RU2599500C1 - Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина - Google Patents

Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина Download PDF

Info

Publication number
RU2599500C1
RU2599500C1 RU2015132581/15A RU2015132581A RU2599500C1 RU 2599500 C1 RU2599500 C1 RU 2599500C1 RU 2015132581/15 A RU2015132581/15 A RU 2015132581/15A RU 2015132581 A RU2015132581 A RU 2015132581A RU 2599500 C1 RU2599500 C1 RU 2599500C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
fluorine
contrast agent
label
introduction
lysine residues
Prior art date
Application number
RU2015132581/15A
Other languages
English (en)
Inventor
Татьяна Сергеевна Годовикова
Владимир Николаевич Сильников
Вячеслав Евдокимович Платонов
Алексей Сергеевич Чубаров
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)
Priority to RU2015132581/15A priority Critical patent/RU2599500C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2599500C1 publication Critical patent/RU2599500C1/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
    • C07D333/36—Nitrogen atoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фармакологии и медицинской диагностике. Раскрыт контрастирующий агент, представляющий собой N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина, который может быть использован для введения фтор-19 метки в белковые молекулы, содержащие остатки лизина. Изобретение обеспечивает повышение качества и стабильности контрастирующего агента. 1 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к фармакологии и медицинской диагностике, конкретнее к контрастирующим агентам для введения фтор-19 метки в белки для последующей визуализации процессов фармакокинетики и фармакодинамики белковых препаратов в режиме фтор-19 ЯМР и магнитно-резонансной томографии (МРТ).
Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) представляет собой сегодня широко применяемый метод медицинской диагностики, используемый для создания изображения in vivo, с помощью которого можно получить изображение сосудов и тканей тела (включая злокачественные опухоли), замеряя магнитные свойства ядер атомов в жидкости организма.
Исключительно перспективным ядром для ЯМР спектроскопии in vivo и томографических измерений является фтор-19 [Jesus Ruiz-Cabello, Brad P. Barnett, and Jeff W.M. Bulte / Fluorine (19F) MRS and MRI in biomedicine // NMR Biomed., 2011, 24(2), 114-129]. Он имеет почти такой же большой магнитный момент (40 МГц/Тл), как и протон (42,6 МГц/Тл), и его природное содержание составляет 100%. Ядер 19F в живых организмах практически нет, однако возможности реализовать томографию на ядрах фтор-19 (19F-МРТ) появляются благодаря особым свойствам фторорганических соединений, в которых с углеродом вместо атомов водорода связаны атомы фтора. Вещества, имеющие перфторированный радикал, применяются в МРТ для распознавания различных физиологических и патофизиологических структур и, таким образом, для улучшения диагностической информации, например, местоположения заболевания, для выбора и оценки результата направленной терапии и для профилактики заболеваний и расстройств.
В качестве агентов для МРТ по сигналу 19F широко используются эмульсии перфторуглерода [Díaz-López R, Tsapis N, Fattal E. Liquid perfluorocarbons as contrast agents for ultrasonography and (19)F-MRI // Pharm Res. 2010. V. 1. P. 1-16]. Однако эти препараты обладают серьезными недостатками: они гетерогенны, нестабильны, имеют расщепленные сигналы в спектрах 19F-MPT и, что наиболее важно, они могут задерживаться в различных тканях и органах на продолжительное (иногда месяцы) время.
Перечисленные недостатки агентов на основе перфторуглерода могут быть преодолены при условии использования в качестве контрастирующих агентов ковалентных или нековалентных комплексов фторсодержащих соединений, желательно с единичным сигналом 19F от множественных атомов фтора, с белками.
Так, например, в патентной заявке WO 2003045441, опубл. 05.06.2003 для in vivo для визуализации ферментативной активности используют конъюгаты субстратов различных ферментов, аномальная активность которых связана с конкретными заболеваниями, с соединениями, содержащими перфторалкильную или перфторарильную группу.
