RU2604796C1 - EXPRESSION SYSTEM AND METHOD OF PRODUCING NON-MODIFIED RECOMBINANT PROTEINS IN Escherichia coli USING IT - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: group of inventions relates to biotechnology. DNA construct is disclosed, which codes fused precursor protein, in which auxiliary amino acid sequence is bound to N-end of mature target polypeptide sequence with transition site intended for identification and splitting of hybrid precursor by specific protease to form non-modified protein of interest. Above site represents truncated at N-end by 23 amino acid residues SUMO protein of S. cerevisiae (Smt3), which includes site of splitting with SUMO-hydrolase (Ulp1). On basis of DNA construct coding version of precursor, which comprises glutathione-S-transferase (GST) as auxiliary sequence and negatively charged peptide and human interferon (IFN) α2b as target protein recombinant E. coli strain is obtained. Method of producing non-modified IFN α2b using above E. coli strain is also disclosed.

EFFECT: group of inventions enables to obtain target protein with high purity and activity.

7 cl, 9 dwg, 2 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению рекомбинантных полипептидов через промежуточную форму гибридного белка. Предлагается ДНК-конструкция, кодирующая слитый белок-предшественник, в котором вспомогательная аминокислотная последовательность связана с N-концом последовательности зрелого целевого полипептида переходной областью, предназначенной для распознавания и расщепления гибридного предшественника специфической протеазой с образованием немодифицированной зрелой формы интересующего белка. Согласно изобретению указанная область представляет собой усеченный с N-конца на 23 аминокислотных остатка белок SUMOSac. cerevisiae (Smt3), который содержит сайт расщепления SUMO-гидролазой (Ulp1). Получены, охарактеризованы и испытаны конкретные формы рекомбинантных ДНК и кодируемых ими гибридных белков, включающих различные партнеры слияния. На основе ДНК-конструкции, кодирующей вариант предшественника, который включает в качестве вспомогательной последовательности глутатион-S-трансферазу (GST) и отрицательно заряженный пептид, а в качестве целевого белка интерферон (IFN) α2b человека, получен рекомбинантный штамм E. coli и описан способ получения немодифицированного IFN α2b с его использованием.The invention relates to biotechnology, in particular to the production of recombinant polypeptides through an intermediate form of a hybrid protein. A DNA construct encoding a fusion precursor protein is proposed in which the auxiliary amino acid sequence is linked to the N-terminus of the mature target polypeptide sequence with a transition region for recognizing and cleaving the hybrid precursor with a specific protease to form an unmodified mature form of the protein of interest. According to the invention, said region is a SUMOSac protein truncated from the N-terminus into 23 amino acid residues. cerevisiae (Smt3), which contains the cleavage site of SUMO hydrolase (Ulp1). The specific forms of recombinant DNAs and the hybrid proteins encoded by them, including various fusion partners, were obtained, characterized and tested. Based on the DNA construct encoding a variant of the precursor, which includes, as an auxiliary sequence, glutathione S-transferase (GST) and a negatively charged peptide, and the recombinant E. coli strain is obtained as the target protein, human interferon (IFN) α2b, and a method is described obtaining unmodified IFN α2b with its use.

ВведениеIntroduction

Грамотрицательная бактерия Escherichiacoli является одним из наиболее широко используемых микроорганизмов-хозяев для промышленного производства рекомбинантных белков. Однако хорошо известно, что экспрессия гетерологичных белков в клетках Е. coli связана с целым рядом проблем, которые должны быть решены в процессе их получения. В частности, если после синтеза аутентичных (собственных) протеинов обусловленный механизмом трансляции дополнительный N-концевой остаток метионина в большинстве случаев эффективно удаляется бактериальными ферментами, то при экспрессии чужеродных белков в лучшем случае происходит его частичное отщепление. Дополнительный метионин на N-конце рекомбинантного белка может не оказывать отрицательного влияния на его свойства, однако известно, что его присутствие в ряде случаев приводит к снижению стабильности и повышению иммуногенности белков (Ben-Bassat A., Bauer K., 1987, Nature 326, 315) и даже к потере их биологической активности (Rabbani et al., 1988, J Biol Chem, 263:1307-1313). Это, в частности, послужило основанием для признания IFN α2 геномодифицированным продуктом и ограничения производства и использования содержащих его препаратов на территории европейских стран (Eur. Pharm., 5^th ed.: 2004).Gram-negative bacterium Escherichiacoli is one of the most widely used host microorganisms for the industrial production of recombinant proteins. However, it is well known that the expression of heterologous proteins in E. coli cells is associated with a number of problems that must be solved in the process of their preparation. In particular, if after the synthesis of authentic (intrinsic) proteins, the additional N-terminal methionine residue due to the translation mechanism is effectively removed in most cases by bacterial enzymes, then, when foreign proteins are expressed, partial cleavage occurs in the best case. Additional methionine at the N-terminus of the recombinant protein may not adversely affect its properties, however, it is known that its presence in some cases leads to a decrease in stability and an increase in the immunogenicity of proteins (Ben-Bassat A., Bauer K., 1987, Nature 326, 315) and even to the loss of their biological activity (Rabbani et al., 1988, J Biol Chem, 263: 1307-1313). This, in particular, served as the basis for the recognition of IFN α2 as a genomically modified product and the restriction of the production and use of preparations containing it in European countries (Eur. Pharm., 5 ^th ed .: 2004).

В настоящее время наиболее распространенным методом синтеза в E. coli гетерологичных протеинов с «правильным» N-концом является получение целевого белка через гибридный предшественник, от которого конечный продукт в последующем отщепляется путем обработки специфической протеазой. Важно, что применение этой методологии, кроме основной задачи удаления дополнительного метионинового остатка, позволяет решить целый ряд других проблем, возникающих при экспрессии гетерологичных белков в Е. coli, в том числе предотвратить или уменьшить их протеолитическую деградацию в бактериальных клетках, а также возможность «ошибок» при формировании нативной структуры белковых молекул; при необходимости - преодолеть низкую растворимость гибридного белка и существенно упростить методологию очистки целевого продукта.Currently, the most common method for synthesizing heterologous proteins with the “correct” N-terminus in E. coli is to obtain the target protein through a hybrid precursor, from which the final product is subsequently cleaved by treatment with a specific protease. It is important that the application of this methodology, in addition to the main task of removing the additional methionine residue, allows us to solve a number of other problems arising from the expression of heterologous proteins in E. coli, including the prevention or reduction of their proteolytic degradation in bacterial cells, as well as the possibility of “errors” »In the formation of the native structure of protein molecules; if necessary, to overcome the low solubility of the hybrid protein and significantly simplify the purification methodology of the target product.

С учетом вышеизложенного, представляется очевидным, что задача разработки новых генетических конструкций и экспрессионных систем для получения в E. coli интересующих гетерологичных белков через гибридные предшественники сохраняет свою актуальность.In view of the foregoing, it seems obvious that the task of developing new genetic constructs and expression systems for obtaining heterologous proteins of interest through E. coli through hybrid precursors remains relevant.

Уровень техникиState of the art

Партнеры слияния, наиболее часто используемые в гибридных предшественниках целевых белков - это гистидиновый таг (6-10 His), мальтоза-связывающий белок (MBP) (Kapust R et al., 1999, Protein Sci., 8, 1668-1674), глутатион-S-трансфераза (GST) (Rabhi-Essafi I. et al., 2007, Protein Eng. Des. Sel. 20, 201-209; Smith D., 1988, Gene 67, 31-40; Artika M. et al., Am. J. Biochem. Biotechnol., 2013, 9 (4), 423-429) высоко заряженный пептид (EP 0089626), белок SUMO (Butt T. et al., Protein Expr. Purif. 43, 1-9; Zhu F. et al., World J. Microbiol. Biotechnol., 2013, 29, 319-325; Peciak K. et al., 2005, Protein Exp. Purif., 43, 1-9; Panavas T. et al., 2009, Methods Mol Biol., 497, 303-317) и др. При этом общим положительным результатом объединения любого из перечисленных вспомогательных полипептидов с целевым белком является определенное повышение степени защиты последнего от протеолитической деградации, тогда как в остальном каждый из партнеров привносит в гибридный белок индивидуальные особенности.The fusion partners most commonly used in hybrid precursors of target proteins are histidine tag (6-10 His), maltose binding protein (MBP) (Kapust R et al., 1999, Protein Sci., 8, 1668-1674), glutathione S-transferase (GST) (Rabhi-Essafi I. et al., 2007, Protein Eng. Des. Sel. 20, 201-209; Smith D., 1988, Gene 67, 31-40; Artika M. et al ., Am. J. Biochem. Biotechnol., 2013, 9 (4), 423-429) a highly charged peptide (EP 0089626), SUMO protein (T. Butt et al., Protein Expr. Purif. 43, 1-9 ; Zhu F. et al., World J. Microbiol. Biotechnol., 2013, 29, 319-325; Peciak K. et al., 2005, Protein Exp. Purif., 43, 1-9; Panavas T. et al ., 2009, Methods Mol Biol., 497, 303-317) and others. Moreover, the general positive result of combining any of the following of auxiliary polypeptides with the target protein is a certain increase in the degree of protection of the latter from proteolytic degradation, while in the rest, each of the partners brings individual features to the hybrid protein.

Так, известно, что His-таг обеспечивает возможность отделения гибридного белка с помощью металло (Ni, Cu, Zn, Co) - хелатной аффинной хроматографии; MBP повышает растворимость и способствует правильному рефолдингу белка; (+) или (-) - заряженный пептид позволяет направленно изменить заряд белковой молекулы (pI); GST - повысить выход предшественника и его растворимость, а также использовать для «захвата» гибридного белка аффинное сродство GST к глутатион-содержащим сорбентам.So, it is known that His-tag provides the ability to separate the hybrid protein using metal (Ni, Cu, Zn, Co) - chelate affinity chromatography; MBP increases solubility and promotes proper protein refolding; (+) or (-) - a charged peptide allows you to directionally change the charge of the protein molecule (pI); GST - to increase the yield of the precursor and its solubility, and also to use the affinity affinity of GST for glutathione-containing sorbents to “capture” the hybrid protein.

Что касается использования в качестве партнера слияния с интересующим полипептидом убиквитин-подобных белков, в частности белка SUMO, то основная особенность этого типа партнеров состоит в том, что в отличие от всех перечисленных выше, получаемый гибридный предшественник не нуждается во введении отдельного протеазного сайта для отщепления целевого продукта, поскольку такой сайт представлен в самой молекуле SUMO. К числу основных достоинств SUMO-содержащих гибридных предшественников относят высокую специфичность гидролиза, а также принципиальную возможность повышения растворимости «гибрида». Корректное расщепление гибридного предшественника, включающего SUMO, подтверждено многочисленными примерами, в том числе и с целевыми белками, представляющими наиболее сложные субстраты для ферментативного гидролиза, а именно содержащими S-S-связи вамино-терминальной области. В частности, показано, что при выщеплении из предшественника SUMO-IFN α2 конечного продукта дисульфидная связь сохраняется, даже находясь в первом положении последовательности интерферона (патент РФ №2441072). Что же касается способности SUMO влиять на растворимость гибридного белка, то, как показывает практика, это свойство существенно зависит от структуры основного партнера и условий биосинтеза слитого белка (Peciak K., 2014; Zhang H., PLoSOne, February 3, 2015). Таким образом, можно заключить, что безусловным преимуществом использования SUMO в составе гибридных предшественников следует считать формирование области распознавания и расщепления протеазой, отличающуюся высокой специфичностью гидролиза.As for the use of ubiquitin-like proteins, in particular SUMO protein, as a fusion partner of interest to the polypeptide, the main feature of this type of partners is that, unlike all of the above, the resulting hybrid precursor does not need to introduce a separate protease site for cleavage the target product, since such a site is represented in the SUMO molecule itself. Among the main advantages of SUMO-containing hybrid precursors are the high specificity of hydrolysis, as well as the fundamental possibility of increasing the solubility of the "hybrid". The correct cleavage of the hybrid precursor, including SUMO, has been confirmed by numerous examples, including with target proteins representing the most complex substrates for enzymatic hydrolysis, namely, containing S-S bonds of the terminal region of your body. In particular, it was shown that when the final product is cleaved from the SUMO-IFN α2 precursor, the disulfide bond is maintained even in the first position of the interferon sequence (RF patent No. 2441072). As for the ability of SUMO to influence the solubility of a hybrid protein, as practice shows, this property significantly depends on the structure of the main partner and the biosynthesis conditions of the fusion protein (Peciak K., 2014; Zhang H., PLoSOne, February 3, 2015). Thus, we can conclude that the formation of the recognition and cleavage region of a protease, which is characterized by a high specificity of hydrolysis, should be considered an absolute advantage of using SUMO in the composition of hybrid precursors.

