RU2606693C1 - Method for preparation of biologically active substance, based on vermiculture - Google Patents

Method for preparation of biologically active substance, based on vermiculture Download PDF

Info

Publication number
RU2606693C1
RU2606693C1 RU2015138316A RU2015138316A RU2606693C1 RU 2606693 C1 RU2606693 C1 RU 2606693C1 RU 2015138316 A RU2015138316 A RU 2015138316A RU 2015138316 A RU2015138316 A RU 2015138316A RU 2606693 C1 RU2606693 C1 RU 2606693C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
hours
worms
biologically active
vermiculture
extract
Prior art date
Application number
RU2015138316A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Людмила Дмитриевна Тимченко
Игорь Владимирович Ржепаковский
Давид Александрович Арешидзе
Марина Николаевна Сизоненко
Мария Александровна Козлова
Сергей Иванович Писков
Иван Александрович Семин
Валерий Николаевич Вакулин
Надежда Ивановна Бондарева
Галина Николаевна Блажнова
Светлана Суреновна Аванесян
Original Assignee
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Кавказский федеральный университет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Кавказский федеральный университет" filed Critical федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Кавказский федеральный университет"
Priority to RU2015138316A priority Critical patent/RU2606693C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2606693C1 publication Critical patent/RU2606693C1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/62—Leeches; Worms, e.g. cestodes, tapeworms, nematodes, roundworms, earth worms, ascarids, filarias, hookworms, trichinella or taenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: pharmaceutics.
SUBSTANCE: invention relates to pharmaceutical industry, namely to method for preparation of low-molecular biologically active substance, based on vermiculture. Method for preparation of low-molecular biologically active substance, based on vermiculture, consists in fact, that collection of red californian worms into closed container is made and it is placed in refrigeration chamber, then they are washed with running water and put into succinic acid and cooled, then worms with acid are placed in low-temperature refrigerator, after that they are thawed, then they are crushed in blender and filtered, homogenized using high-pressure homogenizer, extract pH is determined and acidity regulator – aqueous solution of sodium bicarbonate is added and they are mixed with saccharose-gelatine medium, autoclaved, obtained solution is frozen and lyophilized under certain conditions.
EFFECT: method, described above, enables to obtain more stable and effective immunotropic agent with anti-inflammatory effect.
1 cl, 3 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, в r частности способу получения биологически активной субстанции на основе тканей красного калифорнийского дождевого червя (Eisenia foetidae).The invention relates to biotechnology and veterinary medicine, in particular, to a method for producing a biologically active substance based on tissues of a red California earthworm (Eisenia foetidae).

Полученная биологически активная субстанция на основе тканей красного калифорнийского червя включает широкий перечень биологически активных веществ, оказывающих иммуномодулирующий и противовоспалительный эффекты.The obtained biologically active substance based on the tissues of the red California worm includes a wide range of biologically active substances that have immunomodulating and anti-inflammatory effects.

Уровень техникиState of the art

Одним из активно развивающихся направлений современной биологии и медицины является получение и изучение биологически активных веществ из сырья природного происхождения. В настоящее время мировая наука в качестве источника природного сырья для получения биологически активных веществ обращает внимание на вермикультуру различных видов земляных червей, в частности красного калифорнийского червя Eisenia foetida.One of the actively developing areas of modern biology and medicine is the production and study of biologically active substances from raw materials of natural origin. Currently, world science as a source of natural raw materials for the production of biologically active substances draws attention to the vermiculture of various types of earthworms, in particular, the California red worm Eisenia foetida.

Развитие биотехнологии интенсифицировало исследование фармакологических эффектов вермикультур. Исследования, посвященные земляным червям, выявили наличие в их организмах разнообразных биологически активных агентов, которые могут быть использованы как основа для создания фармакологических препаратов. Эти вещества проявляют различные типы биологической активности, такие как антикоагуляционную, противомикробную, фибринолитическую, противоопухолевую. Таким образом, биологически активные вещества, получаемые из вермикультур червей, могут использоваться для лечения различных заболеваний (Cooper E.L. et al., 2012).The development of biotechnology has intensified the study of the pharmacological effects of vermicultures. Studies on earthworms have revealed the presence in their bodies of a variety of biologically active agents that can be used as the basis for the creation of pharmacological preparations. These substances exhibit various types of biological activity, such as anticoagulation, antimicrobial, fibrinolytic, antitumor. Thus, biologically active substances obtained from vermicure worms can be used to treat various diseases (Cooper E.L. et al., 2012).

Целомоциты земляных червей синтезируют и секретируют иммунопротективные вещества, вызывающие агглютинацию, опсонизацию и последующий лизис антигенов. Кроме того, молекулы этих веществ принимают участие в реакциях коагуляции и фенолоксидазном каскаде (Mohrig W. et al., 1996; Cooper E.L. et al., 2002).Earthworm coelomocytes synthesize and secrete immunoprotective substances that cause agglutination, opsonization and subsequent lysis of antigens. In addition, the molecules of these substances take part in coagulation reactions and phenol oxidase cascade (Mohrig W. et al., 1996; Cooper E.L. et al., 2002).

Гликопротеиды под названием лектины, содержащиеся в земляных червях, - важнейший элемент процесса агглютинации. Протеазы земляных червей являются крайне важным фактором для иммунной системы, принимая во внимание их участие в разрушении антигенов (

Figure 00000001
К., Cerenius L., 1998).Glycoproteins called lectins in earthworms are an essential element of the agglutination process. Earthworm proteases are an extremely important factor for the immune system, given their involvement in the destruction of antigens (
Figure 00000001
K., Cerenius L., 1998).

Земляные черви являются многообещающим источником биологически активных соединений и фибринолитических энзимов. Так, некоторые виды земляных червей, в том числе Lumbricus rubellas и Eisenia foetida, являются доказанным источником сильнодействующих и безопасных для организма фибринолитических энзимов, проявляющих клинически подтвержденный терапевтический и профилактический эффект в отношении тромбозных заболеваний (Nakajima N. et al., 1993;

Figure 00000002
М. et al., 1993;
Figure 00000003
М. et al., 2005;
Figure 00000004
P. et al., 2006;
Figure 00000005
et al., 2011).Earthworms are a promising source of biologically active compounds and fibrinolytic enzymes. So, some types of earthworms, including Lumbricus rubellas and Eisenia foetida, are a proven source of potent and safe for the body fibrinolytic enzymes that have a clinically proven therapeutic and prophylactic effect against thrombotic diseases (Nakajima N. et al., 1993;
Figure 00000002
M. et al., 1993;
Figure 00000003
M. et al., 2005;
Figure 00000004
P. et al., 2006;
Figure 00000005
et al., 2011).

Противоопухолевый эффект макромолекул, полученных из земляных червей, был показан в исследованиях in vitro и in vivo против клеток гепатомы и гепатоцеллюлярной карциномы, была выявлена индукция апоптического процесса (

Figure 00000006
М. et al., 1993; Chen Н. et al., 2001; YuanL. et al., 2004; Sherman M., Chen H. et al., 2007).The antitumor effect of macromolecules obtained from earthworms was shown in in vitro and in vivo studies against hepatoma cells and hepatocellular carcinoma, an induction of the apoptotic process was revealed (
Figure 00000006
M. et al., 1993; Chen N. et al., 2001; YuanL. et al., 2004; Sherman M., Chen H. et al., 2007).

