 мкм.The sensor was made according to the method described in example 1, but it had an additional spacer layer on the entire sensor rod. Sensors with an appropriate diffusion layer were made using copolymers A, B, D and E described in examples 1 and 2. For this purpose, a 24% solution of the polymer in ether was prepared. Each solution was applied to a batch of sensors (N = 10) and then dried in a belt dryer. In this way, diffusion layers with a thickness of 7 μm were obtained.

После этого на датчики наносили спейсерный слой как описано в примере 2.After that, a spacer layer was applied to the sensors as described in example 2.

Датчик соединяли с измерительной системой на головке датчика, которая передавала измеряемые данные в хранилище данных. Измерения in vitro осуществляли как описано в примере 1, однако период измерений составлял 7 дней. На основе измеренных данных для каждого датчика рассчитывали дрейф чувствительности в течение соответствующего периода. На фиг. 6 представлены величины дрейфа in vitro для каждого варианта датчика, т.е. группы датчиков с одним вариантом диффузионного слоя. Из расчетов исключали начальную фазу измерений, а именно первые 6 ч, так называемую стартовую фазу.The sensor was connected to the measuring system on the sensor head, which transmitted the measured data to the data warehouse. In vitro measurements were carried out as described in example 1, however, the measurement period was 7 days. Based on the measured data for each sensor, the sensitivity drift was calculated over the corresponding period. In FIG. Figure 6 shows the in vitro drift values for each sensor variant, i.e. groups of sensors with one version of the diffusion layer. The initial phase of measurements, namely, the first 6 hours, the so-called starting phase, was excluded from the calculations.

Для всех сополимеров В, Г и Е, содержавших гидрофобный блок БМА, имел место положительный дрейф, т.е. чувствительность возрастала с течением времени. В отличие от этого, сополимер А, имеющий гидрофобный блок из статистического сополимера ММА и БМА, приводил к очень малому отрицательному дрейфу.For all copolymers B, D, and E containing a hydrophobic block of BMA, there was a positive drift, i.e. sensitivity increased over time. In contrast, copolymer A, having a hydrophobic block of a random copolymer of MMA and BMA, led to a very small negative drift.

Указанные различия можно объяснить длительным ответом проницаемости соответствующих диффузионных слоев, который был измерен в дополнительных экспериментах. На палладиевые датчики без WE-пасты, но с определенной активной поверхностью, т.е. без ферментного слоя, что исключало влияние его свойства набухания на результаты, наносили покрытия с использованием указанных выше растворов полимеров и после сушки измеряли толщину слоя. Затем измеряли проводимость в содержащем натрий и хлор буферном растворе.These differences can be explained by the long permeability response of the corresponding diffusion layers, which was measured in additional experiments. On palladium sensors without WE-paste, but with a certain active surface, i.e. without an enzyme layer, which excluded the effect of its swelling properties on the results, coatings were applied using the above polymer solutions and, after drying, the layer thickness was measured. Then, the conductivity was measured in a buffer containing sodium and chlorine.

На фиг. 7 продемонстрировано, что проводимость сополимера А оставалась практически постоянной после короткой стартовой фазы.In FIG. 7 shows that the conductivity of copolymer A remained almost constant after a short start phase.

Как можно видеть из данных, представленных на фиг. 8, это не имело места в случае сополимера Е даже в идентичных условиях измерений. В этом случае был выявлен пролонгированный и выраженный ответ проницаемости диффузионного слоя, состоящего из полимера Е, который практически не зависел от толщины слоя. Для сополимера Е, а также для сополимеров В и Г (данные не представлены), имевших гидрофобный блок БМА, имело место повышение проницаемости даже по истечении длительного периода времени. При измерениях это приводило к непрерывному повышению чувствительности, если диффузионный слой наносили на датчик с распределенным ферментным слоем. Это объясняет наблюдаемый положительный дрейф датчика.As can be seen from the data presented in FIG. 8, this did not occur in the case of copolymer E, even under identical measurement conditions. In this case, a prolonged and pronounced response to the permeability of the diffusion layer consisting of polymer E was revealed, which was practically independent of the thickness of the layer. For copolymer E, as well as for copolymers B and D (data not shown), which had a hydrophobic block of BMA, an increase in permeability occurred even after a long period of time. In measurements, this led to a continuous increase in sensitivity if the diffusion layer was applied to a sensor with a distributed enzyme layer. This explains the observed positive drift of the sensor.

Наоборот, для датчика с блок-сополимером А обнаружен незначительный дрейф, что обусловлено очень малым изменением проницаемости при измерении проводимости. Однако сразу после начала измерений (в течение примерно 1 ч после этого), наблюдалось сильное повышение проводимости сополимера А. Таким образом, имел место очень быстрый старт, который заканчивался примерно через 1 ч. За это время диффузионный слой полностью смачивался и прекращалась его структурная реорганизация, обусловленная поглощением воды. Степень структурного изменения, по-видимому, зависит от Т_ст. Возможно, что сополимер, имеющий повышенную Т_ст, подвергается реорганизации, которая является более ограниченной по времени и уровню по сравнению с сополимером, имеющим Т_ст в диапазоне температур окружающей среды.On the contrary, a slight drift was detected for the sensor with block copolymer A, which is due to a very small change in permeability when measuring conductivity. However, immediately after the start of measurements (within about 1 hour after this), a strong increase in the conductivity of copolymer A was observed. Thus, there was a very quick start, which ended after about 1 hour. During this time, the diffusion layer was completely wetted and its structural reorganization ceased due to absorption of water. The degree of structural change, apparently, depends on T _Art . It is possible that a copolymer having an increased T _article undergoes a reorganization that is more limited in time and level compared to a copolymer having a T _article in the ambient temperature range.