Очевидным недостатком простой комбинации SUMO с интересующим белком является то, что в отличие от большинства других «тагов», данный белок не рассчитан на использование в процессах выделения и очистки продуктов биосинтеза. С этой точки зрения перспективным представляется создание генетических конструкций, в которых в качестве вспомогательных полипептидов «гибрида» используется комбинация SUMO, выполняющего в предшественнике роль переходной области расщепления, с другими «тагами», свойства которых (в зависимости от решаемой задачи) позволяют упростить очистку и/или сместить равновесие между нерастворимой и растворимой формами и/или повысить общий выход белка-предшественника (Butt T., 2005; US 7,220,576 22.05.2007; Zhang H. et al., 2015).The obvious disadvantage of a simple combination of SUMO with the protein of interest is that, unlike most other "tags", this protein is not designed for use in the processes of isolation and purification of biosynthesis products. From this point of view, it seems promising to create genetic constructs in which a combination of SUMO is used as auxiliary polypeptides of the "hybrid", which plays the role of a transition region of the cleavage in the predecessor, with other "tags" whose properties (depending on the problem being solved) make it possible to simplify the cleaning and / or shift the balance between insoluble and soluble forms and / or increase the overall yield of the precursor protein (Butt T., 2005; US 7,220,576 05/22/2007; Zhang H. et al., 2015).

Принимая во внимание то, что гидролиз специфической SUMO-протеазой нуждается не только в наличии расщепляемого сайта, но и в сохранении нативной конформации белковой молекулы (Butt Т., 2005), комбинирование этого партнера с другими «тагами» обычно приводит к получению «гибридов» достаточно большого размера. Однако эта проблема может быть частично решена за счет использования хорошо известной тактики удаления из общей структуры предшественника частей, не являющихся функционально значимыми. В частности, с этой целью некоторыми исследователями используются формы SUMO, «укороченные» с N-конца на 9-12 аминокислот, т.к. согласно существующей на сегодня точке зрения для сохранения необходимой конформации молекулы этого белка и протекания реакции гидролиза необходимой является аминокислотная последовательность от 13 до 98 аминокислотного остатка (Mossessova E., Lima C., 2000, Mol Cell, 5, 865-876).Taking into account the fact that hydrolysis with a specific SUMO protease requires not only the presence of a cleavable site, but also the preservation of the native conformation of the protein molecule (T. Butt, 2005), combining this partner with other “tags” usually results in “hybrids” large enough. However, this problem can be partially solved by using the well-known tactics of removing parts that are not functionally significant from the general structure of the precursor. In particular, for this purpose, some researchers use forms of SUMO, "shortened" from the N-terminus to 9-12 amino acids, because according to the current point of view, in order to maintain the necessary conformation of the molecule of this protein and the hydrolysis reaction, the amino acid sequence from 13 to 98 amino acid residues is necessary (Mossessova E., Lima C., 2000, Mol Cell, 5, 865-876).

С учетом вышеизложенного наиболее близким аналогом настоящего изобретения можно считать разработку, представленную в патенте РФ №2453604 и раскрывающую гибридный белок 10His-SUMO-IFN α2b, где SUMO из Sac. cerevisiae (Smt3) комбинируется с тагом, обычно вводимым в такого рода конструкции для выделения гибридного белка с помощью металло-хелатной хроматографии; экспрессионный вектор; рекомбинантный штамм E. coli и способ продукции безметионинового целевого продукта.In view of the foregoing, the closest analogue of the present invention can be considered the development presented in the patent of Russian Federation No. 2453604 and revealing the hybrid protein 10His-SUMO-IFN α2b, where SUMO from Sac. cerevisiae (Smt3) is combined with a tag typically introduced in this type of construct to isolate the fusion protein using metal chelate chromatography; expression vector; recombinant E. coli strain and method for producing a methionine-free target product.

В отношении прототипа могут быть отмечены следующие недостатки.With regard to the prototype, the following disadvantages can be noted.

а) Недостаточно удачный выбор «тага», имеющего назначением применение для аффинной очистки гибридного предшественника, в ходе которой используют ионы Ni (Cu, Zn, Co), образующие с матрицей координационную связь. Это определяет возможность загрязнения промежуточных продуктов ионами названных металлов и, соответственно, проверки материала на их наличие, а при обнаружении - их полного удаления. Возможно, именно это обстоятельство объясняет, что присутствующий в векторной конструкции His-таг часто остается неиспользованным в ходе очистки, если последняя осуществляется в производственных масштабах.a) The choice of a “tag” is not good enough, it is used for affinity purification of a hybrid precursor, during which Ni ions (Cu, Zn, Co) are used, which form a coordination bond with the matrix. This determines the possibility of contamination of intermediate products with ions of the named metals and, accordingly, checking the material for their presence, and if detected, their complete removal. Perhaps this circumstance explains that the His tag present in the vector structure often remains unused during cleaning if the latter is carried out on a production scale.

б) Хроматографическая очистка продуктов предусматривает 4 этапа, одним которых является обращенно-фазовая хроматография, требующая специального оборудования, обслуживания и материалов. Кроме того, известно, что используемые в данном процесс органические растворители, в частности ТФУ, оказывают достаточно жесткое воздействие на белковую молекулу, результатом которого могут быть и необратимые изменения ее конформации. И, наконец, применение обращено-фазовой хроматографии при получении рекомбинантных белков медицинского назначения, представляется весьма нежелательным, поскольку создает дополнительные сложности в плане безопасности (качества) получаемых препаратов, и, по крайней мере, требует их тщательной проверки на предмет «следов» токсичных примесей, прежде всего, - ацетонитрила, который используется в очень высоких концентрациях (70-80%%).b) Chromatographic purification of products involves 4 stages, one of which is reverse phase chromatography, which requires special equipment, maintenance and materials. In addition, it is known that the organic solvents used in this process, in particular TFA, have a rather severe effect on the protein molecule, which may result in irreversible changes in its conformation. And, finally, the use of reversed-phase chromatography in the preparation of recombinant proteins for medical use appears to be highly undesirable, since it creates additional difficulties in terms of safety (quality) of the preparations obtained, and, at the very least, requires their careful examination for “traces” of toxic impurities First of all, acetonitrile, which is used in very high concentrations (70-80 %%).

в) Не полностью использованные возможности по удалению из структуры гибрида частей, не несущих функциональной нагрузки.c) Incomplete opportunities for removing parts that do not carry a functional load from the hybrid structure.

Задачей настоящего изобретения была разработка экспрессионной системы (генетической конструкции и, соответственно, кодируемого ею предшественника, экспрессионного вектора и трансформированной им клетки E. coli), обеспечивающей получение немодифицированного целевого белка, в частности интерферона альфа 2b, простым в технологическом отношении и экономичным способом, гарантирующим отсутствие загрязнений фармацевтических продуктов следами вредных примесей.The objective of the present invention was to develop an expression system (genetic construct and, accordingly, the precursor encoded by it, the expression vector and the E. coli cell transformed by it), providing an unmodified target protein, in particular interferon alpha 2b, in a technologically simple and economical way, guaranteeing lack of contamination of pharmaceutical products with traces of harmful impurities.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Решение поставленной задачи предусматривало: а) исследование возможности усовершенствования (максимально возможного уменьшения размеров без нарушения процесса протеолитического расщепления) переходной области гибридного предшественника путем получения и испытания в реакции гидролиза «гибридов» с различными «усечениями» N-конца Smt3; б) конструирование и экспрессию рекомбинантных ДНК с последовательностью, кодирующей отобранный на стадии (а) минимальный по размеру фрагмент Smt3, слитый с различными видами вспомогательных последовательностей при одном и том же целевом белке, и выбор оптимальных (по интересующим показателям) гибридных конструкций; в) конструирование и экспрессию рекомбинантных ДНК с последовательностью, кодирующей отобранный на стадии (а) фрагмент Smt3, слитый с различными видами целевых белков при одном и том же вспомогательном партнере слияния, и выбор оптимальных (по интересующим показателям) гибридных конструкций; г) испытание отобранных на стадиях (б)-(в) конструкций в полном цикле получения кодируемого ими целевого белка с проведением его выделения, очистки и анализа.The solution to this problem envisaged: a) investigation of the possibility of improving (the largest possible reduction in size without disturbing the proteolytic cleavage process) of the transition region of the hybrid precursor by preparing and testing in the hydrolysis reaction “hybrids” with various “truncations” of the N-terminus of Smt3; b) constructing and expressing recombinant DNA with a sequence encoding the smallest Smt3 fragment selected at stage (a), fused with different kinds of auxiliary sequences with the same target protein, and selecting the optimal (in terms of interest) hybrid constructs; c) the construction and expression of recombinant DNAs with a sequence encoding the Smt3 fragment selected in stage (a), fused with different types of target proteins with the same auxiliary fusion partner, and the selection of optimal (in terms of interest) hybrid constructs; d) testing of the structures selected at stages (b) - (c) in the full cycle of obtaining the target protein encoded by them with the selection, purification and analysis.

а) Ранее для SUMO Sac. cerevisiae (Smt3) была показана возможность укорачивания белка с N-конца, не влияющая на эффективность гидролиза специфической протеазой, на 12 аминокислот (прототип). Однако из анализа трехмерной структуры комплекса данного белка с Ulp1, а также картины выравнивания последовательностей различных убиквитин-подобных белков (Mossessova Е., 2000 и др.) нами было сделано предположение о возможности дальнейшего усечения молекулы, не влекущего за собой нарушения ее конформации. Для проверки этой гипотезы были получены оптимизированные для экспрессии в E.coli нуклеотидные последовательности, кодирующие SUMOΔ19, SUMOΔ23 и SUMOΔ40, которые после слияния с оптимизированной для экспрессии в E.coli последовательностью, кодирующей IFN α2b человека, и введения в подходящую плазмиду были использованы для трансформации клеток E. coli (пример 1) и биосинтеза гибридного предшественника. В результате анализа расщепления экспрессированных гибридных белков SUMO-протеазой Ulp1 (фиг. 1) было впервые показано, что максимально возможным «усечением» последовательности Smt3, не оказывающим негативного влияния на процесс гидролиза, является удаление с N-конца 23 аминокислотных остатков.a) Previously for SUMO Sac. cerevisiae (Smt3) showed the possibility of shortening the protein from the N-terminus, which does not affect the efficiency of hydrolysis by a specific protease, by 12 amino acids (prototype). However, from an analysis of the three-dimensional structure of the complex of this protein with Ulp1, as well as the sequence alignment pattern of various ubiquitin-like proteins (Mossessova E., 2000, etc.), we made the assumption about the possibility of further truncation of the molecule, which does not entail violation of its conformation. To test this hypothesis, nucleotide sequences optimized for expression in E. coli encoding SUMOΔ19, SUMOΔ23 and SUMOΔ40 were obtained, which, after fusion with a sequence encoding human IFN α2b optimized for expression in E. coli, and introductions into a suitable plasmid were used to transform E. coli cells (Example 1) and biosynthesis of a hybrid precursor. As a result of the analysis of the cleavage of the expressed hybrid proteins by the SUMO protease Ulp1 (Fig. 1), it was shown for the first time that the maximum possible “truncation” of the Smt3 sequence, which does not adversely affect the hydrolysis process, is to remove 23 amino acid residues from the N-terminus.