Кроме того, были выявлены противовоспалительный и регенеринстимулирующий эффекты, а также антибактериальная активность экстрактов земляных червей (Stein Е. et al., 1982; Valembois P. et al., 1982; Hirigoyenberry F. et al., 1990; Milochau A. et al., 1997).In addition, anti-inflammatory and regenerative stimulating effects, as well as the antibacterial activity of earthworm extracts, were identified (Stein E. et al., 1982; Valembois P. et al., 1982; Hirigoyenberry F. et al., 1990; Milochau A. et al ., 1997).

Исследования различных авторов выявляют также и другие биологические функции целомической жидкости земляных червей. В их число входят бактериостатическая (

Figure 00000007
М. et al., 2005), протеолитическая (Nakajima F. et al., 1993), цито- и гемолитическая (
Figure 00000004
P. et al., 2006;
Figure 00000005
M. et al., 2011) и митогенная активность (
Figure 00000006
M. et al., 1993).Studies by various authors also reveal other biological functions of the coelomic fluid of earthworms. These include bacteriostatic (
Figure 00000007
M. et al., 2005), proteolytic (Nakajima F. et al., 1993), cyto- and hemolytic (
Figure 00000004
P. et al., 2006;
Figure 00000005
M. et al., 2011) and mitogenic activity (
Figure 00000006
M. et al., 1993).

Вышеперечисленные данные позволяют сделать вывод об обширных перспективах терапевтического применения биологически активных макромолекул, получаемых из земляных червей.The above data allow us to conclude about the vast prospects for the therapeutic use of biologically active macromolecules obtained from earthworms.

Известен способ получения мази для лечения инфицированных ран, который заключается в том, что она содержит экстракт биомассы красного навозного, красного калифорнийского червей вида Eisenia foetidae, а в качестве мазевой основы - полиэтиленоксид 400 и 1500, образованные сплавлением их при температуре 35-41°С при соотношении 7:3 (см. патент на изобретение РФ 2180574, кл. A61K 35/56).A known method of obtaining ointments for the treatment of infected wounds, which consists in the fact that it contains biomass extract of red dung, red California worms of the species Eisenia foetidae, and as an ointment base, polyethylene oxide 400 and 1500 formed by fusing them at a temperature of 35-41 ° C with a ratio of 7: 3 (see patent for invention of the Russian Federation 2180574, class A61K 35/56).

Недостатком данного способа является ограниченность области применения и отсутствие информации о способе получения экстракта.The disadvantage of this method is the limited scope and lack of information about the method of obtaining the extract.

Известна питательная среда для культивирования гетеротрофных бактерий. Среда для культивирования гетеротрофных бактерий содержит в качестве белковой основы красных калифорнийских червей 90-100 г, пептон 9-11 г, хлористый натрий 4-5 г, агар-агар 18-20 г, дистиллированная вода до 1 л. Изобретение обеспечивает простоту приготовления, доступность субстрата высокопитательными свойствами и низкой стоимостью (см. патент на изобретение РФ 2276188, кл. C12N 1/20).Known nutrient medium for the cultivation of heterotrophic bacteria. The medium for culturing heterotrophic bacteria contains 90-100 g, peptone 9-11 g, sodium chloride 4-5 g, agar-agar 18-20 g, distilled water up to 1 l as the protein base of red California worms. The invention provides ease of preparation, the availability of the substrate with highly nutritious properties and low cost (see patent for the invention of the Russian Federation 2276188, CL C12N 1/20).

Недостатком данного способа является отсутствие иммунотропного действия.The disadvantage of this method is the lack of immunotropic action.

Известен энтеральный препарат, содержащий экстракт биомассы красного калифорнийского дождевого червя Eisenia foetidae в виде таблеток «Вермин». Сущность изобретения: предлагаемая таблетированная форма препарата содержит в качестве активного компонента экстракт биомассы красного калифорнийского дождевого червя при следующем соотношении масс в граммах на одну таблетку весом 0,200 г: экстракт биомассы красного калифорнийского дождевого червя Eisenia foetidae 0,010-0,020, целлюлоза микрокристаллическая 0,187-0,177, кальция стеарат или магния стеарат 0,001, крахмал картофельный или кукурузный 0,002. Технический результат: расширение ассортимента средств для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний различного генеза (см. патент на изобретение РФ 2177784, кл. A61K 9/00, A61K 35/00).Known enteric preparation containing biomass extract of the red California earthworm Eisenia foetidae in the form of tablets "Vermin". The inventive tablet form of the preparation contains, as an active component, an extract of red californian earthworm biomass in the following ratio of grams per tablet weighing 0.200 g: an extract of biomass red californian earthworm Eisenia foetidae 0.010-0.020, microcrystalline cellulose 0.187-0.177, calcium stearate or magnesium stearate 0.001, potato or corn starch 0.002. Effect: expanding the range of products for the treatment and prevention of immunodeficiency states of various origins (see patent for the invention of the Russian Federation 2177784, class A61K 9/00, A61K 35/00).

Недостатком данного способа является отсутствие информации о способе получения экстракта и высокая себестоимость.The disadvantage of this method is the lack of information about the method of obtaining the extract and the high cost.

Известен способ производства белково-витаминной кормовой муки из гибрида красного калифорнийского дождевого червя и вермикомпостированных яблочных выжимок. Способ производства кормовой муки включает введение дождевых червей в субстрат из яблочных выжимок, вермикомпостирование, последующую сушку и измельчение. Измельченный субстрат, увлажненный до 80-90%, размещают буртами на открытых площадках при температуре не ниже 15°С или в отапливаемом помещении, заселяют червями и вермикомпостируют в течение 20 суток. Сушат червей и вермикомпост, конвективным методом в течение 2 часов при температуре 21° и в течение 2 часов при температуре 24-27° в вакууме. Полученную сухую массу измельчают на мельнице до размера частиц 0,02-0,03 мм. Использование заявленного изобретения позволит получить кормовую добавку с высокой питательной ценностью (см. патент на изобретение РФ 2470521, кл. A23K 1/00).A known method of producing protein-vitamin feed meal from a hybrid of red California earthworm and vermicomposted apple pomace. A method for the production of fodder flour includes the introduction of earthworms into a substrate from apple pomace, vermicomposting, subsequent drying and grinding. The ground substrate, moistened to 80-90%, is placed with collars in open areas at a temperature of at least 15 ° C or in a heated room, colonized by worms and vermicompost for 20 days. The worms and vermicompost are dried using the convective method for 2 hours at 21 ° C and for 2 hours at 24-27 ° C in vacuum. The resulting dry mass is ground in a mill to a particle size of 0.02-0.03 mm. Using the claimed invention will allow to obtain a feed additive with high nutritional value (see patent for the invention of the Russian Federation 2470521, CL A23K 1/00).

Недостатком данного способа является отсутствие иммунотропного действия.The disadvantage of this method is the lack of immunotropic action.

