RU2597985C1

RU2597985C1 - Method for site-specific hydrolysis of c5-methylated dna sequence

Info

Publication number: RU2597985C1
Application number: RU2015118601/10A
Authority: RU
Inventors: Валерий Алексеевич Чернухин; Мурат Абдурашитович Абдурашитов; Владимир Сергеевич Дедков; Наталья Александровна Михненкова; Светлана Германовна Удальева; Сергей Харитонович Дегтярев
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм"
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2016-09-20

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and represents a method for site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA sequence. Reaction mixture is prepared containing a buffer solution and a sample of C5-methylated DNA, the mixture is added with dimethyl sulfoxide to the final concentration of 15-25 %, and then with MD-endonuclease, the mixture is incubated for one hour at 30-37 °C, followed by analysis of the DNA hydrolysis result by gel electrophoresis, herewith the MD-endonuclease used is GlaI with the concentration of 4-8 ea/mcl or PcsI with the concentration of 1-2 ea/mcl.

EFFECT: invention provides higher efficiency of site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA sequence.

4 cl, 3 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для исчерпывающего сайт-специфического гидролиза по С5-метилированным последовательностям ДНК.The invention relates to the field of biotechnology and can be used for exhaustive site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA sequences.

При проведении эпигенетического анализа ДНК, например при сравнении статуса метилирования ДНК малигнантных и здоровых клеток человека, анализируют преимущественно сайты узнавания метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз (MD-эндонуклеаз), которые расщепляются с низкой эффективностью, что существенно ограничивает возможности использования данных ферментов.When carrying out epigenetic DNA analysis, for example, when comparing the DNA methylation status of malignant and healthy human cells, the recognition sites of methyl-dependent site-specific DNA endonucleases (MD endonucleases) are predominantly analyzed, which are cleaved with low efficiency, which significantly limits the possibilities of using these enzymes.

Поскольку точность эпигенетического анализа ДНК, используемого, в частности, в онкодиагностике, напрямую зависит от полноты гидролиза С 5-метилированной ДНК [1], задача усовершенствования способов гидролиза С5-метилированной ДНК является актуальной.Since the accuracy of the epigenetic analysis of DNA used, in particular, in oncodiagnostics, directly depends on the completeness of hydrolysis of C 5-methylated DNA [1], the task of improving the methods of hydrolysis of C5-methylated DNA is relevant.

К настоящему времени известны способы сайт-специфического гидролиза С5-метилированных последовательностей ДНК, включающие подготовку реакционной смеси, содержащей буфер (10-50 мМ Трис-ацетат или Трис-HCl, рН 7.8-8.5, 10 мМ магния ацетат или 10 мМ магния хлорид, 1 мМ дитиотреитол, NaCl или KCl в концентрации до 100 мМ) и образец С5-метилированной ДНК, добавление к смеси MD-эндонуклеазы, инкубирование смеси с последующим анализом результата гидролиза ДНК с помощью гель-электрофореза. В частном варианте для увеличения активности и специфичности расщепления в реакционную смесь добавляют спермидин в концентрации около 8 мМ [2].To date, methods for site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA sequences are known, including preparing a reaction mixture containing a buffer (10-50 mm Tris-acetate or Tris-HCl, pH 7.8-8.5, 10 mm magnesium acetate or 10 mm magnesium chloride, 1 mM dithiothreitol, NaCl or KCl at a concentration of up to 100 mM) and a sample of C5-methylated DNA, addition to the mixture of MD-endonuclease, incubation of the mixture, followed by analysis of the result of DNA hydrolysis using gel electrophoresis. In a particular embodiment, to increase the activity and specificity of cleavage, spermidine is added to the reaction mixture at a concentration of about 8 mM [2].

Известно также, что для увеличения активности некоторых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз в реакционную смесь дополнительно добавляют олигонуклеотидные дуплексы, содержащие сайты узнавания данных ферментов [3].It is also known that to increase the activity of some site-specific DNA endonucleases, oligonucleotide duplexes containing recognition sites for these enzymes are additionally added to the reaction mixture [3].

Недостатком известных способов является низкая эффективность гидролиза С5-метилированной последовательности ДНК.A disadvantage of the known methods is the low efficiency of hydrolysis of the C5-methylated DNA sequence.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом - является способ сайт-специфического гидролиза С5-метилированной последовательности ДНК, включающий подготовку реакционной смеси, содержащей буфер (33 мМ Трис-ацетат или Трис-HCl, рН 8.5, 10 мМ магния ацетат, 1 мМ дитиотреитол, 66 мМ калия ацетат) и образец С5-метилированной ДНК, добавление к смеси MD-эндонуклеазы Glal с удельной активностью 10 е.а./мкл, инкубирование смеси в течение часа при 30°C с последующим анализом результата гидролиза ДНК с помощью гель-электрофореза [4].Closest to the claimed method — the prototype — is a site-specific hydrolysis of a C5 methylated DNA sequence, comprising preparing a reaction mixture containing a buffer (33 mM Tris-acetate or Tris-HCl, pH 8.5, 10 mM magnesium acetate, 1 mM dithiothreitol, 66 mM potassium acetate) and a sample of C5-methylated DNA, addition to a Glal MD-endonuclease mixture with specific activity of 10 ea / μl, incubation of the mixture for one hour at 30 ° C followed by analysis of the result of DNA hydrolysis using gel electrophoresis [four].