Кроме того, было установлено, что датчики с сополимером А обладали сравнительно высокой чувствительностью при начале измерений по сравнению с датчиками, имеющими диффузионный слой из сополимера F. Это следовало ожидать, поскольку они имели идентичные относительные соотношения между гидрофобными и гидрофильными блоками. Достигаемая чувствительность, находящаяся в диапазоне от 1 до 1,5 нА/мМ (см. пример 1), считается идеальной. Такая чувствительность также была получена для датчиков, имеющих диффузионный слой, состоящий из сополимера А.In addition, it was found that sensors with copolymer A had a relatively high sensitivity at the beginning of measurements compared to sensors having a diffusion layer of copolymer F. This was to be expected, since they had identical relative ratios between hydrophobic and hydrophilic blocks. An achievable sensitivity in the range of 1 to 1.5 nA / mM (see Example 1) is considered ideal. This sensitivity was also obtained for sensors having a diffusion layer consisting of copolymer A.

С точки зрения суммы трех физико-химических характеристик, а именно проницаемости, механической стабильности и ответа проницаемости, оптимальный датчик предпочтительно может быть создан с использованием диффузионного слоя из блок-сополимера, имеющего гидрофобный блок, состоящий по меньшей мере из двух различных случайным образом расположенных гидрофобных мономерных звеньев, такого как блок-сополимер А. Ни один из остальных блок-сополимеров, гидрофобные блоки которых состояли только из одного мономерного звена, не обладали с точки зрения всех трех параметров качеством, сравнимым с сополимером А.In terms of the sum of the three physicochemical characteristics, namely permeability, mechanical stability, and permeability response, an optimal sensor can preferably be created using a diffusion layer of a block copolymer having a hydrophobic block consisting of at least two different hydrophobic randomly arranged monomer units, such as block copolymer A. None of the remaining block copolymers, hydrophobic blocks of which consisted of only one monomer unit, did not possess from the point of view all three parameters with a quality comparable to copolymer A.

Пример 4. Характеризация блок-сополимеровExample 4. Characterization of block copolymers

Создавали имеющий несколько полей датчик (по 10 полей рабочих электродов и противоэлектродов соответственно) для непрерывных измерений глюкозы и осуществляли его характеризацию in vitro.A sensor having several fields was created (10 fields of working electrodes and counter electrodes respectively) for continuous measurements of glucose and its characterization was carried out in vitro.

Датчик снабжали диффузионным слоем, состоящим из блок-сополимера, который содержал гидрофобный блок из статистически сополимеризованных метилметакрилата (ММА) и н-бутилметакрилата (БМА) и гидрофильный блок из 2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА). Указанные полимеры (обозначенные как Ж и З) изготавливали на фирме Polymer Source, Монреаль, и они обладали большей проницаемостью, чем полимер А, описанный в примерах 1-3, который включен в настоящее описание в качестве ссылки.The sensor was equipped with a diffusion layer consisting of a block copolymer that contained a hydrophobic block of statistically copolymerized methyl methacrylate (MMA) and n-butyl methacrylate (BMA) and a hydrophilic block of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). These polymers (designated G and H) were manufactured by Polymer Source, Montreal, and had greater permeability than Polymer A described in Examples 1-3, which is incorporated herein by reference.

В приведенной ниже таблице 2 представлены характеристики сополимеров:The following table 2 presents the characteristics of the copolymers:

В приведенной выше таблице 2 молекулярные массы Mn каждого блока указаны по отдельности, и они представляют собой средние значения, поскольку, как известно, полимеры характеризуются распределениями длин молекулярных цепей относительно определенного среднего значения. Этот факт относится также и к величинам, выведенным из величин, приведенных в таблице 2.In the above table 2, the molecular masses Mn of each block are indicated separately, and they are average values, because, as you know, polymers are characterized by distributions of the lengths of the molecular chains relative to a certain average value. This fact also applies to values derived from the values given in table 2.

Указанные температуры стеклования гидрофобного блока находятся в пределах желаемого диапазона, что гарантирует механическую гибкость.The indicated glass transition temperatures of the hydrophobic block are within the desired range, which guarantees mechanical flexibility.

Параметром, имеющим решающее значение с точки зрения проницаемости диффузионного барьера для аналита, является чувствительность на единицу площади рабочего электрода (т.е. геометрической площади). Чувствительность SE рассчитывали для каждого из анализируемых датчиков на основе измерений тока (I) при концентрации глюкозы 10 мМ и 0 мМ в забуференном фосфатом растворе (рН 7,4) в нА/мМ:The parameter that is crucial in terms of the permeability of the diffusion barrier for the analyte is the sensitivity per unit area of the working electrode (i.e., geometric area). The sensitivity SE was calculated for each of the analyzed sensors based on measurements of current (I) at a glucose concentration of 10 mM and 0 mM in phosphate-buffered solution (pH 7.4) in nA / mM:

SE=[I(10 мМ)-I(0 мМ)]/10.SE = [I (10 mM) -I (0 mM)] / 10.