Известен способ производства сухого порошка из дождевых червей, который включает стадии: нахождение живых дождевых червей на свету, удаление образованных на их коже наносов, контакта дождевых червей с органической кислотой и/или водным раствором органической кислоты, промывка дождевых червей водой, измельчение живых дождевых червей в гомогенат, лиофилизация гомогената и термообработка высушенного продукта при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет получить стерилизованный продукт из дождевых червей с сохраненной ферментативной активностью (см. патент на изобретение РФ 2438681, кл. A61K 35/56).A known method of producing dry powder from earthworms, which includes the steps of: finding live earthworms in the light, removing sediment formed on their skin, contacting the earthworms with organic acid and / or an aqueous solution of organic acid, washing the earthworms with water, grinding live earthworms homogenate, lyophilization of the homogenate and heat treatment of the dried product under certain conditions. The above method allows to obtain a sterilized product from earthworms with preserved enzymatic activity (see patent for the invention of the Russian Federation 2438681, CL A61K 35/56).

Недостатком данного способа приготовления препарата является малый выход действующих веществ, отсутствие иммунотропного действия.The disadvantage of this method of preparation of the drug is a low yield of active substances, the absence of immunotropic effects.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ получения сухого порошка из дождевых червей, согласно которому червей помещают в водный раствор органических кислот (например - янтарной кислоты), затем промывают червей водой, измельчают, замораживают полученный гомогенат при температуре от -60 до -100°С, полученный гомогенат лиофильно высушивают. Вышеописанный способ позволяет получить субстанцию для приготовления антигиперлипедимических, антидиабетических, гипотензивных и антигипотензивных средств (см. патент на изобретение US 5024844 А).The closest in technical essence and the achieved positive effect and adopted by the authors for the prototype is a method for producing dry powder from earthworms, according to which the worms are placed in an aqueous solution of organic acids (for example, succinic acid), then they are washed with water, crushed, and the resulting homogenate is frozen at at a temperature of from -60 to -100 ° C, the resulting homogenate is freeze-dried. The above method allows to obtain a substance for the preparation of antihyperlipidemic, anti-diabetic, antihypertensive and antihypertensive drugs (see patent for invention US 5024844 A).

Недостатком данного способа приготовления препарата является наличие в субстанции большого количества высокомолекулярных балластных компонентов, отсутствие иммунотропного действия и противовоспалительного эффекта.The disadvantage of this method of preparation of the drug is the presence in the substance of a large number of high molecular weight ballast components, the absence of immunotropic effects and anti-inflammatory effect.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого способа, сводится к иммуномодуляции организма, получению более стабильного низкомолекулярного и эффективного иммунотропного средства с противовоспалительным эффектом.The technical result that can be achieved using the proposed method is to immunomodulate the body, to obtain a more stable low molecular weight and effective immunotropic agent with anti-inflammatory effect.

Технический результат достигается с помощью способа приготовления низкомолекулярной биологически активной субстанции на основе вермикультуры, включающего промывку червей водой, контакт с водным раствором органической кислоты, охлаждение при температуре 2-4°С, заморозку, оттаивание, гомогенизацию под высоким давлением, лиофилизацию, при этом предварительно живых червей помещают в холодильную камеру при температуре 2-4°С на 72 часа, в качестве органической кислоты используют 0,5% янтарную кислоту, залитых кислотой червей охлаждают при температуре 2-4°С в течение 12 часов, затем червей с кислотой помещают на 24 часа в низкотемпературный холодильник при температуре минус 38-40°С, после оттаивают при температуре 2-6°С 12 часов, затем измельчают в блендере и фильтруют трехкратно через ватно-марлевый фильтр, полученный фильтрат гомогенизируют под высоким давлением с использованием гомогенизатора высокого давления при 1000 бар трехкратно, после чего доводят рН экстракта до 7,0-7,2, смешивают с сахарозо-желатиновой защитной средой, автоклавируют и подвергают лиофилизации.The technical result is achieved using a method of preparing a low molecular weight biologically active substance based on vermiculture, including washing the worms with water, contacting with an aqueous solution of an organic acid, cooling at a temperature of 2-4 ° C, freezing, thawing, high-pressure homogenization, lyophilization, while previously live worms are placed in a refrigerator at a temperature of 2-4 ° C for 72 hours, 0.5% succinic acid is used as the organic acid, the acid-filled worms are cooled while a temperature of 2-4 ° C for 12 hours, then the worms with acid are placed for 24 hours in a low-temperature refrigerator at a temperature of minus 38-40 ° C, then thawed at a temperature of 2-6 ° C for 12 hours, then crushed in a blender and filtered three times through a cotton-gauze filter, the obtained filtrate is homogenized under high pressure using a high-pressure homogenizer at 1000 bar three times, after which the extract is adjusted to pH 7.0-7.2, mixed with a sucrose-gelatin protective medium, autoclaved and lyophilized.

Сущность способа приготовления низкомолекулярной биологически активной субстанции на основе вермикультуры заключается в следующем.The essence of the method of preparation of a low molecular weight biologically active substance based on vermiculture is as follows.

Проводят отбор красных калифорнийских червей в закрытую емкость и помещают в холодильную камеру на 72 часа, затем их промывают под проточной водой и помещают в 0,5% янтарную кислоту - одна часть червей к десяти частям кислоты - и охлаждают при температуре 2-4°С в течение 12 ч. Затем червей с кислотой помещают на 24 часа в низкотемпературный холодильник при температуре минус 38-40°С и оттаивают при температуре 2-6°С 12 часов, затем измельчают в блендере и фильтруют трехкратно через ватно-марлевый фильтр, гомогенизируют с использованием гомогенизатора высокого давления при 1000 бар трехкратно, определяют рН экстракта и добавляют регулятор кислотности - 1,5%-ный водный раствор бикарбоната натрия - в таком количестве, чтобы рН экстракта составлял 7,0-7,2, смешивают с сахарозо-желатиновой средой в соотношении 1 часть экстракта и 1 часть среды, автоклавируют при 120°С 30 мин. Затем полученный раствор замораживают при минус 38-40°С 72-144 часа и подвергают лиофилизации 20-30 часов.California red worms are selected in a closed container and placed in a refrigerator for 72 hours, then they are washed under running water and placed in 0.5% succinic acid - one part of the worms to ten parts of acid - and cooled at a temperature of 2-4 ° С within 12 hours. Then the worms with acid are placed for 24 hours in a low-temperature refrigerator at a temperature of minus 38-40 ° С and thawed at a temperature of 2-6 ° С for 12 hours, then they are ground in a blender and filtered three times through a cotton-gauze filter, homogenized using a homogenizer high pressure at 1000 bar three times, determine the pH of the extract and add an acidity regulator - a 1.5% aqueous solution of sodium bicarbonate - in such an amount that the pH of the extract is 7.0-7.2, mixed with sucrose-gelatin medium in the ratio 1 part of the extract and 1 part of the medium, autoclave at 120 ° C for 30 minutes Then, the resulting solution is frozen at minus 38-40 ° C for 72-144 hours and lyophilized for 20-30 hours.

Примеры конкретного выполнения опытов приготовления низкомолекулярной биологически активной субстанции на основе вермикультуры.Examples of specific experiments for the preparation of low molecular weight biologically active substances based on vermiculture.