Недостатком данного способа является низкая эффективность гидролиза С5-метилированной последовательности ДНК.The disadvantage of this method is the low efficiency of hydrolysis of the C5 methylated DNA sequence.

Задачей изобретения является обеспечение высокоэффективного исчерпывающего сайт-специфического гидролиза по С5-метилированным последовательностям ДНК с помощью MD-эндонуклеаз.The objective of the invention is the provision of highly effective exhaustive site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA sequences using MD-endonucleases.

Технический результат: повышение эффективности сайт-специфического гидролиза С5-метилированной последовательности ДНК.Effect: increasing the efficiency of site-specific hydrolysis of the C5-methylated DNA sequence.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.The problem is achieved by the proposed method, which consists in the following.

К реакционной смеси, содержащей реакционный буфер (33 мМ Трис-ацетат, рН 7.9, 10 мМ магния ацетат, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол) и образец С5-метилированной ДНК, добавляют диметилсульфоксид (DMSO) до конечной концентрации 15-25% и препарат MD-эндонуклеазы. Смесь инкубируют в течение 1 часа при 30-37°C.To the reaction mixture containing the reaction buffer (33 mm Tris acetate, pH 7.9, 10 mm magnesium acetate, 66 mm potassium acetate, 1 mm dithiothreitol) and a sample of C5-methylated DNA, dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to a final concentration of 15-25% and an MD endonuclease preparation. The mixture is incubated for 1 hour at 30-37 ° C.

Конкретное количество реагентов и объем реакционной смеси зависят от количества С5-метилированной ДНК, которую необходимо подвергнуть сайт-специфическому гидролизу с целью определения уровня ее метилирования. В классическом (типовом) варианте к 20 мкл реакционной смеси, содержащей однократный реакционный буфер и образец С5-метилированной ДНК в количестве 0,1-1 мкг, добавляют 3-5 мкл диметилсульфоксида (до конечной концентрации 15-25%, соответственно) и 1 мкл препарата MD-эндонуклеазы. Смесь инкубируют в течение 1 часа при 30-37°C.The specific amount of reagents and the volume of the reaction mixture depend on the amount of C5 methylated DNA that needs to be subjected to site-specific hydrolysis in order to determine its methylation level. In the classic (typical) version, 20 μl of the reaction mixture containing a single reaction buffer and a sample of C5-methylated DNA in an amount of 0.1-1 μg, add 3-5 μl of dimethyl sulfoxide (to a final concentration of 15-25%, respectively) and 1 μl of the preparation of MD-endonuclease. The mixture is incubated for 1 hour at 30-37 ° C.

Результаты гидролиза анализируют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ x1, содержащем 0,04 М Трис-HCl, рН 8.4, 0,02 М уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА.The hydrolysis results are analyzed by electrophoresis on a 1% agarose gel in TAE x1 buffer containing 0.04 M Tris-HCl, pH 8.4, 0.02 M acetic acid, 1 mM EDTA.

В качестве реакционного буфера в смеси может быть использован буфер, содержащий 33 мМ Трис-ацетат, рН 7.9, 10 мМ магния ацетат, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол, или буфер, содержащий 10-50 мМ Трис-HCl, рН 7.5-9.0, NaCl с концентрацией до 100 мМ, 1 мМ дитиотреитол.As a reaction buffer in the mixture, a buffer containing 33 mM Tris acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 1 mM dithiothreitol, or a buffer containing 10-50 mM Tris-HCl, pH 7.5- can be used 9.0, NaCl with a concentration of up to 100 mM, 1 mM dithiothreitol.

В качестве MD-эндонуклеазы может быть использована GlaI [4] с концентрацией (удельной активностью) 4-8 е.а./мкл или PcsI [5] с концентрацией 1-2 е.а./мкл.GlaI [4] with a concentration (specific activity) of 4-8 ea / μl or PcsI [5] with a concentration of 1-2 ea / μl can be used as MD endonuclease.

Предлагаемый способ позволяет провести исчерпывающий сайт-специфический гидролиз MD-эндонуклеазами по всем сайтам узнавания на конкретной ДНК, поскольку при использовании традиционных методов гидролиза часть сайтов не расщепляется полностью. Так, фермент PcsI становится способным эффективно расщеплять все последовательности вида 5′-(5mC)GNNNN^NNN(5mC)G-3′, а фермент GlaI - следующие С5-метилированные последовательности ДНК:The proposed method allows for an exhaustive site-specific hydrolysis of MD-endonucleases at all recognition sites on a specific DNA, because when using traditional hydrolysis methods, some sites are not completely split. So, the PcsI enzyme becomes able to efficiently cleave all sequences of the form 5 ′ - (5mC) GNNNN ^ NNN (5mC) G-3 ′, and the GlaI enzyme - the following C5-methylated DNA sequences:

5′-G(5mC)G(5mC)-3′/3′-(5mC)G(5mC)G-5′;5′-G (5mC) G (5mC) -3 ′ / 3 ′ - (5mC) G (5mC) G-5 ′;

5′-R(5mC)G(5mC)-3′/3′-YG(5mC)G-5′;5′-R (5mC) G (5mC) -3 ′ / 3′-YG (5mC) G-5 ′;

5′-A(5mC)GT-3′/3′-TG(5mC)A-5′;5′-A (5mC) GT-3 ′ / 3′-TG (5mC) A-5 ′;

5′-G(5mC)R(5mC)-3′/3′-(5mC)GYG-5′;5′-G (5mC) R (5mC) -3 ′ / 3 ′ - (5mC) GYG-5 ′;

5′-G(5mC)GT-3′/3′-CG(5mC)A-5′;5′-G (5mC) GT-3 ′ / 3′-CG (5mC) A-5 ′;

5′-G(5mC)GC-3′/3′-CG(5mC)G-5′.5′-G (5mC) GC-3 ′ / 3′-CG (5mC) G-5 ′.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:The defining differences of the proposed method, in comparison with the prototype, are:

1. В реакционную смесь добавляют DMSO до конечной концентрации 15-25%, что позволяет повысить эффективность гидролиза С5-метилированных последовательностей ДНК MD-эндонуклеазами в 10-32 раза.1. DMSO is added to the reaction mixture to a final concentration of 15-25%, which makes it possible to increase the efficiency of hydrolysis of C5-methylated DNA sequences by MD-endonucleases by 10-32 times.

2. В реакционную смесь добавляют соответствующее количество MD-эндонуклеазы с определенной концентрацией (GlaI - 4-8 е.а./мкл, а PcsI - 1-2 е.а./мкл), что позволяет эффективно гидролизовать С5-метилированные последовательности ДНК без проявления MD-эндонуклеазами неспецифической активности. При гидролизе С5-метилированных последовательностей ДНК способом-прототипом данные MD-эндонуклеазы не способны расщеплять вышеуказанные последовательности полностью, что резко ограничивает применение этих ферментов в молекулярной биологии, генной инженерии, эпигенетике и онкодиагностике.2. An appropriate amount of MD endonuclease with a specific concentration (GlaI is 4-8 ea / μl and PcsI is 1-2 ea / μl) is added to the reaction mixture, which allows efficient hydrolysis of C5-methylated DNA sequences without the manifestation of MD-specific endonucleases of non-specific activity. During the hydrolysis of C5-methylated DNA sequences by the prototype method, the data of MD endonucleases are not able to completely split the above sequences, which sharply limits the use of these enzymes in molecular biology, genetic engineering, epigenetics, and oncology diagnostics.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.

Пример 1. Сайт-специфический гидролиз С5-метилированной ДНК плазмиды pHspAI2 MD-эндонуклеазой GlaI в зависимости от концентрации DMSO.Example 1. Site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA plasmid pHspAI2 MD-endonuclease GlaI depending on the concentration of DMSO.

Для сайт-специфического гидролиза использовали плазмиду pHspAI2, в которой во всех последовательностях 5′-GCGC-3′ С5-метилирован первый цитозин [4]. Таким образом, ДНК данной плазмиды содержит метилированные последовательности 5′-G(5mC)GC-3′/3′-CG(5mC)G-5′, которые должны расщепляться GlaI.For site-specific hydrolysis, the pHspAI2 plasmid was used, in which the first cytosine was methylated in all 5′-GCGC-3 ′ C5 sequences [4]. Thus, the DNA of this plasmid contains methylated 5′-G (5mC) GC-3 ′ / 3′-CG (5mC) G-5 ′ sequences that must be cleaved by GlaI.

Для удобства анализа плазмида pHspAI2 была предварительно линеаризована эндонуклеазой рестрикции DriI.For ease of analysis, the plasmid pHspAI2 was previously linearized by the restriction enzyme DriI.

Из исходного препарата GlaI с активностью 8 е.а./мкл путем последовательных разбавлений в буфере для хранения и разбавления ферментов «В 100» производства ООО «СибЭнзайм» (10 мМ Трис-HCl, рН 7.6, 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 200 мкг/мл бычий сывороточный альбумин, 1 мМ дитиотреитол, 50% глицерин) получали препараты GlaI с концентрациями 4 е.а./мкл, 2 е.а./мкл, 1 е.а./мкл, 1/2 е.а./мкл и 1/4 е.а./мкл, то есть 6 различных растворов фермента, включая исходный и 5 разбавленных, отличающихся друг от друга концентрациями GlaI в 2 раза.From the initial GlaI preparation with an activity of 8 ea / μl by successive dilutions in the buffer for storage and dilution of enzymes “B 100” manufactured by SibEnzyme LLC (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 200 μg / ml bovine serum albumin, 1 mM dithiothreitol, 50% glycerol) received GlaI preparations with concentrations of 4 EA / μl, 2 EA / μl, 1 EA / μl, 1/2 ea / μl and 1/4 ea / μl, i.e. 6 different solutions of the enzyme, including the original and 5 diluted, differing from each other by GlaI concentrations by 2 times.