б) На втором этапе к отобранной конструкции, кодирующей SUMOΔ23-IFN α2b, присоединяли с 5′-конца нулкотидные последовательности, кодирующие различные вспомогательные белки: тиоредоксин (TrxA), GST, GST + отрицательно заряженный пептид. Выбор именно этой группы «тагов» определялся поставленной задачей: упростить очистку продуктов и полностью исключить возможность их загрязнения токсичными соединениями. После экспрессии данных вариантов конструкции в E.coli выяснилось, что включение в состав «гибрида» различных партнеров слияния не влияет на эффективность выщепления конечного продукта (пример 2, табл. 1), а также то, что введение GST (в обоих случаях) существенно стимулирует рост колоний, обеспечивает повышение стабильной экспрессии и, соответственно, повышает выход гибридного белка.b) At the second stage, to the selected construct encoding SUMOΔ23-IFN α2b, nuclide sequences encoding various auxiliary proteins were attached from the 5′-end: thioredoxin (TrxA), GST, GST + negatively charged peptide. The choice of this particular group of “tags” was determined by the task: to simplify the cleaning of products and completely eliminate the possibility of their contamination with toxic compounds. After the expression of these design variants in E. coli, it turned out that the inclusion of various fusion partners in the “hybrid” does not affect the efficiency of cleavage of the final product (Example 2, Table 1), as well as the fact that the introduction of GST (in both cases) is essential stimulates the growth of colonies, provides an increase in stable expression and, accordingly, increases the yield of the hybrid protein.

в) Далее был проведен эксперимент по сравнению расщепления гибридных белков типа GST-(-)пептид -SUMOΔ23-IFN α2b; GST-(-)пептид -SUMOΔ23-caIFN и GST-(-)пептид -SUMOΔ23-proCPB, где caIFN-интерферон собаки, а proCPB - прокарбоксипептидаза Б. Полученные результаты показали, что SUMOΔ23 эффективно распознается протеазой Ulp1 во всех трех случаях, т.е. может выполнять функцию сайта расщепления в составе гибридного предшественника различных интересующих белков (пример 3). Кроме того, результаты анализа позволили заключить, что созданный нами гибридный белок-партнер GST-(-)пептид - SUMOΔ23 (сокращенно GLSΔ23) создает особо благоприятные условия для очистки продуктов, т.к. позволяет быстро растворять «тельца включения», проводить их очистку на обычном анионообменнике (фиг. 2) и легко отделять партнер от целевого белка (фиг. 3).c) Next, an experiment was conducted comparing the cleavage of hybrid proteins of the GST type - (-) peptide-SUMOΔ23-IFN α2b; GST - (-) peptide -SUMOΔ23-caIFN and GST - (-) peptide -SUMOΔ23-proCPB, where caIFN-interferon is a dog, and proCPB is procarboxypeptidase B. The obtained results showed that SUMOΔ23 is effectively recognized by Ulp1 protease in all three cases, t .e. can serve as a cleavage site in the composition of the hybrid precursor of various proteins of interest (example 3). In addition, the results of the analysis allowed us to conclude that the hybrid protein partner GST that we created - (-) peptide - SUMOΔ23 (abbreviated GLSΔ23) creates particularly favorable conditions for the purification of products, because allows you to quickly dissolve the "inclusion body", to clean them on a conventional anion exchanger (Fig. 2) and to easily separate the partner from the target protein (Fig. 3).

Для осуществления полного цикла получения и очистки немодифицированного рекомбинантного белка была выбрана конструкция, кодирующая предшественник GST-(-)пептид -SUMOΔ23-IFN α2b (GLSΔ23-IFNα2b).To implement the full cycle of obtaining and purification of the unmodified recombinant protein, a construct was selected that encodes the GST precursor - (-) peptide -SUMOΔ23-IFNα2b (GLSΔ23-IFNα2b).

г) Получение интерферона альфа 2b человека включало создание экспрессионного вектора, функционально активного в E. coli, трансформацию бактериальных клеток, отбор положительных клонов и получение рекомбинантного штамма - продуцента гибридного предшественника, культивирование продуцента в условиях, обеспечивающих образование гибридного белка в нерастворимой форме, его растворение, рефолдинг, выделение и очистку.d) Obtaining human interferon alfa-2b included the creation of an expression vector functionally active in E. coli, the transformation of bacterial cells, selection of positive clones and the preparation of a recombinant strain producing a hybrid precursor, culturing the producer under conditions ensuring the formation of a hybrid protein in an insoluble form, its dissolution , refolding, isolation and purification.

В частном случае воплощения рекомбинантная ДНК, кодирующая предшественник GST-(-)пептид -SUMOΔ23-IFN α2b, была встроена в вектор pGEMEX, что не должно служить ограничением изобретения, поскольку очевидно, что в данном случае вектором-носителем могла бы быть и другая плазмида из числа используемых в практике для получения рекомбинантных белков в E. coli, например, принадлежащая к серии pET.In a particular embodiment, the recombinant DNA encoding the GST precursor - (-) peptide -SUMOΔ23-IFN α2b was inserted into the pGEMEX vector, which should not be a limitation of the invention, since it is obvious that in this case another plasmid could also be a carrier vector from those used in practice to obtain recombinant proteins in E. coli, for example, belonging to the pET series.

В качестве штамма-реципиента в конкретном случае выполнения использовали штамм Е. coli BL21(DE3), что также не исключает возможности применения и других известных лабораторных штаммов бактерии, предпочтительно со сниженной протеазной активностью. Полученный рекомбинантный штамм E. coli BL21(DE3)/pGLSΔ23-IFNA2B характеризовался следующими признаками:As a recipient strain in a particular embodiment, E. coli strain BL21 (DE3) was used, which also does not exclude the possibility of using other known laboratory bacterial strains, preferably with reduced protease activity. The resulting recombinant strain of E. coli BL21 (DE3) / pGLSΔ23-IFNA2B was characterized by the following features:

- при микроскопии клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные;- under microscopy, cells are straight, rod-shaped, gram-negative, non-spore;

- при росте на питательном агаре колонии гладкие, круглые, блестящие, серые, края колоний ровные, диаметр 1-2 мм;- when growing on nutrient agar, the colonies are smooth, round, shiny, gray, the edges of the colonies are even, with a diameter of 1-2 mm;

- культура хорошо растет на обычно используемых питательных средах, при росте в жидких средах YT, LB культура имеет вид однородной суспензии;- the culture grows well on commonly used nutrient media; when grown in liquid media, YT, LB, the culture has the form of a uniform suspension;

- устойчив к антибиотику ампициллину в концентрации 100 мкг/мл.- resistant to the antibiotic ampicillin at a concentration of 100 μg / ml.

Условия культивирования полученного штамма-продуцента (см. пример 5) подбирались таким образом, чтобы основная часть белка была представлена нерастворимой формой, поскольку в условиях масштабного производства она имеет преимущества как в плане возможности получения более высоких выходов целевого продукта, так и с точки зрения удобства обращения с ней и ее хранения. Вместе с тем, при необходимости соотношение между нерастворимой и растворимой формами гибридного предшественника могло быть легко смещено в пользу последней путем изменения температурных режимов и условий аэрации, чему, как известно, в большой степени способствует присутствие в структуре «гибрида» глутатион-S-трансферазы (Harper S. and Speicher D., 2011, Methods Mol Biol., 681, 259-280).The cultivation conditions of the obtained producer strain (see Example 5) were selected so that the bulk of the protein was an insoluble form, since under large-scale production conditions it has advantages both in terms of the possibility of obtaining higher yields of the target product, and from the point of view of convenience handling and storing it. At the same time, if necessary, the ratio between the insoluble and soluble forms of the hybrid precursor could be easily shifted in favor of the latter by changing the temperature and aeration conditions, which, as is known, is greatly facilitated by the presence of glutathione-S-transferase in the structure of the “hybrid” ( Harper S. and Speicher D., 2011, Methods Mol Biol., 681, 259-280).

Растворение и рефолдинг гибридного белка проводили общепринятыми способами (пример 5), а для его отделения мог использоваться один из двух вариантов, первый из которых основан на связывании GSTc глутатион-содержащим сорбентом, а второй - на взаимодействии отрицательно заряженного пептида с положительно заряженным сорбентом. Последующая очистка целевого продукта (после расщепления «гибрида» Ulp1) в обоих случаях предусматривала проведение хроматографической очистки на Q- и CM-сефарозе и процедуры гель-фильтрации.The hybrid protein was dissolved and refolded by conventional methods (Example 5), and one of two options could be used for its separation, the first of which was based on the binding of GSTc to a glutathione-containing sorbent, and the second on the interaction of a negatively charged peptide with a positively charged sorbent. Subsequent purification of the target product (after cleavage of the Ulp1 "hybrid") in both cases involved chromatographic purification on Q and CM sepharose and gel filtration procedures.

В результате (вне зависимости от варианта «захвата» гибридного белка) был получен IFN α2b человека с показателями чистоты и специфической активности, близкими к прототипу. При этом предложенная ДНК-конструкция и ее применение по назначению позволили получить целевой продукт более простым в технологическом отношении и более дешевым способом, чем в прототипе, и исходно (без дополнительных проверок) гарантировать отсутствие загрязнения его следами токсичных соединений, обеспечивая тем самым достижение планируемых технических результатов.As a result (regardless of the variant of "capture" of the hybrid protein), human IFN α2b was obtained with purity and specific activity indices close to the prototype. At the same time, the proposed DNA design and its intended use made it possible to obtain the target product in a technologically simpler and cheaper way than in the prototype, and initially (without additional checks) to ensure that it is not contaminated with traces of toxic compounds, thereby ensuring the achievement of the planned technical results.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

Фиг. 1. Эффективность гидролиза гибридных белков с вариантами укороченного белка SUMO.FIG. 1. The effectiveness of the hydrolysis of hybrid proteins with variants of the truncated protein SUMO.

Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза Ulp1 в 14% ПААГ.Electrophoretic separation of the products of Ulp1 hydrolysis in 14% PAAG.

Дорожки 1 и 10 - маркеры молекулярных весов (14,4; 18,4; 25; 35; 45; 66,2; 116 кД). Дорожки 2-3; 4-5; 6-7; 8-9 - лизат без добавления Ulp1 и лизат, инкубированный с Ulp1 1 час во льду при гидролизе предшественников SUMO-IFNα2b, SUMOΔ19-IFNα2b, SUMOΔ23-IFNα2b, SUMOΔ40-IFNα2b, соответственно.Lanes 1 and 10 are molecular weight markers (14.4; 18.4; 25; 35; 45; 66.2; 116 kD). Lanes 2-3; 4-5; 6-7; 8-9 - a lysate without the addition of Ulp1 and a lysate incubated with Ulp1 for 1 hour in ice upon hydrolysis of the precursors SUMO-IFNα2b, SUMOΔ19-IFNα2b, SUMOΔ23-IFNα2b, SUMOΔ40-IFNα2b, respectively.

Фиг. 2. Предварительная очистка неренатурированного гибридного белка GLSΔ23-caIFN в 6 М мочевине на анионообменной смоле.FIG. 2. Pre-purification of the unrenatured fusion protein GLSΔ23-caIFN in 6 M urea on an anion exchange resin.

Электрофоретическое разделение в 10% ПААГ.Electrophoretic separation in 10% SDS page.

Дорожка 1 - маркеры молекулярных весов (14,4; 18,4; 25; 35; 45; 66,2; 116 кД).Lane 1 - molecular weight markers (14.4; 18.4; 25; 35; 45; 66.2; 116 kD).

Дорожка 2 - растворенные тельца включения GLSΔ23-caIFN в 8 М мочевине.Lane 2 — Dissolved inclusion bodies of GLSΔ23-caIFN in 8 M urea.

Дорожка 3 - то же, что и дорожка 2, но нанесено в 5 раз меньше материала.Lane 3 is the same as lane 2, but 5 times less material is applied.

Дорожка 4 - промывка колонки 0,2 М NaCl. Дорожка 5 - элюция 0,5 М NaCl. Дорожка 6 - смыв гибридного белка в агрегатном состоянии (1 М NaCl).Lane 4 — washing the column with 0.2 M NaCl. Lane 5 — Elution with 0.5 M NaCl. Lane 6 — washout of the fusion protein in the state of aggregation (1 M NaCl).

Фиг. 3. Отделение карбоксипептидазы Б человека из гибридного белка GLSΔ23-СРВ. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ.FIG. 3. Separation of human carboxypeptidase B from the GLSΔ23-CPB fusion protein. Electrophoretic separation in 12% SDS page.

Дорожка 1 - маркеры молекулярных весов (14,4; 18,4; 25; 35; 45; 66,2; 116 кД).Lane 1 - molecular weight markers (14.4; 18.4; 25; 35; 45; 66.2; 116 kD).

Дорожка 2 - нерастворимый белок после растворения телец включения.Lane 2 - insoluble protein after dissolution of inclusion bodies.

Дорожка 3 - растворимый белок после растворения телец включения.Lane 3 — soluble protein after dissolution of inclusion bodies.