Пример 1. Проводят отбор красных калифорнийских червей в закрытую емкость и помещают в холодильную камеру на 72 часа, затем их промывают под проточной водой и помещают в 0,5% янтарную кислоту - одна часть червей к десяти частям кислоты и охлаждают при температуре 2-4°С в течение 12 часов, затем червей с кислотой помещают на 24 часа в низкотемпературный холодильник при температуре минус 38-40°С, после оттаивают при температуре 2-6°С 12 часов, затем червей с кислотой измельчают в блендере и фильтруют трехкратно через ватно-марлевый фильтр, фильтрат смешивают с сахарозо-желатиновой средой в соотношении 1 часть экстракта и 1 часть среды и автоклавируют. Затем полученный раствор замораживают при минус 38-40°С 72-144 часа и подвергают лиофилизации 20-30 часов.Example 1. Red California worms are selected in a closed container and placed in a refrigerator for 72 hours, then they are washed under running water and placed in 0.5% succinic acid — one part of the worms to ten parts of acid and cooled at a temperature of 2-4 ° C for 12 hours, then the worms with acid are placed for 24 hours in a low-temperature refrigerator at a temperature of minus 38-40 ° C, then thawed at a temperature of 2-6 ° C for 12 hours, then the worms with acid are ground in a blender and filtered three times through cotton-gauze filter, mix filtrate vayut with sucrose gelatin medium at a ratio of 1 part of the extract and 1 part of medium and autoclaved. Then, the resulting solution is frozen at minus 38-40 ° C for 72-144 hours and lyophilized for 20-30 hours.

Полученная субстанция обладает недостатками: малый выход продукта, высокая кислотность.The resulting substance has disadvantages: low product yield, high acidity.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но после измельчения в блендере и фильтрования определяют рН экстракта и добавляют регулятор - кислотности 1,5%-ный водный раствор бикарбоната натрия (пищевой соды) - в таком количестве, чтобы рН экстракта составлял 7,0-7,2.Example 2. Carried out analogously to example 1, but after grinding in a blender and filtering, determine the pH of the extract and add a regulator - acidity 1.5% aqueous solution of sodium bicarbonate (baking soda) - in such an amount that the pH of the extract was 7.0- 7.2.

Полученная субстанция обладает недостатками: неоднородность порошка и низкая иммунотропная активность.The resulting substance has disadvantages: powder inhomogeneity and low immunotropic activity.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 2, но после измельчения в блендере и фильтрования фильтрат подвергают дополнительному наноструктурированию с использованием гомогенизатора высокого давления при 1000 бар трехкратно, а затем гомогенат смешивают с сахарозо-желатиновой средой в соотношении 1 часть экстракта и 1 часть среды и автоклавируют. Затем полученный раствор замораживают при минус 38-40°С 72-144 часа и подвергают лиофилизации 20-30 часов.Example 3. Carried out analogously to example 2, but after grinding in a blender and filtering, the filtrate is subjected to additional nanostructuring using a high pressure homogenizer at 1000 bar three times, and then the homogenate is mixed with sucrose-gelatin medium in the ratio of 1 part of the extract and 1 part of the medium and autoclaved. Then, the resulting solution is frozen at minus 38-40 ° C for 72-144 hours and lyophilized for 20-30 hours.

Полученная субстанция при данных параметрах содержит комплекс низкомолекулярных компонентов, обладает стабильностью, широким перечнем биологически активных веществ и высоким иммуномодулирующим и противовоспалительным эффектом.The given substance at these parameters contains a complex of low molecular weight components, has stability, a wide range of biologically active substances and a high immunomodulating and anti-inflammatory effect.

Исследования по оценке иммуномодулирующей и противовоспалительной активности субстанции, приготовленной согласно примеру 3, были проведены на самцах белых крыс линии Вистар в возрасте 9 месяцев. Животные содержались в виварии в стандартных условиях, на стандартной виварной диете со свободным доступом к воде. Температура воздуха в помещении составляла плюс 20…22°с, влажность воздуха - 40-45%, цикл освещения 12:12.Studies to evaluate the immunomodulatory and anti-inflammatory activity of the substance prepared according to example 3 were carried out on male Wistar rats 9 months old. Animals were kept in a vivarium under standard conditions, on a standard vivar diet with free access to water. The air temperature in the room was plus 20 ... 22 ° C, air humidity - 40-45%, the lighting cycle 12:12.

Все эксперименты на животных были выполнены согласно Директиве ЕС 86/609/ЕЕС и в соответствии с законодательством Российской Федерации, регулирующим проведение экспериментов на животных.All animal experiments were carried out in accordance with EU Directive 86/609 / EEC and in accordance with the legislation of the Russian Federation governing animal experiments.

Оценка иммунотропной активности субстанции на основе вермикультуры.Evaluation of the immunotropic activity of a substance based on vermiculture.

Животные в количестве 40 были рандомизированы и разделены на две группы по 20 животных в каждой группе. Группа I служила интактным контролем. Животным группы II (опытная группа) скармливали биологически активную субстанцию на основе вермикультуры в дозировке 6 мг/кг живой массы в течение 10 дней.40 animals were randomized and divided into two groups of 20 animals in each group. Group I served as an intact control. Group II animals (experimental group) were fed a biologically active substance based on vermiculture at a dose of 6 mg / kg body weight for 10 days.

На десятый день эксперимента посредством прямой сердечной пункции с применением эфирной анестезии были забраны образцы крови. Был произведен общий анализ крови с применением гематологического анализатора Abacus junior.On the tenth day of the experiment, blood samples were taken by direct cardiac puncture using ether anesthesia. A general blood test was performed using an Abacus junior hematology analyzer.

Небольшие доли селезенки и тимуса были забраны и зафиксированы в 10%-ном нейтральном формалине. После нескольких этапов дегидратации в спиртах восходящей плотности, с образцов ткани были сделаны срезы толщиной 5-7 мкм, впоследствии окрашенные гематоксилином и эозином. На представленных срезах был проведен гистопатологический анализ.Small fractions of the spleen and thymus were collected and fixed in 10% neutral formalin. After several stages of dehydration in alcohols of ascending density, sections 5-7 μm thick were made from tissue samples, subsequently stained with hematoxylin and eosin. A histopathological analysis was performed on the sections presented.

Посредством анализатора изображений «Videotest» на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, была определена площадь долек тимуса и соотношение белой и красной пульпы селезенки. Соотношение белой и красной пульпы селезенки определялось по формуле:Using the Videotest image analyzer on sections stained with hematoxylin and eosin, the area of the thymus lobes and the ratio of the white and red pulp of the spleen were determined. The ratio of white and red pulp of the spleen was determined by the formula:

Sкр=Sобщ-Sбел,S cr = S total -S bel ,

где Sкр - площадь красной пульпы селезенки;where S cr - the area of the red pulp of the spleen;

Sобщ - площадь поля зрения под текущим увеличением;S total - the area of the field of view under the current increase;

Sбел - площадь белой пульпы селезенки.S bel - the area of the white pulp of the spleen.

Все подсчеты проводились в 10 полях зрения для каждого гистологического образца печени с последующим вычислением среднего значения.All calculations were carried out in 10 fields of view for each histological sample of the liver with subsequent calculation of the average value.