К 20 мкл реакционной смеси, содержащей реакционный буфер (33 мМ Трис-ацетат, рН 7.9, 10 мМ магния ацетат, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол) и 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI2, линеаризованной DriI (pHspAI2/DriI), добавляли 3 мкл, 4 мкл, 5 мкл или 6 мкл DMSO (до концентрации 15%, 20%, 25% или 30% соответственно), а затем добавляли по 1 мкл каждого из полученных разведений фермента GlaI.To 20 μl of the reaction mixture containing the reaction buffer (33 mM Tris acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 1 mM dithiothreitol) and 1 μg DNA of plasmid pHspAI2 linearized with DriI (pHspAI2 / DriI), 3 were added μl, 4 μl, 5 μl or 6 μl DMSO (to a concentration of 15%, 20%, 25% or 30%, respectively), and then 1 μl of each of the resulting dilutions of the GlaI enzyme was added.

Поскольку растворы фермента GlaI готовили последовательным разбавлением исходного препарата в 2 раза, использование в реакции расщепления метилированной ДНК 1 мкл каждого из полученных разбавлений фермента эквивалентно тому, что в разные реакционные смеси добавляются по 1 (8 е.а.), 1/2 (4 е.а.), 1/4 (2 е.а.), 1/8 (1 е.а.), 1/16 (0,5 е.а.) и 1/32 мкл (0,25 е.а.) фермента соответственно.Since solutions of the GlaI enzyme were prepared by 2-fold sequential dilution of the initial preparation, the use of 1 μl of each of the obtained dilutions of the enzyme in the methylation DNA cleavage reaction is equivalent to the addition of 1 (8 ea), 1/2 (4 ea), 1/4 (2 ea), 1/8 (1 ea), 1/16 (0.5 ea) and 1/32 μl (0.25 e .a.) of the enzyme, respectively.

Расщепление ДНК проводили в течение 1 часа при 30°C. Результаты гидролиза анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ x1, содержащем 0,04 М Трис-HCl, рН 8.4, 0,02 М уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА.DNA digestion was carried out for 1 hour at 30 ° C. The hydrolysis results were analyzed by electrophoresis on a 1% agarose gel in TAE x1 buffer containing 0.04 M Tris-HCl, pH 8.4, 0.02 M acetic acid, 1 mM EDTA.

Результаты анализа приведены на фиг. 1, где дорожка 1 - 1 мкл (8 е.а.) исходного препарата GlaI; дорожка 2 - 1/2 мкл (4 е.а.) исходного препарата GlaI; дорожка 3 - 1/4 мкл (2 е.а.) исходного препарата GlaI; дорожка 4 - 1/8 мкл (1 е.а.) исходного препарата GlaI; дорожка 5-1/16 мкл (0,5 е.а.) исходного препарата GlaI; дорожка 6 - 1/32 мкл (0,25 е.а.) исходного препарата GlaI; дорожка К - контрольная ДНК (pHspAI2/DriI); М - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производства ООО «СибЭнзайм»).The analysis results are shown in FIG. 1, where lane 1 - 1 μl (8 ea) of the original GlaI preparation; lane 2 - 1/2 μl (4 ea) of the original GlaI preparation; lane 3 - 1/4 μl (2 ea) of the original GlaI preparation; lane 4 - 1/8 μl (1 ea) of the original GlaI preparation; lane 5-1 / 16 μl (0.5 ea) of the original GlaI preparation; lane 6 - 1/32 μl (0.25 EA) of the original GlaI preparation; lane K - control DNA (pHspAI2 / DriI); M - 1 kb DNA molecular weight marker (manufactured by SibEnzyme LLC).

Как видно из набора фрагментов ДНК на фиг. 1, наиболее полный гидролиз ДНК плазмиды pHspAI2/DriI MD-эндонуклеазой GlaI наблюдается в случае использования DMSO в конечной объемной концентрации 20%. В этом случае глубина гидролиза pHspAI2/DriI на 5 дорожке (0,5 мкл препарата фермента, 20% DMSO) заметно превосходит таковую на 1 дорожке (1 мкл препарата фермента, без DMSO), а набор продуктов гидролиза на 6 дорожке (0,25 мкл препарата фермента, 20% DMSO), близка к набору продуктов расщепления этой же ДНК на 1 дорожке (1 мкл препарата фермента, без DMSO). При увеличении же концентрации DMSO до 30% активность фермента начинает ингибироваться. Таким образом, можно заключить, что активность GlaI в присутствии 20% DMSO (оптимальная концентрация) увеличивается в 16-32 раза.As can be seen from the set of DNA fragments in FIG. 1, the most complete hydrolysis of plasmid DNA with pHspAI2 / DriI by GlaI MD-endonuclease is observed when DMSO is used in a final volume concentration of 20%. In this case, the pHspAI2 / DriI hydrolysis depth on the 5th lane (0.5 μl of the enzyme preparation, 20% DMSO) significantly exceeds that on the 1st lane (1 μl of the enzyme preparation, without DMSO), and the hydrolysis set on the 6th lane (0.25 μl of the enzyme preparation, 20% DMSO), is close to the set of products of the cleavage of the same DNA on 1 lane (1 μl of the enzyme preparation, without DMSO). With an increase in the concentration of DMSO to 30%, the activity of the enzyme begins to be inhibited. Thus, we can conclude that the activity of GlaI in the presence of 20% DMSO (optimal concentration) increases by 16-32 times.