На основе индивидуальных измеренных величин (N=8) определяли среднюю чувствительность SE_m. Полученные величины чувствительности делили на измеренную под микроскопом общую геометрическую площадь F всех пятен рабочего электрода на имеющем несколько полей датчике. Таким путем получали плотность чувствительности SE_m/F.Based on the individual measured values (N = 8), the average sensitivity SE _{m was} determined. The obtained sensitivity values were divided by the total geometric area F of all spots of the working electrode measured under a microscope using a sensor with several fields. In this way, the sensitivity density SE _m / F was obtained.

Линейность Y полученной в условиях in vitro функциональной кривой является показателем функциональной способности слоя полимерного покрытия на рабочем электроде контролировать диффузию. Ее рассчитывали для каждого из анализируемых датчиков в % на основе измерений тока при концентрациях глюкозы 20 мМ, 10 мМ и 0 мМ:The linearity Y obtained in vitro functional curve is an indicator of the functional ability of the polymer coating layer on the working electrode to control diffusion. It was calculated for each of the analyzed sensors in% based on current measurements at glucose concentrations of 20 mm, 10 mm and 0 mm:

Y^{20 мМ}=50⋅[I(20 мМ)-I(0 мМ)]/[I(10 мМ)-I(0 мМ)].Y ^{20 mM} = 50⋅ [I (20 mM) -I (0 mM)] / [I (10 mM) -I (0 mM)].

На основе индивидуальных измеренных величин определяли среднюю величину линейности и ее стандартное отклонение (см. таблицу 3).Based on the individual measured values, the average linearity and its standard deviation were determined (see table 3).

И, наконец, толщину L слоя диффузионного барьера датчиков определяли путем измерений оптическим методом для каждого из полимеров. Соответствующие средние значения получали для выборки, включающей ≥23 датчиков с покрытием из одного и того же полимера. На основе этих данных можно было рассчитывать эффективный коэффициент диффузии D_eff слоя покрытия:And finally, the thickness L of the layer of the diffusion barrier of the sensors was determined by optical measurements for each of the polymers. Corresponding mean values were obtained for a sample comprising ≥23 sensors coated with the same polymer. Based on these data, it was possible to calculate the effective diffusion coefficient D _{eff of the} coating layer:

D_eff=SE_m/F⋅L_m⋅5,182⋅10^-8 D _eff = SE _m / F⋅L _m ⋅5.182⋅10 ^-8

в см²/с, где SE_m и L_m обозначают соответствующие средние величины чувствительности и толщины слоя, a F обозначает общую площадь всех пятен рабочего электрода.in cm ² / s, where SE _m and L _m denote the corresponding average sensitivity and layer thickness, and F denotes the total area of all spots of the working electrode.

Дрейф датчика рассчитывали на основе результатов повторных стадий измерений in vitro концентрации глюкозы в течение 7 дней. Результаты, полученные для полимера Н, свидетельствующие о практически постоянной проводимости, представлены на фиг. 9.Sensor drift was calculated based on the results of repeated in vitro measurements of glucose concentration for 7 days. The results obtained for polymer H, indicating almost constant conductivity, are presented in FIG. 9.

В приведенной ниже таблице 3 представлены результаты определения функциональных характеристик:The following table 3 presents the results of determining the functional characteristics:

Для более гидрофильного полимера Ж (который обладает большей проницаемостью для глюкозы) коэффициент диффузии определяли также с помощью другого метода, а именно, оценивали проникновение глюкозы через полимерную пленку из камеры, содержащей раствор глюкозы, в камеру, в которой находился не содержащий глюкозу буфер. С помощью указанного метода были получены сходные величины коэффициента диффузии (1,17⋅10^-9 см²/с).For a more hydrophilic polymer G (which has a higher permeability for glucose), the diffusion coefficient was also determined using another method, namely, the penetration of glucose through the polymer film from the chamber containing the glucose solution into the chamber containing the glucose-free buffer was evaluated. Using this method, similar values of the diffusion coefficient (1.17 × 10 ^-9 cm ² / s) were obtained.

Пример 5. Связывание белков с материалом спейсерного слоя Example 5. The binding of proteins to the material of the spacer layer