Дорожка 4 - ренатурированный гибридный белок.Lane 4 - Renatured Hybrid Protein.

Дорожка 5 - гидролиз Ulp1 ренатурированного гибридного белка GLSΔ23-CPB.Lane 5 — Ulp1 hydrolysis of the renatured GLSΔ23-CPB fusion protein.

Фиг. 4. Очистка гибридного белка на Q-сефарозе Fast Flow.FIG. 4. Purification of the hybrid protein on Q-Sepharose Fast Flow.

Фиг. 5. Хроматографическое разделение на Q-сефарозе Fast Flow после ферментативного расщепления гибридного белка.FIG. 5. Chromatographic separation on Fast Flow Q-Sepharose after enzymatic cleavage of the fusion protein.

Фиг. 6. Электрофоретическое разделение в 14% ПААГ.FIG. 6. Electrophoretic separation in 14% PAAG.

Дорожка 1 - маркеры молекулярных весов (14,4; 18,4; 25; 35; 45; 66,2; 116 кД).Lane 1 - molecular weight markers (14.4; 18.4; 25; 35; 45; 66.2; 116 kD).

Дорожка 2 - растворимый белок после растворения телец включения.Lane 2 — soluble protein after dissolution of inclusion bodies.

Дорожка 3 - нерастворимый белок после растворения телец включения.Lane 3 - insoluble protein after dissolution of inclusion bodies.

Дорожка 4 - ренатурированный гибридный белок.Lane 4 - Renatured Hybrid Protein.

Дорожка 5 - фракция гибридного белка GLSΔ23-IFNα2b с Q-сефарозы Fast Flow.Lane 5 — GLSΔ23-IFNα2b fusion protein fraction from Fast Flow Q-Sepharose.

Дорожка 6 - гидролиз Ulp1. ренатурированного гибридного белка GLSΔ23-IFNα2b.Lane 6 - hydrolysis of Ulp1. renatured fusion protein GLSΔ23-IFNα2b.

Дорожка 7 - фракция IFNα2b с Q-сефарозы Fast Flow.Lane 7 — IFNα2b fraction from Q-Sepharose Fast Flow.

Дорожка 8 - фракция GLSΔ23 с Q-сефарозы Fast Flow.Lane 8 — GLSΔ23 fraction with Q-Sepharose Fast Flow.

Фиг. 7. Очистка IFNα2b на CM-сефарозе Fast Flow.FIG. 7. Purification of IFNα2b on Fast Flow CM-Sepharose.

Фиг. 8. Количественное определение специфических примесей в образце IFNα2b методом ВЭЖХ.FIG. 8. Quantification of specific impurities in an IFNα2b sample by HPLC.

Фиг. 9. Сравнение пептидной карты образца IFN α2b с пептидной картой стандартного образца интерферона альфа-2b.FIG. 9. Comparison of the peptide map of the IFN α2b sample with the peptide map of the standard interferon alpha-2b sample.

Осуществление изобретения.The implementation of the invention.

Пример 1. Исследование влияния укорачивания последовательности SUMO (Smt3) на экспрессию и расщепление гибридного предшественника.Example 1. The study of the effect of shortening the sequence of SUMO (Smt3) on the expression and cleavage of the hybrid precursor.

а) Дизайн варианта синтетического гена Smt3 (SUMO из Saccharomycescerevisiae, NP_010798.1), соединенного с геном зрелого интерферона-alpha 2b человека (IFNα2b, NP_000596.2), разрабатывали на основе известной аминокислотной последовательности при помощи программы DNABuilder (http://www.innovationsinmedicine.org/software/DNABuilder), руководствуясь информацией о составе кодонов, сильно экспрессирующихся генов (stronglyexpressedgenes) Eshcherichiacoli.a) The design of a variant of the synthetic Smt3 gene (SUMO from Saccharomycescerevisiae, NP_010798.1) linked to the mature human interferon-alpha 2b gene (IFNα2b, NP_000596.2) was developed on the basis of the known amino acid sequence using the DNABuilder program (http: // www .innovationsinmedicine.org / software / DNABuilder), guided by information on the composition of codons, strongly expressed genes (stronglyexpressedgenes) of Eshcherichiacoli.

При помощи программы Clone Manager (Sci-Ed Software, США) полученную нуклеотидную последовательность гена проверяли на наличие рестрикционных сайтов, используемых в дальнейшей работе. Найденные рестрикционные сайты удаляли с помощью замены соответствующего нуклеотидного триплета с использованием таблицы частоты встречаемости кодонов E. coli.Using the Clone Manager program (Sci-Ed Software, USA), the obtained nucleotide sequence of the gene was checked for the presence of restriction sites used in further work. The found restriction sites were removed by replacing the corresponding nucleotide triplet using the E. coli codon frequency table.

Составленную таким образом нуклеотидную последовательность гена SUMO-IFNα2b, оптимизированную для экспрессии в клетках E. coli, разбивали на олигонуклеотиды длиной 50 н.п. с помощью программы DNA Builder для последующей сборки полного гена методом рекомбинантной ПЦР. При дизайне 5`фланкирующего праймера к его 5`-концевой последовательности добавляли сайт рестриктазы NdeI, а при дизайне 3`-фланкирующего праймера - сайт рестриктазы HindIII. Эти сайты были необходимы для последующего создания экспрессионной конструкции.The nucleotide sequence of the SUMO-IFNα2b gene thus compiled, optimized for expression in E. coli cells, was partitioned into oligonucleotides of 50 np in length. using DNA Builder for subsequent assembly of the complete gene by recombinant PCR. In the design of the 5` flanking primer, the NdeI restriction enzyme site was added to its 5`-terminal sequence, and in the design of the 3` flanking primer, the HindIII restriction enzyme site was added. These sites were necessary for the subsequent creation of the expression construct.

ПЦР-амплификацию проводили в два этапа. В реакцию вносили эквимолярную смесь (5 мкМ каждого) олигонуклеотидных праймеров (всех, кроме крайних), составляющих ген, взаимно перекрывающихся между собой на 15-20 нуклеотидов, 0.2 мкМ раствора dNTP, 1/10 часть реакционного 10х буфера и 1 ед. термостабильной ДНК-полимеразы PfuI. Температуру отжига праймеров рассчитывали по стандартной формуле:PCR amplification was carried out in two stages. An equimolar mixture (5 μM each) of oligonucleotide primers (all but the extreme ones) comprising the gene mutually overlapping by 15-20 nucleotides, 0.2 μM dNTP solution, 1/10 of the reaction buffer 10 and 1 unit was introduced into the reaction. thermostable PfuI DNA polymerase. The primer annealing temperature was calculated by the standard formula:

T_m(°C)=2·[N_A+N_T]+4·[N_C+N_G]-10,T _m (° C) = 2 · [N _A + N _T ] + 4 · [N _C + N _G ] -10,

где N_X - количество соответствующих оснований. Реакцию проводили по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°C, 5 минут; затем 10 циклов: денатурация ДНК при 95°C, 1 минута; отжиг праймеров при 55°C, 1 минута; синтез ДНК при 74°C, 2,5 минуты. Вторую амплификацию проводили, используя в качестве матрицы раствор первой реакции и крайние праймеры, обеспечивающие синтез гена с необходимыми сайтами рестриктаз, по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°C, 5 минут; затем 30 циклов: денатурация ДНК при 95°C, 1 минута; отжиг праймеров при 55°C, 1 минута; синтез ДНК при 74°C, 2,5 минуты.where N _X is the number of corresponding bases. The reaction was carried out as follows: DNA denaturation at 95 ° C, 5 minutes; then 10 cycles: DNA denaturation at 95 ° C, 1 minute; primer annealing at 55 ° C, 1 minute; DNA synthesis at 74 ° C, 2.5 minutes. The second amplification was carried out using the solution of the first reaction and the extreme primers providing the synthesis of the gene with the necessary restriction enzyme sites as the template, according to the following scheme: DNA denaturation at 95 ° C, 5 minutes; then 30 cycles: DNA denaturation at 95 ° C, 1 minute; primer annealing at 55 ° C, 1 minute; DNA synthesis at 74 ° C, 2.5 minutes.

Смесь для ПЦР (50 мкл):Mix for PCR (50 μl):

5 мкл 10-кратного буфера для PfuI-полимеразы («Евроген»);5 μl of a 10-fold buffer for PfuI polymerase (Eurogen);

5 мкл реакционной смеси 15 μl of reaction mixture 1

0,5 мкл 100 мкМ праймера Direct-S (SEQ ID NO: 1);0.5 μl of 100 μM Direct-S primer (SEQ ID NO: 1);

0,5 мкл 100 мкМ праймера Reverse-I (SEQ ID NO: 2);0.5 μl of 100 μM Primer Reverse-I (SEQ ID NO: 2);

1 мкл 10 мМ dNTP каждого вида («Fermentas»);1 μl of 10 mm dNTP of each type ("Fermentas");

38 мкл деионизованной воды;38 μl of deionized water;

0,5 мкл PfuI ДНК-полимеразы («Fermentas»).0.5 μl of PfuI DNA polymerase (Fermentas).

После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и выявляли гомогенный фрагмент размером 830 п.н. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора Min Elute Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.After amplification, 5 μl of PCR mixture was analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel and a homogeneous fragment of 830 bp was detected. The fragment was isolated from the gel using the Min Elute Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions.

б) В качестве вектора-носителя использовали плазмиду pGEMEX-1 (Promega, США). С целью накопления плазмиды проводили трансформацию компетентных клеток штаммаb) The plasmid pGEMEX-1 (Promega, USA) was used as a carrier vector. In order to accumulate plasmids, competent strain cells were transformed

Escherichiacoli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [

proAB lacI^qZΔM15 Tn10 (Tet^r)] (Stratagene, США), затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора QIA prep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя.Escherichiacoli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [

proAB lacI ^q ZΔM15 Tn10 (Tet ^r )] (Stratagene, USA), then plasmid DNA preparations were isolated from the obtained ampicillin-resistant transformants using the QIA prep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions.

Так как в плазмиде pGEMEX-1 есть два сайта NdeI, использовали трехкомпонентное лигирование. Для этого 200 нг исходной плазмиды pGEMEX-1 гидролизовали 10 единицами рестриктаз NdeI и AatII (New England Biolabs, США), получая фрагмент ДНК примерно 2000 п.н. Кроме этого, 200 нгр GEMEX-1 гидролизовали 10 единицами рестриктаз AatII и HindIII (New England Biolabs, США), получая фрагмент ДНК примерно 1000 п.н. 200 нг полученного продукта ПЦР (полной последовательности искусственного гена SUMO-IFNα2b) гидролизовали 10 единицами рестриктаз NdeI и HindIII (New England Biolabs, США). Выделенные из агарозного геля фрагменты объединяли и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки штамма Escherichiacoli XL1-Blue, а затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора QIA prep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Полученные образцы ДНК анализировали совместным гидролизом рестриктазами NdeI/HindIII, и отбирали «положительные» клоны, содержащие NdeI/HindIII фрагменты размером 803, 755 и 2347 п.н. На наличие мутаций плазмиды анализировали методом секвенирования ДНК. В итоге был получен экспрессионный вектор, обозначенный нами pGEMEX-1/SUMO-IFNA2B.Since there are two NdeI sites in plasmid pGEMEX-1, ternary ligation was used. For this, 200 ng of the original plasmid pGEMEX-1 was hydrolyzed with 10 restriction enzymes NdeI and AatII (New England Biolabs, USA) to obtain a DNA fragment of approximately 2000 bp. In addition, 200 ng of GEMEX-1 was hydrolyzed with 10 AatII and HindIII restriction enzymes (New England Biolabs, USA) to obtain a DNA fragment of approximately 1000 bp. 200 ng of the obtained PCR product (complete sequence of the artificial SUMO-IFNα2b gene) was hydrolyzed with 10 restriction enzymes NdeI and HindIII (New England Biolabs, USA). Fragments isolated from agarose gel were pooled and ligated with T4 DNA ligase. The competent ligase mixture was transformed with competent cells of the Escherichiacoli strain XL1-Blue, and then plasmid DNA preparations were isolated from the obtained ampicillin-resistant transformants using the QIA prep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions. The obtained DNA samples were analyzed by co-hydrolysis with restriction enzymes NdeI / HindIII, and "positive" clones containing NdeI / HindIII fragments of 803, 755 and 2347 bp were selected. For mutations, plasmids were analyzed by DNA sequencing. As a result, an expression vector was obtained, designated by us as pGEMEX-1 / SUMO-IFNA2B.