В заявке WO 2014135590, опубл. 12.09.2014, предложен универсальный реагент для визуализации биомолекул, в том числе для нужд тераностики, представляющий собой металлоцен, с обогащенными атомами фтора лигандами и линкерной группой для присоединения металлоцена к биополимерам. Визуализация может осуществляться как за счет атомов 19F, так и 18F или любого другого подходящего радионуклида, который может формировать металлоцен.
В заявке WO 2014041150, опубл. 12.09.2014, также предложен универсальный реагент для визуализации, состоящий из наночастиц сополимера молочной и гликолевой кислот, включающих полифторированные краунэфиры и комплексы гадолиния.
Однако для таких реагентов характерно «вымывание» ионов металлов из металлокомплексов, что, с одной стороны, повышает токсичность таких реагентов, а с другой стороны, приводит к расщеплению сигналов от атомов фтора и, в конечном итоге, к снижению чувствительности. Кроме того, реагенты, описанные в приведенных выше примерах, перед присоединением к белкам нуждаются в дополнительной активации.
Ближайшим к заявляемому контрастирующему агенту - прототипом, является контрастирующий агент на основе трифторацетилированного производного тиолактона гомоцистеина для введения в белки фтор-19 метки (19F). Реагент не требует предварительной активации и имеет единичный сигнал от трех атомов фтора -CF3 группы [A.S. Chubarov et. al. Bioorgan. Med. Chem. Lett. (2011) V. 21. P. 4050-4053]. Однако присоединение фтор-метки через трифторацетамидную связь делает такой реагент не достаточно устойчивым.
Задачей изобретения является получение нового контрастирующего агента, содержащего для увеличения интенсивности сигнала более одной CF3 группы, не содержащего нестабильной трифторацетамидной связи и не требующего для мечения белков предварительной активации.
Технический результат: повышение качества и стабильности контрастирующего агента.
Поставленная задача достигается предлагаемым контрастирующим агентом на основе фторпроизводного тиолактона гомоцистеина для введения фтор-19 метки в белки, содержащие в своем составе остатки лизина.
Заявляемый контрастирующий агент представляет собой N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина со следующей структурной формулой (I):
Figure 00000001
Способ получения заявляемого контрастирующего агента заключается в следующем (на фиг. 1 представлена общая схема его синтеза).
Исходную смесь оптических изомеров гидрохлорида тиолактона гомоцистеина (DL-гидрохлорид тиолактона гомоцистеина) переводят в основание 0,25 М раствором карбонатного буфера (pH 10,5) с последующей экстракцией свободного основания тиолактона гомоцистеина этилацетатом и последующим удалением органического растворителя на ротационном испарителе. Полученное свободное основание тиолактона сразу растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавляют эквивалентное количество м-перфторксилола и перемешивают на магнитной мешалке в течение 16 ч при 25°C. Целевой продукт осаждают из реакционной смеси водой, осадок отделяют центрифугированием. После двухкратной промывки осадка водой осадок высушивают в вакууме. Выход целевого продукта составляет 93,4-95,1%.
Полученный реагент отличается большей стабильностью, позволяет вводить в человеческий сывороточный альбумин до 6 трифторметильных групп на одну молекулу белка, не нуждаются в дополнительной активации перед присоединением к белкам.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Получение N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина.
К 20,4 мг DL-гидрохлориду тиолактона гомоцистеина добавляют 0,5 мл 0,25 М карбонатного буфера (pH 10,5), перемешивают в течение 40 секунд при комнатной температуре. Полученное свободное основание тиолактона гомоцистеина экстрагируют 10 мл этилацетата с последующим удалением органического растворителя на ротационном испарителе. Продукт сразу используется для следующей стадии синтеза ввиду его нестабильности.