Для оценки связывания белков с материалами, из которых изготавливали спейсерный слой, в планшет для инкубации (FluoroNunc Maxisorp, фирма Thermo Scientific) вносили этанольные растворы Adapt™ (фирма Biointeractions Ltd, Ридинг, Великобритания) или Eudragit E100 (фирма Evonik Industries). Eudragit E100 представляет собой катионный сополимер на основе диметиламиноэтилметакрилата, бутилметакрилата и метилметакрилата. Полимеры сушили в течение ночи при 40°С. После этого на материалы для спейсера наносили раствор фибриногена. Раствор содержал фибриноген, полученный из человеческой плазмы, конъюгированный с флуоресцентным красителем Alexa488 (полученный от фирмы Invitrogen). После инкубации в течение 4 ч раствор фибриногена аспирировали и слои спейсера отмывали восемь раз боратным буфером. Количество связанного со спейсером белка анализировали путем измерения интенсивности флуоресценции в планшете для инкубации при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны испускания 528 нм с использованием флуоресцентного ридера (Synergy4, фирма BioTek Instruments). Для построения калибровочной кривой, с помощью которой результаты измерений флуоресценции превращали в количество белка, использовали меченый белок в известных концентрациях (6,25-500 нг).Adapt ™ ethanol solutions (Biointeractions Ltd, Reading, UK) or Eudragit E100 (Evonik Industries) were added to an incubation plate (FluoroNunc Maxisorp, Thermo Scientific) to evaluate the binding of proteins to the materials from which the spacer layer was made. Eudragit E100 is a cationic copolymer based on dimethylaminoethyl methacrylate, butyl methacrylate and methyl methacrylate. The polymers were dried overnight at 40 ° C. After that, a fibrinogen solution was applied to the spacer materials. The solution contained fibrinogen derived from human plasma conjugated to Alexa488 fluorescent dye (obtained from Invitrogen). After incubation for 4 hours, the fibrinogen solution was aspirated and the spacer layers were washed eight times with borate buffer. The amount of spacer-bound protein was analyzed by measuring the fluorescence intensity in an incubation plate at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 528 nm using a fluorescent reader (Synergy4, BioTek Instruments). To construct a calibration curve by which the results of fluorescence measurements were converted into the amount of protein, labeled protein was used in known concentrations (6.25-500 ng).

Как и ожидалось, фибриноген присоединялся к планшету для инкубации, не имеющему покрытия (контроль), было обнаружено 390 нг связанного белка (фиг. 10). Для планшета с покрытием из Eudragit El00 было обнаружено меньшее количество связанного белка, составлявшее 60 нг. На планшете с покрытием из Adapt™ обнаружить связанный белок оказалось почти невозможно. Данные, полученные до осуществления инкубации, были обусловлены фоновой флуоресценцией. Эти результаты убедительно демонстрируют, что поверхности, на которые нанесено покрытие из применяемых для спейсеров материалов, прежде всего те, на которые нанесено покрытие из Adapt™, хорошо защищены от адгезии фибриногена.As expected, fibrinogen was attached to an incubation plate without coating (control), 390 ng of bound protein was detected (Fig. 10). For a tablet coated with Eudragit El00, a lower amount of bound protein of 60 ng was detected. On an Adapt ™ coated tablet, it was almost impossible to detect bound protein. Data obtained before incubation was determined by background fluorescence. These results convincingly demonstrate that surfaces coated with materials used for spacers, especially those coated with Adapt ™, are well protected from fibrinogen adhesion.

Пример 6. Высвобождение цитокинов клетками после контактирования со спейсерным слоемExample 6. The release of cytokines by cells after contact with the spacer layer

Датчики изготавливали согласно методу, описанному в примере 2. После этого на датчики наносили спейсерный слой согласно методу, описанному в примере 2. Спейсерный слой создавали из Lipidure СМ 5206 (фирма NOF Corporation, Япония) или его создавали из Adapt™ (фирма Biointeractions Ltd, Ридинг, Великобритания).The sensors were made according to the method described in example 2. After that, a spacer layer was applied to the sensors according to the method described in example 2. The spacer layer was made from Lipidure CM 5206 (NOF Corporation, Japan) or it was created from Adapt ™ (Biointeractions Ltd, Reading, UK).

Датчики без спейсерного слоя, датчики со спейсерным слоем, изготовленным из Lipidure СМ 5206, или датчики со спейсерным слоем, изготовленным из Adapt™M, инкубировали с моноцитами линии ТНР-1 и анализировали индукцию маркеров воспаления.Sensors without a spacer layer, sensors with a spacer layer made of Lipidure CM 5206, or sensors with a spacer layer made of Adapt ™ M were incubated with THP-1 monocytes and the induction of inflammatory markers was analyzed.

Клетки линии ТНР-1 культивировали в присутствии датчиков в течение 24 ч при 37°С. Затем клетки собирали центрифугированием. Супернатант использовали для определения высвобождения цитокинов, в то время как клеточный дебрис ресуспендировали в ЗФР, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), и использовали для анализа экспрессии белка клеточной поверхности CD54 (известного также ка ICAM-1, биомаркер воспаления). Клетки линии ТНР-1 инкубировали с антителом к CD54, конъюгированным с флуоресцентным красителем фикоэритрином (фирма BD Bioscience). После инкубации в течение 45 мин при 4°С клетки отмывали в ЗФР/1% БСА и определяли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) от 10000 клеток с использованием проточного цитометра (длина волны возбуждения 532 нм, длина волны испускания 585 нм) (устройство BD FACSArray, фирма BD Bioscience). По сравнению с необработанными ТНР-1-клетками инкубация с датчиками, не имеющими покрытия, приводила к повышению относительного уровня экспрессии CD54 (6-кратная индукция), о чем свидетельствуют высокие значения MFI (фиг. 11). Инкубация клеток с датчиками, имеющими покрытие в виде спейсерных слоев из СМ 5206 или Adapt™, приводила к ослаблению экспрессии CD54 на 45% или 41% соответственно.THP-1 cells were cultured in the presence of sensors for 24 hours at 37 ° C. Then the cells were harvested by centrifugation. The supernatant was used to determine cytokine release, while cell debris was resuspended in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) and used to analyze the expression of the cell surface protein CD54 (also known as ICAM-1, an inflammatory biomarker). THP-1 cells were incubated with an anti-CD54 antibody conjugated to a fluorescent dye phycoerythrin (BD Bioscience). After incubation for 45 min at 4 ° C, the cells were washed in PBS / 1% BSA and the average fluorescence intensity (MFI) of 10,000 cells was determined using a flow cytometer (excitation wavelength 532 nm, emission wavelength 585 nm) (BD FACSArray device , company BD Bioscience). Compared to untreated THP-1 cells, incubation with uncoated sensors increased the relative expression level of CD54 (6-fold induction), as evidenced by high MFI values (Fig. 11). Incubation of cells with sensors coated with spacer layers from CM 5206 or Adapt ™ resulted in weakened CD54 expression by 45% or 41%, respectively.