Гематологические параметры крыс контрольной и опытной групп находились в пределах возрастной нормы. Однако было выявлено увеличение количества эритроцитов - 8,72±0,39×109/л в крови животных опытной группы против 7,53±0,35×109/л в контрольной группе.Hematological parameters of rats in the control and experimental groups were within the age norm. However, an increase in the number of red blood cells was detected - 8.72 ± 0.39 × 10 9 / L in the blood of animals of the experimental group versus 7.53 ± 0.35 × 10 9 / L in the control group.

В то же время уменьшилось содержание гемоглобина в эритроците в сравнении с контрольной группой. В контроле этот показатель составлял 20,28±0,96 (fmol/pg), тогда как в экспериментальной группе он был равен 17,84±0,54 (fmol/pg).At the same time, the hemoglobin content in the erythrocyte decreased in comparison with the control group. In control, this indicator was 20.28 ± 0.96 (fmol / pg), whereas in the experimental group it was equal to 17.84 ± 0.54 (fmol / pg).

Применение биологически активной субстанции на основе вермикультуры привело к увеличению числа лейкоцитов в крови крыс опытной группы до 12,44±1,80×109/л в сравнении с 8,30±0,87×109/л в крови животных контрольной группы. Число лимфоцитов крови животных контрольной группы составило 4,18±0,11×109/л, гранулоцитов - 3,12±0,45×109/л, в то время как содержание аналогичных клеток в крови животных опытной группы было существенно выше - 4,45±0,30×109/л и 6,47±0,15×109/л соответственно.The use of a biologically active substance based on vermiculture led to an increase in the number of leukocytes in the blood of rats of the experimental group to 12.44 ± 1.80 × 10 9 / L in comparison with 8.30 ± 0.87 × 10 9 / L in the blood of animals of the control group . The number of blood lymphocytes in the animals of the control group was 4.18 ± 0.11 × 10 9 / l, granulocytes - 3.12 ± 0.45 × 10 9 / l, while the content of similar cells in the blood of animals of the experimental group was significantly higher - 4,45 ± 0,30 × 10 9 / l and 6.47 ± 0.15 × 10 9 / l, respectively.

Результаты морфометрических исследований свидетельствуют об увеличении площади белой пульпы селезенки с 25,73±4,31% в контроле до 41,83±1,90% у экспериментальных животных. Кроме того, наблюдалась интенсивная инфильтрация паренхимы селезенки клетками белой крови, в частности макрофагами и плазматическими клетками.The results of morphometric studies indicate an increase in the area of the white pulp of the spleen from 25.73 ± 4.31% in the control to 41.83 ± 1.90% in experimental animals. In addition, there was intense infiltration of the spleen parenchyma by white blood cells, in particular macrophages and plasma cells.

В это же время выявлено увеличение площади долек тимуса с 561,0±15,1 мкм2 в тимусе контрольных животных до 638,0±24,5 мкм2 в тимусе животных опытной группы. В тимусе крыс экспериментальной группы, в отличие от контроля, выявлена артериальная гиперемия и лимфоидный инфильтрат вокруг сосудов, а также хорошо выраженная граница между корковым и мозговым веществом.At the same time, an increase in the area of the thymus lobes was detected from 561.0 ± 15.1 μm 2 in the thymus of control animals to 638.0 ± 24.5 μm 2 in the thymus of animals of the experimental group. In the thymus of rats of the experimental group, in contrast to the control, arterial hyperemia and lymphoid infiltrate around the vessels, as well as a well-defined border between the cortical and medulla, were detected.

При применении субстанции у животных в нормальном состоянии наблюдается увеличение числа эритроцитов против снижения гематокрита в пределах стандартных величин и снижения среднего уровня содержания гемоглобина в одном эритроците, что свидетельствует о стимуляции эритропоэза и о выходе в кровь значительного числа молодых эритроцитов; снижение гематокрита может свидетельствовать также о повышении содержания неклеточных компонентов в плазме, в частности белков крови (альбумины, глобулины и т.д.).When using the substance in animals in a normal state, an increase in the number of red blood cells is observed against a decrease in hematocrit within standard values and a decrease in the average hemoglobin content in one red blood cell, which indicates the stimulation of erythropoiesis and the release of a significant number of young red blood cells into the blood; a decrease in hematocrit may also indicate an increase in the content of non-cellular components in plasma, in particular blood proteins (albumin, globulins, etc.).

Кроме того, за счет как гранулоцитов, так и лимфоцитов увеличивается общее количество лейкоцитов в крови. Изменения в параметрах белой крови здоровых животных при скармливании субстанции свидетельствует о его иммунотропном влиянии.In addition, due to both granulocytes and lymphocytes, the total number of leukocytes in the blood increases. Changes in the parameters of the white blood of healthy animals when feeding the substance indicates its immunotropic effect.

Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать вывод, что биологически активная субстанция на основе вермикультуры обладает выраженным иммунотропным эффектом, что выражается в стимулирующем действии на ткани тимуса и селезенки.Thus, the study allows us to conclude that a biologically active substance based on vermiculture has a pronounced immunotropic effect, which is expressed in the stimulating effect on the tissue of the thymus and spleen.

Оценка противовоспалительной активности субстанции на основе вермикультуры.Assessment of anti-inflammatory activity of a substance based on vermiculture.

Изучение противовоспалительной активности субстанции на основе вермикультуры проводили на модели формалин-индуцированного воспаления у крыс. У животных контрольной (n=12) и опытной (n=16) групп воспроизводилась острая воспалительная реакция путем субплантарного введения 0,1 мл 2% водного раствора формалина в левую заднюю лапу.A study of the anti-inflammatory activity of a substance based on vermiculture was carried out on a model of formalin-induced inflammation in rats. In animals of the control (n = 12) and experimental (n = 16) groups, an acute inflammatory reaction was reproduced by subplanetary injection of 0.1 ml of a 2% aqueous solution of formalin into the left hind paw.

Животным опытной группы скармливали биологически активную субстанцию на основе вермикультуры в дозировке 6 мг/кг живой массы за 1 час до инъекции формалина и 1 раз в сутки в последующие дни исследования.The animals of the experimental group were fed a biologically active substance based on vermiculture in a dosage of 6 mg / kg body weight 1 hour before formalin injection and 1 time per day on the following days of the study.

Величину воспалительного отека измеряли онкометрическим методом по изменению объема конечности животных непосредственно перед инъекцией формалина, а также через 3 часа после введения и на 2-й, 3-й, 4-й и 5-й день эксперимента. Воспалительную реакцию также оценивали по гематологическим показателям.The value of inflammatory edema was measured by the oncometric method by changing the volume of the limbs of animals immediately before formalin injection, as well as 3 hours after administration and on the 2nd, 3rd, 4th and 5th day of the experiment. The inflammatory response was also evaluated by hematological parameters.

Через 3 часа после субплантарного введения формалина у крыс развивался выраженный отек пораженной конечности, объем которой увеличился от исходного состояния на 60% в контрольной группе и на 37% в опытной.3 hours after subplanetary administration of formalin, rats developed severe edema of the affected limb, the volume of which increased from the initial state by 60% in the control group and by 37% in the experimental group.