Из данных, приведенных на фиг. 1, также видно, что при обработке субстратной ДНК 1 мкл препарата GlaI (8 е.а.) в реакционной смеси без DMSO гидролиз этой ДНК оказывается неполным, тогда как при использовании в буфере 15-20% DMSO сайт-специфический гидролиз становится исчерпывающим.From the data shown in FIG. 1, it is also seen that, when treating the substrate DNA with 1 μl of the GlaI preparation (8 ea) in the reaction mixture without DMSO, the hydrolysis of this DNA is incomplete, whereas when using 15-20% DMSO in buffer, the site-specific hydrolysis becomes exhaustive.

Пример 2. Сайт-специфический гидролиз MD-эндонуклеазой GlaI ДНК фага лямбда, предварительно метилированной по последовательности 5′-CG-3′ в зависимости от концентрации DMSO.Example 2. Site-specific hydrolysis with MD-endonuclease GlaI DNA of phage lambda, previously methylated by the sequence 5′-CG-3 ′ depending on the concentration of DMSO.

Для иллюстрации возможности осуществления исчерпывающего сайт-специфического гидролиза С5-метилированной ДНК при использовании в реакционном буфере DMSO и препарата MD-эндонуклазы GlaI с концентрацией 4 е.а./мкл использовали ДНК фага лямбда, в которой все CG-пары С5-метилированы метилазой SssI. Именно такой тип метилирования характерен для геномной ДНК человека, поэтому данный анализ показывает, что эффективность расщепления GlaI CG-метилированной ДНК человека увеличивается при использовании 20% DMSO.To illustrate the possibility of an exhaustive site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA when using DMSO in the reaction buffer and GlaI MD endonuclease preparation with a concentration of 4 ea / μl, lambda phage DNA was used in which all CG pairs are C5-methylated with SssI methylase . This type of methylation is typical for human genomic DNA; therefore, this analysis shows that the efficiency of the GlaI cleavage of human CG-methylated DNA increases with 20% DMSO.

В результате обработки метилазой SssI метилируются в том числе и последовательности 5′-RCGY-3′ с образованием сайтов узнавания GlaI: 5′-R(5mC)GY-3′/3′-YG(5mC)R-5′.As a result of methylase treatment, SssI also methylates 5′-RCGY-3 ′ sequences with the formation of GlaI recognition sites: 5′-R (5mC) GY-3 ′ / 3′-YG (5mC) R-5 ′.

К 20 мкл реакционной смеси, содержащей реакционный буфер (33 мМ Трис-ацетат, рН 7.9, 10 мМ магния ацетат, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол) и 1 мкг ДНК фага лямбда, предварительно метилированной метилазой SssI, добавляли 4 мкл DMSO (до конечной концентрации 20%), а затем добавляли 1 мкл препарата GlaI с концентрацией 4 е.а./мкл.To 20 μl of the reaction mixture containing the reaction buffer (33 mM Tris acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 1 mM dithiothreitol) and 1 μg lambda phage DNA pre-methylated with SssI methylase, 4 μl DMSO ( to a final concentration of 20%), and then 1 μl of a GlaI preparation with a concentration of 4 ea / μl was added.

Расщепление ДНК проводили в течение 1 часа при 30°C. Результаты гидролиза анализировали в 1% агарозном геле после проведения электрофореза в буфере ТАЕ x1.DNA digestion was carried out for 1 hour at 30 ° C. The hydrolysis results were analyzed on a 1% agarose gel after electrophoresis in TAE x1 buffer.

Результаты анализа приведены на фиг. 2.The analysis results are shown in FIG. 2.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг. 2:Description of tracks on the electrophoregram depicted in FIG. 2:

1 - контрольная ДНК фага λ+M.SssI;1 - control DNA of phage λ + M.SssI;

2 - 1 мкл препарата (4 е.а.) GlaI в реакционной смеси без DMSO;2 - 1 μl of the drug (4 EA) GlaI in the reaction mixture without DMSO;

3 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производства ООО «СибЭнзайм»);3 - 1 kb DNA molecular weight marker (manufactured by SibEnzyme LLC);

4-1 мкл препарата (4 е.а.) GlaI в реакционной смеси с 20% DMSO.4-1 μl of the drug (4 EA) GlaI in the reaction mixture with 20% DMSO.