Супернатант применяли для определения количества цитокинов интерлейкина-8 (IL-8) и «моноцитарного хемотаксического белка-1» (МСР-1) с помощью иммуноанализа с использованием гранул согласно инструкциям производителя (наборы Flex, фирма BD Bioscience) и последующего анализа методом проточной цитометрии (BD FACSArray, фирма BD Bioscience). Анализ данных осуществляли с использованием программного обеспечения FCAP array, версия 1.0.1 (фирма Soft flow Hungary Ltd.).The supernatant was used to determine the amount of cytokines interleukin-8 (IL-8) and "monocytic chemotactic protein-1" (MCP-1) using immunoassay using granules according to the manufacturer's instructions (Flex kits, BD Bioscience) and subsequent analysis by flow cytometry (BD FACSArray, BD Bioscience). Data analysis was performed using FCAP array software, version 1.0.1 (Soft flow Hungary Ltd.).

По сравнению с необработанными ТНР-1-клетками датчики, не имеющие покрытия, индуцировали сильное высвобождение IL-8 (49 по сравнению с 197 пг/мл) (фиг. 12а) и МСР-1 (6 по сравнению с 48 пг/мл) (фиг. 12б). Высвобождение IL-8 и МСР-1 снижалось в том случае, когда датчики имели покрытие в виде спейсерных слоев из СМ 5206 или Adapt™. Датчики с покрытием из Adapt™ индуцировали высвобождение 100 пг/мл IL-8 и 25 пг/мл МСР-1. Датчики с покрытием из СМ 5206 приводили к секреции 125 пг/мл IL-8 и 18 пг/мл МСР-1.Compared to untreated THP-1 cells, uncoated sensors induced a strong release of IL-8 (49 compared to 197 pg / ml) (Fig. 12a) and MCP-1 (6 compared to 48 pg / ml) (Fig. 12b). The release of IL-8 and MCP-1 decreased when the sensors were coated with spacer layers of CM 5206 or Adapt ™. Adapt ™ coated sensors induced the release of 100 pg / ml IL-8 and 25 pg / ml MCP-1. Sensors coated with CM 5206 resulted in the secretion of 125 pg / ml IL-8 and 18 pg / ml MCP-1.

Взятые в совокупности, эти данные демонстрируют, что спейсерные слои ослабляют индукцию трех хорошо известных биомаркеров воспаления, а именно, CD54, IL-8 и МСР-1.Taken together, these data demonstrate that spacer layers weaken the induction of three well-known inflammatory biomarkers, namely, CD54, IL-8, and MCP-1.

Для анализа роли адсорбции белка в активации ТНР-1 -клеток на планшеты для культур тканей наносили покрытие из СМ 5206, Adapt™ или Eudragit E100. Затем спейсер инкубировали с человеческим фибриногеном (фирма Sigma-Aldrich). Клетки линии ТНР-1 инкубировали с различными слоями спейсеры + фибриноген. После инкубации в течение 48 ч при 37°С клетки осаждали центрифугированием и анализировали супернатант в отношении высвобождения IL-8. В качестве контроля клетки выращивали в культуральных планшетах без спейсера, но покрытых фибриногеном (материал, из которого сделан планшет, представлял собой полистирол). Как продемонстрировано на фиг. 13, указанные клетки высвобождали 89 пг/мл IL-8. Из клеток, которые культивировали на СМ 5206 + фибриногене или на Adapt™ + фибриногене, высвобождалось 68 или 49 пг/мл соответственно. В отличие от этого, из клеток, выращенных на Eudragit E100 + фибриногене, высвобождалось 206 пг/мл IL-8. Следует отметить, что клетки, выращенные на Eudragit E100 без фибриногенового покрытия, секретировали лишь 59 пг/мл IL-8. Адсорбция фибриногена на полимерной поверхности и конформационные изменения белка могут приводить к экспозиции сайта связывания МАС-1. Клетки линии ТНР-1, активированные посредством связывания MAC-1 с их рецептором, высвобождают цитокины, такие как IL-8, и тем самым запускают воспалительный ответ. Таким образом, спейсерные слои, состоящие из Adapt™ или СМ 5206, позволяют избегать отложения белка и экспозиции структурных мотивов на поверхностях (таких как датчики) и тем самым минимизировать воспалительные реакции против имплантатов.To analyze the role of protein adsorption in the activation of THP-1 cells, tissue culture plates were coated with CM 5206, Adapt ™ or Eudragit E100. The spacer was then incubated with human fibrinogen (Sigma-Aldrich). THP-1 cells were incubated with various layers of spacers + fibrinogen. After an incubation of 48 hours at 37 ° C., the cells were pelleted by centrifugation and the supernatant was analyzed for IL-8 release. As a control, cells were grown in culture plates without a spacer but coated with fibrinogen (the material from which the plate was made was polystyrene). As shown in FIG. 13, these cells released 89 pg / ml of IL-8. From cells that were cultured on CM 5206 + fibrinogen or Adapt ™ + fibrinogen, 68 or 49 pg / ml, respectively, were released. In contrast, 206 pg / ml IL-8 was released from cells grown on Eudragit E100 + fibrinogen. It should be noted that cells grown on Eudragit E100 without fibrinogen coating secreted only 59 pg / ml IL-8. Fibrinogen adsorption on the polymer surface and conformational changes in the protein can lead to exposure of the MAC-1 binding site. THP-1 cells activated by binding of MAC-1 to their receptor release cytokines, such as IL-8, and thereby trigger an inflammatory response. Thus, spacer layers consisting of Adapt ™ or CM 5206 avoid protein deposition and exposure to structural motifs on surfaces (such as sensors) and thereby minimize inflammatory responses against implants.