Выраженность уменьшения местных признаков индуцированного воспаления в динамике 2-5 дней относительно исходного объема конечности в контрольной группе животных составила 137±8,8%, 128±6,4%, 125±6,8%, 121±6,4%, соответственно. В опытной группе животных, которые получали биологически активную субстанцию на основе вермикультуры, изменение объема воспаленной конечности составило 120±5,9%, 110±5,2%, 108±5,1%, 103±2,8%.The severity of local signs of induced inflammation in the dynamics of 2-5 days relative to the initial limb volume in the control group of animals was 137 ± 8.8%, 128 ± 6.4%, 125 ± 6.8%, 121 ± 6.4%, respectively . In the experimental group of animals that received a biologically active substance based on vermiculture, the change in the volume of the inflamed limb was 120 ± 5.9%, 110 ± 5.2%, 108 ± 5.1%, 103 ± 2.8%.

Анализ гематологических показателей свидетельствовал о развитии в организме всех экспериментальных животных, которым вводился формалин, выраженной воспалительной реакции, в частности снизилось количество эритроцитов в среднем на 52,58% и гематокрит на 66,01%, а также достоверно повысились показатели среднего содержания и концентрации гемоглобина в эритроцитах, что свидетельствует о массовой гибели эритроцитов в результате действия факторов воспаления и выходе новых клеток из депо крови. Кроме того, наблюдается увеличение общего количества лейкоцитов в среднем на 10,11% за счет гранулоцитов, что классически соответствует первичной иммунной реакции.An analysis of hematological parameters testified to the development in the body of all experimental animals that were injected with formalin, a pronounced inflammatory reaction, in particular, the number of red blood cells decreased by an average of 52.58% and the hematocrit by 66.01%, and the average hemoglobin content and concentration significantly increased in red blood cells, which indicates the mass death of red blood cells as a result of the action of inflammatory factors and the release of new cells from the blood depot. In addition, there is an increase in the total number of leukocytes by an average of 10.11% due to granulocytes, which classically corresponds to the primary immune response.

Использование субстанции на основе вермикультуры животным с острым течением воспалительной реакции привело к увеличению общего количества гемоглобина на 5,8%, и количества гемоглобина в эритроците на 7,87%, это связано с усилением защитно-компенсаторной реакцией организма. Кроме того, анализируя показатели белой крови, выявлено снижение в пределах нормативных показателей общего количества лейкоцитов на 18,1% в основном за счет снижения гранулоцитов на 15% и количества клеток, относящихся к пулу, объединяющему моноциты, базофилы и эозинофилы (MID, 109/л) на 26,49%, что может свидетельствовать о противовоспалительном действии исследуемой субстанции. При использовании субстанции животным с острым воспалением наблюдается увеличение количества тромбоцитов на 13,4%, повышается тромбокрит на 17,61% и средний объем тромбоцита на 3,45%, что может свидетельствовать о стимулирующем действии субстанции на выработку интерлейкинов оказывающих стимулирующее действие на мегакариоциты.The use of a substance based on vermiculture in animals with an acute inflammatory reaction led to an increase in the total amount of hemoglobin by 5.8%, and the amount of hemoglobin in the red blood cell by 7.87%, this is due to the increased protective-compensatory reaction of the body. In addition, analyzing the indicators of white blood, a decrease of 18.1% in the total number of leukocytes within the normative indicators was revealed, mainly due to a 15% decrease in granulocytes and the number of cells belonging to the pool uniting monocytes, basophils and eosinophils (MID, 10 9 / l) by 26.49%, which may indicate the anti-inflammatory effect of the test substance. When using the substance in animals with acute inflammation, there is an increase in platelet count by 13.4%, platelet count rises by 17.61% and the average platelet volume by 3.45%, which may indicate a stimulating effect of the substance on the production of interleukins that have a stimulating effect on megakaryocytes.

Анализ гематологических показателей при подостром течении воспаления на фоне применения изучаемой субстанции характеризуется повышением количества эритроцитов на 0,68×1012/л при снижении их количества в контрольной группе, а также увеличением количества гемоглобина в одном эритроците на 4,23 пг, это свидетельствует о более быстром восстановлении эритроцитарного звена и снижение воспалительной реакции. Об этом же свидетельствует менее резкая динамика повышения количества лейкоцитов в процессе течения воспалительного процесса, так в контрольной группе их количество повысилось до 14,10±1,10×109/л, а в опытной группе до 10,68±0,86×109/л. Повышение количества лейкоцитов на этапе подострого течения воспалительной реакции в обеих группах происходило в основном за счет лимфоцитов. При изучении особенностей реакции тромбоцитов крови на применение субстанции при подостром течении воспалительной реакции наблюдается снижение количества тромбоцитов по сравнению с контрольной группой на 29,64%, одновременно с повышением тромбокрита на 57,25% и снижением среднего объема тромбоцита на 9,8%, что также свидетельствует о снижении воспалительной реакции в опытной группе по сравнению с контролем.The analysis of hematological parameters in the subacute course of inflammation while using the studied substance is characterized by an increase in the number of red blood cells by 0.68 × 10 12 / L with a decrease in their number in the control group, as well as an increase in the amount of hemoglobin in one red blood cell by 4.23 pg, this indicates more rapid restoration of the red blood cell link and a decrease in the inflammatory response. This is also evidenced by the less sharp dynamics of an increase in the number of leukocytes during the course of the inflammatory process, so in the control group their number increased to 14.10 ± 1.10 × 10 9 / l, and in the experimental group to 10.68 ± 0.86 × 10 9 / l. The increase in the number of leukocytes at the stage of the subacute course of the inflammatory reaction in both groups occurred mainly due to lymphocytes. When studying the characteristics of the reaction of blood platelets to the use of a substance in the subacute course of the inflammatory reaction, a decrease in the number of platelets by 29.64% compared with the control group is observed, along with an increase in platelet count by 57.25% and a decrease in the average platelet volume by 9.8%, which also indicates a decrease in the inflammatory response in the experimental group compared with the control.

Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать вывод, что полученная согласно примеру 3 биологически активная субстанция на основе вермикультуры обладает противовоспалительной активностью.Thus, the study allows us to conclude that obtained according to example 3 biologically active substance based on vermiculture has anti-inflammatory activity.

Источники информацииInformation sources

1. Патент РФ №2177784. Энтеральный препарат, содержащий экстракт биомассы красного калифорнийского дождевого червя eisenia foetidae в виде таблеток «Вермин» / В.Ф. Петров, Г.М. Сафонова, М.Г. Хилько, М.Р. Закиров. - Опубл. 10.01.2002.1. RF patent No. 2177784. Enteral preparation containing biomass extract of the red California earthworm eisenia foetidae in the form of Vermin tablets / V.F. Petrov, G.M. Safonova, M.G. Hilko, M.R. Zakirov. - Publ. 01/10/2002.

2. Патент РФ №2180574. Мазь для лечения инфицированных ран / О В.Ф. Петров, Г.М. Сафонова, Е.Н. Перевозчикова, Л.К. Коростелева. - Опубл. 20.03.2002.2. RF patent No. 2180574. Ointment for the treatment of infected wounds / About V.F. Petrov, G.M. Safonova, E.N. Perevozchikova L.K. Korosteleva. - Publ. 03/20/2002.