в) Укорачивание последовательности SUMO проводили методом ПЦР. В качестве матрицы использовали плазмиду pGEMEX-1/SUMO-IFNA2B. Реакцию проводили по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°C, 5 минут; затем 30 циклов: денатурация ДНК при 95°C, 1 минута; отжиг праймеров при 52°C, 1 минута; синтез ДНК при 74°C, 2 минуты. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды: 3`-концевой праймер - HSeq (SEQ ID NO: 3) и 5′-концевые праймеры S20 (SEQ ID NO: 4), S24 (SEQ ID NO: 5), S41 (SEQ ID NO: 6) для получения, соответственно, SUMOΔ19-IFNα2b, SUMOΔ23-IFNα2b, SUMOΔ40-IFNα2b.c) Shortening of the SUMO sequence was carried out by PCR. Plasmid pGEMEX-1 / SUMO-IFNA2B was used as a matrix. The reaction was carried out as follows: DNA denaturation at 95 ° C, 5 minutes; then 30 cycles: DNA denaturation at 95 ° C, 1 minute; primer annealing at 52 ° C, 1 minute; DNA synthesis at 74 ° C, 2 minutes. Synthetic oligonucleotides were used as primers: 3`-terminal primer - HSeq (SEQ ID NO: 3) and 5'-terminal primers S20 (SEQ ID NO: 4), S24 (SEQ ID NO: 5), S41 (SEQ ID NO : 6) to obtain, respectively, SUMOΔ19-IFNα2b, SUMOΔ23-IFNα2b, SUMOΔ40-IFNα2b.

После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и выявляли гомогенные фрагменты размером 824, 836, 887 и 938 п.н., (SUMOΔ19-IFNα2b, SUMOΔ23-IFNα2b и SUMOΔ40-IFNα2b, соответственно).After amplification, 5 μl of PCR mixture was analyzed by electrophoresis on a 1% agarose gel and homogeneous fragments of 824, 836, 887 and 938 bp were detected (SUMOΔ19-IFNα2b, SUMOΔ23-IFNα2b and SUMOΔ40-IFNα2b, respectively).

Фрагменты выделяли из геля с помощью набора Min Elute Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя, гидролизовали рестриктазами NdeI и HindIII, илигировали с фрагментами плазмиды pGEMEX-1, как описано в п.б). Отобранные плазмиды обозначили как pGEMEX-1/SUMOΔ19-IFNA2B, pGEMEX-1/SUMOΔ23-IFNA2B и pGEMEX-1/SUMOΔ40-IFNA2B, соответственно.Fragments were isolated from the gel using the Min Elute Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany) according to the manufacturer's instructions, digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, or ligated with fragments of plasmid pGEMEX-1, as described in b). Selected plasmids were designated as pGEMEX-1 / SUMOΔ19-IFNA2B, pGEMEX-1 / SUMOΔ23-IFNA2B and pGEMEX-1 / SUMOΔ40-IFNA2B, respectively.

г) Так как в векторе pGEMEX-1 гены гибридных белков в полученных рекомбинантных плазмидах находятся под транскрипционным контролем T7 полимеразы, для трансформации использовали штамм E. coli BL21 (DE3) [F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), dcm, gal, λ (DE3)], который синтезирует РНК-полимеразу фага T7, а также обладает сниженной протеазной активностью.d) Since the genes of the hybrid proteins in the obtained recombinant plasmids in the pGEMEX-1 vector are under transcriptional control of T7 polymerase, E. coli strain BL21 (DE3) [F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), dcm was used for transformation , gal, λ (DE3)], which synthesizes RNA polymerase of the phage T7, and also has a reduced protease activity.

Для селекции трансформированные бактерии высевали на агаризованную культуральную среду YT, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Выросшими колониями бактерий инокулировали 50 мл культуральной среды TB5052 (Studier F.W. Protein Expr Purif. 2005; 41:207-234) и культивировали 48 часов при 15°C, затем бактерии собирали центрифугированием, декантировали надосадочную жидкость и осадок замораживали при -20°C.For selection, transformed bacteria were plated on YT agar culture medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / ml. Overgrown bacterial colonies were inoculated with 50 ml of TB5052 culture medium (Studier F.W. Protein Expr Purif. 2005; 41: 207-234) and cultured for 48 hours at 15 ° C, then the bacteria were collected by centrifugation, the supernatant was decanted and the precipitate was frozen at -20 ° C.

Для анализа эффективности гидролиза гибридных белков гидролазой Ulp1 клетки размораживали и разрушали ультразвуком с периодическим охлаждением во льду в лизис-буфере, содержащем 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 0.1 мМ PMSF, pH 9.0. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 13000 об/мин 10 мин. К надосадочной жидкости добавляли Ulp1, полученную, как описано в (Reverter D., Lima C.D. Methods Mol Biol. 2009; 497:225-239), до конечной концентрации 2 мкг/мл и инкубировали 1 час во льду. Эффективность гидролиза анализировали методом электрофореза в ДСН-ПААГ.To analyze the efficiency of the hydrolysis of hybrid proteins by Ulp1 hydrolase, the cells were thawed and destroyed by ultrasound with periodic cooling in ice in a lysis buffer containing 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, pH 9.0. Cell debris was removed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes. Ulp1, prepared as described in (Reverter D., Lima C. D. Methods Mol Biol. 2009; 497: 225-239), was added to the supernatant to a final concentration of 2 μg / ml and incubated for 1 hour in ice. The hydrolysis efficiency was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis.

В результате проведенного анализа было установлено, что гибриды, содержащие усеченные формы SUMOΔ19 и SUMOΔ23, гидролизуются Ulp1 с той же эффективностью, что и гибрид с полноразмерным SUMO, тогда как предшественник с SUMOΔ40 вообще не подвергается ферментативному расщеплению (фиг. 1). Для дальнейшей работы была отобрана конструкция SUMOΔ23-IFNα2bc показанным нами максимально возможным укорачиванием SUMO Sac. cerevisiae.As a result of the analysis, it was found that hybrids containing truncated forms of SUMOΔ19 and SUMOΔ23 are hydrolyzed by Ulp1 with the same efficiency as the hybrid with full-sized SUMO, whereas the precursor with SUMOΔ40 does not undergo enzymatic cleavage at all (Fig. 1). For further work, the design of SUMOΔ23-IFNα2bc was selected, which we showed as much as possible shortening SUMO Sac. cerevisiae.

SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 3

SEQ ID NO: 4SEQ ID NO: 4

SEQ ID NO: 5SEQ ID NO: 5

SEQ ID NO: 6SEQ ID NO: 6

Пример 2. Исследование влияния различных вспомогательных полипептидов на экспрессию и расщепление гибридного предшественника.Example 2. The study of the effect of various auxiliary polypeptides on the expression and cleavage of the hybrid precursor.

К отобранной в предыдущем примере конструкции, кодирующей SUMOΔ23-IFN α2b, присоединяли с 5′-конца нуклеотидные последовательности, кодирующие различные белки: тиоредоксин (TrxA), GST, GST + отрицательно заряженный пептид. Выбор именно этой группы «тагов» определялся поставленной задачей: упростить очистку продуктов и полностью исключить возможность загрязнения токсичными соединениями.The nucleotide sequences encoding various proteins: thioredoxin (TrxA), GST, GST + negatively charged peptide were attached from the 5′-end of the selected construct in the previous example to the encoding SUMOΔ23-IFN α2b. The choice of this particular group of “tags” was determined by the task: to simplify the cleaning of products and completely eliminate the possibility of contamination with toxic compounds.

а) TrxAa) TrxA

Ген тиоредоксина E. coli tvxA (AAC40210.1) клонировали методом ПЦР, используя в качестве матрицы коммерческую плазмиду рЕТ32а. При дизайне 5` фланкирующего праймера Trx-Dir (SEQ ID NO: 7) к его 5`-концевой последовательности добавляли сайт рестриктазы NdeI, а при дизайне 3`-фланкирующего праймера Trx-Rev (SEQ ID NO: 8) - сайт рестриктазы EcoRI. Эти сайты были необходимы для последующего клонирования в плазмиду pGEMEX-1 (для плазмид серии рЕТ вместо NdeI используется сайт NcoI). Клонирование продукта ПЦР проводили аналогично описанному в Примере 1 по сайтам рестрикции NdeI и EcoRI. Полученную плазмиду pGEMEX-1/TrxA анализировали методом секвенирования ДНК в пределах вставки.The thioredoxin gene of E. coli tvxA (AAC40210.1) was cloned by PCR using the commercial plasmid pET32a as a template. When designing the 5 ′ Trx-Dir flanking primer (SEQ ID NO: 7), the NdeI restriction enzyme site was added to its 5`-terminal sequence, and when designing the Trx-Rev 3 ′ flanking primer (SEQ ID NO: 8), the EcoRI restriction enzyme site . These sites were necessary for subsequent cloning into the pGEMEX-1 plasmid (for pET plasmids, the NcoI site is used instead of NdeI). Cloning of the PCR product was performed as described in Example 1 at the restriction sites NdeI and EcoRI. The resulting plasmid pGEMEX-1 / TrxA was analyzed by DNA sequencing within the insert.

Для сборки итогового экспрессионного плазмидного вектора вводили сайт EcoRI перед последовательностью гена гибрида SUMOΔ23-IFNα2b с помощью метода ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду pGEMEX-1/SUMOΔ23-IFNA2B. В последовательности 5`-концевого праймера E-S24 (SEQ ID NO: 9) был предусмотрен сайт EcoRI, в качестве 3`-концевого праймера использовали HSeq (SEQ ID NO: 3). Продукт ПЦР клонировали в вектор pGEMEX-1/TrxA аналогично описанному в Примере 1 по сайтам рестрикции EcoRI и HindIII. Полученную плазмиду pGEMEX-1/TrxA-SUMOΔ23-IFNA2B анализировали методом секвенирования ДНК в пределах вставки.To assemble the final expression plasmid vector, the EcoRI site was introduced before the SUMOΔ23-IFNα2b hybrid gene sequence using the PCR method using pGEMEX-1 / SUMOΔ23-IFNA2B plasmid as a template. An EcoRI site was provided in the sequence of the 5`-terminal primer E-S24 (SEQ ID NO: 9), HSeq (SEQ ID NO: 3) was used as the 3`-terminal primer. The PCR product was cloned into the vector pGEMEX-1 / TrxA as described in Example 1 at EcoRI and HindIII restriction sites. The resulting plasmid pGEMEX-1 / TrxA-SUMOΔ23-IFNA2B was analyzed by DNA sequencing within the insert.

б) GSTb) GST

Ген глутатион-S-трансферазы из Schistosomajaponicum (GST) клонировали из коммерческого вектора pET28GST-LIC (GenBank: EF456739.1) методом ПЦР с использованием праймеров: 5`-фланкирующего GST-Dir (SEQ ID NO: 10), содержащего сайт рестриказы NdeI, и 3`-фланкирующего праймера GST-Rev (SEQ ID NO: 11), содержащий сайт рестриктазы EcoRI. Продукт ПЦР клонировали в плазмиду pGEMEX-1 аналогично описанному в Примере 1 по сайтам рестрикции NdeI/EcoRI. Полученную плазмиду pGEMEX-1/GST анализировали методом секвенирования ДНК в пределах вставки и использовали для получения плазмиды pGEMEX-1/GST-SUMOΔ23-IFNA2B аналогично получению плазмиды pGEMEX-1/TrxA-SUMOΔ23-IFNA2B, описанному выше.The glistathione S transferase gene from Schistosomajaponicum (GST) was cloned from the commercial vector pET28GST-LIC (GenBank: EF456739.1) by PCR using primers: 5`-flanking GST-Dir (SEQ ID NO: 10) containing the NdeI restriction site , and the 3`-flanking primer GST-Rev (SEQ ID NO: 11) containing the EcoRI restriction site. The PCR product was cloned into the plasmid pGEMEX-1 as described in Example 1 at the NdeI / EcoRI restriction sites. The resulting plasmid pGEMEX-1 / GST was analyzed by DNA sequencing within the insert and used to obtain the plasmid pGEMEX-1 / GST-SUMOΔ23-IFNA2B similar to the plasmid pGEMEX-1 / TrxA-SUMOΔ23-IFNA2B described above.