Пример 7. Ограниченный гемолиз, обусловленный датчиками с нанесенным спейсерным слоемExample 7. Limited hemolysis due to sensors with a spacer layer

Датчики изготавливали согласно методу, описанному в примере 2. После этого на датчики наносили спейсерный слой как описано в примере 2. Спейсерный слой создавали с использованием Lipidure СМ 5206 (фирма NOF Corporation, Япония) или Adapt™ (фирма Biointeractions Ltd, Ридинг, Великобритания).The sensors were made according to the method described in example 2. After that, a spacer layer was applied to the sensors as described in example 2. A spacer layer was created using Lipidure CM 5206 (NOF Corporation, Japan) or Adapt ™ (Biointeractions Ltd, Reading, UK) .

Анализировали гемолитическую способность датчиков без спейсерного слоя, датчиков со спейсерным слоем, состоящим из Lipidure СМ 5206, или датчиков со спейсерным слоем, состоящим из Adapt™. Для этой цели датчики с общей площадью поверхности 6 см² инкубировали с эритроцитами и затем определяли лизис путем измерения высвобождения гемоглобина в супернатант. Эритроциты выделяли из свежей человеческой крови путем центрифугирования (для того, чтобы избежать коагуляции, добавляли цитрат). Затем их отмывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР) и после этого разводили с помощью ЗФР в соотношении 1:40. Суспензию эритроцитов инкубировали с датчиками в течение 24 ч при 37°С в темноте на вращающейся платформе (350 об/мин). После этого клетки осаждали путем центрифугирования и измеряли содержание гемоглобина в супернатанте спектроскопическим методом путем измерения абсорбции в супернатанте при длине волны 575 нм. Результаты представляли в виде литического индекса (в %), который представляет собой высвобождение гемоглобина в образце, деленное на высвобождение гемоглобина в положительном контроле (т.е. полный осмотический лизис эритроцитов в дистиллированной воде). Результаты представлены на фиг. 14.The hemolytic ability of sensors without a spacer layer, sensors with a spacer layer consisting of Lipidure CM 5206, or sensors with a spacer layer consisting of Adapt ™ was analyzed. For this purpose, sensors with a total surface area of 6 cm ^{2 were} incubated with red blood cells and then lysis was determined by measuring the release of hemoglobin into the supernatant. Red blood cells were isolated from fresh human blood by centrifugation (citrate was added to avoid coagulation). Then they were washed with phosphate buffered saline (PBS) and then diluted with PBS in a ratio of 1:40. The erythrocyte suspension was incubated with sensors for 24 hours at 37 ° C in the dark on a rotating platform (350 rpm). After that, the cells were besieged by centrifugation and the hemoglobin content in the supernatant was measured spectroscopically by measuring the absorption in the supernatant at a wavelength of 575 nm. The results were presented as a lytic index (in%), which represents the release of hemoglobin in the sample divided by the release of hemoglobin in the positive control (i.e., complete osmotic lysis of red blood cells in distilled water). The results are shown in FIG. fourteen.

Датчики без спейсерного слоя вызывали значительный гемолиз, характеризующийся высоким гемолитическим индексом, равным 47,4%. Покрытие датчиков спейсерным слоем из Lipidure СМ 5206 снижало гемолитическую способность датчиков, что характеризовалось литическим индексом, составлявшим 14,7%. Датчики, покрытые спейсерным слоем из Adapt™, вызывали лишь незначительный гемолиз, характеризовавшийся литическим индексом, составлявшим 7,5%, что находилось в пределах литических индексов, установленных для отрицательного контроля (т.е. когда эритроциты в ЗФР инкубировали в отсутствии какого-либо тестируемого материала) или только Adapt™. Полученные результаты свидетельствуют о защитной функции спейсерного слоя, приводящей к снижению гемолиза.Sensors without a spacer layer caused significant hemolysis, characterized by a high hemolytic index of 47.4%. Coating the sensors with a Lipidure CM 5206 spacer layer reduced the hemolytic ability of the sensors, which was characterized by a lytic index of 14.7%. Sensors coated with an Adapt ™ spacer layer caused only slight hemolysis, characterized by a lytic index of 7.5%, which was within the lytic indices established for negative control (i.e. when red blood cells were incubated in PBS in the absence of any test material) or Adapt ™ only. The results obtained indicate the protective function of the spacer layer, leading to a decrease in hemolysis.