К 15 мг свободного основания тиолактона гомоцистеина (tHcy) (0,128 ммоль) добавляют 0,6 мл ДМСО и 8,1 мкл м-перфторксилола. Перемешивают в течение 16 ч при 25°C. К реакционной смеси добавляют 0,6 мл дистиллированной воды и центрифугируют до полного осаждения осадка, декантируют. К осадку приливают 0,4 мл воды, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, центрифугируют, декантируют. Процедуру повторяют еще один раз. Выход целевого продукта составляет 95,1% в виде светло-желтого твердого вещества. 19F ЯМР (CD3CN, δ, м.д., J, Гц): 108,78 (д, 3F, CF3(1)), 108,17 (т, 3F, CF3(2)), 45,18 (м, 1F, F-3a), 31,60 (м, 1F, F-5a), 7,91 (м, 1F, F-6а), JCF3(1),3a=30,9, JCF3(1),5a=3,6, JCF3(2),3a=JCF3(2),5a=22,3, J3a,5a=2,6, J3a,6a=10,0, J5a,6a=18,0, JNH,6a=2,0. 1H ЯМР (DMSO-d6, δ, м.д., J, Гц): 6,52 (ш. д, 1H, NH), 4,71 (м, 1H, H-3), 3,43 (м, 1H, H-5′), 3,31 (м, 1H, H-5), 2,76 (м, 1H, H-4′), 2,26 (м, 1H, H-4), J3,4=12,8, J3,4′=7,0, J3,5=0,5, J3,NH=8,4, J4,4′=12,2, J4,5=7,0, J4,5′=12,2, J4′,5=1,3, J4′,5′=5,3, J5,5′=11,5, J4,NH=2,0, J4′,NH=1,0. 13C ЯМР (CD3CN, δ, м.д., J, Гц): 207,2 (CO), 155,0 (C-3a), 141,6 (C-5a), 140,7 (C-6a), 138,3 (C-1a), 125,8 (CF3), 124,4 (CF3), 123,1 (C-4a), 121,6 (C-2a), 66,2 (C-3), 33,4 (C-5,5′), 28,0 (C-4,4′). ESI MS (m/z) рассч. C12H5NOSF9 [M-H]: 381.995, найдено 381.896. УФ-спектр (CH3CN), λmax/нм (ε, M-1 см-1): 296 ((6,0±0,1)×103), 255 ((1,3±0,1)×104), 325 ((1,9±0,1)×103).
Пример 2.
Получение N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина.
К 204 мг DL-гидрохлориду тиолактона гомоцистеина добавляют 5 мл 0,25 М карбонатного буфера (pH 10,5), перемешивают в течение 2 мин. при комнатной температуре. Полученное свободное основание тиолактона гомоцистеина экстрагируют 3×40 мл этилацетата с последующим удалением органического растворителя на ротационном испарителе. Продукт сразу используется для следующей стадии синтеза ввиду его нестабильности.
К 150 мг свободного основания tHcy (1,28 ммоль) добавляют 6 мл ДМСО и 81 мкл м-перфторксилола. Перемешивают в течение 16 ч при 25°C. К реакционной смеси добавляют 6 мл дистиллированной воды и центрифугируют до полного осаждения осадка, декантируют. К осадку приливают 5 мл воды, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, центрифугируют, декантируют. Процедуру повторяют еще один раз. Выход: 93,4% в виде светло-желтого твердого вещества.
Пример 3.
Взаимодействие N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеина с человеческим сывороточным альбумином.
Человеческий сывороточный альбумин 66,5 мг растворяют в 1 мл фосфатного буферного раствора (PBS), добавляют 109 мкл 29,4 мМ раствора N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил) тиолактона гомоцистеина в ДМСО и инкубируют при 37°C в течение 18 ч. После инкубации реакционную смесь очищают от низкомолекулярных веществ с помощью концентраторов «Centricon» (Amicon Centriprep YM30, Millipore, Bedford) при 9000 g. Для этого раствор белка концентрируют до минимально возможного объема (~0,2 мл), добавляют буфер PBS (0,4 мл×4), а затем воду (0,4 мл×6), после добавления каждой порции буфера или воды раствор концентрируют. Затем порции раствора человеческого сывороточного альбумина раскапывают по пробиркам порциями по 0,2 мл, упаривают досуха на вакуумной центрифуге Speed Vac при 30°C и хранят при -20°C. УФ-спектр (буфер PBS pH 7,4), λmax/нм: 259, 278, 300. 19F ЯМР (pH 7,4, буфер PBS): δ 109,3 (м, 3F, CF3(1)), 108,5 (м, 3F, CF3(2)), 47,0 (м, 1F, F-3a), 33,8 (м, 1F, F-5a), 4,0 (м, 1F, F-6а). Выход модифицированного белка составляет ~95%. С использованием 5,5′-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) было показано, что на одну молекулу белка в среднем приходится 3,0±0,1 остатка N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)гомоцистеина. Молярная масса конъюгата, по данным MALDI-TOF масс-спектрометрии, составила 67,6 кг/моль (что соответствует присоединению 3 остатков N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)гомоцистеина).
С помощью метода гель-электрофореза (SDS-PAGE) было показано отсутствие образования высокомолекулярных агломератов и соответствие полос белка нативному человеческому сывороточному альбумину.
Использование предлагаемого контрастирующего агента позволит увеличить чувствительность метода ЯМР спектроскопии за счет увеличения на одну молекулу белка числа CF3 групп, дающих единичный сигнал и повышения стабильности метки за счет исключения из реагента лабильной трифторацетамидной группы.