Как видно из фиг. 2, в случае использования DMSO в конечной концентрации 20% эффективность гидролиза CG-метилированной ДНК фага лямбда существенно возрастает (дорожка 4) по сравнению со случаем, когда реакционная смесь не содержит DMSO (дорожка 2). Согласно теоретическим расчетам, проведенным в программе Vector NTI Suite 7.1, при 100% гидролизе С5-метилированной ДНК фага лямбда по сайтам узнавания GlaI 5′-R(5mC)GY-3′/3′-CG(5mC)R-5′ максимальная длина образующихся фрагментов ДНК не превышает 1083 п.н., что соответствует картине гидролиза при использовании в реакционной смеси, содержащей DMSO в конечной объемной концентрации 20%.As can be seen from FIG. 2, when using DMSO at a final concentration of 20%, the efficiency of hydrolysis of CG-methylated lambda phage DNA significantly increases (lane 4) compared with the case when the reaction mixture does not contain DMSO (lane 2). According to theoretical calculations performed in the Vector NTI Suite 7.1 program, with 100% hydrolysis of C5-methylated lambda phage DNA at recognition sites GlaI 5′-R (5mC) GY-3 ′ / 3′-CG (5mC) R-5 ′ maximum the length of the formed DNA fragments does not exceed 1083 bp, which corresponds to the hydrolysis pattern when used in a reaction mixture containing DMSO in a final volume concentration of 20%.

Таким образом, использование в реакционной смеси 20% DMSO и 4-8 е.а. GlaI позволяет осуществить исчерпывающий сайт-специфический гидролиз С5-метилированной ДНК, тогда как без использования DMSO гидролиз оказывается неполным.Thus, the use of 20% DMSO and 4-8 ea in the reaction mixture. GlaI allows an exhaustive site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA, while without DMSO hydrolysis is incomplete.

Пример 3. Сайт-специфический гидролиз С5-метилированной ДНК плазмиды pMTL-MSssI MD-эндонуклеазой PcsI в зависимости от концентрации DMSO.Example 3. Site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA of plasmid pMTL-MSssI with MD-endonuclease PcsI depending on the concentration of DMSO.

Для гидролиза использовали плазмиду pMTL-MSssI, в которой во всех последовательностях 5-CG-3′ С5-метилирован цитозин. Данная плазмида была получена путем лигирования фрагмента, несущего ген метилазы SssI [6] и вектора pMTL22 [7] по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции FauNDI и BamHI.For hydrolysis, plasmid pMTL-MSssI was used, in which cytosine was methylated in all 5-CG-3 ′ C5 methylated sequences. This plasmid was obtained by ligation of a fragment carrying the SssI methylase gene [6] and pMTL22 vector [7] at the recognition sites of the restriction endonucleases FauNDI and BamHI.

Таким образом, ДНК данной плазмиды содержит метилированные последовательности 5′-(5mC)G-3′/3′-G(5mC)-5′, которые образуют несколько сайтов узнавания фермента PcsI - последовательностей 5′-(5mC)GNNNNNNN(5mC)G-3′/3′-G(5mC)NNNNNNNG(5mC)-5′.Thus, the DNA of this plasmid contains the methylated sequences 5 ′ - (5mC) G-3 ′ / 3′-G (5mC) -5 ′, which form several recognition sites of the PcsI enzyme - sequences 5 ′ - (5mC) GNNNNNNN (5mC) G-3 ′ / 3′-G (5mC) NNNNNNNG (5mC) -5 ′.

Для удобства анализа плазмида pMTL-MSssI была предварительно переведена в линейную форму расщеплением эндонуклеазой рестрикции DriI по уникальному сайту.For convenience of analysis, the plasmid pMTL-MSssI was previously linearized by digestion with restriction enzyme DriI at a unique site.

К 20 мкл реакционной смеси, содержащей реакционный буфер (33 мМ Трис-ацетат, рН 7.9, 10 мМ магния ацетат, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол) и 1 мкг ДНК плазмиды pMTL-MSssI, линеаризованной DriI (pMTL-MSssI/DriI), добавляли 3 мкл, 4 мкл или 5 мкл DMSO (до концентрации 15%, 20% или 25% соответственно), а затем добавляли по 1 мкл препарата MD-эндонуклеазы PcsI с концентрацией 1 е.а./мкл.To 20 μl of the reaction mixture containing the reaction buffer (33 mM Tris acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 1 mM dithiothreitol) and 1 μg DNA plasmid pMTL-MSssI, linearized DriI (pMTL-MSssI / DriI ), 3 μl, 4 μl, or 5 μl DMSO were added (to a concentration of 15%, 20%, or 25%, respectively), and then 1 μl PcsI MD endonuclease preparation was added at a concentration of 1 ea / μl.

Расщепление ДНК проводили в течение 1 часа при 37°C. Результаты гидролиза анализировали в 1% агарозном геле после проведения электрофореза в буфере ТАЕ x1.DNA digestion was carried out for 1 hour at 37 ° C. The hydrolysis results were analyzed on a 1% agarose gel after electrophoresis in TAE x1 buffer.