Claims (54)

1. Электродная система, предназначенная для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, содержащая электрод с иммобилизованными молекулами фермента, необязательно диффузионный барьер, который контролирует диффузию аналита из окружающей электродную систему среды к молекулам фермента,1. An electrode system designed to measure analyte concentration under in conditions vivo, containing an electrode with immobilized enzyme molecules, optionally a diffusion barrier that controls the diffusion of the analyte from the environment surrounding the electrode system to the enzyme molecules, отличающаяся тем, что спейсерная мембрана образует по меньшей мере часть наружного слоя электродной системы, и где спейсерная мембрана содержит гидрофильный сополимер акриловых и/или метакриловых мономеров, где гидрофильный сополимер содержит от 60 до 85 мол.% гидрофильных мономеров, и содержит вплоть до 40 мол.% гидрофобных акриловых и/или метакриловых мономеров.characterized in that the spacer membrane forms at least part of the outer layer of the electrode system, and where the spacer membrane contains a hydrophilic copolymer of acrylic and / or methacrylic monomers, where the hydrophilic copolymer contains from 60 to 85 mol.% hydrophilic monomers, and contains up to 40 mol .% hydrophobic acrylic and / or methacrylic monomers. 2. Электродная система по п.1, в которой спейсерная мембрана представляет собой гидрофильный сополимер по меньшей мере 2 или 3 акриловых и/или метакриловых мономеров.2. The electrode system according to claim 1, in which the spacer membrane is a hydrophilic copolymer of at least 2 or 3 acrylic and / or methacrylic monomers. 3. Электродная система по п.1 или 2, в которой гидрофильные мономеры выбраны из сложных гидрофильных (мет)акриловых эфиров с полярными группами, такими, например, как ОН, OCH₃ или OC₂H₅, гидрофильных (мет)акриламидов, (мет)акриловой кислоты или их комбинаций.3. The electrode system according to claim 1 or 2, in which the hydrophilic monomers are selected from complex hydrophilic (meth) acrylic esters with polar groups, such as, for example, OH, OCH ₃ or OC ₂ H ₅ , hydrophilic (meth) acrylamides, ( meth) acrylic acid or combinations thereof. 4. Электродная система по п. 3, в которой гидрофильные мономеры выбраны из:4. The electrode system according to claim 3, in which the hydrophilic monomers are selected from: 2-гидроксиэтилакрилата,2-hydroxyethyl acrylate, 2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА),2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), 2-метоксиэтилакрилата,2-methoxyethyl acrylate, 2-метоксиэтилметакрилата,2-methoxyethyl methacrylate, 2-этоксиэтилакрилата,2-ethoxyethyl acrylate, 2-этоксиэтилметакрилата,2-ethoxyethyl methacrylate, 2- или 3-гидроксипропилакрилата,2- or 3-hydroxypropyl acrylate, 2- или 3-гидроксипропилметакрилата (2- или 3-ГПМА),2- or 3-hydroxypropylmethacrylate (2- or 3-GPMA), 2- или 3-метоксипропилакрилата,2- or 3-methoxypropyl acrylate, 2- или 3-метоксипропилметакрилата,2- or 3-methoxypropylmethacrylate, 2- или 3-этоксипропилакрилата,2- or 3-ethoxypropyl acrylate, 2- или 3-этоксипропилметакрилата,2- or 3-ethoxypropylmethacrylate, 1- или 2-глицерилакрилата,1- or 2-glyceryl acrylate, 1- или 2-глицерилметакрилата,1- or 2-glyceryl methacrylate, акриламида,acrylamide метакриламида,methacrylamide N-алкил- или N,N-диалкилакриламида иN-alkyl or N, N-dialkyl acrylamide and N-алкил- или N,N-диалкилметиламида,N-alkyl or N, N-dialkylmethylamide, где алкил содержит 1-3 атома С,where alkyl contains 1-3 C atoms, акриловой кислоты,acrylic acid метакриловой кислотыmethacrylic acid и их комбинаций,and their combinations, предпочтительно из 2-гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА), 2-гидроксипропилметакрилата (2-ГПМА) и их комбинаций.preferably from 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), 2-hydroxypropyl methacrylate (2-GPMA), and combinations thereof. 5. Электродная система по пп.1, 2, 4, в которой гидрофильный сополимер спейсерной мембраны содержит по меньшей мере 70 мол.% гидрофильных мономеров.5. The electrode system according to claims 1, 2, 4, in which the hydrophilic copolymer of the spacer membrane contains at least 70 mol.% Hydrophilic monomers. 6. Электродная система по пп.1, 2, 4, в которой сополимер, из которого выполнена спейсерная мембрана, содержит вплоть до 30 мол.% гидрофобных мономеров.6. The electrode system according to claims 1, 2, 4, in which the copolymer from which the spacer membrane is made contains up to 30 mol% of hydrophobic monomers. 7. Электродная система по п. 6, в которой гидрофобные мономеры выбраны из:7. The electrode system according to claim 6, in which the hydrophobic monomers are selected from: метилакрилата,methyl acrylate метилметакрилата (ММА),methyl methacrylate (MMA), этилакрилата,ethyl acrylate этилметакрилата (ЭМА),ethyl methacrylate (EMA), н-пропилакрилата или изопропилакрилата,n-propyl acrylate or isopropyl acrylate, н-пропилметакрилата или изопропилметакрилата,n-propyl methacrylate or isopropyl methacrylate, н-бутилакрилата,n-butyl acrylate, н-бутилметакрилата (БМА),n-butyl methacrylate (BMA), неопентилакрилата,neopentyl acrylate неопентилметакрилатаneopentyl methacrylate и их комбинаций,and their combinations, предпочтительно из метилметакрилата (ММА), н-бутилметакрилата (БМА) и их комбинаций.preferably from methyl methacrylate (MMA), n-butyl methacrylate (BMA), and combinations thereof. 