В) GSTc (-)пептидом (Linker)C) GSTc (-) peptide (Linker)

Нуклеотидную последовательность, кодирующую отрицательно заряженный пептид, адаптировали в плазмиду pGEMEX-1/GST-SUMOΔ23-IFNA2B между генами GST и SUMOΔ23 аналогично получению плазмиды pGEMEX-1/GST-SUMOΔ23-IFNA2B, где в качестве 3`-фланкирующего линкера использовали синтетический олигонуклеотид с SEQ ID NO: 12. В результате была получена плазмида, которую обозначили pGEMEX-1/GLSΔ23-IFNA2B.The nucleotide sequence encoding the negatively charged peptide was adapted into the pGEMEX-1 / GST-SUMOΔ23-IFNA2B plasmid between the GST and SUMOΔ23 genes, similarly to the preparation of the pGEMEX-1 / GST-SUMOΔ23-IFNA2B plasmid, where a synthetic oligonucleotide was used as a 3` flanking linker SEQ ID NO: 12. The result was a plasmid, which was designated pGEMEX-1 / GLSΔ23-IFNA2B.

SEQ ID NO: 7SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 8SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 9SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 10SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 11SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 12SEQ ID NO: 12

Linker:Linker:

г) Экспрессионный анализ и анализ гидролиза гибридных белков Ulp1.d) Expression analysis and analysis of the hydrolysis of hybrid proteins Ulp1.

Полученными экспрессионными векторами трансформировали клетки E. coli штамма BL21(DE3), высевали на селекционную агаризованную среду YT, содержащую ампициллин. Выросшими бактериальными колониями инокулировали жидкую среду TB5052, содержащую ампициллин, и культивировали 16 часов при 37°C либо 48 часов при 15°C. Затем бактерии собирали центрифугированием, декантировали надосадочную жидкость и осадок замораживали при -20°C.The obtained expression vectors transformed E. coli cells of strain BL21 (DE3), seeded on selection agar medium YT containing ampicillin. The grown bacterial colonies were inoculated with ampicillin-containing TB5052 liquid medium and cultured for 16 hours at 37 ° C or 48 hours at 15 ° C. Then the bacteria were collected by centrifugation, the supernatant was decanted and the precipitate was frozen at -20 ° C.

Для анализа эффективности гидролиза гибридных белков гидролазой Ulp1 клетки размораживали и разрушали ультразвуком с периодическим охлаждением во льду в буфере, содержащем 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 0.1 мМ PMSF, pH 9.0. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием при 13000 об/мин 10 мин. К надосадочной жидкости добавляли ULP1 до конечной концентрации 2 мкг/мл и инкубировали 1 час во льду. Эффективность гидролиза анализировали методом электрофореза в ДСН-ПААГ. Данные представлены в таблице 1.To analyze the efficiency of the hydrolysis of hybrid proteins by Ulp1 hydrolase, the cells were thawed and sonicated with periodic cooling in ice in a buffer containing 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, pH 9.0. Cell debris was removed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes. ULP1 was added to the supernatant to a final concentration of 2 μg / ml and incubated for 1 hour in ice. The hydrolysis efficiency was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis. The data are presented in table 1.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что во всех исследованных вариантах предшественника, содержащих в своей структуре различные «таги», наблюдается нормальный процесс гидролиза Ulp1. Вместе с тем, следует отметить, что наличие в составе гибридного белка GST (см. две последние строки в таблице) положительно влияет на рост колоний, соответственно, общий выход гибридного белка.The results obtained indicate that in all investigated variants of the precursor containing various “tags” in their structure, the normal process of hydrolysis of Ulp1 is observed. At the same time, it should be noted that the presence of GST in the composition of the hybrid protein (see the last two lines in the table) positively affects the growth of colonies, respectively, the overall yield of the hybrid protein.

Пример 3. Получение и испытание ДНК-конструкций предлагаемого типа для различных целевых белков.Example 3. Obtaining and testing DNA constructs of the proposed type for various target proteins.

Помимо интерферона человека в качестве целевых белков в предлагаемых белках-предшественниках использовали интерферон собаки и прокарбоксипептидазу Б человека.In addition to human interferon, dog interferon and human procarboxypeptidase B were used as target proteins in the proposed precursor proteins.

а) Интерферон собаки (caIFN)a) Interferon dogs (caIFN)

Ген гибридного белка SUMOΔ23-caIFN, состоящий из усеченного гена SUMOΔ23 (Пример 2) и гена интерферона собаки альфа 1 (ABF68838.1), был собран при помощи метода ПЦР из синтетических олигонуклеотидов на основе известной аминокислотной последовательности. При дизайне последовательности руководствовались информацией о частоте встречаемости кодонов в сильно экспрессирующихся генах Eshcherichiacoli. Фланкирующие праймеры 5`-E-S24 (SEQ ID NO: 9) и Са-Rev (SEQ ID NO: 13) содержали сайты рестриктаз EcoRI и HindIII, соответственно. Эти сайты были необходимы для получения экспрессионной конструкции pGEMEX-1/GLSΔ23-caINF. Сборка конструкции велась аналогично сборке вектора pGEMEX-1/GLSΔ23-IFNA2B (конструкции отличаются только тем, что вместо гена интерферона альфа-2b человека в конструкцию включен ген интеферона альфа 1 собаки).The SUMOΔ23-caIFN fusion protein gene, consisting of the truncated SUMOΔ23 gene (Example 2) and the dog alpha interferon gene alpha 1 (ABF68838.1), was assembled using the PCR method from synthetic oligonucleotides based on the known amino acid sequence. When designing the sequences, they were guided by information on the frequency of occurrence of codons in strongly expressed Eshcherichiacoli genes. Flanking primers 5`-E-S24 (SEQ ID NO: 9) and Ca-Rev (SEQ ID NO: 13) contained restriction enzyme sites EcoRI and HindIII, respectively. These sites were necessary to obtain the expression construct pGEMEX-1 / GLSΔ23-caINF. The assembly of the construct was carried out similarly to the assembly of the vector pGEMEX-1 / GLSΔ23-IFNA2B (the designs differ only in that the dog gene interferon alpha 1 is included in the construct instead of the human interferon alpha-2b gene).

б) Прокарбоксипептидаза (proCPB)b) Procarboxypeptidase (proCPB)

Ген прокарбоксипептидазы Б человека (NP_001862.2) был собран при помощи метода ПЦР и адаптирован в плазмидный вектор pGEMEX-1/GLSΔ23-proCPB аналогично предыдущим примерам с использованием 3`-фланкирующего праймера CPB-Rev (SEQ ID NO: 14).The human procarboxypeptidase B gene (NP_001862.2) was assembled by PCR and adapted to the pGEMEX-1 / GLSΔ23-proCPB plasmid vector similar to the previous examples using the 3`-flanking CPB-Rev primer (SEQ ID NO: 14).

SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 14SEQ ID NO: 14

в) Конструкциями трансформировали клетки E. coli BL21(DE3), культивирование рекомбинантных штаммов проводили при 37°C с получением предшественника в нерастворимой форме, последующим растворением тел включения, рефолдингом гибридного белка и гидролизом его Ulp1 (более подробно все указанные процессы описаны в примере 5).c) E. coli BL21 (DE3) cells were transformed with constructs, recombinant strains were cultured at 37 ° C to obtain the precursor in insoluble form, followed by dissolution of inclusion bodies, refolding of the hybrid protein and hydrolysis of its Ulp1 (all of these processes are described in more detail in Example 5 )

Полученные данные позволили заключить, что созданный нами гибридный белок-партнер GLSΔ23 позволяет легко растворять «тельца включения», успешно чистить их на аниообменной смоле (Фиг. 2) и отделять его от целевого белка (Фиг. 3). При этом SUMOΔ23 эффективно расщеплялся протеазой Ulp1 во всех трех случаях, т.е. выполнял функцию сайта расщепления в составе гибридного предшественника различных интересующих белков.The data obtained allowed us to conclude that the hybrid partner protein GLSΔ23 that we created allows us to easily dissolve the inclusion bodies, successfully clean them on the anion exchange resin (Fig. 2) and separate it from the target protein (Fig. 3). Moreover, SUMOΔ23 was efficiently cleaved by Ulp1 protease in all three cases, i.e. served as a cleavage site in the hybrid precursor of various proteins of interest.

Пример 4. Получение рекомбинантного штамма-продуцента ИФН альфa2b человека.Example 4. Obtaining a recombinant strain producing IFN alpha alpha2b person.

Рекомбинантный штамм, продуцирующий человеческий ИФН альфа2b, был получен на основе описанной в примере 3 первичной культуры клеток E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pGLSΔ23-IFNA2B, после 3-х кратного пересева.The recombinant strain producing human IFN alpha2b was obtained based on the primary culture of E. coli BL21 (DE3) cells transformed with plasmid pGLSΔ23-IFNA2B described in Example 3 after 3-fold reseeding.

Полученный рекомбинантный штамм E. coli BL21(DE3)/pGLSΔ23-IFNA2B характеризовался следующими признаками:The resulting recombinant strain of E. coli BL21 (DE3) / pGLSΔ23-IFNA2B was characterized by the following features:

- при микроскопии клетки прямые, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные;- under microscopy, cells are straight, rod-shaped, gram-negative, non-spore;

- при росте на питательном агаре колонии гладкие, круглые, блестящие, серые, края колоний ровные, диаметр 1-2 мм;- when growing on nutrient agar, the colonies are smooth, round, shiny, gray, the edges of the colonies are even, with a diameter of 1-2 mm;

- культура хорошо растет на обычно используемых питательных средах, при росте в жидких средах YT, LB культура имеет вид однородной суспензии;- the culture grows well on commonly used nutrient media; when grown in liquid media, YT, LB, the culture has the form of a uniform suspension;

- устойчив к антибиотику ампициллину в концентрации 100 мкг/мл.- resistant to the antibiotic ampicillin at a concentration of 100 μg / ml.

Пример 5. Получение немодифицированного ИФН альфa2b человека с использованием рекомбинантного штамма E.coli BL21(DE3)/pGLSΔ23-IFNA2BExample 5. Obtaining unmodified IFN human alpha2b using recombinant E. coli strain BL21 (DE3) / pGLSΔ23-IFNA2B

а) Культивирование.a) Cultivation.

Культивирование штамма-продуцента гибридного предшественника интерферона человека альфa2b осуществляли на лабораторном ферментере с рабочим объемом 3 л в среде TB (дрожжевой экстракт - 24 г/л, триптон - 12 г/л, фосфат калия однозамещенный - 2,31 г/л, фосфат калия двузамещенный - 12,54 г/л, глицерин - 4 мл/л). Культивирование проводили при температуре 37°C и поддержании растворенного кислорода на уровне не менее 10%. Аэрацию поддерживали на постоянном уровне 1 об/об/мин. Обороты мешалки регулировались автоматически в диапазоне 300-800 об/мин в зависимости от данных датчика растворенного кислорода. Индукцию синтеза целевого белка осуществляли при достижении культурой оптической плотности 4 о.е. путем добавления ИПТГ до конечной концентрации 0,2 мМ. Культивирование продолжали до достижения культурой стационарной фазы роста. Оценку выхода целевого белка определяли по данным электрофореза в ПААГ по методу Лэмли. На стадии ферментации выход гибридного белка оценивался на уровне не менее 1000 мг/л.The cultivation of the producer strain of the hybrid precursor of human interferon alfa2b was carried out on a laboratory fermenter with a working volume of 3 l in TB medium (yeast extract - 24 g / l, tryptone - 12 g / l, potassium phosphate monosubstituted - 2.31 g / l, potassium phosphate disubstituted - 12.54 g / l, glycerin - 4 ml / l). Cultivation was carried out at a temperature of 37 ° C and maintaining dissolved oxygen at a level of at least 10%. Aeration was maintained at a constant level of 1 rpm / min. The stirrer speed was automatically adjusted in the range of 300-800 rpm depending on the data of the dissolved oxygen sensor. The synthesis of the target protein was induced when the culture reached an optical density of 4 p.u. by adding IPTG to a final concentration of 0.2 mM. Cultivation was continued until the culture reached a stationary growth phase. Estimation of the yield of the target protein was determined by electrophoresis in SDS page according to the Lamley method. At the fermentation stage, the yield of the hybrid protein was estimated to be at least 1000 mg / L.