Результаты анализа приведены на фиг. 3.The analysis results are shown in FIG. 3.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг. 3:Description of tracks on the electrophoregram depicted in FIG. 3:

1 - pMTL-MSssI/DriI;1 - pMTL-MSssI / DriI;

2 - pMTL-MSssI/DriI+1 мкл препарата (1 е.а.) PcsI в реакционной смеси без DMSO;2 - pMTL-MSssI / DriI + 1 μl of the drug (1 EA) PcsI in the reaction mixture without DMSO;

3 - pMTL-MSssI/DriI+1 мкл препарата (1 е.а.) PcsI в реакционной смеси с 15% DMSO;3 - pMTL-MSssI / DriI + 1 μl of the drug (1 EA) PcsI in the reaction mixture with 15% DMSO;

4 - pMTL-MSssI/DriI+1 мкл препарата (1 е.а.) PcsI в реакционной смеси с 20% DMSO;4 - pMTL-MSssI / DriI + 1 μl of the drug (1 EA) PcsI in a reaction mixture with 20% DMSO;

5 - pMTL-MSssI/DriI+1 мкл препарата (1 е.а.) PcsI в реакционной смеси с 25% DMSO;5 - pMTL-MSssI / DriI + 1 μl of the drug (1 EA) PcsI in a reaction mixture with 25% DMSO;

6 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производства ООО «СибЭнзайм»).6 - 1 kb DNA molecular weight marker (manufactured by SibEnzyme LLC).

Как видно из набора фрагментов ДНК на фиг. 3, в случае использования реакционной смеси без DMSO (дорожка 2) сайт-специфический гидролиз линеаризованной формы pMTL-MSssI (pMTL-MSssI/DriI) является неполным. В то же время при добавлении в реакционную смесь DMSO до конечных объемных концентраций 15, 20 и 25% (дорожки 3, 4 и 5 соответственно) наблюдается исчерпывающий гидролиз метилированной ДНК при ее обработке препаратом PcsI с активностью 1 е.а.As can be seen from the set of DNA fragments in FIG. 3, in the case of using the reaction mixture without DMSO (lane 2), the site-specific hydrolysis of the linearized form pMTL-MSssI (pMTL-MSssI / DriI) is incomplete. At the same time, when DMSO was added to the reaction mixture to final volume concentrations of 15, 20, and 25% (lanes 3, 4, and 5, respectively), an exhaustive hydrolysis of methylated DNA was observed when it was treated with PcsI with an activity of 1 ea.

Пример 4. Сайт-специфический гидролиз С5-метилированной ДНК плазмиды pMTL-MSssI MD-эндонуклеазой PcsI.Example 4. Site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA of the plasmid pMTL-MSssI with MD-endonuclease PcsI.

Для гидролиза использовали плазмиду pMTL-MSssI, в которой во всех последовательностях 5-CG-3′ С5-метилирован цитозин.For hydrolysis, plasmid pMTL-MSssI was used, in which cytosine was methylated in all 5-CG-3 ′ C5 methylated sequences.

К 20 мкл реакционной смеси, содержащей реакционный буфер (33 мМ Трис-ацетат, рН 7.9, 10 мМ магния ацетат, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол) и 1 мкг ДНК плазмиды pMTL-MSssI, линеаризованной DriI (pMTL-MSssI/DriI), добавляли 4 мкл DMSO (до конечной концентрации 20%), а затем добавляли 1 мкл препарата MD-эндонуклеазы PcsI с концентрацией 2 е.а./мкл.To 20 μl of the reaction mixture containing the reaction buffer (33 mM Tris acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 1 mM dithiothreitol) and 1 μg DNA plasmid pMTL-MSssI, linearized DriI (pMTL-MSssI / DriI ), 4 μl DMSO was added (to a final concentration of 20%), and then 1 μl PcsI MD-endonuclease preparation was added at a concentration of 2 ea / μl.

Расщепление ДНК проводили в течение 1 часа при 37°C. Результаты гидролиза анализировали в 1% агарозном геле после проведения электрофореза в буфере ТАЕ x1. При этом наблюдался исчерпывающий гидролиз метилированной ДНК pMTL-MSssI/DriI в присутствии 20% DMSO, то есть картина гидролиза субстратной ДНК препаратом PcsI с концентрацией 2 е.а./мкл оказалась идентичной таковой, приведенной на фиг. 3, дорожка 4.DNA digestion was carried out for 1 hour at 37 ° C. The hydrolysis results were analyzed on a 1% agarose gel after electrophoresis in TAE x1 buffer. In this case, an exhaustive hydrolysis of methylated pMTL-MSssI / DriI DNA was observed in the presence of 20% DMSO, i.e., the pattern of hydrolysis of substrate DNA with PcsI at a concentration of 2 ea / μl turned out to be identical to that shown in FIG. 3, track 4.

Таким образом, предложенный способ позволяет осуществить высокоэффективный исчерпывающий сайт-специфический гидролиз С5-метилированных последовательностей ДНК с помощью MD-эндонуклеаз.Thus, the proposed method allows for highly effective exhaustive site-specific hydrolysis of C5-methylated DNA sequences using MD-endonucleases.