Claims (1)

  1. Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина, представляющий собой N-(2,3,5-трифтор-4,6-бис(трифторметил)фенил)-тиолактон гомоцистеин со следующей структурной формулой (I):
    Figure 00000002
RU2015132581/15A 2015-08-04 2015-08-04 Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина RU2599500C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015132581/15A RU2599500C1 (ru) 2015-08-04 2015-08-04 Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015132581/15A RU2599500C1 (ru) 2015-08-04 2015-08-04 Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2599500C1 true RU2599500C1 (ru) 2016-10-10

Family

ID=57127519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015132581/15A RU2599500C1 (ru) 2015-08-04 2015-08-04 Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2599500C1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0592306A2 (en) * 1992-10-06 1994-04-13 Terumo Kabushiki Kaisha 19F-MRI Contrast medium
RU2009116678A (ru) * 2006-10-02 2010-11-10 Байер Шеринг Фарма Акциенгезельшафт (DE) Радиофторирование
WO2014041150A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 Stichting Katholieke Universiteit Contrast agent and its use for imaging
EP2774930A1 (en) * 2013-03-07 2014-09-10 Aptenia S.R.L. Metallocene compounds and labeled molecules comprising the same for in vivo imaging.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0592306A2 (en) * 1992-10-06 1994-04-13 Terumo Kabushiki Kaisha 19F-MRI Contrast medium
RU2009116678A (ru) * 2006-10-02 2010-11-10 Байер Шеринг Фарма Акциенгезельшафт (DE) Радиофторирование
WO2014041150A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 Stichting Katholieke Universiteit Contrast agent and its use for imaging
EP2774930A1 (en) * 2013-03-07 2014-09-10 Aptenia S.R.L. Metallocene compounds and labeled molecules comprising the same for in vivo imaging.

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
А. С. ЧУБАРОВ и др. Фторсодержащий ацилирующий реагент на основе тиолактона гомоцистеина для модификации белков//Труды Всероссийской научной молодежной школы-конференции "Химия по знаком "Сигма". Омск - 2010, с.261-262. *
А. С. ЧУБАРОВ и др. Фторсодержащий ацилирующий реагент на основе тиолактона гомоцистеина для модификации белков//Труды Всероссийской научной молодежной школы-конференции "Химия по знаком "Сигма". Омск - 2010, с.261-262. А. И. ЧЕРТЕНКОВ. Флуоресцентное мечение гомоцистеинилированного альбумина человека//Ж: Медицина и образование в Сибири, 2014, N3. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xiao et al. Aminopeptidase‐N‐activated theranostic prodrug for NIR tracking of local tumor chemotherapy
EP2953649B1 (en) Groundbreaking platform technology for specific binding to necrotic cells
EP2155215B1 (en) Gold nanoparticle based protease imaging probes and use thereof
Kotková et al. Cyclodextrin‐based bimodal fluorescence/MRI contrast agents: an efficient approach to cellular imaging
US20210206774A1 (en) Molecular containers and methods of making and using same
Li et al. A visible and near-infrared dual-fluorescent probe for discrimination between Cys/Hcy and GSH and its application in bioimaging
US8293782B2 (en) Compound, probe containing the novel compound, and fluorescence-imaging contrast agent containing the novel compound or the probe
JP2000510147A (ja) 光学イメージングにおけるコントラスト増強のためのδ▲上１，６▼ビシクロ［４，４，０］官能性染料
Zhang et al. Gadolinium-doped Au@ prussian blue nanoparticles as MR/SERS bimodal agents for dendritic cell activating and tracking
JP2002531377A (ja) 診断および治療に有用な非共有結合的バイオコンジュゲート
JP2017128532A (ja) 光学イメージング用造影剤の製造方法、及び光学イメージング用造影剤
Sang et al. An “AND” Molecular Logic Gate as a Super‐Enhancers for De Novo Designing Activatable Probe and Its Application in Atherosclerosis Imaging
CN107325809B (zh) 一种与Aβ斑块具有亲和力的荧光化合物及制备与应用
JP2000511521A (ja) 光学イメージングにおけるコントラスト増強のための三環式官能性染料
CN103946232B (zh) 抗淀粉样蛋白的ɑ‑螺旋阻断超小肽疗法
Jia et al. Water-soluble chromenylium dyes for shortwave infrared imaging in mice
CN109456210A (zh) 一种竹红菌素迫位和2-位同时氨基取代的衍生物及其制备方法和应用
RU2599500C1 (ru) Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина
WO2018172543A1 (fr) Plateforme tétrazine modulaire biocompatible
EP0995740A1 (en) Novel nitroxyl compounds and drugs and reagents containing the same as the active ingredient
Roberts et al. Optoacoustic Imaging of Glucagon-like Peptide-1 Receptor with a Near-Infrared Exendin-4 Analog
JP2001521488A (ja) 光学イメージングにおけるコントラスト増強のための△▲上１，２▼ビシクロ［４，４，０］官能性染料
WO2016092325A1 (en) Contrast agent for imaging hypoxia
Mitin et al. Fluorinated Human Serum Albumin as Potential 19F Magnetic Resonance Imaging Probe
JP2013545795A (ja) 造影剤

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20190805