б) Выделение, очистка и ферментативный гидролиз гибридного белка.b) Isolation, purification and enzymatic hydrolysis of the hybrid protein.

- получение телец включения.- getting Taurus inclusion.

Для получения тел включения биомассу штамма-продуцента суспендировали в буфере состава: 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ натрий хлорид, 5 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, pH 8,0 в соотношении 1:10 и дважды пропускали через дезинтегратор высокого давления при давлении 850 бар.To obtain inclusion bodies, the biomass of the producer strain was suspended in the composition buffer: 50 mM Tris-HCl, 100 mM sodium chloride, 5 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, pH 8.0 in a ratio of 1:10 and twice passed through a high-pressure disintegrator at a pressure of 850 bar.

- растворение тел включения.- dissolution of inclusion bodies.

Нерастворимые тельца включения выделяли, очищали и растворяли в буфере (8 М мочевина, 100 мМ Трис-HCl pH 9,5, 2 мМ ЭДТА, 20 мМ 2-меркаптоэтанол). Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 6 часов. Нерастворенный материал удаляли центрифугированием (15000 g), а раствор фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.Insoluble inclusion bodies were isolated, purified and dissolved in buffer (8 M urea, 100 mM Tris-HCl pH 9.5, 2 mM EDTA, 20 mM 2-mercaptoethanol). The resulting mixture was incubated at room temperature for 6 hours. Insoluble material was removed by centrifugation (15000 g), and the solution was filtered through a membrane with a pore diameter of 0.45 μm.

- ренатурация гибридного белка.- renaturation of the hybrid protein.

Ренатурацию белка GST-SUMOΔ23-IFN α2b проводили путем разбавления полученного раствора в 20 раз буфером 20 мМ глицин pH 9,3, 0,4 М мочевина, 0,1% Твин 20,1 мМ цистеин, 0,1 мМ цистин. Инкубировали реакционную смесь в течение 18 часов при температуре +8÷12°C и постоянном перемешивании со скоростью 120 об/мин.The GST-SUMOΔ23-IFN α2b protein was renaturated by diluting the resulting solution 20 times with 20 mM glycine pH 9.3, 0.4 M urea, 0.1% Tween 20.1 mM cysteine, 0.1 mM cystine. The reaction mixture was incubated for 18 hours at a temperature of + 8 ÷ 12 ° C and constant stirring at a speed of 120 rpm.

- очистка гибридного белка- purification of the hybrid protein

Поскольку в состав гибридного белка входят GST-таг и заряженный линкер, очистка гибридного белка могла проводиться одним из двух ниже описанных вариантов.Since the GST tag and the charged linker are part of the fusion protein, fusion protein purification could be carried out by one of the two options described below.

Вариант 1.Option 1.

После ренатурации в реакционную смесь при перемешивании со скоростью 120 об/мин добавляли 10% фосфорную кислоту до установления значения pH 7,3 и фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный раствор подвергали очистке на аффинном сорбенте.After renaturation, 10% phosphoric acid was added to the reaction mixture with stirring at a speed of 120 rpm until a pH of 7.3 was established and filtered through a membrane with a pore diameter of 0.45 μm. The resulting solution was purified on an affinity sorbent.

Процедуру захвата гибридного белка проводили с использованием колонки XK 50/20 (GE Healthcare) с рабочим объемом 200 мл, содержащей сорбент Глутатион-сефарозу 4 B (GE Healthcare), при рабочей скорости потока 7 мл/мин. Сначала колонку уравновешивали 400 мл буфера PBS pH 7,3, затем наносили раствор гибридного белка. После этого колонну промывали 400 мл буфера PBS pH 7,3. Элюцию гибридного белка проводили 800 мл буфера A1 (50 mM Трис-HCl, 10 mM восстановленный глутатион, pH 8,0). Элюцию GST-SUMOΔ23-IFN α2b отслеживали по оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюат подвергали ферментативному гидролизу (см. соответствующий раздел).The hybrid protein capture procedure was performed using an XK 50/20 column (GE Healthcare) with a 200 ml working volume containing the Glutathione Sepharose 4 B sorbent (GE Healthcare) at a working flow rate of 7 ml / min. First, the column was equilibrated with 400 ml of PBS pH 7.3 buffer, then a hybrid protein solution was applied. After that, the column was washed with 400 ml of PBS pH 7.3. The fusion protein was eluted with 800 ml of A1 buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0). Elution GST-SUMOΔ23-IFN α2b was monitored by optical density at a wavelength of 280 nm. The eluate was subjected to enzymatic hydrolysis (see the corresponding section).

Вариант 2.Option 2

Раствор с ренатурированным белком фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный раствор гибридного белка подвергали очистке на анионообменном сорбенте.The solution with the renatured protein was filtered through a membrane with a pore diameter of 0.45 μm. The resulting hybrid protein solution was purified on an anion exchange sorbent.

Процедуру захвата гибридного белка проводили с использованием колонки XK 26/20 (GE Healthcare) с рабочим объемом 70 мл, содержащей сорбент Q-сефарозу Fast Flow (GE Healthcare), при рабочей скорости потока 7 мл/мин. Предварительно колонку уравновешивали 200 мл буфера A2 (50 mM Трис-HCl pH 8,0), затем наносили раствор белка. После этого колонну промывали 350 мл буфера A2. Элюцию гибридного белка проводили линейным градиентом 0-50% буфера B1 (50 mM Трис-HCl, 1 М натрий хлорид, pH 8,0) в объеме 700 мл. Элюцию гибридного предшественника отслеживали по оптической плотности при длине волны 280 нм (фиг. 4). Элюат подвергали ферментативному гидролизу (см. далее).The hybrid protein capture procedure was performed using an XK 26/20 column (GE Healthcare) with a working volume of 70 ml containing Fast Flow Q-Sepharose sorbent (GE Healthcare) at a working flow rate of 7 ml / min. The column was pre-equilibrated with 200 ml of buffer A2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0), then a protein solution was applied. After that, the column was washed with 350 ml of buffer A2. The hybrid protein was eluted using a linear gradient of 0-50% B1 buffer (50 mM Tris-HCl, 1 M sodium chloride, pH 8.0) in a volume of 700 ml. The elution of the hybrid precursor was monitored by optical density at a wavelength of 280 nm (Fig. 4). The eluate was subjected to enzymatic hydrolysis (see below).

- ферментативное расщепление гибридного белка SUMO-протеазой (Ulp1).- enzymatic cleavage of the hybrid protein by SUMO protease (Ulp1).

Ферментативное расщепление белка GST-SUMOΔ23-IFNα2b, выделенного любым из описанных выше вариантов, проводили при перемешивании со скоростью 120 об/мин в течение 1,5 часов при температуре +20÷25°C. Для этого к раствору гибридного белка добавляли протеиназу Ulp1 из расчета 2 мг протеиназы (Reverter D., et al., 2009) на 1 г гибридного белка. В случае варианта 2 раствор гибридного белка перед добавлением фермента предварительно разбавляли в 5 раз буфером 50 mM Трис-HCl pH 8,0.Enzymatic cleavage of the protein GST-SUMOΔ23-IFNα2b, isolated by any of the above options, was carried out with stirring at a speed of 120 rpm for 1.5 hours at a temperature of + 20 ÷ 25 ° C. For this, Ulp1 proteinase was added to the solution of the hybrid protein at the rate of 2 mg proteinase (Reverter D., et al., 2009) per 1 g of the hybrid protein. In the case of option 2, the solution of the hybrid protein was previously diluted 5 times with 50 mM Tris-HCl pH 8.0 buffer before the enzyme was added.

По завершении ферментативного расщепления полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и подвергали дальнейшей хроматографической очистке.Upon completion of the enzymatic digestion, the resulting solution was filtered through a membrane filter with a pore diameter of 0.22 μm and subjected to further chromatographic purification.

в) Очистка целевого белка (ИФН альфа2b)c) Purification of the target protein (IFN alpha2b)

- хроматография на Q-сефарозе.- chromatography on Q-Sepharose.

Использовали колонку XK 26/20 (GE Healthcare) с рабочим объемом 70 мл, содержащую сорбент Q-сефарозу Fast Flow (GE Healthcare), при рабочей скорости потока 7 мл/мин. После уравновешивания колонки 200 мл буфера A2 (50 mM Трис-HCl pH 8,0) наносили полученный на предыдущей стадии фильтрат. После этого колонну промывали 300 мл буфера A2. Целевой белок элюировали линейным градиентом 0-50% буфера B1 (50 mM Трис-HCl, 1 М натрий хлорид, pH 8,0) в объеме 700 мл. Элюцию IFN α2b отслеживали по оптической плотности при длине волны 280 нм (Фиг. 5, 6) Сбор фракций осуществляли по 30 мл в полипропиленовые пробирки.An XK 26/20 column (GE Healthcare) was used with a working volume of 70 ml containing Fast Flow Q-Sepharose sorbent (GE Healthcare) at a working flow rate of 7 ml / min. After equilibrating the column with 200 ml of A2 buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0), the filtrate obtained in the previous step was applied. After this, the column was washed with 300 ml of buffer A2. The target protein was eluted with a linear gradient of 0-50% B1 buffer (50 mM Tris-HCl, 1 M sodium chloride, pH 8.0) in a volume of 700 ml. Elution of IFNα2b was monitored by optical density at a wavelength of 280 nm (Fig. 5, 6). The fractions were collected in 30 ml fractions in polypropylene tubes.

Собранные фракции элюатаза окисляли, для чего их объединяли и при перемешивании со скоростью 120 об/мин разбавляли в 5 раз буфером A3 (50 мМ натрий ацетат, pH 4,5). Полученный раствор фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм.The collected eluatase fractions were oxidized, for which they were combined and, with stirring, at a speed of 120 rpm, was diluted 5 times with A3 buffer (50 mM sodium acetate, pH 4.5). The resulting solution was filtered through a 0.22 μm filter.

- хроматография на CM-сефарозе.- chromatography on CM-Sepharose.

Использовали колонку XK 26/20 (GE Healthcare) с рабочим объемом 50 мл, содержащую сорбент CM-сефарозу Fast Flow (GE Healthcare), при рабочей скорости потока 5 мл/мин. Колонну уравновешивали 150 мл буфера A3, наносили раствор белка, затем промывали 250 мл буфера A4 (50 мМ натрий ацетат, 0,1 М натрий хлорид, 0,1% Твин 20, pH 4,5) и 200 мл буфера A3. Элюцию целевого белка проводили линейным градиентом 0-50% буфера B2 (50 мМ натрия ацетат, pH 4,5, 1 М натрий хлорид) в объеме 500 мл. Элюцию IFN α2b отслеживали по оптической плотности при длине волны 280 нм (Фиг. 7). При достижении значения 100 мУЕ осуществляли сбор фракций по 30 мл в полипропиленовые пробирки.An XK 26/20 column (GE Healthcare) with a working volume of 50 ml containing a Fast Flow CM-Sepharose sorbent (GE Healthcare) was used at a working flow rate of 5 ml / min. The column was equilibrated with 150 ml of A3 buffer, a protein solution was applied, then washed with 250 ml of A4 buffer (50 mM sodium acetate, 0.1 M sodium chloride, 0.1% Tween 20, pH 4.5) and 200 ml of A3 buffer. The target protein was eluted with a linear gradient of 0-50% B2 buffer (50 mM sodium acetate, pH 4.5, 1 M sodium chloride) in a volume of 500 ml. IFNα2b elution was monitored by optical density at a wavelength of 280 nm (FIG. 7). Upon reaching 100 mUU, 30 ml fractions were collected in polypropylene tubes.

Собранные фракции элюата анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие целевой белок с чистотой не ниже 96%, объединяли и пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.The collected eluate fractions were analyzed by HPLC. Fractions containing the target protein with a purity of at least 96% were combined and passed through a membrane filter with a pore diameter of 0.22 μm.

- гель-фильтрация.- gel filtration.