Источники информацииInformation sources

1. Д.А. Гончар, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев. BlsI- и GlaI-ПЦР-анализ - новый метод исследования метилированных участков ДНК // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2010. - Т. 6. - №1. - С. 5-12.1. D.A. Gonchar, A.G. Akishev, S.Kh. Degtyarev. BlsI- and GlaI-PCR analysis - a new method for studying methylated DNA regions // Bulletin of Biotechnology and Physico-Chemical Biology named after Yu.A. Ovchinnikov. - 2010. - T. 6. - No. 1. - S. 5-12.

2. Pingoud A. Spermidine increases the accuracy of type II restriction endonucleases. Suppression of cleavage at degenerate, non-symmetrical sites // Eur. J. Biochem. - 1985. - V. 147. - P. 105-109.2. Pingoud A. Spermidine increases the accuracy of type II restriction endonucleases. Suppression of cleavage at degenerate, non-symmetrical sites // Eur. J. Biochem. - 1985. - V. 147. - P. 105-109.

3. Kupper D., Reuter M., Meisel A., Krtiger D.H. Reliable detection of DNA CpG methylation profiles by the isoschizomers MspI / HpaII using oligonucleotide stimulators // Biotechniques. - 1997. - V. 23. - P. 843-847.3. Kupper D., Reuter M., Meisel A., Krtiger D.H. Reliable detection of DNA CpG methylation profiles by the isoschizomers MspI / HpaII using oligonucleotide stimulators // Biotechniques. - 1997. - V. 23. - P. 843-847.

4. Trasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S. Kh. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biology. 2008, 9:7.4. Trasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S. Kh. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biology. 2008, 9: 7.

5. Чернухин B.A., Наякшина Т.Н., Тарасова Г.В., Голикова Л.Н., Акишев А.Г., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3К - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pes I // Патент на изобретение RU 2377294 С1 (2008).5. Chernukhin B.A., Nayakshina T.N., Tarasova G.V., Golikova L.N., Akishev A.G., Dedkov B.C., Mikhnenkova N.A., Degtyarev S.Kh. The strain of bacteria Paracoccus carotinifaciens 3K - producer of site-specific endonuclease Pes I // Patent for invention RU 2377294 C1 (2008).

6. Renbaum P. et al. Cloning, characterization, and expression in Escherichia coli of the gene coding for the CpG DNA methylase from Spiroplasma sp. strain MQ1(M.SssI) // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P. 1145-1152.6. Renbaum P. et al. Cloning, characterization, and expression in Escherichia coli of the gene coding for the CpG DNA methylase from Spiroplasma sp. strain MQ1 (M.SssI) // Nucleic Acids Res. - 1990. - V.18. - P. 1145-1152.

7. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. The pMTL nic-cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing // Gene. - 1988. - V. 68. - P. 139-149.7. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. The pMTL nic-cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing // Gene. - 1988. - V. 68. - P. 139-149.

Claims

1. Способ сайт-специфического гидролиза C5-метилированной последовательности ДНК, включающий подготовку реакционной смеси, содержащей буферный раствор и образец C5-метилированной ДНК, добавление к смеси MD-эндонуклеазы, инкубирование смеси в течение часа с последующим анализом результата гидролиза ДНК с помощью гель-электрофореза, отличающийся тем, что в реакционную смесь добавляют диметилсульфоксид до конечной концентрации 15-25%, а в качестве MD-эндонуклеазы используют GlaI с концентрацией 4-8 е.а./мкл или PcsI с концентрацией 1-2 е.а./мкл.1. A method for site-specific hydrolysis of a C5-methylated DNA sequence, comprising preparing a reaction mixture containing a buffer solution and a sample of C5-methylated DNA, adding MD endonuclease to the mixture, incubating the mixture for one hour, followed by analysis of the result of DNA hydrolysis using gel- electrophoresis, characterized in that dimethyl sulfoxide is added to the reaction mixture to a final concentration of 15-25%, and GlaI with a concentration of 4-8 ea / μl or PcsI with a concentration of 1-2 ea / is used as MD endonuclease μl

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют буфер, содержащий 10-50 мМ Трис-HCl, pH 7.5-9.0, NaCl с концентрацией до 100 мМ, 1 мМ дитиотреитол.2. The method according to p. 1, characterized in that as a buffer solution using a buffer containing 10-50 mm Tris-HCl, pH 7.5-9.0, NaCl with a concentration of up to 100 mm, 1 mm dithiothreitol.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют буфер, содержащий 33 мМ Трис-ацетат, pH 7.9, 10 мМ магния ацетат, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол.3. The method according to p. 1, characterized in that as a buffer solution using a buffer containing 33 mm Tris acetate, pH 7.9, 10 mm magnesium acetate, 66 mm potassium acetate, 1 mm dithiothreitol.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гель-электрофорез проводят в буфере, содержащем 0,04 М Трис-HCl, pH 8.4, 0,02 М уксусную кислоту, 1 мМ ЭДТА. 4. The method according to p. 1, characterized in that the gel electrophoresis is carried out in a buffer containing 0.04 M Tris-HCl, pH 8.4, 0.02 M acetic acid, 1 mm EDTA.