3. Патент РФ №2276188. Питательная среда для культивирования гетеротрофных бактерий / О.Ф. Вятчина, Н.Е. Буковская, Т.В. Завезенова, Д.И. Стом, Н.А. Черных. - Опубл. 10.05.2006.3. RF patent No. 2276188. Nutrient medium for the cultivation of heterotrophic bacteria / O.F. Vyatchina, N.E. Bukovskaya, T.V. Zavezenova, D.I. Stom, N.A. Blacks. - Publ. 05/10/2006.

4. Патент РФ №2438681. Способ производства сухого порошка из дождевых червей / Й. Исии, К. Исии, X. Суми, Е. Йосида, С. Исии. - Опубл. 10.01.2012.4. RF patent No. 2438681. Method for the production of dry powder from earthworms / J. Ishii, K. Ishii, X. Sumi, E. Yoshida, S. Ishii. - Publ. 01/10/2012.

5. Патент РФ №2470521. Способ производства белково-витаминной кормовой муки из гибрида красного калифорнийского дождевого червя и вермикомпостированных яблочных выжимок / О.В. Ириков, Ю.И. Забудский. - Опубл. 27.12.2012.5. RF patent No. 2470521. A method for the production of protein and vitamin feed flour from a hybrid of red California earthworm and vermicomposted apple pomace / O.V. Irikov, Yu.I. Zabudsky. - Publ. 12/27/2012.

6. Chen Н, Takahashi S, Imamura М, Okutani Е, Zhang Z, Chayama K, et al. Earthworm fibrinolytic enzyme: anti-tumor activity on human hepatoma cells in vitro and in vivo. Chin. Med. J. 120: 898-904, 2007.6. Chen H, Takahashi S, Imamura M, Okutani E, Zhang Z, Chayama K, et al. Earthworm fibrinolytic enzyme: anti-tumor activity on human hepatoma cells in vitro and in vivo. Chin. Med. J. 120: 898-904, 2007.

7. Cooper EL, Balamurugan M, Huang CY, Tsao CR, Heredia J, Tommaseo-Ponzetta M, et al. Earthworms dilong: Ancient, inexpensive, noncontroversial models my help clarify approaches to integrated medicine emphasizing neuroimmuno systems. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2012: 164152, 2012. (doi: 10.1155/2012/164152).7. Cooper EL, Balamurugan M, Huang CY, Tsao CR, Heredia J, Tommaseo-Ponzetta M, et al. Earthworms dilong: Ancient, inexpensive, noncontroversial models my help clarify approaches to integrated medicine emphasizing neuroimmuno systems. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2012: 164152, 2012. (doi: 10.1155 / 2012/164152).

8. Cooper EL, Kauschke E, Cossariazza A. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. BioEssays 24: 319-333, 2002.8. Cooper EL, Kauschke E, Cossariazza A. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. BioEssays 24: 319-333, 2002.

9. Hirigoyenberry F, Lassale F,

Figure 00000008
M. Antibacterial activity of Eisenia foetida Andrei coelomic fluid: transcription and translation regulation of lysozyme and proteins evidenced after bacterial infection. Comp. Biochem. Physiol. 95B: 71-75, 1990.9. Hirigoyenberry F, Lassale F,
Figure 00000008
M. Antibacterial activity of Eisenia foetida Andrei coelomic fluid: transcription and translation regulation of lysozyme and proteins evidenced after bacterial infection. Comp. Biochem. Physiol. 95B: 71-75, 1990.

10.

Figure 00000009
M, Kobrehel D, Levanat S, Jurin M,
Figure 00000010
T. Mitogenicity of earthworm (Eisenia foetida) insulin-like proteins. Comp. Biochem. Physiol. 104B: 723-729, 1993.10.
Figure 00000009
M, Kobrehel D, Levanat S, Jurin M,
Figure 00000010
T. Mitogenicity of earthworm (Eisenia foetida) insulin-like proteins. Comp. Biochem. Physiol. 104B: 723-729, 1993.

11.

Figure 00000011
M,
Figure 00000012
M, Micek V,
Figure 00000013
M. Influence of earthworm extract G-90 on the haemostasis in Wistar rats. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 15: 71-78, 2011.eleven.
Figure 00000011
M
Figure 00000012
M, Micek V,
Figure 00000013
M. Influence of earthworm extract G-90 on the haemostasis in Wistar rats. Eur. Rev. Med. Pharmacol Sci. 15: 71-78, 2011.

12. Milochau A,

Figure 00000014
M, Valembois P. Purification, characterization and activities of two haemolytic and antimicrobial proteins from coelomic fluid of the annelid Eisenia foetida Andrei. Biochim. Biophys. Acta 1337: 123-132, 1997.12. Milochau A,
Figure 00000014
M, Valembois P. Purification, characterization and activities of two haemolytic and antimicrobial proteins from coelomic fluid of the annelid Eisenia foetida Andrei. Biochim. Biophys. Acta 1337: 123-132, 1997.

13. Mohrig W, Eue I, Kauschke E, Hennicke F. Crossreactivity of haemolytic and hemagglutinating proteins in the coelomic fluid of earthworms. Comp. Biochem. Physiol. 115A: 19-30, 1996.13. Mohrig W, Eue I, Kauschke E, Hennicke F. Crossreactivity of haemolytic and hemagglutinating proteins in the coelomic fluid of earthworms. Comp. Biochem. Physiol. 115A: 19-30, 1996.

14. Nakajima N, Mihara H, Sumi H. Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus. Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1726-1730, 1993.14. Nakajima N, Mihara H, Sumi H. Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus. Biosci. Biotech Biochem. 57: 1726-1730, 1993.

15.

Figure 00000015
M,
Figure 00000016
M,
Figure 00000017
T. Glycolipoprotein G-90 obtained from the earthworm Eisenia foetida exerts antibacterial activity. Vet. Arch. 75: 119-128, 2005.fifteen.
Figure 00000015
M
Figure 00000016
M
Figure 00000017
T. Glycolipoprotein G-90 obtained from the earthworm Eisenia foetida exerts antibacterial activity. Vet. Arch. 75: 119-128, 2005.

16.

Figure 00000018
Р,
Figure 00000019
М, Felsberg J,
Figure 00000020
R, Beschin A, De Baetselier P, et al. Relationship between hemolytic molecules in Eisenia foetida earthworms. Dev. Comp. Immunol. 30: 381-392, 2006.16.
Figure 00000018
R,
Figure 00000019
M, Felsberg J,
Figure 00000020
R, Beschin A, De Baetselier P, et al. Relationship between hemolytic molecules in Eisenia foetida earthworms. Dev. Comp. Immunol. 30: 381-392, 2006.

17. Sherman M, Takayama Y. Screening and treatment for hepatocellular carcinoma. Gastroent. Clin. North Am. 33: 671-691, 2004.17. Sherman M, Takayama Y. Screening and treatment for hepatocellular carcinoma. Gastroent. Clin. North am. 33: 671-691, 2004.

18.

Figure 00000021
K, Cerenius L. Role of prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Curr. Opin. Immunol. 10: 23-28, 1998.eighteen.
Figure 00000021
K, Cerenius L. Role of prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Curr. Opin. Immunol. 10: 23-28, 1998.