Гель-фильтрацию проводили на колонке (GE Healthcare) с рабочим объемом 2000 мл, содержащей сорбент Sephadex G-50 (GE Healthcare), при рабочей скорости потока - 4 мл/мин. Колонку предварительно уравновешивали 3 л буфера A5 (20 мМ натрий ацетат, 150 мМ натрий хлорид, pH 5,0), после чего наносили раствор, полученный после очистки на CM-сефарозе, и промывали колонну 2 л буфера A5. Элюцию целевого белка отслеживали по оптической плотности при длине волны 280 нм. При достижении значения OD 50 мУЕ осуществляли сбор фракций в полипропиленовые пробирки.Gel filtration was performed on a column (GE Healthcare) with a working volume of 2000 ml containing a Sephadex G-50 sorbent (GE Healthcare), at a working flow rate of 4 ml / min. The column was pre-equilibrated with 3 L of A5 buffer (20 mM sodium acetate, 150 mM sodium chloride, pH 5.0), after which the solution obtained after purification on CM-Sepharose was applied, and the column was washed with 2 L of A5 buffer. The elution of the target protein was monitored by optical density at a wavelength of 280 nm. Upon reaching an OD value of 50 mUU, fractions were collected in polypropylene tubes.

Собранные фракции элюата анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие немодифицированный интерферон альфа-2b с чистотой не ниже 96%, объединяли и пропускали через стерильный мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.The collected eluate fractions were analyzed by HPLC. Fractions containing unmodified interferon alpha-2b with a purity of not less than 96% were combined and passed through a sterile membrane filter with a pore diameter of 0.22 μm.

г) Выход и характеристики целевого продукта.d) The yield and characteristics of the target product.

В случае применения первого варианта очистки гибридного предшественника, основанной на аффинном сродстве, выход целевого белка составил более 100 мг с 1 л культуры, тогда как применение второго варианта, использующего наличие в составе гибридного предшественника отрицательно заряженного пептида, позволило повысить выход целевого белка в полтора раза, и получить более 150 мг с 1 л культуры (см. таблицу 2).In the case of using the first variant of purification of the hybrid precursor based on affinity affinity, the yield of the target protein was more than 100 mg per 1 liter of culture, while the use of the second variant, using the presence of a negatively charged peptide in the hybrid precursor, made it possible to increase the yield of the target protein by 1.5 times , and get more than 150 mg with 1 liter of culture (see table 2).

Очищенный интерферон альфа-2b человека, полученный с применением как варианта 1, так и варианта 2 выделения гибридного предшественника, имеет следующие характеристики:Purified human interferon alpha-2b obtained using both option 1 and option 2 isolation of the hybrid precursor has the following characteristics:

- чистота не ниже 96%, (фиг. 8);- purity not lower than 96%, (Fig. 8);

- пептидная карта полученного белка принципиально соответствует пептидной карте стандартного образца интерферона альфа-2b (Interferonalpha-2bCRS, Councilof Europe; European Directorate for the Quality of Medicines European Pharmacopoeia; Strasbourg, cat. №10320301), (фиг. 9);- the peptide map of the obtained protein basically corresponds to the peptide map of a standard sample of interferon alpha-2b (Interferonalpha-2bCRS, Councilof Europe; European Directorate for the Quality of Medicines European Pharmacopoeia; Strasbourg, cat. No. 10320301), (Fig. 9);

- специфическая активность, определенная биологическим методом с использованием культуры клеток MDBK и вируса везикулярного стоматита (VSV) согласно (European Pharmacopoeia 6.0, Interferonalfa-2 concentrated solution), составляет не менее 1,4×10⁸ МЕ/мг.- the specific activity determined by the biological method using a culture of MDBK cells and vesicular stomatitis virus (VSV) according to (European Pharmacopoeia 6.0, Interferonalfa-2 concentrated solution) is at least 1.4 × 10 ⁸ IU / mg.

Таким образом, при осуществлении настоящего изобретения был получен IFN α2b человека с показателями чистоты и специфической активности, близкими к прототипу. При этом предложенная ДНК-конструкция и ее применение по назначению позволили получить целевой продукт более простым в технологическом отношении и более дешевым (без применения обращенно-фазовой хроматографии) способом, чем в прототипе, и исходно (без дополнительных проверок) гарантировать отсутствие загрязнения его следами токсичных соединений.Thus, in the implementation of the present invention was obtained IFN α2b person with indicators of purity and specific activity close to the prototype. Moreover, the proposed DNA construct and its intended use allowed to obtain the target product in a technologically simpler and cheaper (without the use of reverse phase chromatography) method than in the prototype, and initially (without additional checks) to ensure that it was not contaminated with toxic traces compounds.

Литература.Literature.

Artika M. et al., 2013, Am. J. Biochem. Biotechnol., 9 (4), 423-429.Artika M. et al., 2013, Am. J. Biochem. Biotechnol., 9 (4), 423-429.

Ben-Bassat A., Bauer K., 1987, Nature, 326, 315.Ben-Bassat A., Bauer K., 1987, Nature, 326, 315.

Butt T. et al., 2005, Protein Expr. Purif., 43(1), 1-9.Butt, T. et al., 2005, Protein Expr. Purif., 43 (1), 1-9.

EP 0089626, 28.09.1983.EP 0089626, 09/28/1983.

Eur. Pharm., 5^th ed., 2004.Eur. Pharm., 5 ^th ed., 2004.

Eur. Pharm. 6.^th ed., 20, Interferonalfa-2 concentrated solution.Eur. Pharm. 6. ^th ed., 20, Interferonalfa-2 concentrated solution.

http://www.innovationsinmedicine.org/software/DNABuilder.http://www.innovationsinmedicine.org/software/DNABuilder.

Harper S., Speicher D., 2011, Methods Mol. Biol., 681, 259-280.Harper S., Speicher D., 2011, Methods Mol. Biol., 681, 259-280.

Kapust R. et al., 1999, Protein Sci., 8, 1668-1674.Kapust R. et al., 1999, Protein Sci., 8, 1668-1674.

Mossessova E., Lima C., 2000, Mol. Cell, 5, 865-876.Mossessova E., Lima C., 2000, Mol. Cell, 5, 865-876.

Panavas T. et al., 2009, Methods Mol. Biol., 497, 303-317.Panavas, T. et al., 2009, Methods Mol. Biol., 497, 303-317.

Peciak K. et al., 2014, Protein Exp. Purif., 99, 18-26.Peciak K. et al., 2014, Protein Exp. Purif., 99, 18-26.

Rabbani et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, 1307-1313.Rabbani et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, 1307-1313.

Rabhi-Essafi et al., 2007, Protein Eng. Des. Sel., 20, 201-209.Rabhi-Essafi et al., 2007, Protein Eng. Des. Sel., 20, 201-209.

Reverter D., Lima C.D. Methods Mol Biol. 2009; 497:225-239.Reverter D., Lima C.D. Methods Mol Biol. 2009; 497: 225-239.

RU 2441072, 27.01.2012.RU 2441072, 01.27.2012.

RU 2453604, 20.06.2012.RU 2453604, 06/20/2012.

Smith D. et al., 1988, Gene, 67, 31-40.Smith D. et al., 1988, Gene, 67, 31-40.

Studier F.W. Protein Expr Purif. 2005; 41:207-234.Studier F.W. Protein Expr Purif. 2005; 41: 207-234.

US 7,220,576, 22.05.2007.US 7,220,576, May 22, 2007.

Zhang H. et al., PLoS One, February 3, 2015.Zhang H. et al., PLoS One, February 3, 2015.

Zhu F. et al., 2013, World J. Microbiol. Biotechnol., 29, 319-325.Zhu F. et al., 2013, World J. Microbiol. Biotechnol., 29, 319-325.

Claims (7)

1. Элемент генетической конструкции, которая кодирует гибридный предшественник немодифицированной формы целевого рекомбинантного белка, где названный элемент представляет собой полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, кодирующей укороченный с N-конца на 23 аминокислотных остатка белок SUMO Sac. cerevisiae (Smt3), и выполняет в гибридном предшественнике роль области распознавания и расщепления специфической протеазой Ulp1.1. An element of a genetic construct that encodes a hybrid precursor of an unmodified form of the target recombinant protein, where the named element is a polynucleotide with a nucleotide sequence encoding SUMO Sac protein shortened from the N-terminus to 23 amino acid residues. cerevisiae (Smt3), and in the hybrid precursor plays the role of the recognition and cleavage region of the specific protease Ulp1. 2. Генетическая конструкция, кодирующая гибридный предшественник немодифицированной формы целевого рекомбинантного белка, которая состоит из оперативно связанных нуклеотидных последовательностей, кодирующих вспомогательную аминокислотную последовательность, аминокислотную последовательность области распознавания и расщепления специфической протеазой и последовательность целевого белка, где указанная область распознавания и расщепления кодируется элементом по п. 12. The genetic construct encoding the hybrid precursor of the unmodified form of the target recombinant protein, which consists of operatively linked nucleotide sequences encoding an auxiliary amino acid sequence, the amino acid sequence of the recognition and cleavage region of a specific protease and the sequence of the target protein, where the specified recognition and cleavage region is encoded by an element according to . one 3. Генетическая конструкция, кодирующая гибридный предшественник немодифицированной формы целевого рекомбинантного белка, которая состоит из оперативно связанных нуклеотидных последовательностей, кодирующих вспомогательную аминокислотную последовательность, аминокислотную последовательность области распознавания и расщепления специфической протеазой и последовательность целевого белка, где указанная область распознавания и расщепления кодируется элементом по п. 1, а вспомогательная аминокислотная последовательность представлена глутатион-S-трансферазой (GST), связанной с областью расщепления заряженным пептидным линкером.3. The genetic construct encoding the hybrid precursor of the unmodified form of the target recombinant protein, which consists of operatively linked nucleotide sequences encoding an auxiliary amino acid sequence, the amino acid sequence of the recognition and cleavage region of a specific protease and the sequence of the target protein, where the specified recognition and cleavage region is encoded by an element according to . 1, and the auxiliary amino acid sequence is ene glutathione-S-transferase (GST), related to the charged region of the cleavage peptide linker. 4. Генетическая конструкция, кодирующая гибридный предшественник немодифицированной формы целевого рекомбинантного белка, которая состоит из оперативно связанных нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность GST, отрицательно заряженный пептидный линкер, укороченный с N-конца на 23 аминокислотных остатка белок SUMO Sac. cerevisiae (Smt3) и последовательность интерферона альфа-2b человека4. The genetic construct encoding the hybrid precursor of the unmodified form of the target recombinant protein, which consists of operatively linked nucleotide sequences encoding the GST amino acid sequence, a negatively charged peptide linker, shortened from the N-terminus to 23 amino acid residues of the SUMO Sac protein. cerevisiae (Smt3) and human interferon alpha-2b sequence 5. Рекомбинантный вектор экспрессии, функционально активный в Е. coli, содержащий под контролем промотора генетическую конструкцию по п. 4.5. Recombinant expression vector functionally active in E. coli containing, under the control of a promoter, the genetic construct of claim 4. 6. Культура клеток Е. coli, трансформированных экспрессионным вектором по п. 5 и обеспечивающая синтез гибридного предшественника, кодируемого генетической конструкцией по п. 4.6. The culture of E. coli cells transformed with the expression vector according to claim 5 and providing the synthesis of a hybrid precursor encoded by the genetic construct according to claim 4. 7. Способ получения рекомбинантного интерферона альфа 2b человека, предусматривающий культивирование продуцента гибридного предшественника интерферона альфа 2b в условиях, обеспечивающих образование продукта в нерастворимой форме, отделение и растворение телец включения, рефолдинг гибридного белка, его выделение и очистку, гидролиз SUMO-протеазой (Ulp1) и хроматографическую очистку целевого белка, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют культуру клеток E.coli, охарактеризованную в п. 6, для выделения и очистки гибридного предшественника используют аффинную хроматографию на глутатион-сефарозе 4В или ионообменную хроматографию на Q-сефарозе, а для очистки целевого белка последовательно используют две стадии ионообменной хроматографии, на Q-сефарозе и СМ-сефарозе. 7. A method for producing recombinant human interferon alfa-2b, comprising cultivating a producer of the interferon alfa-2b hybrid precursor under conditions ensuring the formation of the product in insoluble form, separation and dissolution of inclusion bodies, refolding of the hybrid protein, its isolation and purification, hydrolysis with SUMO protease (Ulp1) and chromatographic purification of the target protein, characterized in that the E. coli cell culture described in clause 6 is used as producer for isolation and purification of the hybrid precursor Tween calves use affinity chromatography on glutathione-Sepharose 4B or ion-exchange chromatography on Q-Sepharose, and two stages of ion-exchange chromatography, Q-Sepharose and CM-Sepharose, are sequentially used to purify the target protein.

Images