8. Электродная система п.7, в которой гидрофобные мономеры представляют собой метилметакрилат (ММА) или н-бутилметакрилат (БМА), а гидрофильные мономеры представляют собой 2-гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА) и/или 2-гидроксипропилметакрилат (2-ГПМА).8. The electrode system of claim 7, in which the hydrophobic monomers are methyl methacrylate (MMA) or n-butyl methacrylate (BMA), and the hydrophilic monomers are 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and / or 2-hydroxypropyl methacrylate (2-GPMA). 9. Электродная система по пп.7 и 8, в которой спейсерная мембрана содержит сополимер н-бутилметакрилата (БМА), 2-гидроксиэтилметакрилата (2-ГЭМА) и 2-гидроксипропилметакрилата (2-ГПМА), где сополимер содержит примерно 80 мол.% мономеров 2-ГЭМА.9. The electrode system according to claims 7 and 8, in which the spacer membrane contains a copolymer of n-butyl methacrylate (BMA), 2-hydroxyethyl methacrylate (2-HEMA) and 2-hydroxypropyl methacrylate (2-GPMA), where the copolymer contains about 80 mol.% 2-HEMA monomers. 10. Электродная система по пп.1, 2, 4, 7 и 8, в которой гидрофильный сополимер представляет собой статистический сополимер или блок-сополимер.10. The electrode system according to claims 1, 2, 4, 7, and 8, in which the hydrophilic copolymer is a random copolymer or block copolymer. 11. Электродная система по пп.1, 2, 4, 7 и 8, в которой толщина спейсерной мембраны составляет менее чем примерно 20 мкм, предпочтительно менее чем 5 мкм, более предпочтительно от примерно 1 до примерно 3 мкм.11. The electrode system according to claims 1, 2, 4, 7 and 8, in which the thickness of the spacer membrane is less than about 20 microns, preferably less than 5 microns, more preferably from about 1 to about 3 microns. 12. Электродная система по пп.1, 2, 4, 7 и 8, в которой относительное поглощение воды гидрофильным сополимером не превышает 50 мас.%, предпочтительно 40 мас.%, более предпочтительно 30 мас.%, в пересчете на общую массу сополимера.12. The electrode system according to claims 1, 2, 4, 7 and 8, in which the relative absorption of water by the hydrophilic copolymer does not exceed 50 wt.%, Preferably 40 wt.%, More preferably 30 wt.%, Calculated on the total weight of the copolymer . 13. Электродная система по пп.1, 2, 4, 7 и 8, в которой диффузионный барьер содержит гидрофильный полиуретан или блок-сополимер, имеющий по меньшей мере один гидрофильный блок и по меньшей мере один гидрофобный блок.13. The electrode system according to claims 1, 2, 4, 7 and 8, in which the diffusion barrier contains a hydrophilic polyurethane or block copolymer having at least one hydrophilic block and at least one hydrophobic block. 14. Электродная система по пп.1, 2, 4, 7 и 8, которая содержит противоэлектрод (2), имеющий электрический проводник (2а), рабочий электрод (1), имеющий электрический проводник (1а), на котором размещены иммобилизованные молекулы фермента (5) и необязательно диффузионный барьер (8), и спейсерную мембрану (9), которая покрывает по меньшей мере рабочий электрод (1) и необязательно также противоэлектрод (2).14. The electrode system according to claims 1, 2, 4, 7 and 8, which contains a counter electrode (2) having an electrical conductor (2a), a working electrode (1) having an electrical conductor (1a), on which immobilized enzyme molecules are placed (5) and optionally a diffusion barrier (8), and a spacer membrane (9) that covers at least the working electrode (1) and optionally also the counter electrode (2). 15. Датчик, предназначенный для измерения концентрации аналита в условиях in vivo, содержащий электродную систему по пп.1-14.15. The sensor is designed to measure the concentration of the analyte in vivo, containing the electrode system according to claims 1-14. 16. Датчик по п.15, предназначенный для измерения глюкозы.16. The sensor of claim 15, for measuring glucose. 17. Применение гидрофильного сополимера акриловых и/или метакриловых мономеров, в котором гидрофильный сополимер содержит от 60 до 85 мол.% гидрофильных мономеров, в качестве спейсерной мембраны для ферментной электродной системы по одному из пп.1-14.17. The use of a hydrophilic copolymer of acrylic and / or methacrylic monomers, in which the hydrophilic copolymer contains from 60 to 85 mol.% Hydrophilic monomers, as a spacer membrane for the enzyme electrode system according to one of claims 1 to 14. 18. Применение по п.17 для минимизации реакции против чужеродного тела (FRB), направленной против ферментной электродной системы.18. The use of claim 17 to minimize the reaction against a foreign body (FRB) directed against the enzyme electrode system.

Images