19. Yuan L, Xu JM, Zhou YC. Effects of the purified earthworm extracts on various hemal tumor cells. Clin. Med. J. China. 11: 177-179, 2004.19. Yuan L, Xu JM, Zhou YC. Effects of the purified earthworm extracts on various hemal tumor cells. Clin. Med. J. China. 11: 177-179, 2004.

20. Patent №5024844 A US Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient / Yoichi Ishii, Hisashi Mihara. - Опубл. 18.06.1991.20. Patent No. 5024844 A US Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient / Yoichi Ishii, Hisashi Mihara. - Publ. 06/18/1991.

Claims (1)

Способ приготовления низкомолекулярной биологически активной субстанции на основе вермикультуры, характеризующийся тем, что проводят отбор красных калифорнийских червей в закрытую емкость и помещают в холодильную камеру на 72 часа, затем их промывают под проточной водой и помещают в 0,5% янтарную кислоту - одна часть червей к десяти частям кислоты - и охлаждают при температуре 2-4°С в течение 12 ч, затем червей с кислотой помещают на 24 часа в низкотемпературный холодильник при температуре минус 38-40°С, после оттаивают при температуре 2-6°С 12 часов, затем измельчают в блендере и фильтруют трехкратно через ватно-марлевый фильтр, гомогенизируют с использованием гомогенизатора высокого давления при 1000 бар трехкратно, определяют рН экстракта и добавляют регулятор кислотности - 1,5%-ный водный раствор бикарбоната натрия - в таком количестве, чтобы рН экстракта составлял 7,0-7,2, смешивают с сахарозо-желатиновой средой в соотношении 1 часть экстракта и 1 часть среды, автоклавируют при 120°С в течение 30 мин, полученный раствор замораживают при минус 38-40°С 72-144 часа и подвергают лиофилизации 20-30 часов.A method of preparing a low molecular weight biologically active substance based on vermiculture, characterized in that the selection of red California worms is carried out in a closed container and placed in a refrigerator for 72 hours, then they are washed under running water and placed in 0.5% succinic acid - one part of the worms to ten parts of acid - and cooled at a temperature of 2-4 ° C for 12 hours, then the worms with acid are placed for 24 hours in a low-temperature refrigerator at a temperature of minus 38-40 ° C, then thawed at a temperature of 2-6 ° C for 12 hours c, then it is ground in a blender and filtered three times through a cotton-gauze filter, homogenized using a high-pressure homogenizer at 1000 bar three times, the pH of the extract is determined and the acidity regulator is added - a 1.5% aqueous solution of sodium bicarbonate - in such a quantity that The pH of the extract was 7.0-7.2, mixed with sucrose-gelatin medium in a ratio of 1 part of extract and 1 part of medium, autoclaved at 120 ° C for 30 minutes, the resulting solution was frozen at minus 38-40 ° C 72-144 hours and lyophilized for 20-30 hours aces.
RU2015138316A 2015-09-08 2015-09-08 Method for preparation of biologically active substance, based on vermiculture RU2606693C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015138316A RU2606693C1 (en) 2015-09-08 2015-09-08 Method for preparation of biologically active substance, based on vermiculture

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015138316A RU2606693C1 (en) 2015-09-08 2015-09-08 Method for preparation of biologically active substance, based on vermiculture

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2606693C1 true RU2606693C1 (en) 2017-01-10

Family

ID=58452527

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015138316A RU2606693C1 (en) 2015-09-08 2015-09-08 Method for preparation of biologically active substance, based on vermiculture

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2606693C1 (en)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5024844A (en) * 1987-08-18 1991-06-18 Eimei Company, Ltd. Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient
RU2416633C2 (en) * 2009-04-03 2011-04-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольский государственный университет Method for production of hydrolysate of californian worms
RU2438681C1 (en) * 2009-10-13 2012-01-10 Велл Стоун Ко. Method of manufacturing dry powder of earthworms
RU2560845C1 (en) * 2014-09-30 2015-08-20 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Кавказский федеральный университет" Method for producing low-molecular activated embryonic complex (nika-em)

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5024844A (en) * 1987-08-18 1991-06-18 Eimei Company, Ltd. Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient
RU2416633C2 (en) * 2009-04-03 2011-04-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольский государственный университет Method for production of hydrolysate of californian worms
RU2438681C1 (en) * 2009-10-13 2012-01-10 Велл Стоун Ко. Method of manufacturing dry powder of earthworms
RU2560845C1 (en) * 2014-09-30 2015-08-20 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Кавказский федеральный университет" Method for producing low-molecular activated embryonic complex (nika-em)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100455294C (en) Process for preparing chick embryo element
Gur et al. In vitro and in vivo investigations of the wound healing effect of crude Spirulina extract and C-phycocyanin
Nimalan et al. Mucosal barrier status in Atlantic salmon fed marine or plant-based diets supplemented with probiotics
CN102908365A (en) Preparation method of eggembryosin
CN110538312A (en) skin wound repair ointment and preparation method thereof
CN102908366A (en) Preparation method of chick embryo active component
Ma et al. A new insight on copper: Promotion of collagen synthesis and myofiber growth and development in juvenile grass carp (Ctenopharyngodon idella)
CN107224445B (en) Propolis effective part and compound product and application thereof
KR101391911B1 (en) Bee venom composition having improved growth rate and immune function
KR101795655B1 (en) medicinal marine collagen using fishes by-product and manufacturing method thereof
CN110812469B (en) Application of polypeptide AR12 in preparation of antioxidant
RU2606693C1 (en) Method for preparation of biologically active substance, based on vermiculture
Li et al. Comparison study of protective effects of porcine bile acids and sheep bile acids against heat stress in chickens
CN109771457A (en) Purposes of the russule extract in the preparation that preparation treatment and/or prevention high fat diet cause hepatic injury related disease
CN110935003B (en) Biological polypeptide composition for promoting skin injury repair
WO2021052450A1 (en) Reversed phase chromatography isolation of active component in amniotic fluid of non-human animal
US10941432B1 (en) Method for the preparation of low molecular weight porcine lympho-reticular polypeptides
Rodahl Hypervitaminosis A: a study of the effect of excess of vitamin A in experimental animals
KR101418881B1 (en) Lipid water soluble bee venom extracts for improving immunity and for curing inflammation and for curing pain and composition for parenteral medicines and manufacturing method of the same
Assaw et al. Potential of Malaysian white type edible jellyfish, Lobonema smithii as antioxidant and collagen promoter in dermal wound of Sprague Dawley rats
US10751376B1 (en) Method for treating cancer
US10568915B1 (en) Method of preparing a therapeutic composition using a preparation from epidermal gel secretions of catfish
AT392003B (en) METHOD FOR PRODUCING A PARTICULARLY FOR Wounds Healing Or For Treatment In Geriatrics, Active Ingredients From Mammalian Blood By PAPAINE HYDROLYSIS AND A PREPARATION CONTAINING SUCH AN ACTIVE SUBSTANCE
RU2669933C2 (en) Peptide medication from collagen for regeneration of skin tissue, method for its production and application
RU2658844C1 (en) Method of producing sea star fodder additive

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20200909